CN101500615A - 针对ccr5的抗体和抗融合肽的缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种缀合物和所述缀合物的药学应用,所述缀合物包括一种或多种抗融合肽和针对结合HIV gp20的细胞表面受体的抗体,其特征在于,1-8个抗融合肽的每一个缀合到所述针对结合HIV gp20的细胞表面受体的抗体的重链和/或轻链的一个末端上。
Description
本发明涉及针对CCR5的抗体和抗融合肽的缀合物,其中1-8个抗融合肽的每一个缀合到抗-CCR5抗体的重链和/或轻链的一个末端上。所述抗融合肽在氨基酸水平上可以不同的、相似的或相同的。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)对细胞的感染是通过这样的过程实现的:其中要被感染的细胞的膜和病毒膜融合。提出了这一过程的概括方案:病毒包膜糖蛋白复合物(gp120/gp41)与位于要被感染的细胞的膜上的细胞表面受体相互作用。gp120与例如,与共同受体如CCR-5或CXCR-4组合的CD4受体的结合引起所述gp120/gp41复合物的构象改变。作为构象改变的结果,gp41蛋白能够插入到靶细胞的膜上。这种插入是膜融合过程的开端。已知由于天然存在的多态性,gp41蛋白的氨基酸序列在不同的HIV毒株中是不同的。但是可以识别相同的结构域结构,更精确地是,融合信号,两个七残基重复结构域(HR1,HR2)和跨膜结构域(以N-到C-端的方向)。暗示所述融合(或融合性的)结构域参与插入到细胞膜内和细胞膜的分解。所述HR区域由多个包含7个氨基酸(“七残基”)的片段组成(参见,例如,Shu,W.,等,生物化学(Biochemistry)38(1999)5378-5385)。除了所述七残基之外,还存在一个或多个亮氨酸拉链样基序。这种组成解释gp41蛋白的卷曲螺旋结构的形成,并且刚好解释来源于这些结构域的肽。在一般的寡聚体中,卷曲螺旋由两个或多个相互作用的螺旋组成。具有由gp41的HR1和HR2结构域演绎的氨基酸序列的肽是细胞摄入HIV的有效的体外和体内抑制剂(例如,参见例如US 5,464,933,US 5,656,480,US 6,258,782,US 6,348,568,或US 6,656,906的肽)。例如,T20(也叫作DP178,,一种HR2肽),T651(US 6,479,055),和T2635(WO 2004/029074)是非常有力的HIV感染抑制剂。已经试图利用例如氨基酸取代或化学交联增强HR2来源的肽的效力(Sia,S.K.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)99(2002)14664-14669;Otaka,A.,等,Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。
肽与特定分子的缀合物可以改变它们的药物动力学特征,例如,这样的肽缀合物的血清半衰期可被提高。报道了下列缀合物,例如,关于聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP 0 442 724),关于PEG和红细胞生成素(WO 01/02017),关于包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649),关于基于分泌的抗体的融合蛋白(US 2002/147311),关于包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991;人血清白蛋白US 5,876,969),关于PEG化的多肽(US 2005/0114037),和关于干扰素融合。在本领域的状况中还描述了包含多花白树毒蛋白和一种抗体的免疫毒素(WO 94/26910),修饰的运铁蛋白-抗体融合蛋白(US 2003/0226155),抗体-细胞因子融合蛋白(US 2003/0049227),和由具有免疫-刺激性、膜转运或嗜同性活性的肽和一种抗体组成的融合蛋白(US 2003/0103984)。在WO 2004/085505中,报道了由与大分子化学连接的生物活性化合物组成的长作用生物活性缀合物。
共同受体CCR5被大部分HIV-1原代分离物所用,并且对于感染的建立和维持是至关重要的。另外,CCR5功能对人的健康不是必要的。突变的CCR5等位基因,“CCR5△32”,编码一种剪截的、无功能的蛋白(Samson,M.,等,自然(Nature)382(1996)722-725;Dean,M.,等,科学(Science)273(1996)1856-1862)。关于该突变纯合的个体缺少CCR5表达,并且得到强保护免于HIV-1感染。他们表现出不明显的表型结果,并且对M-向性HIV感染是高度抗性的,而杂合的个体表现出延迟的疾病进展(Schwarz,M.K.和Wells,T.N.,自然药物发现综述(Nat.Rev.Drug Discov.)1(2002)347-358)。CCR5的缺少没有明显不利的后果,可能是因为CCR5是作为α-趋化因子MIP-1α、MIP-1β、和RANTES的受体的高丰度趋化因子网络的一部分,α-趋化因子MIP-1α、MIP-1β、和RANTES具有许多重叠的功能,并且它们中的大部分具有备选的受体(Rossi,D.和Zlotnik,A.,免疫学每年综述(Annu.Rev.Immunol.)18(2000)217-242)。将CCR5鉴定为HIV-1的共同受体是基于它的配体,即MIP-1α、MIP-1β和RANTES阻断R5感染而不是R5X4或X4分离物感染的能力(Cocchi,F.,等,科学(Science)270(1995)1811-1815)。CCR5还是“成簇”趋化因子的受体,所述“成簇”趋化因子主要在炎性反应过程中产生,并且控制嗜中性细胞(CXC趋化因子)、巨噬细胞和T细胞亚型(T辅助Th1和Th2细胞)的募集。例如,Th1反应典型地是包括有效抗病毒和肿瘤的细胞介导的免疫、负责杀死细胞内寄生虫的促炎性反应、和使自体免疫反应永存的那些,而Th2反应被认为是过敏症中的关键因素。因此,这些趋化因子受体的抑制剂可以有效用作免疫调节剂。对于Th1反应,例如,在包括类风湿性关节炎的自体免疫中,消除过分活跃的反应,或者,对于Th2反应,减少哮喘发作或过敏反应,包括遗传性过敏性皮炎(参见,例如,Schols,D.,Curr.Top.Med.Chem.4(2004)883-893;Mueller,A.,和Strange,P.G.,国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.J.Biochem.Cell Biol.)36(2004)35-38;Kazmierski,W.M.,等,现代药物靶点感染病症(Curr.Drug Targets Infect.Disord.)2(2002)265-278;Lehner,T.,免疫学趋势(Trends Immunol.)23(2002)347-351)。
针对人CCR5的抗体是,例如,PRO 140(Olson,W.C.,et al.,J.Virol.73(1999)4145-4155),和/或2D7(Samson,M.,等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272(1997)24934-24941)。其它的抗体在下列各项中提到:US 2004/0043033,US 6,610,834,US 2003/0228306,US 2003/0195348,US 2003/0166870,US 2003/0166024,US 2003/0165988,US 2003/0152913,US 2003/0100058,US 2003/0099645,US 2003/0049251,US 2003/0044411,US 2003/0003440,US 6,528,625,US 2002/0147147,US 2002/0146415,US 2002/0106374,US 2002/0061834,US 2002/0048786,US 2001/0000241,EP 1 322 332,EP 1 263 791,EP 1 207 202,EP 1 161 456,EP 1 144 006,WO 2003/072766,WO 2003/066830,WO 2003/033666,WO 2002/083172,WO 02/22077,WO 01/58916,WO 01/58915,WO 01/43779,WO 01/42308,和EP 05007138.0。
从US 2003/0228306中可知针对CCR5抗体的聚乙二醇缀合物。US 2003/0215421提及趋化因子-毒素缀合物。WO 01/43779提及抗-CD4抗体和抗-CCR5抗体的缀合物以及抗-CD4抗体和HIV-1融合抑制肽的缀合物。CCR5抗体和毒素的缀合物在EP 1 346 731中提及。
发明概述
本发明报道了包括1-8个抗融合肽和针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体的缀合物,所述缀合物的特征在于,1-8个,优选2个或4个抗融合肽分别缀合到所述针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体的重链和/或轻链的一个末端上(只有如果所述抗体包含8个末端时,即,由例如两个重链和两个轻链组成时,每个抗体8个抗融合肽的数目才是可能的;如果所述抗体包含更少的C-和N-端数目,例如,作为scFv,则在所述缀合物中最多可能的抗融合肽的对应数目也减少,即,所述数目减少到小于8)。
本发明还包括包含一个或多个抗融合肽和抗-CCR5抗体(mAb CCR5)的缀合物,所述缀合物的特征在于,至多1-8个抗融合肽分别缀合到所述抗-CCR5抗体的重链和/或轻链的一个末端上(只有如果所述mAb CCR5包含8个末端时,即,由例如两个重链和两个轻链组成时,8个抗融合肽/mAb CCR5的数目才是可能的;如果所述mAb CCR5包含更少的C-和N-端数目,例如,作为scFv,则在所述缀合物中最多可能的抗融合肽的对应数目也减少,即,所述数目减少到小于8)。
优选地,抗-CCR5抗体链的羧基端氨基酸缀合到所述抗融合肽的氨基端氨基酸上,或者所述抗融合肽的羧基端氨基酸缀合到所述抗体链的氨基端氨基酸上,优选地通过具有或不具有中间接头的肽键缀合。
优选地,所述缀合物特征在于下述通式
mAb CCR5-[接头]m-[抗融合肽]n
其中m对于每个抗融合肽独立地是0(即,在mAb CCR5和抗融合肽之间是肽键)或1(即,在mAb CCR5和抗融合肽之间是接头),并且n是1-8的整数。
mAb CCR5的重链和/或轻链和抗融合肽的优选缀合物(“链缀合物”)选自由下列各项组成的组:
(1)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]
(2)[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(3)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[抗融合肽]
(4)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]
(5)[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
(6)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[抗融合肽]
(7)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(8)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
其中在所述链缀合物中(在内部和之间)的所述接头可以是相同的或不同的,其中m是1或0的整数,并且在所述链缀合物中(在内部和之间),m可以独立地是相同的或不同的。
(肽或mAb CCR5链的左侧意指N端,右侧意指C端。因此,在(1)中,抗融合肽的C端通过肽键或接头与mAb CCR5的重链的N端连接)。
优选地,所述链缀合物组装成本发明所述的包含mAb CCR5的缀合物(例如,由两个轻链和两个重链组成,包括恒定Fc结构域、scFv片段、或Fab片段)。
特别优选的链缀合物是(2),(3),(4),和(7)。特别优选的本发明所述的缀合物包括2x[mAb CCR5轻链]和2x(2),2x[mAb CCR5轻链]和2x(3),或2x[mAb CCR5重链]和2x(4),或2x[mAb CCR5轻链]和2x(7)。所述重链和/或轻链优选地包括恒定区(Fc)。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的可变重链结构域,所述可变重链结构域由免疫球蛋白构架和选自由重链CDR3序列SEQ ID NO:16,17组成的组的CDR3区组成。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的可变重链结构域,所述可变重链结构域由下列各项组成:免疫球蛋白构架,和选自由CDR3序列SEQID NO:16,17组成的组的CDR3区,选自由CDR2序列SEQ ID NO:13,14,15组成的组的CDR2区,和选自由CDR1序列SEQ ID NO:9,10,11,12组成的组的CDR1区。
优选地,所述缀合物特征在于包括选自包含SEQ ID NO:1,3,5,和7的重链可变结构域的组的重链可变结构域。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的轻链可变结构域,所述轻链可变结构域由下列各项组成:免疫球蛋白构架,和选自SEQ ID NO:18,19,20的CDR1区,选自SEQ ID NO:21,22,23的CDR2区,和选自SEQ IDNO:24,25的CDR3区。
优选地,所述缀合物特征在于,包括作为重链CDRs的SEQ ID NO:1的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:2的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:3的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:4的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:5的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:6的CDRs,或作为重链CDRs的SEQ ID NO:7的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:8的CDRs。
优选地,所述缀合物特征在于包括独立地选自由下列各项组成的组的可变的重链和轻链结构域:
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:2定义的轻链(VL)可变结构域;
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:4定义的轻链可变结构域;
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:6定义的轻链可变结构域;
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:8定义的轻链可变结构域。
优选地,所述缀合物特征在于包括由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:2定义的轻链(VL)可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:4定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ IDNO:5定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:6定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:8定义的轻链可变结构域;选自由氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)、三肽GST、以及SEQ ID NO:36-62和SEQ ID NO:67-70组成的组的接头;和选自由SEQ ID NO:29-35和SEQ ID NO:73定义的肽的组的抗融合肽。
优选地,所述缀合物特征在于包括选自包含C34,T20,T1249,T651,T2635,N36,DP107,和afp-1的肽的组的抗融合肽。
优选地,所述缀合物特征在于,在每个重链C端或在每个轻链N端包含抗融合肽(两个抗融合肽)。优选地,所述缀合物特征在于,它在每个重链C端和在每个轻链N端包含抗融合肽(4个抗融合肽)。
优选地,所述缀合物特征在于包含两个SEQ ID NO:2的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33,特征在于包含两个SEQ IDNO:4的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33,特征在于包含两个SEQ ID NO:6的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:5的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33,或特征在于包含两个SEQ ID NO:8的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域,接头SEQID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33。
优选地,所述缀合物特征在于,所述抗-CCR5抗体是IgG1亚类的。还优选地,所述抗-CCR5抗体是IgG4亚类的,或者是IgG1或IgG2亚类的,具有在氨基酸位置S228,L234,L235和/或D265的突变,和/或包含PVA236突变。优选地,所述缀合物特征在于,所述IgG4亚类的抗-CCR5抗体具有S228P突变,并且所述IgG1亚类的抗-CCR5抗体具有L234A和L235A突变。
