CN101291956A - 肽-免疫球蛋白缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肽-免疫球蛋白缀合物,其中免疫球蛋白多肽链的末端中至少有两个与肽缀合,由此所述肽可以是不同的、相似的或者相同的。该缀合在核酸水平上实现。
Description
技术领域
本发明涉及肽-免疫球蛋白缀合物(peptide-immunoglobulin-conjugate),其中两个或者两个以上的肽被分别缀合到免疫球蛋白的轻链或重链的一个末端。这些肽在氨基酸水平上可以是不同的、相似的或者相同的。与肽缀合的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白(not functionable immunoglobulin)。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)对细胞的感染通过病毒膜与将被感染的细胞的细胞膜融合的过程而实现。对于此过程提出了一个一般性的模式:病毒包膜糖蛋白复合物(gp120/gp41)与位于将被感染的细胞的细胞膜上的细胞表面受体相互作用。gp120与例如CD4受体以及诸如CCR-5或CXCR-4的共受体相结合,引起gp120/gp41复合物的构象的改变。这种构象改变的结果是gp41蛋白能够插入到靶细胞的膜中。这种插入是膜融合过程的开始。
已知由于天然发生的多态性,不同HIV株之间的gp41蛋白的氨基酸序列不同。但是可以识别出相同的结构域构造,确切地,从N端到C端的方向为融合信号、两个七肽重复序列结构域(HR1,HR2)和跨膜结构域。据称该融合(fusion或fusogenic)结构域参与了插入细胞膜和细胞膜的解体。该HR区由多段包括7个氨基酸(七肽)的序列构成(例如参见Shu,W.,et al.,Biochemistry 38(1999)5378-5385)。除了七肽,还有一个或多个类亮氨酸拉链基序。这个组成解释了gp41蛋白以及同样地衍生自这些结构域的肽的卷曲螺旋结构的形成。卷曲螺旋通常是由两个或两个以上相互作用的螺旋组成的寡聚物。
具有自gp41的HR1或HR2结构域推导的氨基酸序列的肽在体外和体内是细胞摄取HIV的有效抑制剂(例如参见如US 5,464,933、US 5,656,480、US 6,258,782、US 6,348,568或US 6,656,906中所述的肽)。例如,T20(也称为DP178,,一种HR2肽)和T651(US 6,479,055)是非常有效的HIV感染的抑制剂。
采用例如氨基酸替代或化学交联的方法,已经尝试增强HR2衍生肽的效力(Sia,S.K.等,PNAS USA 99(2002)14664-14669;Otaka,A.等Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。
肽缀合到某些分子上可以改变其药物代谢动力学性质,例如可以提高这种肽缀合物的血清半衰期。报道的缀合物例如为:PEG化的白细胞介素6(EP 0442724)、PEG化的促红细胞生成素(WO 01/02017)、包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)、基于分泌抗体的融合蛋白(US 2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991、人血清白蛋白US 5,876,969)、PEG化的多肽(US 2005/0114037)和干扰素融合物。
这些方法的目的是融合例如多肽和免疫球蛋白以便组合免疫球蛋白的抗原决定特性和多肽的生物活性。因此缀合物的免疫球蛋白部分展示靶向功能,并且多肽部分提供生物活性。例如已经报道:包括白树毒素和抗体的免疫毒素(WO 94/26910)、修饰的转铁蛋白-抗体融合蛋白(US2003/0226155)、抗体-细胞因子融合蛋白(US 2003/0049227)和由具有免疫刺激的、膜转运的或同嗜性的活性的肽和抗体组成的融合蛋白(US2003/0103984)。
在WO 2004/085505中报道了由化学连接到大分子上的生物活性化合物组成的长效的生物活性缀合物。
发明内容
本发明的目的是提供肽-免疫球蛋白缀合物,其中多于一个的肽缀合到所述的免疫球蛋白上。
本发明包括肽-免疫球蛋白缀合物,其中该免疫球蛋白由两个重链或两个重链和两个轻链组成,其中该免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白,其中通过肽键将免疫球蛋白链的羧基末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上,或者将肽的羧基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氨基酸上,并且其中该缀合物具有下述的通式:
免疫球蛋白-[肽]n
其中n是从2至8的整数。
在一个实施方案中,该肽是生物活性肽。
在另一个实施方案中,该肽由肽接头和生物活性肽组成。
在一个实施方案中,缀合物的肽的氨基酸序列彼此间具有90%或者更高的同一性。
在另外一个实施方案中,该免疫球蛋白或者是G类免疫球蛋白(IgG)或者是E类免疫球蛋白(IgE)。
在另一个实施方案中,该生物活性多肽是抗融合(antifusogenic)肽。
在再一实施方案中,该非功能性的免疫球蛋白是以10-5mol/l或者更高的KD值结合人抗原的免疫球蛋白。
在再一实施方案中,该非功能性的免疫球蛋白是如下的免疫球蛋白:a)其重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的部分或者全部,或者b)其重链和/或轻链无可变区,或者c)其对人抗原具有10-5mol/l或者更高的结合亲和性,或者d)其对人抗原具有10-5mol/l或者更高的结合亲和性,并且对非人类抗原具有10-7mol/l或者更低的结合亲和性。
本发明进一步包括用于制备本发明的缀合物的方法,由此该方法包括在适于表达该缀合物的条件下培养含有包含一个或者多个编码本发明的缀合物的核酸分子的一种或者多种表达载体的细胞,以及从细胞或者培养基中回收该缀合物。
本发明还包括含有本发明的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
本发明进一步包括本发明的缀合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。
在一个实施方案中,该病毒感染是HIV感染。
本发明还包括使用本发明的缀合物治疗需要抗病毒治疗的患者的方法。
发明详述
本发明包括肽-免疫球蛋白缀合物,其中该免疫球蛋白由两个重链或者两个重链和两个轻链组成,其中该免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白,其中肽键将免疫球蛋白链的羧基末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上,或者将肽的羧基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氨基酸上,并且其中该缀合物具有下述的通式,其中该[肽]部分在此通式中的位置不表示该肽连接到免疫球蛋白上的缀合位置,即,氨基酸位置,
免疫球蛋白-[肽]n
其中n是从2至8的整数。
在本发明的范围中,一些使用的术语具有如下定义:
“基因”指表达肽、多肽或者蛋白质所必需的,例如在染色体上或者在质粒上的片段。除编码区之外,基因还含有其他功能性元件,包括启动子、内含子和终止子。
“结构基因”指不带信号序列的基因编码区。
“抗融合肽”是抑制与膜融合相关的事件或者膜融合事件本身的肽,包括例如,抑制由膜融合导致的、病毒对未感染细胞的感染。这些抗融合肽优选是线性肽。例如,其可以衍生自gp41的胞外域,例如,DP107或DP178。这些肽的实例可以见于US 5,464,933、US 5,656,480、US 6,013,263、US6,017,536、US 6,020,459、US 6,093,794、US 6,060,065、US 6,258,782、US6,348,568、US 6,479,055、US 6,656,906、WO 1996/19495、WO 1996/40191、WO 1999/59615、WO 2000/69902和WO 2005/067960。例如,这些肽的氨基酸序列包含或者可以选择自US 5,464,933的SEQ ID NO:1至10;US5,656,480的SEQ ID NO:1至15;US 6,013,263的SEQ ID NO:1至10和16至83的群体;US 6,017,536的SEQ ID NO:1至10,20至83和139至149;US 6,093,794的SEQ ID NO:1至10,17至83和210至214;US6,060,065的SEQ ID NO:1至10,16至83和210至211;US 6,258,782的SEQ ID NO:1286和1310;US 6,348,568的SEQ ID NO:1129,1278-1309,1311和1433;US 6,479,055的SEQ ID NO:1至10和210至238;US6,656,906的SEQ ID NO:1至171,173至216,218至219,222至228,231,233至366,372至398,400至456,458至498,500至570,572至620,622至651,653至736,739至785,787至811,813至815,816至823,825,827至863,865至875,877至883,885,887至890,892至981,986至999,1001至1003,1006至1018,1022至1024,1026至1028,1030至1032,1037至1076,1078至1079,1082至1117,1120至1176,1179至1213,1218至1223,1227至1237,1244至1245,1256至1268,1271至1275,1277,1345至1348,1350至1362,1364,1366,1368,1370,1372,1374至1376,1378至1379,1381至1385,1412至1417,1421至1426,1428至1430,1432,1439至1542,1670至1682,1684至1709,1712至1719,1721至1753,1755至1757,或者WO2005/067960的SEQ ID NO:5至95。抗融合肽具有由5至100个氨基酸,优选地10至75个氨基酸,并且更优选地15至50个氨基酸组成的氨基酸序列。
