CZ200288A3 - Hybridní polypeptid - Google Patents

Hybridní polypeptid Download PDF

Info

Publication number
CZ200288A3
CZ200288A3 CZ200288A CZ200288A CZ200288A3 CZ 200288 A3 CZ200288 A3 CZ 200288A3 CZ 200288 A CZ200288 A CZ 200288A CZ 200288 A CZ200288 A CZ 200288A CZ 200288 A3 CZ200288 A3 CZ 200288A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
core
hybrid
peptide sequence
amino acid
Prior art date
Application number
CZ200288A
Other languages
English (en)
Inventor
Shawn Barney
Kelly I. Guthrie
Gene Merutka
Mohmed K. Anwer
Dennis M. Lambert
Original Assignee
Trimeris, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trimeris, Inc. filed Critical Trimeris, Inc.
Publication of CZ200288A3 publication Critical patent/CZ200288A3/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18Antivirals for RNA viruses for HIV
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/20Antivirals for DNA viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/59Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10Tetrapeptides
    • C07K5/1021Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10Tetrapeptides
    • C07K5/1024Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/18011Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1· ···· · · · t · “ ·· ······· ··· ···· ·· ·· ·· ···· Z7/ <P<P
Hybridní polypeptid
Oblast techniky Předkládaný vynález se týká zesilujících (enhancer) peptidových sekvencí původně odvozených od různých proteinových sekvencí 5 retrovirového obalu (gp41), které zlepšují farmakokinetické vlastnosti jakéhokoli polypeptidového jádra, na které jsou navázány. Vynález je z části založen na objevu, že hybridní polypeptidy obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na polypeptidové jádro (core polypeptide) mají zlepšené farmakokinetické vlastnosti, jako je 10 zvýšený poločas. Vynález se dále týká nových antifuzogenních a/nebo antivirových peptidů včetně takových peptidů, které obsahují tyto zesilující peptidové sekvence, a způsobů použití těchto peptidů. Vynález se dále týká způsobů zlepšování farmakokinetických vlastností jakéhokoli polypeptidového jádra navázáním zesilujících 15 peptidových sekvencí na toto polypeptidové jádro. Mezi polypeptidová jádra použitelná při provádění tohoto vynálezu může patřit jakýkoli farmakologicky využitelný peptid, který může být například použit k terapeutickým nebo preventivním účelům. V neomezujícím provedení je vynález demonstrován na příkladu, u kterého je ukázáno, že 20 hybridní polypeptid obsahující například polypeptidová jádro HIV navázané na zesilující peptidové sekvence, je silným, necytotoxickým inhibitorem infekce HIV-1, HIV-2 a SIV. Navíc byly zesilující peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu navázány na polypeptidové jádro viru respiračního syncytia (RSV) a polypeptidové jádro receptoru 25 luteinizačního hormonu (LH-RH). V každém případě bylo zjištěno, že hybridní polypeptid má zlepšené farmakokinetické vlastnosti, a že hybridný polypeptid RSV vykazoval podstatnou aktivitu proti RSV. * · ·· f
Dosavadní stav techniky
Tato přihláška navazuje (continuation-in-part) na přihlášku No. 09/350,641, 9. července 1999, která navazuje na přihlášku No. 09/315,304, 20. května 1999, která navazuje na přihlášku No. 5 09/082,279, 20. května 1998, přičemž obsah všech těchto přihlášek je zařazen ve svém celku odkazem.
Polypeptidové produkty mají širokou škálu použití jako terapeutické a/nebo profylaktické látky pro prevenci a léčení onemocnění. Mnoho polypeptidů je schopno regulovat biochemické io nebo fyziologické procesy buď pro prevenci onemocnění nebo pro dosažení zmírnění příznaků spojených s onemocněním. Například polypeptidy jako virové nebo bakteriální polypeptidy byly úspěšně používány jako vakcíny pro prevenci patologických onemocnění. Peptidy byly dále úspěšně používány jako terapeutické prostředky pro 15 léčení příznaků onemocnění. Tyto peptidy spadají do různých kategorií, jako jsou například hormony, enzymy, imunomodulátory, sérové proteiny a cytokiny.
Aby se mohly v cílových místech projevit patřičné biologické a terapeutické účinky polypeptidů, musí být polypeptidy přítomné ve 2o vhodných koncentracích v místě působení. Navíc musí být obecně zachována jejich strukturní integrita. Proto se řídí formulace polypeptidů jako léčiv pro terapeutické použití chemickou povahou a vlastnostmi polypeptidů jako je jejich velikost a komplexnost, jejich konformační požadavky a jejich často komplikované profily z hlediska 25 stability a rozpustnosti. Farmakokinetické vlastnosti jakéhokoli konkrétního terapeuticky využitelného peptidu jsou závislé na biologické dostupnosti, distribuci a vylučování příslušného peptidu.
Protože mnoho biologicky aktivních látek jako jsou peptidy a proteiny se v těle rychle rozkládá, pro vyvinutí účinných systémů je 3o kritické udržení stálých koncentrací peptidu v krevním oběhu pro zvýšení účinnosti takových peptidů a pro minimalizaci výskytu a vážnosti nepříznivých vedlejších účinků. 3.1 Podstata vynálezu 5 Předkládaný vynález se v prvním provedení týká zesilujících peptidových sekvencí, které jsou původně odvozeny z různých proteinových sekvencí retrovirového obalu (gp41), tj. HIV-1, HIV-2 a SIV, které zesilují farmakokinetické vlastnosti . kteréhokoli polypeptidového jádra, se kterým jsou spojeny. Vynález je založen na 10 překvapivém výsledku, že jestliže se navážou popisované zesilující peptidové sekvence na kterékoli polypeptidové jádro (core polypeptide), získaný hybridní polypeptid má zlepšené farmakokinetické vlastnosti včetně například zvýšeného poločasu a snížené rychlosti vylučování vzhledem k samotnému 15 polypeptidovému jádru. Předkládaný vynález se dále týká těchto hybridních polypeptidů a polypeptidových jader a nových polypeptidů, které mají antifuzogenní účinky, antivirové účinky a/nebo schopnost modulovat intracelulární procesy, kterých se účastní peptidové struktury typu coiled-coil. Mezi tyto peptidy patří takové peptidy, které 20 obsahují zesilující peptidové sekvence.
Polypeptidová jádra mohou obsahovat jakékoli peptidy, které mohou být zavedeny do živého systému, například jakékoli peptidy schopné fungovat jako terapeutické, profylaktické nebo zobrazovací reagencie použitelné pro léčení nebo prevenci onemocnění nebo pro 25 diagnostické nebo prognostické metody, včetně metod zobrazování in vivo. Mezi tyto peptidy patří například růstové faktory, hormony, cytokiny, angiogenní růstové faktory, polypeptidy extracelulární matrice, receptorové ligandy, agonisté, antagonisté nebo inverzní agonisté, látky zacílené na peptidy, jako jsou zobrazovací látky nebo 30 cytotoxické zacílené látky, nebo polypeptidy vykazující antifuzogenní • · ··· ·
Μ ·· • · · · • · · • · · • I · • · · · · · a/nebo antivirové účinky, a peptidy nebo polypeptidy fungující jako antigeny nebo imunogeny, včetně například virových a bakteriálních polypeptidů.
Vynález se dále týká způsobů zesílení farmakokinetických 5 vlastností jakéhokoli polypeptidového jádra navázáním polypeptidového jádra na zesilující peptidové sekvence za vytvoření hybridních polypeptidů.
Vynález se ještě dále týká způsobů použití zde popisovaných polypeptidů, včetně hybridních polypeptidů obsahujících zesilující 10 peptidové sekvence. Mezi způsoby podle vynálezu patří například způsoby snižování nebo inhibice virové infekce, například HIV-1, HIV-2, RSV, spalničky, chřipka, parainfluenza, virus Epstein-Barrové a virus hepatitidy, a/nebo buněčné fúze indukované viry. Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být navíc použity pro 15 zvýšení poločasu polypeptidového jádra, na které byly navázány sekvence zesilujícího peptidu, in vitro nebo ex-vivo, například zesilující peptidové sekvence mohou zvýšit poločas navázaného polypeptidového jádra v buněčné kultuře nebo ve vzorcích buněk nebo tkáně. 20 Vynález je ukázán na příkladech, kde je ukázáno, že hybridní polypeptidy obsahující polypeptidové jádro HIV navázané na zesilující peptidové sekvence mají značně zlepšené farmakokinetické vlastnosti a působí jako silné, necytotoxické inhibitory infekce HIV-1, HIV-2 a SIV. Vynález je dále demonstrován na příkladech, ve kterých je 25 ukázáno, že hybridní polypeptidy obsahující polypeptidové jádro RSV nebo polypeptid luteinizačního hormonu, mají značně zlepšené farmakokinetické vlastnosti. Navíc bylo zjištěno, že hybridní polypeptid RSV měl významnou anti-RSV aktivitu. - 5 • * ···· • · · ♦ 9 - 5 • * ···· • · · ♦ 9
·♦ ···· 3.2 Definice
Peptidy, polypeptidy a proteiny jsou zde definovány jako organické sloučeniny obsahující dvě nebo více kovalentně navázaných aminokyselin, například peptidovými amidovými vazbami. Peptidy, 5 polypeptidy a proteiny mohou také obsahovat aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě, a jakékoli modifikace a další aminové a karboxylové skupiny, jak se zde popisuje. Termíny „peptid,“ „polypeptid" a „protein11 se zde proto používají zaměnitelně.
Peptidové sekvence definované v předkládaném vynálezu jsou io znázorněny následujícími jednopísmenovými symboly pro zbytky aminokyselin: A (alanin) R (arginin) N (asparagin) 15 D (kyselina asparagová) C (cystein) Q (glutamin) E (kyselina glutamová) G (glycin) 20 H (histidin) I (isoleucin) L (leucin) K (lysin) M (methionin) 25 F (fenylalanin) P (prolin) S (serin) T (threonin) W (tryptofan) 30 Y (tyrosin) V (valin) 6
X (jakákoli aminokyselina) „Zesilující peptidové sekvence" („enhancer peptide sequences") jsou definovány jako peptidy, které mají následující konvenční (consensus) aminokyselinové sekvence: 5 „WXXWXXXI", „WXXWXXX", „WXXWXX", „WXXWX", „WXXW", „WXXXWXWX", „XXXWXWX", „XXWXWX", „XWXWX", „WXWX", „WXXXWXW", „WXXXWX", „WXXXW", „IXXXWXXW", „XXXWXXW", „XXWXXW", „XWXXW", „XWXWXXXW", „XWXWXXX", „XWXWXX", „XWXWX", „XWXW", „WXWXXXW" nebo „XWXXXW", kde X může být 10 jakákoli aminokyselina, W znamená tryptofan a I znamená isoleucin. Jak se popisuje dále, zesilující peptidové sekvence podle vynálezu zahrnují také peptidové sekvence, které jsou jinak stejné jako konvenční aminokyselinové sekvence, ale obsahují substituce, inzerce nebo delece aminokyselin, které však nesnižují schopnost peptidu 15 zesilovat farmakokinetické vlastnosti polypeptidového jádra, na které jsou navázány, vzhledem k farmakokinetickým vlastnostem samotného polypeptidového jádra. „Polypeptidové jádro" (core polypeptid), jak se zde používá, označuje jakýkoli polypeptid, který může být zaveden do živého 20 systému a představuje tak biologicky aktivní molekulu, například jakýkoli polypeptid, který může fungovat jako farmakologicky použitelný peptid pro léčení nebo prevenci onemocnění. „Hybridní polypeptid", jak se zde používá, označuje jakýkoli polypeptid obsahující aminokoncovou, karboxykoncovou nebo amino-25 a karboxykoncovou sekvenci zesilujícího peptidu a polypeptidové jádro. Sekvence zesilujícího peptidu je typicky navázána přímo na polypeptidové jádro. Je třeba rozumět, že zesilující polypeptid může být také navázán na mezilehlou aminokyselinovou sekvenci přítomnou mezi sekvencí zesilujícího peptidu a polypeptidovým jádrem. - 7 • · · · ···· ·· ·· ·· · • · · · ♦ ♦ ♦ ♦ • · · · · · · • · · · · · · ♦ · ♦ • « * · · · · · · ··· »··# ·· ·♦ ·· ···♦ „Antifuzogenní“ a „působící proti fúzi s membránou11, jak se zde používá, označuje schopnost peptidu inhibovat nebo omezovat míru fúzních dějů mezi dvěma nebo více strukturami, například buněčnými membránami nebo obaly viru nebo pilusy, vzhledem k míře 5 membránové fúze, ke které dochází mezi strukturami v nepřítomnosti peptidu. „Antivirový1·, jak se zde používá, označuje schopnost peptidu inhibovat virovou infekci buněk prostřednictvím například buněčné fúze nebo infekce volným virem. Tato infekce může zahrnovat 10 membránovou fúzi, jak k tomu dochází v případě virů opatřených obaly, nebo jiný fúzní děj zahrnující virovou strukturu a buněčnou strukturu, například fúze virového pilusu a bakteriální membrány při konjugaci bakterií. 15 4. Přehled obrázků na výkresech
Obr. .1. Hybridní polypeptidy. Zesilující peptidové sekvence odvozené od domnělých N-koncových a C-koncových interaktivních oblastí jsou znázorněny navázané na obecné polypeptidové jádro. Konzervované sekvence zesilujícího peptid jsou vystínovány. Je třeba 20 zdůraznit, že uvedené sekvence zesilujícího peptidu mohou být použity buď jako N-koncové, C-koncové nebo N- a C-koncové přídavky. Navíc mohou být zesilující peptidové sekvence přidány k polypeptidovému jádru v dopředně nebo reverzní orientaci, jednotlivě nebo v jakékoli možné kombinaci, aby se dosáhlo zesílení 25 farmakokinetických vlastností peptidu.
Obr. 2A. Zesilující peptidové sekvence odvozené od různých sekvencí obalového proteinu (gp41) reprezentující N-koncovou interaktivní oblast pozorovanou ve všech dosud publikovaných izolovaných sekvencích HIV-1, HIV-2 a SIV. Konečná sekvence 30 „WXXWXXXr označuje dohodnutou sekvenci. - 8 ♦♦ ♦♦♦· - 8 ♦♦ ♦♦♦· ·· · • · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ·· ♦* ····
Obr. 2B. Zesilující varianty peptidových sekvencí odvozené od různých sekvencí obalového proteinu (gp41) reprezentující C-koncovou interaktivní oblast pozorovanou ve všech dosud publikovaných izolovaných sekvencích HIV-1, HIV-2 a SIV. Konečná 5 sekvence „WXXXWXWX“ označuje dohodnutou sekvenci.
Obr. 3. Porovnání titrů HIV-1 ve tkáních myší SCID-HuPBMC infikovaných HIV-1 9320 při měření hladin P24 v testech společné kultivace HuPBMC. Tento obrázek ukazuje srovnání inhibice virů T20 a T1249 in vivo. io Obr. 4A - 4B. Farmakokinetický profil v plasmě T1249 proti kontrolnímu jádru T1387 u krys CD po i.v. injekci do 2 hod (obr. 4A) a 8 hod (obr. 4B). Polypeptid T1387 je polypeptidové jádro a polypeptid T1249 je polypeptidové jádro navázané na zesilující peptidové sekvence. 15 Obr. 5. Farmakokinetický profil v plasmě polypeptidu T1249 proti kontrole T20 u krys CD po i.v. podání. Polypeptid T1249 je hybridní polypeptid polypeptidového jádra (T1387) navázaný na zesilující peptidové sekvence. T20: n = 4; T1249: n = 3.
Obr. 6. Porovnání aktivity a cytotoxicity T20/T1249 anti-HIV- 20 1/lllb.
Obr. 7. Přímá vazba polypeptidu T1249 na konstrukt gp41 Μ41Δ178. 125I-T1249 byl čištěný HPLC na maximální specifickou aktivitu. Je ukázána saturační vazba na Μ41Δ178 (fúzní protein ektodomény gp41 postrádající T20 aminokyselinovou sekvenci) 25 imobilizovaný v mikrotitračních destičkách při koncentraci 0,5 mg/ml.
Obr. 8. Časový průběh asociace/disociace T1249. Tyto výsledky ukazují, že 125I-T1249 a 125I-T20 mají podobné vazebné afinity velikosti 1 až 2 nM. Rychlosti počátečního náběhu a poklesu pro 125I-T1249 byly podstatně nižší než rychlosti 125I-T20. Disociace navázaného • · ·· ···· ♦· ·· • I t · · ♦ ♦ t » « t • ·· ·· · t · “ν’ · * · ·····« ·«····· ·· ·· ·· ···· radioligancu byla měřena po přidání neznačeného peptidu na konečnou koncentraci 10 pm v 1/10 celkového objemu testu.
Obr. 9. Soutěžení o vazbu T1249 na Μ41Δ178. Neznačené T1249 a T20 byly titrovány v přítomnosti jedno koncentrace buď 125J-5 T1249 nebo 125I-T20. Ligand byl přidán pro zahájení inkubace těsně po přidání neznačeného peptidu.
Obr. 10A - 10B. Farmakokinetická profil v plasmě hybridních polypeptidů RSV T1301 (10A) a T1302 (10B) proti T786 u krys CD.
Obr. 11 A. Test snížení plaků. Hybridní polypeptid T1293 je io schopen inhibovat infekci virem RSV s hodnotou IC50 2,6 pg/ml.
Obr. 11B. Test snížení plaků ukazuje schopnost hybridních polypeptidů RSV T1301, T1302 a T1303 inhibovat infekci RSV.
Obr. 12A a 12B. Farmakokinetický profil hybridního polypeptidů luteinizačního hormonu T1324 proti T1323 u samců krys CD. 15 Polypeptid T1323 je polypeptidové jádro luteinizačního hormonu a polypeptid T1324 je hybridní polypeptid obsahující polypeptidové jádro navázané na zesilující peptidové sekvence.
Obr. 13A - D. Sekvence hybridního polypeptidů odvozené od různých polypeptidových jader. Sekvence polypeptidových jader jsou 20 ukázány vystínované. Nevystínované aminokoncové a karboxykoncové sekvence představují zesilující peptidové sekvence.
Obr. 14A - B. Spektra cirkulárního dichroismu (CD) pro T1249 v roztoku (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, pH 7) samotný (10 μΜ při 1 °C; obr. 14A) a v kombinaci s peptidem o délce 45 zbytků 25 z vazebné domény HR1 gp41 (T1346); plné čtverečky () znamenají teoretické spektrum CD předpovězené pro „model bez interakce", zatímco skutečná spektra CD jsou reprezentována plnými kroužky (·).
Obr. 15. Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu ukazující ochranu T1249 konstruktu gp41 Μ41Δ178 ze štěpení proteinázou-K; - 10 - 10 ·· ♦·· · #· · ·· ♦♦ • ♦ · · ·»·· • · ♦ · · · · · • · · · · « · « · ♦ t · · · ♦ ι « · « ·♦ ···· «· «· ·ψ «··· dráha 1: primerový markér; dráha 2; neštěpený Μ41Δ178; dráha 3: Μ41Δ178 inkubovaný s proteinázou-K; dráha 4: neštěpený T1249; dráha 5: T1249 inkubovaný s proteinázou-K; dráha 6: Μ41Δ178 inkubovaný s T1249; dráha 7: inkubace T1249 a Μ41Δ178 před 5 přídavkem proteinázy K.
Obr. 16A - C. Farmakokinetické vlastnosti T1249 v aibinotických krysách Sprague-Dawley; obr. 16A: farmakokinetické vlastnosti T1249 při jediné podané dávce kontinuální subkutánní infuzí; obr. 16B: farmakokinetické vlastnosti v plasmě T1249 podaného subkutánní io injekcí (s.c.) nebo intravenózní injekcí (i.v.); obr. 16C: kinetická analýza T1249 v lymfě a plasmě po intravenózním podání.
Obr. 17A - B.Farmakokinetické vlastnosti T1249 u opic cynomologus; obr. 17A: farmakokinetické vlastnosti v plasmě jediné dávky 0,8 mg/kg T1249 subkutánní (s.c.), intravenózní (i.v.) nebo 15 intramuskulární (i.m.) injekcí; obr. 17B: farmakokinetické vlastnosti v plasmě u subkutánně podaného T1249 při třech různých dávkách (0,4 mg/kg, 0,8 mg/kg a 1,6 mg/kg).
Obr. 18A - 18D. Antivirová aktivita peptidů DP397 (—□—), T649 (—O—) a T1249 (—Δ—) u různých T649 rezistentních kmenů HIV-1 20 při testování testem infekčnosti Magi-CCR-5; plná (horní) a čárkovaná (dolní) vodorovná čára na každém obrázku označuje hladiny 50%, popřípadě 90% snížení infekce HIV-1;· obr. 18A: antivirová aktivita DP397, T649 a T1249 u kmene HIV-1 RF-649; obr. 18B: antivirová aktivita DP397, T649 a T1249 u kmene HIV-1 DH012-649; obr. 18C: 25 antivirová aktivita DP397, T649 a T1249 u kmene HIV-1 3’ETVQQQ; obr. 18D: antivirová aktivita DP397, T649 a T1249 u kmene HIV-1 SIM-649. - 11 • ·· ·· ·#·· »· ·Φ ·· · · t ♦ · #»· · • · · · · · « « • · · · · ···· « • · · · · · · · · ··· *··· ·· ·· ·* ···· 5. Podrobný popis vynálezu
Popisují se peptidové sekvence označované jako zesilující peptidové sekvence odvozené od různých proteinových sekvencí retrovirového obalu (gp41), které jsou schopny zesilovat 5 farmakokinetické vlastnosti polypeptidových jader, ke kterým jsou připojeny. Tyto zesilující peptidové sekvence mohou být použity při způsobech zesílení farmakokinetických vlastností kteréhokoli polypeptidového jádra prostřednictvím navázání zesilujících peptidových sekvencí na polypeptidové jádro, za vytvoření hybridního io polypeptidu se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi ve srovnání se samotným polypeptidovým jádrem. Může být také zvýšen poločas in vitro polypeptidového jádra, na které byly zesilující peptidová sekvence nebo více těchto sekvencí navázány. Navázané zesilující peptidové sekvence mohou například zvýšit poločas polypeptidového 15 jádra, jestliže je přítomno v buněčné kultuře, tkáňové kultuře nebo vzorcích tkáně pacienta, jako jsou buňky, tkáně nebo jiné vzorky.
Polypeptidová jádra hybridních polypeptidů podle vynálezu zahrnují jakýkoli peptid, který může být zaveden do živého systému, například jakýkoli peptid, který může fungovat jako terapeutický nebo 20 preventivní prostředek použitelný pro léčení nebo prevenci onemocnění, nebo jako zobrazovací prostředek použitelný pro zobrazování struktur in vivo.
Popisují se zde také peptidy včetně peptidů, které obsahují zesilující peptidové sekvence, které mají antifuzogenní a/nebo 25 antivirové účinky. Dále se popisují způsoby použití těchto peptidů včetně způsobů snížení nebo inhibice virové infekce, a/nebo vírem indukované buněčné fúze. • ·<* ·♦ ··*· 99 tt Φ9 9 9 φ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ”12” · ·**·*·· ··· ··· ···· ·· ·· ·· ···· 5.1 Hybridní polypeptidv
Hybridní polypeptidy podle vynálezu obsahují alespoň jednu zesilující peptidovou sekvenci a polypeptidové jádro. Hybridní polypeptidy podle vynálezu obsahují s výhodou alespoň dvě zesilující 5 peptidové sekvence a polypeptid jádra, přičemž alespoň jeden zesilující peptid je v hybridním polypeptidu přítomen na aminovém konci vzhledem k polypeptidu jádra, a alespoň jedna zesilující peptidová sekvence je v hybridním polypeptidu přítomna na karboxylovém konci vzhledem k polypeptidu jádra. io Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu zahrnují peptidové sekvence odvozené původně od různých proteinových sekvencí retrovirového obalu (gp 41), včetně sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV, a jejich dále popisované specifické variace nebo modifikace. Polypeptidové jádro může obsahovat jakoukoli peptidovou sekvenci, 15 s výhodou jakoukoli peptidovou sekvenci, která může být zavedena do živého systému, včetně například peptidů použitelných pro terapeutické, profylaktické nebo zobrazovací účely.
Hybridní polypeptid bude mít typicky délku v rozmezí přibližně 10 až přibližně 500 aminokyselinových zbytků, přičemž výhodná je 20 délka přibližně 10 až přibližně 100 aminokyselinových zbytků, a nejvýhodnější je délka přibližně 10 až přibližně 40 aminokyselinových zbytků.
Aniž by si autoři přáli být vázáni jakoukoli konkrétní teorií, struktura obalového proteinu je taková, že domnělá oblast a-25 šroubovice umístěná v C-koncové oblasti proteinu se podle předpokladů asociuje s oblastí leucinového zipu umístěnou v N-koncové oblasti proteinu. Uspořádání N-koncové a C-koncové zesilující peptidové sekvence oblastí gp41 bylo pozorováno u všech v současnosti publikovaných izolovaných sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV 30 konvenčních aminokyselinových sekvencí.
Byly konkrétně identifikovány následující konvenční aminokyselinové sekvence reprezentující konvenční zesilující peptidové sekvence (konvenční sekvence jsou dále uvedeny v dopředných (forward, tj. ve směru 5' 3' příslušného genu) a 5 reverzních (reverse, tj. ve směru 3' 5' příslušného genu) orientacích, protože tyto zesilující peptidové sekvence mohou být použity buď v dopředně nebo reverzní orientaci: „WXXWXX11, „WXXWXXX11, „WXXWX“, „WXXW“, „WXXXWXWX“, „XXXWXWX“, „XXWXWX", „XWXWX", „WXXXWX“, „WXXXW“, „IXXXWXXW", 10 „XXXWXXW", „WXWX“, „WXXXWXW“, „XXWXXW", „XWXXW“, „XWXWXXXW“, „XWXWXXX", „XWXWXX“, „XWXWX“, „XWXW“, „WXWXXXW" nebo „XWXXXW11, kde X může být jakákoli aminokyselina, W znamená tryptofan a I znamená isoleucin. Dopředně orientace konvenčních aminokyselinových sekvencí jsou ukázány v 15 obr. 1 a 2. 20 • ·» · + ·· . ·· ·· · · • • # • t • · • · t • • • • • · · • * • · • * t • ♦ • « • · • ' • • · + · »«·« ·· ·· ····
Zesilující peptidová sekvence bude mít typicky délku přibližně 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 nebo 30 aminokyselinových zbytků, kde výhodná je délka přibližně 4 až přibližně 20 zbytků, výhodnější je délka přibližně 4 až přibližně 10 zbytků a nejvýhodnější je délka přibližně 6 až přibližně 8 zbytků.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahují zesilující peptidové sekvence, které mohou být použity pro zlepšení farmakokinetických vlastností výsledných hybridních polypeptidů, specifické zesilující 25 peptidové sekvence ukázané na obr. 2, 13, a v tabulce 1 níže. Mezi nejvýhodnějšími zesilujícími peptidovými sekvencemi jsou sekvence obsahující následující aminokyselinovou sekvenci: „WQEWEQKI11 a „WASLWEWF“.
Jako neomezující příklad uvádí tabulka 1 níže aminokyselinové 30 sekvence, které představují výhodná provedení zesilujících peptidových sekvencí mezi peptidovými sekvencemi podle vynálezu. - 14 - 14 ··»· • »» #· · · • » • · • ·
• ft · »IM • « # · · • · • · · ft * · · Μ ·· • « * · • · ♦ t » » • · · ·· #·*·
Je třeba rozumět, že zatímco dopředně orientace těchto sekvencí je znázorněna níže, do rámce předkládaného vynálezu spadá také reverzní orientace sekvencí. Například jestliže je dále znázorněna dopředná orientace zesilující peptidové sekvence „WMEWDREl·1, její 5 reverzní orientace, tj. „IERDWEMW“, má být do vynálezu zahrnuta také.
Tabulka 1
WMEWDREl io WQEWERKV
WQEWEQKV MTWMEWDREI NNMTWMEWDREI WQEWEQKVRYLEANI 15 N N MTWQ EWEZKVRYLEANI
WNWFI
WQEWDREISNYTSLl WQEWEREISAYTSLI WQEWDREI 20 WQEWEI
WNWF WQEW WQAW WQEWEQKI 25 WASLWNWF
WASLFNFF WDVFTNWL WASLWEWF ' EWASLWEWF 30 WEWF
EWEWF
IEWEWF
IEWEW
EWEW
WASLWEWF
WAGLWEWF
AKWASLWEWF
AEWASLWEWF
WASLWAWF
AEWASLWAWF
AKWASLWAWF
WAGLWAWF
AEWAGLWAWF
WASLWAW
AEWASLWAW
WAGLWAW
AEWAGLWAW
DKWEWF
IEWASLWEWF
IKWASLWEWF
DEWEWF
GGWASLWNWF
GGWNWF V dalším výhodném provedení obsahují konkrétní zesilující peptidové sekvence podle vynálezu zesilující sekvence znázorněné na obr. 2, 13 a v tabulce 1, které obsahují konzervativní substituce aminokyselin v jedné, dvou nebo třech polohách, kde uvedené substituce nezmenšují schopnost zesilující peptidové sekvence zlepšovat farmakokinetické vlastnosti hybridního polypeptidu vzhledem k odpovídajícímu polypeptidovému jádru.
Nejvýhodnější je, jestliže tyto substituce vedou k zesilujícím peptidovým sekvencím, které spadají do některé z konvenčních - 16 • 9* 90 00 ·* ·#·* ♦ · » * • 9 • 0 9 0 009 0000 9 · 1 · • · • · · ·· • 0 9 O 0 0 9 09 0 9 0 9 9 9 9 900 9 9 9 sekvencí zesilujících peptidových sekvencí. Obecně se substituce tedy provádějí na aminokyselinových zbytcích odpovídajících polohám „X“ znázorněných u konvenčních aminokyselinových sekvencí uvedených výše, a v obr. 1 a 2. „Konzervativní substituce" označují substituce aminokyselinovými zbytky s podobnými vlastnostmi z hlediska náboje, velikosti a/nebo hydrofobních/hydrofílních vlastností, jako substituovaný aminokyselinový zbytek. Tyto vlastnosti aminokyselin jsou odborníkům v oboru dobře známé. Předkládaný vynález dále poskytuje zesilující peptidové sekvence obsahující aminokyselinové sekvence z obr. 1, 2, 13 a tabulky 1, které jsou jinak stejné, ale takové zesilující peptidové sekvence obsahují jednu nebo více adicí aminokyselin (obecně ne více než v délce přibližně 15 aminokyselin), delecí (například zkrácení na aminovém nebo jiném konci), nebo nekonzervativní substituce, které však nezmenšují schopnost výsledného zesilujícího peptidu zlepšovat farmakokinetické vlastnosti polypeptidových jader, na která jsou navázány, ve srovnáni s polypeptidovými jádry, která tyto zesilující peptidové sekvence neobsahují. Adice nejsou obecně větší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků a mohou obsahovat adice 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 za sebou následujících aminokyselinových zbytků. Celkový počet aminokyselinových zbytků přidaných k původnímu zesilujícímu peptidu není s výhodou vyšší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků, výhodněji není větší než přibližně 5 aminokyselinových zbytků.
