CN103108884A - Serpin-finger融合多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明包括融合多肽，所述融合多肽包含任选地通过肽接头多肽与生物学活性多肽缀合的serpin-finger多肽。另一个方面是serpin-finger融合多肽和serpin的蛋白质复合体，其中所述融合多肽被掺入到serpin的β-片层A的中间作为链4a。本发明的一个方面还是体外制备蛋白质复合体。serpin-finger多肽以高亲和力和功能性空间定向靶向和锚定生物学活性多肽。
Description
本发明涉及包含serpin-finger多肽和第二个肽、多肽或蛋白质的融合多肽，以及此类融合多肽的用途。
发明背景
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)调节许多生理学通路，例如炎症、凝固、纤维蛋白溶解、细胞凋亡和胞外基质重建。丝氨酸蛋白酶切割serpin的反应环，并且通过破坏催化位点使所述丝氨酸蛋白酶失活。
α1-抗胰蛋白酶是394个氨基酸的52kDa糖蛋白，其由肝细胞、巨噬细胞和肠上皮细胞和支气管上皮细胞合成。晶体结构显示α1-抗胰蛋白酶由5个β-片层、9个α-螺旋和暴露的移动的反应环组成，所述反应环包含14个残基，呈现了作为靶蛋白酶的假底物的肽序列。切割易断裂的反应键(表示为P1-P1′)导致不可逆的构象改变，其中环的N-端残基被完全掺入到α1-抗胰蛋白酶的β-片层中间，作为链4a(Schechter，I.和Berger，A.，Biochem.Biophys.Res.Commun.27(1967)157-162；Loebermann，H.等人，J.Mol.Biol.177(1984)531-557；Baumann，U.等人，J.Mol.Biol.218(1991)595-606；Baumann，U.等人，J.Mol.Biol.226(1992)1207-1218；Mourey，L.等人，Biochim.72(1990)599-608；Mourey，L.等人，J.Mol.Biol.232(1993)223-241)。
在被靶蛋白酶蛋白水解切割后，P1Met和P1′Ser分开，并且未被活化的活性位点环插入到反平行的β-片层A中，作为链4a。具有链4a的氨基酸序列的肽(人α1-抗胰蛋白酶的345-358位残基Thr-Glu-Ala-Ala-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Val-Met)与完整的α1-抗胰蛋白酶结合，并形成具有与裂解的α1-抗胰蛋白酶相似性质的化学计量复合体(Schulze，A.J.等人，Eur.J.Biochem.194(1990)51-56)。
在WO 97/024453中，报道了用于将病毒和颗粒整合和内化到靶细胞中的受体特异性的嵌合病毒表面多肽。EP 0 147 761中报道了与水溶性的聚合物共价连接的α1-抗胰蛋白酶-蛋白酶抑制剂复合体。US 2006/0040867中报道了丝氨酸蛋白酶活性的抑制剂，及其在用于细菌感染治疗的方法和组合物中的用途。
Schulze，A.J.等人报道了通过序列上与β-链S4A相似的肽进行的α-1抗胰蛋白酶的结构转变(Eur.J.Biochem.194(1990)51-56)。Congote，L.F.在Anti-infective agents in medicinal chemistry，Bentham Sciencepublishers，Hilversum(NL)，7(2008)126-133中报道了基于serpin C-末端肽中存在的氨基酸序列的多功能抗HIV剂。Qi，Z.等人(J.Biol.Chem.283(2008)30376-30384)报道了合理设计的抗HIV肽，所述肽含有作为分子探针的多功能结构域，用于研究第一代和第二代HIV融合抑制剂的作用机制。WO 01/51673中报道了用于抑制膜融合相关事件(包括HIV传播)的方法和组合物。WO 02/063017中报道了整联蛋白结合的嵌合体。EP 0 355905中报道了具有抗HIV作用的肝素片段和碎片。WO 00/52034和US 6,849,605中报道了用于治疗病毒感染的丝氨酸蛋白酶活性的抑制剂、方法和组合物。
发明概述
已发现，为了允许与serpin足够快的结合，serpin-finger多肽必须具有最小数目的氨基酸残基。此外，已发现serpin-finger多肽的第2位氨基酸(自serpin-finger多肽的N-末端起计数)处的氨基酸残基为谷氨酸是有益的。
本文中报道的serpin-finger融合多肽包含
-serpin-finger多肽，和
-另一个多肽，
其中，另一个多肽可以是发挥生物学活性，例如抑制、激活、结合或标记的任意多肽。
在一个实施方案中，serpin-finger融合多肽还包含至少一个
-肽接头多肽，
-蛋白酶切割位点，
-标签。
在一个实施方案中，serpin-finger多肽的氨基酸序列选自AGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：01)、AAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：02)、TEAAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：03)、AGAMFLEAIVM(SEQID NO：04)、TEAAGAMFFEAIPM(SEQ ID NO：05)、TAVVIA(SEQID NO：06)、SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO：07)、TEAAGATAVVIA(SEQ ID NO：08)、TDAAGATAVVIA(SEQ ID NO：09)、SDAAGAMFLEAI(SEQ ID NO：10)或SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)。在一个实施方案中，serpin-finger多肽的氨基酸序列选自SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO：07)和SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)。
在一个实施方案中，肽接头多肽的氨基酸序列是GGSGG(SEQ ID NO：12)或SGGGGSGGGGSGGGGT(SEQ ID NO：52)或STT(SEQ ID NO：75)。
在一个实施方案中，serpin-finger多肽的第2位氨基酸处的氨基酸残基(自serpin-finger多肽的N-末端起计数)是谷氨酸。
在一个实施方案中，serpin-finger多肽由8至14个氨基酸残基组成，在一个实施方案中，所述serpin-finger多肽由10至14个氨基酸残基组成，而在一个实施方案中，它由11至13个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，另一个多肽选自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、激素、细胞因子、生长因子、受体配体、受体激动剂、受体拮抗剂、酶配体、酶激动剂、酶拮抗剂、细胞毒性剂、抗病毒剂、显像剂和酶活性调节剂。
本文一方面报道了融合多肽，所述融合蛋白在N-至C-末端的方向包含融合到生物学活性多肽的serpin-finger多肽，任选地在它们之间具有肽接头多肽。