本发明还包括包含两个或多个抗融合肽和抗-CD4抗体(mAb CD4)的缀合物,所述缀合物特征在于,2-8个抗融合肽,优选地2个或4个,分别缀合到所述抗-CD4抗体的重链和/或轻链的一个末端(只有如果所述mAb CD4包含8个末端时,即,由例如两个重链和两个轻链组成时,8个抗融合肽/mAb CD4的数目才是可能的;如果mAb CD4包含更少的C-和N-端数目,例如,作为scFv,则在所述缀合物中最多可能的抗融合肽的对应数目也减少,即,所述数目减少到小于8)。
优选地,抗体链的羧基端氨基酸缀合到抗融合肽的氨基端氨基酸,或者抗融合肽的羧基端氨基酸缀合到抗体链的氨基端氨基酸,优选地通过具有或不具有中间接头的肽键缀合。
优选地,所述缀合物特征在于下述通式:
抗体-[接头]m-[抗融合肽]n
其中m对于每个抗融合肽独立地是0(在抗体和抗融合肽之间是肽键)或1(在抗体和抗融合肽之间是接头),并且n是2-8的整数,优选2-8的偶数,更优选是2或4。优选地,所述抗体是mAb CD4。
抗体重链和/或轻链和抗融合肽的优选缀合物(“链缀合物”)选自由下列各项(以N端到C端方向)组成的组:
(1)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]
(2)[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(3)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[抗融合肽]
(4)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]
(5)[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
(6)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[抗融合肽]
(7)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(8)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
其中在所述链缀合物中(在内部和之间)所述接头可以是相同的或不同的,其中m是1或0的整数,并且在所述链缀合物中(在内部和之间),m可以独立地是相同的或不同的。
(肽或抗体链的左侧意指N端,右侧意指C端。因此,在(1)中,抗融合肽的C端通过肽键或接头与抗体重链的N端连接)。
优选地,所述链缀合物组装成本发明所述的包含mAb CD4的缀合物(例如,由两个轻链和两个重链组成,包括恒定Fc结构域、scFv片段、或Fab片段)。
特别优选的链缀合物是(2),(3),(4),和(7)。特别优选的本发明所述的缀合物包括2x[mAb CD4轻链]和2x(2),2x[mAb CD4轻链]和2x(3),或2x[mAb CD4重链]和2x(4),或2x[mAb CD4轻链]和2x(7)。所述重链和/或轻链优选地包括恒定区。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的可变重链结构域,所述可变重链结构域由免疫球蛋白构架和选自由重链CDR3序列SEQ ID NO:103,104,或105的CDR3区组成。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的可变重链结构域,所述可变重链结构域由下列各项组成:免疫球蛋白构架,和选自CDR3序列SEQ IDNO:103,104或105的CDR3区,选自CDR2序列SEQ ID NO:100,101,或102的CDR2区,和选自CDR1序列SEQ ID NO:97,98,或99的CDR1区。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的重链可变结构域,其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:82,或83。
优选地,所述缀合物特征在于包括这样的轻链可变结构域,所述轻链可变结构域由下列各项组成:免疫球蛋白构架,和选自SEQ ID NO:87,88,或90的CDR1区,选自SEQ ID NO:91,92,或93的CDR2区,和选自SEQID NO:94,95,或96的CDR3区。
优选地,所述缀合物特征在于包括作为重链CDRs的SEQ ID NO:81的CDRs,和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:75的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:82的CDRs,和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:76的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:84的CDRs,和作为轻链CDRs的SEQ IDNO:78的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:85的CDRs,和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:79的CDRs,或作为重链CDRs的SEQ ID NO:86的CDRs,和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:80的CDRs。
优选地,所述缀合物特征在于包括独立地选自由下列的可变的重链和轻链结构域:
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:81定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:75定义的轻链可变结构域;
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:82定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:76定义的轻链可变结构域;
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:84定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:78定义的轻链可变结构域;
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:85定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:79定义的轻链可变结构域,
e)由氨基酸序列SEQ ID NO:86定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:80定义的轻链可变结构域。
优选地,所述缀合物特征在于包括由氨基酸序列SEQ ID NO:81定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:75定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:82定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:76定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:84定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:78定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:85定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:79定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQID NO:86定义的重链可变结构域,和由氨基酸序列SEQ ID NO:80定义的轻链可变结构域;选自氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)、三肽GST、以及SEQ ID NO:36-62和SEQ ID NO:67-70的接头;和选自SEQ ID NO:29-35或SEQ ID NO:73的抗融合肽的抗融合肽。
优选地,所述缀合物特征在于包括选自下列各项的抗融合肽:抗融合肽C34,T20,T1249,T651,T2635,N36,DP107,或afp-1。
优选地,所述缀合物特征在于,在每个重链C端或在每个轻链N端包含抗融合肽(两个抗融合肽)。优选地,所述缀合物特征在于,它在每个重链C端和在每个轻链N端包含抗融合肽(4个抗融合肽)。优选地,所述缀合物特征在于,它在两个重链C端和在两个轻链N端包含抗融合肽(4个抗融合肽)。
优选地,所述缀合物特征在于包含两个SEQ ID NO:75的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:81的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:69和抗融合肽SEQ ID NO:73,特征在于包含两个SEQ IDNO:76的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:82的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:69和抗融合肽SEQ ID NO:73,特征在于包含两个SEQ ID NO:78的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:84的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:69和抗融合肽SEQ ID NO:73,特征在于包含两个SEQ ID NO:79的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:85的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:69和抗融合肽SEQ ID NO:73,或者特征在于包含两个SEQ IDNO:80的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,其中每个包含SEQ ID NO:86的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:69和抗融合肽SEQ ID NO:73。
优选地,所述缀合物特征在于,所述抗体是IgG1亚类或IgG4亚类的。还优选地,所述抗体是IgG4或IgG1或IgG2亚类的,具有在氨基酸位置S228,L234,L235和/或D265的突变,和/或包含PVA236突变。优选地,所述缀合物特征在于,所述IgG4亚类的抗体具有S228P突变,并且所述IgG1亚类的抗体具有L234A和L235A突变。
特别优选的是,所述抗体是抗-CD4抗体或抗-CCR5抗体。
本发明包括生产本发明所述的缀合物的方法,所述方法的特征在于,所述方法包括:
a)在适于表达所述缀合物的条件下,培育包含一种或多种质粒的细胞,所述质粒含有编码本发明所述的缀合物的一个或多个核酸分子,
b)从所述细胞或上清中回收所述缀合物。
在一个实施方案中,编码具有或不具有连接的抗融合肽的mAb CCR5或mAb CD4的轻链和重链的基因位于同一表达载体或不同表达载体上。
本发明包括一种药物组合物,所述药物组合物包含本发明所述的缀合物,以及药用赋形剂或载体。
本发明包括本发明所述的缀合物用于制备治疗病毒感染的药物的应用。优选地所述应用特征在于所述病毒感染是HIV感染。
本发明包括本发明所述的缀合物用于治疗需要抗病毒治疗、优选是抗HIV治疗的患者的应用。
发明描述
本发明的一个方面是包含一种或多种抗融合肽和抗-CCR5抗体(mAb CCR5)的缀合物,所述缀合物特征在于,1-8个抗融合肽每一个缀合到所述抗-CCR5抗体的重链和/或轻链的一个末端上。只有如果mAb CCR5包含8个末端时,即由例如两个重链和两个轻链组成时,8个抗融合肽/mAbCCR5的数目才是可能的。如果mAb CCR5包括更少数目的C端和N端,例如,作为scFv,则在所述缀合物中最多可能的抗融合肽的对应数目也减少,即,所述数目减少到小于8。本发明的另一个方面是包含两个或多个抗融合肽和抗-CD4抗体(mAb CD4)的缀合物,所述缀合物特征在于,2-8个抗融合肽每一个缀合到所述抗-CD4抗体的重链和/或轻链的一个末端上。
当在下述参考中概括地提到抗体或提到mAb CCR5或mAb CD4时,适当时,它还包括同样提及其它mAb和相对应的序列。
“抗融合肽”是抑制与膜融合相关的事件或膜融合事件本身的肽,其中包括,由膜融合引起的病毒对未感染的细胞的感染的抑制。这些抗融合肽优选地是线性的肽。例如,它们可以来源于gp41胞外结构域,例如,诸如DP107,DP178。这样的肽的实例可以在US 5,464,933,US 5,656,480,US 6,013,263,US 6,017,536,US 6,020,459,US 6,093,794,US 6,060,065,US 6,258,782,US 6,348,568,US 6,479,055,US 6,656,906,WO 1996/19495,WO 1996/40191,WO 1999/59615,WO 2000/69902,和WO 2005/067960中找到。例如,这样的肽的氨基酸序列包括或者可以选自下列各项的组:US5,464,933的SEQ ID NO:1-10;US 5,656,480的SEQ ID NO:1-15;US 6,013,263的SEQ ID NO:1-10和16-83;US 6,017,536的SEQ ID NO:1-10,20-83和139-149;US 6,093,794的SEQ ID NO:1-10,17-83和210-214;US 6,060,065的SEQ ID NO:1-10,16-83和210-211;US 6,258,782的SEQID NO:1286和1310;US 6,348,568的SEQ ID NO:1129,1278-1309,1311和1433;US 6,479,055的SEQ ID NO:1-10和210-238;US 6,656,906的SEQID NO:1-171,173-216,218-219,222-228,231,233-366,372-398,400-456,458-498,500-570,572-620,622-651,653-736,739-785,787-811,813-823,825,827-863,865-875,877-883,885,887-890,892-981,986-999,1001-1003,1006-1018,1022-1024,1026-1028,1030-1032,1037-1076,1078-1079,1082-1117,1120-1176,1179-1213,1218-1223,1227-1237,1244-1245,1256-1268,1271-1275,1277,1345-1348,1350-1362,1364,1366,1368,1370,1372,1374-1376,1378-1379,1381-1385,1412-1417,1421-1426,1428-1430,1432,1439-1542,1670-1682,1684-1709,1712-1719,1721-1753,1755-1757;或WO 2005/067960的SEQ ID NO:5-95。所述抗融合肽具有包含5-100个氨基酸、优选10-75个氨基酸和更优选15-50个氨基酸的氨基酸序列。特别优选的抗融合肽是C-34,T-20,T-1249,T-651,T-2635,N-36,(Root,M.J.,等,当代药物设计(Curr.Pharm.Des.)10(2004)1805-1825)和DP-107(Wild,C.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91(1994)12676-12680)和afp-1(SEQ ID NO:29-35以及SEQ ID NO:73)。在一个实施方案中,本发明所述的缀合物包括一个或多个抗融合肽和抗体,其中i)所述抗融合肽是线性的肽,具有5-100个氨基酸的氨基酸序列,和ii)1-8个抗融合肽每一个缀合到所述抗体的重链和/或轻链的一个末端上。在另一个实施方案中,本发明所述的缀合物包括一个或多个抗融合肽和抗体,例如,抗-CCR5抗体(mAb CCR5),其中i)所述抗融合肽来源于gp41的胞外结构域,和ii)1-8个抗融合肽每一个缀合到所述抗体的重链和/或轻链的一个末端上。术语“gp41胞外结构域”表示从HIV-1 gp160的氨基酸位置561起始并且在氨基酸位置620终止的氨基酸序列,或从HIV-1gp41(SEQ IDNO:66)的氨基酸位置50起始并且在氨基酸位置109终止的氨基酸序列(还参见,例如,,S.和Alizon,M.病毒学杂志(J.Virol.)78(2004)811-820)。
术语“抗体”包括抗体结构的不同形式,其包括完整的抗体和抗体片段。本发明所述的抗体优选是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、T细胞抗原缺失(depleted)的抗体(WO 98/33523,WO 98/52976,和WO 00/34317)。抗体的遗传加工,例如,在Morrison,S.L.,等,美国国家科学学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855;美国专利号5,202,238和5,204,244;Riechmann,L.,等,自然(Nature)332(1988)323-327;Neuberger,M.S.,等,自然(Nature)314(1985)268-270;Lonberg,N.,自然生物技术(Nat.Biotechnol.)23(2005)1117-1125中描述。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分,优选的是抗体的可变结构域,或至少是它的抗原结合部分。抗体片段的实例是,例如,单链抗体分子(scFv),Fab,F(ab)2片段,等,只要它们保留抗-CCR5抗体的特征。ScFv抗体,例如,在Huston,J.S.,酶学方法(Methods in Enzymol.)203(1991)46-88中描述。Huston还描述了用于连接对本发明有效的多肽的接头和方法。