Delece nejsou s výhodou větší než přibližně celkem 3 aminokyselinové zbytky (buď za sebou následujících nebo jiných zbytků), lépe 2 aminokyselinové zbytky, nejvýhodněji delece jediných aminokyselinových zbytků. Obecně budou delece aminokyselinových zbytků odpovídat zbytkům „X“ zesilujících konvenčních peptidových sekvencí. - 17 • · • I ·· ··· · •v *
Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu také obsahují konkrétní zesilující peptidové sekvence znázorněné v obr. 2, 13 a v tabulce 1, které obsahují jednu, dvě nebo tři nekonzervativní substituce aminokyselin, přičemž výhodné jsou dvě takové substituce, 5 a nejvýhodnější je jedna taková substituce. „Nekonzervativní11 substituce označují substituce aminokyselinovými zbytky, které nemají podobný náboj, velikost a/nebo hydrofobně-hydrofilní vlastnosti jako nahrazované aminokyselinové zbytky. Tyto vlastnosti aminokyselin jsou odborníkům v oboru dobře známy. io Navíc substituce aminokyselin nemusí být, a v některých případech s výhodou nejsou, omezeny na geneticky kódované aminokyseliny. Peptidy mohou ovšem obsahovat geneticky nekódované aminokyseliny. Navíc k přirozeně se vyskytujícím geneticky kódovaným aminokyselinám mohou být tedy 15 aminokyselinové zbytky v peptidech substituovány v přírodě se vyskytujícími nekódovanými aminokyselinami a syntetickými aminokyselinami. Takové substituce mohou být také přítomny v polypeptidových jádrech hybridních polypeptidů podle vynálezu, ať už jsou přítomny v zesilující sekvenci nebo sekvencích určitého 20 hybridního polypeptidů, nebo nejsou. Některé běžně používané aminokyseliny, které poskytují použitelné substituce, zahrnují bez omezení β-alanin (β-Ala) a další omega-aminokyseliny jako je kyselina 3-aminopropionová, kyselina 2,3-diaminopropionová (Dpr), kyselina 4-aminomáselná atd.; kyselina 25 α-aminoisomáselná (Aib); kyselina ε-aminohexanová (Aha); kyselina β-aminovalerová (Ava); N-methylglycin nebo sarkosin (MeGly); ornithin (Orn); citrulin (Cit); t-butylalanin (t-BuA); t-butylgl-ycin (t-BuG); N-methylisoleucin (Melle); fenylglycin (Phg); cyklohexylalanin (Cha); norleucin (Nle); naftylalanin (Nal); 4-chlorfenylalanin (Phe(4-CI)); 2-30 fluorfenylalanin (Phe(2-F)); 3-fluorfenylalanin (Phe(3-F)); 4- fluorfenylalanin (Phe(4-F)); penicilamin (Pen); kyselina 1,2,3,4- - 18 - 18
·· ·· • · ♦ * · • · » • · · · · • · · · • · · · · · • · · · -tetrahydroisochinolin-3-karboxylová (Tic); β-2-thienylaianin (Thi); methioninsulfoxid (MSO); homoarginin (hArg); N-acetyllysin (AcLys); kyselina 2,4-diaminomáselná (Dbu); kyselina 2,3-diaminomáselná (Dab); p-aminofenylalanin (Phe(pNH2)); N-methylvalin (MeVal); 5 homocystein (hCys), homofenylalanin (hPhe) a homoserin (hSer); hydroxyprolin (Hyp), homoprolin (hPro), methylované aminokyseliny, cyklické analogy aminokyselin (používané například pro omezení aminokyselinových zbytků do určitých konformačních stavů, například acx‘- a ββ'-substituované cyklické aminokyseliny, jako je kyselina 1-io -aminocyklopentankarboxylová (cykloleucin) a kyselina β,β- -cyklopentamethylen-β-merkaptopropionová (viz např. Hrubý a další, 1990, Biochem. J. 268: 249 - 262) a peptoidy nebo oligopeptoidy (N-substituované aminokyseliny, např. N-substituované glyciny; viz např. Simon a další, 1972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9367 -9371).) 15 I když ve většině případů budou aminokyseliny peptidu substituovány L-enantiomerními aminokyselinami, substituce nejsou na L-enantiomerní aminokyseliny omezeny. V definici jsou tedy také zahrnuty „mutované" nebo „pozměněné" formy, kde L-aminokyselina je nahrazena identickou D-aminokyselinou (např. L-Arg - D-Arg), nebo D-20 aminokyselinou stejné kategorie nebo subkategorie (například L-Arg -D-Lys), a naopak. Tyto substituce mohou být také přítomny uvnitř . polypeptidových jader hybridních polypeptidů podle vynálezu, ať už jsou přítomny v zesilující sekvenci nebo sekvencích určitého hybridního polypeptidů nebo nejsou. 25 Navíc k výše popsaným substitucím aminokyselin mohou být provedeny náhrady skupin postranního řetězce, například zavedením methylové skupiny nebo pseudoisosterické skupiny s rozdílnými elektronovými vlastnostmi (viz například Hrubý a další, 1990, Biochem. J. 268: 249 - 262). Navíc mohou být mezi sousedními atomy uhlíku 30 aminokyselin zavedeny dvojné vazby a mohou být vytvořeny cyklické peptidy nebo analogy zavedením kovalentních vazeb, jako je vytvoření - 19 - 19 • · ·· « « ♦· ·· « 4 ♦ · · • ♦ · • · · · · · ··· ··· ···· ·· ·· ·« ···· amidové vazby mezi C-konci, mezi dvěma postranními řetězci nebo mezi postranním řetězcem a N- nebo C-koncem peptidu. Tyto substituce mohou být také přítomny uvnitř polypeptidového jádra hybridních polypeptidů podle vynálezu, ať už jsou přítomny v zesilující 5 sekvenci nebo sekvencích určitého hybridního polypeptidů, nebo nejsou.
Polypeptidové jádro a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také konjugovány s jednou nebo více chemickými skupinami. Chemické skupiny používané pro konjugaci nejsou io s výhodou výrazně toxické nebo imunogenní, tj. jakákoli toxicita nebo imunogenicita pozorovaná u konjugátu jádra nebo hybridního polypeptidů, není významně (tj. méně než 50 %) vyšší než případná toxicita nebo imunogenicita pozorovaná u odpovídajícího nemodifikovaného polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidů. 15 Chemické modifikace jádra a/nebo hybridních polypeptidů mají ovlivňovat farmakokinetické vlastnosti polypeptidů. Mezi tyto účinky patří snížení nebo zvýšení účinnosti léčiva, stability, biologické aktivity, vylučování, imunogenicity a poločasu in vivo, stejně jako účinky na katabolizaci, dopravu a lokalizaci polypeptidů. 20 V jednom provedení jsou hybridní polypeptidy konjugovány s jednou nebo více chemickými skupinami jak na části jádra, tak i na části zesilujícího polypeptidů. V dalším provedení jsou tyto modifikace provedeny na polypeptidovém jádru nebo částech zesilujícího peptidu hybridních polypeptidů. V ještě dalším provedení je modifikována 25 pouze část polypeptidového jádra hybridního polypeptidů. V ještě dalším provedení je polypeptid jádra modifikován jednou nebo více chemickými skupinami, přičemž tento polypeptid jádra není přítomen jako část hybridního polypeptidů. Například polypeptid jádra jako je T1387 (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2) může být 30 modifikován použitím jedné nebo více chemických skupin. - 20 - • ·· ·· ···· ·· « « · ♦ · • · · • · · · · ·
Mezi příklady chemických skupin použitelných pro konjugaci patří neproteinové polymery, jako jsou polyoly. Mezi další chemické skupiny patří proteiny, jako je například albumin nebo immunoglobulin, stejně jako uhlohydráty, jako jsou například uhlohydráty, které se 5 přirozeně vyskytují v glykoproteinech. Pro modifikaci proteinů byly také použity dextran, DL-aminokyseliny a polyvinylpyrrolidon. Pro přehled peptidů modifikovaných polymery viz např. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm. 51: 210 - 18 (1994), který se zařazuje ve svém celku odkazem.
Polypeptid může být například konjugován k jádru nebo io hybridnímu polypeptidu na jednom nebo více aminokyselinových zbytcích, včetně například zbytků lysinu, cysteinu a histidinu. Použitý poiyol může být jakýkoli ve vodě rozpustný poly(alkylenoxidový) polymer a může mít buď přímý nebo rozvětvený řetězec. Mezi vhodné polyoly patří sloučeniny substituované na jedné nebo více 15 hydroxylových skupinách chemickou skupinou jako je alkylová skupina obsahující mezi 1 a 4 atomy uhlíku. Typicky je polyolem poly(alkylenglykol), jako je poly(ethylenglykol) (PEG), a pro usnadnění popisu se tedy zbytek diskuse týká provedení, ve kterých je použitým polyolem PEG, a proces konjugace polyolu k jádru nebo hybridnímu 20 polypeptidu se nazývá „pegylace11. Odborníkům v oboru však bude zřejmé, že mohou být použity jiné polyoly, jako je například poly(propylenglykol) a kopolymery polyethylen-polypropylenglykol, s použitím technik konjugace popisovaných zde pro PEG. Pro přehled modifikací biologicky aktivních molekul pomocí PEG nebo jeho 25 derivátů viz např. Inada a další, Trends Biotechnol. 13: 86 - 91 (1995), který se zařazuje ve svém celku odkazem.
Stupeň pegylace polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu podle předkládaného vynálezu může být nastaven tak, aby se dosáhlo vhodného zvýšení poločasu in vivo ve srovnání 30 s odpovídajícím nepegylovaným proteinem. Poločas pegylovaného jádra nebo hybridního polypeptidu se může postupně zvyšovat se - 21 - ·· ··· · ·· · vzrůstajícím stupněm pegylace. Bylo ukázáno, že modifikace proteinů pomocí PEG nebo derivátů PEG zvyšuje žádoucím způsobem účinnost léčiva, biologickou aktivitu, stabilitu (včetně rezistence proti teplu, chemickým denaturujícím látkám a proteolýze), absorpci/příjem in vivo 5 a poločas in vivo, stejně jako žádoucím způsobem snižuje rychlosti vylučování a imunogenicitu (US patent No. 6,025,325; Westerman a další, Int. J. Cancer 76: 842 - 50 (1998); Conover a další, Artif. Organs 21: 907 - 15 (1997); Tsutsumi a další, J. Pharmacol. Exp. Ther. 278; 1006 - 11 (1996); Kaneda a další, Invasion Metastasis 15: io 156 - 62 (1995); Inada a další, Trends Biotechnol. 13: 86 - 91 (1995); Paige a další, Pharm. Res. 12: 1883 - 88 (1995); Satake-lshikawa a další, Cell Struct.Funct. 17: 157 - 60 (1992); Tanaka a další, Cancer Res. 51: 3710 - 3714 (1991), které jsou zařazeny ve svém celku odkazem). 15 Průměrná molekulová hmotnost PEG může být od přibližně 500 do přibližně 30 000 daltonů (D); s výhodou od přibližně 1000 do přibližně 25 000 D; a nejvýhodněji od přibližně 4000 do přibližně 20 000 D. V jednom provedení se pegylace provádí použitím PEG s průměrnou molekulovou hmotností přibližně 5000 D (dále označován 20 jako „PEG (5000)“). V dalším provedení má PEG s rozvětveným řetězcem dva řetězce po přibližně 10 000 D.
Preparáty PEG, které jsou komerčně dostupné a vhodné pro použití v předkládaném vynálezu, jsou nehomogenní preparáty, které jsou dodávány pod průměrnou molekulovou hmotností. Například 25 preparáty PEG (5000) typicky obsahují molekuly, které mají mírně odlišnou molekulovou hmotnost, obvykle ± 500 D. Byla popsána řada metod pro pegylaci proteinů, viz např. US patent No. 4,179,337, který se zařazuje ve svém celku odkazem, které popisují konjugaci celé řady hormonů a enzymů k PEG a polypropylenglykolu pro získání 3o fyziologicky aktivních neimunogenních prostředků. Reakční podmínky pro vazbu PEG na protein se liší v závislosti na cílovém proteinu, ·· ···« • · požadovaném stupni pegylace, typu PEG nebo použitého derivátu, a cílovým bodem pro navázání. Mezi další vlastnosti patří stabilita, reaktivita a antigenicita vazby PEG. Obecně reaguje PEG obsahující alespoň jednu koncovou hydroxylovou skupinu s vazebným činidlem 5 za vytvoření aktivovaného PEG s koncovou reaktivní skupinou. Tato reaktivní skupina potom reaguje s a- a ε-aminy proteinů za vytvoření kovalentní vazby. Aminové skupiny mohou konjugovat s hydroxylovou skupinou PEG za vytvoření amidové vazby. Karboxylové skupiny mohou konjugovat s aminovými skupinami polypeptidového jádra nebo 10 hybridního polypeptidu za vytvoření amidové vazby a s hydroxylovou skupinou PEG za vytvoření esteru. Druhý konec molekuly PEG může být vhodně „blokován11 nereaktivní chemickou skupinou jako je skupina methoxy pro vytvoření například alkylovaných PEG jako je methoxy-PEG (MPEG), který snižuje tvorbu komplexů proteinových molekul 15 zesítěných PEG.
Pro konjugaci polypeptidového jádra, zesilujících sekvencí nebo hybridního polypeptidu k PEG může být použito několik typů vazebných skupin známých v oboru. Pro příklady vazebných skupin viz např. US patent No. 4,609,546; US patent No. 4,847,325; US patent 20 No. 4,902,502; US patent No. 5,034,514; a US patent No. 5,122,614. V jednom provedení se jako vazebné skupiny používá zesilující peptidové sekvence.
Vhodně aktivované PEG mohou být produkovány řadou běžných reakcí. Například N-hydroxysukcinimidester PEG (M-NHS-PEG) může 25 být připraven z PEG-monomethyletheru (který je komerčně dostupný od firmy Union Karbide) reakcí s N,N’-dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a N-hydroxysukcinimidem (NHS), podle metody Buckmanna a Merra, Makromol. Chem., 182: 1379 - 1384 (1981).
Koncová hydroxylová skupina PEG může být navíc převedena 30 na aminovou skupinu, například reakcí s thionylbromidem za vytvoření PEG-Br, a další aminolýzou nadbytkem amoniaku za vytvoření PEG- 23 -
• · ··· · ·· ·« • · ♦ · · · · • · ♦ · · * ΝΗ2. PEG-NH2 se potom konjuguje s příslušným proteinem použitím standardních vazebných činidel, jako je Woodwardovo činidlo K. Navíc může být koncová skupina PEG -CH2OH převedena na aldehydovou skupinu, například oxidací Mn02. Aldehydová skupina se k proteinu 5 konjuguje redukční alkylací s činidlem jako je kyanoborohydrid. Aminokyseliny mohou být také na PEG navázány přes své aminové skupiny pomocí vhodné vazby, jako je například urethanová skupina. Aminokyselina norleucin, která se nevyskytuje v přírodě, může být aktivována na své karboxylové skupině za vytvoření sukcinimidylesteru 10 pro vazbu na aminové skupiny proteinu (Zalipsky a další, Int. J. Peptide Protein Res. 30: 740 (1987); Sartore a další, Appl. Biochem. Biotech. 27: 45 (1991)). Obecný přehled týkající se pegylace je možno nalézt například v Zalipsky a Lee, ,,Poly(EthylenGlycol)Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications11, J. M. Harris, ed., Plenům, 15 NY, kap. 21 (1992), který se zařazuje ve svém celku odkazem.
Alternativně je možno od různých dodavatelů získat PEG vhodné pro použití při předkládaném vynálezu, jako je bez omezení akrylát PEG, aldehyd PEG, allyl PEG, amino PEG, aminokyselina PEG, estery PEG s aminokyselinou, ω-amino-a-karboxyl PEG, benzotriazol 20 karbonát, biotin PEG, t-Boc PEG, karbonylimidazol PEG, karboxymethylovaný PEG, epoxid PEG, FMOC PEG, fluorescein PEG, hydrazid PEG, co-hydroxy α-amino PEG, ω-hydroxy α-karboxyl PEG, isokyanát PEG, maleimid PEG, methakrylátový ester PEG, NHS-maleimid, NHS-vinylsulfon, p-nitrofenylkarbonát PEG, 25 orthopyridyldisulfid, PEG2, fosfolipid PEG, kyselina přopionová PEG, silan PEG, sukcinát PEG, sukcinimidylbutanoát PEG (SBA-PEG), sukcinimidylester aminokyseliny PEG, sukcinimidylester karboxymethylovaného PEG, sukcinimidylpropionát PEG (SPA-PEG), sukcinimidylsukcinát PEG (SS-PEG), thiol PEG, vinylsulfon PEG. 30 Například firma Shearwater Polymers, lne. (Huntsville, Ala.) dodává M- • 9 9
NHS-PEG jako „SCM-PEG“ navíc k sukcinylkarbonátu MPEG („SC-PEG“) a sukcinimidylpropionátu MPEG („SPA-PEG").
Konkrétní aminokyseliny tvořící hybridní polypeptid nebo polypeptidové jádro mohou být modifikovány například pro zabránění 5 a/nebo umožnění pegylace určitých aminokyselinových zbytků. V jednom provedení mohou být potenciální místa pegylace inaktivována modifikací aminokyselinových zbytků, které mají být pegylovány. Například všechny aminokyselinové zbytky obsahující v polypeptidovém jádru nebo hybridním polypeptidu volnou io aminokyselinu, mohou být chráněny, čímž se zabrání pegylaci na těchto zbytcích. Mezi vhodné ochranné skupiny patří bez omezení terc-butoxykarbonyl (t-Boc) a N-9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc). Může být použita jakákoli ochranná skupina aminové skupiny vhodná pro syntézu peptidů. Několik takových ochranných skupin se popisuje 15 v publikaci Greene, Protective Grouos in Orqanic Svnthesis. John Wiley & Sons, New York, 1981, str. 323 - 334; a Fields a Noble, Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161 - 214 (1990), která se zařazuje ve svém celku odkazem. V případě potřeby mohou být ochranné skupiny následně odstraněny běžnými chemickými , postupy, například 20 působením piperidinu v dimethylformamidu v případě Fmoc, nebo působením kyseliny trifluoroctové v případě t-Boc.
Alternativně mohou být nahrazeny aminokyselinové zbytky polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu, které jsou náchylné k pegylaci, například místně specifickou mutagenezí, 25 aminokyselinovým zbytkem rezistentním k pegylaci. Navíc mohou být pro vytvoření hybridních polypeptidů použity zesilující peptidové sekvence postrádající aminokyselinové zbytky vnímavé k pegylaci. V dalším provedení mohou být jeden nebo více aminokyselinových zbytků polypeptidového jádra nebo hybridního 30 polypeptidu modifikovány tak, aby byla zavedena další pegylační místa. Například jeden nebo více aminokyselinových zbytků vnímavých - 25 - 25 ··♦ o .f . t
·· ·· * ti · » * · » · · » · · •f ·»·· k pegylaci mohou být nahrazeny nebo přidány do polypeptidu jakýmkoli v obořu známým způsobem, jako jsou standardní syntetické postupy, nebo v případě rekombinantních technik pomocí místně specifické mutageneze (Zoller a další, Nud. Acids Res. 10: 6487 5 (1987); Carter a další, Nud. Ádds Res. 13: 4331 (1986)).
Pegylace polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu může být také ovlivněna tak, aby došlo k navázání v určitém místě nebo aby byl ovlivněn stupeň pegylace. Pegylace pouze části možných pegylačních míst polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu io může být uskutečněna jakýmkoli v oboru známým způsobem. Například stupeň pegylace může být řízen reakčními podmínkami, například úpravou molárního poměru polypeptidu k PEG, trváním reakce nebo teplotou, při které se reakce provádí. Po vyčištění pegylovaného polypeptidu například iontoměničovou chromatografií 15 může být zjištěn stupeň pegylace například analýzou SDS-PAGE. Pegylovaný protein může být uchováván použitím jakéhokoli skladovacího média popsaného v oboru, například při -20 °C v pufru PBS (pH 7,3).
Tyto přístupy mohou být kombinovány pro řízení počtu a 20 umístění pegylačních míst podél polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu. Pegylace určitého aminokyselinového zbytku může být provedena kombinací metod chemické ochrany a pegylačních reakcí v průběhu syntézy polypeptidových jader, zesilujících polypeptidů nebo hybridních polypeptidů. Použití různých 25 ochranných skupin v kombinaci s navázáním nebo odstraněním ochranných skupin v různých okamžicích při syntéze peptidů umožní směrování jakéhokoli aminokyselinového zbytku nebo zbytků pro pegylaci. Tato technika může být tedy použita pro selektivní modifikaci u jakékoli chemické skupiny, . jakékoli části nebo specifického 30 aminokyselinového zbytku v polypeptidovém jádru, zesilujícím polypeptidu nebo hybridním polypeptidu. Například částečně - 26 • ·· *···«« ·· ·· ··<·· · · · · ♦ · · • · · · « t φ · • ···« · · · · * • · ······· *·# #··· ·· ·· ΙΦ φφφ Φ syntetizovaný oligopeptid může být chemicky chráněn použitím první ochranné skupiny pro zabránění pegylaci aminokyselinových zbytků, které by jinak byly k pegylaci náchylné. Syntéza polypeptidu může být potom dokončena použitím druhé ochranné skupiny, která by také 5 chránila aminokyselinové zbytky, které by jinak byly náchylné k pegylaci. Druhá ochranná skupina by měla být labilnější než první, takže po ukončení syntézy je možno labilní ochrannou skupinu selektivně odstranit, což umožní pegylaci pouze zbytků, ze kterých byly v tomto okamžiku odstraněny ochranné skupiny (Greene, 10' Protective Groups in Orqanic Svnthesis. John Wiley & Sons, New York, 1981). V jednom neomezujícím příkladu může být selektivně modifikován kterýkoli z aminokyselinových zbytků T1387 (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2), který je vnímavý k pegylaci 15 (např. zbytky lysinu). Například KLDK může být syntetizován a ε-ΝΗ2 skupina lysinových zbytků může být zbavena ochranných skupin a pegylována. Syntéza peptidu by se potom ukončila za získání polypeptidového jádra, ve kterém jsou pegylovány pouze dva ze tří lysinových zbytků. 20 V dalším neomezujícím příkladu může být modifikován lysinový zbytek, který se nachází na nejvíce N-koncové poloze T1387, syntézou NEYELQKLDK a navázáním méně labilní ochranné skupiny na skupiny ε-ΝΗ2 lysinových zbytků. Po ukončení syntézy proteinu, ve kterém je na nejvíce N-koncový lysin na jeho ε-ΝΗ2 skupinu navázána 25 labilnější ochranná skupina, se potom N-koncový lysin selektivně zbaví ochranné skupiny a pegyluje. Odborníkům v oboru by mělo být zřejmé, že strategie jako je tato mohou být použity pro selektivní modifikaci kteréhokoli cílového aminokyselinového zbytku nebo zbytků uvnitř polypeptidového jádra, zesilujícího polypeptidu nebo hybridního 30 polypeptidu. Tyto ochranné skupiny a jejich vlastnosti mohou být 27 - • ·· ·· ···* ·♦ «· ♦ ♦·* # t « * ψ 9 ♦ ♦ · · · · · · · • ···« « * « · # • · ··♦«··· ♦ ·· ·«·* ·· ·· ·· ···· nalezeny v literatuře, jako je Greene, Protective Groups in Orqanic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1981. K polypeptidovému jádru nebo hybridním polypeptidům mohou být také konjugovány jedna nebo více dalších aminokyselinových 5 sekvencí. Použitá aminokyselinová sekvence může být jakákoli aminokyselinová sekvence, která má dlouhý poločas, nebo jej může mít v kontextu s fúzním proteinem. V jednom provedení je použitý protein lidského původu. Ve výhodném provedení je protein lidský albumin. Odborníkům v oboru je však zřejmé, že s použitím způsobů io konjugace popisovaných zde pro albumin mohou být použity další proteiny, jako jsou například imunoglobuliny. Polypeptidové jádro, zesilující polypeptid nebo hybridní polypeptid mohou být například konjugovány se členem této rodiny imunoglobulinů nebo s fragmenty imunoglobulinů. V jednom provedení je polypeptidové jádro, zesilující 15 sekvence nebo hybridní polypeptid fúzován k doméně Fc lidského lgG1. V dalším provedení je polypeptid modifikován navázáním jak neproteinové polyolové modifikace, tak i modifikace založené na aminokyselinové sekvenci, jako jsou modifikace s použitím jak PEG, 20 tak i albuminu.
Aminokyselinové sekvence mohou být navázány buď na C-konec nebo N-konec polypeptidového jádra, zesilujícího polypeptidu nebo hybridního polypeptidu, nebo mohou být navázány jako postranní řetězce podél polypeptidu. Aminokyselinové sekvence mohou být 25 přidány k polypeptidovému jádru nebo hybridnímu polypeptidu buď v průběhu nebo po syntéze polypeptidu. Alternativně může být konstrukt navržen tak, aby poskytl fúzní protein, ve kterém je rekombinantní aminokyselinová sekvence navázána na polypeptidové jádro a/nebo hybridní polypeptid. Například albumin může být fúzován 30 ke každému z obou konců polypeptidového jádra. V případě potřeby mohou být potom umístěny na volném konci polypeptidového jádra • · · ♦ ♦ * · ♦ f ♦ * • ···« · ι · • · · · v ···· · a/nebo na konci navázaného rekombinantního proteinu zesilující peptidové sekvence. V jednom provedení mohou být aminokyselinové sekvence součástí, nebo mohou sloužit jako propojovací skupina mezi polypeptidovým jádrem a zesilujícími polypeptidy. 5 Bylo ukázáno, že modifikace proteinů fúzí s aminokyselinovými sekvencemi jako je albumin podstatně zvyšuje účinnost léčiva, stabilitu, biologickou aktivitu a poločas in vivo, stejně jako žádoucím způsobem snižuje vylučování a toxicitu (Kratz a další, Arch. Pharm. (Weinheim) 331: 47 - 53 (1998); Syed a další, Blood 89: 3243 - 3252 io (1997); Makrides a další, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534 - 42 (1996); Breton a další, Eur. J. Biochem. 231: 563 - 69 (1995); Paige a další, Pharm. Res. 12: 1883 -88 (1995).
Albumin je vysoce polymorfní, takže bylo identifikováno mnoho jeho variant (Weitkamp a další, Arm. Hum. Genet. 37: 219 (1973)). 15 Sekvence albuminu, například sekvence lidského albuminu, jsou odborníkům v oboru dobře známy (viz např. US patent No. 5,876,969, který se zařazuje ve svém celku odkazem). Sekvence albuminu, které mohou být využity pro tyto modifikace proteinů, mohou zahrnovat například pre-pro formy, úplné formy nebo jejich fragmenty (viz např. 20 Kratz a další, Arch. Pharm. (Weinheim) 331: 47 - 53 (1998); Syed a další, Blood 89: 3243 - 3252 (1997); Makrides a další, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534 - 42 (1996); Breton a další, Eur. J. Biochem. 231: 563 - 69 (1995); Paige a další, Pharm. Res. 12: 1883 - 88 (1995)). Sekvence albuminu mohou být k polypeptidům podle předkládaného 25 vynálezu přidány chemickou syntézou nebo rekombinantními metodami nebo jejich kombinací. V jednom neomezujícím příkladu může být fúzován úplný lidský albumin ve čtecím rámci k T1387 (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2) rekombinantními technikami. V dalším neomezujícím příkladu může být T1387 (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2), který byl pegylován, 30 - 29 Μ * *· ♦ · : ž •·*ι « 0 0 0 0 0 90 00 9 0 0 0 0 9 9 9 0 9 9 9 0 90 9009 konjugován s redukovaným lidským albuminem (dostupný u firmy Sigma Chemical, St. Louis), s použitím v oboru známých technik, jako například Paige a další, Pharm. Res. 12: 1883-88 (1995).
Modifikované polypeptidy mohou být testovány na biologickou 5 aktivitu, například antivirovou aktivitu, použitím standardních technik. Rutinně je také možno zjišťovat další takové vlastnosti, jako jsou například farmakokinetické nebo imunogenní vlastnosti modifikovaných polypeptidů. Modifikované polypeptidy mohou být také testovány in vitro a in vivo pro zjištění změn biologické odpovědi io v důsledku modifikace nebo modifikací. 5 - 30 10 15 20 25 30
Tabulka 2 • ·· ·♦···« ♦· Φ· ·* * · · · · **·« • · · · * · · · • · 9 * I 9 9 I 9 9 9 9 # 9 9 9 9 9 9 • 99 9999 99 ·9 99 9999 τ No. Sekvence_ 1 GIKQLQARILAVERYLKDQ 2 NNLLRAIEAQQHLLQLTVW 3 NEQELLELDKWASLWNWF 4 YTSLIHSLIEESQNQQEK 5 Ac-VWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWG-NH2 6 QHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ 7 LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV 8 VQQQNNLLARIEAQQHLLQLTVWGIKQL 9 RQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT 10 MTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQ 12 WSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL 13 LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY 15 Ac-VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNG-NH2 19 Ac-LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY-NH2 20 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 21 Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 22 Ac-IELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQST-NH; 23 Ac-IELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKY-NH2 24 Ac-ENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTEL-NH2 25 Ac-DAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQST-NH2 26 Ac-CNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH2 27 Ac-SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH2 28 Ac-ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGV-NH2 29 Ac-SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNG-NH2 30 Ac-VLHLEGEVNKIKSALLSTHKAVVSLSNGVSVLTSK-NH2 31 Ac-ARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHYLENEVARLKKLV-NH2 32 Ac-RMKQLEDKVEELLSKNYHYLENEVARLKKLVGER-NH2 33 Ac-VQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQL-NH2 34 Ac-LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV-NH2 35 Ac-QHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 36 Ac-RQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT-NH2 37 Ac-MTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQ-NH2 38 Ac-AKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSS-NH2 35 - 31 • ·· ·· ···· ·φ ·· ·· ♦ * · · · · ι t « • · · t · i· · • · · · · · « t · · • ♦ ♦ · * · ··· ♦ ♦♦ ···· ·· I# ·· ·««·
T
No. Sekvence__ 39 Ac-AAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSS-NH2 40 Ac-AKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVA-NH2 41 Ac-GTIALGVATSAQITAAVALVEAKQARSD-NH2 42 Ac-ATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEA-NH2 43 Ac-AAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKANH2 44 Ac-IEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVA-NH2 45 Ac-IRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVOQY-NH2 46 Ac-AVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEIV-NH2 47 Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLARILA -VERYLKDQ-NH2 48 Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQ-NH2 49 Ac-MTWMEMDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLELDK -WASLWNWF-NH2 50 Ac-WMEWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH2 51 Ac-INNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH2 52 Ac-INNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH2 53 Ac-EWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH2 54 Ac-QSRTLLAGIVQQQQQLLDWKRQQELLR-NH2 55 Ac-NNDTWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD-NH2 56 Ac-WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEK-NH2 57 ac-vdfleenitalleeaqiqqeknmyelqk-nh2 58 Ac-ITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-NH2 59 AC-SSESFTLLEQWNNWKLQLAEQWLEQINEKHYLEDIS-NH2 60 Ac-DKWASLWNWF-NH2 61 AC-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2 62 Ac-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 63 Ac-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 64 AC-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 65 Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 66 Ac-NDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIΙΚΕΕ-ΝΗ2 67 Ac-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 68 Ac-VSKGYSALRTGWYTSVITIELSNIKEN-NH2 69 Ac-WSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL-NH2 70 Ac-VNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSK-NH2 71 Ac-PIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR-NH2
- 32- 5 #♦ ··· · • ·· ·· · ♦ # · * « · « · ·· ·· • ·« · » · · • · · · · ♦···♦·· ·· ·· • · · ·· ···· 10 15 20 25 30 τNo. Sekvence _.____- 72 Ac-NLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQTAEA-NH2 7 3 Ac-LNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDASYRS-NH2 74 Ac-ELLVLKKAQLNRHSYLKDSDFLDAALD-NH2 7 5 Ac-LAEAGEESVTEDTEREDTEEEREDEEE-NH2 7 6 Ac-ALLAEAGEESVTEDTEREDTEEEREDEEEENEART-NH2 77 Ac-ETERSVDLVAALLAEAGEESVTEDTEREDTEEERE-NH2 78 Ac-EESVTEDTEREDTEEEREDEEEENEART-NH2 79 Ac-VDLVAALLAEAGEESVTEDTEREDTEEE-NH2 8 0 Ac-NSETERSVDLVAALLAEAGEESVTE-NH2 81 Ac-DISYAQLQFTYDVLKDYINDALRNIMDA-NH2 82 Ac-SNVFSKDEIMREYNSQKQHIRTLSAKVNDN-NH2 8 3 Biotín-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 84 Dig-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 8 5 Biotin-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 8 6 Dig-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 8 7 Ac-VLHQLNIQLKQYLETQERLLAGNRIAARQLLQIWKDVA-NH2 8 8 Ac-LWHEQLLNTAORAGLQLQLINQALAVREKVLIRYDIQK-NH2 89 Ac-LLDNFESTWEQSKELWEQQEISIQNLHKSALQEYW-NH2 90 Ac-LSNLLQISNNSDEWLEALEIEHEKWKLTQWQSYEQF-NH2 91 Ac-KLEALEGKLEALEGKLEALEGKLEALEGKLEALEGK-NH2 92 Ac-ELRALRGELRALRGELRALRGELRALRGK-NH2 9 3 Ac-ELKAKELEGEGLAEGEEALKGLLEKAAKLEGLELLK-NH2 9 4 Ac-WEAAAREAAAREAAAREAAARA-NH2 9 5 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF-NH2 9 6 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANWF-NH2 9 7 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLELDKWASLWNWF-NH2 9 8 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF-NH2 99 ' Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF-NH2 10 0 ac-rmkqledkveelsknyhlenevarlkklvger-nh2 101 Ac-QQLLQLTVWGIKQLQARI LAVERYLKNQ-NH2 102 Ac-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2 10 3 Ac-YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 104 Ac-IINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRK-NH2 105 Ac-INFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIMQSLAFIRKS-NH2 10 6 Ac-NFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSD-NH2 107 Ac-FYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDE-NH2 35 33 - »· ·« » · T No.