本文使用的术语“生物活性分子”指有机分子,例如诸如肽、蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成的多肽或者蛋白质的生物大分子,当施用于人工生物系统诸如使用细胞系和病毒的生物试验中时,或者当体内给予动物包括但不限于鸟类和包括人类在内的哺乳动物时,生物活性分子引起生物效应。该生物效应可以是,但不限于酶的抑制、激活或者别构修饰、受体的结合(在结合位点或者在周围)、受体的阻断或激活或者信号的触发。
“表达载体”是编码待在宿主细胞中表达的蛋白质的核酸分子。典型地,表达载体包括原核质粒扩增单位,例如对于大肠杆菌,包括复制起点,以及选择标记、真核选择标记,以及一个或多个用于表达目的基因的表达盒,每个表达盒包括启动子、结构基因和转录终止子,包括多聚腺苷酸化信号。基因表达通常被置于启动子的控制下,并且这样的核酸被称为“可操作地连接”(operably linked)在启动子上。相似地,如果调控元件调节核心启动子的活性,则该调控元件与核心启动子可操作地连接。
“多顺反子转录单位”是其中有多于一个的结构基因处于相同的启动子控制下的转录单位。
“分离的肽”是基本上没有污染性细胞组分的多肽,该细胞组分例如是碳水化合物、脂类或者天然与该肽相关的其他的蛋白质杂质。典型地,分离的肽的制品含有高度纯化形式的肽,即至少大约80%的纯度,至少大约90%的纯度,至少大约95%的纯度,大于95%的纯度或者大于99%的纯度。一种证实某蛋白制品含有分离的肽的方法是在该蛋白制品经过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色凝胶后出现单一的条带。然而,术语“分离的”不排除存在相同肽的可选物理形式诸如二聚体或者糖基化或者衍生化的形式。
如本文使用的,术语“免疫球蛋白”指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质和其衍生物或者片段。组成免疫球蛋白的不同的多肽基于其重量被称为轻链和重链。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在。每个重链和轻链都包含可变结构域(区)(通常是该多肽链的氨基端部分)。免疫球蛋白的轻链或者重链的可变结构域包含不同的片段,即4个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。每个重链和轻链多肽链都包括恒定区(通常为该多肽链的羧基端部分)。重链的恒定结构域/区介导抗体结合至i)携带Fc-γ受体(FcγR)的细胞,例如吞噬细胞,或者ii)携带新生儿Fc受体(FcRn),也称为Brambell受体的细胞。其还介导与一些因子,包括诸如组分(C1q)的经典补体系统的因子,的结合。
根据本发明的免疫球蛋白包括至少两个重链多肽。任选地,两个轻链多肽可以存在。根据本发明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。
本发明中使用的术语“非功能性的免疫球蛋白”指以如下KD值结合人抗原的免疫球蛋白,所述KD值(结合亲和性)为10-5mol/l或者更高(例如10-3mol/l),优选KD值为10-4mol/l或者更高。用诸如表面等离子体共振技术()等标准的结合试验可以测定结合亲和性。不必将此结合亲和性看作一个确切的值,其仅仅是一个参考点。其用于确定和/或选择对人靶标/抗原显示出不具有免疫球蛋白典型的特异性靶结合并且因此无人类治疗活性的免疫球蛋白,即例如,非功能性的免疫球蛋白是不发生序列特异性抗原/表位结合的免疫球蛋白。同时,例如基于离子相互作用的非特异性相互作用,完全可能存在。这不排除该免疫球蛋白显示出对非人类靶标/抗原的特异性靶结合。此非人抗原的特异靶结合与10-7mol/l或更低的(例如10-10mol/l)KD值相关,优选与10-8mol/l或更低的KD值相关。
用于本申请的术语“接头”或者“肽接头”指天然和/或合成来源的肽接头。其由线性氨基酸链构成,其中20种天然存在的氨基酸是单体构件。该链具有1至50个氨基酸的长度,优选介于3和25个氨基酸之间的长度。接头可以包含重复的氨基酸序列或者天然多肽的序列,例如具有铰链功能的多肽。接头具有通过允许缀合到免疫球蛋白上的肽正确折叠并且恰当呈现从而确保其能够实施其生物学活性的功能。
优选的接头是被设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成的肽接头”。这些残基以例如最多5个氨基酸的小的重复单元的方式排列,例如GGGGS,QQQQG或SSSSG。这种小的重复单元可以重复二至五次以形成多聚体单元。在该多聚体单元的氨基末端和/或羧基末端可以添加最多六个额外的任意天然氨基酸。其他合成的肽接头由重复次数在10至20次之间的单一氨基酸组成,例如在接头SSSSSSSSSSSSSSS中的丝氨酸。在氨基末端和/或羧基末端各可以存在最多六个额外的任意天然氨基酸。
本申请中使用的术语“氨基酸”指天然的羧基α-氨基酸,其包括丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸、(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
本领域技术人员已知的、可用于实施本发明的方法和技术公开在例如Ausubel,F.M.编辑的Current Protocols in Molecular Biology,Volumes Ito III(1997),Wiley和Sons;Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
本发明包括免疫球蛋白缀合物,其中该免疫球蛋白的末端中的至少两个与肽缀合。免疫球蛋白被划分为五种不同的类别:IgA(A类免疫球蛋白)、IgD、IgE、IgG和IgM。在这些类别之间,免疫球蛋白在其整体结构上不同。可以发现构件上的相似性。所有的免疫球蛋白由成对的多肽链构成,该对包含所谓的免疫球蛋白轻链多肽(简称:轻链)和所谓的免疫球蛋白重链多肽(简称:重链)。IgG类的免疫球蛋白的共同结构在图1中显示。
在诸如免疫球蛋白等由不同的亚基组成的复杂蛋白质中,由于模块化的结构而可获得多于一个的氨基端和多于一个的羧基端。例如,G类或者E类免疫球蛋白,各拥有两对的重链和轻链。由于这种组成,在这些免疫球蛋白中,即在一个免疫球蛋白分子中,存在4个氨基端和4个羧基端。这允许最多8个肽缀合到一个IgG或IgE上,即,氨基端(N端)和羧基端(C端)的数目总和。
本发明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。即使其结合人类抗原,由于缺乏针对人类抗原的功能性可变结构域,而将具有10-5mol/l或更高的KD值。这不排除非人类抗原以10-7mol/l或更低的KD值被特异地结合。
免疫球蛋白提供一个支架,肽通过遗传学方式与其连接。因此,具有非功能性可变结构域或者缺少一个或者多个可变结构域区域的全部或者部分并因此不具有任何抗原结合能力的免疫球蛋白也可以作为非功能性的免疫球蛋白而用于本发明。
在免疫球蛋白链的末端引入的肽与整个的免疫球蛋白相比较,其大小是小的。例如,最小的免疫球蛋白,即,G类免疫球蛋白,具有大约150kDa的分子量;修饰物具有小于12.5kDa的大小,等价于大约100个氨基酸,通常小于7.5kDa,等价于大约60个氨基酸。
通过分子生物学技术在核酸水平上将肽引入免疫球蛋白。
缀合到免疫球蛋白上的肽具有5至100个氨基酸残基的氨基酸序列,优选具有10至75个氨基酸残基,更优选具有15至50个氨基酸残基。缀合到免疫球蛋白的多肽可以选自生物活性分子/肽。当将这些分子施用于人工生物系统、活细胞或者诸如鸟类或包括人类的哺乳动物的活的生物体时,其引起生物学效应。这些生物活性化合物包括,但不限于酶、受体、免疫球蛋白等等的激动剂以及拮抗剂、表现细胞毒性的、抗病毒的、抗细菌的或者抗癌的活性的靶向试剂以及抗原。优选的生物活性肽选自抗融合肽。本发明的免疫球蛋白缀合物可以用于制药、治疗或者诊断应用。
生物活性肽可以选自但不限于例如hedgehog蛋白、骨形成蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素、蛋白质激素、抗病毒肽、抗融合肽、抗血管生成肽及细胞毒素肽等等。
当多于一个的肽与免疫球蛋白末端缀合时,存在不同的分布。可以缀合到免疫球蛋白上的肽的数目从一个至免疫球蛋白多肽链的氨基和羧基末端的总数。
如果单一个肽缀合到免疫球蛋白上,该肽可以占据免疫球蛋白的任何一个末端。同样的,如果最大可能数目的肽缀合到免疫球蛋白上,则所有的末端都将被单一一个肽占据。如果缀合到免疫球蛋白上的肽的数目大于一但是小于最大可能数目,肽在免疫球蛋白末端可以有不同的分布。
例如,如果四个肽缀合到G或者E类免疫球蛋白上,可以存在五种不同的组合(参见表1)。在两个组合中,属于一个类型的所有末端(即免疫球蛋白链的所有的四个氨基末端或者所有的四个羧基末端)每个各缀合一个肽。其他末端则没有被缀合。这导致将修饰/缀合分配到免疫球蛋白的一个区域中的一种实施方案。在其他情况中,多肽缀合到多个两种不同的末端上。在这些组合中,缀合的肽被分配到免疫球蛋白的不同区域。在任一种情况中,发生缀合的末端的总数是4。
表1:四个肽缀合到由四个多肽链组成的免疫球蛋白的末端的可能组合
被占据的氨基末端的数目 | 被占据的羧基末端的数目 | 被占据的末端的总数目 |
4 | 0 | 4 |
3 | 1 | 4 |
2 | 2 | 4 |
1 | 3 | 4 |
0 | 4 | 4 |
本发明包括其中至少两个末端缀合有肽的免疫球蛋白。该缀合的肽本身不衍生自免疫球蛋白。缀合的肽的氨基酸序列可以是不同的、相似的或者相同的。通常,氨基酸序列是不同的,即具有小于90%的氨基酸同一性。在一个实施方案中,氨基酸序列的同一性为90%至小于100%;这些氨基酸序列以及相应的肽被定义为是相似的。在另一个实施方案中,肽具有100%的氨基酸序列同一性,这使得它们是相同的。