“CCR5”意指人CCR5,如,例如在Oppermann,M.,细胞信号(CellSignal.)16(2004)1201-1210和SwissProt P51681中所述的。术语“与CCR5结合的抗体”、“抗-CCR5抗体”或“mAb CCR5”,它们可在本申请中互换使用,意指特异性结合CCR5并且优选地抑制HIV与靶细胞的融合的抗体。结合可以在基于细胞的体外ELISA测定(表达CCR5的CHO细胞)中检测。如果所述抗体在100ng/ml的抗体浓度引起5或更大的、优选10或更大的S/N(信号/噪声)比例,则发现结合。术语“抑制HIV与靶细胞的融合”是指在测定中测量的抑制HIV与靶细胞的融合,所述测定包括,在存在处于有效抑制病毒与所述细胞的膜融合的浓度的抗体的条件下,使所述靶细胞(例如,PBMC)与病毒接触,并且测量例如萤光素酶报告基因活性或HIV p24抗原浓度。术语“膜融合”是指共表达CCR5和CD4多肽的第一细胞和表达HIV env蛋白的第二细胞或病毒之间的融合。膜融合通过报告基因测定(例如,通过萤光素酶报告基因测定)通过遗传加工的细胞和/或病毒确定。
优选的抗-CCR5抗体在下列各项中提到:US 2004/0043033,US 6,610,834,US 2003/0228306,US 2003/0195348,US 2003/0166870,US 2003/0166024,US 2003/0165988,US 2003/0152913,US 2003/0100058,US 2003/0099645,US 2003/0049251,US 2003/0044411,US 2003/0003440,US 6,528,625,US 2002/0147147,US 2002/0146415,US 2002/0106374,US 2002/0061834,US 2002/0048786,US 2001/0000241,EP 1 322 332,EP 1 263 791,EP 1 207 202,EP 1 161 456,EP 1 144 006,WO 2003/072766,WO2 003/066830,WO 2003/033666,WO 2002/083172,WO 02/22077,WO 01/58916,WO 01/58915,WO 01/43779,WO 01/42308,和WO2006/103100。特别优选的抗-CCR5抗体在WO 2006/103100中描述。特别优选的抗-CCR5抗体特征在于,所述抗体包括可变重链结构域,所述可变重链结构域由免疫球蛋白构架和选自由重链CDR3序列SEQ ID NO:16,17组成的组的CDR3区组成。其它优选的抗体包括由下列各项组成的可变重链区:免疫球蛋白构架,和选自由CDR3序列SEQ ID NO:16,17组成的组的CDR3区,选自由CDR2序列SEQ ID NO:13,14,15组成的组的CDR2区,和选自由CDR1序列SEQ ID NO:9,10,11,12组成的组的CDR1区。优选的重链可变结构域显示在SEQ ID NO:1,3,5,7中。优选的抗-CCR5抗体还包括由下列各项组成的可变轻链结构域:免疫球蛋白构架,和选自由CDR1序列SEQ ID NO:18,19,20组成的组的CDR1区,选自由CDR2序列SEQ ID NO:21,22,23组成的组的CDR2区,和选自CDR3序列SEQID NO:24,25的组的CDR3区。优选地,所述抗-CCR5抗体特征在于,包括作为重链CDRs的SEQ ID NO:1的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ IDNO:2的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:3的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:4的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:5的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:6的CDRs,或作为重链CDRs的SEQ IDNO:7的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:8的CDRs。
CDR序列可以按照Kabat,E.A.,等,免疫学目的的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版,公共卫生服务(Public Health Service),美国全国卫生研究院(National Institutes ofHealth),Bethesda,MD(1991)的标准定义确定。SEQ ID NO:1-8的CDRs显示在SEQ ID NO:9-25中。
优选地,所述抗-CCR5抗体包括独立地选自由下列各项组成的组的可变的重链和轻链结构域:
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由SEQ IDNO:2定义的轻链(VL)可变结构域;
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:4定义的轻链可变结构域;
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:6定义的轻链可变结构域;
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:8定义的轻链可变结构域。
“CD4”意指人CD4,如,例如在Brady,R.L.和Barclay,A.N.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.205(1996)1-18和SwissProt P01730中所述。术语“与CD4结合的抗体”、“抗-CD4抗体”或“mAb CD4”,它们可在本申请中互换使用,指特异性结合CD4并且优选地抑制HIV与靶细胞的融合的抗体。结合可以在基于细胞的体外ELISA测定(表达CD4的CHO细胞)中检测。如果被讨论的抗体在100ng/ml的抗体浓度引起5或更大的、优选10或更大的S/N(信号/噪声)比例,则发现结合。术语“抑制HIV与靶细胞的融合”是指在测定中测量的抑制HIV与靶细胞的融合,所述测定包括,在存在处于有效抑制病毒与所述细胞的膜融合的浓度的被讨论的抗体的条件下,使所述靶细胞(例如,PBMC)与病毒接触,并且测量例如萤光素酶报告基因活性或HIV p24抗原浓度。术语“膜融合”是指表达CD4多肽的第一细胞和表达HIV env蛋白的第二细胞或病毒之间的融合。膜融合通过报告基因测定(例如,通过萤光素酶报告基因测定)通过遗传加工的细胞和/或病毒确定。示例性的抗-CD4抗体在,例如Reimann,K.A.,等,艾滋病研究和人反转录病毒(Aids Res.Human Retrovir.)13(1997)933-943,EP 0 512 112,US 5,871,732,EP 0 840 618,EP 0 854 885,EP 1 266 965,US2006/0051346,WO 97/46697,WO 01/43779,US 6,136,310,WO 91/009966中提到。
“CXCR4”意指人CXCR4,如,例如在Feng,Y.,等,科学(Science)272(1996)809-810,或Tamamura,H.和Fujii,N.,关于治疗靶点的专家意见(Expert Opinion on Therapeutic Targets)9(2005)1267-1282中所述。术语“与CXCR4结合的抗体”、“抗-CXCR4抗体”或“mAb CXCR 4”,它们可在本申请中互换使用,指特异性结合CXCR4并且优选地抑制HIV与靶细胞的融合的抗体。结合可以在基于细胞的体外ELISA测定(表达CXCR 4的CHO细胞)中检测。如果被讨论的抗体在100ng/ml的抗体浓度引起5或更大的、优选10或更大的S/N(信号/噪声)比例,则发现结合。术语“抑制HIV与靶细胞的融合”是指在测定中测量的抑制HIV与靶细胞的融合,所述测定包括,在存在处于有效抑制病毒与所述细胞的膜融合的浓度的被讨论的抗体的条件下,使所述靶细胞(例如,PBMC)与病毒接触,并且测量例如萤光素酶报告基因活性或HIV p24抗原浓度。术语“膜融合”是指表达CXCR 4多肽的第一细胞和表达HIV env蛋白的第二细胞或病毒之间的融合。膜融合通过报告基因测定(例如,通过萤光素酶报告基因测定)通过遗传加工的细胞和/或病毒确定。示例性的抗-CXCR4抗体在Strizki,J.M.,等,病毒学杂志(J.Virol.)71(1997)5678-5683(Ab 12G5),US 7,138,496中报道。
“针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体”在本发明内是指与细胞表面受体结合的抗体,所述细胞表面受体由HIV gp120亚基用来调节病毒与细胞的细胞表面的结合,并且因此防止gp120与所述受体的结合以及HIV与细胞表面的结合。HIV gp120来源于前体HIV gp160的蛋白水解分解(参见,例如,Brenneman,D.E.,等,国际神经生物学综述(Int.Rev.Neurobiol.)32(1990)305-353)。这种分解的第二片段是HIV gp41。这两个片段非共价缔合,并且调节HIV与细胞的结合和细胞融合。示例性的细胞表面受体是CD4受体,或趋化因子受体,诸如CCR5受体,CXCR4受体,或CXCR5受体。因此,在一个实施方案中,针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体是抗-CD4抗体,或抗-CCR5抗体,或抗-CXCR4抗体,或抗-CXCR5抗体。
用在本发明所述的缀合物中的抗体优选地特征在于,恒定结构域是人源的。这样的恒定结构域是本领域状态中公知的,并且,例如由Kabat(参见,例如,Johnson,G.,和Wu,T.T.,核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218)描述。例如,有效的人IgG1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)包括独立地选自由SEQ ID NO:26,27组成的组的氨基酸序列。例如,有效的人kappa(κ)轻链恒定结构域包括SEQ ID NO:28的κ轻链恒定结构域(κ轻链恒定结构域,CL)的氨基酸序列。还优选所述抗体的可变结构域是小鼠来源的,并且包括Kabat(参见,例如,Johnson,G.,和Wu,T.T.,核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218)所述的小鼠抗体的抗体可变结构域序列框架。
优选的抗-CCR5抗体表现出与选自由抗体A-E组成的组的抗体结合的CCR5表位相同的CCR5表位,或者由于结合的空间阻碍或竞争性结合而在与CCR5的结合中被抗体A-E抑制。表位结合通过利用丙氨酸扫描按照Olson,W.C.,等.(病毒学杂志(J.Virol.)73(1999)4145-4155)关于表位绘图的方法进行研究。75%或更多的信号减少表明,突变的氨基酸有助于被所述抗体识别的表位。如果有助于所述表位的氨基酸被所研究的抗体和抗体A,B,C,D,或E识别,则发现所述抗体与同一表位的结合。抗体C,其在HIV测定中表现出比抗体2D7更低的IC50值,与包括CCR5 ECL2结构域上的氨基酸的表位相结合(Lee,B.,等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274(1999)9617-9626),所述表位不同于抗体2D7所识别的表位(2D7结合ECL2A的氨基酸K171和E172,而不结合ECL2B氨基酸184-189)。对于CCR5突变体K171A或E172A(glu 172被突变成ala),发现对于抗体C的表位结合是20%。关于野生型CCR5,定义100%的表位结合。其它优选的抗-CCR5抗体与抗体C所结合表位相同的表位相结合。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白决定子。表位通常由分子的化学活性表面基团组成,诸如氨基酸或糖侧链,并且通常具有特异性的三维结构特征,以及特异性的电荷特征。区分构象和非构象的表位,因为在存在变性溶剂的条件下,失去与前者的结合而不是与后者的结合。优选地,本发明所述的抗体特异性结合天然的而不是变性的CCR5。这样的抗体优选地包括SEQ ID NO:17的重链CDR3,并且优选地还包括选自SEQ ID NO:10,11,12,14和/或15的CDRs的组的重链CDRs。优选地,这样的抗体是抗体B,C,D,或E,或者包括抗体B,C,D,或E的可变结构域。优选地,与变性的CCR5结合的抗体是抗体A,或包括抗体A的可变结构域。
术语“可变结构域”(轻链可变结构域(VL),重链可变结构域(VH)),当用于本发明时,指每对轻链和重链结构域的每个结构域,其直接参与抗体与抗原的结合。轻链和重链的可变结构域具有相同的通用结构,即,它们拥有“免疫球蛋白构架”,并且每个结构域包括序列是广泛保守的4个“构架区”(FR),其由3个“高可变区”(或“互补决定区”,CDRs)连接。所述构架区采用β-折叠构象,并且所述CDRs可以形成连接所述β-折叠结构的环。在每条链中的CDRs通过构架区保持在它们的三维结构中,并且与另一条链的CDRs一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和性中起着特别重要的作用,并且因此提供本发明的另一个目的。
术语“抗体的抗原-结合部分”或“抗体的抗原-结合位点”,当用于本发明时,是指抗体负责抗原-结合的氨基酸残基。抗体的抗原-结合位点包括来自“互补决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除超可变区之外的那些可变结构域区域,如本文所定义的。因此,抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括区域FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,和FR4(免疫球蛋白构架)。特别地,重链的CDR3区是最有助于抗原结合的区域,并且限定所述抗体。优选地,本发明所述的抗-CCR5抗体特征在于,在其重链可变结构域中包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的CDR3序列。互补决定簇(CDR)和构架(FR)区按照Kabat,E.A.,等,免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,公共健康服务(Public Health Service),美国全国卫生研究所(NationalInstitutes of Health),Bethesda,MD(1991)的标准定义确定。
抗-CCR5抗体的“Fc部分”不直接参与与CCR5结合,但是表现出各种效应器功能。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列,将抗体或免疫球蛋白分成下列种类:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,并且这些中的一些可以进一步分成亚类(同种型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,IgA1与IgA2。按照重链恒定区,不同种类的免疫球蛋白分别称为α,δ,ε,γ,和μ。本发明所述的抗体优选是IgG类型的。“抗体的Fc部分”是熟练的技术人员公知的术语,并且是依据抗体的木瓜蛋白酶分解而定义的。本发明所述的抗体包含人Fc部分或来源于人源的Fc部分作为Fc部分。在本发明的另一个实施方案中,所述Fc部分是亚类IgG4的人抗体的Fc部分,或者是亚类IgG1,IgG2,或IgG3的人抗体的Fc部分,所述Fc部分以这样的方式进行修饰,以致不能检测到如下文定义的Fcγ受体(例如,FcγRIIIa)结合和/或Clq结合。优选地,所述FC部分是人Fc部分,并且特别优选地是来自人IgG4亚类,或是来自人IgG1亚类的突变的Fc部分。进一步优选的是来自人IgG1亚类具有突变L234A和L235A的Fc部分。进一步优选的是SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,具有突变L234A和L235A的SEQ IDNO:26,具有突变S228P的SEQ ID NO:27中所示的Fc部分。尽管IgG4表现出减少的Fcγ受体(FcγRIIIa)结合,但是其他IgG亚类的抗体表现出强结合。然而,Pro238,Asp265,Asp270,Asn297(缺少Fc糖部分),Pro329,Leu234,Leu235,Gly236,Gly237,Ile253,Ser254,Lys288,Thr307,Gln311,Asn434,和His435是这样的残基,即,如果改变,其也提供减少的Fcγ受体结合(Shields,R.L.,等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604;Lund,J.,等,FASEB杂志(FASEB J.)9(1995)115-119;Morgan,A.,等,免疫学(Immunology)86(1995)319-324;EP0307434)。优选地,本发明所述的抗体是关于IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的Fcγ结合受体,具有L234,L235,和/或D265的突变,和/或含有PVA236突变。优选的是突变S228P,L234A,L235A,L235E,和/或PVA236(PVA236意指IgG1的氨基酸位置233-236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码表示)或者IgG4的EFLG由PVA替代)。特别优选的是IgG4的突变S228P,和IgG1的L234A与L235A。抗体的Fc部分直接参与ADCC(抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体-依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)通过补体因子Clq与大部分IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用而引起。这样的Fc部分结合位点是本领域状态中已知的,并且例如由Lukas,T.J.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560;Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917;Burton,D.R.,等,自然(Nature)288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,等,分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等,病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168;Morgan,A.,等,免疫学(Immunology)86(1995)319-324;和EP 0 307 434。这样的Fc部分结合位点特征在于,例如,氨基酸L234,L235,D270,N297,E318,K320,K322,P331,和P329(按照Kabat的EU指数编号)。亚类IgG1,IgG2,和IgG3的抗体通常表现出补体活化,包括Clq和C3结合,而IgG4不激活补体系统,并且不结合Clq和C3。不结合Fcγ受体和/或补体因子Xlq的抗-CCR5抗体不引发抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。优选地,这种抗体特征在于,它结合CCR5,包含来源于人源的Fc部分,并且不结合Fcγ受体和/或补体因子Clq。更优选地,这种抗体是人的、或人源的、或T-细胞抗原缺失(depleted)的抗体。Clq结合可以按照Idusogie,E.E.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184进行测量。如果在这样的测定中,在492-405nm处关于测试抗体的光学密度(OD)低于以8μg/ml抗体浓度的未修饰的野生型抗体Fc部分的人Clq结合的值的15%,则发现不了“Clq结合”。ADCC可以作为在人NK细胞上所述抗体对于人FcγRIIIa的结合而进行测量。结合在20μg/ml抗体浓度处确定。“没有Fcγ受体结合”或“没有ADCC”意指与人IgG1(SEQ ID NO:26)相同的抗体的结合相比,在20μg/ml的抗体浓度处的在人NK细胞上达到高达30%的与人FcγRIIIa的结合。