Sekvence 108 Ac 109 Ac 5 110 Ac 111 Ac 112 Ac 113 Ac 114 Ac 10 115 Ac 116 Ac 117 Ac 118 Ac 119 Ac 15 120 Ac 121 Ac 122 Ac 123 Ac 124 Ac 20 125 Ac 126 Ac 127 Ac 128 Ac 129 Ac 25 130 Ac 131 AC 132 Ac 133 Ac 134 Ac 30 135 Ac 136 Ac 137 Ac 138 Ac 139 Ac 35 140 Ac 141 Ac 142 Ac 143 Ac - 34 • · · ·· ·« · · ·· ·· ···· * · · ··«« • «·«· ·· · * · ♦ · * · 4 · « » I · ······· «·· ···· ·« ·· Μ |««« τΝο.
Sekvence 144 Ac . 145 Ac 5 146 Ac 147 Ac . 148 Ac 149 Ac 150 Ac 10 151 Ac 152 Ac 153 Ac 154 Ac 155 Ac 15 156 Ac 157 Ac 158 Ac 159 Ac 160 Ac 20 161 Ac 162 Ac 163 Ac 164 Ac 165 Ac 25 166 Ac 167 Ac 168 Ac 169 Ac 170 Ac 30 171 Ac 172 Ac 173 Ac 174 Ac 175 Ac 35 176 Ac 177 Ac 178 Ac 179 Ac τNo.
Sekvence 180 Ac 181 Ac 5 182 Ac 183 Ac 184 Ac 185 Ac 186 Ac 10 187 Ac 188 Ac 189 Ac 190 Ac 191 Ac 15 192 Ac 193 Ac 194 Ac 195 Ac 196 Ac 20 197 Ac 198 Ac 200 Ac 201 Ac 202 Ac 25 203 Ac 204 Ac 205 Ac 206 Ac 207 Ac 30 208 Ac 209 Ac 210 Ac 211 .Ac 212 Ac 35 213 Ac 214 Ac 215 Ac 216 Ac • «· ·» ··#· ·· ·· · · • • • • • * · • · • • • • • • • · · • • • • · • • • · ♦ *· ·# 9# • • ·· • · • · « • · • • Μ«· 2 2 2 2 2 - 36 - 36 • ·· »* >··· *· >· ·«·· ·· · · · · · • · · ♦ · · I » » » · * · · ··· ·«· ·ΙΜ ·· ·· ·· ····
T
No. Sekvence_ 217 Ac-YTSLIHSLIQQSQNQQQKNQQQLLQLNKWASLWNWF-NH2 218 Ac-EQELLELDKWASLWNWF-NH2 219 Ac-QELLELDKWASLWNWF-NH2 220 Ac-ELLELDKWASLWNWF-NH2 221 Ac-LELDKWASLWNWF-NH2 222 Ac-ELDKWASLWNWF-NH2 226 Ac-WASLWNWF-NH2 227 Ac-ASLWNWF-NH2 229 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANAA-NH2 230 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF-NH2 231 Ac-YTSLIQSLIEESQNQQEKNQQELLELDKWASLWNWF-NH2 234 Ac-EAAAREAAAREAAARLELDKWASLWNWF-NH2 236 Ac-PSLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSG-NH2 237 Ac-SLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGG-NH2 238 Ac-LRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGD-NH2 239 Ac-RDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDL-NH2 240 Ac-DPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLL-NH2 241 Ac-PISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLG-NH2 242 Ac-ISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGI-NH2 243 Ac-SAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGIL-NH2 244 Ac-AEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILE-NH2 245 Ac-EISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILES-NH2 246 Ac-ISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESR-NH2 247 Ac-SIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRG-NH2 248 Ac-IQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGI-NH2 24 9 Ac-QALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLC-ILESRGIK-NH2 250 Ac-ALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKA-NH2 251 Ac-LSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKAR-NH2 252 Ac-PDAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLED-NH2 253 Ac-DAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDA-NH2 254 Ac-AVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAK-NH2 255 Ac-VYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKE-NH2 256 Ac-YLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKEL-NH2 257 Ac-LHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELL-NH2 258 Ac-HRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLE-NH2 259 Ac-RIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLES-NH2 • ·· 4»» * ·· *· *· · « • • • • • P · • · » t • • • t • · # • • ♦ • · • • • · ♦ • • · • · é ··» *«·· ·· *· • · »**· τ
No. Sekvence_ 260 Ac-IDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESS-NH2 261 Ac-DLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSD-NH2 5 262 Ac-LGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLES SDQ-NH2 2 63 Ac-GPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLES SDQI-NH2 264 Ac-PPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQIL-NH2 265 Ac-PISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILR-NH2 266 Ac-ISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQIRS-NH2 10 267 Ac-SLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESS DQILRSM-NH2 268 Ac-LERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSMK-NH2 269 Ac-EWIRRSNQKLDSI-NH2 270 Ac-LELDKWASLANAF-NH2 271 Ac-LELDKWASLFNFF-NH2 15 272 Ac-LELDKWASLANWF-NH2 273 Ac-LELDKWASLWNAF-NH2 274 Ac-ELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTSTSA-NH2 275 Ac-TELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTSTS-NH2 276 Ac-STELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTST-NH2 20 277 Ac-ISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTS-NH2 278 Ac-DISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLT-NH2 279 Ac-LDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKL-NH2 280 Ac-NLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVK-NH2 281 Ac-GNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNV-NH2 25 282 Ac-TGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVN-NH2 283 Ac-VTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKV-NH2 284 Ac-IVTGNLDlSTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDK-NH2 285 Ac-VIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLD-NH2 286 Ac-QVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKL-NH2 30 287 AC-SQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEE'SNSK-NH2 288 Ac-DSQVIVTGNLDlSTELGNVNNSISNALDKLEESNS-NH2 289 Ac-LDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESN-NH2 290 Ac-ILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEES-NH2 291 Ac-SILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEE-NH2 35 292 Ac-ISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLE-NH2 293 Ac-NISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKL-NH2 294 Ac-KNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDK-NH2 , 295 Ac-QKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALD-NH2 - 38 - 4* ···· - 38 - 4* ···· • ·· ·· · 4 · • · · • · · # • · · ··« ···· ·· ·· » · · · 9 » • 4 · · 4 • « · · · 4 • · η · · · • 4 »4 ·· ····
T
No. Sekvence_ 2 96 Ac-YQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNAL-ŇH2 2 97 Ac-TYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNA-NH2 5 298 Ac-ATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISN-NH2 2 99 Ac-DATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNS IS- NH2 300 Ac-FDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSI-NH2. 301 Ac-Ε FDAT YQKNI S ILDSQVI VTGNLDI STELGNVNNS-NH2 302 Ac-GEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNN-NH2 10 303 Ac-SGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVN-NH2 304 Ac-LSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNV-NH2 305 Ac-RLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGN-NH2 30 6 Ac-LRLSGEFDATYQKNIS ILDSQVI VTGNLDI STELG-NH2 307 Ac-TLRLSGEFDATYQKNIS ILDSQVI VTGNLDI STEL-NH, 15 308 Ac-ITLRLSGEFDATYQKNI3ILDSQVIVTGNLDISTE-NH2 30 9 AC-GITLRLSGEFDATYQKNIS ILDSQVI VTGNLDI ST-NH2 310 Ac-TATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNNT-NH2 311 Ac-ITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNN-NH, 312 Ac-SITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFN-NH2 20 314 Ac-KESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQ-NH2 315 Ac-LKESITATIEAVHEVTDGL5QLAVAVGKMQQFVND-NH2 316 Ac-RLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVN-NH2 317 Ac-LRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFV-NH2 318 Ac-ILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQF-NH2 25 . 319 Ac-NILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQ-NH2 32 0 Ac-ANILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQ-NH2 321 Ac-AANILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKM-NH2 32 2 Ac-HKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGV-NH2 32 3 Ac-KCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVK-NH2 30 324 Ac-CDDECMNSVKNGTYDYPKY3EESKLNRNEIKGVKL-NH2 325 Ac-DDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLS-NH2 32 6 Ac-DECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSS-NH2 32 7 Ac-ECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSM-NH2 32 8 Ac-CMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMG-NH2 35 32 9 Ac-MNSVKNGTYDYPKYEEESXLNRNEIKGVKLSSMGV-NH2 3 30 Ac-NSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVY-NH2 331 Ac-SVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQ-NH2 3 32 Ac-VKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI-NH2 - 39 - • · - 39 - • · T No. 333 334 5 335 336 337 338 339 10 340 341 342 343 344 15 345 346 347 348 349 20 350 351 352 353 354 25 3 55 356 357 358 359 30 3 60 361 362 363 364 365 366 367 368 • · 0 t ·
Sekvence_ ac-kngtydypkyeeesklnrneikgvklssmgvyqil-nh2
Ac-AFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-WLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAI DNL-NH2 AC-VLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLR-NH2 Ac-LAGAALGVATAAQI TAGI ALHQSMLNSQAI DNLRA-NH2 Ac-AGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRAS-NH2 Ac-GAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASL-NH2 Ac-AALGVATAAQITAGI ALHQSMLNSQAIDNLRASLE-NH2 Ac-ALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLET-NH2 Ac-LGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETT-NH2 Ac-G VAT AAQITAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTN-NH2 Ac-VATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQ-NH2 Ac-ATAAQI TAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQA-NH2 Ac-TAAQ ITAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAI-NH2 Ac-AAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIE-NH2 Ac-AQI TAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAIEA-NH2 Ac-QITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAI-NH2 Ac-ITAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAIEAIR-NH2 Ac-TAGI ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAIEA.IRQ-NH2 Ac-AGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQA-NH2 Ac-GIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAG-NH2 Ac-I ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQ-NH2 Ac-ALHQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAI EAIRQAGQE-NH2 Ac-LHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEM-NH2 Ac-HQSMLNSQAI DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMI -NH2 AC-QSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMIL-NH2 AC-SMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILA-NH2 Ac-MLNSQAI DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAV-NH2 AC-LNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQ-NH2 Ac-NSQAI DNLRASLETTNQAI EAI RQAGQEMILAVQG-NH2 Ac-SQAI DNLRASLETTNQAI EAI RQAGQEMI LAVQGV-NH2 Ac-QAI DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQ-NH2 Ac-AI DNLRASLETTNQAI EAIRQAGQEMILAVQGVQD-NH2 Ac-IDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDY-NH2 Ac-DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDY.I-NH2 Ac-NLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYIN-NH2 35 - 40 ··· · • · T No. 369 370 5 371 372 373 374 375 10 376 377 378 379 381 15 382 383 38 4 385 386 20 38 7 388 389 390 391 25 392 393 394 395 396 30 397 398 399 400 401 35 4 02 403 405 406 • ···· ··
Sekvence__
Ac-LRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINN-NH2
Ac-RASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINNE-NH2
Ac-YTSVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYK-NH2
Ac-TSVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYKN-NH2
Ac-SVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYKNA-NH2
Ac-SNIKENKUNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH2
Ac-KENKUNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-NH2
Ac-CLELDKWASLWNWFC-NH2
Ac-CLELDKWASLANWFC-NH2
Ac-CLELDKWASLFNFFC-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF-NH2
Ac-RMKQLEDKVEELLSKNYHLENELELDKWASLWNWF-NH2
Ac-KVEELLSKNYHLENELELDKWASLWNWF-NH2
Ac-RMKQLEDKVEELLSKLEWIRRSNQKLDSI-NH2
Ac-RMKQLEDKVEELLSKLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-ELEALRGELRALRGELELDKWASLWNWF-NH2
Ac-LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI-NH2
Ac-CNEQLSDSFPVEFFQV-NH2
Ac-MAEDDPYLGRPEQMFHLDPSL-NH2
Ac-EDFSSIADMDFSALLSQISS-NH2
Ac-TWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQ-NH2
Ac-WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK-NH2
Ac-QEWERKVEFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL-NH2
Ac-EWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLN-NH2
Ac-WERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS-NH2
Ac-ERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW-NH2
Ac-RKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD-NH2
Ac-KVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDV-NH2
Ac-VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-NH2
Ac-DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFG-NH2
Ac-FLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGN-NH2
Ac-LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNW-NH2
Ac-LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWF-NH2
Ac-NEQSEEKENELYWAKEQLLDLLFNIFNQTVGAWIMQ-NH2
Ac-QQQLLDWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKD-NH2
Ac-QQLLDWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH2 • * v# ♦ - 41 - : .· ♦ ·· ····
Sekvence__
Ac-QQLLDWKRQQELLRLTVWG?KNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH2
Ac-DERKQDKVLWQQTGTLQLTLIQLEKTAKLQWVRLNRY-NH2
Ac-QQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKY-NH2 ac-qqlldwkrqqellrltvwgtknlqtrvtaiekyl-nh2 AC-QLLDWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLK-NH2 AC-LLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKD-NH2 AC-LDWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH2 AC-DWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQA-NH2
Ac-WKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQ-NH,
Ac-VKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQL-NH, AC-KRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLN-NH2 AC-RQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNA-NH2 AC-QQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAW-NH2 AC-QELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAWG-NH2 AC-ELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAQGC-NH2 AC-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGPKQLQARILAVERYLKDQ-NH2
Ac-SELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAK-NH2 AC-ELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKS-NH2 AC-LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSS-NH2 AC-EIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSE-NH2
Ac-IKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSEN-NH2 AC-KRYKNRVASRKCRAKFKQL1QHYREVAAAKSSEND-NH2
Ac-RYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDR-NH2
Ac-YKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRL-NH2
Ac-KNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLR-NH2
Ac-NRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRL-NH2
Ac-RVASRKCRAKFKQLLQHYRFVAAAKSSENDRLRLL-NH2
Ac-VASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL-NH2
Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK-NH2
Ac-SRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ-NH2
Ac-RKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQM-NH2
Ac-KCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC-NH2
Ac-CRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCP-NH2
Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPS-NH2
Ac-AKFKQLLQHYREVAAAKSSSNDRLRLLLKQMCPSL-NH2
Ac-KFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLD-NH2
τ No. 407 408 5 409 410 411 412 413 10 414 415 416 417 418 15 419 420 421 422 423 20 42 4 425 426 427 428 25 42 9 430 431 432 433 30 434 435 436 437 438 35 43 9 440 441 442 5 - 42 10 15 20 25 30 TNo. 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 534 •5 3 5 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550
• · · · · · · • · ·. · · · · • · · · · · ····
Sekvence_ Ac-FKQLLQHYREVAAADSSENDRLRLLLKQMCPSLDV-NH2 Ac-KQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVD-NH2 Ac-QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDS-NH2 Ac-LLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSI-NH2 Ac-LQHYREVAAAKS'SENDRLRLLLKQMCPSLDVDSII-NH2
Ac-QHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIP-NH2 Ac-HYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPR-NH2 Ac-YREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRT-NH2 Ac-REVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTP-NH2 Ac-EVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPD-NH2 Ac-VAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDV-NH2 Ac-AAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVL-NH2 Ac-AAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLH~NH2 Ac-AKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHE-NH2 Ac-KSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHED-NH2 Ac-SSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDL-NH2 Ac-SENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLL-NH2 Ac-ENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLN-NH2 Ac-NDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF-NH2 Ac-PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGML-NHz Ac-GYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLP-NH2 Ac-YRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPV-NH2 Ac-RWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVC-NH2 Ac-WMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCP-NH2 Ac-MCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPL-NH2 Ac-CLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLI-NH2 Ac-LRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIP-NH2 Ac-RRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPG-NH2 Ac-RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGS-NH2 Ac-FIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSS-NH2 Ac-IIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSST-NH2 Ac-IFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTT-NH2 Ac-FLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTS-NH2 Ac-LFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTST-NH2 Ac-FILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTG-NH2 Ac-ILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLI.PGSSTTSTGP-NH2 35 ·♦ I 10 15 20 25 30 - 43 - : • ·
τNo. Sekvence_ _ 551 Ac-LLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPC-NH2 552 Ac-LLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCR-NH2 553 Ac-LCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRT-NH2 554 Ac-CLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTC-NH2 555 Ac-LIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPGRTCM-NH2 . 556 Ac-IFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMT-NHz 557 Ac-FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT-NH2 558 ac-pplvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggt-nh2 559 Ac-LLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTT-NH2 560 Ac-LVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTV-NH2 561 Ac-VLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTT.VC-NH2 562 Ac-LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCL-NH2 563 Ac-QAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLG-NH2 5 64 Ac-AGFFLLTRILTIPQS'LDSWWTSLNFLGGTTVCLGQ-NH2 565 Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQN-NH2 566 Ac-FFLLTRILTIPQSLDS.WWTSLNFLGGTTVGLGQNS-NH2. 567 Ac-FLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQ-NH2 568 Ac-LLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQS-NH2 569 , Ac-LTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSP-NH2 570 Ac-FWNWLSAWKDLELKSLLEEVKDELQKMR-NH2 571 Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVW-NH2 572 Ac-CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 573 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 574 C13H27CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 575 Ac-AVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKUNGTDA-NH2 576 Ac-SISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVS-NH2 577 Ac-DQQIKQYKRLLDRLIIPLYDGLRQKDVIVSNQESN-NH2 578 Ac-YSELTNIFGDNIGSLQEKGIKLQGIASLYRTNITEI-NH2 579 Ac-TSITLQVRLPLLTRLLNTQIYRVDSISYNIQNREWY-NH2 580 Ac-VEIAEYRRLLRTVLEPIRDALNAMTQNIRPVQSVA-NH2 581 Ac-SYFIVLSIAYPTLSEIKGVIVHRLEGVSYNIGSQEW-NH2 582 Ac-LKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKS-NH2 583 nnllraieaqqhllqltvwgikqlqarilaverylkdq-nh2 583 nnllraieaqqhllqltvwgikqlqarilaverylkdq-nh2 584 QKQEPIDKELYPLTSL 585 YPKFVKQNTLKLAT 35 • · • ·
• · • · I - 44 τ
No. Sekvence_
586 QYIKANQKFIGITE
587 NGQIGNDPNRDILY
588 Ac-RPDVY-OH 589 CLELDKWASLWNWFC-(cyklický) 590 CLELDKWASLANWFC-(cyklický) 591 CLELDKWASLANFFC-(cyklický) 5 94 Ac-NNLLRAIEAQQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 595 Ac-CGGYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNNWF-NH2 59 6 Ac-PLLVLQAGFFLLTRILTI PQSLDSWWTSLNFLGGT-NH2 597 Ac-LLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTT-NH2 598 Ac-LVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTV-NH2 5 99 Ac-VLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVC-NH2 60 0 Ac-LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCL-NH2 601 Ac-QAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLG-NH2 602 Ac-AGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQ-NH2 603 Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQN-NH2 604 Ac-FFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNS-NH2 605 Ac-FLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQ-NH2 60 6 Ac-LLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQS - nh2 607 Ac-LTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSP-NH2 608 AC-LELDKWASLWNWA-NH2 609 Ac-LELDKWASAWNWF-NH2 610 Ac-LELDKAASLWNWF-NH2 611 Ac-LKLDKWASLWNWF-NH2 612 Ac-LELKKWASLWNWF-NH2 613 Ac-DELLHNVNAGKST-NH2 614 Ac-KS DELLHNVNAGKST-NH2 615 Ac-IRKSDELLHNVNAGKST-NH2 616 Ac-AFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 617 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFI-NH2 618 Ac-YAADKESTQKAFDGITNKVNS viekmntqfeavgke-nh2 619 Ac-SVIEKMNTQFEAVGKEFGNLERRLENLNKRMEDGFL-NH2 62 0 Ac-VWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQL-NH2 621 Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH2 622 Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH2 623 Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH2 5 - 45 10 15 20 25 30 • ♦· Μ I « • ' · ί .· • « · Μ·«
τNo. Sekvence_;____ 624 Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NHz 625 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE -LDKWASLWNWF-NH2 626 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH2 627 Ac-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIFI-NH2 627 Ac-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIFI-NH2 628 Ac-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIF-NH2 629 Ac-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKI-NH2 630 Ac-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH2 631 Ac-EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYI-NH2 632 Ac-IEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY-NH2 633 Ac-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLW-NH2 634 ' Ac-SLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWL-NH2 635 Ac-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNW-NH2- 636 Ac-IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITN-NH2 637 Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT-NHz 638 Ac-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH2 63 9 Ac-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN=-NH2 640 Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW-NH2 641 Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-NH2 642 Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-NH2 643 Ac-EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NHz 644 Ac-REINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-NH2 645 Ac-DREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA-NH2 646 Ac-WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-NHz 647 Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-NH2 648 Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-NH 649 Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2 650 Ac-TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH2 651 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NHz 652 Ac~NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2 653 Ac-NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH2 654 Ac-WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-NH2 655 Ac-IWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE-NH2 656 Ac-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN-NH2 657 Ac-EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH2 35 - 46
T
No. Sekvence _;___ 65 8 Ac-LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIH'SLIEESQNQQE-NH2 659 Ac-SLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQ-NH2 660 Ac-KSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQ-NH2 661 Ac-NKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQN-NH2 662 Ac-SLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 663 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRK-NH2 664 Ac-YTSLIHSLIEESQQQQEKQEQELLELDKWASLWNWF-NH2 6 65 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH2 666 Ac-FDAS isqvnekinqslafirksdellhnvna-nh2 667 Ac-FDAS ISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2 668 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH-NH2 669 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH2 67 0 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKS D-NH2 671 ' Ac-ASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 67 2 Ac-I SQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 673 Ac-QVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 674 Ac-NEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 675 Ac-KINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 676 Ac-NQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 677 Ac-FWNWLSAWKDLELYPGSLELDKWASLWNWF-NH2 67 8 Ac-CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 679 Ac-CGGYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
680 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
681 NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ 682 Ac-EKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQYGV-NH2 683 Ac-QEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQYG-NH2 684 Ac-QQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQY-NH2 685 Ac-IQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQ-NH2 686 Ac-QIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYI-NH2 687 Ac-AQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQY-NH2 688 Ac-QAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQ-NH2 689 Ac-EQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYI-NH2 690 Ac-LEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRY-NH2 691 Ac-SLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVR-NH2 692 Ac-QSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWV-NH2 693 Ac-SQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSW-NH2
- 47
* ·
T No. 694 695 5 696 697 699 700 701 10 702 703 704 705 706 15 707 708 709 20 710 711 712 713 714 25 715 716 718 719 720 30 721 722 723 72 4 725 35 72 6 727 728 729
Sekvence__
Ac-ISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTS-NH2
Ac-NISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFT-NH2
Ac-ANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDF-NH2
Ac-EANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLD-NH2
Ac-YLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNW-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNLQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKLEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEFDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKPASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASPWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNSF-NH2
Biotin NH(CH2) 4CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE -ldkwaslwnwf-nh2
Biotin NH (CH2) 6co-ytsl:hslieesqnqqekneqelle -ldkwaslwnwf-nh2 fmoc-ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf fmoc-nnllraieaqqhllqlevwgikqlqarilaverylkdq
Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH2
Ac-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-FWNWLSAWKDLELGGPGSGPGGLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH2
Ac-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 FMOC-GGGGGYTSLIHSLIEE3QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTS.LIYSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEKSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSSIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ac-leanisqlleqaqiqqeknmyelqklnswdvftnwl-nh2
Ac-SLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYR-NH2
Ac-LEECDSELEIKRYKNRVA3RKCRAKFKQLLQHYRE-NH2
Ac-EECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREV-NH2
Ac-ECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVA-NH2 ac-cdseleikryknrvasrkcrakfkqllqhyrevaa-nh2
Ac-DSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAA-NH2 5 » 48 - 10 15 20 25 30
τNo. Sekvence_. _ 7 30 Desaminotyros in-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST- -NH2 731 WASLWNW-NH2 732 Ac-EAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWG-NH2 733 Ac-IEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW-NH2 734 Ac-AIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGI-nh2 735 Ac-RAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLG-NH2 736 Ac-LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLL-NH2 737 Ac-LLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQÁRILAVERYLKDQQL-NH2 738 Ac-NLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQ-NH2 739 Ac-QNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKD-NH2 740 Ac-QQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK-NH2 741 Ac-QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYL-NH2 742 Ac-VQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERY-NH2 743 Ac-IVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVER-NH2 744 Ac-GIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVE-NH2 745 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV-NH2 758 AC-RSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTV-NH2 760 Ac-GARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQL-NH2 764 Ac-GSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH-NHa 765 Ac-GSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH-NH2 766 AC-EGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ-NH2 7 67 Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKS SENDRLRLL-NH2 768 Ac-AKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL-NH2 769 ac-kfkqllqhyrevaaakssendrlrlllk-nh2 770 Ac-FKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ-NH2 771 Ac-RAKFKQELQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPS-NH2 772 DKWASLWNWF-NHz 773 Biotin-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 774 Ac-YDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 775 Ac-YDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 776 Ac-FDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 777 Ac-FDASISQVQEKIQQSLAFIRKSDELLHQVQAGKST-NH2 7 7 8 Ac-FDAS ISQVNEKINQALAFIRKADELI1HNVNAGKST-NH2 779 Ac-FDASISQVNEKINQALAFIRKSDELLHNVNAGKST-NHa 780 Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKADELLHNVNAGKST-NH2 35 - 49 - * ♦ ♦ · » I · τNo.
Sekvence 781 Ac 782 Ac 5 783 Ac 784 Ac 785 Ac 786 ~Ac 787 Ac 10 788 Ac 789 Ac 790 Ac 791 Ac 792 Ac 15 793 Ac 793 Ac 794 Ac 795 Ac 796 Ac 20 797 Ac 798 Ac 800 Ac 801 Ac 802 Ac 25 803 Ac 804 Ac 805 Ac 80 6 Ac 807 Ac 30 808 Ac 809 Ac 810 Ac 811 Ac 812 Ac 35 813 Ac 814 Ac 815 Ac 816 Ac
50 - i I ·· • + -· » · : • · * ♦ τ No. 817 818 5 819 820 821 823 824 10 825 826 841 842 843 15 844 845 845 846 847 20 8 56 860 861 862 863 25 8 64 865 866 867 30 8 68 869 870 871 872 35 8 7 3 874 875 876
Sekvence__ __ ac-qiwnnmtwmewdreinnytslihslieesqqq.qekn-nh2
Ac-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQQQQEKQ-NH2 AC-NKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQQ-NH2 Ac-FDAS ISQVNEKINQSLAFIEESDELLHNVNAGKST-NH: Ac-ACIRKSDELCL-NH2 AC-YTSLIHSLIEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQDQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQDQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH2 AC-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWDWF-NH2
Ac-LEANITQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH2 ac-leanisasleqaqiqqeknmyelqklnswdvftnwl-nh2 ac-leanisalleqaqiqqeknmyelqklnswdvftnwl-nh2
Ac-LEANITALLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH2
Ac-LEANITASLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH2
Ac-LEANITASLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH2
Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMUPS-NH-
Ac-Abu-DDE-Abu-MNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKL-NH2
Ac-WQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL-NH2
Ac-DE YDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH;
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS -NH2
Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVE- -RYLKDQ-NH?