在一个实施方案中，生物学活性多肽是抗病毒剂。
在一个实施方案中，抗病毒剂是HIV融合抑制剂多肽。在一个实施方案中，HIV融合抑制剂多肽的氨基酸序列是MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO：13)。
本文报道的另一个方面是本文报道的serpin-finger融合多肽与serpin或其片段的蛋白质复合体，其中所述融合多肽被掺入在serpin的β-片层A中间，作为链4a。
本文报道的另一个方面是包含本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道的蛋白质复合体以及任选的包含可药用的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物进一步包含额外的治疗剂。
本文报道的另一个方面是本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道蛋白质复合体，用作药物。
本文报道的另一个方面是本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道蛋白质复合体用于治疗病毒感染。
在本文报道的一个方面，本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道蛋白质复合体用于抑制细胞-细胞膜融合，或抑制病毒对细胞的感染。在一个实施方案中，病毒对细胞的感染是HIV感染，并且serpin-finger融合多肽是serpin-finger HIV融合抑制剂多肽的融合多肽。
本文报道的一个方面是本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道的蛋白质复合体在生产药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗病毒感染。在另一个实施方案中，药物用于抑制细胞-细胞膜融合，或抑制病毒对细胞的感染。在一个实施方案中，病毒感染是HIV感染，并且serpin-finger融合多肽是serpin-finger HIV融合抑制剂多肽的融合多肽。
本文报道的另一个方面是治疗具有病毒感染的个体的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道的蛋白质复合体。在一个实施方案中，病毒感染是HIV感染，并且serpin-finger融合多肽是serpin-finger HIV融合抑制剂多肽的融合多肽。
本文报道的另一个方面是在个体中抑制细胞-细胞膜融合的方法，或抑制病毒对细胞感染的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的serpin-finger融合多肽或本文报道的蛋白质复合体，来抑制细胞-细胞膜融合，或抑制病毒对细胞的感染。
本文报道的另一个方面是包含本文报道的serpin-finger融合多肽和serpin或其片段的混合物，包含这种混合物的药物组合物，及其作为药物的用途。
本文报道的一个方面是serpin或其片段在生产具有serpin-finger融合多肽的蛋白质复合体中的用途，所述serpin-finger融合多肽在N-至C-末端的方向包含融合到生物学活性多肽上的serpin-finger多肽。
本文报道的另一个方面是在分开的容器中包含serpin-finger融合多肽和serpin的试剂盒，任选地包含用于混合这两个组分的另一个容器，以及任选地包含说明书。在一个实施方案中，试剂盒进一步包括检测样品中的融合多肽的方法。
发明详述
本文中报道了serpin-finger融合多肽，其包含
-serpin-finger多肽，和
-另一个多肽，
其中，另一个多肽可以是发挥生物学活性，例如抑制、激活、结合或标记的任意多肽。
在本文的一个方面，报道了包含serpin-finger融合多肽和serpin的蛋白质复合体，其中融合多肽被整合到β-片层A的中间，作为serpin的链4a。
serpin-finger融合多肽以高亲和力和功能性空间定向，将融合的其它多肽靶向和锚定至serpin上。
在一个实施方案中，报道了这样的serpin-finger融合多肽，所述融合多肽包含通过肽接头多肽融合到HIV融合抑制剂上的serpin-finger多肽。
在本发明中使用的术语“serpin-finger多肽”表示由8至16个氨基酸残基组成的多肽，所述氨基酸残基源自serpin的天然的反应中心环，或源自其合成类似物。在一个实施方案中，多肽的氨基酸序列由11至13个氨基酸残基组成。在一个实施方案中，serpin-finger多肽的氨基酸序列选自
AGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：01)，AAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：02)，TEAAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：03)，AGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：04)，TEAAGAMFFEAIPM(SEQ ID NO：05)，TAVVIA(SEQ ID NO：06)，SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO：07)，TEAAGATAVVIA(SEQ ID NO：08)，TDAAGATAVVIA(SEQ ID NO：09)，SDAAGAMFLEAI(SEQ ID NO：10)，SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)，TIDEKGTEAAGAMFLE(SEQ ID NO：14)，DVFEEGTEASAATAVK(SEQ IDNO：15)，DVDEAGTEAAAATTFA(SEQ ID NO：16)，QLNEEGVDTAGSTGVT(SEQ ID NO：17)，HIGEKGTEAAAVPEVE(SEQ ID NO：18)，EVDERGTEAVAGILSE(SEQ ID NO：19)，EVTEEGVEAAAATAVV(SEQ IDNO：20)，EVTEEGAEAAAATAVV(SEQ ID NO：21)，TVNEEGTQATTVTTVG(SEQ ID NO：22)，EVDENGTQAAAATGAV(SEQ ID NO：23)，EVNEEGTEAAAATAVV(SEQ ID NO：24)，DVNEEGTEAAAGTGGV(SEQ IDNO：25)，EVNESGTVASSSTAVI(SEQ ID NO：26)，DVFEEGTEASAATAVK(SEQ ID NO：27)，EVTEEGTEATAATGSN(SEQ ID NO：28)，EITEDGGDSIEVPGAR(SEQ ID NO：29)，ELSEVGVEAAAATSIA(SEQ IDNO：30)，ELTETGVEAAAASAIS(SEQ ID NO：31)，GTEAAGAMFLEAIPMS(SEQ ID NO：82)，和SGTEAAGAMFLEAIPMS(SEQ ID NO：83)。