另外,用于本发明所述的缀合物中的抗体包括这样的抗体,其具有“保守序列修饰”(变体抗体),其是不影响或不改变本发明所述的抗体的上述特征的氨基酸序列修饰。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入,诸如通过定向诱变和PCR介导的诱变引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的那些。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域内得到了定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸),酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸),具有β-分支的侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸),和具有芳香侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,在人抗-CCR5抗体中预测的非必需氨基酸残基可以优选地由来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基替代。因此,“变体”抗-CCR5抗体,在本发明中是指这样的分子,其在氨基酸序列上与“亲本”抗-CCR5抗体的氨基酸序列不同在于在所述亲本抗体除重链CCR3区域之外的一个或多个可变结构域区域中达到10个、优选约2-约5个添加、删除、和/或取代。每个其他重链CDR区最多包括一个单一的氨基酸添加、删除和/或取代。本发明包括修饰与CCR5结合的亲本抗体的CDR氨基酸序列的方法,所述方法特征在于,从由SEQ ID NO:1,3,5,7,82,83组成的重链可变结构域组选择重链可变结构域和由从由SEQ ID NO:2,4,6,8,76,77组成的轻链可变结构域组选择轻链可变结构域,提供编码所述初始可变结构域氨基酸序列的核酸,修饰所述核酸,其中在重链CDR1中的一个氨基酸被修饰,在重链CDR2中的一个氨基酸被修饰,在轻链CDR1中的1-3个氨基酸被修饰,在轻链CDR2中的1-3个氨基酸被修饰,和/或在轻链CDR3中的1-3个氨基酸被修饰,表达并将所述修饰的可变结构域氨基酸序列结合在抗体结构中,测量所述抗体是否与CCR5结合,并且如果所述抗体与CCR5结合,选择所述修饰的可变结构域/CDR(s)。优选地,这样的修饰是保守序列修饰。氨基酸序列修饰可以通过基于如Riechmann,L.等,自然(Nature)332(1988)323-327,和Queen,C.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)10029-10033所述的分子模拟进行的诱变而进行。
当用于本发明时,术语“接头”或“肽接头”表示天然的和/或合成来源的肽接头。它们构成线性氨基酸链,其中20种天然存在的氨基酸是单聚体构建组件。该链具有1-50个氨基酸的长度,优选地1-28个氨基酸,特别优选3-25个氨基酸的长度。所述接头可以包含重复的氨基酸序列或天然存在的多肽的序列,诸如具有铰链功能的多肽。所述接头具有这样的功能,以确保缀合到抗-CCR5抗体上的肽可以通过允许该肽正确折叠并被正确地呈递而实现它的生物活性。优选地,所述接头是“合成的肽接头”,其指定为富含甘氨酸、谷氨酰胺、和/或丝氨酸残基。例如,这些残基以多达5个氨基酸的小重复单位排列,诸如GGGGS,QQQQG,或SSSSG。这种小的重复单位可以重复2-5次,以形成多聚体单元。在多达6个另外的任意(残基)的多聚体单元的氨基-端和/或羧基-端,可以添加天然存在的氨基酸。其他合成的肽接头由重复10-20次的单个氨基酸组成,例如,在接头SSSSSSSSSSSSSSS中的丝氨酸。在多达6个另外的任意(残基)的氨基-端和/或羧基-端的每一个,可以存在天然存在的氨基酸。优选的接头显示在表2中。特别优选的是下列接头:[GQ4]3GNN(SEQ ID NO:40),LSLSPGK(SEQ ID NO:36),LSPNRGEC(SEQ ID NO:37),LSLSGG(SEQID NO:61),LSLSPGG(SEQ ID NO:62),G3[SG4]2SG(SEQ ID NO:69)。所有的肽接头可以由核酸分子编码,并且因此可以重组表达。由于接头本身是肽,所以抗融合肽通过在两个氨基酸之间形成的肽键而连接到接头上。在抗融合肽和所述抗融合肽要与之缀合的抗-CCR5抗体链之间引入肽接头。因此,分别存在两个或三个可能的序列(以氨基端到羧基端方向):a)抗融合肽-肽接头-抗-CCR5抗体多肽链,或b)抗-CCR5抗体多肽链-肽接头-抗融合肽,或c)抗融合肽-肽接头-抗-CCR5抗体多肽链-肽接头-抗融合肽。
在本发明的一个实施方案中,mAb CCR5-缀合物特征在于包含i)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由SEQ IDNO:2定义的轻链(VL)可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO:4定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO:6定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO:8定义的轻链可变结构域;ii)选自由下列各项组成的组的接头:氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N),三肽GST,和SEQ ID NO:36-62,以及SEQ ID NO:67-70;和iii)选自由SEQ ID NO:29-35,或73定义的肽的组的抗融合肽。
mAb CCR5的重链和/或轻链和抗融合肽的优选的缀合物(“链缀合物”)选自由下列缀合物组成的组:(1)[抗融合肽]-[接头]m-[重链],(2)[重链]-[接头]m-[抗融合肽],(3)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[抗融合肽],(4)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链],(5)[轻链]-[接头]m-[抗融合肽],(6)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[抗融合肽],(7)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[接头]m-[抗融合肽],(8)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[接头]m-[抗融合肽],其中接头可以是相同的或不同的,二者均在所述链缀合物内部和之间,其中m是1或0的整数,并且m可以是独立地相同的或不同的,二者均在所述缀合物内部和之间。例如,在包含链缀合物(7)和mAb CCR5轻链的缀合物中,在链缀合物(7)中的两个接头可以是相同的,即,具有相同的氨基酸序列和长度,或者可以是不同的,即,具有不同的氨基酸序列和/或长度,或者一个或两个可以是不存在的。例如,在包含链缀合物(2)和(4)的缀合物中,链缀合物(2)中包含的接头和链缀合物(4)中包含的接头可以是相同的,即,具有相同的氨基酸序列和长度,或者可以是不同的,即,具有不同的氨基酸序列和/或长度,或者一个或两个可以是不存在的。在链缀合物中,接头可以是存在的(m=1)或不存在的(m=0)。优选的链缀合物是链缀合物(2),(3),(4),和(7)。本发明的一个实施方案是包含2x[mAbCCR5轻链]和2x链缀合物(2)的缀合物。这种缀合物包含两个未缀合的抗-CCR5抗体轻链和通过C-端与抗融合肽的N-端缀合的两个抗-CCR5抗体重链,任选地具有中间的接头。本发明的另一个实施方案是包含两个mAb CCR5轻链和两个链缀合物(3)的缀合物。另一个实施方案是包含两个mAb CCR5重链和两个链缀合物(4)的缀合物。本发明的另一个实施方案是包含两个mAb CCR5轻链和两个链缀合物(7)的缀合物。重链和/或轻链优选地包含恒定区(Fc)。
本发明还提供一种用于制备包含有效量的本发明所述的缀合物和药用载体的药物组合物的方法,和本发明所述的缀合物对于这样的方法的应用。
本发明还提供本发明所述的缀合物以有效量用于制备治疗患有AIDS的患者的药物试剂的应用,优选地与药用载体一起用于制备治疗患有AIDS的患者的药物试剂的应用。
当在本申请中应用时,术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组,其包括丙氨酸(三字母密码:ala,单字母密码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。
在Ausubel,F.M.,编,现代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology),第I-III卷(1997),Wiley和Sons;Sambrook等,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),Cold SpringHarbor,纽约(1989)中描述了本领域的技术人员已知的有效用于实施本发明的方法和技术。
在本发明所述的缀合物中,抗体链的羧基-端氨基酸通过肽键与抗融合肽的氨基-端氨基酸缀合,或者抗融合肽的羧基-端氨基酸通过肽键与抗体链的氨基-端氨基酸缀合。在一个实施方案中,在抗融合肽和抗体链之间存在中间的接头。因此,本发明所述的缀合物特征在于通式:
抗体-[接头]m-[抗融合肽]n
其中m对于每个抗融合肽独立地是0(即,在抗体和抗融合肽之间是直接的肽键)或1(即,在抗体和抗融合肽之间存在接头),并且n是1-8的整数。在一个实施方案中,n是2-8的整数。在另一个实施方案中,n是2-4的整数。在另一个实施方案中,n是整数2或4。本发明的一个实施方案包括这样的缀合物,所述缀合物的特征在于在抗体重链的每个C-端或在轻链的每个N-端包含抗融合肽。在这个实施方案中,两个抗融合肽缀合到一个抗体上。在另一个实施方案中,所述缀合物特征在于在重链的每个C-端和在轻链的每个N-端包含抗融合肽。在这个实施方案中,4个抗融合肽缀合到一个抗体上。在一个实施方案中,所述抗体是mAb CCR5或mAbCD4。
与mAb CCR5相比较,在mAb CCR5重链和/或轻链的末端引入的抗融合肽尺寸是小的。例如,最小的免疫球蛋白,G类免疫球蛋白,具有约150kDa的分子量;抗融合肽优选地具有小于12.5kDa的大小(分子量),这等价于约100个氨基酸,通常小于7.5kDa,这等价于约60个氨基酸。抗融合肽具有5-100个氨基酸残基的氨基酸序列,优选地10-75个氨基酸残基,更优选地15-50个氨基酸残基的氨基酸序列。本发明是缀合物有效用于制药、治疗或诊断应用。可以缀合到mAb CCR5重链和/或轻链上的抗融合肽的数目从1到抗-CCR5抗体多肽链的氨基-和羧基-端的组合的数目。由于本发明包括不同的抗-CCR5抗体,所以抗融合肽的数目可以不同。在包含两个重链和两个轻链的抗-CCR5抗体中,氨基-端(N-端)和羧基-端(C-端)的组合的数目是8,这同时是缀合的抗融合肽的最大总数;例如,在抗-CCR5抗体片段的情形中,诸如在单链抗体(scFv)的情形中,末端组合的数目以及由此缀合的抗融合肽的最大数目是2。如果单个抗融合肽缀合到mAb CCR5上,肽可以占据抗-CCR5抗体链的末端的任何一个。同样地,如果最大可能数目的肽缀合到mAb CCR5上,则所有的末端都被单一的肽占据。如果缀合到mAb CCR5上的肽的数目小于最大可能数目,则肽在抗-CCR5抗体链末端的不同分布是可能的。例如,如果4个肽缀合到G或E类免疫球蛋白上,则可能有5种不同的组合(见表1)。在两种组合中,一种的所有末端,即,抗-CCR5抗体链的所有4个氨基-端或所有4个羧基-端每一个缀合到一个单抗融合肽上。另一个末端不缀合。这在一个实施方案中导致在抗-CCR5抗体的一个区域内的修饰/缀合的分配。在其余情形中,多肽缀合到许多两个末端上。在这些组合中,缀合的肽分配在抗-CCR5可以的不同区域。在每种情形中,缀合的末端的总数是4。
表1:4个肽缀合到由4个多肽链组成的抗-CCR5抗体末端的可能组合
占据的氨基-端数目 | 占据的羧基-端数目 | 占据的末端总数 |
4 | 0 | 4 |
3 | 1 | 4 |
2 | 2 | 4 |
1 | 3 | 4 |
0 | 4 | 4 |
本发明优选地包括这样的缀合物,其中至少两个末端与抗融合肽缀合。所述抗融合肽的氨基酸序列可以是不同的、相似的或相同的。在一个实施方案中,氨基酸序列相同性在90%-低于100%的范围内;这些氨基酸序列和相对应的肽定义为是相似的。在优选实施方案中,所述抗融合肽是相同的,即,具有100%的氨基酸相同性。
本发明包括包含一个或多个抗融合肽和抗-CCR5抗体(mAb CCR5)的缀合物,其中1-8个抗融合肽每一个通过肽键缀合到所述抗-CCR5抗体的重链和/或轻链的一个末端上。在一个实施方案中,本发明所述的缀合物包含至少两个抗融合肽和抗-CCR5抗体,其中2-8个抗融合肽每一个缀合到所述抗-CCR5抗体的重链和/或轻链的一个末端上。
在一个实施方案中,本发明所述的缀合物特征在于,i)包含两个SEQID NO:2的轻链可变结构域,两个(2)型链缀合物,其中每个链缀合物包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ IDNO:33;ii)包含两个SEQ ID NO:4的轻链可变结构域,两个(2)型链缀合物,其中每个链缀合物包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域,接头SEQ IDNO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33;iii)包含两个SEQ ID NO:6的轻链可变结构域,两个(2)型链缀合物,其中每个链缀合物包含SEQ ID NO:5的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33;或iv)包含两个SEQ ID NO:8的轻链可变结构域,两个(2)型链缀合物,其中每个链缀合物包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域,接头SEQ ID NO:40和抗融合肽SEQ ID NO:33。