Ac-DREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWAAA-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAAAANWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDAAASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLAAAKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQAAAELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKAAAELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQAAANEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESAAAQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-YTSLIHSLIAAAQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 - 51 ···"· · #· 10 15 20 25 30 ··; r τNo. Sekvence________' _ 877 Ac-YTSLIHAAAEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 878 Ac-YTSAAASLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 879 Ac-EIWNNMTWMEWDRENEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2 880 Ac-YISEVNEEINQSLAFIRKADELLENVDKWASLWNWF-NH2 881 Ac-TSVITIELSNIKENKANGTDAKVKLIKQELDKYKN-NH2 882 ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwfmg-nh2 883 Ac-NEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2 884 Biotin-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH2 885 Biotin-PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH-NH2 88 6 Biotin-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKS DELLHNV-NH2 887 Biotin-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH2 888 Biotin-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2 889 Bí otin-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 890 Ac-VYPSDEFDASISQVQEEIQQALAFIRKADELLEQV-NH2 891 Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 892 Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 893 Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 894 Ac-EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 895 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN-NH2 896 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH2 897 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT-NH2 898 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITN-NH2 899 Ac-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH2 900 Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN-NH2 901 Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH2 905 Ac-KCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLD -VDSIIPRTPD-NH2 906 Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSII -PRTPD-NH2 907 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIAAADELLENV-NH2 909 Ac-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH2 910 Ac-M-Nle-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2 911 Ac-KNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI-NH2 912 Ac-VTEKIQMASDNINDLIQSGVNTRLLTIQSHVQNYI-NH2 913 QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 914 Ac-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 35 - 52
T No. 915 916 5 917 918 919 920 921 10 922 923 924 925 926 15 940 941 942 20 94 4 945 946 947 948 25 94 9 950 951 952 953 30 9 5 4 955 956 957 958 35 95 9 960 961 962
Sekvence__ lwnwf-nh2 elleldkwaslwnwf-nh2 ekneqelleldkwaslwnwf-nh2 slieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2
Ac-AAVALLPAVLLALLAPSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQL -LQHYREVAAAK-NH2
Ac-AAVALLPAVLLALLAPCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSEND -RLRLLLKQMCP-NH2
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNNNIERDWEMWTMNNWIQ-NH2 VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2
Ac-LMQLARQLMQLARQMKQLADS'LMQLARQVSRLESA-NH2 AC-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2 'AC-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2 AC-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2
Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQSKNEQELLE-NH2
Biotin-W-Nle-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2
Ac-YLEYDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2
Ac-IKQFINMWQEVGKAMYA-NH2
Ac-IRKSDELL-NH2
Dekanoyl-IRKSDELL-NH2
Acetyl-Aca-Aca-IRKSDELL-NH2
Ac-YDASISQV-NH2
Ac-NEKINQSL-NH2
Ac-SISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH2
Ac-QVNEEINQALAYIRKADELL-NH'2
Ac-EEINQALAYIRKADELL-NH AC-NQALAYIRKADELL-NH2 AC-LAYIRKADELL-NH2 • ·· · 1« «· - 53 - t *· Μ I · · • · · * • # · * · I « · · · ··· ·♦·♦ ·# ι v : • · « · » « · ·* ···· τ
Sekvence
No. 963 FDASISQVNEKINQALAFIRKSDELL-NH2 9 64 Ac-W-Nle-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2 5 965 Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDS-NH2 967 Ac-WLEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH2 968 Ac-YVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL-NH2 969 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQSLAYIRKADELLHNV-NH2 97 0 Ac-YDAS ΙδθνΝΕΕΙΝΟΑΕΑΥΙΕΚΑΟΕΕΕΕΝν-ΝΗ2 10 971 Ac-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELLE-NH2 972 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKAAELLHNV-NH2 97 3 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKALELLHNV-NH2 97 4 Dekanoyl - YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 975 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQLLAYIRKLDELLENV-NH2 15 976 Ac-DEYDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 977 AC-SNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKTNT-NH2 97 8 Ac-ESTQKAFDGITNKVNSVIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKR-NH2 97 9 Ac-DGITNKVNSVIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKRLENLNK-NH2 980 Ac-DSNVKNLYDKVRSQLRDNVKELGNGAFEFYHK-NH2 20 98 1 Ac-RDNVKELGNGAFEFYHKADDEALNSVKNGTYDYPKY-NH2 982 Ac-EFYHKADDEALNSVKNGTYDYPKY-NH2 98 3 Ac-AAVALLPAVLLALLAPAADKESTQKAFDGITNKVNS -NH2 98 4 Ac-AAVALLPAVLLALLAPAADSNVKNLYDKVRSQLRDN-NH2 985 Ac-KESTQKAFDGITNKVNSV-NH2 25 98 6 Ac - IEKTNTQFEAVGKEFGNLER-NH2 987 Ac-RLENLNKRVEDGFLDVWTYNAELLVALENE-NH2 988 Ac-SNVKNLYDKVRSQLRDN-NH; 989 Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2 990 Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH2 30 991 Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2 992 Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH2 993 Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH2 994 Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2 995 Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2 35 996 Ac-YTKFIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 997 Ac-YMKQLADSLMQLARQVSRLESA-NH2 998 AC-YLMQLARQMKQLADSLMQLARQVSRLESA-NH2 999 Ac-YQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL-NH2 5 10 15 20 25 30 - 54 • ι· «· · · · • · · « · t · I * « ·«· ·♦·♦ *· ···* • · τNo. Sekvence _ 1000 Ac-WMAWAAAINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEEEEE-NH2 1001 Ac-YASLIAALIEESQNQQEKNEQELLELAKWAALWAWF-NH2 1002 [Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH2] dimer 1003 Ac-YDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH2 1004 Biotinyl-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH2 1005 Ac-YTSLI-OH 1006 Fmoc-HSLIEE-OH 1007 Fmoc-SQNQQEK-OH 1008 Fmoc-NEQELLEL-OH 1009 Fmoc-DKWASL-OH 1010 Fmoc-WNWF-OH 1011 Ac-AKTLERTWDTLNHLLFISSALYKLNLKSVAQITLSI-NH2 1012 Ac-NITLQAKIKQFINMWQEVGKAMYA-NH2 1013 Ac-LENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDN-NH2 1014 Ac-LENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNVKELGNG-NH2 1015 Ac-TLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNVKELGNGAFEF-NH2 1016 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH2 1021 Biotinyl-SISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH2 1022 Biotinyl-SISQVNEEINQSLAYIRKS DELL-NH2 1023 Ac-SISQVNEEINQSLAYIRKSDELL-NH2 1024 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIEKSNQELDSIGNWE-NH2 102 5 Ac-1 DlSIELNKAKS DLEESKEWIKKSNQELDSIGNWH-NH2 1026 Ac-IDISIELNKAKSDLEEAKEWIDDANQKLDSIGNWH-NH2 1027 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKANQKLDSIGNWH-NH2 1028 Ac-IDISIELNKAKSDLEEAKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH2 1029 Biotinyl-NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKL-NH2 1030 Biotinyl-ALDPIDlSIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSI-NH2 1031 Desaminotyrosin-NS VALDPIDIS IELNKAKSDLEE.SKEWIKKS -NQKL-NH2 10 32 Desaminotyros in-ALDPIDlSIELNKAKS DLEESKEWIKKSNQKL -DSI-NH2 1033 Ac-YDASISQVNEEINQALAFIRKADEL-NH2 1034 Ac-YDASISQVNEEINQSLAYIRKADELL-NH2 1035 Biotinyl-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH2 1036 Biotinyl-YDASISQVNEEINQSLAFIRKSDELL-NH2 1037 Ac-YDASISQVNEEINQSLAFIRKSDELL-NH2 »·' >« * • · • » • ·« · 35 5 - 55 10 15 20 25 30 ·« #t • « * t I « · « · * · · · f · f » · · 9 · · · · · t# # · · · · · · ·· ···« ·· ·· ·· ···· *· t * ·· ·»·· T No. Sekvence __- 1038 Ac-WLEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2 103 9 Biot inyl -I Dl SIELNKAKS DLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH-NH2 10 4 4 Ac-YESTQKAFDGITNKVNS VIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKR-NH2 1045 Biotin-DEYDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1046 Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2 1047 Ac-WQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYEL-NH2 1048 Ac-WQEWEQKVRYLEANIsqsleqaqiqqekneyel-nh2 1049 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYEL-NH2 1050 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNMYEL-NH2 1051 ac-wqeweqkvryleanisqsleqaqiqqekneyelqkl-nh2 1052 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NHz 1053 ac-wqeweqkvryleanitalleqaqiqqeknmyelqkl-nh2 1054 Ac-1 DlSIELNKAKS DLEESKEWIEKSNQKLDSIGNWH-NH2 1055 Ac-EFGNLEKRLENLNKRVEDGFLDVWTYNAELLVALENE-NH2 10 5 6 Ac-EDGFLDVWT YNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQL-NH2 10 57 Ac-SISQVNEKINQSLAFIRKS DELL-NH2 1058 Desaminotyr-SISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1059 Ac-SISQVNEKINQSLAYIRKSDELL-NH2 1060 Ac-QQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARTVAIEKYLKDQ-NH2 1061 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFC 1062 Ac-FDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELL-NH2 1063 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA 1064 Indol-3-acetyl-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 10 65 Indol-3-ace ty l-DEFDESISQVNEKINQSLAFIRKS.DELL-NHz 1066 Indol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKIEQSLAFIRKSDELL-NH2 1067 Indol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1068 Indol-3-acety1-DEFDESISQVNEKIEESLQFIRKSDELL-NH2 10 69 Indol-3-acetyl-GGGGGDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1070 2-Naftoyl-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1071 DesNH2Tyr-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1072 Biotin-ALDPIDlSIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI-NH2 1073 Ac-YDASISQVNEKINQALAYIRKADELLHNVNAGKST-NH2 1074 Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQALAYIRKADELLHNV-NH2 1075 Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELLHNV-NH2 1076 Ac-WGWGYGYG-NH2 1077 Ac-YGWGWGWGF-NH2 35 5 - 56 ·* ♦ #·« 10 15 20 25 30 » # • · ·« # • * · · » * « » · • · · » •t ·· *·«· TNo. Sekvence__ 1078 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALQEQAQIQAEKAEYELQKL-NH2 1079 Ac-WQEWEQKVRYLEAEITALQEEAQIQAEKAEYELQKL-NH2 1081 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS 1082 Ac-VWPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2 1083 Ac-SKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWGV-NH2 108 4 Ac-LSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTS DWG-NH2 10 8 5 Ac-DLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTS DW-NH2 108 6 Ac-EDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTS D-NH2 1087 Ac-IEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTS-NH2 1088 Ac-GIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWT-NH2 1089 Ac-IGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWW-NH2 10 90 2-Naftoyl--PSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKS DELLHNVN-NH2 10 91 Ac-VYPS DEYDASISQVNEKINQALAYIRKADELLENV-NH2 1092 Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQALAFIRKADELLENV-NH2 10 93 Ac-VYPS DEYDASI SQVNEKINQALAYI READELLE'NV-NH2 10 94 Biotinyl-YDASISQVNEKINQSLAFIRES DELL-NH2 1095 Ac-AIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKW-NH2 1096 Ac-AAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGK-NH2 1097 Ac-DAAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGG-NH2 1098 Ac-PDAAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLG-NH2 1099 Ac-NITDKIDQIIEDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI-NH2 1100 Ac-KNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQW-NH2 1101 Ac-TKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQ-NH2 1102 Ac-WTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWR-NH2 1103 Ac-DWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGW-NH2 1104 AC-HDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG-NH2 1105 Ac-PHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWT-NH2 1106 Ac-EPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWW-NH2 1107 Ac-IEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNW-NH2 1108 Ac-AIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDN-NH2 1109 Ac-AAI EPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDND-NH2 1110 Ac-DAAIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDN-NH2 1111 Ac-LS PTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFF-NH2 1112 Ac-GLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIF-NH2 1113 Ac-VGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPI-NH2 1114 Ac-FVGLSPTWLSVIWMMWYWGPSLYS ILS PFLPLLP-NH2 35 5 - 57 ···· 10 15 20 25 30 ·· ···· ·« * * · · · · * • · · * * · « · ♦ * » * # • · · · * * · ·· ·· ·♦ ··«· τ No. Sekvence____: _ 1115 Ac-WFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILS PFLPLL-NH2 1116 Ac-QWFVFLS PTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPL-NH2 1117 Ac-VQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLP-NH2 1118 Ac-FVQWFVGLS PTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFL-NH2 1119 Ac-PFVQWFVGLS PTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPF-NH2 1120 Ac-VPFVQWFVGLS PTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSP-NH2 1121 Ac-LVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILS-NH2 1122 H-NHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-OH 1123 H-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARI -LAVERYLKDQ-OH 1124 Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIREADELLENV-NH2 1125 Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAYIREADELLENV-NH2 1126 Ac-DEFDASISQVNEKINQSLAYIREADELL-NH2 1127 Ac-NEQELLELDKWASLWNWFGGGGDEFDASISQVNEKINQS -LAFIRKSDELL-NH2 1128 Ac-LELDKWASLWNWFGGGGDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1129 Naftoyl-EGEGEGEGDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1130 Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDV-NH2 1131 Na ftoy1-GDEEDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1132 Naftoy1-GDEEĎASESQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1133 Naftoyl-GDEEDASESQQNEKINQSLAFIRKSDELL-NH2 1134 Naftoy1-GDEEDASESQQNEKQNQSLAFIRKS DELL-NH2 1135 Naftoy1-GDEEDASESQQNEKQNQSEAFIRKSDELL-NH2 113 6 Ac-WGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKS DELL-NH2 1137 Ac-YTSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKS DELLGGWNWF-NH2 1138 Ac-YTSLIHSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKS DELLGGWA--SLWNWF-NH2 1139 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1140 2-Naftoyl-GDEEDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1141 2-Naftoy1-GDEEDESISQVQEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1142 2-Na ftoyl-GDEEDESISQVQEKIEESLLFIRKSDELL-NH2 1143 Biotin-GDEYDESISQVNEKIEESLAFIRKS DELL-NH2 1144 2-Naftoy1-GDEYDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 114 5 Ac-YTSLIHSLIDEQEKIEELAFIRKS DELLELDKWNWF-NH2 1146 VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1147 AC-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGSKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 35 5 - 58 10 15 20 25 30 9* 999· ·« 99 • · 9 9 9 9 • 9 9 t 9 9 • 9 • 9 9 • 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ♦ · ·· • 9 9 9 9 999· τNo. Sekvence___._ ' _.· 1148 GGGVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 '114 9 Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGEKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 1150 Ac-PTRVNYILIIGVLVLAbuEVTGVRADVHLL-NH2 1151 Ac-PTRVNYILI IGVLVLAbuEVTGVRADVHLLEQPGNLW-NH2 1152 Ac-PEKTPLLPTRVNYILI IGVLVLAbuEVTGVRADVHLL-NH2 1153 AhaGGGVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 . 1155 Ac-YTSLIHSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NHa 1156 Ac-YTSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1157 Ac-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWASLWNWF-NH2 1158 Ac-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWNWF-NH2 1159 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKASLWNWF-NH2 1160 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKSLWNWF-NH2 1161 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKLWNWF-NH2 1162 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWNWF-NH2 1163 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEES-QNQQEKNEQELLELDKA -slwnwf-nh2 1164 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL -DKSLWNWF-NH2 1165 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKLWNWF-NH2 1166 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWNWF-NH2 1167 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK -waslwn- nh2 1168 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH2 1169 (Pyr)HWSY (2-naftyl-D-Ala)LRPG-NH2 1170 Ac-WNWFDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NH2 1171 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKYASLYNYF-NH2 1172 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKYAYLYNYF-NH2 1173 2-Naf toyl-AcaAcaAcaDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL -AcaAcaAcaW-NH2 117 4 2-Naf toyl-AcaAcaAcaGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLG -AcaAcaAcaW-NH2 117 5 2-Na ftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIRES DELL-NH2 1176 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIEES DELL-NH2 117 7 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 117 8 Ac-WQEWEQKVDYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NHa 1179 Ac-WQEWEQKVRWLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 35 5 - 59 10 15 20 25 30 • é ·· • · · ι « · · ♦ • · » » « i · · i · · · · · · · · · » « · · ♦ · ♦ ·· M« ·*·· ·« «« ·· ···· ·· * #» ·«·« T No. Sekvence__. 1180 Ac-WQEWEKQVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 1181 Ac-WQEWEHQVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 1182 Ac-WQEWEHKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 118 3 Ac-WQEWDREVRYLEANITALLEQAQIQQEKNE yelqkl-nh2 1184 Ac-WQEWEREVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 118 5 Ac-WQEWERQVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 118 6 Ac-WQEWEQKVKYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 1187 Ac-WQEWEQKVRFLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 118 8 Ac-VNalPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1189 Ac-VNalPSDENalDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1190 Ac-VNalPSDEYDASISQVNEEINQALANalIRKADELLENV-NH2 1191 Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIREADELLFNFF-NH2 1192 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLFNFF-NH2 1193 Ac-YTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH2 1194 Ac-YTSLITALLĚQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1195 Ac-YTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWASLWEWF-NH2 1196 Ac-YTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQELDEWASLWEWF-NH2 1197 Ac-YTSLITALLEEAQIQQEKNEYELQELDEWASLWEWF-NH2 1198 Naftoyl-Aua-Aua-Aua-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAua-Aua--Aua-W-NH2 1199 Ac-WAAWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 12 0 0 AC-WQEAAQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 12 01 Ac-WQEWAAKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 1202 Ac-WQAAEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NHz 1203 AC-WQEWEAAVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 12 0 4 Ac-WQEWEQAARYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 12 0 5 Ac-WQEWEQKAAYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH2 1206 Ac-WQEWEQKVAALEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-ŇH2 1207 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKLGGGG -waslwnf-nh2 1208 2-Na ftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELT-NH2 120 9 2-Naf toyl - GDEFDASISQVNEKINQSLAFTRKS DELT-NH2 1210 2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKTNQSLAFTRKS DELT-NH2 1211 2-Naftoyl-GDEFDASISQTNEKTNQSLAFTRKSDELT-NH2 1212 2-Naftoyl-GDEFDASTSQTNEKTNQSLAFTRKSDELT-NH2 1213 2-Naf toyl-GDEYDAST SQTNEKTNQS LAFTRKS DELT-NH2 35 5 - 60 4 «I · ίο 15 20 25 30 ·· ·*·♦ «1 · · • · * • 1 4 • » • · · • · • 4 • · · · • * * • · t · * * • · ·« ·· · τNo, Sekvence__________ 1214 2-Naftoyl-GDEFDEElSQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1215 2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELA-NH2 1216 2-Naftoyl-GDEFDASASQANEKANQSLAFARKS DELA-NH2 1217 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFTRKS DELL-NH2 1218 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKTEESLAFIRKSDELL-NH2 1219 2-Na ftoyl-GDEFDESISQTNEKIEESLAFIRKS DELL-NH2 1220 2-Naftoyl-GDEFDESTSQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH2 1221 Ac-WNWFDEFDESTSQVNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NH2 1222 Ac-WNWFDEFDESTSQTNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NHz 1223 Ac-WNWFDEFDESTSQTNEKTEESLAFIRKSDELLWNWF-NH2 1224 Ac-LQAGFFLLTŘILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVAL-NHz 1225 Ac-YTNLIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWSWF-NH2 1226 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASL--WNWF-NH2 1227 Ac-NNMTWQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQK -ldkwaslwnwf-nh2 1230 Ac-WNWFIEES DELLWNWF-NH2 1231 2-Naftoyl-GFIEESDELLW-NH2 1232 Ac-WFIEESDELLW-NH2 1233 2-Na ftoy1-GFNFFIEESDELLFNFF-NH2 1234 2-Naftoyl-GESDELW-NH2 1235 Ac-WNWFGDEFDESISQVQEEIEESLAFIEESDELLGGWNWF-NH2 1236 Ac-WNWFIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1237 Ac-YTSLITALLEQAQIQQEENEYELQALDEWASLWEWF-NH2 1238 Ac-YTSLIHSLGGDEFDESISQVNEEIEESLAFIEESDELLGGWA -SLWNWF-NH2 1239 2-Naftoyl-GDEFDESISQVQEEIEESLAFIEESDELL-NH2 1240 H-QARQLLSSIMQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARI -LAVERYLKDQ-OH 1241 Ac-CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR-NH2 1242 Ac-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSC-NH2 1243 Ac-LNFLGGT-NH2 1244 Ac-LDSWWTSLNFLGGT-NH2 1245 Ac-ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT-NH2 1246 Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT-NH2 12 4 7 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF--NH2 35 5 ·* ·«·· - 61 * » · I I · • » # · ·· *· ·· ·· * » · · • · # * · * • · · ·· ···· 10 15 20 25 30 τNo, Sekvence_;_._" - 12 4 8 Ac-WNWFITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH2 12 4 9 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1250 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKIEYELQKL-NH2 1251 Ac-WQEWEQKVRYLEAQITALLEQAQIQQEKIEYELQKL-NH2 1252 Ac-KENKANGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-NH2 1253 Ac-NIKENKANGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLM-NH2 1254 (FS)-ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh2 1255 2-Naftoy1-GWNWFAcaDEFDESISQVQEEIEESLAFIEES DELL -AcaWNWF-NH2 1256 Ac-WNWFGDEFDESISQVNEKIEESLAFIEESDELLGWNWF-NH2 1257 Ac-WNWFGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGWNWF-NH2 1258 Ac-WNWF-Aca-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-Aca--WNWF-NH2 1259 . Ac-WNWF-Aca-DEFDESISQVNEKIEESLAFIEESDELL-Aca- -wnwf-nh2 1260 Ac-EESQNQQEKNEQELLELDKWA-NH2 1261 EESQNQQEKNEQELLELDKWA 1262 Ac-CGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFG-NH2 1263 Ac-GVEHRLEAACNWTRGERADLEDRDRSELSP-NH2 12 64 Ac-CVREGNASRAWVAVTPTVATRDGKLPT-N.H2 1265 Ac-CFSPRHHWTTQDANASIYPG-NH2 1266 Ac-LQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDS-NH2 1267 Ac-WQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEQA--slwewf-nh2 1268 Ac-CWQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWA -slwewfc-nh2 12 69 Ac-WQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH2 127 0 Ac-CWQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWFC-NH2 1271 Ac-GQNSQSPTSNHSPTSAPPTAPGYRWA-NH2 1272 Ac-PGSSTTSTGPARTALTTAQGTSLYPSA-NH2 1273 Ac-PGSSTTSTGPARTALTTAQGTSLYPSAAATKPSDGNATA-NH2 1275 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH2 127 6 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWASLWEWF-NH2 1277 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH2 1278 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH2 1279 AC-WQEWEREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH2 35 5 10 15 20 25 30 f ·· ·♦ · « • · ·· ·· ♦· • ♦ # · f » · • ♦ t · é f - 62 - • 4 «·· ♦#·· • · ♦ * · · · ·· 41 ·· ···· τNo. Sekvence___.___ 1280 Ac-WQEWEREITALLEQAQIQQEKIEYELQKLDEWEWF-NH2 1281 Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH2 1282 Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH2 1283 Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKIEYELQKLDEWEWF-NH2 1284 Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH2 1285 Ac-WQEWDREIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2 1286 Ac-WQEWEREIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2 1287 Ac-WQEWEIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2 1288 Ac-WQEWDREIDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH2 1289 Ac-WQEWEREIDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH2 1290 Ac-WQEWEIDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH2 1291 AC-WQEWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2 1292 Ac-WQEWDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH2 1293 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH2 1294 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWASEWEWF-NH2 1295 Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWASLWEWF-NH2 1298 -VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1299 Ac-WVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENVWNWF-NH2 13 00 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-LWNWF-NH2 1301 Ac-WQEWDEYDASISQVNEKINQALAYIREDAELWAWF-NH2 1302 Ac-WQAWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWAWF-NH2 1303 Ac-WQAWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2 1304 Biotin-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH2 1305 Biotin-YDPLVFPS DEFDASISQVNEKINQSLAF-NH2 1306 BiOtin-QVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH2 1307 Ac-WMEWDREI-NH2 1308 Ac-WQEWEQKI-NH2 1309 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIKWASLWEWF-NH2 1310 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWASLWEWF-NH2 1311 Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH2 1312 Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKEWEWF-NH2 1313 Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKEWEW-NH2 1314 Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEW-NH2 1315 Ac-FNLSDHSESIQKKFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLR-NH2 1316 Ac-DHSESIQKKFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIF-NH2 1317 Ac-WSVKQANLTTSLLGDLLDDVTSIRHAVLQNRA-NHz 35 5 - 63 10 15 20 25 30 • ·· ·· · « • · • * • « ·«· ···· »· *·#· • · • · • · • · · ·· ·· ·· • · · • · • · # • · · ·· ··· τNo. Sekvence_ - ......_ . 1318 Biotin-WMEWDREI-NH2 1319 Biotin-NNMTWMEWDREINNYTSL-NH2 132 0 Ac-GAASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEÁQQHLL-NH2 1321 Ac-ASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQL-NH2 1322 " Ac-VSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVF-NH2 1323 Ac-QHWSYGLRPG-NH2 1324 Ac-WQEWEQKIQHWSYGLRPGWASLWEWF-NH2 1325 Ac-WQEWEQKIQHWSYGLRPGWEWF-NH2 1326 Ac-WNWFQHWSYGLRPGWNWF-NH2 1327 Ac-FNFFQHWSYGLRPGFNFF-NH2 1328 Ac-GAGAQHWSYGLRPGAGAG-NH2 1329 PLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT 133 0 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLAKWASLWEWF-NH2 1331 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLAEWASLWEWF-NH2 1332 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAEWASLWEWF-NH2 1333 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAEWASLWAWF-NH2 13 3 4 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAKWASLWAWF-NH2 1335 Ac-TNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-NH2 1336 Ac-KAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS-NH2 1337 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH2 1338 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH2 1339 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLDKWEWF-NH2 1340 AC-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAF-NH2 1341 Fluor--VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1342 Fluor-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1344 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2 1345 Ac-QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 1346 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH2 1347 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAWF-NH2 1348 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAW-NH2 1349 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAEWASLWAW-NH2 1350 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWAGLWAWF-NH2 1351 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWAGLWAW-NH2 1352 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAEWAGLWAW-NHz 1353 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWAGLWEWF-NH2 1354 Ac-WQEWQHWSYGLRPGWEWF-NH2 35 5 64 - 10 15 20 25 30 « *· ·· ···· ·· ·· ·♦ · · · • • • • • · • · · • • Φ • • • · · · • • · · • • #·· #·♦· *i • • · ·· ·« • # ···· τNo. Sekvence_. ____ 1355 Ac-WQAWQHWSYGLRPGWAWF-NH2 135 6 Biot inyl-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1357 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF 1358 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF 13 61 Ac-AGSTMGARSMTLTVQARQLL'SGIVQQQNNLLRAIEAQQ-NH2. 13 62 Ac-AGSAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQ-NH2 1363 Ac-AGSAMGAASTALTAQSRTLLAGIVQQQQQLLDWKRQQ-NH2 13 64 Ac-ALTAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGT-NH2 13 65 Ac-TLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDWKRQQEMLRLTVWGT-NH2 1366 Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGI-NH2 1367 Ac-WQAWIEYEAELSQVKEKIEQSLAYIREADELWAWF-NH2 13 68 Ac-WQAWIEYEASLSQAKEKIEESKAYIREADELWAWF-NH2 1369 Ac-WQAWIEYERLLVQAKLKIAIAKLYIAKELLEWAWF-NH2 1370 Ac-WQAWIEYERLLVQVKLKIAIALLYIAKELLEWAWF-NH2 1371 Ac-WQAWIELERLLVQVKLKLAIAKLEIAKELLEWAWF-NH2 1372 Ac-GEWTYDDATKTFTVTEGGH-NH2 1373 Ac-WQEWEQKIGEWTYDDATKTFTVTEGGHWASLWEWF-NHz 1374 Ac-GEWTYDDATKTFTVTE-NH2 1375 Ac-WQEWEQKIGEWTYDDATKTFTVTEWASLWEWF-NH2 1376 Ac-MHRFDYRT-NH2 1377 Ac-WQEWEQKIMHRFDYRTWASLWEWF-NH2. 1378 Ac-MHRFNWSTGGG-NH2 1379 Ac-WQEWEQKIMHRFNWSTGGGWASLWEWF-NH2 1380 Ac-MHRFNWST-NH2 1381 Ac-WQEWEQKIMHRFNWSTWASLWEWF-NH2 1382 Ac-LLVPLARIMTMSSVHGGG-NH2 138 3 Ac-WQEWEQKILLVPLARIMTMSSVHGGGWASLWEWF-NH2 1384 Ac-LLVPLARIMTMSSVH-NH2 1385 Ac-WQEWEQKILLVPLARIMTMSSVHWASLWEWF-NH2 1386 TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK 1387 Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2 1388 Ac-TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE-NH2 1389 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE 1390 Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV--ERY-NH-, 35 5 - 65 • · ♦ ♦ t • · · · · · • · · · · · » · • · · · · · » ·»« #··· ·· ·« • · 10 15 20 25 30 τNo. Sekvence_ . _ 1391 Rhod-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQA -RILAVERY-NH2 1392 Ac-GAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDWKRQQEML-NH2 1393 ac-gsamgaasltlsaqsrtllagivqqqqqlldvvkrqqeml-nh2 1394 Ac-PALSTGLIHLHQNIVDVQFLFGVGSSIASWAIKWEY-NH2. 1395 Ac-PALSTGLIHLHQNIVDVQFLYGVGSSIASWAIK-NH2 1396 Ac-LSTTQWQVLPUSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQY-NH2 1397 Ac-FRKFPEATFSRUGSGPRITPRUMVDFPFRLWHY-NH2 1398 Ac-DFPFRLWHFPUTINYTIFKVRLFVGGVEHRLEAAUNWTR-NH2 71 1399 Ac-YVGGVEHRLEAAUNWTRGERUDLEDRDRSELSPL-NH2 1400 MVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKDELLENV 1402 Ac-GPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGG-NH2 1403 Ac-LGPLLVLQAGFFLLTRILLIPQSLDSWWTSLNFLG-NH2 1404 Ac-FLGPLLVLQAGFFLLTRILLIPQSLDSWWTSLNFL-NH2 1405 Ac-YTNTIYŤLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1406 YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF 1407 AC-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-NH2 1408 YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF 1409 Ac-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1410 YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF 1411 Ac-EKSQIQQEKNEQELLELDKWA-NH2 1412 EKSQIQQEKNEQELLELDKWA 1413 Ac-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWA-NH2 1414 Ac-YTSLIGSLIEESQIQQERNEQELLELDRWASLWEWF-NH2 1415 Ac-YTXLIHSLIXESQNQQXKNEQELXELDKWASLWNWF-NH2 1416 Ac-YTXLIHSLIWESQNQQXKNEQELXELD-NH2 1417 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-NH2 1418 AC-WQEQEXKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLDKWASLWEWF-NH2 1419 Ac-XKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLDKWASLWEWF-NH2 1420 Ac-WQEWWXKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLD-NH2 1421 Ac-WEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH2 1422 Ac-WEXKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLD-NH2 1423 Ac-XKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLD-NH2 1425 Ac-QKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH2 1426 Ac-QKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 35 5 - 66 10 15 20 25 30
• · · · ♦ ·
T No. Sekvence_. __ 1427 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH2 142 8 Ac-VYPS DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLEN-OH 1429 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLE-OH 1430 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELL-OH 1431 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL-OH 1432 YPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1433 PSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1434 SDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1435 DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1436 AC-VYPSDEYDASISQVDEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1437 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEIDQALAYIRKADELLENV-NH2 1438 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLEDV-NH2 1439 Ac-VYPSDEYDASISQVDEEIDQALAYIRKADELLENV-NH2 1440 Ac-LLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLP-NH2 1441 Ac-LSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPI-NH2 1442 Ac-STNKAVVSLSNGVSVGTSKVLDLKNYIDKQLLPIV-NH2 1443 Ac-TNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVN-NH2 1444 Ac-NKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-NH2 1445 Ac-KAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ-NH2 1446 Ac-AVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS-NH2 1447 Ac-WSLSNGVSVLTSKVDLKNYIDKQWLLPIVNKQSU-NH2 144 Ac-VSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL1PIVNKQSUS-NH2 1449 Ac-SLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSI-NH2 1450 Ac-LSNGVSVLTSKVLDKLKNYIDKQLLPIVNKQSUSIS-NH2 1451 Ac-SNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISN-NH2 1452 Ac-NGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNI-NHZ 1453 Ac-GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIE-NH2 1454 Ac-VSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISINIET-NH2 1455 Ac-SVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETV-NH2 1456 Ac-VLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVI-NH2 1457 Ac-LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIE-NH2 1458 Ac-TSKVLDLKNYIDKQLLPIVKQSUSISNIETVIEF-NH2 1459 Ac-STVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQ-NH2 1460 Ac-KVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQ-NH2 1461 Ac-VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQK-NH2 1462 Ac-LDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKN-NH2 35 5 - 67 • · ·· ·· • · · · » · · · • · · ·· ···· 10 15 20 25 30 τNo. Sekvence _ . 14 63 Ac-DLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNN-NH2 14 64 Ac-LKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNR-NH2 1465 Ac-KNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRL-NH2 1466 Ac-NYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLL-NH2 1467 Ac-YIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLE-NH2 1468 Ac-IDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEI-NH2 1469 Ac-DKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEIT-NH2 1470 Ac-KQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR-NH2 1471 Ac-QLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNRLLEITRE-NH2 1472 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALA 1473 QVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1474 VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV 1475 Ac-DEYDASISQVNEEINQALAYIREADEL-NH2 1476 Ac-DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL-NH2 1477 Ac-DDECLNSVKNGTYDFPKFEEESKLNRNEIKGVKLS-NH2 1478 Ac-DDE-Abu-LNSVKNGTYDFPKFEEESKLNRNEIKGVKLS -NH2 147 9 Ac-YHKCDDECLNSVKNGTFDFPKFEEESKLNRNEIKGVKLSS-NH2 1480 Ac-YHK-Abu-DDE-Abu-LNSVKNGTFDFPKFEEESKLNRNEIKGV -KLSS-NH2 1481 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1482 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEYELLELDKWASLWNWF-NH2 14 83 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEYELLELDKWASLWNWF-NH2 1484 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH2 148 5 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELQKLDKWASLWNWF-NH2 14 8 6 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH2 1487 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELQKLDKWASLWNWF-NH2 1488 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL·LELDKWASLWEWF-NH2 148 9 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASLWEWF-NH2 14 90 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEYELLELDKWASLWEWF-NH2 14 91 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEYELLELDKWASLWEWF-NH2 1492 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 14 93 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELQKLDKWASLWEWF-NH2 14 94 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 14 95 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELQKLDKWASLWEWF-NH2 14 96 Ac-WQEQEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKEWWF-NH2 1497 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWASLWEWF-NH2 35 5 - 68 ··· ·*· ·· ···· ·· tl • · · · · · t I t I I • · Φ · · · II t · · · II II · · mi 10 15 20 25 30
T No. Sekvence_- _ 1498 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWASLWEWF-NH2 1499 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIKWASLWEWF-NH2 1500 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWAGLWEWF-NH2 ' 1501 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWAGLWEWF-NHj 1-502 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIKWAGLWEWF-NH2 1503 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWAGLWAWF-NH2 1504 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWAGLWAWF-NH2 1505 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIkwaglwawf-nh2 1506 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELQKLDKQEQF-NH2 1507 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELLELDKWEWF-NH2 1508 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELQKLAKWENF-NHz 1509 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELQKLDWQWEF-NH2 1510 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELLELAKWEWF-NH2 1511 Ac-WEQWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELDKWENF-NH2 1512 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELEEELIEWASLWEWF-NH2 1513 . Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELIEWAGLWEWF-NH2 1514 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELIEQAGLWAWF-NH2 1515 Ac-WQEWEREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWASLWEWF-NH2 1516 Ac-WQEWEREIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1517 Ac-WQEWEREIQQEKGEYELQKLIEWEWF-NH2 1518 Ac-WQEWQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1519 Ac-WQEWQAQIQQEKGEYELQKLIEWEWF-NH2 1520 PEG-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDEWASLWEWF-NH; 1521 Ac-GWQEWEQRItalleqaqiqqerneyelqrldewaslwewf-nh2 1522 peg-ytslitalleqaqiqqerneqelleldewaslwewf-nh2 1523 Ac-YTSLITALLEQAQIQQERNEQELLELDEWASLWEWF-NH2 1526 PEG-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQELDEWASLWEWF-NH2 1527 Ac-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQELDEWASLWEWF-NH2 1528 PEG-YTSLIGSLIEESQIQQERNEQELLELDRWASLWEWF-NH2 1529 PEG-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDRWASLWEWF-NH2 1530 Ac-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDRWASLWEWF-NH2 1531 PEG-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQELDRWASLWEWF-NH2 1532 AC-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQELDRWASLWEWF-NH2 1533 PEG-YTSLIGSLIEESQNQQERNEQELLELDRWASLWNWF-NHa 1534 Ac-YTSLIGSLIEESQNQQERNEQELLELDRWASLWNWF-NH2 1538 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEK-OH 35 5 - 69 ·· T .