在一个实施方案中，serpin-finger多肽的氨基酸序列是AGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：01)或AAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：02)或TEAAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：03)或SEAAASTAVVIA(SEQ IDNO：07)或SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)。在一个实施方案中，serpin-finger多肽源自α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶。
术语“serpin”表示具有多种功能的蛋白质超家族。下文列举了serpin超家族的示例性成员。在一个实施方案中，serpin选自α1-抗胰蛋白酶(serpinA1)、抗胰蛋白酶相关蛋白(serpinA2)、α1-抗糜蛋白酶(serpinA3)、kallistatin(serpinA4)、C蛋白抑制剂(serpinA5)、皮质醇结合球蛋白(serpinA6)、甲状腺素结合球蛋白(serpinA7)、血管紧张素原(serpinA8)、centerin(serpinA9)、Z蛋白相关蛋白酶抑制剂(serpinA10)、serpinA11、vaspin(serpinA12)、serpinA13、单核细胞嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(serpinB1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(serpinB2)、鳞状细胞癌抗原-1和-2(serpinB3和B4)、maspin(serpinB5)、PI-6(serpinB6)、megsin(serpinB7)、PI-8(serpinB8)、PI-9(serpinB9)、骨髓丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpinB10)、serpinB11、yukopin(serpinB12)、hurpin/headpin(serpinB13)、抗凝血酶(serpinC1)、肝素辅因子II(serpinD1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(serpinE1)、胶质衍生的连接蛋白/蛋白酶连接蛋白I(serpinE2)、色素上皮衍生因子(serpinF1)、α2-抗纤维蛋白溶酶(serpinF2)、补体1抑制剂(serpinG1)、HSP47(serpinH1)、neuroserpin(serpinI1)和pancpin(serpinI2)。Serpin的片段是仍然发挥这样的功能的分子，所述功能是将本文报道的serpin-finger融合多肽掺入到β-片层A中间，作为serpin片段的链4a。
本文使用的术语“生物学活性多肽”指当施用至人工生物学系统或到人工生物学系统中(所述人工生物学系统例如，生物测定，例如使用细胞系和病毒)，或对动物(包括但不限于鸟类或哺乳动物，包括人)体内施用时引起生物学效应的有机分子，例如生物学大分子，如肽、蛋白质、糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成的多肽或蛋白质。这种生物学效应可以是但不限于酶抑制或激活、在结合位点或周围结合受体或配体、信号触发或信号调节。生物学活性分子不限于例如免疫球蛋白，或激素，或细胞因子，或生长因子，或受体配体，或激动剂或拮抗剂，或细胞毒性剂，或抗病毒剂，或显像剂，或酶抑制剂、酶激活物或酶活性调节剂，例如变构物质。在一个实施方案中，生物学活性多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白缀合物或HIV融合抑制剂多肽。
“HIV融合抑制剂多肽”是抑制与膜融合相关的事件或膜融合事件本身，包括例如抑制由于膜融合HIV病毒对未感染细胞的感染的多肽。在一个实施方案中，HIV融合抑制剂多肽是线性多肽。例如，在一个实施方案中，HIV融合抑制剂多肽源自HIV gp41胞外结构域。例如DP107或DP178。HIV融合抑制剂多肽的氨基酸序列由5至100个氨基酸残基组成，在一个实施方案中，由10至75个氨基酸残基组成，在另一个实施方案中，由15至50个氨基酸残基组成。在一个实施方案中，HIV融合抑制剂多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：32至42。HIV融合抑制剂多肽的其他实例可见于US 5,464,933、US 5,656,480、US 6,013,263、US 6,017,536、US 6,020,459、US 6,093,794、US 6,060,065、US 6,258,782、US 6,348,568、US 6,479,055、US 6,656,906、WO 1996/19495、WO 1996/40191、WO 1999/59615、WO 2000/69902和WO 2005/067960。例如HIV融合抑制剂多肽的氨基酸序列可以选自US 5,464,933的SEQ IDNO：1至10；US 5,656,480的SEQ ID NO：1至15；US 6,013,263的SEQ IDNO：1至10和16至83；US 6,017,536的SEQ ID NO：1至10、20至83和139至149；US 6,093,794的SEQ ID NO：1至10、17至83和210至214；US 6,060,065的SEQ ID NO：1至10、16至83和210至211；US 6,258,782的SEQ ID NO：1286和1310；US 6,348,568的SEQ ID NO：1129、1278-1309、1311和1433；US 6,479,055的SEQ ID NO：1至10和210至238；US6,656,906的SEQ ID NO：1至171、173至216、218至219、222至228、231、233至366、372至398、400至456、458至498、500至570、572至620、622至651、653至736、739至785、787至811、813至823、825、827至863、865至875、877至883、885、887至890、892至981、986至999、1001至1003、1006至1018、1022至1024、1026至1028、1030至1032、1037至1076、1078至1079、1082至1117、1120至1176、1179至1213、1218至1223、1227至1237、1244至1245、1256至1268、1271至1275、1277、1345至1348、1350至1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374至1376、1378至1379、1381至1385、1412至1417、1421至1426、1428至1430、1432、1439至1542、1670至1682、1684至1709、1712至1719、1721至1753、1755至1757；或WO 2005/067960的SEQ IDNO：5至95。
表1：HIV融合抑制剂多肽氨基酸序列