在抗融合肽和抗-CCR5抗体之间的缀合是在核酸水平上进行的。因此,在抗融合肽和抗-CCR5抗体链之间以有或无中间接头的形式形成肽键。因此,抗融合肽的羧基-端氨基酸以有或无中间接头的形式缀合到抗-CCR5抗体链的氨基-端氨基酸上,或者抗-CCR5抗体链的羧基-端氨基酸以有或无中间接头的形式缀合到抗融合肽的氨基-端氨基酸上,或者抗-CCR5抗体链的两个末端每一个以有或无中间接头的形式缀合到抗融合肽上。对于本发明所述的抗融合肽-抗-CCR5抗体-缀合物的重组生产,需要编码不同多肽的一个或多个核酸分子,优选地利用2-8个核酸分子。这些核酸分子编码所述缀合物的不同的抗-CCR5抗体链,并且在下文叫作结构基因。它们可以位于相同的表达质粒(载体)上,或可以备选地位于不同的表达质粒(载体)上。缀合物的组装优选地在分泌所述缀合物之前并且因此在表达的细胞内进行。因此,编码所述缀合物的多肽链的核酸分子优选地在相同的宿主细胞内表达。如果在重组表达后获得缀合物的混合物,则缀合物可以通过本领域技术人员已知的方法分离和纯化。这些方法是充分确立的,并且广泛用于免疫球蛋白纯化,并且单独的或组合的应用。这样的方法,例如,利用微生物-来源的蛋白的亲和层析(例如,蛋白质A或蛋白质G亲和层析),离子交换层析(例如,阳离子交换(羧基甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换层析),亲硫吸附(例如,利用β-巯基乙醇和其他SH配体),疏水相互作用或芳香吸附层析(例如,利用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂、或m-氨基苯基硼酸),金属螯合亲和层析(例如,利用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料),大小排阻层析,和制备级电泳方法(诸如凝胶电泳,毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,应用生物化学和生物技术(Appl.Biochem.Biotech.)75(1998)93-102)。利用本领域技术人员已知的重组加工技术,缀合物可以在核酸/基因水平上进行特制的加工。编码免疫球蛋白的核酸序列是已知的,并且可以例如从基因组数据库中获得。同样地,编码抗融合肽的核酸序列是已知的,或者可以容易地从它们的氨基酸序列推导出来。构建用于表达本发明的缀合物的表达质粒所需要的元件是,例如,用于以其天然的和/或修饰的和/或缀合的版本的抗-CCR5抗体轻链的表达盒,用于以其天然的和/或修饰的和/或缀合的版本的抗-CCR5抗体重链的表达盒(备选地,所述抗-CCR5抗体轻链和抗-CCR5抗体重链可以包含在同一表达盒内,例如,作为双顺反子表达元件),选择标记,和大肠杆菌(E.coli)复制以及选择单位。这些表达盒包含启动子,编码选择信号序列的DNA片段,结构基因,和终止子/多腺苷化信号。所述元件以可操作连接的形式组装在编码缀合物的所有链的一个质粒上,或者组装在两个或多个质粒上,所述质粒的每一个编码缀合物的一条或多条链。对于所编码的多肽的表达,将质粒引入到适当的宿主细胞中。蛋白优选地在哺乳动物细胞如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、K562细胞、BHK细胞、细胞等中生产。质粒的调节元件必须以它们在所选择的宿主细胞中有功能的方式进行选择。对于表达,将包含编码缀合物的一条或多条链的质粒的宿主细胞在适于所述链的表达的条件下培养。表达的缀合物链功能性组装。完全加工的抗融合肽-抗-CCR5抗体-缀合物分泌到培养基中。
“表达质粒”是编码要在宿主细胞中表达的多肽的核酸。典型地,表达质粒包含原核质粒增殖单元,例如,用于大肠杆菌的,其包含复制起点,和抗性基因,真核选择标记,和用于表达目的结构基因的一个或多个表达盒,所述表达盒包括启动子、结构基因和转录终止子,包括多腺苷化信号。基因表达通常在启动子的控制性进行,并且这样的结构基因据说是“可操作性地连接”到启动子上。类似地,如果调节元件调控核心启动子的活性,则调节元件和核心启动子是可操作性地连接的。
因此,本发明的一个方面是用于生产本发明所述的缀合物的方法,所述方法包括下述步骤:
a)在适于表达所述缀合物的条件下,培养含有一个或多个表达质粒的细胞,所述表达质粒每一个包含编码本发明所述的缀合物的一个或多个核酸分子,
b)从细胞或上清中回收所述缀合物。
术语“在适于所述缀合物表达的条件下”表示这样的条件,所述条件用于培养表达多肽的细胞,并且所述条件是已知的或可以容易地由本领域技术人员确定。本领域技术人员已知这些条件可以取决于被培养的细胞的类型和被表达的多肽的类型而变化。一般地,细胞在例如20℃-40℃的温度下培养,并且持续充分的时间,以足以允许多肽缀合物的有效生产,例如,持续4-28天。
当用于本文时,“药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层(coatings)、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延迟剂等,它们是生理相容的。优选地,载体适于注射或输注。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。将这样的介质和试剂用于药物活性物质是本领域已知的。除了水之外,载体可以是,例如,等渗缓冲的盐溶液。
不管所选择的施用途径,通过本领域技术人员已知的常规方法,将可以以适当的水合形式使用的和/或用在本发明的药物组合物中的本发明的化合物配制成药用剂型。
在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以不同,以获得这样的活性成分的量,所述量对具体的患者、组合物和施用模式有效地实现需要的治疗反应,而对患者无毒性。选择的剂量水平将取决于许多药物代谢动力学因素,包括所用的本发明的具体组合物的活性,施用的途径,施用的时间,被用的具体化合物的排泄率,与所用的具体组合物组合的其他药物、化合物和/或物质,被治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和已有的医疗史等医学领域公知的因素。
本发明优选地包括本发明所述的缀合物用于治疗患有免疫缺陷综合征如AIDS的患者的应用。
提供下述实施例,序列表,附图和保藏,以帮助理解本发明,其真正的范围在后附的权利要求中设定。应该理解,在不背离本发明的精神的条件下,可以在描述的方法中进行修改。
附图描述
图1:mAb CCR5 κ-轻链表达载体4900的质粒图谱。
图2:mAb CCR5 γ1-重链表达载体4901的质粒图谱。
图3:mAb CCR5 γ1-重链缀合物表达载体4995的质粒图谱。
图4:mAb CD4 κ-轻链表达载体6310的质粒图谱。
图5:mAb CD4 γ1-重链表达载体6309的质粒图谱。
图6:mAb CD4 γ1-重链缀合物表达载体6303的质粒图谱。
抗-CCR5抗体保藏
优选的表达mAb CCR5的杂交瘤细胞系保藏在德国的德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH)(DSMZ),所述mAb CCR5有效用于本发明所述的缀合物。
细胞系 | 保藏号 | 保藏日期 |
m<CCR5>Pz01.F3 | DSM ACC 2681 | 18.08.2004 |
m<CCR5>Pz02.1C11 | DSM ACC 2682 | 18.08.2004 |
m<CCR5>Pz03.1C5 | DSM ACC 2683 | 18.08.2004 |
m<CCR5>Pz04.1F6 | DSM ACC 2684 | 18.08.2004 |
抗体命名
<CCR5>Pz01.F3: 抗体A SEQ ID NO:1,2
<CCR5>Pz02.1C11: 抗体B SEQ ID NO:3,4
<CCR5>Pz03.1C5: 抗体C SEQ ID NO:5,6
<CCR5>F3.1H12.2E5:抗体D SEQ ID NO:7,8
<CCR5>Pz04.1F6: 抗体E
mAb CD4的可变结构域1在US 5,871,732中的SEQ ID NO:10,15,45,和56中报道。
mAb CD4的可变结构域2和4在Reimann,K.A.,等,艾滋病研究和人类反转录病毒(Aids Res.Human Retrovir.)13(1997)933-943中报道。
mAb CD4的可变结构域3在WO 91/009966的附图3,4,12,和13中报道。
抗体序列,抗融合肽的序列和肽接头的序列
SEQ ID NO:1<CCR5>Pz01.F3重链,可变结构域
SEQ ID NO:2<CCR5>Pz01.F3轻链,可变结构域
SEQ ID NO:3<CCR5>Pz02.1C11重链,可变结构域
SEQ ID NO:4<CCR5>Pz02.1C11轻链,可变结构域
SEQ ID NO:5<CCR5>Pz03.1C5重链,可变结构域
SEQ ID NO:6<CCR5>Pz03.1C5轻链,可变结构域
SEQ ID NO:7 <CCR5>F3.1H12.2E5重链,可变结构域
SEQ ID NO:8 <CCR5>F3.1H12.2E5轻链,可变结构域
SEQ ID NO:9 重链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:10 重链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:11 重链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:12 重链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:13 重链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:14 重链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:15 重链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:16 重链CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:17 重链CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:18 轻链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:19 轻链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:20 轻链CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:21 轻链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:22 轻链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:23 轻链CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:24 轻链CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:25 轻链CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:26 γ1重链恒定区
SEQ ID NO:27 γ4重链恒定区
SEQ ID NO:28 κ轻链恒定结构域
SEQ ID NO:29 C34
SEQ ID NO:30 T20
SEQ ID NO:31 T1249
SEQ ID NO:32 T651
SEQ ID NO:33 T2635
SEQ ID NO:34 N36
SEQ ID NO:35 DP107
SEQ ID NO:36-62,67-70 接头肽
SEQ ID NO:63 成熟mAb CCR5 κ-轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:64 成熟mAb CCR5 γ1-重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:65 成熟mAb CCR5缀合物重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:66 HIV-1 gp41
SEQ ID NO:71 成熟mAb CD4 κ-轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:72 成熟mAb CD4 γ1-重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:73 afp-1
SEQ ID NO:74 成熟mAb CD4缀合物重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:75 鼠源轻链可变结构域1 mAb CD4
SEQ ID NO:76 嵌合轻链可变结构域1 mAb CD4
SEQ ID NO:77 嵌合轻链1mAb CD4
SEQ ID NO:78 嵌合轻链可变结构域2 mAb CD4
SEQ ID NO:79 嵌合轻链可变结构域3 mAb CD4
SEQ ID NO:80 嵌合轻链可变结构域4 mAb CD4
SEQ ID NO:81 鼠源重链可变结构域1 mAb CD4
SEQ ID NO:82 嵌合重链可变结构域1 mAb CD4
SEQ ID NO:83 嵌合重链1 mAb CD4
SEQ ID NO:84 嵌合重链可变结构域2 mAb CD4
SEQ ID NO:85 嵌合重链可变结构域3 mAb CD4
SEQ ID NO:86 嵌合重链可变结构域4 mAb CD4
SEQ ID NO:87 轻链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:88 轻链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:89 轻链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:90 轻链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:91 轻链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:92 轻链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:93 轻链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:94 轻链CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:95 轻链CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:96 轻链CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:97 重链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:98 重链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:99 重链CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:100 重链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:101 重链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:102 重链CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:103 重链CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:104 重链CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:105 重链CDR3 mAb CD4
表2:接头
No. | 接头肽 | SEQ ID NO: |
1 | LSLSPGK | 36 |
2 | LSPNRGEC | 37 |
3 | [GQ4]3 | 38 |
4 | [GQ4]3G | 39 |
5 | [GQ4]3GNN | 40 |
6 | GGG[SG4]2SGG | 41 |
7 | GGG[SG4]2SGN | 42 |
8 | [SG4]3 | 43 |
9 | [SG4]3G | 44 |
10 | G[SG4]3T | 45 |
11 | [SG4]3GG | 46 |
12 | [SG4]3GGT | 47 |
13 | [SG4]3GGN | 48 |
14 | [SG4]3GAS | 49 |
15 | [SG4]5 | 50 |
16 | [SG4]5G | 51 |
17 | [SG4]5GG | 52 |
18 | [SG4]5GAS | 53 |
19 | G(S)15G | 54 |
20 | G(S)15GAS | 55 |
21 | G | - |
22 | N | - |
23 | GST | - |
24 | [(G)4S]3GAS | 56 |
25 | [(G)4S]3G | 57 |
26 | [(G)4S]5G | 58 |
27 | [(G)4S]3GG | 59 |
28 | [(G)4S]5GG | 60 |
29 | LSLSGG | 61 |
30 | LSLSPGG | 62 |
31 | [G3S]5 | 67 |
32 | [G3S]5GGG | 68 |
33 | G3[SG4]2SG | 69 |
34 | G3[SG4]2SG2 | 70 |
实施例
材料和方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的通用信息在下述中给出:Kabat,E.A.,等,免疫目的的蛋白的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第5版,公共健康服务(Public Health Service),美国全国卫生研究所(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸按照EU编号进行编号(Edelman,G.M.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)63(1969)78-85;Kabat,E.A.,等,免疫目的的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,公共健康服务(Public Health Service),美国全国卫生研究所(NationalInstitutes of Health),Bethesda,MD,(1991))。
重组DNA技术:
利用标准方法操作DNA,如在Sambrook,J.等,分子克隆:实验室手册(Molecular cloning:A laboratory manual);冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约,1989中所述。分子生物学试剂按照供应商的用法说明进行使用。
基因合成:
需要的基因片段从通过化学合成制成的寡核苷酸制备。由单一限制性核酸内切酶分裂位点侧连的100-600bp长的基因片段通过寡核苷酸的退火和连接组装,这包括PCR扩增,并且随后通过A-突出端克隆到pCR2.1-TOPO-TA克隆载体(Invitrogen公司,美国)中。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。