No. Sekvence___
1539 NEQELLELDK 1540 WASLWNWF-NH2 1542 Ac-AAAWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1543 Ac-WQEAAAKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1544 Ac-WQEWEQAAAALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1545 Ac-WQEWEQKITAAAEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1546 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYAAAKLDKWASLWEWF-NH2 10 1547 Ac-WQEWEQKITALLEQAAAAQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1548 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQAAANEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1549 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAAAELQKLDKWASLWEWF-NH2 1550 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYAAAKLDKWASLWEWF-NH2 1551 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQAAAKWASLWEWF-NH2 15
1552 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDAAASLWEWF-NH
1553 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWAAAAEWF-NH
1554 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWAAA-NH 1556 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLLDKWASLWNWF-NH2 1557 Ac-YTSLIHSLIEESQNQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 20 1558 Ac-ERTLDFHDS-NH2 1559 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN(W)F-NH2 1563 Ac-YTSLIHSLIEESQN (Q)QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1564 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQDKWASLWNWF-NH2 1566 Ac-FYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKWEDWVGWIGNI-NH2 25 1567 Ac-INQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIE-NH2 1568 Ac-WNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQ-NH2 1572 AC-YTSLIHSLIEESENQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1573 Ac-YTSLIHSLIEESQDQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1574 AC-YTSLIHSLIEESQNEQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 30 1575 c-TYSLIHSLIEESQNQEEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1576 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1577 Ac-LGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQ-NH2 1578 Ac-WYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQK-NH2
1579 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEEELLELDKWASLWNWF-NH2 158 0 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE'KNEQELLELDKWASLWDWF-NH2 1586 Ac-XTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWX-NH2 1588 Ac-YNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKW-NH2 1598 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF 35 5 - 70 10 15 20 25 30 • ·· ·· ···· • · · · · · * • » · · ♦ ·· ·· • ♦ · · • » · • · · • · · • · ···· τNo. Sekvence _ · ._ 1600 Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQAR-NH2 1603 Ac-LQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKWEDWVGW-NH2 1627 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLALDKWASLWNWF-NH2 1628 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEADKWASLWNWF-NH2 1629 ' AC-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELAKWASLWNWF-NH2 1630 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKAEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1631 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNAQELLELDKWASLWNWF-NH2 1632 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEAELLELDKWASLWNWF-NH2 1634 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELQKLDKWASLWEWF-NH2 1635 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 1636 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNAYELQKLDKWASLWEWF-NHa 1637 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEAELQKLDKWASLWEWF-NHz 1644 Ac-EYDLRRWEK-NH2 1645 Ac-EQELLELDK-NH2 1646 Ac-EYELQKLDK-NH2 1647 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELLKLDKWASLWEWF-NH2 1648 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELLELDKWASLWEWF-NH2 1649 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNDKWASLWEWF-NH2 1650 Ac-YTSLIHSLIEESQNQAEKNEQELLE'LDKWASLWNWF-NH2 1651 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQAKNEQÉLLELDKWÁSLWNWF-NH2 1652 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEANEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1653 Ac-YTSLIHSLIEESANQQEANEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1654 Ac-YTSLIHSLIEESQAQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1655 Ac-YTSLIHSLIEESQNAQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1656 Ac-YTSLIHALIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1657 AC-YTSLIHSAIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1658 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2 1659 Ac-YTSLIHSLAEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1660 Ac-YTSAIHALIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1661 Ac-YTSLAHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1662 Ac-YTSLIASLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 16 63 Ac-ATS LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1664 Ac-YASLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1665 Ac-YTALIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 1666 Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQ-NH2 1667 Ac-HTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLREN-NH2 35 - 71 a··· - 71 a··· 5 10 15 T No. 1668 1669 1670 1671 1672 1673 1674 1675 1676 1677 1678 1679 1680 1681 1682 1683 1684 1685 1687 1688 ι·« · · · ·
Sekvence _ ' __
Ac-SEMNKLFEKTRRQLREN-NH2
Ac-VFPSDEADASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISAVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQANEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQVAEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-WQEWEQKITAALEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 AC-WQEWEQKITALAEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2
Ac-WQEWEQKITALLEQAAIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 AC-WQEWEQKITALLEQAQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2
Ac-WQEWEQKITALLEQAQIAQEKMEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQAEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSAAFIRKSDELLHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAAIRK.SDELLHNV-NH2 AC-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEALHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELAHNV-NH2
Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLANV-NH2 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQAKŇEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQALDKWASLWEWF-NH2
Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKADKWASLWEWF-NH2 20 - 72 •« ···· · · · # • ♦ · · · · • ♦ ♦ Φ · • · · · · · • · · · ♦ · • « · · · · · f · «t ·· ····
Je třeba rozumět, že peptidy uvedené v tabulce 2 a v příkladu uvedeném v části 11 dále, mají také spadat do rámce předkládaného vynálezu. Jak je uvedeno výše, ty peptidy znázorněné v tabulce 2 a v uvedeném příkladu dále, které již neobsahují zesilující peptidové 5 sekvence (tj. nepředstavují hybridní polypeptidy), mohou být použity spolu se zesilujícími peptidovými sekvencemi a na základě zde uváděných znalostí pro vytváření hybridních polypeptidů. Navíc mohou být polypeptídová jádra a polypeptidová jádra hybridních polypeptidů ukázaná v tabulce 2, obr. 13 a příkladu uvedeném v části 11 níže, io použity s kteroukoli ze zesilujících peptidových sekvencí popisovanou v předkládané přihlášce, pro výrobu dalších hybridních polypeptidů, které rovněž spadají do rámce předkládaného vynálezu.
Například peptid DP397, ukázaný v příkladu uvedeném v části 11 představuje polypeptidové jádro, a má spadat do rámce 15 předkládaného vynálezu. Navíc mají do rámce předkládaného vynálezu spadat také hybridní polypeptidy obsahující polypeptidové jádro DP397 plus jednu nebo více popisovaných zesilujících polypeptidových sekvencí.
Je třeba uvést, že i když je v tabulce 2 a obr. 13 uvedena celá 2o řada polypeptidů s modifikovanými, například blokovanými aminovými nebo karboxylovými konci, nebo d-isomerními aminokyselinami (znázorněné zbytky uvnitř závorek), jakýkoli polypeptid obsahující primární aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v tabulce 2 a obr. 13 má být rovněž součástí předkládaného vynálezu. 25 Sekvence polypeptidového jádra samy o sobě ukázané v tabulce 2, obr. 13 a uvedeném příkladu v části 11 dále, stejně jako hybridní polypeptidy obsahující tato polypeptidová jádra, mohou mít antivirovou a/nebo antifuzogenní aktivitu a/nebo mohou mít schopnost modulovat intercelulární procesy, kterých se účastní struktury peptidů typu coiled-30 coil. Navíc mohou být tyto peptidy také používány jako část screeningových metod pro identifikaci sloučenin včetně peptidů - 73 • ·* ·· ··*· ·· ·· ··#· · · * · * * * • · · · * · # · • ·«·· · · · · · • · ·#·· · ·· • ·· ·· ·· ···· s těmito aktivitami. Mezi sekvencemi polypeptidového jádra jsou například sekvence, které byly odvozeny od jednotlivých sekvencí virových proteinů. Mezi sekvence polypeptidových jader patří také například sekvence, jejichž pořadí aminokyselin je odvozeno od více než jedné sekvence virového proteinu (např. polypeptidová jádra odvozená od HIV-1, HIV-2 a SIV).
Navíc se v těchto polypeptidových jádrech mohou vyskytovat substituce, delece a/nebo inzerce aminokyselin, jak je diskutováno výše u zesilujících polypeptidových sekvencí. V případech, kdy polypeptidová jádro má antivirovou a/nebo antifuzogenní aktivitu, nesnižují s výhodou tyto modifikace (buď jako takové nebo jako součást hybridního polypeptidu) tuto aktivitu.
Co se týče delecí aminokyselin, je výhodné, aby získané polypeptidové jádro mělo délku alespoň přibližně 4 až 6 aminokyselinových zbytků. Co se týče inzercí aminokyselin, výhodné inzerce nejsou delší než přibližně 50 aminokyselinových zbytků, a výhodněji nejsou delší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků. Je také výhodné, pokud jsou inzerce polypeptidového jádra inzerce na aminovém a/nebo karboxylovém konci.
Mezi substitucemi, delecemi a/nebo inzercemi aminokyselin v polypeptidovém jádru nebo hybridních polypeptidech podle vynálezu jsou takové, které odpovídají substitucím, delecím a/nebo inzercím aminokyselin nalézaným u mutantů, například v přírodě se vyskytujících mutantů, endogenních proteinových sekvencí, ze kterých je konkrétní polypeptidové jádro odvozeno.
Jestliže je například polypeptidové jádro odvozeno od virového proteinu, a toto polypeptidové jádro (buď jako .takové nebo jako součást hybridního polypeptidu) má antivirovou účinnost proti dalšímu viru, je možné, že mohou existovat nebo mohou nakonec vzniknout varianty (například variantní kmeny) viru, které mají určitou míru odolnosti proti peptidu co se týče antivirového účinku tohoto peptidu - 74 «· ♦·♦· ·· ·· • * < · # « • · # · · • * · · · * • ψ ♦ · · · ·· ·· ·· ···♦ na kmen viru, ze kterého byla sekvence původního endogenního polypeptidového jádra odvozena.
Pro vytvoření polypeptidových jader, která mají antivirovou účinnost proti těmto rezistentním kmenům virů, mohou být zavedeny modifikace původního polypeptidového jádra. Odborník v oboru může použitím standardních technik zvláště izolovat izoláty rezistentního viru. Určení sekvence, která v rezistentním viru odpovídá původnímu polypeptidovému jádru, může být také rutinně provedeno a sekvence může být porovnána se sekvencí původního polypeptidového jádra. V případě, že se odpovídající sekvence získaná z mutantního, rezistentního kmene, liší od sekvence polypeptidového jádra, mohou být zavedeny modifikace polypeptidového jádra tak, že výsledné modifikované polypeptidové jádro má stejnou sekvenci jako odpovídající oblast v rezistentním viru. Získané modifikované polypeptidové jádro, buď jako takové nebo jako součást hybridního polypeptidu, bude vykazovat antivirové vlastnosti proti kmenu viru, který byl rezistentní na původní polypeptidové jádro. Tyto metody mohou být proto využity pro identifikaci polypeptidových jader, která mají antivirovou účinnost proti kmenům virů, které jsou, nebo které se staly rezistentní na antivirovou aktivitu jiných polypeptidových jader.
Jeden konkrétní, ale neomezující příklad úspěšného použití této metody pro vytvoření modifikovaného polypeptidového jádra, které vykazuje antivirový účinek proti kmenu viru rezistentnímu na „rodičovské" polypeptidové jádro, se popisuje v příkladu uvedeném dále v části 11. V jednom provedení jsou taková modifikovaná polypeptidová jádra, která mají antivirový účinek proti kmenům rezistentním k „rodičovským" polypeptidovým jádrům taková polypeptidová jádra, ve kterých byly zavedeny substituce, inzerce a/nebo delece aminokyselin, - 75 ··»·
které modifikují „rodičovské11 polypeptidové jádro takovým způsobem, že ve výsledném modifikovaném polypeptidovém jádru byla odstraněna konvenční sekvence N-glykosylace nebo O-glykosylace, která byla přítomná v „rodičovském11 polypeptidovém jádru. 5 Například konvenční sekvence pro N-glykosylační místo je -N-X- S/T, kde S/T je buď serin nebo threonin a X je jakákoli aminokyselina kromě prolinu nebo kyseliny asparagové. V jednom provedení může tedy být rodičovské polypeptidové jádro obsahující takovou konvenční sekvenci modifikováno inzercí, substitucí a/nebo delecí aminokyselin 10 tak, že tato konvenční sekvence není v modifikovaném polypeptidovém jádře obsažena.
Mezi těmito aminokoncovými a/nebo karboxykoncovými inzercemi jsou takové, které obsahují aminokyselinové sekvence ve směru amino a/nebo karboxy vzhledem k endogenní proteinové 15 sekvenci, ze které se odvozuje polypeptidové jádro. Jestliže je například polypeptidové jádro odvozeno od proteinu gp41, taková inzerce by obsahovala aminokoncovou a/nebo karboxykoncovou inzerci obsahující aminokyselinovou sekvenci gp41 sousedící se sekvencí gp41 polypeptidového jádra. Takové aminokoncové a/nebo 2o karboxykoncové inzerce mohou typicky zahrnovat od přibližně 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 aminokyselinových zbytků ve směru amino a/nebo karboxy vzhledem k původnímu polypeptidovému jádru.
Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou ještě dále obsahovat další modifikace, které snadno dovolí detekci polypeptidu. 25 Hybridní polypeptidy mohou být například značeny, buď přímo nebo nepřímo. Způsoby značení peptidů jsou odborníkům v oboru dobře známé, a bez omezení zahrnují radioaktivní, fluorescenční a kolorimetrické techniky. Techniky nepřímého značení jsou rovněž odborníkům v oboru známy a zahrnují bez omezení systém značení 30 biotin/streptavidin a nepřímé značení protilátkami. - 76 ·· ·· « i f < ♦ · i
Vynález se dále týká asociace zesilujících polypeptidových sekvencí k typům molekul jiným než jsou peptidy. Například zesilující peptidové sekvence mohou být pro účely zesílení farmakokinetických vlastností těchto molekul navázány na molekuly nukleových kyselin 5 (např. DNA nebo RNA) nebo jakýkoli typ malé organické molekuly. 5.2 Syntéza peptidů
Zesilující polypeptidy, polypeptidová jádra a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány nebo připravovány způsoby io dobře známými v oboru, viz například Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co, NY, který se zařazuje ve svém celku odkazem. Hybridní polypeptidy mohou být připraveny použitím běžné postupné syntézy v roztoku nebo na pevné fázi, kondenzací fragmentů nebo chemickými reakcemi s využitím 15 Fmoc nebo Boc (viz např. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams a další, ed., 1997, CRC Press, Boča Raton Florida, a tam uváděné odkazy; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, ed., 1989, IRL Press, Oxford, Anglie, a tam uváděné odkazy). Podobně se mohou získávat 2o aminokoncové a/nebo karboxykoncové modifikace.
Tyto metody mohou zahrnovat obecně postupné přidávání jedné nebo více aminokyselin nebo vhodně chráněných aminokyselin k rostoucímu peptidovému řetězci. Obvykle se vhodnou ochrannou skupinou chrání buď aminová nebo karboxylová skupina první 25 aminokyseliny. Chráněná nebo derivatizovaná kyselina potom může být buď navázána na inertní pevný nosič nebo použita v roztoku přidáním další aminokyseliny v řadě s vhodně chráněnou komplementární (aminovou nebo karboxylovou) skupinou, za podmínek vhodných pro vytvoření amidové vazby. Ochranná skupina 30 se potom z tohoto nově přidaného zbytku aminokyseliny odstraní a potom se přidá další aminokyselina (vhodně chráněná) atd. Po
- 77 ·' ·· *· · P
♦ ♦ * ·· ♦♦ ♦ · · ♦ f ♦ · • · ·♦ ·*♦♦ navázání všech požadovaných aminokyselin v patřičném pořadí mohou být zbývající ochranné skupiny a případný pevný nosič odstraněn, buď postupně nebo současně, za získání požadovaného konečného polypeptidu. Jednoduchou modifikací tohoto obecného 5 postupu je možné přidávat k rostoucímu řetězci současně více než jednu aminokyselinu, například navázáním (za podmínek, při kterých nedochází k racemizaci chirálhích center) chráněného tripeptidu s vhodně chráněným dipeptidem zá vytvoření, po odstranění ochranných skupin, pentapeptidu. 10 Mezi typické ochranné skupiny patří T-butyloxykarbonyl (Boc), 9- -fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc), benxyloxykarbonyl (Cbz), p--toluensulfonyl (Tos); 2,4-dinitrofenyl, benzyl (Bzl), bifenylisopropyloxykarboxykarbonyl, cyklohexyl, isopropyl, acetyl, o--nitrofenylsulfonyl, apod. Z těchto skupin jsou výhodné Boc a Fmoc. 15 Typické pevné nosiče jsou obecně zesítěné polymerní materiály.
Sem patří bez omezení divinylbenzenem zesítěné polymery na bázi styrenu, například kopolymery divinylbenzen-hydroxymethylstyren, kopolymery divinylbenzen-chlormethylstyren a kopolymery divinylbenzen-benzhydrylaminopolystyren. Tyto kopolymery nabízejí 20 výhodu přímého zavádění koncové amidové funkční skupiny do peptidového řetězce, kdy tato funkční skupina se zachová na řetězci při jeho odštěpení od nosiče. Tímto způsobem mohou být syntetizovány polypeptidy obsahující buď L- nebo D-aminokyseliny. 25 Složení polypeptidu může být potvrzeno kvantitativní analýzou aminokyselin a specifická sekvence každého peptidu může být zjištěna analýzou sekvence.
Zesilující sekvence, polypeptidová jádra a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být čištěny způsoby známými v oboru, jako je 30 kapalná chromatografie s vysokou účinností s normálními nebo ♦ ♦ ♦ #·* reverzními fázemi, iontoměničová chromatografie, gelová elektroforéza, afinitní chromatografie, chromatografie typu size exclusion, srážení apod. Skutečné podmínky použité pro čištění konkrétního polypeptidu budou z části záviset na strategii syntézy 5 a na faktorech, jako je celkový náboj, hydrofobnost, hydrofilnost, rozpustnost, stabilita atd., a odborníkům v oboru budou zřejmé.
Hybridní polypeptidy, zesilující polypeptidy a polypeptidová jádra mohou být také vyráběna použitím technik rekombinantní DNA. V tomto případě je možno syntetizovat a/nebo klonovat nukleotidové 10 sekvence kódující polypeptidy podle vynálezu, které mohou být exprimovány způsoby dobře známými odborníkům v oboru, viz například Sambrook, a další, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, díl 1 - 3, Cold Spring Harbor Press, NY. Úsek DNA kódující sledovaný polypeptid je možno získat 15 použitím různých molekulárně biologických technik, které jsou známé odborníkům v oboru. Pro vytvoření fragmentu DNA kódujícího sledovaný protein může být například použita polymerázová řetězová reakce (PCR). Alternativně může být fragment DNA získán z komerčního zdroje. 20 DNA kódující sledované polypeptidy může být rekombinantním způsobem vložena do řady systémů hostiťel-vektor, které také poskytují replikaci DNA ve velkém měřítku. Tyto vektory mohou být navrženy tak, aby obsahovaly nezbytné prvky pro řízení transkripce a/nebo translace sekvence DNA kódující hybridní polypeptid. 25 Vektory, které mohou být použity, zahrnují bez omezení vektory odvozené od rekombinantní bakteriofágové DNA, plasmidové DNA nebo kosmidové DNA. Mohou být například použity plasmidové vektory jako jsou řady vektorů pcDNA3, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 a M13 mp. Mezi bakteriofágové vektory mohou patřit řady 30 bakteriofágových vektorů Xgt10, Xgt11, Xgt18-23, λΖΑΡ/R a EMBL. Jako kosmidové vektory mohou být bez omezení použity řady vektorů ♦· ·♦♦· pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 a charomid 9.
Alternativně je možno zkonstruovat rekombinantní virové vektory obsahující bez omezení vektory odvozené od vidů jako je herpetický 5 virus, retroviry, viry vakcinie, adenoviry, viry asociované s adenoviry nebo bovinní papilomavirus, rostlinné viry jako je virus tabákové mozaiky a bakulovirus.
Pro expresi biologicky aktivního polypeptidu musí být nukleotidová sekvence kódující protein vložena do vhodného io expresního vektoru, tj. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložených kódujících sekvencí. Pro konstrukci expresních vektorů, ve kterých je sekvence kódující hybridní polypeptid operativně spojena s vhodnými signály pro řízení transkripce/translace, mohou být použity metody dobře známé 15 odborníkům v oboru. Mezi tyto metody patří techniky rekombinantní DNA in vitro a syntetické techniky, viz například způsoby popisované v Sambrook, a další, 1992, Molecular Clonina. A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. a Ausubel a další, 1989, Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates & Wiley 20 Interscience, N.Y, z nichž každá je zařazena ve svém celku odkazem.
Molekula, nukleové kyseliny kódující hybridní polypeptid, zesilující polypeptid a polypeptidové jádro, o které se zajímáme, může být operativně spojena s řadou různých promotorových/zesilujících prvků. Promotorové/zesilující prvky mohou být zvoleny pro optimalizaci 25 exprese terapeutických množství proteinu. Expresní prvky těchto vektorů se mohou lišit z hlediska jejich síly a specificity. Na základě použitého systému hostitel/vektor je možno použít jakéhokoli z řady vhodných transkripčních a translačních prvků. Promotor může být ve formě promotoru, který je přirozeně asociovaný se sledovaným genem. 30 DNA může být alternativně umístěna pod řízení rekombinantního nebo heterologního promotoru, například promotoru, který není normálně - 80 - 80 ·· *· ♦ ··· • r · * • • ♦ • ' ♦ · • · • • • · • ♦ ··· ·* ·· ·· • · • ♦ • · • • * • • · • ♦ ♦ s tímto genem asociován. Pro řízení exprese převedené DNA ve specifických typech buněk mohou být použity tkáňově specifické promotorové/zesilující prvky. Příklady oblastí řídících transkripci, které mají tkáňovou 5 specificitu, které byly popsány a mohly by být použity, zahrnují bez omezení kontrolní oblast genu elastázy I, který je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (Swift a další, 1984, Cell 38: 639 - 646; Ornitz a další, 1986, Cold Sprina Harbor Svmp. Quant. Biol. 50: 399 - 409; MacDonald, 1987, Hepatoloav 7: 42S-51S); řídící oblast io inzulínového genu, která je aktivní v buňkách beta pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115 - 122); řídící oblast imunoglobulinového genu, která je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl a další, 1984, Cell 38: 647 - 658; Adams a další, 1985, Nátuře 318: 533 - 538; Alexander a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 15 1436 - 1444); řídící oblast albuminového genu, která je aktivní v játrech (Pinkert a další, 1987, Genes and Devel. 1: 268 - 276); řídící oblast alfa-fetoproteinového genu, která je aktivní v játrech (Krumlauf a další, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639 - 1648; Hammer a další, 1987, Science 235: 53 - 58); řídící oblast alfa-1-antitrypsinového genu, která 20 je aktivní v játrech (Kelsey a další, 1987, Genes and Devel. 1: 161 -171); řídící oblast beta-globinového genu, která je aktivní v myeloidních buňkách (Magram a další, 1985, Nátuře 315: 338 - 340; Kollias a další, 1986, Cell 46: 89 - 94); řídící oblast bazického proteinu myelinu, která je aktivní v oligodendrocytových buňkách v mozku 25 (Readhead a další, 1987, Cell 48: 703 - 712); řídící oblast genu lehkého řetězce 2 myosinu, která je aktivní v kosterních svalech (Shani, 1985, Nátuře 314: 283 - 286); a řídící oblast hormonu uvolňujícího gonadotropin, která je aktivní v hypothalamu (Mason a další, 1986, Science 234: 1372 - 1378). Mohou být použity promotory 3o izolované z genomu virů, které rostou v savčích buňkách (např. promotory viru vakcinie 7,5K, SV40, HSV, promotory adenovirů MLP, MMTV, LTR a CMV), stejně jako promotory vytvořené technikami - 81 ·· ·*♦* ·· ·» • · · · · · · • · * · I · • « * · · ♦ · • · · · · ♦ ♦ • Φ ·· #· ♦··· rekombinantní DNA nebo syntézou. V některých případech mohou být prvky promotoru konstitutivní nebo inducibilní promotory a mohou být použity za vhodných podmínek pro směrování vysoké hladiny řízené exprese sledované nukleotidové sekvence. Exprese genů pod řízením 5 konstitutivních promotorů nevyžaduje přítomnost specifického substrátu pro indukci genové exprese, a bude probíhat za všech podmínek buněčného růstu. Naopak exprese genů řízených inducibilními promotory odpovídá na přítomnost nebo nepřítomnost induktoru. 10 Pro dostatečnou translaci vložených sekvencí kódujících protein jsou také nezbytné specifické iniciační signály. Mezi tyto signály patří iniciační kodon ATG a sousední sekvence. V případech, kdy jsou do vhodných expresních vektorů vloženy celé kódující sekvence včetně iniciačního kodonu a přilehlých sekvencí, nemusí být nutné žádné 15 další signály řídící translaci. V případech, kdy se vkládá pouze část kódující sekvence, však musí být poskytnuty signály pro řízení exogenní translace včetně iniciačního kodonu ATG. Navíc musí být iniciační kodon ve fázi s čtecím rámcem sekvencí kódujících protein pro zajištění translace celého inzertu. Tyto exogenní signály řízení 20 translace a iniciační kodony mohou být různého původu, přirozeného i syntetického. Účinnost exprese může být zvýšena zavedením transkripčních atenuačních sekvencí, zesilujících prvků apod. 5.3 Použití zesilujících peptidovvch sekvencí, polypeptidovych jader 25 a hybridních polypeptidů podle vynálezu
Jak je diskutováno výše, zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být použity ke zlepšení farmakokinetických vlastností kteréhokoli polypeptidového jádra prostřednictvím spojení poíypeptidového jádra se zesilujícími peptidovými sekvencemi za 30 vytvoření hybridních polypeptidů. Pozorované zlepšení farmakokinetických vlastností se vztahuje k farmakokinetickým ·« ···* • · · · · » • · · t · • · - 82 • 9 * * · · • « 9 9 9 9 9 99 99 99 9999 vlastnostem samostatného polypeptidového jádra. Standardní farmakokinetické charakteristické vlastnosti a způsoby zjištění a .charakterizace farmakokinetických vlastností prostředku jako je polypeptid jsou odborníkům v oboru dobře známé. Neomezující 5 příklady těchto metod jsou uvedeny v následující příkladové části.
Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být navíc použity pro zvýšení poločasu polypeptidového jádra, na které byly navázány zesilující peptidové sekvence, in vitro nebo ex-vivo. Zesilující peptidové sekvence mohou například zvýšit poločas io navázaných polypeptidových jader, jestliže jsou výsledné hybridní polypeptidy přítomny v buněčné kultuře, tkáňové kultuře nebo vzorcích od pacienta (například vzorky buněk, vzorky tkání z biopsie nebo další vzorky obsahující tělesné tekutiny).
Polypeptidová jádra a hybridní polypeptidy podle vynálezu 15 mohou být také využity jako součást metod pro modulaci (například snížení, inhibici, rozbití, stabilizaci nebo zesílení) fuzogenních dějů. Tyto peptidy mají s výhodou antifuzogenní nebo antivirovou aktivitu. Peptidy podle vynálezu mohou také mít schopnost modulovat intracelulární procesy, kterých se účastní peptidové interakce typu 20 coiled-coil. V konkrétních provedeních mohou být hybridní polypeptidy a polypeptidová jádra podle vynálezu, které mají antivirové účinky, použity jako součást metod pro snížení virové infekce. Tyto antivirové metody mohou být použity například proti lidským retrovirům, zvláště 25 HIV (virus lidské imunodeficience), např. HIV-1 a HIV-2, a lidským virům T-lymfocytů (HTLV-I a HTLV-II), a jiným než lidským retrovirům, jako je virus bovinní leukózy, viry kočičího sarkomu a leukemie, viry opičí imunodeficience (SIV), sarkomové a leukemické viry a viry progresivní pneumonie ovcí. 3o Antivirové metody podle vynálezu mohou být také použity proti neretrovirovým virům, včetně bez omezení viru respiračního syncytia «··»···* OO » »*«· ♦«··· - oj - ·· ····**· ».· ><«< ·· ·· *· ···· (RSV), viru psinky, viru newcastleské nemoci, viru lidské parainfluenzy, virů chřipky, virů spalniček, virů Epstein-Barrové, virů hepatitidy B a virů Mason-Pfizer. Výše uvedené viry jsou viry opatřené obalem. Antivirové metody 5 podle vynálezu mohou být také použitý proti virům, které nejsou opatřeny obalem, včetně bez omezení pikornavirů jako jsou polioviry, viru hepatitidy A, enteroviru, echoviru, viru coxsackie, papovavirů jako je papillomavirus, parvovirů, adenovirů a reovirů.
Další antifuzogenní aktivity, které mohou být modulovány 10 metodami využívajícími peptidy podle vynálezu, zahrnují bez omezení modulaci výměny neuronových přenašečů prostřednictvím buněčné fúze, a fúze spermie-vajíčko. Mezi intracelulárními poruchami, kterých se účastní interakce typu coiled-coil, které mohou být odstraněny způsoby využívajícími peptidy podle vynálezu, jsou poruchy s účastí 15 například bakteriálních toxinů.
Antifúzní nebo antivirová aktivita daného polypeptidového jádra nebo hybridního polypeptidu může být rutinně zjišťována standardními tedsty in vitro, ex vivo a na zvířecích modelech, které mohou být vzhledem k antivirové aktivitě pro sledovaný virus specifické nebo 20 částečně specifické, a které jsou dobře známé odborníkům v oboru. Výše uvedený popis se týká hlavně antivirových a s antifúzními účinky souvisejících aktivit polypeptidových jader a hybridních polypeptidů podle vynálezu. Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také použity jako součást jakékoli metody, při které může 25 být uvažováno podávání nebo použití samotného polypeptidového jádra. Použití hybridních polypeptidů jako součást těchto metod je zvláště výhodné v případech, kdy se požaduje zlepšení farmakokinetických vlastností polypeptidového jádra. Například inzulín se používá jako součást léčby některých typů diabetů. Hybridní 30 polypeptid obsahující inzulín nebo fragment inzulínu jako polypeptidové jádro může být proto také použit jako součást metod - 84 - 84
»« «ΙΜ • · 4 9 4 4 4· 4 4 · · · 44 44 ·· ·· • 4 4 · 4 4 4 4 4· 4 4 4 «· 4444 odstranění příznaků těch forem diabetů, u kterých se používá a/nebo uvažuje použití inzulínu.
Navíc k výše popsaným léčebným metodám mohou být peptidy podle vynálezu ještě dále použity jako součást prognostických metod 5 pro prevenci stavů, včetně bez omezení poruch zahrnujících fúzní děje, intracelulárních procesů zahrnujících peptidy typu coiled-coil a virových infekcí, kterých se účastní fúze buňka-buňka a/nebo virus-buňka. Například polypeptidové jádro a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být použity jako součást preventivních metod pro io prevenci virové infekce.
Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být ještě dále použity jako součást diagnostických metod. Tyto metody mohou být buď metody in vivo nebo in vitro. S použitím hybridního polypeptidu obsahujícího polypeptidové jádro a modifikaci primární 15 aminokyselinové sekvence umožňující detekci hybridního polypeptidu může být také provedena jakákoli diagnostická metoda, při které je možno použít určitého polypeptidového jádra. Tyto techniky mohou odrážet zlepšení vzhledem k diagnostickým metodám v tom, že samotné zvýšení poločasu hybridního polypeptidu vzhledem 20 k poločasu samostatného polypeptidového jádra může zvýšit citlivost diagnostického postupu, při kterém se používá. Mezi tyto diagnostické postupy patří bez omezení zobrazovací metody, například metody zobrazování in vivo. V neomezujícím příkladu zobrazovací metody může být detekována struktura, která se váže na polypeptidové jádro 25 hybridního polypeptidu, prostřednictvím vazby hybridního polypeptidu a zobrazení (buď přímého nebo nepřímého) navázaného hybridního polypeptidu. - 85 • *» #4* I ·· · · • • • • · • • • • · • · • » · 4 • « · ·«· <«·* ·* 4 · »4 ·* • · * « I I · • · · · • · · ·* ·»·* 5.4 Farmaceutické prostředky, dávkování a způsoby podávání
Peptidy podle vynálezu mohou být podávány použitím způsobů dobře známých odborníkům v oboru. Prostředky se s výhodou formulují a podávají systémově. Způsoby formulace a podávání je 5 možno nalézt v publikaci „Remington’s Pharmaceutical Sciences11, poseldní vydání, Mack Publishing Co, Easton, PA. Mezi vhodné způsoby mohou patřit orální, rektální, vaginální, plicní (například inhalační), transdermální, transmukosální nebo intestinální podávání; parenterální podávání včetně intramuskulárních, subkutánních io a intramedulárních injekcí, stejně jako intrathekálních, přímých intraventrikulárních, intravenózních, intraperitoneálních, intranazálních nebo intraokulárních injekcí, pokud uvádíme pouze příklady. Pro intravenózní injekci mohou být prostředky podle vynálezu formulovány ve vodných roztocích, s výhodou ve fyziologicky kompatibilních 15 pufrech jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok, nebo fyziologickém solném roztoku, pokud uvádíme jenom některé. Navíc mohou být pro dodávání peptidů podle vynálezu používány infuzní pumpy. Pro transmukosální podávání se ve formulaci používají penetrační prostředky pro usnadnění pronikání bariérou. Tyto penetrační 20 prostředky jsou v oboru obecně známé. V případech, kdy je výhodné intracelulární podávání peptidů podle vynálezu nebo jiných inhibičních prostředků, mohou být použity techniky dobře známé odborníkům v oboru. Takové prostředky mohou být například zapouzdřené do liposomů nebo mikrosfér a potom 25 podávány jak bylo popsáno výše. Liposomy jsou kulové lipidické dvojvrstvy s vodnou fází uvnitř. Všechny molekuly přítomné ve vodném roztoku v době vytváření liposomů jsou do této vodné vnitřní části zahrnuty. Obsahy liposomů jsou jak chráněné před vnějším mikroprostředím, tak i účinně dodávány do buněčné cytoplasmy, 30 protože liposomy fúzují s buněčnými membránami. Navíc v důsledku 86 - *« ·» II ·ΜΙ ·· ···· · * ·· · « · · . · * · · «··· 1 · · · · • · 4 · · · · · • Μ ···· «· ·· ·· ΜΜ jejich hydrofobičnosti, pokud se mají podávat malé molekuly, je možno dosáhnout přímého intracelulárního podávání.