在本申请中使用的术语“肽接头多肽”表示天然和/或合成起源的肽接头多肽。肽接头多肽由线性氨基酸残基链组成，链中20个天然存在的氨基酸是单体构件。链具有1至50个氨基酸残基的长度，在一个实施方案中，链具有1至28个氨基酸残基的长度，在另一个实施方案中，链具有3至25个氨基酸残基的长度。肽接头多肽可含有重复氨基酸序列或天然存在的多肽序列，例如具有铰链功能的多肽。通过允许缀合物或融合物中的缀合/融合多肽的每个多肽正确地折叠和恰当地展示，肽接头多肽具有确保每个多肽可以实行其生物学活性的功能。在一个实施方案中，肽接头多肽是指定富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成的肽接头多肽”。残基排列成例如多达5个氨基酸残基，例如GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、QQQQG或SSSSG的小重复单元。重复单元可以重复2至5次，形成多聚单元。在多聚单元的氨基和/或羧基末端，可以添加多达6个额外任意的、天然存在的氨基酸残基。其他的合成肽接头多肽由重复10至20次的单个氨基酸残基组成，并且在氨基和/或羧基末端可以包含多达6个额外的任意的、天然存在的氨基酸残基，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO：61)中的丝氨酸。在一个实施方案中，肽接头多肽选自抗体铰链区，LSLSPGK(SEQ ID NO：43)、LSPNRGEC(SEQ ID NO：44)、[GQ4]3GNN(SEQ ID NO：47)、LSLSGG(SEQ ID NO：69)、LSLSPGG(SEQ ID NO：70)、G3[SG4]2SG(SEQ ID NO：73)、G3[SG4]2SG2(SEQID NO：74)或STT(SEQ ID NO：75)。所有的肽接头多肽都可以由核酸分子编码，因此可以被重组表达。由于肽接头多肽本身是多肽，因此serpin-finger多肽通过在两个氨基酸之间形成的肽键与肽接头多肽连接。
表2：肽接头多肽氨基酸序列
| No. | 接头肽 | SEQ ID NO： |
| 1 | G2SG2 | 12 |
| 2 | LSLSPGK | 43 |
| 3 | LSPNRGEC | 44 |
| 4 | [GQ4]3 | 45 |
| 5 | [GQ4]3G | 46 |
| 6 | [GQ4]3GNN | 47 |
| 7 | GGG[SG4]2SGG | 48 |
| 8 | GGG[SG4]2SGN | 49 |
| 9 | [SG4]3 | 50 |
| 10 | [SG4]3G | 51 |
| 11 | [SG4]3T | 52 |
| No. | 接头肽 | SEQ ID NO： |
| 12 | [SG4]3GG | 53 |
| 13 | [SG4]3GGT | 54 |
| 14 | [SG4]3GGN | 55 |
| 15 | [SG4]3GAS | 56 |
| 16 | [SG4]5 | 57 |
| 17 | [SG4]5G | 58 |
| 18 | [SG4]5GG | 59 |
| 19 | [SG4]5GAS | 60 |
| 20 | G(S)15G | 61 |
| 21 | G(S)15GAS | 62 |
| 22 | G | |
| 23 | N | |
| 24 | GST | 63 |
| 25 | [G4S]3GAS | 64 |
| 26 | [G4S]3G | 65 |
| 27 | [G4S]5G | 66 |
| 28 | [G4S]3GG | 67 |
| 29 | [G4S]5GG | 68 |
| 30 | LSLSGG | 69 |
| 31 | LSLSPGG | 70 |
| 32 | [G3S]5 | 71 |
| 33 | [G3S]5GGG | 72 |
| 34 | G3[SG4]2SG | 73 |
| 35 | G3[SG4]2SG2 | 74 |
| 36 | STT | 75 |
术语“到β-片层A中作为链4a”表示在serpin的β-片层A，例如α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶的β-片层A的链4和5之间插入serpin-finger融合多肽。
与分离的多肽相比，在包含融合到具有生物学活性的多肽上(任选地通过肽接头)的serpin-finger多肽的融合多肽中的具有生物学活性的融合多肽具有改进的性质。融合多肽可以例如插入到serpin(例如α1-抗胰蛋白酶)的β-片层A中，以改善具有生物学活性的融合多肽的体内半寿期。已发现源自抗凝血酶的serpin-finger多肽很好地插入到α1-抗胰蛋白酶的β-片层中。这种组合是本发明方面的一个实施方案。例如从表3中给出的体外结合数据中可见这种组合。
此外，已经发现不是具有最短的6个氨基酸残基的氨基酸序列的serpin-finger多肽插入最快，而是具有更长的11至13个氨基酸残基的序列的serpin-finger多肽插入最快。此外，氨基酸谷氨酸作为serpin-finger多肽的第2个氨基酸(自serpin-finger多肽的N末端起计数)增加了serpin-finger融合多肽在serpinβ片层中的插入效率。
表3：Serpin-finger多肽氨基酸序列和与serpinα1-抗胰蛋白酶的体外缔合T1/2
| serpin-finger多肽氨基酸序列 | 体外缔合T1/2[h] |
| Ac-TEAAGAMFLEAIVM | 10 |
| Ac-AGAMFLEAIVM | 4-5天 |
| Ac-TEAAGAMFFEAIPM | 10 |
| Ac-TAVVIA | 16 |
| Ac-SEAAASTAVVIA | 1.4 |
| Ac-TEAAGATAVVIA | 9.5 |
| Ac-TDAAGATAVVIA | 16 |
| Ac-SDAAGAMFLEAI | 16 |
| Ac-SEAAASMFLEAI | 4 |
在下文中，用serpin-finger融合多肽示例了本文报道的方面，所述serpin-finger融合多肽包含肽接头多肽和作为生物学活性多肽的HIV融合抑制剂多肽。给出的下文仅示例本文报道的主题，而不作为限制或限定。
已制备了不同的融合多肽。通过化学基因合成已经获得了编码基因，并已经在大肠杆菌中重组产生多肽。不同的融合多肽已经以这样的构建体被表达，所述构建体包含作为纯化标签的链霉亲和素载体蛋白、胰蛋白酶切割位点、serpin-finger多肽、肽接头多肽和HIV融合抑制剂多肽。
在一个实施方案中，胰蛋白酶切割位点的氨基酸序列是GR。
在一个实施方案中，serpin-finger多肽的氨基酸序列是SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO：07)，具有或不具有N-末端和/或C-末端接头，其中所述接头独立地且分别选自S或G或SG。
在一个实施方案中，肽接头多肽的氨基酸序列是[SG4]3(SEQ ID NO：50)或[SG4]3T(SEQ ID NO：52)或STT(SEQ ID NO：75)。
融合多肽FP-1的氨基酸序列是SEQ ID NO：76，融合多肽FP-2的氨基酸序列是SEQ ID NO：77，融合多肽FP-3的氨基酸序列是SEQ ID NO：78。在融合多肽FP-1至FP-3中，相同的serpin-finger多肽与不同的HIV融合抑制剂多肽缀合。在大肠杆菌中，融合多肽FP-3比FP-2表达得好，而FP-2又比融合多肽FP-1表达得好。在BIAcore测定中，获得了用于结合靶HIV HR-1多肽(FP-3＞FP-2＞FP-1)的融合多肽的相同序列。在细胞-细胞融合测定(CCF测定)中，也已经发现了用于抗病毒活性的相同序列。
通过凝胶电泳(尿素-PAGE)已经显示，形成了根据本发明的融合多肽与α1-抗胰蛋白酶的蛋白质复合体。图1显示了在单个FP-X融合多肽和α1-抗胰蛋白酶之间的稳定的复合体的形成。