尽管缀合的肽可以显示一定程度的同源性或者同一性,但是它们还可以具有不同的氨基酸序列总长。
肽和免疫球蛋白之间的缀合在核酸水平上实施。因此两个氨基酸之间的肽键使该肽和该免疫球蛋白缀合在一起。因此或者是肽的羧基末端的氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端的氨基酸上,或者是免疫球蛋白链的羧基末端的氨基酸缀合到肽的氨基末端的氨基酸上。
本发明的肽-免疫球蛋白缀合物的再一特征是可以由一个或者多个核酸分子,优选地由两个至八个核酸分子编码完整的缀合物。这使得免疫球蛋白缀合物能够重组产生。
对于本发明的肽-免疫球蛋白缀合物的重组制备,需要两个或者两个以上编码不同多肽的核酸分子,优选需要两个至八个核酸分子。这些核酸分子编码缀合物的不同的免疫球蛋白多肽链,并且在下文中被称为结构基因。它们可以是同一个表达盒中的部分或者可以位于不同的表达盒中。缀合物的组装优选在其分泌之前并因此在表达细胞中发生。因此,优选编码缀合物的多肽链的核酸分子在相同的宿主细胞中表达。
通常而言,对于未缀合的免疫球蛋白的制备,需要两个结构基因,一个编码轻链以及另一个编码重链。对于肽-免疫球蛋白缀合物的制备,需要另外的编码缀合的免疫球蛋白轻链和/或重链的结构基因。图12中显示一个示例,其中显示了一个免疫球蛋白和两个不同的肽的所有肽-免疫球蛋白缀合物。
本发明的由缀合相同的肽的两个重链组成的免疫球蛋白,由一个或者两个结构基因编码。在两个肽都缀合到重链的相同末端氨基酸上时,使用一个结构基因。在一个肽缀合到第一重链的氨基末端的氨基酸上而且另一个肽缀合到第二重链的羧基末端的氨基酸上时,使用两个结构基因。
再一示例是这样的缀合物,其中轻链的两个氨基末端缀合了不同或相似的肽。在这种情况中,不得不使用三个结构基因(图11)。一个结构基因编码未缀合的重链(结构基因2),一个结构基因编码缀合肽1的第一轻链(结构基因1),以及一个结构基因编码缀合肽2的第二轻链(结构基因3)。对于这些结构基因,可以设计位于一个或者多个表达载体(质粒)上的一个或者多个表达盒。当在前述实例中缀合的肽是相同的时,仅仅需要两个结构基因,即一个编码未缀合的重链和另一个编码氨基端发生缀合的轻链(参见图11:结构基因1和3是相同的)。优选该肽-免疫球蛋白缀合物的所有三个构件在相同的细胞中表达。假设免疫球蛋白链进行统计学组装,可以实现四种不同的免疫球蛋白缀合物。在这些中,免疫球蛋白2和免疫球蛋白2a是相同的,并且因此三种不同的免疫球蛋白缀合物被分泌到培养基中。如果所有三个结构基因以化学计量方式表达,则免疫球蛋白1、免疫球蛋白2和免疫球蛋白3之间的比例是1∶2∶1。通过增强或者降低这些结构基因中的一个或者多个的表达,可以使所组装的缀合物的比例向优选的缀合物(1、2或者3)移动。方法是本领域技术人员已知的,例如使用具有不同的启动子强度的启动子。在肽相同的情况中,仅仅有一种免疫球蛋白缀合物形成并且分泌到培养基中。
可以通过本领域技术人员已知的方法分离和纯化获得的免疫球蛋白缀合物的混合物。这些方法已经良好建立并广泛应用于免疫球蛋白纯化,并且这些方法可以单独使用或者联合使用。这些方法例如有使用微生物衍生的蛋白的亲和层析法(例如蛋白A或者蛋白G亲和层析)、离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换层析)、亲硫吸附(例如使用β巯基乙醇和其它的SH配体)、疏水相互作用或者芳族基因吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖、aza-arenophilic树脂或者间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、分子大小排阻层析和制备型电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
图13和14显示不同的缀合物,其可以通过使用缀合到轻链的氨基末端的第一肽以及缀合到重链的羧基末端的第二肽获得。在这种情况中,从四种不同的结构基因开始可以产生十种不同的免疫球蛋白缀合物。
与未缀合的肽相比较,肽-免疫球蛋白缀合物显示出改进的药物动力学特性,例如半衰期(即最初量的肽的一半从血流中被清除掉和/或代谢掉所需要的时间)。同时,因为缀合的肽通过其缀合的免疫球蛋白被呈递和固定在彼此邻近的区域,故使用本发明的肽-免疫球蛋白缀合物可以增加缀合的肽的局部浓度。也可以提供缀合到相同的免疫球蛋白上的多于一种(即两种或者两种以上)的不同的肽。
之前概述的本发明的免疫球蛋白缀合物的特性取决于缀合的肽的生物活性。因此该肽必需采取其天然的三维结构以便能够与其靶标相互作用,并且该肽应该以恰当的方式呈现并不受限制地被接近。为了防止空间干扰,缀合的肽可以由肽接头和生物活性肽组成(关于肽接头参见表2)。
表2肽接头
接头编号 | 接头的核苷酸或者氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
1 | [Ser(Gly)4]3 | 01 |
2 | [Ser(Gly)4]5 | 02 |
3 | [Gly(Gln)4]3Gly | 03 |
4 | [Gly(Gln)4]3 | 04 |
5 | Gly(Ser)15Gly | 05 |
6 | GST | 06 |
7 | [(Gly)4Ser]3-Gly-Ala-Ser | 07 |
8 | Gly(Ser)15-Gly-Ala-Ser | 08 |
9 | [(Gly)4Ser]3-Gly | 09 |
10 | [(Gly)4Ser]5-Gly | 10 |
11 | [(Gly)4Ser]3-Gly2 | 11 |
12 | [(Gly)4Ser]5-Gly2 | 12 |
13 | agatcttttgccaccgctagc | 13 |
14 | aagcttgtccccgggcaaatgagtgctagc | 14 |
15 | agatctatatatatatatgctagc | 15 |
16 | ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePhe | 16 |
17 | aagcttcaacaggggagagtgttgaagggagaggcgcc | 17 |
所有的肽接头可以由核酸分子编码并因此可以重组表达。由于接头本身是肽,生物活性肽通过在两个氨基酸之间形成的肽键而与接头连接。肽接头被引入到生物活性肽和生物活性肽待缀合的免疫球蛋白链之间。因此从氨基末端到羧基末端的方向上而言存在不同的可能序列:a)生物活性肽-肽接头-免疫球蛋白多肽链,或者b)免疫球蛋白多肽链-肽接头-生物活性肽,或者c)生物活性肽-肽接头-免疫球蛋白多肽链-肽接头-生物活性肽,其中该生物活性肽可以是相同的或者不同的,并且其中该肽接头可以存在或者不存在,即在C端至N端的方向上可能的序列包括:d)生物活性肽-免疫球蛋白多肽链,或e)免疫球蛋白多肽链-生物活性肽,或者f)生物活性肽-免疫球蛋白多肽链-生物活性肽。
使用本领域技术人员已知的重组工程方法,免疫球蛋白缀合物可以在核酸/基因水平上进行特制。编码免疫球蛋白的核酸序列是已知的并且可以例如从基因组数据库中获得。同样地,生物活性肽的核酸序列也是已知的或者可以容易地根据编码生物活性肽的氨基酸序列的氨基酸的核苷酸三联体密码而从其氨基酸序列推导出。
用于表达本发明的缀合物的表达载体(质粒),其构建所需要的元件为天然的和/或修饰的和/或缀合形式的免疫球蛋白轻链的表达盒、天然的和/或修饰的和/或缀合形式的免疫球蛋白重链的表达盒、选择标记、大肠杆菌(E.coli.)复制以及选择单元。这些表达盒包括启动子、结构基因、编码分泌信号序列的DNA片段和终止子。这些元件以可操作连接的方式组装在一个编码免疫球蛋白缀合物的所有链的表达载体(质粒)上,或者组装在两个或者两个以上分别编码免疫球蛋白缀合物的一个或者多个链的表达载体(质粒)上。
为了表达编码的多肽,将表达载体(质粒)导入合适的宿主细胞。优选在诸如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞等的哺乳动物细胞中制备蛋白。载体的调控元件必须按其在选定的宿主细胞中可以发挥功能的方式来选择。
为了表达,可以将含有编码免疫球蛋白缀合物的一个或多个链的(一种或多种)载体(质粒)的宿主细胞,培养在适于表达该链的条件下。所表达的免疫球蛋白链进行功能性组装。完全加工后的肽-免疫球蛋白缀合物分泌到培养基中。
缀合物的免疫球蛋白部分提供肽附着的支架。该免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白,即其以10-5mol/l或更高的(例如10-3mol/l)KD值(结合亲和性)结合人类抗原。属于此定义的免疫球蛋白例如是重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白、重链和/或轻链没有可变结构域(区)的免疫球蛋白、对于非人类抗原具有10-7mol/l或者更低的(例如10-10mol/l)KD值的免疫球蛋白。
提供下述实施例、序列表和附图用于帮助理解本发明,本发明的真正保护范围由后附权利要求说明。可以理解在不偏离本发明的精神的情况下,可以对列出的方法进行修改。
附图说明
图1:IgG类免疫球蛋白的共同结构。
图2:抗IGF-1Rγ1重链表达载体4818的质粒图谱。
图3:抗IGF-1Rκ轻链表达载体4802的质粒图谱。
图4:γ1重链恒定区基因载体4962的质粒图谱。
图5:修饰的抗IGF-1Rγ1重链表达载体4961的质粒图谱。
图6:修饰的抗IGF-1Rκ轻链表达载体4964的质粒图谱。
图7:修饰的抗IGF-1R轻链表达载体4963的质粒图谱。
图8:亲和纯化的免疫球蛋白缀合物的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色图;根据表6进行样品排列。
图9:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达之后对细胞培养物上清液中的轻链的免疫检测;根据表6进行样品排列。