Nukleotidové sekvence kódující peptidy podle vynálezu, které se mají podávat intracelulárně, mohou být exprimovány ve sledovaných 5 buňkách s použitím technik dobře známých odborníkům v oboru. Pro dodávání a expresi těchto nukleotidových sekvencí do populace cílových buněk mohou být například použity expresní vektory odvozené od virů jako jsou retroviry, viry vakcinie, viry asociované s adenoviry, herpetické viry nebo bovinní papilomaviry. Způsoby io konstrukce těchto vektorů a expresních konstruktů jsou dobře známé, viz například Sambrook a další, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, a Ausubel a další, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates a Wiley Interscience, NY. 15 Účinné dávky peptidů podle vynálezu vhodné pro podávání mohou být zjištěny způsoby dobře známými v oboru, které se týkají parametrů jako biologický poločas, biologická dostupnost a toxicita. Ve zvláště výhodných provedeních určuje odborník v oboru účinné rozmezí dávek hybridního polypeptidu použitím údajů z rutinních studií 2o in vitro a in vivo, které jsou dobře známé odborníkům v oboru. Například testy antivirové aktivity na buněčných kulturách in vitro, jako jsou testy uváděné pro T1249 jako příklady v části 7 dále, budou poskytovat údaje, ze kterých může odborník v oboru snadno určit střední inhibiční koncentraci (IC) peptidu nebo polypeptidu nutného 25 pro blokování určitého množství infekční schopnosti viru (např. 50 %, IC50; nebo 90 %, IC50). Vhodné dávky je potom možno zvolit použitím farmakokinetických údajů z jednoho nebo více rutinních modelů na zvířatech, jako jsou farmakokinetické údaje popisované jako příklady v části 10 níže, pro T1249, takže se získá minimální koncentrace 30 peptidu v plasmě (Cmin). která je rovná nebo která je vyšší než je zjištěná hodnota IC. 0*7 ······· -0/- ·" · ···· ·«····· ·· · · Příklady dávek polypeptidu mohou být již 0,1 pg/kg tělesné hmotnosti a až 10 pg/kg tělesné hmotnosti. Výhodnější rozmezí účinných dávek je od 0,1 do 100 pg/kg tělesné hmotnosti. Další příklady dávek peptidů podle vynálezu zahrnují 1 až 5 mg, 1 až 10 mg, 5 1 až 30 mg, 1 až 50 mg, 1 až 75 mg, 1 až 100 mg, 1 až 125 mg, 1 až 150 mg, 1 až 200 mg, nebo 1 až 250 mg peptidu. Terapeuticky účinná dávka označuje takové množství sloučeniny, které je dostatečné pro dosažení odstranění příznaků nebo pro prodloužení přežití u pacienta. Toxicitu a terapeutickou účinnost těchto sloučenin je možno zjistit io standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, například pro zjištění LD50 (dávka smrtelná pro 50 % populace) a ED50 (dávka terapeuticky účinná pro 50 % populace). Poměr dávek mezi toxickým a terapeutickým účinkem je terapeutický index a může být vyjádřen jako poměr LD50/ED50· 15 Výhodné jsou sloučeniny, které mají větší terapeutické indexy. Data získaná z těchto testů na buněčných kulturách a studií na zvířatech mohou být použita pro formulaci rozmezí dávek pro použití u lidí. Dávky těchto sloučenin jsou s výhodou v rozmezích koncentrací v oběhu, které zahrnují ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávka se 20 může v tomto rozmezí lišit v závislosti na použité dávkové formě a způsobu podávání. Pro jakoukoli sloučeninu používanou při způsobu podle vynálezu se bude terapeuticky účinná dávka na počátku odhadovat na základě testů na buněčné kultuře. Dávka může být formulována na zvířecích modelech pro dosažení rozmezí koncentrací 25 v cirkulující plasmě, které zahrnuje IC50 (např. koncentrace testované sloučeniny, která poskytne polovinu maximální inhibice fuzogenního děje, jako je polovina maximální inhibice virové infekce vzhledem k míře takového děje v nepřítomnosti testované sloučeniny) při zjišťování v buněčné kultuře. Tyto informace mohou být použity pro 30 přesnější určení použitelných dávek u člověka. Hladiny v plasmě mohou být měřeny například vysokoúčinnou kapalinovou • •Μ
chromatografií (HPLC) nebo jakýmkoli biologickým nebo imunologickým testem schopným měřit hladiny peptidů.
Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být podávány jednorázově, přerušovaně, periodicky nebo kontinuálně. Polypeptidy podle vynálezu mohou být například podávány při jediném podání, jako je jediná subkutánní injekce, jediná intravenózní infuze nebo jediné spolknutí. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány ve větším počtu přerušovaných podávání, včetně periodických podávání. V některých provedeních mohou být například polypeptidy podle vynálezu podávány jednou týdně, jednou denně, dvakrát denně (např. každých 12 hod), každých 6 hodin, každé 4 hodiny, každé 2 hodiny nebo každou hodinu. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány kontinuálně, jako například kontinuální subkutánní nebo intravenózní infúzní pumpou, nebo pomocí subkutánního nebo jiného implantátu, který dovolí kontinuální absorpci polypeptidů tělem pacienta.
Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány v kombinaci s alespoň jedním dalším léčebným prostředkem. Ačkoli to není pro terapii HIV výhodné, může se provádět podávání jiných typů léčení (například protirakovinné terapie) současně nebo postupně, včetně cyklického léčení (tj. podávání první sloučeniny po určité časové období a následné podávání druhé antivirové sloučeniny po určité časové období, a opakování tohoto postupného podávání s cílem snížit vyvinutí rezistence na některé z těchto léčení. V případě virových, například retrovirových infekcí, se může účinné množství hybridního polypeptidů nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu podávat v kombinaci s alespoň jedním, s výhodou alespoň dvěma jinými antivirovými prostředky.
Pokud jako příklad vezmeme infekci HIV, tyto antivirové prostředky mohou bez omezení zahrnovat DP-107 (T21), DP178 (T20), jakékoli jiné pofypeptidové jádro znázorněné v tabulce 2
- 89 - 89 » · • ♦ • · ···· ·· • · · · · • · ♦ · · · · 9 Φ ·»·· ···· · • · ·♦*···♦ ·· ···· ·· Μ ·· ···· odvozené z HIV-1 nebo HIV-2, jakýkoli jiný hybridní polypeptid, jehož polypeptidové jádro je alespoň z části odvozené od HIV-1 nebo HIV-2, cytokiny, například rIFN a, rlFN β, rIFN γ; inhibitory reverzní transkriptázy včetně nukleosidových a nenukleosidových inhibitorů, 5 např. AZT, 3TC, D4T, ddl, adefovir, abakavir a další dideoxynukleosidy nebo dideoxyfluoronukleosidy, nebo delaviridin--mesylát, nevirapin, efavirenz; inhibitory úpravy virové mRNA čepičkou, jako je ribavirin; inhibitory HIV proteázy, jako je ritonavir, nelfinavirmesylát, amprenavir, sakvinavir, sakvinavirmesylát, indinavir io nebo ABT378, ABT538 nebo MK639; amfotericin B jako molekula vázající lipid s anti-HIV aktivitou; a kasta n os perm i n jako inhibitor úpravy v buňkách (procesingu) glykoproteinů.
Hybridní polypeptidy a/nebo polypeptidová jádra podle vynálezu mohou být dále využívány profylakticky pro prevenci onemocnění. 15 Hybridní polypeptidy a/nebo polypeptidová jádra mohou působit přímo pro zabránění onemocnění, nebo mohou být alternativně použity jako vakcíny, kde hostitel vytváří protilátky proti hybridním polypeptidům podle vynálezu, které potom slouží pro neutralizaci patogenních organismů včetně například inhibice virové, bakteriální a parazitické 20 infekce.
Pro všechna tato léčení popisovaná výše může být zvolena přesná formulace, způsob podávání a dávkování jednotlivým ošetřujícím lékařem podle pacientova stavu (viz např. Fingl a další, 1975, v „The Pharmacological Basis of Therapeutics", kap. 1, str. 1). 25 Je třeba uvést, že ošetřující lékař by věděl, jak a kdy ukončit, přerušit nebo upravit podávání z hlediska toxicity nebo poruchy funkce orgánů. Naopak ošetřující lékař by také věděl, jak upravit léčení pro zvýšení klinické odpovědi tam, kde není odpovídající (a vyhnout se toxicitě. Velikost podané dávky při zvládání onkogenního onemocnění 30 bude záviset na vážnosti léčeného stavu a způsobu podávání. Dávka a patrně i počet dávek se také budou lišit v závislosti na věku, tělesné - 90 hmotnosti a reakci jednotlivého pacienta. Ve veterinárním lékařství může být použit program srovnatelný s výše diskutovaným programem.
Do rámce předkládaného vynálezu také patří použití farmaceuticky přijatelných nosičů pro formulaci zde popisovaných 5 sloučenin pro provádění vynálezu do dávkových forem vhodných pro systémové podávání. Při správném výběru nosiče a vhodném provádění výroby mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu, zvláště sloučeniny formulované jako roztoky, podávány parenterálně, jako je subkutánní injekcí, intravenózní injekcí, 10 subkutánní infuzí nebo intravenózní infuzí, například infuzní pumpou, sloučeniny mohou být snadno formulovány použitím farmaceutických nosičů, dobře známých v oboru, na dávkové formy vhodné pro orální podávání. Tyto nosiče umožní formulaci sloučenin podle vynálezu do formy tablet, pilulek, kapslí, kapalin, gelů, sirupů, kaší, suspenzí 15 apod., pro orální přijímání léčeným pacientem.
Mezi farmaceutické prostředky vhodné pro použití v předkládaném vynálezu patří prostředky, ve kterých jsou obsaženy účinné složky v účinném množství pro dosažení zamýšleného účelu. Zjištění účinných množství spadá do schopnosti odborníka v oboru, 20 zvláště z hlediska zde poskytovaného podrobného popisu.
Navíc k účinným složkám mohou tyto farmaceutické prostředky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče obsahující excipienty a pomocné látky umožňující zpracování účinných sloučenin do prostředků, které mohou být farmaceuticky použity. Prostředky 25 formulované pro orální podávání mohou být ve formě tablet, dražé, kapslí nebo roztoků. Pro orální podávání peptidů jsou dobře známé v oboru způsoby, které se například používají firmou Emisphere Technologies, které mohou být rutinně používány.
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou 30 být vyráběny způsobem, který je sám o sobě znám, .například pomocí běžného míšení, rozpouštění, granulace, výroby dražé, roztírání, - 91 • · • ·· « • · • · · • · ·· ♦ t • ♦ · ·
rozprašovacího sušení, emulgace, zapouzdřování, zachycování nebo lyofilizace.
Farmaceutické prostředky pro parenterální podávání zahrnují vodné roztoky účinných složek ve formě Rozpustné ve vodě. Navíc 5 mohou být připraveny emulze a suspenze účinných složek ve formě vhodných olejových injekčních směsí. Mezi vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula patří mastné oleje jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát nebo triglyceridy, liposomy nebo jiné látky známé v oboru pro výrobu 10 lipidových nebo lipofilních emulzí. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je sodná sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran. Suspenze může také popřípadě obsahovat vhodné stabilizátory nebo látky zvyšující rozpustnost sloučenin pro umožnění přípravy vysoce koncentrovaných 15 roztoků.
Farmaceutické prostředky pro orální použití mohou být získány kombinací účinných sloučenin s pevnou pomocnou látkou, popřípadě rozdrcením výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných látek v případě potřeby za získání tablet nebo 20 jader dražé. Vhodné pomocné látky jsou zvláště plniva jako jsou cukry včetně laktózy, sacharózy, trehalózy, mannitolu nebo sorbitolu; celulózové preparáty jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragakantová guma, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl 25 karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). V případě potřeby mohou být přidána rozvolňovadla, jako je zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar, nebo alginová kyselina nebo její sůl, jako je alginát sodný. Jádra dražé jsou opatřena vhodnými povlaky. K tomuto účelu 30 mohou být použity koncentrované cukerné roztoky, které mohou popřípadě obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, - 92 • · • · t * • · • · • · ··« ···· ·· ···· • · f • · · · · · • i · · ·· · · • · · · · · · ·· ·· ······ ♦ · karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Do povlaků tablet nebo dražé mohou být přidávány barevné látky nebo pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci různých kombinací dávek aktivní 5 sloučeniny.
Farmaceutické prostředky, které mohou být použity orálně, zahrnují zasunovací kapsle vyrobené z želatiny, stejně jako měkké, uzavřené kapsle, vyrobené ze želatiny a plastifikátoru, jako je glycerol nebo sorbitol. Zasunovací kapsle mohou obsahovat účinné složky ve 10 směsi s plnivem jako je laktóza, pojivý jako jsou škroby a/nebo kluznými látkami jako je talek nebo stearan hořečnatý, a popřípadě stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být účinné sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, parafinový olej nebo kapalné polyethylenglykoly. Navíc 15 mohou být přidány stabilizátory. V případech, kdy je žádoucí zesílení imunitní odpovědi hostitele, mohou být hybridní polypeptidy formulovány s vhodným adjuvans pro zvýšení imunologické odpovědi. Mezi tato adjuvans mohou bez omezení patřit minerální gely jako je hydroxid hlinitý; povrchově aktivní 20 látky jako je lysolecithin, pluronové polyoly, polyanionty; jiné peptidy; olejové emulze; a potenciálně použitelná adjuvans jako je BCG a Corynebacterium parvum. Pro zavádění vakeín popisovaných výše mohou být použity různé způsoby. Mezi tyto způsoby patří bez omezení orální, intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, 25 intravenózní, subkutánní a intranazální způsoby. - 93 • ·· · • · · • · • « · · · · · · · ······· ·· ·· ·· ···· Příklady provedení vynálezu 6. Příklad
Identifikace konvenčních aminokyselinových sekvencí, které obsahují zesilující peptidové sekvence 5 Retrovirový protein gp41 obsahuje strukturní domény označované jako oblast α-šroubovice, umístěné v C-koncové oblasti proteinu, a oblast leucinového zipu umístěnou v N-koncové oblasti proteinu. Porovnání oblastí zesilující peptidové sekvence obsažených v gp41 (obr. 2A a 2B) z gp41 ze všech dosud publikovaných io izolovaných sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV identifikovalo konvenční aminokyselinové sekvence ukázané v obr. 1.
Jak je popsáno podrobně v dále uvedených příkladech, tyto sekvence reprezentují zesilující peptidové sekvence v tom, že vazba těchto peptidových sekvencí na celou řadu různých polypeptidových 15 jader zlepšuje farmakokinetické vlastnosti výsledných hybridních polypeptidů. 7. Příklad
Hybridní polypeptidv. které fungují jako silné inhibitory infekce HIV-1 2o T1249, tak jak je znázorněn na obr. 13, je hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na polypeptidové jádro HIV. Jak je uvedeno dále, hybridní polypeptid T1249 má zlepšené farmakokinetické vlastnosti a silnou aktivitu in vitro proti izolátům HIV-1, HIV-2, a SIV, se zlepšenou účinností proti klinickým 25 izolátům HIV-1 v testech infekčností HuPBMC in vitro stejně jako v myším modelu HuPBMC SCID infekce HIV-1 in vivo. V dále popisovaných biologických testech se aktivita T1249 porovnává s účinným antivirovým polypeptidem T20. Polypeptid T20, který je také - 94 - 94 ···· • · · · · · · známý jako DP-178, je odvozený z proteinové sekvence gp41 HIV-1 a popisuje se a nárokuje v US patentu No. 5,464,933. 7.1 Materiály a metody 5 7.1.1 Syntéza a čištění peptidii
Peptidy byly syntetizovány pomocí chemických reakcí typu Fast Moc. Obecně, pokud není uvedeno jinak, obsahovaly peptidy amidované karboxylové konce a acetylované aminové konce. Čištění bylo prováděno HPLC s reverzními fázemi. ίο T1249 (Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASL- -WEWF-NH2) je peptid o délce 39 aminokyselin (Mh = 5036,7), který se skládá výlučně z aminokyselin vyskytujících se v přírodě a je na aminovém konci blokován acetylovou skupinou, a karboxylový konec je blokován amidovou skupinou pro zvýšení stability. T1387 je peptid 15 o délce 23 aminokyselin postrádající zesilující peptidové sekvence (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2). T1387 tedy představuje polypeptidové jádro hybridního polypeptidu T1249. T1387 je na aminovém a karboxylovém konci blokován stejným způsobem jako T1249. 20 T1249 byl konkrétně syntetizován použitím standardních podmínek syntézy na pevné fázi. Identita hlavního vrcholu záznamu HPLC byla potvrzena hmotnostní spektroskopií jako T1249. T1249 byl snadno vyčištěn chromatografií s reverzními fázemi na koloně 15,2 cm naplněné nosičem C18, 10 pm, 120Á. 7.1,2 Virus
Virus HIV-1Lai (Popovic, M. a další, 1984, Science 224: 497 -508) byl pomnožen v buňkách CEM kultivovaných v médiu RPMI 1640 s obsahem 10% fetálního telecího séra. Supernatant z infikovaných • · « · buněk CEM byl protlačen filtrem 0,2 pm a infekční titr byl určen mikroinfekčním testem použitím buněčné linie AA5, aby se podpořila replikace viru. K tomuto účelu bylo 20 pl sériově zředěného viru přidáno ke 20 pl buněk CEM v koncentraci 6 x 105/ml v 96-jamkové 5 mikrotitrační destičce. Každé ředění viru bylo testováno v triplikátu. Buňky byly kultivovány 7 dnů přidáváním čerstvého média každý druhý den. Sedm dnů po infekci byly vzorky supernatantu testovány na replikaci viru, jejímž důkazem byla aktivita reverzní transkriptázy uvolňovaná do supernatantu. Byla vypočtena hodnota TCID5o pomocí io vzorce podle Reeda a Muencha (Reed, L. J. a další, 1938, Am. J. Hyg. 27: 493 - 497). 7.1.3 Test buněčné fúze Přibližně 7 x 104 buněk Molt-4 bylo inkubováno s 1 x 104 buněk 15 CEM chronicky infikovaných buňkami HIV-1Lai v 96-jamkových destičkách pro tkáňové kultivace v konečném objemu 100 μΙ kultivačního média (RPMI 1640 obsahující 10% teplem inaktivované FBS, doplněné 1% L-glutaminem a 1% Pen-Strep), jak bylo popsáno dříve (Matthews, T. J., a další, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 20 5424 - 5428). Peptidové inhibitory byly přidávány v objemu 10 μ! a buněčné směsi byly inkubovány 24 hod při 37 °C v 5% C02. V tomto čase byly počítány vícejaderné obří buňky (syncytia, šířka pěti buněk nebo větší) mikroskopickým vyšetřením při zvětšení 10 x a 40 x, které umožnilo vizualizaci celé jamky v jediném poli. Ošetřené buňky byly 25 porovnávány s infikovanými, neošetřenými kontrolami, a výsledky byly vyjádřeny jako procento inhibice infikovaných kontrol. 7.1.4 Testy infekčnosti MAGI-CCR-5 Přibližně 1 x 106 buněk Magi-CCR-5 (získaných prostřednictvím 30 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of - 96 - ♦ · *· ♦ ♦ · ♦ • ♦ · ♦ • · · · * · • · · · ··«:·:§>♦·· ·· • * « · · · *· ·· • · * · ♦ • I # • m · * · • · · · ·« ··♦· AIDS, NIAID; Chackerian, B., a další, 1997, J. Virol. 7t: 3932 - 3939) bylo zaočkováno do 48-jamkové destičky pro tkáňovou kultivaci (přibližně 2 x 104 buněk/jamku v objemu 300 pl/jamku selektivního růstového média obsahujícího DMEM doplněné 10 % teplem 5 inaktivovaného FBS, 1 % L-glutaminu, 1 % Pen/Strep, hygromycinem B, geneticinem a puromycinem) a ponecháno přichytit přes noc při 37 °C, 5 % C02. Do následujícího dne bylo dosaženo konfluence buněk přibližně 30 %. Očkovací médium bylo odstraněno a byl přidán zředěný peptidový inhibitor v objemech 50 μΙ/jamku (u neošetřených io kontrol pouze média) a potom 100 μΙ/jamku zředěného viru (požadovaný vstupní titr viru 100 až 200 pfu/jamku). Nakonec bylo do každé jamky přidáno 250 μΙ selektivního růstového média a destička byla inkubována 2 dny při 37 °C, 5% C02. Fixace a barvení byly prováděny podle protokolu poskytnutého NIAID pro buňky MAGI-15 CCR5. Ve stručnosti, médium bylo z destičky odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 500 μΙ fixačního roztoku. Destičky byly ponechány fixovat 5 min při teplotě místnosti. Fixační roztok byl odstraněn, každá jamka byla dvakrát promyta DPBS, a do každé jamky bylo přidáno 200 μΙ barvicího roztoku. Destička byla potom inkubována při 37 °C, 20 5% C02, 50 min, byl odstraněn barvicí roztok a každá jamka byla dvakrát promyta DPBS. Destička byla ponechána sušit na vzduchu před počítáním modrých buněk pod mikroskopem pro celou jamku. Ošetřené jamky byly porovnávány s infikovanými, neošetřenými kontrolami, a výsledky byly vyjádřeny jako procenta inhibice 25 infikovaných kontrol. 7.1.5 Test na reverzní transkriptázu
Mikrotest na reverzní transkriptázu (RT) byl upraven z Goff a další (Goff, S. a další, 1981, J. Virol. 38: 239 - 248) a Willey a další 30 (Willey, R. a další, 1988, J. Virol. 62: 139 - 147). Supernatanty z kultur virů/buněk byly upraveny na koncentraci 1% Triton-X100. 10 μΙ - 97 - ···.'· * ♦ ♦ ♦ · · • · · · · • · · · ··· ·♦·· ·· #·' • · ·· • · ♦ • · • · každého vzorku supernatant/Triton X-100 bylo. přidáno k 50 pl koktejlu RT (75 mM KCI, 2 mM Clevelandsovo činidlo, 5 mM MgCI2, 5 pg/ml póly A, 0,25 jednotek/ml oligo dT, 0,05% NP40, 50 mM Tris-HCI, pH 7,8, 0,5 pM neradioaktivní dTTP, a 10 cCi/ml 32P-dTTP) v 96-jamkové 5 mikrotitrační destičce s U-dnem a destičky byly inkubovány při 37 °C 90 min. Po inkubaci bylo 40 pl reakční směsi z každé jamky převedeno do zařízení Schleicher a Schuell (S+S) dot blot apparatus, v částečném vakuu, nesoucího mřížkou rozdělenou 96-jamkovou filtrační vrstvu (Wallac catalog # 1450 - 423) a filtrační podložku io nasycenou pufrem 2 x SSC (0,3 M NaCI a 0,003 M citran sodný). Každá jamka byla čtyřikrát promyta alespoň 200 pl 2 x SSC při plném vakuu. Zařízení bylo rozloženo a filtrační papír rozdělený mřížkou byl odstraněn a třikrát promyt pufrem 2 x SSC. Nakonec byla filtrační membrána odsáta na absorpčním papíře, ponechána usušit na 15 vzduchu a byla uzavřena v zatavovacích sáčcích. Vzorky byly umístěny v kazetě s fosforeskujícím stínítkem a bylo přiloženo vymazané (alespoň 8 min) fosforeskující stínítko a kazeta byla uzavřena. Expozice trvala 16 hod. Hodnoty Pixel Index Values (PIV) vytvořené ve formátu „volume reporting formát" získaném z přenosů 20 zobrazování s použitím fosforescence (Molecular Dynamics
Phosphorimager) byly použity pro zjištění ovlivněné nebo inhibované frakce (Fa) pro všechny dávky inhibitoru nebo inhibitorů při porovnání s neošetřenými infikovanými kontrolami (analýza programem ImageQuant volume report, korekce na pozadí). 25
7.1.6 Test infekčnosti/neutralizace na lidských PBMC
Tento prototypový test používal buněčné linie, kde test primárního izolátu využívá PBMC získané od Interstate Blood Bank, aktivované 2 až 3 dny kombinací protilátek OKT3 (0,5 pg/ml) a CD28 30 (0,1 pg/ml). Cílové buňky byly naneseny na médium pro separaci lymfocytů (LSM), promyty a zmraženy. Buňky byly ponechány podle - 98
·· · *·· «9 ·· • ♦ · · · · * 9 · 9 # I · • · · · t · · 9 * · · · * * 99 ·· 99 999# potřeby roztát a byly aktivovány jak bylo uvedeno výše minimálně 2 až 3 dny před testem. V tomto testu v 96-jamkovém formátu byly buňky v koncentraci 2 x 106/ml v 5% médiu IL-2 a konečném objemu 100 μΙ. Zásobní roztoky peptidu byly připraveny v DBPS (1 g/ml). Ředění 5 peptidu byla prováděna v kompletním médiu RPMI 1640 s 20 % FBS/5 % IL-2.
7.1.7 Model infekce HIV-1 in vivo na myších SCID HuPBMC
Samice myší SCID (stáří 5 až 7 týdnů) dostaly 5 až 10 x 107 io PBMC z dospělých lidí intraperitoneální injekcí. O dva týdny později byly myši infikovány i.p. v den 0 103 TCID50 HIV-1 9320 (izolát A018 citlivý na AZT). Léčení peptidy probíhalo i.p., dvakrát denně, počínaje dnem -1, a pokračovalo až do šestého dne. Míra infekce krevních buněk, splenocytů, lymfatických uzlin a peritoneálních buněk byla 15 zjišťována kvantitativní společnou kultivací s lidskými blasty PBMC týdně po tři za sebou následující týdny po odběru vzorků krve a tkání (den 7, přibližně 12 až 18 hod po posledním podání léčiva). Supernatanty ze společné kultivace byly vyhodnocovány na produkci antigenu HIV-1 p24 jako měřítko infekce virem (kity a protokol 20 Immunotek Coulter). 7.1.8 Farmakokinetické studie na krysách
Byly použity samci krys CD o hmotnosti 250 až 300 g s dvojitým jugulárním katétrem, získaní od firmy Charles River Laboratories. 25 Peptidy byly vstřikovány do jednoho jugulárního katétru v objemu 200 μΙ roztoku peptidu (přibližně 3,75 mg/ml), koncentrace dávkovacího roztoku byla zjišťována Edelhochovou metodou (Edelhoch, 1967, Biochemistry 6: 1948 - 1954) a upravena na základě hmotnosti zvířat tak, že každé zvíře dostalo dávku 2,5 mg/kg). 30 Přibližně 250 až 300 μΙ krve bylo odebíráno v určených časových - 99 - - 99 - • ·· ·· · * • · • · ♦ · • · · * 9 ♦ # 9 9 · • · · ·♦ ·«·· »· «··♦ • · · ♦ · * • * · · • t ·· intervalech (0, 15, 30 min a 1, 2, 4, 6 a 8 hod) a uchováváno ve zkumavkách EDTA capiject. Z usazených buněk po centrifugaci byla odebrána plasma, která byla buď zmražena nebo ihned zpracována na analýzu fluorescenční HPLC.
7.1.9 Analýza vzorků plasmy fluorescenční HPLC 100 μΙ vzorku plasmy bylo přidáno k 900 μΙ srážecího pufru (acetonitril, 1,0% TFA, detergent), což vedlo k vysrážení většiny plasmatických proteinů. Po centrifugaci 10 000 ot/min 10 min bylo odebráno 400 μΙ supernatantu a přidáno k 600 μΙ vody pro HPLC. Podle koncentrace peptidu přítomného v každém vzorku byla prováděna sériová ředění v ředicím pufru složeném ze 40 % srážecího pufru a 60 % vody pro HPLC. Navíc k ředěním vzorku byla prováděna sériová ředění dávkovacího roztoku v pufru stejně jako v plasmě a použita pro vytvoření standardní křivky závislosti plochy vrcholu na známé koncentraci peptidu. Tato křivka byla potom použita pro výpočet koncentrace peptidu v plasmě, přičemž se brala v úvahu všechna provedená ředění a množství nastřikované na kolonu.
7.1.10 Protokol XTT
Pro měření cytotoxických/cytostatických účinků peptidů byly prováděny testy XTT (Weislow, O. S. a další, 1989, J. Nati. Cancer Inst. 81_: 577 - 586) v přítomnosti různých koncentrací peptidu s cílem účinně získat index selektivity (Sl). Hodnota TC5o byla při tomto testu zjišťována inkubací buněk v přítomnosti a nepřítomnosti sériově ředěného peptidu s následným přidáním XTT. V přežívajících/metabolizujících buňkách se XTT redukuje na rozpustné hnědé barvivo, XTT-formazan. Absorbance se odečítá a získané údaje se porovnávají mezi vzorky s přítomností a bez přítomnosti peptidu pro určení TC50 použitím Karberovy metody (viz
♦ ·«·« ♦· · ··♦ • · ♦ · · t · • « * · # · «* · · * - 100- ·..··..· např. Lennette, E. H. a další, ed., 1969, „Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections", American Public Health Association, lne., čtvrté vyd., str. 47 - 52). Buňky Molt 4, CEM (80 000 buněk/jamku) a kombinace těchto dvou typů buněk (70 000, 5 popřípadě 10 000) byly vysety a inkubovány se sériově ředěným peptidem 24 hod v celkovém objemu 100 μΙ. Po inkubaci bylo do každé jamky přidáno 25 pl pracovního zásobního roztoku XTT (1 mg/ml XTT, 250 μΜ PMS v úplném médiu obsahujícím 5% DMSO) a destičky byly inkubovány při 37 °C. Bylo odečítáno vyvinuté zbarvení io a výsledky byly použity pro vyjádření hodnot poskytnutých jamkami obsahujícími peptid jako procento hodnot z jamek s neošetřenou kontrolou. 7.2 Výsledky 15 7.2.1 Antivirová účinnost - testy fúze T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech mezibuněčné fúze zprostředkované virem, prováděných na chronicky infikovaných buňkách CEM smíšených s neinfikovanými buňkami Molt-4, jak je ukázáno v tabulce 3 dále. Inhibice fúze T1249 proti laboratorním 2o izolátům, jako je lllb, MN a RF, je porovnatelná s T20, a vykazuje přibližně 2,5 až 5 násobné zlepšení ve srovnání s T20. T1249 byl rovněž aktivnější (zlepšení 3 až 28 krát) než T20 proti několika klinickým izolátům indukujícím syncytia, včetně AZT rezistentního izolátu (G691-2), a izolátu léčeného před AZT (G762-3), a 9320 25 (izolátu použitého ve studiích HuPBMC-SCID). Nejzajímavější je, že T1249 byl více než 800 krát účinnější proti HIV-2 NIHZ než T20. - 101- • · 9 99 9 99 • t • * 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 f • * • 9 9-9 9 • · • 99 9 9 • t 999
Tabulka 3
Izolát viru T20 (ng/ml) n T1249 (ng/ml) n Násobek rozdílu HIV-1 lllb 2,5 9 1,0 9 2,5 HIV-1 G691-2 (AZT-R) 406,0 1 16,0 1 25 HIV-1 G762-3(Pre-AZT) 340,1 1 12,2 1 28 HIV-1 MN 20,0 7 3,1 7 6 HIV-1 RF 6,1 7 2,1 7 3 HIV-1 9320 118,4 1 34,5 1 3 HIV-2 NI HZ 3610,0 >10 4,3 2 840 7.2.2 Antivirová účinnost - testy infekčnosti Maqi-CCR-5
Test infekčnosti Magi-CCR-5 umožňuje přímá porovnání izolátů 5 viru indukujících a neindukujících syncytia stejně jako porovnání mezi laboratorními a klinickými izoláty. Test je také přímým měřítkem virové infekce (exprese TAT po infekci, transaktivace produkce beta-galaktosidázy působením LTR) v protikladu s běžně používanými nepřímými měřítky pro infekčnost, jako je antigen p24 nebo produkce io reverzní transkriptázy. Testy infekčnosti Magi-CCR-5 (viz tabulka 4 níže) ukazují, že T1249 je za všech okolností účinnější než T20 proti všem testovaným izolátům, jak z hlediska EC50, tak i výpočtů inhibice Vn/Vo = 0,1. T1249 vykazuje podstatné zlepšení účinnosti proti klinickému izolátu HIV-1 301714 (>25 násobné), což je jeden 15 z nejméně citlivých izolátů na T20. Navíc je T1249 alespoň 100 x účinnější než T20 proti izolátu SIV B670. Tyto údaje spolu s fúzními daty ukazují, že T1249 je silný peptidový inhibitor HIV-1, HIV-2 a SIV. - 102- - 102- • t ···· « · » · · ♦ · ·♦ • · · · • · · • · · • · · ·« ·»*·
Tabulka 4 T20 T1249 Izolát viru EC-50 Vn/Vo=0,1 EC-50 Vn/Vo=0,1 Násobek rozdílu EC-50 Násobek rozdílu Vn/Vo=0,1 HIB-1 lllb 42 80 8 10 5 8 HIV-1 9320 11 50 1 6 11 8 HIV-1 301714 (subtyp B, NSI) 1065 4000 43 105 25 38 HIV-1 G691-2 (AZT-R) 13 200 0,3 20 43 10 HIV-1 pNL4-3 166 210 1 13 166 16 SIV-B670 2313 >10000 21 100 110 >100
7.2.3 Antivirová účinnost - test infekčnosti HuPBMC T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech infekčnosti 5 HuPBMC (tabulka 5, níže), který představuje uznávanou náhražku systému in vitro pro předpovídání koncentrací léčiva v plasmě nutných pro inhibici viru in vtvo. Tato porovnání odhalila, že T1249 má silnější účinky proti všem dosud testovaným izolátům HIV-1, kde všechny hodnoty Vn/Vo = 0,1 (dávka nezbytná pro snížení titru viru o jeden io řád) jsou sníženy na submikrogramové koncentrace. Mnoho z nejméně citlivých klinických izolátů na T20 vykazovalo desetinásobnou nebo vyšší citlivost na T1249. Je zajímavé, že HIV-1 9320, izolát používaný - 103- ♦ ·* ·» ♦ ti· ·· • · » • · • • · · • · • ff • • · • · · • · • « • · • · • · • · • ♦ ·· **·· ·· ·· ·· · v myším modelu HuPBMC SCID infekce, má na T20 46 krát nižší citlivost než na T1249, což ukazuje velmi dobrou korelaci s výsledky in vivo. 5 Tabulka 5 T20 T1249 Izolát viru (HIV-1) Vn/Vo=0,1 (ng/ml) Vn/Vo=0,1 (ng/ml) Násobek rozdílu IIIB 250 80 3 9320 6000 130 46 301714 (subtyp B, NSI) 8000 700 11 302056 (subtyp B, NSI) 800 90 9 301593 (subtyp B, Sl) 3500 200 18 302077 (subtyp A) 3300 230 14 302143 (Sl) 1600 220 7 G691-2 (AZT-R) 1300 400 3 7.2.4 Antivirová účinnost, laboratorní izolátv rezistentní na T20 T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech mezibuněčné fúze zprostředkované virem prováděných na chronicky infikovaných io buňkách CEM smíšených s neinfikovanými buňkami Molt-4 (tabulka 6, níže). T1249 byl téměř 200 krát silnější než T20 proti izolátům rezistentním na T20. - 104- »· »1 • r Ψ9 ···*
• « t • · ·«· MM • I • · • * • · · 4* Μ « Μ «* < · · *··* ··· * *
Tabulka 6
Izolát viru T20 n T1249 n Násobek (ng/ml) (ng/ml) rozdílu HIB-1 pNL4-3 SM (T20 rezistentní) 405,3 3 . 2, Ί 3 193 V testech Magi-CCR-5 (viz tabulka 7 níže) je T1249 až 50 000 krát účinnější než T20 proti izolátům rezistentním na T20, jako je 5 pNL4-3 SM a pNL4-3 STM (Rimsky, L. a Matthews, T., 1998, J. Virol. 72: 986 - 993).