蛋白确定:
缀合物的蛋白浓度通过确定在280nm的光学密度(OD)而确定,其利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数。
实施例1
制备抗-CCR5抗体表达质粒
将编码抗-CCR5抗体轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因片段联合,同样将关于抗-CCR5抗体重链可变结构域(VH)和人γ1-重链恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)的基因片段联合。
在SEQ ID NO:63/64的mAb CCR5的情形中,重链和轻链可变结构域源自小鼠抗体,并且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。
随后,将编码完整的抗-CCR5抗体轻链的基因片段在N-端和/或C-端与编码抗融合肽、包括连接接头序列的核酸连接,和/或将编码完整的抗-CCR5抗体重链的基因片段在N-端和/或C-端与编码抗融合肽、包括连接接头序列的核酸连接。
a)载体4900
载体4900是在HEK293细胞中瞬时表达mAb CCR5轻链(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
除了mAb CCR5 κ-轻链表达盒之外,这种载体还包含:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-埃巴病毒(EBV)的复制起点,oriP,
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
mAb CCR5 κ-轻链基因的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-合成的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-鼠源抗-CCR5抗体成熟可变κ-轻链编码片段,在5’-末端(L2信号序列)排列独特的BsmI限制性位点和剪接供体位点以及在3’-末端的独特的NotI限制性位点,
-人/小鼠κ-轻链杂合内含子2,
-人κ-轻链基因恒定结构域,
-人免疫球蛋白κ-多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-分别在5’-和3’-末端的独特的限制性位点AscI和FseI。
mAb CCR5 κ-轻链表达载体4900的质粒图谱显示在图1中。成熟(无信号序列)mAb CCR5 κ-轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:63中。
b)载体4991
载体4991是在HEK293细胞中瞬时表达mAb CCR5 γ1-重链(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
除了mAb CCR5 γ1-重链表达盒之外,这一载体还包含:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-埃巴病毒(EBV)的复制起点,oriP,
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
mAb CCR5 γ1-重链的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-合成的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-鼠源抗-CCR5抗体成熟可变重链编码片段,在5’-末端(L2信号序列)排列独特的BsmI限制性位点和剪接供体位点以及在3’-末端的独特的NotI限制性位点,
-人/小鼠重链杂合内含子2,其包含小鼠重链增强子元件(片段JH3,JH4)(Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378),
-基因组人γ1-重链基因恒定结构域,
-人γ1-免疫球蛋白多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-分别在5’-和3’-末端的独特的限制性位点AscI和SgrAI。
mAb CCR5 γ1-重链表达载体4901的质粒图谱显示在图2中。成熟(无信号序列)mAb CCR5 γ1-重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:64中。
c)载体4995
载体4995是在HEK293细胞中瞬时表达嵌合的肽-抗-CCR5抗体γ1-重链缀合物(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
载体4995以这样的方式源自质粒4991,即,mAb CCR5 γ1-重链在C-端与编码抗融合肽T-2635(SEQ ID NO:33)和肽接头序列[GQ4]3GNN(SEQ ID NO:40)的核酸连接。
除了嵌合的肽抗-CCR5抗体γ1-重链缀合物表达盒之外,这种载体还包含:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因,
-埃巴病毒(EBV)的复制起点,oriP,
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
嵌合肽-抗-CCR5抗体γ1-重链缀合物的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-合成的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-鼠源抗-CCR5抗体成熟可变重链编码片段,在5’-末端(L2信号序列)排列独特的BsmI限制性位点和剪接供体位点以及在3’-末端的独特的NotI限制性位点,
-人/小鼠重链杂合内含子2,其包含小鼠重链增强子元件(片段JH3,JH4)(Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378),
-基因组人γ1-重链基因恒定结构域,
-抗融合肽T-2635,
-肽接头序列[GQ4]3GNN,
-人γ1-免疫球蛋白多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-分别在5’-和3’-末端的独特的限制性位点AscI和SgrAI。
mAb CCR5 γ1-重链缀合物表达载体4995的质粒图谱显示在图3中。成熟(无信号序列)缀合物重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:65中。
实施例2
制备最终的抗-CCR5抗体表达质粒
利用已知的的重组方法和技术,通过连接所述的核酸片段,组装融合基因(重链和/或轻链抗体融合基因),所述融合基因包含mAb CCR5基因片段,任选的接头基因片段和抗融合肽基因片段。编码肽接头和抗融合多肽的核酸序列分别通过化学合成而合成,并且然后连接到大肠杆菌质粒上用于扩增。亚克隆的核酸序列通过DNA测序进行验证。
实施例3
在HEK293EBNA细胞中瞬时表达免疫球蛋白和免疫球蛋白变体
重组的抗-CCR5抗体和抗-CCR5抗体-变体通过贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达埃巴病毒核抗原的人胚肾细胞系293;美国典型培养物收藏保藏号ATCC # CRL-10852)的瞬时转染而产生,所述细胞培育在补充了10%超低IgG FCS(胎牛血清,Gibco),2mM谷氨酰胺(Gibco),1%体积/体积(v/v)非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基,Gibco)中。对于转染,FuGENETM 6转染试剂(罗氏分子生物化学(RocheMolecular Biochemicals))以3:1-6:1的试剂(μl):DNA(μg)的比例使用。包括抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物轻链和重链的轻链和重链分别从两种不同的质粒表达,使用1:2-2:1的轻链编码质粒:重链编码质粒的摩尔比例。在转染后第4-11天,收集含有抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的细胞培养物上清。关于人免疫球蛋白的重组表达,例如在HEK293细胞中的重组表达的通用信息在Meissner,P.等,生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)75(2001)197-203中给出。
实施例4
利用SDS PAGE,蛋白质印迹转移进行表达分析和利用免疫球蛋白特异性抗体缀合物进行检测
表达的和分泌的抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行处理,并且将分离的抗-CCR5-抗体和抗融合肽-抗-CCR5-抗体-缀合物链从凝胶上转移到膜上,并且随后通过免疫学方法检测。
SDS-PAGE:
LDS样品缓冲液,4倍浓度(4x):4g甘油,0.682g TRIS-碱,0.666gTRIS-盐酸,0.8g LDS(十二烷基硫酸锂),0.006g EDTA(乙二胺四乙酸),0.75ml的在水中1重量%(w/w)Serva蓝G250溶液,0.75ml的1重量%(w/w)酚红溶液,加水制成10ml总体积。
将含有分泌的抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的培养物肉汤离心,以去除细胞和细胞碎片。将澄清上清的等分试样与1/4体积(v/v)的4xLDS样品缓冲液和1/10体积(v/v)的0.5M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后,将样品在70℃温育10分钟,并且通过SDS-PAGE分离蛋白。按照供应商的使用说明使用 Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。特别地,使用10%的 Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和MOPS运行缓冲液。
蛋白质印迹:
转移缓冲液:39mM甘氨酸,48mM TRIS-盐酸,0.04重量%(w/w)SDS,和20体积%甲醇(v/v)。
在SDS-PAGE后,按照Burnette“半干-印迹-方法(Semidry-Blotting-Method)”(Burnette,W.N.,分析生物化学(Anal.Biochem.)12(1981)195-203),将分离的抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物链电泳转移到硝基纤维素滤膜上(孔大小:0.45μm)。
免疫学检测:
TBS-缓冲液:50mM TRIS-盐酸,150mM NaCl,调整到pH 7.5
封闭溶液:在TBS-缓冲液中的1%(w/v)蛋白质印迹封闭试剂(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))
TBST-缓冲液:具有0.05体积%(v/v)吐温-20的1x TBS-缓冲液
对于免疫学检测,将蛋白质印迹膜在室温下在摇动条件下在TBS-缓冲液中温育两次,5分钟,并且在封闭溶液中温育一次,持续90分钟。
肽免疫球蛋白缀合物链的检测:
重链:为了检测抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的重链,利用纯化的缀合到过氧化物酶上的兔抗-人IgG抗体(DAKO,Code No.P 0214)。
轻链:抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的轻链利用纯化的过氧化物酶缀合的兔抗-人κ轻链抗体(DAKO,Code No.P 0129)进行检测。
为了显现抗体轻链和重链,首先,在重链的情形中,将洗涤的和封闭的蛋白质印迹膜用纯化的缀合到过氧化物酶上的兔抗-人IgG抗体温育,或者在轻链的情形中,将洗涤的和封闭的蛋白质印迹膜用纯化的过氧化物酶缀合的兔抗-人κ轻链抗体温育,以1:10,000稀释温育在10ml封闭液中,在4℃在摇动条件下持续过夜。在室温下将所述膜用TBTS-缓冲液洗涤3次并且用TBS缓冲液洗涤一次持续10分钟后,将蛋白质印迹膜用产生化学发光的鲁米诺/过氧化物-溶液显色(Lumi-LightPLUS蛋白质印迹底物,罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))。因此,将所述膜在10ml鲁米诺/过氧化物-溶液中温育10秒-5分钟,并且然后用LUMI-ImagerF1 Analysator(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))检测发射的光,和/或用X-射线膜记录。点的密度用LumiAnalyst软件(Version 3.1)定量。
免疫印迹的多次染色:
通过将所述膜在70℃在含有100mM β-巯基乙醇和20%(w/v)SDS的1M TRIS-盐酸-缓冲液(pH6.7)中温育1小时,可以从染色的印迹上去除用于检测的二级过氧化物酶-标记的抗体缀合物。在这一处理后,所述印迹可以用不同的二级抗体进行第二次染色。在第二次检测之前,将印迹在室温下在摇动条件下在TBS-缓冲液中洗涤3次,每次10分钟。
实施例5
肽免疫球蛋白缀合物的亲和纯化、透析和浓缩
使用蛋白质A-琼脂糖TM CL-4B(GE卫生保健前安玛西亚生物科学(GE Healthcare former Amersham Bioscience),瑞典),按照已知的方法通过亲和层析纯化表达的和分泌的抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物。简言之,在离心(10,000g,10分钟)和通过0.45μm滤器过滤后,将含有肽免疫球蛋白缀合物的澄清的培养物上清上样到蛋白质A-琼脂糖TM CL-4B柱上,该柱用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡。未结合的蛋白用PBS平衡缓冲液和0.1M柠檬酸缓冲液,pH 5.5洗下。抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物用0.1M柠檬酸缓冲液,pH 3.0洗脱,并且含有缀合物的级分用1M TRIS-碱中和。然后,将抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物在4℃针对PBS缓冲液彻底透析,用装有Biomax-SK膜(Millipore公司,美国)的-CL离心滤器部件浓缩,并且保存在0℃的冰-水浴中。所述缀合物的完整性通过在存在和不存在还原剂的条件下的SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色进行分析,如实施例4中所述。抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的聚集通过分析性大小排阻层析进行分析。
实施例6
肽免疫球蛋白缀合物的去糖基化
抗-CCR5抗体和抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的N-连接的碳水化合物通过用肽-N-糖苷酶F(PNGaseF,罗氏分子生物化学(Roche MolecularBiochemicals),Mannheim,德国或Prozyme,San Leandro,CA)酶促处理进行分裂。因此,将抗-CCR5抗体和抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物在37℃用50mU PNGaseF/mg N-糖基化的蛋白在PBS缓冲液中以约2mg/ml的蛋白浓度温育12-24小时。此后,通过制备性凝胶过滤按照已知的方法分离肽-N-糖苷酶F。简言之,将PNGaseF处理的抗-CCR5-抗体和抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物应用到SuperoseTM 12 10/300GL柱(GE卫生保健前安玛西亚生物科学,瑞典)上,该柱用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mMKH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡,然后,利用来自安玛西亚生物科学(Amersham Bioscience)(GE卫生保健前安玛西亚生物科学,瑞典(GE Healthcare former Amersham Bioscience,Sweden))的探测层析系统,用平衡缓冲液以0.5-1.0ml/min的流速洗脱。
实施例7
单周期抗病毒活性测定
为了生产假型NL-Bal病毒,将质粒pNL4-3Δenv(HIV pNL4-3基因组构建体,在env基因内具有缺失)和pCDNA3.1/NL-BAL env[含有NL-Balenv基因的pcDNA3.1质粒(获自艾滋病试剂NIBSC集中机构(NIBSCCentralized Facility for AIDS Reagents))]共转染到HEK 293FT细胞系(Invitrogen)中,在Dulbecco改良的极限培养基(DMEM)中培养,所述极限培养基包含10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,2mM L-谷氨酰胺和0.5mg/mL geniticin(所有介质来自Invitrogen/Gibco)。在转染后2天收集含有假型病毒的上清,并且通过0.45μm孔大小的PES(聚醚砜)滤器(Nalgene)过滤而去除细胞碎片,并且在-80℃以等分试样保存。为了在测定表现中标准化,将病毒储液等分试样用来感染JC53-BL(美国NIH艾滋病试剂项目(US NIH Aids Reagent Program))细胞,产生约1.5 x105RLU(相对光单位(relative light unit))/孔。测试抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物,参照抗体和参照抗融合肽(T-20,T-1249,T-651和T-2635)连续稀释在96-孔平板中。测定以一式四份进行。每个平板包含细胞对照和病毒对照孔。将等价于1.5 x 105RLU的病毒储液加入到每个孔中,然后,向每个孔中加入2.5 x 104JC53-BL细胞,每个孔的最终测定体积是200μl。在37℃,90%相对湿度,和5% CO2温育3天后,吸出培养基,向每个孔中加入50μl的Steady-萤光素酶测定系统(普洛麦格(Promega))。在室温下温育10分钟后,将测定平板在发光计(Luminoskan,热电子公司(Thermo Electron Corporation))上读取。在减去背景后,对每个剂量点计算萤光素酶活性的抑制百分数,并且通过利用Excel XLfit曲线拟合软件(version 3.0.5 Build12;微软)确定IC50和IC90-值。结果显示在表3中。