由于不能通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质复合体和游离的α1-抗胰蛋白酶，必须通过与HR1-多肽-生物素-缀合物温育的Western印迹，进行确定蛋白质复合体的形成。图2显示了示例性的印迹。为了制备分离游离的融合多肽和蛋白质复合体，可以使用尺寸排阻层析。图3显示了单个级分的示例性层析图与SDS-PAGE分析。
测定了不同的serpin-finger融合多肽与serpinα1-抗胰蛋白酶的缔合速率。最快的结合者具有1至4小时的体外缔合T1/2。
在表4中，显示了与分离的HIV融合抑制剂多肽相比，FP-1至FP-3融合多肽的结合特征。
表4：FP-1至FP-3对HIV HR1多肽的结合性质
通过表面等离振子共振测定的结合亲和力展示出对游离的融合抑制剂和三种融合肽相似的结合常数。从图4显示的BIAcore结合图可见，一方面蛋白质复合体与HIV HR1多肽结合(图4b)，另一方面，含有FP-2的蛋白质复合体具有三种复合体中对固定的HR1多肽的最好的亲和力。
从表5可见，融合多肽FP-1至FP-3具有与分离的HIV融合抑制剂多肽可比较的抗病毒活性。
表5：融合多肽在CCF测定中的抗病毒活性
提供下列实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，所附权利要求中给出了本发明的真实范围。理解的是，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。
序列表描述
SEQ ID NO：1至11、14至31、82、83serpin-finger多肽氨基酸序列
SEQ ID NO：12和43至75 肽接头多肽氨基酸序列
SEQ ID NO：13和32至42 HIV融合抑制剂多肽氨基酸序列
SEQ ID NO：76 融合多肽1氨基酸序列
SEQ ID NO：77 融合多肽2氨基酸序列
SEQ ID NO：78 融合多肽3氨基酸序列
SEQ ID NO：79和80 引物序列
SEQ ID NO：81 核心链霉亲和素氨基酸序列
SEQ ID NO：84至86 FP-1、FP-2、FP-3编码核酸
SEQ ID NO：87 HIV HR1氨基酸序列
附图描述
图1分析融合多肽和α1-抗胰蛋白酶的蛋白质复合体的形成：在37℃温育一周后进行8M尿素PAGE-SDS凝胶(1-分子量标记；3-FP-1-AAT；4-FP-2-AAT；5-FP-3-AAT；6-FP-1-AAT；7-FP-2-AAT)和温育物的凝胶过滤分离的12％SDS-PAGE(1-分子量记；2-AAT；3-FP-1-AAT；4-FP-2-AAT；5-FP-3-AAT)。[AAT＝α1-抗胰蛋白酶]
图28M尿素PAGE-SDS凝胶(温育4天：1＝37℃+FP-2；2＝37℃+FP-3；3＝45℃+FP-2；4＝45℃+FP-3；5＝37℃+FP-2；6＝37℃+FP-3；7＝45℃+FP-2；8＝45℃+FP-3；9＝AAT37℃)和Western印迹(1＝FP-2；2＝FP-3；3＝AAT45℃；4＝AAT RT；5＝蛋白质复合体FP-237℃；6＝SEC纯化的蛋白质FP-2 45℃；7＝蛋白质复合体FP-3 37℃；8＝蛋白质复合体FP-3 45℃；9＝蛋白质复合体FP-2+凝胶过滤；10＝蛋白质复合体FP-3+SEC纯化)。
图3经分离的游离的融合多肽和蛋白质复合体的示例性尺寸排阻层析。
图4显示a)游离FP-2和b)FP-2和α1-抗胰蛋白酶的蛋白质复合体对固定的HIV HR1多肽的结合的BIAcore图；c)显示含有FP-2和FP-3的蛋白质复合体对固定的HIV HR1多肽结合的BIAcore图。
实施例
材料&方法
重组DNA技术
用于操作DNA的标准方法描述在Sambrook，J.等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因合成
通过化学合成制备所希望的基因片段。通过基因合成制备所希望的基因片段。将合成的基因片段克隆到特定的表达载体中。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。
蛋白质测定
通过测定280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，测定缀合物的蛋白质浓度。
实施例1
制备表达质粒
通过重组方法制备融合多肽FP-1、FP-2和FP-3。使用核心-链霉亲和素作为在大肠杆菌中高水平表达的载体蛋白，在大肠杆菌中将所述融合多肽表达为更大的融合蛋白。使用胰蛋白酶(FP-1和FP-2)或内切蛋白酶LysC(FP-3)，通过体外酶切割释放所希望的多肽。
设计核心-链霉亲和素载体融合蛋白
通过分别含有唯一的胰蛋白酶或LysC内切蛋白酶切割位点的GR或GK蛋白酶接头，将多肽FP-1(SEQ ID NO：76＝GR+SEQ ID NO：05+SEQ ID NO：52+SEQ ID NO：37)、FP-2(SEQ ID NO：77＝GR+SEQ IDNO：82+SEQ ID NO：75+SEQ ID NO：13)和FP-3(SEQ ID NO：78＝GR+SEQ ID NO：83+SEQ ID NO：50+SEQ ID NO：40)与核心-链霉亲和素序列(SEQ ID NO：81)融合。
用已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸片段，装配核心-链霉亲和素融合基因，其包含核心-链霉亲和素编码核酸、短内切蛋白酶接头编码核酸(GR)、serpin-finger多肽编码核酸、接头编码核酸和HIV融合抑制剂肽编码核酸。通过化学合成制备编码多肽F1、F2和F3的核酸序列，然后连接到大肠杆菌质粒中用于扩增。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。
制备和描述基础/起始的大肠杆菌表达质粒4980
质粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉亲和素的表达质粒。通过连接源自质粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重复；在EP-B 1 422237中报道)的3142bp长的EcoRI/CelII-片段与435bp的长的编码核心-链霉亲和素的EcoRI/CelII-片段来产生所述质粒4980。
核心-链霉亲和素大肠杆菌表达质粒包含下列元件：
-用于在大肠杆菌中复制的来自载体pBR322的复制起点(对应于根据Sutcliffe，G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90中的bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3基因，其编码乳清苷5’-磷酸脱羧酶(Rose，M.等人，Gene29(1984)113-124)，并且允许通过大肠杆菌pyrF突变菌株互补(尿嘧啶营养缺陷型)的质粒选择，
-核心-链霉亲和素表达盒，其由以下构成：
-包括根据Stueber，D.等人的合成核糖体结合位点(参见前文)的T5杂合启动子(根据Bujard，H.等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber，D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，
-核心-链霉亲和素基因，和