图10:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达之后对细胞培养物上清液中的重链的免疫检测;根据表6进行样品排列。
图11:轻链的两个氨基末端缀合了不同或者相似的肽的肽-免疫球蛋白缀合物。
图12:由一个免疫球蛋白和两个不同的肽组成的肽-免疫球蛋白缀合物。
图13和14:第一肽缀合到免疫球蛋白的轻链的氨基末端,并且第二肽缀合到免疫球蛋白的重链的羧基末端的肽-免疫球蛋白缀合物。
实施例
材料和方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242中给出。
根据EU编号对抗体链的氨基酸进行编号(Edelman,G.M.等,PNAS 63(1969)78-85;Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242。
重组DNA技术
使用如Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的标准方法操作DNA。根据厂商的说明使用分子生物学试剂。
蛋白质测定
使用在氨基酸序列的基础上计算的摩尔消光系数,通过在280nm测定光密度(OD)而确定肽-免疫球蛋白缀合物的蛋白质浓度。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried,德国)上实施的双链测序而测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
使用10.2版本的GCG’s(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)软件包和8.0版本的Infomax’s Vector NTI Advance suit进行序列的创建、作图、分析、注解和说明。
基因合成
通过Medigenomix GmbH(Martinsried,德国)从化学合成的寡核苷酸制备需要的基因片段。边侧带有限制性内切酶单酶切位点的100-600bp长度的基因片段通过寡核苷酸退火和连接,包括PCR扩增而组装,并且随后通过A突出端克隆入pCR2.1-TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)。通过DNA测序对亚克隆的基因片段的DNA序列进行确认。
免疫球蛋白缀合物的亲和纯化
根据已知的方法使用蛋白A-SepharoseTM CL-4B(AmershamBioscience)通过亲和层析纯化已表达和分泌的肽-免疫球蛋白缀合物。简而言之,离心(10,000x g,10分钟)和通过0.45μm滤器过滤后,含有免疫球蛋白缀合物的澄清的培养物上清液施加到用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的蛋白A-SepharoseTM CL-4B柱上。使用PBS平衡缓冲液和pH 5.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液洗去未结合的蛋白质。使用pH 3.0的0.1M的柠檬酸盐缓冲液洗脱免疫球蛋白缀合物,并且使用1M Tris碱中和含有免疫球蛋白缀合物的级分。然后,4℃,免疫球蛋白缀合物在PBS缓冲液中进行充分透析,使用配备有Biomax-SK膜(Millipore)的ultrafree离心过滤装置进行浓缩,然后储存在0℃的冰水浴中。
实施例1
制备表达质粒
连接编码胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抗体(在下文也称为抗IGF-1R或IR)轻链可变区(VL)和人κ轻链恒定区(CL)(序列参见US 2005/0008642)的基因片段,对编码抗IGF-1R重链可变区(VH)和人γ1重链恒定区(CH1-铰链区-CH2-CH3)的基因片段也进行连接。
a)载体4818
载体4818是用于在HEK293EBNA细胞中瞬时表达抗IGF-1R抗体重链(以基因组方式组织的表达盒;外显子-内含子的组织方式)的表达质粒,其包括下述功能元件:
除了抗IGF-1Rγ1重链表达盒之外,此载体还含有:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,
-来自pUC18载体的复制起点,其允许本质粒在大肠杆菌中复制,和
-赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗IGF-1Rγ1重链基因的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子,
-合成的5’-非翻译区(UT),
-包括信号序列内含子(信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2])的鼠免疫球蛋白重链信号序列;
-克隆的抗IGF-1R可变重链编码片段,在5’末端(L2信号序列)安排有BsmI限制性内切酶单酶切位点,以及在3’末端安排有剪切供体位点和NotI限制性内切酶单酶切位点,
-包括小鼠重链增强子元件(部分JH3,JH4)的小鼠/人重链杂合内含子2(Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378),
-基因组人γ1重链基因恒定区,
-人γ1免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列,和
-分别在5’-和3’-末端的AscI和SgrAI限制性内切酶单酶切位点。
图2显示抗IGF-1Rγ1重链表达载体4818的质粒图谱。
b)载体4802
载体4802是用于在HEK293EBNA细胞中瞬时表达抗IGF-1R抗体轻链(cDNA)的表达质粒,其包括下述功能元件:
除了抗IGF-1R κ轻链表达盒之外,此载体还含有:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,
-来自pUC18载体的复制起点,其允许本质粒在大肠杆菌中复制,和
-赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗IGF-1Rκ轻链基因的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子,
-克隆的抗IGF-1R可变轻链cDNA,包括
-天然5’-UT,和
-在5’-末端安排有BglII限制性内切酶单酶切位点的人免疫球蛋白种系基因的天然轻链信号序列,
-人κ轻链基因恒定区,
-人免疫球蛋白κ多聚腺苷酸化信号(“poly A”)序列,
-分别在5’-和3’-末端的AscI和FseI限制性内切酶单酶切位点。
图3显示了抗IGF-1Rκ轻链表达载体4802的质粒图谱。
c)质粒4962
载体4962作为用于组装表达质粒4965、4966和4967的基础结构。这些质粒使得修饰的抗体重链(没有可变结构域的N末端缀合,cDNA组织方式)能够在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达。质粒4962包括下述功能元件:
除了γ1重链恒定区的表达盒之外,本载体还含有:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,
-来自pUC18载体的复制起点,其允许本质粒在大肠杆菌中复制,
-赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
γ1重链恒定区基因(CH1-铰链区-CH2-CH3)的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子,
-包括在5’末端的BglII限制性内切酶单酶切位点和在3’末端的NheI限制性内切酶单酶切位点(NheI位点在CH1 N末端内)的合成接头(SEQID NO:13),
HCMV-启动子 AlaSer(CH1)
...agatcttttgccaccgctagc...
BglII NheI
-人γ1重链基因恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3,cDNA组织方式),
-人γ1免疫球蛋白多聚腺苷酸化信号(“poly A”)序列,
-分别在5’-和3’-末端的AscI和FseI限制性内切酶单酶切位点。
γ1重链恒定区基因载体4962的质粒图谱在图4中显示。
d)质粒4961
载体4961作为用于组装表达质粒4970至4975的基础结构。这些质粒使得修饰的抗体重链(C末端缀合)可以在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达。
基础载体4961是用于在HEK293EBNA细胞中瞬时表达抗IGF-1R抗体重链(以基因组方式组织的表达盒)的表达质粒。其包括下述功能元件:
除了抗IGF-1Rγ1重链的表达盒之外,本载体还含有:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP,
-来自pUC18载体的复制起点,其允许本质粒在大肠杆菌中复制,
-赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗IGF-1Rγ1重链基因的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子,
-合成的5’-UT,
-包括信号序列内含子(L1、内含子、L2)的鼠免疫球蛋白重链信号序列;
-克隆的抗IGF-1R可变重链编码片段,在5’末端(L2信号序列)安排有BsmI限制性内切酶单酶切位点,以及在3’末端安排有剪切供体位点和的NotI限制性内切酶单酶切位点,
-包括小鼠重链增强子元件(部分JH3,JH4)的小鼠/人重链杂合内含子2(Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378),
-基因组人γ1重链基因恒定区和轻微修饰的CH3-IgG1多聚腺苷酸化(pA)连接区(SEQ ID NO:14,插入HindIII和NheI限制性内切酶单酶切位点)
CH3 IgG1 pA
...ctaagcttgtccccgggcaaaTGAgtgctagcgccggcaagcc...