Tabulka 7 T20 T1249 Izolát viru (HIV-1) EC-50 Vn/Vo = 0,1 EC-50 Vn/Vo = 0,1 Násobek rozdílu EC-50 Násobek rozdílu Vn/Vo=0,1 pNL4-3 166 210 1 13 166 16 pNL4-3 SM (T20-R) 90 900 4 11 23 82 pNL4-3 SM (T20-R) Duke 410 2600 4 11 103 236 pNL4-3 STM (T20/T649-R) >50000 >50000 1 13 >50000 >3846 ίο T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech infekčnosti
HuPBMC (viz tabulka 8, níže) vyhodnocujícím rozdíly v účinnosti proti rezistentnímu izolátu. T1249 je více než 250 krát účinnější než T20 proti rezistentnímu izolátu pNL4-3 SM. - 105- · + • I * »·· ···· *· ··** i * ί _ _ * · ··. λ · # # · » : « ····
Tabulka 8 T20 T1249 Izolát viru (HIV-1) Vn/Vo=0,1 (ng/ml) Vn/Vo=0,1 (ng/ml) Násobek rozdílu pNL4-3 3500 30 117- pNL4-3 SM (T20-R) >10000 40 >250 7.2.5 Antivirová účinnost - model SCID-HuPBMC in vivo 5 Antivirová účinnost in vivo T1249 byla přímo porovnávána s aktivitou T20 v modelu na myších HuPBMC-SCID infekce HIV-1 9320 (obr. 3). Po dvou týdnech po rekonstituci buňkami HuPBMC byly myši infikovány i.p. v den 0 103 TCID50 HIV-1 9320 pasážovaného v buňkách PBMC (izolát A018 citlivý na AZT). Peptidy byly podávány 10 i.p., dvakrát denně, na celkové denní dávky 67 mg/kg (T20), 20 mg/kg (T1249), 6,7 mg/kg (T1249), 2,0 mg/kg (T1249) a 0,67 mg/kg (T1249), osm dnů, počínaje dnem -1. Rozsah infekce v krevních buňkách, splenocytech, lymfatických uzlinách a peritoneálních buňkách byl zjišťován kvantitativní společnou kultivací s lidskými blasty PBMC 15 týdně po tři za sebou následující týdny byl sledován po odebrání vzorků krve a tkání (den 7, přibližně 12 až 18 hod po podání poslední dávky léčiva). Supernatanty pro společnou kultivaci byly testovány na produkci antigenu p24 HIV-1 jako měřítko infekce virem. Infekční virus nebyl v krvi nebo lymfatických tkáních zvířat ošetřených T20 20 detekovatelný, i když byl detekovatelný v peritoneálních výplaších a preparátu sleziny. Všechny orgány byly negativní na infekční virus při dávce 6,7 mg/kg T1249, což ukazuje alespoň desetinásobné zlepšení proti ošetření T20. V dávce 2,0 mg/kg T1249 byly jak lymfa, tak i slezina zcela prosté detekovatelného infekčního viru, přičemž 106- 106- • · · ι» · ·« · ·· ·· ·· · · · ♦ I « » · · • · · ♦ · · · φ • · · · · · · ·· ··· ···· Μ ·· «· ···· v peritoneálním výplachu byl snížen titr viru s faktorem 2 log10 a v krvi s faktorem 1 log™, ve srovnání s infikovanými kontrolami. Při nejnižší dávce T1249, 0,67 mg/kg, byly peritoneální výplachy a krev ekvivalentní infikované kontrole; jak v lymfě, tak i slezinných tkáních 5 byl však pozorován pokles titru infekčního viru s faktorem alespoň 1 logio· Celkově tyto výsledky ukazují, že T1249 je za těchto podmínek přibližně 30 a 100 krát účinnější proti HIV-1 9320 in vivo. 7,2.6 Farmakokinetické studie - krysa to Pro další definování farmakokinetického profilu T1249 byly použity krysy se zavedenými kanylami. Samci krys CD o hmotnosti 250 až 300 g dostávali i.v. jugulárním katétrem T1249 a T20 (obr. 4A-5). Výsledné vzorky plasmy byly testovány metodou fluorescenční HPLC pro odhad množství peptidu v extrahované plasmě. Poločas beta-fáze 15 a celková AUC T1249 byly téměř třikrát vyšší než u T20 (obr. 5). 7.2.7 Cvtotoxicita
Nebyl pozorován žádný zjevný důkaz cytotoxicity T1249 in vitro, jak je ukázáno na obr. 6. 20 Navíc není T1249 akutně toxický (smrt během 24 hod) při dávce 167 mg/kg (nejvyšší testovaná dávka) podané i.v. jugulární kanylou (0,3 ml v průběhu 2 až 3 min). 7,2.8 Přímá vazba na konstrukt αρ41 Μ41Δ178 25 T1249 byla radioaktivně označena 125l a čištěna HPLC na maximální specifickou aktivitu. T20 byl jodován stejným způsobem. Saturační vazba Μ41Δ178 (zkrácený fúzní protein ektodomény gp41 postrádající aminokyselinovou sekvenci T20) (mobilizovaného na mikrotitračních destičkách při koncentraci 0,5 mg/μΙ je ukázána na - 107- • · - 107- • · ·♦·· ·· ·« • t · ♦ ♦ · • ♦ ♦ · ···· obr. 7. Nespecifická vazba byla definována jako vazba radioligandu v přítomnosti 1 μΜ neznačeného peptidu. Specifická vazba byla rozdíl mezi celkovou a nespecifickou vazbou. Výsledky ukazují, že 125l-T1249 a 125I-T20 mají podobné vazebné afinity 1 až 2 nM. Lineární 5 inverzní Scatchardova vynesení ukazují, že každý ligand se váže na homogenní třídu vazebných míst.
Kinetika vazby 125I-T1249 a 125I-T20 byla zjišťována na scintilačních mikrotitračních destičkách potažených 0,5 pg/ml Μ41Δ178. Časový průběh asociace a disociace je ukázán na obr. 8. io Disociace navázaného radioligandu byla měřena po přidání neznačeného peptidu na konečnou koncentraci 10 μΜ v jedné desetině celkového objemu testu. Počáteční hodnoty náběhu a poklesu pro 125I-T1249 byly podstatně nižší než hodnoty pro 125I-T20. Obrazy disociace pro oba radioligandy byly nezměněné, jestliže byla 15 disociace zahájena jiným neznačeným peptidem (tj. 125I-T1249 s T20).
Pro další demonstraci, že oba ligandy soutěží o stejné cílové místo, byly T1249 a T20 titrovány v přítomnosti jediné koncentrace buď 125I-T1249 nebo 125I-T20. Ligand byl přidán těsně po začátku inkubace neznačeného peptidu. Kompetitivní křivky ukázané na obr. 9 20 naznačují, že ačkoli oba ligandy mají podobné afinity, je nutná vyšší koncentrace buď neznačeného T20 nebo T1249 pro plné soutěžení o vazbu 125I-T1249. 7.2,9 Přímá vazba na oblast HR1 GP41 25 Pro měření sekundární struktury T1249 v roztoku (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, pH 7) samostatně a v kombinaci s peptidem o délce 45 zbytků (T1346) z HR1 (sedminásobné opakování 1) vazebné oblasti gp41 byla použita spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD). Obr. 14A ilustruje spektrum CD 30 samotného T1249 v roztoku (10 μΜ, 1 °C). Spektrum je typické pro peptidy, které přijmou alfa-šroubovicovou strukturu. Rozbor tohoto spektra zvláště s použitím jediné hodnoty rozkladu se základem nastaveným na spektra proteinu 33 předpovídá obsah šroubovice T1249 (samostatný v roztoku) na 50 %. Obr. 14B ilustruje 5 reprezentativní spektrum CD T1249 ve směsi s T1346. Plné čtverečky () znázorňují teoretické spektrum CD předpovězené pro „model bez interakce", kde se předpokládá, že peptidy v roztoku neinteragují. Skutečné experimentální spektrum (·) se podstatně liší od tohoto teoretického spektra „bez interakce", což ukazuje, že tyto dva peptidy io samozřejmě interagují při vzniku měřitelné strukturní změny, která se pozoruje na spektru CD. 7.2.10 Ochrana vazebné oblasti T1249 uvnitř gp41 před proteázou
Vnímavost chimérního proteinu Μ41Δ178, popisovaného v části 15 7.2.8 výše ke štěpení proteinázou K byla zjišťována a analyzována elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 15.
Jestliže se buď Μ41Δ178 (neošetřený; obr. 15, dráha 2) nebo-T1249 (neošetřený; obr. 15, dráha 4) inkubují jednotlivě s proteinázou 20 K (obr. 15, dráhy 3 a 5), štěpí se oba proteiny. Jestliže se však T1249 inkubuje s Μ41Δ178 před přidáním proteinázy K (obr. 15, dráha 7), vznikne chráněný fragment HR-1 s výslednou molekulovou hmotností přibližně 6500 Daltonů. Sekvenování chráněného fragmentu ukazuje, že odpovídá oblasti primární sekvence umístěné uvnitř ektodomény 25 gp41. Chráněný fragment zahrnuje rozpustný peptid HR1 (T1346) používaný ve studiích CD popisovaných v části 7.2.9 výše, a dále obsahuje dalších sedm aminokyselinových zbytků umístěných na aminovém konci. Tato ochrana může být připisována vazbě T1249 na specifickou sekvenci gp41, která je obsažena v konstruktu Μ41Δ178. 30 »» ·♦· · 8. Příklad
Hybridní polypeptidy viru respiračního svncvtia Následující příklad popisuje hybridní polypeptidy viru respiračního syncytia (RSV) se zlepšenými farmakokinetickými 5 vlastnostmi. Dále se uvádějí výsledky, které dokládají, že hybridní polypeptidy RSV jsou silné inhibitory infekce RSV. 8.1 Materiály a metody 8.1.1 Syntéza peptidů a čištění io Polypeptidy RSV byly syntetizovány použitím standardních chemických reakcí Fast Moc. Obecně, pokud není uvedeno jinak, obsahovaly peptidy amidované karboxylové konce a acetylované aminové konce. Čištění bylo prováděno HPLC s reverzními fázemi. 15 8.1.2 Test snížení počtu plaků viru respiračního svncvtia Všechna nezbytná ředění peptidů byla prováděna v čisté, sterilní 96-jamkové destičce TC. Bylo připraveno celkem 11 ředění pro každý peptid a jedna kontrolní jamka neobsahující peptid. Rozmezí konečných koncentrací peptidů začínalo na 50 pg/ml nebo 100 pg/ml 20 celkem s 11 dvojnásobnými ředěními. RSV byl připraven s koncentrací 100 PFU/jamku ve 100 pl 3% EMEM, zjištěnou pomocí známého titru RSV. Virus se potom přidá do všech jamek. Z jedné 96-jamkové destičky se subkonfluentními buňkami Hep2 byla odebrána média. Materiál z ředicí destičky byl převeden na 25 destičky s buňkami počínaje řadou 1, a potom byly převedeny řady 12, 11, atd., dokud nebyly převedeny všechny řady. Destičky byly vloženy zpátky do inkubátoru na 48 hod.
Buňky byly testovány pro zajištění, že v kontrolních jamkách jsou přítomna syncytia. Média byla odstraněna a do každé jamky bylo ·· ·· · přidáno přibližně 50 μ| 0,25% krystalové violeti v methanolu. Jamky byly okamžitě opláchnuty ve vodě pro odstranění nadbytku barviva a ponechány usušit. Pomocí preparačního mikroskopu byla počítána syncytia v každé jamce. 5 8.2 Výsledky
Farmakokinetické studie s hybridními peptidy RSV T1301 (Ac--WQEWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWA WF-NH2) a T1302 (Ac-WQAWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELW AWF-NH2) io obsahujícími zesilující peptidové sekvence ukázaly značně zlepšený poločas ve srovnání s polypeptidovým jádrem T786 (Ac--VYPSDEYDASISQVNEElNQALAYIRKADELLENV-NH2), jak je také ukázáno na obr. 10A - 10B. Hybridní polypeptidy T1301, T1302 a T1303 (Ac-WQAWDEYDASISDVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2) 15 rovněž ukázaly značně zvýšený poločas vzhledem k polypeptidovému jádru T1476 (Ac-DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL-NH2).
Hybridní polypeptidy RSV T1301, T1302 a T1303 stejně jako - polypeptid T786 a T1293, byly testovány na svou schopnost inhibovat tvorbu plaků RSV na buňkách HEp2. Jak je ukázáno na obr. 11A a 20 11B, testované hybridní polypeptidy RSV stejně jako polypeptidová jádra T786 byly schopny inhibovat infekci RSV. Je překvapivé, že se hybridní polypeptid T1293 rovněž ukázal jako silná anti-RSV sloučenina (obr. 13). 25 9. Příklad
Hybridní polypeptidy luteinizačního hormonu
Zde popisovaný příklad ukazuje hybridní proteiny luteinizačního hormonu (LH) se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi. Následující hybridní peptidy LH byly syntetizovány a čištěny použitím 30 výše popsaných metod: polypeptidové jádro T1323 (Ac- - 111- - 111- • ·· ·· • · » 9 f • · · 9 9 9 · · • · · · • · 1999 -QHWSYGLRPG-NH2) a hybridní polypeptid T1324 (Ac- -WQEWEQKIQHWSYGLRPGWASLWEWF-NH2), který obsahuje aminokyselinovou sekvenci polypeptidového jádra T1323 svázanou se zesilujícími peptidy na aminovém a karboxylovém konci. Jak je 5 ukázáno na obr. 12A a 12B, hybridní peptid T1324 ukázal podstatně zvýšený poločas při porovnání s polypeptidovým jádrem T1323 postrádajícím zesilující peptidové sekvence. 10. Příklad 10 Farmakologické vlastnosti hybridního polypeptidu T1249 T1249 znázorněný na obr. 13 je hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na polypeptidové jádro odvozené ze směsi virových sekvencí. Jak je ukázáno v příkladu uvedeném v části 7 výše, hybridní polypeptid T1249 má zlepšené 15 farmakokinetické vlastnosti a silnou aktivitu in vitro i in vivo proti ΗIV-1. V příkladu uvedeném níže se dále popisují farmakologické vlastnosti T1249 jak u modelů na hlodavcích, tak i na modelech primátů. 20 10.1 Materiály a metody 10.1,4 Jediná dávka podaná savcům T1249 byl podáván albinotickým krysám Sprague-Dawley v jediné dávce kontinuální subkutánní infuzí (s.c.i.), subkutánní (s.c.) injekcí nebo intravenózní (i.v.) injekcí. Každá léčená skupina se 25 skládala z 9 krys každého pohlaví ve skupině. Skupiny dostávaly sterilní preparáty samotné léčivé látky T1249 v dávkách 0,5, 2,0, nebo
6.5 mg/kg c.s.i. Jedna skupina dostala 50 mM karbonát-bikarbonát pH 8.5 jako kontrolu. Peptidy byly podávány 12 hod katétrem polyvinylchlorid/polyethylen, chirurgicky implantovaným podkožně v 30 týlu krku. Dvě skupiny dostaly jedinou dávku T1249 v množství 1,2 - 112- - 112- ·· ·· ♦ ♦ ♦ · • · · • · ♦ #♦ ···· nebo 1,5 mg/kg subkutánní injekcí do intraskapuiární oblasti. Dvě skupiny dostaly jedinou dávku T1249 v množství 1,5 nebo 5 mg/kg intravenózní injekcí. Skutečné množství T1249 v miligramech bylo vypočteno použitím obsahu peptidu, který byl určen pro každou 5 podanou šarži. Při analýzách byla prováděna pozorování v kleci (dvakrát denně na úmrtnost a nemocnost), byly zjišťovány klinické laboratorní parametry, tělesná hmotnost, a byla provedena pitva. Vzorky krve byly získány občasným vzorkováním v průběhu 12 hod od tří krys od io každého pohlaví ve skupině v každém z následujících časů: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 19 a 12 hod po podání dávky. Analýza vzorku byla prováděna testem PcAb ECLIA (Blackburn, G. a další, 1991, Clin. Chem. 37: 1534 - 1539; Deaver, D., 1995, Nátuře 377: 758).
Pro farmakokinetické analýzy T1249 v plasmě a lymfě krys byl 15 T1249 připraven ve formě sterilního roztoku v bikarbonátovém pufru a podáván ve formě jednotlivé dávky, jednorázové intravenózní injekce, do laterální ocasní žíly, v dávce 20 mg/kg. Zvířatům byla odebírána krev pomocí zavedeného jugulárního katétru. Vzorky byly odebírány ihned po podání dávky, a v časech 5, 15a 30 min, a 1, 2, 4 20 a 6 hod po podání léčiva. Pro analýzu lymfatických kapalin byly odebírány vzorky bezprostředně před podáním dávky a každých 20 min prvních 6 hod po podání dávky. Lymfatická tekutina byla odebírána z katétru umístěného přímo do hrudního lymfatického kanálu, jak bylo popsáno dříve (Kirkpatrick a Silver, 1970, The Journal 25 of Surgical Research 10: 147 - 158). Koncentrace T1249 v plasmě a lymfatické tekutině byly zjišťovány použitím standardního kompetitivního testu ELISA na T1249 (Hamilton, G. 1991, str. 139, v „Immunochemistry of Solid-Phase lmmunoassay“, Butler, J., ed., CRC Press, Boston). 30 1A r\ ······ 13- ·· «... 10.1.2 Jednorázové podávání primátům
Sterilní preparáty čisté léčivé látky T1249 byly podávány opicím cynomologus v jednorázových dávkách podávaných subkutánní (s.c.), intramuskulární (i.m.) nebo intravenózní (i.v.) injekcí. V sekvenčním 5 zkříženém uspořádání dostala jedna skupina zvířat složená ze dvou zvířat od každého pohlaví jednu jednorázovou dávku T1249 i.v. (0,8 mg/kg), i.m. (0,8 mg/kg) nebo s.c. (0,4, 0,8 a 1,6 mg/kg). Každý den s podáním dávky byl oddělen od jiných alespoň třemi dny vyplavovacího období. Lyofilizovaný T1249 byl rekonstituován ve io sterilním fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem pH 7,4 bezprostředně před podáním dávky. Skutečné množství testované látky v miligramech bylo vypočteno pomocí obsahu peptidu zjištěného pro podávanou šarži. Při analýze byla zvířata pozorována v klecích a byla prováděna 15 fyzikální vyšetření a zjišťována tělesná hmotnost. Pro i.v. fázi studie byly do heparinizovaných zkumavek odebírány vzorky krve v následujících časech. Ihned po podání dávky, a v časech 0,25, 0,5, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hod po podání dávky. Pro fáze i.m. a s.c. studie byly do heparinizovaných zkumavek od každého zvířete odebírány vzorky 20 krve v následujících časech: 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 a 24 hodin po podání dávky. Vzorky plasmy byly připravovány během jedné hodiny po odběru a rychle zamraženy v kapalném dusíku. Analýzy vzorků byly prováděny testem PcAb ECLIA (Blackburn, G. a další, 1991, Clin. Chem. 37: 1534 - 1539; Deaver, D., 1995, Nátuře 377: 758). 25 10.1.3 Přemosťující farmakokinetická studie Šest samců opis cynomolgus bylo náhodně zařazeno do tří skupin po dvou zvířatech ve skupině. Všechny dávky T1249 byly podány jednorázovou subkutánní injekcí. Studie byla rozdělena do 30 dvou částí. V části 1 dostala zvířata ve skupinách 1, 2 a 3 sterilní - 114- ·* ·«»· ·· ·♦
l 9 • t ♦ • · • I • ♦ ·· · · preparát samostatné léčivé látky (tj. látka T1249 rozpuštěná v karbonátovém-bikarbonátovém pufru, pH 8,5) dvakrát denně po čtyři za sebou následující dny (dny studie 1 - 4) v dávkách 0,2, 0,6 a 2,0 mg/kg/dávku. Část 1 a část 2 byly odděleny desetidenním 5 vymývacím obdobím. V části 2 dostaůa zvířata ve skupinách 1, 2 a 3 sterilní preparát léčivé látky T1249 (tj. ve vodném roztoku pH 6,5, plus mannitol) dvakrát denně po čtyři za sebou následující dny (dny studie 15 - 18) s dávkami 0,2, 0,6 a 2,0 mg/kg/dávku.
Vzorky krve pro farmakokinetické analýzy byly odebírány ve io dnech studie 1 a 15 pro zjišťování farmakokinetických vlastností pro jednu dávku a ve dnech studie 4 a 18 pro zjišťování ustálených farmakokinetických parametrů v plasmě. Vzorky byly odebírány v následujících časech: bezprostředně před odáním dávky a 0,5, 1,5, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 12,0 hod po podání dávky. V částech 1 a 2 studie 15 byla zvířata monitorována na klinické příznaky a změny tělesné hmotnosti. 10.2 Výsledky 10,2.1 Farmakokinetické vlastnosti T1249 podávaného krysám 20 Pro počáteční zjištění farmakokinetických vlastností v plasmě a distribuce T1249 byly použity krysí modely. Pro zvířata ve všech dávkových skupinách nebyly pozorovány žádné změny tělesné hmotnosti, fyzického stavu, hematologických a klinických chemických parametrů nebo makroskopických patologických pozorování 25 souvisejících s podáváním T1249.
Krysy, které dostaly T1249 c.s.i., dosáhly rovnovážných koncentrací peptidu v plasmě přibližně 4 hod po podání. Jak rovnovážné koncentrace v plasmě (Cpss), tak i vypočtená plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plasmě na čase (AUC) byly přímo 30 úměrné podané dávce, což ukazuje, že T1249 vykazuje lineární - 115- ♦ · • ♦ ·· ♦ * + • · farmakokinetické vlastnosti v rozmezí testovaných dávek 0,5 až 6,5 mg/kg. Jak vypočtené farmakokinetické vlastnosti, tak i křivky závislosti plasmatické koncentrace na čase pro podávání c.s.i., jsou uvedeny v tabulce 9, popřípadě v obr. 16A.
Tabulka 9
Skupiny podle dávek Parametr 0,5 mg/kg 2,0 mg/kg 6,5 mg/kg Cpss (pg/ml) 0,80 2,80 10,9 AUCfo-^h) (pg-h/ml) 7,99 25,9 120
Podání T1249 jednorázovou i.v. injekcí vedlo k lineární závislosti farmakokinetických parametrů na dávce v rozmezí testovaných dávek. io Naopak expozice T1249 podaného s.c. injekcí nebyla v rozmezí studovaných dávek závislá na dávce. Vypočtené farmakokinetické parametry a křivky závislosti plasmatické koncentrace na čase jak pro s.c., tak i pro i.v. podání T1249, jsou ukázány v tabulce 10, popřípadě obr. 16B.
Tabulka 10 Dávkově skupiny/způsob podávání (s.c.) (i.v.)
Parametr 1,2 mg/kg 15 mg/kg 1,5 mg/kg 5,0 mg/kg tl/2i koncový (hod) 2,02 2,00 2,46 1,86 tmax (hod) 1,09 1,88 - - Cmax (pg/ml) 6,37 21,5 15,7 46,3 AUC(0-i2h) (pg.h/ml) 27,0 107 45,6 118 AUC(0.oo) (pg.h/ml) 27,6 110 47,1 120 9 • · •9*9 - 116- • 9 •9 99 • 9 9 9 « 9 9 • ♦99 9 • 9 9 9 • 99 9999
Biologická dostupnost T1249 podávaného krysám subkutánně byla zjišťována v porovnání s i.v. podáváním. Výsledky jsou ukázány v tabulce 11 níže. Při nízké dávce (1,2 mg/kg) měla T1249 relativní 5 biologickou dostupnost (Fr) pro subkutánní podání 73 %. Relativní biologická dostupnost byla 30 %, jestliže byla při podání vysoké dávky (15 mg/kg) T1249 koncentrace vyšší než koncentrace, která inhibuje 90 % (ICgo) infekčnosti HIV pro plných 12 hod studie při všech vyšetřovaných dávkách. 10
Tabulka 11
Způsob podání Dávka (mg/kg) AUC(o-») (pg.h/ml) AUC(o.M) (pg.h/ml) Fr (%) Nízká dávka s.c. 1,2 27,6 34,5(a) 73 i.v. 1,5 47,1 - Vysoká dávka s.c. 15 110 36,5(b) 30 i.v. 5 120 - -
Normalizováno z dávky 1,2 mg/kg na dávku 1,5 mg/kg vynásobením AUC^) faktorem 1,25.
Normalizováno z dávky 15 mg/kg na dávku 5 mg/kg vydělením 15 AUC(o-„) faktorem 3.
Kinetická data pro koncentrace v plasmě i v lymfě T1249 jsou ukázána na obr. 16C a uvedena v následující tabulce 12. T1249 rychle pronikal do lymfatického systému a dosáhl rovnováhy s plasmatickou 20 zásobou léčiva v průběhu přibližně 1 hod po podání. Po vyrovnání koncentrace mezi těmito dvěma částmi byly koncentrace léčiva v plasmě a lymfě porovnatelné mimo tří hodin po podání dávky u čtyř - 117- ♦ t ψ ♦ * • * t · ·· ·♦ ♦ * ♦ t ♦ P P • · « • · · ♦♦ ··♦* z pěti zvířat. Jedno zvíře mělo trvale nižší koncentrace T1249 v lymfě než jiná zvířata, avšak profil lymfatické eliminace u tohoto zvířete byl nerozlišitelný od jiných členů skupiny. Porovnání elimínační fáze poločasu (t 1/2) pro plasmu a lymfu ukazuje, že přechod T1249 mezi 5 těmito dvěma částmi je řízen difúzí. Po třech hodinách se zdá, že existuje druhá, rychlejší eliminační fáze z lymfatického systému. Tento rozdíl by mohl být způsoben mechanismem (například v důsledku redistribuce nebo urychlené degradace peptidu v lymfě) nebo jinými faktory. Koncentrace T1249 v lymfatické tekutině 6 hod po injekci je io vyšší než ICg0 pro virovou infekčnost pro běžné laboratorní kmeny a pro primární klinické izoláty HIV-1.
Byla také zjišťována míra pronikání T1249 do cerebrospinální tekutiny (CSF). Koncentrace T1249 byly nižší než je detekční limit (LOD; 2,0 ng T1249/ml CSF) ve všech měřitelných časech, což 15 ukazuje, že po jednorázovém podání neproniká T1249 do centrálního nervového systému.
Tabulka 12
Parametr Plasma T1249 Lymfa h/2, vylučování (hod) 2,6 ±0,41 1,3 ±0,27 Cmax (Mg/ml) ' 291 133(a)/155(b) AUC(0-6h) (Mg.h/ml) 506 348(a)/411(b) AUC(o-«,) (pg.h/ml) 598 390<a)/449(b) Cl (ml/h) 7,8 11,5 (a) Vypočtené průměry včetně jednoho zvířete (krysa #1), které 20 mělo podstatně nižší lymfatické koncentrace, ale podobný kinetický profil ve srovnání s jinými zvířaty ve skupině. (b) Vypočtené průměry s vyloučením krysy #1. - 118- ·· ···-· ·· 1« ·· · • » • * • ♦ • · m • • • • • · t • • • * ♦ • • · • • « *· * • • 10.2.2 Farmakokinetické vlastnosti T1249 podávaného primátům
Pro vyhodnocení vztahu mezi dávkou a různými farmakokinetickými parametry spojenými s parenterálním podáváním 5 T1249 byly použity modely primátů. Koncentrace v plasmě vyšší než 6,0 pg/ml T1249 byly dosaženy všemi způsoby podávání a kvantifikovatelné hladiny (tj. hladiny vyšší než 0,5 μg/ml) byly detekovány 24 hod po podání s.c. a i.v. Poločas vylučování ti/2 byl pro všechny způsoby podávání srovnatelný (5,4 hod, 4,8 hod a 5,6 hod ' io pro podání i.v., s.c. a i.m.). Koncentrace T1249 v plasmě, které byly vyšší než hodnoty IC90 pro laboratorní kmeny a klinické izoláty HIV-1 byly pozorovány ve všech bodech měření v průběhu 24 hod období vzorkování.