-两个噬菌体衍生的转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz，E.等人，Nature272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck，E.和Zink，B.，Gene1-3(1981)35-58)，和
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh，P.J.，Nature274(1978)765-769)。
制备FP-1、FP-2和FP-3融合多肽表达质粒
a)质粒4981
质粒4981(4981-SAC-Serpin1-T1249)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉亲和素-FP-1蛋白的质粒。所述质粒通过在3547bp长的NheI/CelII-4980质粒片段中，插入下列的232bp长的NheI/CelII-F1基因片段(编码F1多肽SEQ ID NO：84)制备。
1 gctagcggtc gtaccgaagc cgcgggcgct atgttcctgg
41 aagcaatccc gatgtccgga ggtggcggtt ctggtggcgg
81 tggttccggc ggtggtggca cgtggcagga atgggaacag
121 aaaatcaccg ctcttctaga acaggcgcag atccagcagg
161 agaaaaacga atacgaactg cagaagcttg acaaatgggc
201 ttctctgtgg gaatggttct aatgagctga gc
b)质粒4982
质粒4982(4982-SAC-Serpin2-T651)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉亲和素-FP-2蛋白的质粒。所述质粒通过在3547bp长的NheI/CelII-4980质粒片段中，插入下列的181bp长的NheI/CelII-F2基因片段(编码F2多肽SEQ ID NO：85)制备。
1 gctagcggtc gtggcactga agctgcaggt gcgatgtttc
41 tagaagctat cccgatgtcc accacgtgga tggagtggga
81 caaagaaatc aacaactaca caagcttgat ccactccctg
121 atcgaagaat cccagaacca gcaggagaaa aacgaacagg
161 aactgctgta atgagctgag c
c)质粒4983
质粒4983(4983-SAC-Serpin3-T2635)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉亲和素-FP-3蛋白的质粒。所述质粒通过在3547bp长的NheI/CelII-4980质粒片段中，插入下列的232bp长的NheI/CelII-F3基因片段(编码F3多肽SEQ ID NO：86)制备。
1 gctagcggca aatctggtac tgaagccgcg ggtgctatgt
41 tcctggaggc gatcccgatg tccggaggtg gcggttctgg
81 cggtggtggc tccggtggtg gtggcaccac gtgggaagca
121 tgggaccgtg ctatcgcaga atacgcggct cgcatcgaag
161 ctttgatccg tgcagctcag gagcagcagg aacgtaacga
201 agcagcgctg cgtgaactgt aatgagctga gc
实施例2
在大肠杆菌中表达核心-链霉亲和素融合蛋白
为了表达核心-链霉亲和素融合蛋白4981、4982和4983，使用这样的大肠杆菌宿主/载体系统，所述系统能够通过大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)的互补进行无抗生素的质粒选择(参见例如EP-B 0 972 838和US6,291,245)。
在大肠杆菌菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF)中表达融合蛋白。
转化和通过在选择培养基中pyrF营养缺陷型互补进行的细胞培养
用前面步骤中获得的表达质粒(分别是4981、4982和4983)，转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF)。被转化的CSPZ-2细胞首先在琼脂平板上，在37℃下生长，随后在含有0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中摇瓶培养，直到550nm的光密度(OD550)为0.6-0.9，随后用IPTG(1-5mmol/l的终浓度)诱导。
在37℃下4至16小时的诱导期后，通过离心收获细胞，用pH6.5的50mmol/l磷酸钾缓冲液洗涤，并在进一步处理前在-20℃下储藏。
表达分析
为了表达分析，将来自离心培养基的3OD550nm单位(1OD550nm＝1ml在550nm的OD为1的细胞悬液)的细胞沉淀重悬在0.25ml10mmol/l磷酸钾缓冲液pH6.5中，并通过超声波处理裂解细胞(50％强度，2次30秒脉冲)。沉降不可溶的细胞组分(14,000rpm离心，5min.)，将上清液与其1/5体积的5xSDS样品缓冲液(1xSDS样品缓冲液：50mmol/lTris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚蓝)混合。将不可溶的细胞碎片部分(沉淀)重悬在0.3ml1xSDS样品缓冲液中，在95℃温育样品5min，再次离心。随后，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质(Laemmli，U.K.，Nature227(1970)680-685)并用考马斯亮蓝R染料染色。
合成的核心-链霉亲和素融合蛋白是同质的，并且仅发现于不溶的细胞碎片部分中并以不溶的蛋白质聚集体(被称作包涵体(IB))的形式存在。在测量精确度的范围内，所有克隆中的表达产量是可比较的，并且在相对于总大肠杆菌蛋白质的30％-60％之间。
实施例3
大肠杆菌的10l高细胞密度发酵，用于重组生产核心-链霉亲和素融合蛋白
预培养
为了制备预培养物，在1000ml锥形瓶中，用1ml分别转化了质粒4981、4982和4983的大肠杆菌CSPZ-2甘油原种，接种300ml M9-plus培养基(补充了0.5％酪蛋白氨酸和各0.9g/l Trp、Pro和Leu的M9培养基)。在外心摇床上在37℃下以150rpm温育培养物约6小时，直到达到3.0的OD578nm。
10l补料-分批主发酵：
在发酵的开始时，将预培养物转移到10升发酵罐中。主培养物在含有1.4％的甘油而非葡萄糖、2％的酪蛋白氨酸和各0.1％的氨基酸Trp、Leu和Pro的被限定的M9盐培养基中生长，直到20的OD578nm。随后，开始用甘油酵母剂(原液：30％酵母提取物和33％甘油)补料培养物，取决于培养物的pH值的发展，所述甘油酵母剂流速在0.8和3.5ml/min之间变化，从而避免任意进一步添加较正液(H3PO4，KOH)。pH维持在pH7.0，通过控制搅拌速度，保持pO2值为50％。在OD578nm为70时，添加1.5mmol/l IPTG。在OD578nm为160-180时终止发酵。.