表3:抗融合多肽、抗体和抗融合肽-抗-CCR5抗体缀合物的抗病毒活性。
实施例8
细胞-细胞融合测定
在第1天,将表达gp160的HeLa细胞(2 x 104细胞/50μl/孔)接种在白色的96微量滴定平板中,处于补充了10% FCS和2μg/ml多西环素的DMEM培养基中。在第2天,将100μl上清样品或抗体对照/孔加入到透明的96微量滴定平板中。然后,加入100μl含有8 x 104 CEM-NKr-Luc悬浮细胞的培养基,并且在37℃温育30分钟。将HeLa细胞培养基从96孔平板吸出,加入来自200μl抗体/CEM-NKr-Luc混合物的100μl,并且在37℃温育过夜。在第3天,加入100μl/孔Bright-GloTM萤光素酶测定底物(1,4-二硫苏糖醇和连二硫酸钠;普洛麦格公司(Promega Corp.),美国),并且在RT温育最少15分钟后测量发光。
材料:
将HeLa-R5-16细胞(在多西环素诱导时表达HIV gp160的细胞系)培养在DMEM培养基中,该培养基包含营养素和10% FCS,具有400μg/mlG418和200μg/ml潮霉素B。CEM.NKR-CCR5-Luc(目录号:5198,一种T-细胞系,可获自NIH艾滋病研究和参考试剂项目McKesson生物服务公司Germantown(NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKessonBioServices Corporation Germantown),MD20874,美国)。细胞类型:转染CEM.NKR-CCR5(Cat.#4376)(电穿孔)以在HIV-2LTR的转录控制下表达萤光素酶基因,并且在含有10%胎牛血清,4mM谷氨酰胺,青霉素/链霉素(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素),和0.8mg/ml geniticin sulfate(G418)的RPMI 1640中增殖。生长特征:圆的淋巴细胞,形态不是非常多变的。细胞以单个细胞悬浮生长,其可以形成小的丛。每周1:10分裂两次。特别特征:在HIV-2 LTR反式激活后表达萤光素酶活性。适于用原代HIV分离株感染,用于中和和药物-敏感性测定(Spenlehauer,C.,等,病毒学(Virology)280(2001)292-300;Trkola,A.,等,病毒学杂志(J.Virol.)73(1999)8966-8974)。该细胞系通过NIH AIDS研究和参考试剂项目,NIAID,NIH获自于John Moore和Catherine Spenlehauer博士。Bright-GloTM萤光素酶测定缓冲液(普洛麦格公司(Promega Corp.)美国,部分号E2264B),Bright-GloTM,萤光素酶测定底物(普洛麦格公司.美国,部分号EE26B)。
实施例9
外周血单核细胞(PBMC)中的抗病毒活性测定。
人PBMC分离自暗黄覆盖层(buffy-coats)(获自斯坦福血液中心),其通过按照供应商的流程进行Ficoll-Paque(安玛西亚(Amersham),Piscataway,新泽西,美国)密度梯度离心而分离。简言之,将血液从暗黄覆盖层转移到50ml锥形管中,并且用无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液(Invitrogen/Gibco)稀释至终体积50ml。将25ml稀释的血液转移到2个50ml的锥形管中,仔细地用12.5ml Ficoll-Paque Plus(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))作为底层,并且在室温下以450xg不减速地离心20分钟。将白色的细胞层仔细地转移到新的50ml锥形管中,并且用PBS洗涤两次。为了去除残留的红细胞,将细胞在室温下用ACK裂解缓冲液(Biosource)温育5分钟,并且再用PBS洗涤一次。计数PBMC,并且在37℃以2-4 x 106细胞/ml的浓度在含有10% FCS(Invitrogen/Gibco),1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,和2μg/ml植物凝集素(Invitrogen)的RPMI1640中培育24小时。在测定之前,将细胞用5单位/ml的人IL-2(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))培育最少48小时。在96孔圆底平板中,在连续稀释的测试肽-免疫球蛋白-缀合物,参照免疫球蛋白和参照肽(T-20,T-1249,T-651和T-2635)存在下,将1 x 105PBMC用HIV-1 JR-CSF病毒(Koyanagi,Y.,等,科学(Science)236(1987)819-822)感染。所用的病毒的量等于1.2ng HIV-1 p24抗原/孔。感染以一式四份建立。平板在37℃温育6天。在感染结束时,通过使用p24 ELISA(HIV-1 p24 ELISA #NEK050B,Perkin Elmer/NEN)利用S型剂量-反应模型,测量病毒产生,所述S型剂量-反应模型在微软Excel Fit(version 3.0.5 Build12;equation 205;微软)中具有一个结合位点。
实施例10
制备抗-CD4抗体表达质粒
将编码抗-CD4抗体轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因片段联合,同样将关于抗-CD4抗体重链可变结构域(VH)和人γ1-重链恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)的基因片段联合。
在SEQ ID NO:71/72的mAb CD4的情形中,重链和轻链可变结构域源自小鼠抗体,其如例如Reimann,K.A.,等,艾滋病研究和人类反转录病毒(Aids Res.Human Retrovir.)13(1997)933-943或在US 5,871,732中所述进行人源化,并且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。
随后,将编码完整的抗-CD4抗体轻链的基因片段在N-端和/或C-端与编码抗融合肽、包括连接接头序列的核酸连接,和/或将编码完整的抗-CD4抗体重链的基因片段在N-端和/或C-端与编码抗融合肽、包括连接接头序列的核酸连接。
a)载体6310
载体6310是一种表达质粒,例如在HEK293细胞中瞬时表达mAb CD4轻链(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
除了mAb CD4 κ-轻链表达盒之外,这种载体还包含:
-作为选择标记的潮霉素抗性基因
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
mAb CD4 κ-轻链基因的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-人抗体种系基因的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-人源化的抗-CD4抗体成熟可变κ-轻链编码片段,在3’-末端排列剪接供体位点和独特的BamHI限制性位点,
-剪截的人κ-轻链内含子2,
-人κ-轻链基因恒定结构域,
-牛生长素(bGH)多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-在3’-末端的独特的限制性位点AscI和SgrAI。
mAb CD4 κ-轻链表达载体6310的质粒图谱显示在图4中。成熟(无信号序列)mAb CD4 κ-轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:71中。
b)载体6309
载体6309是一种表达质粒,例如在HEK293细胞中瞬时表达mAbCD4 γ1-重链(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
除了mAb CD4 γ1-重链表达盒之外,这种载体还包含:
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
mAb CD4 γ1-重链的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-人抗体种系基因的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-人源化的抗-CD4抗体成熟可变重链编码片段,在3’-末端排列剪接供体位点和独特的XhoI限制性位点,
-小鼠/人重链杂合内含子2,
-含有L234A和L235A突变的基因组人γ1-重链基因恒定结构域,
-牛生长素(bGH)多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-在3’-末端的独特的限制性位点SgrAI。
mAb CD4 γ1-重链表达载体6309的质粒图谱显示在图3中。成熟(无信号序列)mAb CD4 γ1-重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:72中。
c)载体6303
载体6303是一种表达载体,例如,在HEK293细胞中瞬时表达嵌合肽-抗-CD4抗体γ1-重链缀合物(基因组组构的表达盒;外显子-内含子组构)的表达质粒。
载体6303以这样的方式源自载体6309,即,mAb CD4 γ1-重链在最后但是一个C-端氨基酸处,即,该重链的C-端赖氨酸残基被去除,与编码抗融合肽afp-1(SEQ ID NO:73)和肽甘氨酸-丝氨酸接头SEQ ID NO:69的核酸连接。
除了嵌合肽抗-CD4抗体γ1-重链缀合物表达盒之外,这种载体包含:
-来自载体pUC18的复制起点,其允许这种质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶基因,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
嵌合肽-抗-CD4抗体γ1-重链缀合物的转录单位由下述元件组成:
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子,
-人抗体种系基因的5’-不翻译区,
-包含信号序列内含子的鼠源免疫球蛋白重链信号序列(信号序列1,内含子,信号序列2[L1-内含子-L2]),
-人源化抗-CD4抗体成熟可变重链编码片段,在3’-末端排列剪接供体位点和独特的XhoI限制性位点,
-小鼠/人重链杂合内含子,其含有L234A和L235A突变,
-肽丝氨酸-甘氨酸接头序列SEQ ID NO:69,
-抗融合肽afp-1 SEQ ID NO:73,
-牛生长素(bGH)多腺苷化(“poly A”)信号序列,和
-在3’-末端的独特的限制性位点SgrAI。
mAb CD4 γ1-重链缀合物表达载体6303的质粒图谱显示在图6中。成熟(无信号序列)缀合物重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:74中。
实施例11
制备最终抗-CD4抗体表达质粒
利用已知的的重组方法和技术,通过连接所述的核酸片段,组装融合基因(重链和/或轻链抗体融合基因),所述融合基因包含mAb CD4基因片段,任选的接头基因片段和抗融合肽基因片段。编码肽接头和抗融合多肽的核酸序列分别通过化学合成而合成,并且然后连接到大肠杆菌质粒上用于扩增。亚克隆的核酸序列通过DNA测序进行验证。
实施例12
在HEK293 EBNA细胞中瞬时表达免疫球蛋白和免疫球蛋白变体
重组的抗-CD4抗体和抗-CD4抗体-变体通过贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达埃巴病毒核抗原的人胚肾细胞系293;美国典型培养物收藏保藏号ATCC # CRL-10852)的瞬时转染而产生,所述细胞培育在补充了10%超低IgG FCS(胎牛血清,Gibco),2mM谷氨酰胺(Gibco),1%体积/体积(v/v)非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基,Gibco)中。对于转染,FuGENETM 6转染试剂(罗氏分子生物化学(RocheMolecular Biochemicals))以3:1-6:1的试剂(μl):DNA(μg)的比例使用。包括抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物轻链和重链的轻链和重链分别从两种不同的质粒表达,使用1:2-2:1的轻链编码质粒:重链编码质粒的摩尔比例。在转染后第4-11天,收集含有抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的细胞培养物上清。关于人免疫球蛋白的重组表达,例如在HEK293细胞中的重组表达的通用信息在Meissner,P.等,生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)75(2001)197-203中给出。
实施例13
利用SDS PAGE,蛋白质印迹转移进行表达分析和利用免疫球蛋白特异性抗体缀合物进行检测
表达的和分泌的抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行处理,并且将分离的抗-CD4-抗体和抗融合肽-抗-CD4-抗体-缀合物链从凝胶上转移到膜上,并且随后通过免疫学方法检测。
SDS-PAGE:
LDS样品缓冲液,4倍浓度(4x):4g甘油,0.682g TRIS-碱,0.666gTRIS-盐酸,0.8g LDS(十二烷基硫酸锂),0.006g EDTA(乙二胺四乙酸),0.75ml的在水中1重量%(w/w)Serva蓝G250溶液,0.75ml的1重量%(w/w)酚红溶液,加水制成10ml总体积。
将含有分泌的抗融合肽-抗-CD 4抗体缀合物的培养物肉汤离心,以去除细胞和细胞碎片。将澄清上清的等分试样与1/4体积(v/v)的4xLDS样品缓冲液和1/10体积(v/v)的0.5M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后,将样品在70℃温育10分钟,并且通过SDS-PAGE分离蛋白。按照供应商的使用说明使用 Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。特别地,使用10%的 Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和 MOPS运行缓冲液。
蛋白质印迹:
转移缓冲液:39mM甘氨酸,48mM TRIS-盐酸,0.04重量%(w/w)SDS,和20体积%甲醇(v/v)。
在SDS-PAGE后,按照Burnette“半干-印迹-方法(Semidry-Blotting-Method)”(Burnette,W.N.,分析生物化学(Anal.Biochem.)12(1981)195-203),将分离的抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物链电泳转移到硝基纤维素滤膜上(孔大小:0.45μm)。
免疫学检测:
TBS-缓冲液:50mM TRIS-盐酸,150mM NaCl,调整到pH 7.5
封闭溶液:在TBS-缓冲液中的1%(w/v)蛋白质印迹封闭试剂(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))
TBST-缓冲液:具有0.05体积%(v/v)吐温-20的1x TBS-缓冲液
对于免疫学检测,将蛋白质印迹膜在室温下在摇动条件下在TBS-缓冲液中温育两次,每次5分钟,并且在封闭溶液中温育一次,持续90分钟。
肽免疫球蛋白缀合物链的检测:
重链:为了检测抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的重链,利用纯化的缀合到过氧化物酶上的兔抗-人IgG抗体(DAKO,Code No.P 0214)。
轻链:抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的轻链利用纯化的过氧化物酶缀合的兔抗-人K轻链抗体(DAKO,Code No.P 0129)进行检测。
为了显现抗体轻链和重链,首先,在重链的情形中,将洗涤的和封闭的蛋白质印迹膜用纯化的缀合到过氧化物酶上的兔抗-人IgG抗体温育,或者在轻链的情形中,将洗涤的和封闭的蛋白质印迹膜用纯化的过氧化物酶缀合的兔抗-人κ轻链抗体温育,温育在10ml封闭液中以1:10,000稀释在4℃在摇动条件下持续过夜。在室温下将所述膜用TBTS-缓冲液洗涤3次并且用TBS缓冲液洗涤一次持续10分钟后,将蛋白质印迹膜用产生化学发光的鲁米诺/过氧化物-溶液显色(Lumi-LightPLUS蛋白质印迹底物,罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))。因此,将所述膜在10ml鲁米诺/过氧化物-溶液中温育10秒-5分钟,并且然后用LUMI-ImagerF1 Analysator(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))检测发射的光,和/或用X-射线膜记录。点的密度用LumiAnalyst软件(Version 3.1)定量。
免疫印迹的多次染色:
通过将所述膜在70℃在含有100mM β-巯基乙醇和20%(w/v)SDS的1M TRIS-盐酸-缓冲液(pH 6.7)中温育1小时,可以从染色的印迹上去除用于检测的二级过氧化物酶-标记的抗体缀合物。在这一处理后,所述印迹可以用不同的二级抗体进行第二次染色。在第二次检测之前,将印迹在室温下在摇动条件下在TBS-缓冲液中洗涤3次,每次10分钟。