...LeuSerLeuSerProGlyLys
HindIII NheI
-人γ1免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列,
-分别在5’-和3’-末端的AscI和FseI限制性内切酶单酶切位点
图5显示修饰的抗IGF-1Rγ1重链表达载体4961的质粒图谱。
e)质粒4964
载体4964作为组装表达质粒4976和4977的基础结构。这些质粒使得修饰的抗IGF-1R抗体轻链(N末端缀合)能够在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达。
质粒4964是表达质粒4802的变体。
抗IGF-1Rκ-轻链基因的转录单位如下所示进行修饰:
天然的轻链信号序列由5’末端安有BglII限制性内切酶单酶切位点、3’末端安有NheI限制性内切酶单酶切位点的合成接头代替,该接头直接连接在VL区(SEQ ID NO:15)上。
|-VL-IGF-IR
...agatctatatatatatatgctagcgaaattgtgttgaca...
AlaSerGluIleValLeuThr...
BglII NheI
图6显示修饰的抗IGF-1Rκ轻链表达载体4964的质粒图谱。
f)质粒4969
表达质粒4968和4969衍生自抗IGF-1R抗体轻链的表达质粒4802。该质粒编码修饰的抗体轻链片段(没有可变区的N端缀合;多肽-接头-κ链的恒定区)。
为了构建质粒4968和4969,将BglII限制性内切酶单酶切位点引入CMV启动子的3’末端,并且将BbsI限制性内切酶单酶切位点引入到抗IGF-1R抗体轻链恒定区(SEQ ID NO:16)的内部。
|--C-κ BbsI
cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc...
ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePhe...
g)质粒4963
载体4963作为组装表达载体4978和4979的基础结构。这些质粒使得修饰的抗IGF-1R抗体轻链(C末端缀合)能够在HEK 293EBNA细胞中瞬时表达。
质粒4963是表达质粒4802的变体。
抗IGF-1Rκ轻链基因的转录单位如下进行修饰:
-在C-κ-Ig-κpA连结区对人κ轻链恒定区基因进行轻微修饰(插入HindIII和KasI限制性内切酶单酶切位点,SEQ ID NO:17)。
...C-κ Ig-κ-pA
...AaaagcttcaacaggggagagtgtTGAagggagaggcgccccca
...LysSerPheAsnArgGlyGluCys
HindIII KasI
图7显示修饰的抗IGF-1R轻链表达载体4963的质粒图谱。
实施例2
制备最终的表达质粒
使用已知的重组方法和技术,通过连接相应的核酸片段,已组装免疫球蛋白融合基因(重链和轻链),其包含免疫球蛋白基因片段、任选的接头基因片段和多肽基因片段。
编码肽接头和多肽的核酸序列分别通过化学合成方法合成,并且然后连接入大肠杆菌质粒。通过DNA测序对该亚克隆核酸序列进行验证。
所使用的免疫球蛋白多肽链(全长重链或轻链),或者,免疫球蛋白多肽链片段(抗体轻链或重链的恒定区)、多肽缀合的位置(N或C末端)、所使用的接头和所使用的多肽在表2(第3页)、表3和表3a中列出。
表3:所使用的蛋白质和多肽;氨基酸序列以及位置的编号如BH8参照株中的一样(Ratner,L.等,Nature 313(1985)277-284;基因座HIVH3BH8;来自法国的HIV-1分离株LAI/IIIB克隆BH8)
蛋白和多肽 | SEQ ID NO: |
HIV-1gp41(BH8gp 160的位置507-851) | 18 |
T-651(例如参见US 6,656,906) | 19 |
T-2635(例如参见WO 2004/029074) | 20 |
HIV-1gp41胞外域变体单点突变:I568P | 21 |
HIV-1gp41胞外域变体四点突变:I568P,L550E,L566E,I580E | 22 |
表3a:用于免疫球蛋白缀合物基因构建的化学制备的基因片段
插入片段 | SEQ ID NO: |
插入片段4964(引入限制性内切酶单酶切位点) | 23 |
插入片段4965(具有T-651) | 24 |
插入片段4966(具有T-651) | 25 |
插入片段4967(具有T-651) | 26 |
插入片段4968(具有T-2635) | 27 |
插入片段4969(gp41单点突变体) | 28 |
插入片段4970(具有T-651) | 29 |
插入片段4971(具有T-651) | 30 |
插入片段4972(具有T-2635) | 31 |
插入片段4973(具有T-2635) | 32 |
插入片段4974(具有T-2635) | 33 |
插入片段4975(gp41四点突变体) | 34 |
插入片段4978(具有T-651) | 35 |
插入片段4979(具有T-651) | 36 |
表4中列出了用于构建瞬时表达修饰的免疫球蛋白多肽轻链和重链(表达盒)的最终表达质粒的组分,以及对应的所使用的基础质粒、克隆位点、编码缀合的免疫球蛋白多肽的插入核酸序列。
表4:用于构建所使用的表达质粒的组分
表5中列出:使用的具有HIV-1抑制特性的多肽(T-651,T-2635和HIV-1gp41胞外域变体)、使用的用于连接免疫球蛋白轻链或重链与生物活性肽的肽接头、从编码的氨基酸序列推导出的推导的修饰抗体链的分子量。
表5:使用的多肽以及修饰的免疫球蛋白多肽链的推导的分子量的一览表
实施例3
在HEK293EBNA细胞中瞬时表达免疫球蛋白变体
通过瞬时转染在DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,Gibco)中贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293,美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852)而产生重组免疫球蛋白变体,该DMEM培养基补充有10%超低IgG的FCS(胎牛血清,Gibco),2mM谷氨酰胺(Gibco),1%体积比(v/v)的非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(Roche Molecular Biochemicals)。为了转染,使用转染试剂FugeneTM 6(Roche Molecular Biochemicals),使用比例为试剂(μl)与DNA(μg)的比为3∶1至6∶1。从两种不同的质粒表达免疫球蛋白的轻链和重链,使用的轻链与重链编码质粒的摩尔比从1∶2至2∶1。在转染后的第4至11天收集合有免疫球蛋白变体的细胞培养物上清液。纯化前将上清液储存在0℃的冰水浴中。
Meissner,P.等,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于例如在HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息。
实施例4
通过SDS PAGE、Western印迹转移和使用免疫球蛋白特异性抗体缀合物进行的检测,实施表达分析
通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)处理表达并分泌的肽-免疫球蛋白缀合物,并且将分离的免疫球蛋白缀合物链从凝胶转移至膜上,并随后通过免疫学方法进行检测。
SDS-PAGE
LDS样品缓冲液,四倍浓度(4x):4g甘油,0.682g Tris碱,0.666gTris-盐酸,0.8g LDS(十二烷基硫酸锂),0.006g EDTA(乙二胺四乙酸),0.75ml的1%重量比(w/w)Serva Blue G250水溶液,0.75ml的1%重量比(w/w)苯酚红溶液,补加水至总体积10ml。
离心含有分泌的肽-免疫球蛋白缀合物的培养液以除去细胞和细胞碎片。等分的澄清上清液与1/4体积(v/v)的4xLDS样品缓冲液以及1/10体积(v/v)的0.5M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后将样品在70℃孵育10min并通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据厂商的说明使用预制胶系统(Invitrogen)。具体地,使用10% Bis-Tris预制胶(pH 6.4)和MOPS电泳缓冲液。
Western印迹
转移缓冲液:39mM甘氨酸,48mM Tris-盐酸,0.04%重量比(w/w)SDS和20%体积比甲醇(v/v)。
SDS-PAGE电泳后,根据Burnette的Semidry-Blotting-Method方法,将分离的免疫球蛋白缀合物多肽链电泳转移到硝酸纤维素滤膜上(孔径大小:0.45μm)(Burnette,W.N.,Anal.Biochem.112(1981)195-203)。
免疫学检测
TBS缓冲液:50mM Tris-盐酸,150mM NaCl,调整至pH 7.5。
封闭溶液:TBS缓冲液中1%(w/v)的Western封闭试剂(RocheMolecular Biochemicals)。
TBST缓冲液:含有0.05%体积比(v/v)的Tween-20的1x TBS缓冲液。
为了进行免疫学检测,western印迹膜在室温TBS缓冲液中振荡孵育两次5分钟,以及在封闭溶液中振荡孵育一次90分钟。
免疫球蛋白缀合物多肽链的检测
重链:为了检测肽-免疫球蛋白缀合物的重链,使用纯化的缀合过氧化物酶的兔抗人IgG抗体(DAKO,Code No.P 0214)。
轻链:使用纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人κ轻链抗体(DAKO,Code No.P 0129)检测肽-免疫球蛋白缀合物的轻链。
为了可视化抗体轻链和重链,首先将洗涤和封闭后的Western印迹膜与1∶10,000稀释的、纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人IgG抗体(对于重链)或者纯化的缀合了过氧化物酶的兔抗人κ轻链抗体(对于轻链),在10ml封闭溶液中,在4℃振荡孵育过夜。室温使用TBTS缓冲液洗涤膜三次和用TBS缓冲液洗涤一次10分钟之后,使用可以产生化学发光的氨基苯二酰肼/过氧化物溶液(Lumi-LightPLUS Western Blotting底物,RocheMolecular Biochemicals)对Western-印迹膜进行显影。因此,在10ml氨基苯二酰肼/过氧化物溶液中孵育膜10秒至5分钟,然后使用Lumi-ImagerF1分析仪(Roche Molecular Biochemicals)检测发射的光和/或用X光片记录。
使用LumiAnalyst软件(3.1版本)定量斑点的强度。
免疫印迹的多重染色
通过将膜在含有100mM β-巯基乙醇和20%(w/v)SDS的1M Tris-盐酸缓冲液(pH 6.7)中70℃孵育1小时,可以从染色的印迹上除去用于检测的过氧化物酶标记的二抗偶联物。经过这个处理之后,该印迹可以用不同的二抗第二次进行染色。在第二次检测之前,印迹用TBS缓冲液室温振荡洗涤三次,每次10分钟。
表6a至6c列出样品的排列。
表6a:SDS PAGE凝胶/Western印迹-凝胶1的样品排列
表6b:SDS PAGE凝胶/Western印迹-凝胶2的样品排列
表6c:SDS PAGE凝胶/Western印迹-凝胶3的样品排列
实施例5
组装的免疫球蛋白缀合物的检测
通过亲和结合到蛋白A SepharoseTM CL-4B上纯化和浓缩免疫球蛋白缀合物多肽
含有一种或者多种质粒的HEK 293EBNA细胞在适于瞬时表达位于质粒上的免疫球蛋白多肽链结构基因的条件下培养6至10天。向1.8mlEppendorf管中1ml的澄清的培养物上清液,加入0.1ml蛋白A-SepharoseTM CL-4B(Amersham Biosciences)悬浮液(1∶1(v/v)的蛋白A-SepharoseTM在PBS缓冲液中的悬浮液,(PBS缓冲液为10mMNa2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4))。该悬浮液在室温振荡孵育1至16个小时。之后,通过离心沉淀Sepharose珠(30s,5000rpm)并且弃掉上清液。随后Sepharose沉淀物用1.6ml PBS缓冲液,1.6ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5.0和1.6ml蒸馏水分别洗涤。使用0.1ml 1xLDS-PAGE样品缓冲液在70℃从Sepharose珠上提取蛋白A结合的免疫球蛋白5至10min。如实施例4所描述的,通过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色进行分析。
结果:
瞬时表达后的重链和轻链的表达/分泌分析:
图8a-c:亲和纯化的免疫球蛋白缀合物的SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色,根据表6进行样品的排列。
免疫球蛋白多肽链的检测:
图9a-c:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达后免疫检测细胞培养物上清液中的轻链。
图10a-c:在HEK293EBNA细胞中瞬时表达后免疫检测细胞培养物上清液中的重链。
从图8a-c,9a-c和10a-c可以推导出免疫球蛋白轻链和重链瞬时表达并分泌到培养基中。在免疫球蛋白链含有一个或者几个糖基化位点的情况中,最终的肽-免疫球蛋白缀合物和相应地单个的免疫球蛋白缀合物链没有确切的分子量,而是具有取决于糖基化程度的一个分子量分布。这导致在SDS-PAGE上,代表一种免疫球蛋白缀合链的所有分子不一致地迁移,并因此使得条带被加宽。
由于免疫球蛋白与蛋白A的亲和结合仅仅是基于重链的Fc部分的相互作用,并且因为除了重链外在SDS-PAGE和考马斯染料染色后还检测到轻链,故可以作出免疫球蛋白缀合物已经正确组装并且由轻链和重链组成的结论。
实施例6
使用人IgG ELISA定量表达的重链
使用夹心ELISA测定在细胞培养物上清液中免疫球蛋白缀合物的重链多肽的浓度,该ELISA使用生物素酰化的抗人IgG F(ab’)2片段作为捕获试剂并使用过氧化物物缀合的抗人IgG F(ab’)2抗体片段用于检测。
链霉亲和素包被的96-孔板(Pierce Reacti-BindTM Streptavidin CoatedPolystyrene Strip Plates,Code No.15121)用稀释缓冲液(稀释缓冲液:含有0.5%重量体积比的牛血清白蛋白的PBS缓冲液)中的0.5μg/ml生物素酰化的山羊多克隆抗人IgG F(ab’)2抗体片段(F(ab’)2<h-Fc>Bi;Dianova,Code No.109-066-098)捕获抗体(0.1ml/孔),通过在室温下(RT)振荡孵育1小时而包被。之后,使用多于0.3ml洗涤缓冲液洗涤板三次(洗涤缓冲液:含有1%重量体积比(w/v)的Tween 20的PBS)。含有IgG免疫球蛋白缀合物的细胞培养物上清液(样品)在稀释缓冲液中系列稀释(两倍)至浓度为0.5-20ng/ml,加入板中并在室温摇晃孵育1小时。稀释缓冲液中的纯化的抗IGF-1R标准抗体(0.5-20ng/ml)用于产生IgG蛋白标准曲线。用0.3ml/孔的洗涤缓冲液洗涤板三次之后,使用过氧化物酶缀合的、山羊多克隆抗人F(ab’)2特异性IgG的F(ab’)2片段[F(ab’)2<h-Fcγ>POD;Dianova,Code No.109-036-098]检测与人Fcγ结合的复合物。用0.3ml/孔的洗涤缓冲液洗涤板三次,用(2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)过氧化物酶底物溶液(RocheMolecular Biochemicals,Code No.1684302)对板进行显色。10-30分钟之后,在Tecan Spectrafluorplus板读数机(Tecan Deutschland GmbH)上扣除试剂空白(孵育缓冲液+ABTS溶液)确定在405nm和490nm的吸光度。对于背景校正,根据公式I,从405nm的吸光度中减去490nm的吸光度。所有的样品至少以一式两份重复测试,并且将来自两次或者三次吸光度测量的数值进行平均。样品的IgG含量从标准曲线上计算。
公式I:
实施例7
活病毒抗病毒实验
为了活NL-Bal病毒的生产,将质粒pNL-Bal(US NIH Aids ReagentProgram)转染到培养在Dulbecco氏改良的极限培养基(DMEM)中的HEK 293FT细胞系中,该培养基含有10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,2mM L-谷氨酰胺和0.5mg/mL geniticin(所有的培养基来自Invitrogen/Gibco)。在转染后两天收集含有病毒颗粒的上清液,采用通过0.45μm孔径的PES(聚醚砜(polyethersulfon))过滤器(Nalgene)过滤除去细胞碎片,并等分储存在-80℃。为了对实验性能进行标化,使用病毒原种的等分样品感染JC53-BL(US NIH Aids ReagentProgram)细胞,产生大约每孔1.5×105RLU(相对光单位)。在96孔板中系列稀释测试的肽-免疫球蛋白缀合物、包括抗CCR5单克隆抗体2D7(PharMingen;CCR5,趋化因子受体;HIV-1感染的共受体)的参考抗体和参考肽(T-651和T-2635)。该实验一式四份实施。每个板含有细胞对照和病毒对照孔。等价于1.5×105RLU的病毒原种添加到每个孔中,然后2.5×104个JC53-BL细胞加入到每个孔中,使得每孔的最终实验体积是200μl。在37℃,90%相对湿度,5%CO2的情况下孵育3天后,吸出培养基,将50μl的Luciferase Assay System(萤光素酶检测系统)(Promega)加入到每个孔中。在室温孵育10分钟后,在发光计(Luminoskan,Thermo Electron Corporation)上读取实验板。在减去背景之后,计算每个剂量点的萤光素酶活性的抑制百分数,通过使用用于Excel的XLfit曲线拟合软件(3.0.5版本,Build12;Microsoft)测定IC50。
表7:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性
实施例8
单周期抗病毒实验
为了产生假型NL-Bal病毒,质粒pNL4-3Δenv(在env基因中具有缺失的HIV pNL4-3基因组构建体)和pCDNA3.1/NL-BAL env[含有NL-Bal env基因的pcDNA3.1质粒(从NIBSC Centralized Facility forAIDS Reagents获得)]共转染到培养在Dulbecco’氏改良的极限培养基(DMEM)中的HEK 293FT细胞系(Invitrogen)中,该培养基含有10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,2mM L-谷氨酰胺和0.5mg/mL geniticin(所有培养基来自Invitrogen/Gibco)。在转染后两天收集含有假型病毒的上清液,采用通过0.45μm孔径的PES(聚醚砜)过滤器(Nalgene)过滤除去细胞碎片,并等分储存在-80℃。为了对实验性能进行标化,使用病毒原种的等分样品感染JC53-BL(US NIHAids Reagent Program)细胞,产生大约每孔1.5×105RLU(相对光单位)。在96孔板中系列稀释测试的肽-免疫球蛋白缀合物、参考抗体和参考肽(T-20,T-651和T-2635)。该实验一式四份实施。每个板含有细胞对照和病毒对照孔。等价于1.5×105RLU的病毒原种添加到每个孔中,然后2.5×104个JC53-BL细胞加入到每个孔中,使得每孔的最终实验体积是200μl。在37℃,90%相对湿度,5%CO2的情况下孵育3天后,吸出上清液,将50μl的Luciferase Assay System(萤光素酶检测系统)(Promega)加入到每个孔中。在室温孵育10分钟后,在发光计(Luminoskan,Thermo Electron Corporation)上读取实验板。在减去背景之后,计算每个剂量点的萤光素酶活性的抑制百分数,通过使用用于Excel的XLfit曲线拟合软件(3.0.5版本,Build12;Microsoft)测定IC50值。
表8:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性
实施例9
在外周血单核细胞(PBMC)中的抗病毒实验
根据生产厂商的说明书,通过Ficoll-Paque(Amersham,Piscataway,New Jersey,USA)密度梯度离心从血沉棕黄层(buffy-coats)(获得自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center))中分离人PBMC。简而言之,从血沉棕黄层中转移血液到50ml锥形管中,并用无菌的Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液(Invitrogen/Gibco)稀释为50ml的终体积。25ml的稀释血液转移到两个50ml锥形管中,将12.5ml的Ficoll-Paque Plus(AmershamBiosciences)小心地铺在下面并且在室温下450x g在不带制动的情况下离心20分钟。将白细胞层小心的转移到新的50ml锥形管中并使用PBS洗涤两次。为了移除剩余的红细胞,在室温使用ACK裂解缓冲液(Biosource)与细胞孵育5分钟,并且用PBS再洗涤一次。计数PBMC并且以2-4×106细胞/ml的浓度在RPMI1640中37℃孵育24h,该RPMI1640含有10%FCS(Invitrogen/Gibco),1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠和2μg/ml植物凝血素(Invitrogen)。在检测前使细胞与5单位/ml人IL-2(Roche Molecular Biochemicals)孵育最少48h。在96孔圆底板中,在存在系列稀释的测试肽-免疫球蛋白缀合物、参考免疫球蛋白和参考肽(T-20,T-651和T-2635)的情况下,使用HIV-1JR-CSF病毒(Koyanagi,Y.,等,Science 236(1987)819-822)感染1×105PBMC。使用的病毒的量等价于1.2ng HIV-1p24抗原/孔。一式四份进行感染。在37℃孵育板6天。在Microsoft Excel Fit(3.0.5版本Build12;equation205;Microsoft)中使用具有一个结合位点的S形剂量反应模型,通过p24ELISA(HIV-1p24ELISA#NEK050B)在感染结束时检测病毒的产量。
表9:肽和肽-免疫球蛋白缀合物的抗病毒活性
实施例10
测定多肽的结合亲合性
通过使用3000仪器(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以等离子体表面共振(SPR)在25℃检测基于HIV-1gp41蛋白的HR1-HR2相互作用(HR,七肽重复序列1和2区)的多肽的结合亲合性。
已经良好建立了系统用于分子相互作用的研究。其能够连续地实时监测配体/分析物的结合,并因此可以测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术是基于测定接近于金涂覆的生物感受器芯片表面的折射率。折射率的改变表明由固定的配体与以溶液注射的分析物的相互作用所引起的表面上的质量改变。如果分子结合表面上固定的配体,则质量增加,在解离的情况中,质量降低。
结合实验
通过三次连续的1分钟注射含有1M NaCl的50mM NaOH预洗涤传感器芯片SA(Sensor Chip SA(SA,链霉亲合素))。然后将生物素酰化的HR1肽,生物素-T-2324(SEQ ID NO:37)固定在SA包被的传感器芯片上。为了避免质传限制(mass transfer ),将溶解在HBS-P缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.005%(v/v)表面活性剂P20)中的最低可能值的HR1肽(约200RU,共振单位)加载在SA芯片上。在开始测量之前,使用0.5%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)以50μL/min的流速脉冲一分钟而第一次再生该芯片。
将待分析的含有HR2HIV-1gp41的多肽首先以大约1mg/mL的浓度溶解在50mM NaHCO3,pH 9中,然后用HPS-P缓冲液稀释以获得范围从25至1.95nM的多个浓度。样品的接触时间是5分钟(结合期)。然后用HBS-P洗涤芯片表面5分钟(解离期)。所有的相互作用在精确的25℃(标准温度)进行。在一个测量周期中样品储存在12℃。以每秒一个信号的检测速率对信号进行检测。样品以50μL/min的流速以递增的浓度注射在HR1缀合的生物感受器元件上。以50μL/min的流速用0.5%(w/v)SDS溶液洗涤1分钟再生该表面。
使用BIAevaluation 4.1软件包,通过分析使用多个不同的浓度获得的传感图曲线而确定定义为ka/kd的平衡常数(KD)。通过从HR2-HR1相互作用的值中减去含有HR2的多肽与无链霉亲合素的表面相互作用的反应值而校正非特异性结合。数据的拟合遵循1∶1 Langmuir结合模型。
多肽的去糖基化
含有HR2的多肽样品以大约2mg/ml的浓度溶解在PBS缓冲液中,通过与肽-N-糖苷酶F(PNGaseF,Prozyme,San Leandro,CA)在37℃孵育12-24小时而去糖基化(除去N-聚糖),其中每毫克N糖基化的多肽使用50mU PNGaseF。
表10a:示例性的含有HR2的多肽与HR1的结合常数
表10b:含有HR2的多肽与HR1的示例性KD-值
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)
<120>肽-免疫球蛋白缀合物
<130>23216 FT
<150>EP 05023002
<151>2005-10-21
<160>37