收获生物质
用流通(flow-through)离心机(13,000rpm，131/h)离心发酵罐的内容物，在进一步加工前，将收获的生物质储藏在-20℃下。
实施例4
细胞裂解和制备IB
在0℃下，将200g大肠杆菌细胞(湿重)悬浮在一升pH7.0的0.1mol/l Tris-HCl中，加入300mg溶菌酶，并在0℃温育20分钟。随后，通过高压分散的方法，将细胞完全机械地裂解，并且通过添加2ml1mol/lMgCl2和10mg DNA酶，在25℃下消化DNA30分钟。然后，将500ml60mmol/l EDTA，6％Triton X-100和1.5mol/l NaCl，pH7.0与裂解溶液混合，并在0℃再温育30分钟。随后，通过离心，沉降不溶的组分(细胞碎片和IB)。将沉淀悬浮在一升0.1mol/l Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH6.5中，在25℃温育30分钟，通过离心分离IB制品。
实施例5
增溶含有核心-链霉亲和素的F1、F2和F3融合蛋白、酶促释放和纯化F1、F2和F3多肽
用100mM磷酸钾缓冲液pH6.5，具有20mM EDTA的500mM氯化钠和双蒸水各洗涤在前面的实施例中获得的包涵体2次。通过添加10ml30mM氢氧化钾溶液，溶解一克(湿重)沉淀的包涵体。30min的搅拌后，通过添加1M硼酸，pH值变为pH8.9。在增溶和调节pH后，用胰蛋白酶(1∶25000w/w)酶促消化含有核心-链霉亲和素的F1和F2融合蛋白，而用LysC(1∶20000w/w；10μl的10μM LysC溶液)酶促消化含有核心-链霉亲和素的F3融合蛋白。溶液在15℃温育过夜。通过添加10倍摩尔过量的抑肽酶，终止胰蛋白酶消化。通过rec SerETI亲和层析纯化剩余的蛋白酶。仅通过rec SerETI亲和层析终止F3的LysC消化。
使用Eurospher C8层析柱，通过反相层析纯化释放的F1、F2和F3融合多肽。
实施例6
形成融合多肽和α1-抗胰蛋白酶的蛋白质复合体
将PBS(磷酸缓冲盐水，1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，105mMNaCl，2.7mM KCl)中的25μMα1-抗胰蛋白酶与4至5倍过量(例如，125μM)的融合多肽在37℃下温育24小时。使用更长的温育时间并未导致蛋白质复合体的进一步形成。在温育后，通过尺寸排阻过滤，分离蛋白质复合体和未复合的serpin-finger多肽。组合包含几乎相同的分子量的分子的级分。浓缩组合级分，并将样品应用于SDS-PAGE凝胶。使用1D-Image-Master(Amersham Bioscience)分析SDS-PAGE凝胶上的单个条带，定量蛋白质复合体的级分，并确定分子量差异。通过BIAcore测定组合的和浓缩的级分的活性(参见图3)。在反应混合物中，已经检测到二聚的α1-抗胰蛋白酶(125kDa，约14％)、蛋白质复合体(60kDa，约15％)和单体的α1-抗胰蛋白酶(55kDa)。
实施例7
BIAcore分析
在25℃下，在BIAcore3000仪器(GE Healthcare Biosciences AB，瑞典)上进行所有的表面等离振子共振测量。根据制造商的说明(GEHealthcare Biosciences AB，瑞典)，将化学制备的HIV HR1肽(7次重复1；生物素-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIK
QLQARILAVERYLKDQ-NH2(SEQ ID NO：87))固定在CM5生物传感器芯片上。将融合多肽稀释至25nM的浓度，并以50μl/min的流速注射5分钟以上。之后，从不同的组合级分中获得的蛋白质复合体被稀释到相同的缓冲液中以达到250nM和80nM的浓度，并以50μl/min的流速被注射5分钟以上。然后，用PBS，pH8.0，0.005％(v/v)Tween20再生传感器芯片1分钟。用BIAevaluation软件(BIAcore，瑞典)进行数据分析(参见图4)。
Claims (15)
1.融合多肽，其包含serpin-finger多肽和生物学活性多肽。
2.根据权利要求1的融合多肽，其特征是所述serpin-finger多肽的第2位氨基酸处的氨基酸残基是谷氨酸。
3.根据前面权利要求任一项的融合多肽，其特征在于所述serpin-finger多肽具有8至14个氨基酸残基长度的氨基酸序列。
4.根据前面权利要求任一项的融合多肽，其特征在于所述生物学活性多肽是HIV融合抑制剂多肽。
5.根据前面权利要求任一项的融合多肽，其特征在于所述serpin-finger多肽的氨基酸序列选自TEAAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO：03)、TEAAGAMFFEAIPM(SEQ ID NO：05)、SEAAASTAVVIA(SEQID NO：07)、TEAAGATAVVIA(SEQ ID NO：08)或SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)。
6.根据权利要求5的融合多肽，其特征在于所述serpin-finger多肽的氨基酸序列是SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO：07)或SEAAASMFLEAI(SEQ ID NO：11)。
7.根据前面权利要求任一项的融合多肽，其特征在于所述融合多肽在所述serpin-finger多肽和所述生物学活性多肽之间包括肽接头多肽，所述肽接头多肽具有GGSGG(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列。
8.根据权利要求4至7的任一项的融合多肽，其特征在于所述HIV融合抑制剂多肽的氨基酸序列是MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO：13)。
9.根据权利要求1至8的任一项的融合多肽和serpin的蛋白质复合体。
10.根据权利要求9的蛋白质复合体，其特征在于所述serpin选自α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶。
11.根据权利要求1至8的任一项的融合多肽或根据权利要求9或10的任一项的蛋白质复合体，所述融合多肽或所述蛋白质复合体用作药物。
12.根据权利要求1至8的任一项的融合多肽或根据权利要求9或10的任一项的蛋白质复合体，所述融合多肽或所述蛋白质复合体用于病毒感染的治疗。
13.根据权利要求4至8的任一项的融合多肽或根据权利要求9或10的任一项的蛋白质复合体，所述融合多肽或所述蛋白质复合体用于HIV感染的治疗。
14.α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶的用途，其用于生产与根据权利要求1至8的任一项的融合多肽的蛋白质复合体。
15.试剂盒，其包含
-根据权利要求1至8的任一项的融合多肽，或根据权利要求9或10的任一项的蛋白质复合体，和
-α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶。
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105793285A (zh) * | 2013-12-10 | 2016-07-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 多亚基结构的亚基的结合结构域用于将药物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052034A2 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| WO2002058638A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | The General Hospital Corporation | Serpin drugs for treatment of hiv infection and method of use thereof |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| ATE84217T1 (de) | 1988-08-24 | 1993-01-15 | Akzo Nv | Fragmente und fraktionen von heparin mit wirkung gegen hiv. |