Porovnání údajů získaných pro parenterální podávání 0,8 mg/kg 15 T1249 všemi způsoby podávání (s.c., i.v. a i.m.) je ukázáno v obr. 17A. Obr. 15B znázorňuje srovnání údajů získaných při s.c. injekci při třech různých dávkách T1249 (0,4 mg/kg, 0,8 mg/kg a 1,6 mg/kg). Vložený obrázek v obr. 17B obsahuje vynesení vypočtené AUC proti podané dávce. 20 T1249 má u opic cynomolgus lineární farmakokinetické vlastnosti po s.c. podání v rozmezí podávaných dávek, což ukazuje, že se v tomto rozmezí nedosáhlo saturace vylučovacího mechanismu nebo mechanismů. Souhrn farmakokinetických údajů po parenterálním podání T1249 opicím cynomolgus je uveden v tabulce 13, níže. 25 Porovnání hodnot AUC v plasmě ukazuje, že ve srovnání s intravenózním podáním je při intramuskulární injekci biologická dostupnost T1249 přibližně 64 % a při subkutánní injekci 92 %. - 119- • f · ·· »· ·« *♦ ♦ · t * • ♦ • t · • · • • * • • t • · · • • • • ♦ • • • · » 9 • · • • • *·· ·«*· ·· «· ·♦ ·»·«
Tabulka 13
Parametr s.c. (0,4) Způsob podání (dávka, mg/kg) s.c. (0,8) s.c. (1,6) i.m. (0,8) i-v. (0,8) tl/2i konečný (h) 6,23 ± 0,52 4,83 ± 0,48 5,55 + 0,92 5,57 ± 0,24 5,35 ± 0,95 tmax (h) 3,97 + 1,18 4,58 ± 1,45 4,72 ± 1,81 2,32 ± 0,43 - Cmax (pg/ml) 3,17 ±0,09 6,85 ± 1,01 13,3 ±2,55 6,37 ± 1,69 26,7 ± 0,25 AUC(o-24) (pg.h/ml) 37,5 ± 6,6 8,12± 11,4 168 ± 34,0 56,4 ± 12,3 87,4 ± 25,0 AUC(o-«) (pg.h/ml) 40,9 ± 8,2 85,3 ± 13,6 181 ±44,0 59,5 ± 13,1 92,5 ± 25,0 Fr (%) - 92,3 - 64,4 - 10.2.3 Přemosťující farmakokinetická studie Přemosťující farmakokinetická studie byly prováděny s cílem 5 srovnat farmakokinetická profily v plasmě čisté léčivé substance T1249 použité pri neklinických pokusech popisovaných výše s léčivým produktem T1249 ve formulovaném prostředku, který by se podával skutečnému subjektu nebo pacientovi, například pro léčení infekce HIV. Tato studie byla navržena jako jednosměrné, zkřížené porovnání io v paralelních skupinách tří dávkových hladin T1249 ve formě čisté léčivé látky a tří dávkových hladin formulovaného léčivého produktu. Farmakokinetické vlastnosti v plasmě byly vyhodnocovány po podání jediné dávky a po dosažení ustáleného stavu.
Podávání T1249 subkutánní injekcí poskytlo měřitelné hladiny 15 peptidu u všech skupin, kterým byla dávka podána. Křivky závislosti koncentrace v plasmě na čase byly u všech skupin s podanou dávkou přibližně paralelní po počáteční dávce (dny 1 a 15) a v ustáleném stavu (dny 4 a 18) jak pro čistou léčivou látku T1249, tak i pro formulovaný léčivý produkt T1249. Navíc se pro obě formulace léčiva 2o hodnoty AUC(o-i2h) měnily přímo úměrně s dávkou. Vypočtené hodnoty AUC(0-i2h) pro léčivý produkt se pohybovaly v rozmezí od 43 % až 80 - 120- f ♦ Ψ ψ ♦ · ··# · • · · • · ♦ ♦ · ·
♦ · * 9 9 • * • · % hodnot AUC(0-i2h) vypočtených pro léčivou látku po podání jedné dávky, a od 36 % do 71 % v ustáleném stavu. Čistá léčivá látka T1249 a produkt léčiva ukázaly podobné farmakokinetické profily u opic cynomolgus po jednorázovém 5 subkutánním podávání při testovaných dávkách a oběmu dávek. Přímé porovnání tvarů křivek závislosti koncentrace v plasmě na čase v provedené studii a tvarů křivek z předcházející studie u opic cynomolgus ukazuje, že při podání T1249 subkutánní injekcí dochází k depotnímu efektu. To je naznačeno zvýšením času, ve kterém je io dosažena maximální koncentrace v plasmě (tmax) a t-i/2.
Tyto výsledky ukazují, že formulace léčivé látky použitá ve farmakologickém programu poskytuje srovnatelné hodnoty AUC a dalších kinetických parametrů s hodnotami pozorovanými po podání formulovaného léčivého produktu. Tato pozorování ukazují, že klinické 15 podávání T1249 povede k celkové expozici pacienta látce T1249. 11. Příklad
Izolace nových polypeptidovych jader s antivirovou aktivitou pro izolát HIV-1 rezistentní na T649 20 Jak se zde popisuje na konkrétním neomezujícím příkladu, je vytvořeno modifikované peptidové jádro, které má antivirovou aktivitu proti kmenům HIV rezistentním na nemodifikované, „rodičovské" peptidové jádro.
Peptid T649 ukázaný v tabulce 2 je peptid odvozený z oblasti 25 proteinu gp41 HIV-1, označovaného zde jako HR2. Ve studiích variant HIV-1 rezistentních na T649 odhaluje izolace a sekvenování nukleové kyseliny kódující oblast HR2 rezistentní varianty peptidu gp41 mutací, která vede k jediné mutaci v této oblasti: změna z asparaginu (N) na lysin (K). - 121- • ΦΦ ΦΦ φ Φ • * Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ φφφφ Φ * φ ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ φ Φ Φ φ Φ φ Φ φ t • φ Φ Φ φ Φ φ Φ φ Φ t φ ' Φ φ Φ φ Φ Φ ΦΦ • Φ ΦΦ ΦΦΦΦ S použitím tohoto výsledku byl syntetizován nový polypeptid, který se zde označuje jako DP397, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci T649, do které byla zavedena výše uvedená mutace N na K. Dále jsou ukázány peptidy T649 a DP397 s jediným rozdílem 5 aminokyseliny mezi dvěma peptidy znázorněným tučně.
T649: WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL
DP397: WMEWDREINKYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL
Je třeba zdůraznit, že rozdíl mezi T649 a DP397 spadá do potenciálního místa N-glykosylace (podtrženo). Mutace gp41 kmene io rezistentního na T649 tedy zrušila toto potenciální místo N-glykosylace.
Polypeptidové jádro DP397 má antivirové účinky proti variantám HIV-1, které jsou rezistentní na peptid T649. Peptid DP397 konkrétně vykazoval podstatně zvýšenou antivirovou účinnost při testu 15 infekčnosti Magi-CCR-5 popisovaném v části 7.1.7 výše proti čtyřem variantám HIV-1. Navíc bylo také při některých experimentech zjištěno, že peptid DP397 má zvýšené antivirové účinky proti těmto kmenům vzhledem k peptidu T1249.
Obr. 18A - D ukazují řadu infikovaných buněk vystavených 2o variantám rezistentním na T649 jako funkci koncentrace peptidu pro T649, DP397 a T1249. Obr. 18A - B konkrétně ukazují údaje z experimentů používajících kmeny HIV-1 rezistentní na T649, označované zde jako RF-649, popřípadě DH012-649. Tyto kmeny jsou odvozeny od izolátů HIV-1 rf a HIV-1 DH012, které byly pasážovány přes 25 buněčné kultury v přítomnosti T649 za vzniku variant rezistentních na T649.
Obr. 18C - D ukazují údaje z experimentů využívajících zkonstruovaných kmenů HIV-1 rezistentních na T649, které se zde označují jako 3’ETVQQQ, popřípadě SIM-649. Kmen 3’ETVQQQ byl 30 získán z klonu HIV-1 lai, který byl molekulárně mutagenizován tak, aby - 122- ♦ ♦ ·» ···· • « • f • t • · · ·* t ♦ #· • · t • i • · • · ··»· obsahoval aminokyselinovou sekvenci ETVQQQ, namísto GIVQQQ v doméně HR1 proteinu gp41. HR1 je oblast proteinu HIV-1 gp41, na kterou se váže doména HR2 a peptid T649. Kmen SIM-649 byl získán z klonu HIV-1lai, který byl molekulárně mutagenizován tak, aby 5 obsahoval sekvenci aminokyselin SIM namísto GIV, v doméně HR1 proteinu gp41, a potom byl pasážován v buněčných kulturách v přítomnosti T649 za vytvoření varianty rezistentní na T649.
Peptid DP397 má podstatně zvýšené inhibiční účinky na infekci HIV-1 ve srovnání s T649 pro všechny čtyři testované kmeny. Navíc 10 má peptid DP397 zvýšené inhibiční účinky na HIV-1 ve srovnání s T1249 pro kmen RF649 (obr. 18A) a při vyšších koncentracích pro kmen DH012-649 (obr. 18B). Předkládaný vynález nemá být, co se týče jeho rozsahu, omezen specifickými zde popisovanými provedeními, která jsou považována za 15 jednotlivé ilustrace individuálních aspektů vynálezu; do rámce předkládaného vynálezu spadají i funkčně ekvivalentní metody a složky. Z předcházejícího popisu a doprovodných výkresů budou odborníkům v oboru zřejmé další modifikace vynálezu navíc k těm, které jsou zde ukázány a popisovány. Tyto modifikace mají rovněž 20 spadat do rámce přiložených nároků.
Zastupuje:

Claims (52)

  1. - 123- φ Φ· ·· * ι • · • · ♦ t • φ» φφφφ ♦ · • · • ♦ • · · * «· ·· φφ φφ • » I « • · ι • « · • · · fť " <Ρ<Ρ PATENTOVÉ NÁROKY 1. Způsob zlepšení farmakokinetických vlastností polypeptidového 5 jádra, vyznačující se tím, že se na polypeptidové jádro naváže zesilující peptidová sekvence za vytvoření hybridního polypeptidu; přičemž zesilující peptidová sekvence zahrnuje WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, XXXWXWX, XXWXWX, 10 XWXWX, WXWX, WXXXWXW, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, XXXWXXW, XXWXXW, XWXXW, XWXWXXXW, XWXWXXX, XWXWXX, XWXWX, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje sekvenci TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK (SEQ ID No. 1286); a kde 15 alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugován s polyolem tak, že při zavedení do živého systému má hybridní polypeptid zlepšené farmakokinetické vlastnosti proti vlastnostem, které má polypeptidové jádro.
  2. 2. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje aminokoncové sekvence WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, XXXWXWX, XXWXWX, XWXWX, WXWX, WXXXWXW, 25 WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, XXXWXXW, XXWXXW, XWXXW, XWXWXXXW, XWXWXXX, XWXWXX, XWXWX, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje sekvenci TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK (SEQ ID No. 1286); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek 30 hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. - 124- • • ·* · ♦ *·· ·· • · ·· • * • · • t • • · • • · * ♦ • · • · • »*·« • m ·· ·· ··*·
  3. 3. Hybridní polypeptid podle nároku 2, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra. 5
  4. 4. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje sekvenci WQEWEQKI (SEQ ID No. 1129) nebo WASLWEWF (SEQ ID No. 1433); kde polypeptidové io jádro obsahuje sekvenci TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK (SEQ ID No. 1286); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugován s polyolem.
  5. 5. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci WQEWEQKI-
  6. 6. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci 2o navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje karboxykoncovou sekvenci WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, xxxwxwx, xxwxwx, xwxwx, wxwx, wxxxwxw, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, xxxwxxw, xxwxxw, 25 xwxxw, xwxwxxxw, xwxwxxx, xwxwxx, xwxwx, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje sekvenci TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK (SEQ ID No. 1286); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. 30 - 125- • ♦ * «·»· ·· ·· ·· · · • · • · • ♦ * • • · • · • • « t « « • • · • • • · • · • · • # • ·· · ···· ·· ·· *
  7. 7. Hybridní polypeptid podle nároku 6, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na aminový konec polypeptidového jádra.
  8. 8. Polypeptid obsahující sekvenci TALLEQAQIQQEKNE- -YELQKLDK (SEQ ID No. 1286); kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  9. 9. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, io že obsahuje polypeptid TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK (SEQ ID No. 1286), kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek tohoto polypeptidu je konjugovaný s polyolem, a farmaceuticky přijatelný nosič.
  10. 10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje polypeptid WQEWEQKITALLEQAQIQQE--KNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID No. 1310), kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek tohoto polypeptidu je konjugovaný s polyolem, a farmaceuticky přijatelný nosič. 20
  11. 11. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WQEWEQKI (SEQ ID No. 1129) nebo WASLWEWF (SEQ ID No. 1433); a kde alespoň jeden 25 aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. - 126-
  12. 12. Hybridní polypeptid podle nároku 11, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec polypeptidového jádra.
  13. 13. Hybridní polypeptid podle nároku 12, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra. 10 15 ·«»» *· • * t · 0 • ♦ · • · * • « • • * · · » • • · • * • · · • · t· ' • • · « • ·· · ·
  14. 14. Hybridní polypeptid podle nároku 11, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  15. 15. Hybridní polypeptid podle nároku 11, kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WQEWEQKI (SEQ ID No. 1129).
    15 -TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID No. 1310), kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek tohoto polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  16. 16. Hybridní polypeptid podle nároku 11, kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WASLWEWF (SEQ ID No. 1433).
  17. 17. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci 20 navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje aminokoncové sekvence WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, xxxwxwx, xxwxwx, xwxwx, wxwx, wxxxwxw, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, xxxwxxw, xxwxxw, 25 xwxxw, xwxwxxxw, xwxwxxx, xwxwxx, xwxwx, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro zahrnuje následující aminokyselinové sekvence LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS; LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS; - 127- ♦ ·« ·· • v ** ··»· *·· ···· ·· ·· • · # · • · · I · « • · · •ϋ ··#· DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANITALLEQAQIIQQEKNEYELQKL; NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE; DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL; DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL; DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL; nebo QHWSYGLRPG (SEQ ID No. 1279, 1280, 1282 - 1285, a 1278 - 1309); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. 30 128- 128- ···· ·· • · ··· ···· • ι • 4 • · * • · · · ·· ·« ·· ·· • ·· · • · I • · · • · · Λ· ····
  18. 18. Hybridní polypeptid podle nároku 17, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  19. 19. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WQEWEQKI (SEQ ID No. 1129) nebo WASLWEWF (SEQ ID No. 1433); kde polypeptidové jádro zahrnuje následující aminokyselinové sekvence io YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS; LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS; NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL; DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL; 15 RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL; NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE; 20 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK; 25 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK; 30 - 129- • ·· • • ·· • · • • • * • *. · • ♦ ♦ · • • • • · • ♦ ···* TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE; DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL; 5 DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL; DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRDSDELL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRDSDEL; nebo QHWSYGLRPG (SEQ ID No. 1278 - 1285 a 1287 - 1309); a kde alespoň jeden io aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  20. 20. Hybridní polypeptid podle nároku 19, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec polypeptidového 15 jádra.
  21. 21. Hybridní polypeptid podle nároku 20, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra. 20
  22. 22. Hybridní polypeptid podle nároku 19, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  23. 23. Hybridní polypeptid podle nároku 19, kde hybridní polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci WQEWEQKITALLEQAQI--QQEKIEYELQKLIEWEWF (SEQ ID No. 1311). • · - 130- • ♦ ►· ····
  24. 24. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje karboxykoncové sekvence WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, 5 XXXWXWX, XXWXWX, XWXWX, wxwx, wxxxwxw, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, xxxwxxw, xxwxxw, XWXXW, XWXWXXXW, XWXWXXX, XWXWXX, XWXWX, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje následující aminokyselinové sekvence io LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS; LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS; DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL; 15 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE; 20 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE;
  25. 25 TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK; 30 TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE; ··«· • · Λ'ΧΑ ·· ··· # · < ΙΟΙ ······· ·· ·· ·« DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL; DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL; DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL; s DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL; nebo QHWSYGLRPG (SEQ ID No. 1279, 1280 a 1282 - 1285 a 1287 - 1309); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. io 25. Hybridní polypeptid podle nároku 24, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na aminový konec polypeptidového jádra.
  26. 26. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci 15 navázanou na polypeptidové jádro; kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec polypeptidového jádra a obsahuje aminokoncové sekvence WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, xxxwxwx, xxwxwx, xwxwx, wxwx, wxxxwxw, 20 wxxxwx, wxxxw, ixxxwxxw, xxxwxxw, xxwxxw, xwxxw, xwxwxxxw, xwxwxxx, xwxwxx, xwxwx, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL(SEQ ID No. 1281); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního 25 polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  27. 27. Hybridní polypeptid podle nároku 26, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra. 30 • ι - 132- • ι - 132- • · • ♦ # · · · ·· · · ·· ····
  28. 28. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec polypeptidového jádra a obsahuje karboxykoncové sekvence WXXWXXXI, 5 WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, xxxwxwx, xxwxwx, xwxwx, wxwx, wxxxwxw, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, xxxwxxw, xxwxxw, xwxxw, xwxwxxxw, xwxwxxx, xwxwxx, xwxwx, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro io obsahuje NNYTSLIHSUEESQNQQEKNEQELLEL(SEQ ID No. 1281); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  29. 29. Hybridní polypeptid podle nároku 28, který dále obsahuje 15 zesilující peptidovou sekvenci navázanou na aminový konec polypeptidového jádra.
  30. 30. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na aminový konec polypeptidového jádra; kde 2o zesilující peptidová sekvence zahrnuje aminokyselinové sekvence WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, XXXWXWX, XXWXWX, XWXWX, WXWX, WXXXWXW, WXXXWX, WXXXW, IXXXWXXW, XXXWXXW, XXWXXW, XWXXW, XWXWXXXW, XWXWXXX, 25 XWXWXX, XWXWX, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW; kde polypeptidové jádro obsahuje YTSLIHSLIEESQNQQE-KNEQELLELDK (SEQ ID No. 1278); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. 30 - 133- - 133- • · ··· · • · · · · • ♦ · · • · · · · • · · · ······ ·· ·· ·· • * t · • · · ι · · • · · · • Ψ · · · »
  31. 31. Hybridní polypeptid podle nároku 30, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  32. 32. Hybridní polypeptid obsahující polypeptidové jádro navázané na zesilující peptidovou sekvenci; kde polypeptidové jádro zahrnuje následující aminokyselinové sekvence YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS; io LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS; NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL; DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANtSQSLEQAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL; 15 NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE; 20 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE; 25 TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE; 30 TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE; DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL; DEYDASISQVNEKINQALAYiREADEL; DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL; nebo QHWSYGLRPG (SEQ ID No. 1278 - 1285 a 1287 - 1309); kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WQEWEQKI (SEQ ID No. 1129) nebo WASLWEWF (SEQ ID No. 1433); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem.
  33. 33. Hybridní polypeptid podle nároku 32, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec polypeptidového jádra.
  34. 34. Hybridní polypeptid podle nároku 33, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  35. 35. Hybridní polypeptid podle nároku 32, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  36. 36. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci VYPSDEY--DASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV, kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek tohoto polypeptidu je konjugovaný s polyolem. - 135- - 135- • * • * • · *» *· • * Ψ • ·
  37. 37. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na polypeptidové jádro; kde polypeptidové jádro zahrnuje následující aminokyselinové sekvence LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS; LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS; DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL; RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKUE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK; TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE; TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE; DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL; DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL; DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL; nebo DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL (SEQ ID No. 1279, 1280, 1282 - 1284 a 1287 - 1303, 1305 - 1308); a kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek hybridního polypeptidu je konjugovaný s polyolem. - 136- ♦ # ·· ·9 • ♦ ♦ · * • · · ♦ • · · · « • · · · • « · ·♦#·
  38. 38. Hybridní polypeptid podle nároku 37, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec polypeptidového jádra. 5
  39. 39. Hybridní polypeptid podle nároku 38, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec polypeptidového jádra. io
  40. 40. Hybridní polypeptid podle nároku 37, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec polypeptidového jádra.
  41. 41. Hybridní polypeptid podle některého z nároků 2 až 4, 6 až 7, 11 15 až 35 a 37 až 40, který dále obsahuje aminokoncovou acetylovou skupinu a karboxykoncovou amidovou skupinu.
  42. 42. Polypeptid podle některého z nároků 5, 8, 9, 10 a 36, který dále obsahuje aminokoncovou acetylovou skupinu a 20 karboxykoncovou amidovou skupinu.
  43. 43. Hybridní polypeptid podle některého z nároků 2 až 4, 6 až 7, 11 až 35 a 37 až 40, kde polypeptidové jádro je terapeuticky aktivní látka. 25
  44. 44. Polypeptid podle některého z nároků 5, 8, 9, 10 a 36, kde polypeptidové jádro je terapeuticky aktivní látka. - 137- ···« ♦ · · • · ♦ · · • · · · ·* ··♦#
  45. 45. Hybridní polypeptid podle některého z nároků 2 až 4, 6 až 7, 11 až 35 a 37 až 40, kde polypeptidové jádro je biologicky aktivní peptid, růstový faktor, cytokin, diferenciační faktor, interleukin, interferon, faktor stimulující tvorbu kolonií, hormon nebo 5 angiogenní faktor.
  46. 46. Polypeptid podle některého z nároků 5, 8, 9, 10 a 36, kde polypeptidové jádro je biologicky aktivní peptid, růstový faktor, cytokin, diferenciační faktor, interleukin, interferon, faktor io stimulující tvorbu kolonií, hormon nebo angiogenní faktor.
  47. 47. Hybridní polypeptid podle některého z nároků 2 až 4, 6 až 7, 11 až 35 a 37 až 40, kde polyolem je poly(propylenglykol), polyethylen-propylenglykol nebo poly(ethylenglykol). 15
  48. 48. Hybridní polypeptid podle nároku 47, kde polyolem je polyol s přímým řetězcem. 20
  49. 49. Hybridní polypeptid podle nároku 47, kde polyolem je polyol s rozvětveným řetězcem.
  50. 50. Polypeptid podje některého z nároků 5, 8, 9, 10 a 36, kde polyolem je poly(propylenglykol), polyethylen-propylenglykol nebo poly(ethylenglykol).
  51. 51. Polypeptid podle nároku 50, kde polyolem je polyol s přímým řetězcem. 25 - 138- * 9 ♦ · · • * t · · « · · 9 ♦ · 0 0 00 0
  52. 52. Polypeptid podle nároku 50, kde polyolem je polyol s rozvětveným řetězcem. 5 Zastupuje:
CZ200288A 1999-07-09 2000-07-10 Hybridní polypeptid CZ200288A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/350,641 US6656906B1 (en) 1998-05-20 1999-07-09 Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ200288A3 true CZ200288A3 (cs) 2002-06-12

Family

ID=23377584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ200288A CZ200288A3 (cs) 1999-07-09 2000-07-10 Hybridní polypeptid

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6656906B1 (cs)
EP (1) EP1206272A4 (cs)
JP (1) JP2003504344A (cs)
KR (1) KR100755418B1 (cs)
CN (1) CN1254271C (cs)
AR (1) AR024699A1 (cs)
AU (1) AU6082200A (cs)
BR (1) BR0012287A (cs)
CA (1) CA2377677A1 (cs)
CZ (1) CZ200288A3 (cs)
HK (1) HK1045259A1 (cs)
HR (1) HRP20020022A2 (cs)
IL (1) IL147331A0 (cs)
MX (1) MXPA02000012A (cs)
NO (1) NO20020087L (cs)
NZ (1) NZ516550A (cs)
PL (1) PL352685A1 (cs)
RU (1) RU2279883C2 (cs)
TR (1) TR200200766T2 (cs)
TW (1) TWI248364B (cs)
WO (1) WO2001003723A1 (cs)
YU (1) YU1402A (cs)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818740B1 (en) 1997-04-17 2004-11-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Inhibitors of HIV membrane fusion
US6150088A (en) 1997-04-17 2000-11-21 Whitehead Institute For Biomedical Research Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein
US6841657B2 (en) 1997-04-17 2005-01-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Inhibitors of HIV membrane fusion
US7960504B2 (en) 1998-07-30 2011-06-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Inhibitors of HIV membrane fusion
US6747126B1 (en) 1998-07-30 2004-06-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Peptide inhibitors of HIV entry
ES2296665T3 (es) 1999-12-16 2008-05-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Proteina cinco-helice.
DE60229677D1 (de) 2001-05-31 2008-12-11 Conjuchem Biotechnologies Inc Langwirkende Fusionspeptidinhibitoren gegen HIV-Infektion
CN1255548C (zh) 2001-06-15 2006-05-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 gp41片段的乙酰化
WO2003074691A1 (fr) * 2002-03-01 2003-09-12 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Cellules et liposomes immobilises et procede d'immobilisation correspondant
EP1545371B1 (en) * 2002-08-01 2016-04-13 Robert A. Levine Cardiac devices and methods for minimally invasive repair of ischemic mitral regurgitation
EP1542718B1 (en) * 2002-09-24 2015-11-11 Dong Xie Peptide derivative fusion inhibitors of hiv infection
US7556813B2 (en) * 2002-09-27 2009-07-07 Trimeris, Inc. Antiviral peptide-polymer conjugate comprising a polymer covalently attached to two or more synthetic HIV gp41 HR1 and/or HR2 peptides
CA2521393A1 (en) * 2003-04-04 2004-10-14 Universite De Lausanne Peptabody for cancer treatment
WO2004106364A1 (en) * 2003-08-05 2004-12-09 Cornell Research Foundation, Inc. Stabilizing peptides and their use in the preparation of stabilized hiv inhibitors
JP2007515965A (ja) 2003-12-23 2007-06-21 セントカー・インコーポレーテツド 抗レトロウイルス性の剤、組成物、方法および用途
WO2005067960A1 (en) * 2004-01-07 2005-07-28 Trimeris, Inc. HIV gp41 HR2-DERIVED SYNTHETIC PEPTIDES, AND THEIR USE IN THERAPY TO INHIBIT TRANSMISSION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS
EP1725262B1 (en) * 2004-03-15 2021-05-26 Nektar Therapeutics Polymer-based compositions and conjugates of hiv entry inhibitors
WO2005118886A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Merck & Co., Inc. Stable peptide mimetic of hiv gp41 fusion intermediate
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
EP1868652A2 (en) * 2005-04-05 2007-12-26 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Method for shielding functional sites or epitopes on proteins
TW200722436A (en) * 2005-10-21 2007-06-16 Hoffmann La Roche A peptide-immunoglobulin-conjugate
CA2651793C (en) * 2006-02-02 2015-07-07 Trimeris, Inc. Hiv fusion inhibitor peptides with improved biological properties
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
CN101088557A (zh) 2006-06-12 2007-12-19 天津市扶素生物技术有限公司 用于预防或治疗hiv感染的药用组合物及其应用
KR101105610B1 (ko) 2006-08-17 2012-01-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ccr5 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
TW200817438A (en) * 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
EP2125876A1 (en) * 2007-03-12 2009-12-02 Thomas Jefferson University Tighter-binding c-peptide inhibitors of hiv-1 entry
US20090143288A1 (en) 2007-03-13 2009-06-04 Roche Palo Alto Llc Peptide-complement conjugates
EP2139526A4 (en) * 2007-04-03 2010-07-14 Trimeris Inc NEW FORMULATIONS TO RELEASE ANTIVIRAL PEPTIDE THERAPEUTICS
WO2008144590A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting modified antifusogenic peptide for preventing hiv infection
EP2170314B1 (en) * 2007-05-24 2013-10-02 The Board of Regents of The University of Texas System Methods and compositions for treating phenylketonuria
AR067584A1 (es) 2007-07-20 2009-10-14 Hoffmann La Roche Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos
WO2009030872A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Mats Axel Atterdag Persson Materials and methods for the treatment of hepatitis c
JP2010540528A (ja) * 2007-09-25 2010-12-24 トリメリス,インコーポレーテッド 治療的抗ウイルス性ペプチドの新規合成方法
WO2009094634A1 (en) * 2008-01-24 2009-07-30 Esperance Pharmaceuticals Lytic domain fusion constructs and methods of making and using same
WO2011060352A1 (en) 2009-11-16 2011-05-19 Ipsen Pharma S.A.S. Pharmaceutical compositions of melanocortin receptor ligands
CA2797033C (en) 2010-04-22 2021-10-19 Longevity Biotech, Inc. Highly active polypeptides and methods of making and using the same
CN103108884A (zh) 2010-09-14 2013-05-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Serpin-finger融合多肽
CN104136455B (zh) * 2012-02-27 2017-05-17 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 抗hiv‑1多肽及其用途
CN104039815A (zh) * 2012-02-28 2014-09-10 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 用于抑制hiv的多肽及其作用靶点
AU2013337926B2 (en) 2012-10-30 2017-12-21 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Antibody/drug conjugates and methods of use
EP2968469A4 (en) 2013-03-15 2016-08-31 Longevity Biotech Inc PEPTIDES COMPRISING NON-ENDOGENIC AMINO ACIDS AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
US10919904B2 (en) 2016-08-17 2021-02-16 North Carolina State University Northern-southern route to synthesis of bacteriochlorins
WO2018081832A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Peptide fragments from filoviruses and their uses
WO2018102252A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 North Carolina State University Methods for making bacteriochlorin macrocycles comprising an annulated isocyclic ring and related compounds
US20210154327A1 (en) * 2017-08-29 2021-05-27 Pharis Biotec Gmbh Protransduzin-d - improved enhancer of gene transfer
US20220283151A1 (en) * 2021-03-05 2022-09-08 Brigham Young University Method for controlling protein dimerization using an intramolecular to intermolecular conformational switch
CN116162136B (zh) * 2021-11-24 2024-08-23 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN117186187B (zh) * 2023-07-12 2024-05-31 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗呼吸道合胞病毒膜融合抑制剂及其药物用途

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
EP0272858A3 (en) 1986-12-15 1989-07-12 Repligen Corporation Recombinant hiv envelope proteins produced in insect cells
AU626797B2 (en) 1987-09-08 1992-08-13 Albany Medical College Immunogenic composites capable of selectively inducing antibody production, pharmaceutical compositions employing the same and method of selectively inducing antibody production
US5763160A (en) 1988-02-12 1998-06-09 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides and process of using same for the detection of antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) gp120 envelope protein, diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions and as vaccines
CA1341285C (en) * 1988-02-12 2001-08-14 Chang Yi Wang Synthetic peptides for the detection of antibodies to hiv gp120 envelope protein for diagnosis of aids and pre-aids conditions and as vaccines
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
IE904083A1 (en) * 1989-11-13 1991-05-22 Cambridge Biotech Corp Diagnostic proteins to test for more than one antibody
US6248574B1 (en) 1989-12-13 2001-06-19 Avigdor Shaffermann Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides
US5723129A (en) 1991-10-16 1998-03-03 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
US5357041A (en) * 1991-12-06 1994-10-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Heparin- and sulfatide-binding peptides from the type I repeats of human thrombospondin
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ZA934199B (en) * 1992-06-18 1994-01-10 Akzo Nv Carrier system against gnrh
WO1994002505A1 (en) 1992-07-20 1994-02-03 Duke University Compounds which inhibit hiv replication
JP3401005B2 (ja) 1992-12-11 2003-04-28 ユニバーシティ オブ フロリダ 有害生物の防除のための材料および方法
US5646167A (en) * 1993-01-06 1997-07-08 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamix acids
US5464933A (en) * 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DE741187T1 (de) * 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
US6019980A (en) 1995-06-07 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
FR2739621B1 (fr) 1995-10-05 1997-12-05 Centre Nat Rech Scient Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6469136B1 (en) * 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001003723A9 (en) 2002-07-25
TWI248364B (en) 2006-02-01
MXPA02000012A (es) 2003-07-21
WO2001003723A1 (en) 2001-01-18
EP1206272A1 (en) 2002-05-22
CA2377677A1 (en) 2001-01-18
HRP20020022A2 (en) 2004-02-29
CN1254271C (zh) 2006-05-03
PL352685A1 (en) 2003-09-08
EP1206272A4 (en) 2003-01-02
AU6082200A (en) 2001-01-30
US7297784B2 (en) 2007-11-20
JP2003504344A (ja) 2003-02-04
AR024699A1 (es) 2002-10-23
CN1373669A (zh) 2002-10-09
KR100755418B1 (ko) 2007-09-05
HK1045259A1 (zh) 2002-11-22
BR0012287A (pt) 2002-04-02
RU2279883C2 (ru) 2006-07-20
NO20020087L (no) 2002-03-01
TR200200766T2 (tr) 2002-10-21
US6656906B1 (en) 2003-12-02
NO20020087D0 (no) 2002-01-08
KR20020029667A (ko) 2002-04-19
NZ516550A (en) 2004-05-28
IL147331A0 (en) 2002-08-14
US20030186874A1 (en) 2003-10-02
YU1402A (sh) 2004-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ200288A3 (cs) Hybridní polypeptid
US6562787B1 (en) Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
EP1989220B1 (en) Hiv fusion inhibitor peptides with improved biological properties
JP3510249B2 (ja) C型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性t細胞を刺激するためのペプチド
WO2004103312A2 (en) Peptides useful as hiv fusion inhibitors
CZ20004324A3 (cs) Hybridní polypeptidy