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>1
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>2
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>3
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly
1 5 10 15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>4
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln
1 5 10 15
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>5
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly
<210>6
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>6
Gly Ser Thr
1
<210>7
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ser
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>8
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210>10
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly
<210>12
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>13
agatcttttg ccaccgctag c 21
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>14
aagcttgtcc ccgggcaaat gagtgctagc 30
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>15
agatctatat atatatatgc tagc 24
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
1 5 10
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>17
aagcttcaac aggggagagt gttgaaggga gaggcgcc 38
<210>18
<211>345
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>基因座HIVH3BH8;来自法国的HIV-1分离株LAI/IIIB克隆BH8;Ratner,L.等人,Nature 313(1985)
277-384;
<400>18
Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln
20 25 30
Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile
35 40 45
Glu Gly Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
50 55 60
Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln
65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala
85 90 95
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp
100 105 110
Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr
115 120 125
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
130 135 140
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
145 150 155 160
Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met
165 170 175
Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser
180 185 190
Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr
195 200 205
His Leu Pro Asn Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu
210 215 220
Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly
225 230 235 240
Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser
245 250 255
Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu
260 265 270
Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu
275 280 285
Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Asn Leu Leu
290 295 300
Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu
305 310 315 320
Leu Val Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu
340 345
<210>19
<211>36
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>T-651
<400>19
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Leu
35
<210>20
<211>38
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>衍生自HIV-1 gp41胞外域的突变的氨基酸序列(碱基位置:621-656;T-2635)
<400>20
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>21
<211>123
<212>PRT
<213>人类免疫缺陷病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>HIV-1 gp41胞外域变体I568P(单点突变)
<400>21
Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg Ala Ile Glu Gly Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val
20 25 30
Trp Gly Pro Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr
35 40 45
Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu
50 55 60
Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser
65 70 75 80
Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu
85 90 95
Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln
100 105 110
Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu
115 120
<210>22
<211>132
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>HIV-1 gp41胞外域变体I568P,L550E,L566E,I580E(四点突变)
<400>22
Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Glu Leu Arg Ala Ile Glu Gly
20 25 30
Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Thr Val Trp Gly Pro Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu
50 55 60
Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro
65 70 75 80
Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn
85 90 95
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
100 105 110
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
115 120 125
Gln Glu Leu Leu
130
<210>23
<211>133
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4964
<400>23
agatctatat atatatatgc tagcgaaatt gtgttgacac agtctccagc caccctgtct 60
ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tagtagctac 120
ttagcctggt acc 133
<210>24
<211>249
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4965
<400>24
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60
tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120
aactacacaa gcttgatcca ctctctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180
gagcaggagc tcctgggcgg gggtggatcc ggcggcgggg gcagcggcgg gggaggctcc 240
ggcgctagc 249
<210>25
<211>279
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4966
<400>25
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60
tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120
aactacacaa gcttgatcca ctctctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180
gagcaggagc tcctgggcgg gggtggctcc ggcggcgggg gcagcggcgg gggaggctcc 240
ggcgggggcg gatccggggg cggtggcagc ggcgctagc 279
<210>26
<211>252
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4967
<400>26
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60
tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120
aactacacaa gcttgatcca ctccctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180
gagcaggagc tcctgggatc cagctccagc tccagctcca gctccagcag tagctccagc 240
tctggcgcta gc 252
<210>27
<211>292
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4968