| ATE183515T1 (de) | 1992-07-20 | 1999-09-15 | Univ Duke | Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren |
| US6017536A (en) | 1993-06-07 | 2000-01-25 | Trimeris, Inc. | Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities |
| US6479055B1 (en) | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
| US5464933A (en) | 1993-06-07 | 1995-11-07 | Duke University | Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission |
| AU723537B2 (en) | 1995-06-07 | 2000-08-31 | Trimeris Inc. | The treatment of HIV and other viral infections using combinatorial therapy |
| JP2001519647A (ja) | 1995-12-28 | 2001-10-23 | カイロン コーポレイション | 標的細胞中へのウイルスおよび粒子の取り込みおよびインターナリゼーションのためのレセプター特異的キメラウイルス表面ポリペプチド |
| EP0927764B1 (de) * | 1997-12-03 | 2004-05-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chimäre Serinproteasen |
| US6258782B1 (en) | 1998-05-20 | 2001-07-10 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| US6656906B1 (en) | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| US6291245B1 (en) | 1998-07-15 | 2001-09-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Host-vector system |
| EP0972838B1 (en) | 1998-07-15 | 2004-09-15 | Roche Diagnostics GmbH | Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy |
| US20100210528A1 (en) * | 1999-03-05 | 2010-08-19 | Leland Shapiro | Compositions, methods and uses for inhibition and/or treatment of influenza infection |
| US6849605B1 (en) | 1999-03-05 | 2005-02-01 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| EP1264840B1 (en) | 1999-05-17 | 2009-09-23 | ConjuChem Biotechnologies Inc. | Long lasting fusion peptide inhibitors of viral infection |
| US6750008B1 (en) | 1999-07-09 | 2004-06-15 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission |
| WO2002050287A2 (en) * | 2000-12-18 | 2002-06-27 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
| US20040072315A1 (en) | 2001-02-05 | 2004-04-15 | Xinjie Lu | Integrin-binding chimeras |
| NZ534492A (en) * | 2002-02-07 | 2009-10-30 | Novozymes Delta Ltd | Albumin-fused kunitz domain peptides |
| CA2443365C (en) | 2002-11-19 | 2010-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides |
| US7550263B2 (en) * | 2003-09-05 | 2009-06-23 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | Method for the production of fusion proteins in transgenic mammal milk |
| RU2006128593A (ru) | 2004-01-07 | 2008-02-20 | Тримерис, Инк. (Us) | Синтетические пептиды, производные области hr2 белка gp41 вич, и их применение в терапии для ингибирования проникновения вируса иммунодефицита человека |
| CL2008000707A1 (es) * | 2007-03-13 | 2008-09-22 | Hoffmann La Roche | Conjugado de polipeptidos antifusogenicos y polipeptidos derivados de la cabeza globular del factor del complemento c1q; composicion farmaceutica que lo comprende; su uso para tratar infecciones viricas; y metodo de produccion. |
| AR067584A1 (es) * | 2007-07-20 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos |
-
2011
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Patent Citations (2)
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| WO2000052034A2 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| WO2002058638A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | The General Hospital Corporation | Serpin drugs for treatment of hiv infection and method of use thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANDREAS J. SCHULZE ET AL.: "Evidence for the Extent of Insertion of the Active Site Loop of Intact α1 Proteinase Inhibitor in β-Sheet A", 《BIOCHEMISTRY》 * |
| 史卫国 等: "HIV-1 融合抑制剂研究现状及发展趋势", 《药学学报》 * |
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