<400>27
agatctagag gaactgctca gttaggaccc agagggaacc atgggcagcc aggtgcacct 60
cctgtccttc ctcctgctgt ggatcagcga cactcgagcc gagaccacct gggaggcgtg 120
ggaccgcgcc atcgccgagt acgccgctcg catcgaagct ttgatccggg ccgcacagga 180
gcagcaggag aagaacgagg ctgcccttcg cgaactgggc gggggtggct ccggcggcgg 240
gggcagcggc gggggcggat ccggccgaac tgtggctgca ccatctgtct tc 292
<210>28
<211>589
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4969
<400>28
agatctagct ctgggagagg agcccagcac tagaagtcgg cggtgtttcc attcggtgat 60
cagcactgaa cacagaggac tcaccatgga gtttgggctg agctgggtgt tcctcgtggc 120
actgctcagg ggtgtacagt gtcaggtgca ggcccgccag ctgctctccg gcatcgtcca 180
gcagcaaaac aatctgctgc gggcgatcga ggggcagcag cacctcctgc agctgacggt 240
gtggggtccc aagcagctgc aggcccgcat tctggccgtg gaacggtacc tgaaggacca 300
gcagctgctc ggcatctggg gatgctctgg caagcttatc tgcaccacag ccgtcccctg 360
gaacgctagc tggagtaaca aaagcctgga gcaaatttgg aacaacatga cctggatgga 420
gtgggatcgc gagatcaata attacacaag cctgatccac tccctgatcg aggaaagcca 480
gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct cctgggcggg ggcggatccg gcggcggggg 540
cagcggtggg ggcggctccg gccgaactgt ggctgcacca tctgtcttc 589
<210>29
<211>192
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4970
<400>29
aagcttgtcc ccgggcaaag gcgggggcgg cagcggcggc gggggatccg gtgggggcgg 60
ctccggcggc aacatgacct ggatggagtg ggatcgcgag atcaataatt acacaagcct 120
gatccactcc ctgatcgagg aaagccagaa ccagcaggag aagaacgagc aggagctcct 180
gtgagtgcta gc 192
<210>30
<211>195
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4971
<400>30
aagcttgtcc ccgggcaaag gatccagctc cagctccagc tccagctcca gcagtagctc 60
cagctctggc aacaacatga cctggatgga gtgggatcgc gagatcaata attacacaag 120
cctgatccac tccctgatcg aggaaagcca gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct 180
cctgtgagtg ctagc 195
<210>31
<211>195
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4972
<400>31
aagcttgtcc ccgggcaaag gcgggggcgg cagcggcggc gggggatccg gtgggggcgg 60
ctccggcggt accacctggg aggcgtggga ccgcgccatc gccgagtacg ccgctcgcat 120
cgaagcgttg atccgggccg cacaggagca gcaggagaag aacgaggctg cccttcgcga 180
actgtgagtg ctagc 195
<210>32
<211>195
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4973
<400>32
aagcttgtcc ccgggcaaag gatccagctc cagctccagc tccagctcca gcagtagctc 60
cagctctggt accacctggg aggcgtggga ccgcgccatc gccgagtacg ccgctcgcat 120
cgaagcgttg atccgggccg cacaggagca gcaggagaag aacgaggctg cccttcgcga 180
actgtgagtg ctagc 195
<210>33
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4974
<400>33
aagcttgtcc ccgggcaaag gccagcagca acaggggcag cagcagcagg gccagcaaca 60
gcagggtaac aacaccacct gggaggcgtg ggaccgcgcc atcgccgagt acgccgctcg 120
catcgaagcg ttgatccggg ccgcacagga gcagcaggag aagaacgagg ctgcccttcg 180
cgaactgtga gtgctagc 198
<210>34
<211>435
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4975
<400>34
aagcttgtcc ccgggcaaag ggagcaccat gggcgcggcc tccatgacgc tgaccgtgca 60
ggcccgccag ctgctctccg gcatcgtcca gcagcaaaac aatgagctgc gggcaattga 120
ggggcagcag cacctcgaac agctgacggt gtggggtccc aagcagctgc aggcccgcga 180
gctggccgtg gaacggtacc tgaaggacca gcagctgctc ggcatctggg gatgctctgg 240
caagctgatc tgcaccacag ccgtcccctg gaacgccagc tggagtaaca aaagcctcga 300
gcaaatttgg aacaacatga cctggatgga gtgggatcgc gagatcaata attacacaag 360
cctgatccac tccctgatcg aggaaagcca gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct 420
cctgtgagtg ctagc 435
<210>35
<211>230
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4978
<400>35
aagcttcaac aggggagagt gtggcggggg tggctccggc ggcgggggca gcggcggggg 60
aggctccggc gggggcggat ccgggggcgg tggcagcggc ggcaacatga cctggatgga 120
gtgggatcgc gagatcaata actacaccag cctgatccac tctctgatcg aggaaagcca 180
gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct cctgtagagg gagaggcgcc 230
<210>36
<211>200
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>插入片段4979
<400>36
aagcttcaac aggggagagt gtggccagca gcaacagggg cagcagcagc agggccagca 60
acagcagggt aacaacatga cctggatgga gtgggatcgc gagatcaata actacaccag 120
cctgatccac tctctgatcg aggaaagcca gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct 180
cctgtagagg gagaggcgcc 200
<210>37
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T-2324
<400>37
Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu
1 5 10 15
Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp
20 25 30
Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu
35 40 45
Lys Asp Gln
50
Claims (15)
1.肽-免疫球蛋白缀合物,其特征在于:
a)所述的免疫球蛋白由两条重链组成,或者由两条重链和两条轻链组成,
b)所述的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白,
c)所述的缀合物具有下述通式
免疫球蛋白-[肽]n
其中n是从2至8的整数,
d)肽键使肽的羧基末端氨基酸缀合到免疫球蛋白链的氨基末端氨基酸上,或者使免疫球蛋白链的羧基末端氨基酸缀合到肽的氨基末端氨基酸上。
2.根据权利要求1的缀合物,其特征在于所述的肽是生物活性肽。
3.根据权利要求1的缀合物,其特征在于所述的肽由肽接头和生物活性肽组成。
4.根据权利要求1-3任一项的缀合物,其特征在于所述肽彼此间具有90%或者更高的氨基酸序列同一性。
5.根据权利要求1-4任一项的缀合物,其特征在于该免疫球蛋白是G类免疫球蛋白(IgG)或者是E类免疫球蛋白(IgE)。
6.根据权利要求2-5任一项的缀合物,其特征在于所述的生物活性肽是抗融合肽。
7.根据权利要求1-6任一项的缀合物,其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是以10-5mol/l或者更高的KD值(结合亲和性)结合人类抗原的免疫球蛋白。
8.根据权利要求1-6任一项的缀合物,其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是:
a)其中重链和/或轻链缺少一个或多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白,或者
b)其中重链和/或轻链没有可变区的免疫球蛋白,或者
c)对于人类抗原具有10-5mol/l或者更高的结合亲和性的免疫球蛋白,或者
d)对于人类抗原具有10-5mol/l或者更高的结合亲和性,并且对于非人类抗原具有10-7mol/l或者更低的结合亲和性的免疫球蛋白。
9.用于生产根据权利要求1的缀合物的方法,其特征在于该方法包括:
a)在适于表达该缀合物的条件下培养含有一种或者多种质粒的细胞,其中所述质粒含有一个或者多个编码根据权利要求1的缀合物的核酸分子,
b)从细胞或者培养基中回收该缀合物。
10.药物组合物,其含有根据权利要求1至8之任一项的缀合物,或者其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂或者载体。
11.根据权利要求1至8任一项的缀合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。
12.根据权利要求11的用途,其特征在于该病毒感染是HIV感染。
13.根据权利要求1至8任一项的缀合物在治疗需要抗病毒治疗的患者中的用途。
14.根据权利要求1至8任一项的缀合物,其特征在于所述的肽具有90%至小于100%的氨基酸序列同一性。
15.根据权利要求1至8和14之任一项的缀合物,其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是其中重链和/或轻链缺少一个或者多个构架区或/和高变区的一部分或者全部的免疫球蛋白,和/或是其中重链和/或轻链无可变区的免疫球蛋白。
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