实施例14
肽免疫球蛋白缀合物的亲和纯化、透析和浓缩
使用蛋白质A-琼脂糖TM CL-4B(GE卫生保健前安玛西亚生物科学(GE Healthcare former Amersham Bioscience),瑞典),按照已知的方法通过亲和层析纯化表达的和分泌的抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物。简言之,在离心(10,000g,10分钟)和通过0.45μm滤器过滤后,将含有肽免疫球蛋白缀合物的澄清的培养物上清上样到蛋白质A-琼脂糖TMCL-4B柱上,该柱用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mMKCl,pH 7.4)平衡。未结合的蛋白用PBS平衡缓冲液和0.1M柠檬酸缓冲液,pH 5.5洗下。抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物用0.1M柠檬酸缓冲液,pH3.0洗脱,并且含有缀合物的级分用1M TRIS-碱中和。然后,将抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物在4℃针对PBS缓冲液彻底透析,用装有Biomax-SK膜(Millipore公司,美国)的-CL离心滤器部件浓缩,并且保存在0℃的冰-水浴中。所述缀合物的完整性通过在存在和不存在还原剂的条件下的SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色进行分析,如实施例13中所述。抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的聚集通过分析性大小排阻层析进行分析。
实施例15
肽免疫球蛋白缀合物的去糖基化
抗-CD4抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的N-连接的碳水化合物通过用肽-N-糖苷酶F(PNGaseF,罗氏分子生物化学(Roche MolecularBiochemicals),Mannheim,德国或Prozyme,San Leandro,CA)酶促处理进行分裂。因此,将抗-CD4抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物在37℃用50mU PNGaseF/mg N-糖基化的蛋白在PBS缓冲液中以约2mg/ml的蛋白浓度温育12-24小时。此后,通过制备性凝胶过滤按照已知的方法分离肽-N-糖苷酶F。简言之,将PNGaseF处理的抗-CD4-抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物应用到SuperoseTM 12 10/300GL柱(GE卫生保健前安玛西亚生物科学,瑞典)上,该柱用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡,然后,利用来自安玛西亚生物科学(Amersham Bioscience)(GE卫生保健前安玛西亚生物科学,瑞典(GE Healthcare former Amersham Bioscience,Sweden))的探测层析系统,用平衡缓冲液以0.5-1.0ml/min的流速洗脱。
实施例16
单周期抗病毒活性测定
为了生产假型NL-Bal病毒,将质粒pNL4-3Δenv(HIV pNL4-3基因组构建体,在env基因内具有缺失)和pCDNA3.1/NL-BAL env[含有NL-Balenv基因的pcDNA3.1质粒(获自艾滋病试剂NIBSC集中机构(NIBSCCentralized Facility for AIDS Reagents))]共转染到HEK 293FT细胞系(Invitrogen)中,在Dulbecco改良的极限培养基(DMEM)中培养,所述培养基包含10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,2mML-谷氨酰胺和0.5mg/mL geniticin(所有介质来自Invitrogen/Gibco)。在转染后2天收集含有假型病毒的上清,并且通过0.45μm孔大小的PES(polyethersulfone)滤器(Nalgene)过滤而去除细胞碎片,并且在-80℃以等分试样保存。为了在测定表现中标准化,将病毒储液等分试样用来感染JC53-BL(美国NIH艾滋病试剂项目(US NIH Aids Reagent Program))细胞,产生约1.5 x 105RLU(相对光单位)/孔。测试抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物,亲本抗-CD4抗体,参照抗体和参照抗融合肽(T-651)连续稀释在96-孔平板中。测定以一式四份进行。每个平板包含细胞对照和病毒对照孔。将等价于1.5 x 105RLU的病毒储液加入到每个孔中,然后,向每个孔中加入2.5 x 104 JC53-BL细胞,每个孔的最终测定体积是200μl。在37℃,90%相对湿度,和5% CO2温育3天后,吸出培养基,向每个孔中加入50μl的Steady-萤光素酶测定系统(普洛麦格(Promega))。在室温下温育10分钟后,将测定平板在发光计(Luminoskan,热电子公司(Thermo ElectronCorporation))上读取。在减去背景后,对每个剂量点计算萤光素酶活性的抑制百分数,并且通过利用Excel XLfit曲线拟合软件(version 3.0.5 Build12;微软)确定IC50和IC90-值。结果分别显示在表4和5中。
表4:抗融合多肽、抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的抗病毒活性(按重量计)。
表5:抗融合多肽、抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物的抗病毒活性(按摩尔计)。
实施例17
细胞-细胞融合测定
在第1天,将表达gp160的HeLa细胞(2 x 104细胞/50μl/孔)接种在白色的96微量滴定平板中,处于补充了10% FCS和2μg/ml多西环素的DMEM培养基中。在第2天,将100μl上清样品或抗体对照/孔加入到透明的96微量滴定平板中。然后,加入100μl含有8 x 104 CEM-NKr-Luc悬浮细胞的培养基,并且在37℃温育30分钟。将HeLa细胞培养基从96孔平板吸出,加入来自200μl抗体/CEM-NKr-Luc混合物的100μl,并且在37℃温育过夜。在第3天,加入100μl/孔Bright-GloTM萤光素酶测定底物(1,4-二硫苏糖醇和连二硫酸钠;普洛麦格公司(Promega Corp.),美国),并且在RT温育最少15分钟后测量发光。
材料:
将HeLa-R5-16细胞(在多西环素诱导时表达HIV gp160的细胞系)培养在DMEM培养基中,该培养基包含营养素和10% FCS,具有400μg/mlG418和200μg/ml潮霉素B。CEM.NKR-CD4-Luc(目录号:5198,一种T-细胞系,可获自NIH艾滋病研究和参考试剂项目McKesson生物服务公司Germantown(NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKessonBioServices Corporation Germantown),MD 20874,美国)。细胞类型:转染CEM.NKR-CD4(Cat.#4376)(电穿孔)以在HIV-2 LTR的转录控制下表达萤光素酶基因,并且在含有10%胎牛血清,4mM谷氨酰胺,青霉素/链霉素(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素),和0.8mg/ml geniticin sulfate(G418)的RPMI 1640中增殖。生长特征:圆的淋巴细胞,形态不是非常多变的。细胞以单个细胞悬浮生长,其可以形成小的丛。每周1:10分裂两次。特别特征:在HIV-2 LTR反式激活后表达萤光素酶活性。适于用原代HIV分离株感染,用于中和和药物-敏感性测定(Spenlehauer,C.,等,病毒学(Virology)280(2001)292-300;Trkola,A.,等,病毒学杂志(J.Virol.)73(1999)8966-8974)。该细胞系获自NIH AIDS研究和参考试剂项目,NIAID,NIH获自于John Moore和Catherine Spenlehauer博士。Bright-GloTM萤光素酶缓冲液(普洛麦格公司(Promega Corp.)美国,部分号E2264B),Bright-GloTM,萤光素酶测定底物(普洛麦格公司.美国,部分号EE26B)。
实施例18
外周血单核细胞(PBMC)中的抗病毒活性测定。
人PBMC分离自暗黄覆盖层(获自斯坦福血液中心),其通过按照供应商的流程进行Ficoll-Paque(安玛西亚(Amersham),Piscataway,新泽西,美国)密度梯度离心而分离。简言之,将血液从暗黄覆盖层转移到50ml锥形管中,并且用无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液(Invitrogen/Gibco)稀释至终体积50ml。将25ml稀释的血液转移到2个50ml的锥形管中,仔细地用12.5ml Ficoll-Paque Plus(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))作为底层,并且在室温下以450xg不减速地离心20分钟。将白色的细胞层仔细地转移到新的50ml锥形管中,并且用PBS洗涤两次。为了去除残余的红细胞,将细胞在室温下用ACK裂解缓冲液(Biosource)温育5分钟,并且再用PBS洗涤一次。计数PBMC,并且在37℃以2-4 x 106细胞/ml的浓度在含有10% FCS(Invitrogen/Gibco),1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,和2μg/ml植物凝集素(Invitrogen)的RPMI1640中培育24小时。在测定之前,将细胞用5单位/ml的人IL-2(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))培育最少48小时。在96孔圆底平板中,在连续稀释的测试抗融合肽-抗-CD4抗体-缀合物,参照免疫球蛋白、亲本抗-CD4抗体和参照肽(T-651)存在下,将1 x 105 PBMC用HIV-1JR-CSF病毒(Koyanagi,Y.,等,科学(Science)236(1987)819-822)感染。所用的病毒的量等于1.2ng HIV-1 p24抗原/孔。感染以一式四份建立。平板在37℃温育6天。在感染结束时,通过使用p24 ELISA(HIV-1 p24 ELISA#NEK050B,Perkin Elmer/NEN)利用S型剂量-反应模型,测量病毒产生,所述S型剂量-反应模型在微软Excel Fit(version 3.0.5 Build 12;equation205;微软)中具有一个结合位点。
表6:抗融合多肽、抗体和抗融合肽-抗-CD4抗体缀合物(按重量计)的抗病毒活性。
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>针对CCR5的抗体和抗融合肽的缀合物
<130>23883 WO
<150>EP 06017156.8
<151>2006-08-17
<150>EP 07014335.9
<151>2007-07-20
<150>EP 06020647.1
<151>2006-09-29
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PCT/RO/134表的中文译文
PCT/EP2007/007164
申请人或代理机构文件参考23883 WO-ASK | 国际申请号PCT/EP2007/007164 |
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示
(PCT细则13bis)
C.附加指示(附页)
申请人: 霍夫曼-拉罗奇有限公司,等
申请人文件参考号:23883 WO-ASK
国际申请号: PCT/EP2007/007164
关于说明书引用的保藏生物材料的专家解决方案相关的指示
涉及保藏的生物材料的指示全部包含在说明书中。下列另外的指示不要求是说明书的一部分,并且应当作为“分开的指示”对待。它们仅涉及专家解决方案。
以下作出的另外的指示涉及在说明书第32页(注:中文第30页)中称为:
m<CCR5)>Pz01.F3 DSM ACC2681
m<CCR5)>Pz02.1C11 DSM ACC2682
m<CCR5)>Pz03.1C5 DSM ACC2683
m<CCR5)>Pz04.1F6 DSM ACC2684
的保藏的生物材料。
另外的指示是:
对于CA(加拿大)指定:
对于加拿大的指定,按照加拿大专利法案专利细则第107和108条规定,只有通过将样品签发给局长提名的独立专家(细则10(4)),直到授予加拿大专利,或直到申请被驳回或被放弃且不再要求恢复、或被撤回的日期,才可以提供保藏的生物材料的样品。
对于EP(欧专局)指定:
关于EPO的指定,按照EPC实施细则的细则28(3)的规定,只有通过将样品签发给请求人提名的专家(细则28(4)EPC),直到欧洲专利授权通知公开,或者如果申请被驳回或撤回或视撤,直至从申请日起20年,才可以提供保藏的生物材料的样品。
对于SG(新加坡)指定:
申请人由此提请注意,我们意欲根据1995年专利法则目录四的第3段,上述培养物仅可提供给专家。
Claims (26)
1.包含一个或多个抗融合肽和针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体的缀合物,所述缀合物的特征在于,1-8个抗融合肽的每一个缀合到所述针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体的重链和/或轻链的一个末端上。
2.权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体与2个或4个抗融合肽缀合。
3.权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述针对结合HIV gp120的细胞表面受体的抗体是抗-CCR5抗体(mAb CCR5)。
4.权利要求3所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体的至少两个末端的每一个与抗融合肽缀合。
5.权利要求3所述的缀合物,其特征在于,所述抗融合肽是线性肽,并且包含5-100个氨基酸的氨基酸序列。
6.权利要求3-5中任一项所述的缀合物,其特征在于通式mAb CCR5-[接头]m-[抗融合肽]n,其中m对于每个抗融合肽独立地是0或1,并且n至多是1-8的整数。
7.权利要求6所述的缀合物,其特征在于,所述缀合物包括mAb CCR5的重链和/或轻链和抗融合肽的缀合物(“链缀合物”),其选自由下列各项组成的组:
(1)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]
(2)[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(3)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[抗融合肽]
(4)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]
(5)[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
(6)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[抗融合肽]
(7)[抗融合肽]-[接头]m-[重链]-[接头]m-[抗融合肽]
(8)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[接头]m-[抗融合肽]
其中所述接头可以是相同的或不同的,其中m是1或0的整数,并且m可以独立地是相同的或不同的。
8.权利要求7所述的缀合物,其特征在于包括链缀合物(2),(3),(4),或(7)。
9.权利要求7所述的缀合物,其特征在于包含2x[mAb CCR5轻链]和2x(2),2 x[mAb CCR5轻链]和2 x(3),2 x[mAb CCR5重链]和2 x(4),或2 x[mAb CCR5轻链]和2 x(7)。
10.权利要求3-9中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗融合肽选自由SEQ ID NO:29-35和SEQ ID NO:73定义的肽的组。
11.权利要求3-10中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含由免疫球蛋白构架和CDR3区组成的可变重链结构域,所述CDR3区选自由重链CDR3序列SEQ ID NO:16,17组成的组。
12.权利要求3-11中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含由下列各项组成的可变重链结构域:免疫球蛋白构架,和选自由重链CDR3序列SEQ ID NO:16和17组成的组的CDR3区,选自由重链CDR2序列SEQ ID NO:13,14,和15组成的组的CDR2区,和选自由重链CDR1序列SEQ ID NO:9,10,11,和12组成的组的CDR1区。
13.权利要求3-12中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含选自SEQ ID NO:1,3,5,和7的组的重链可变结构域。
14.权利要求3-13中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含由下列各项组成的可变轻链结构域:免疫球蛋白构架,和选自SEQ ID NO:18,19,和20的CDR1区,选自SEQ ID NO:21,22,和23的CDR2区,和选自SEQ ID NO:24,和25的CDR3区。
15.权利要求3-14中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含作为重链CDRs的SEQ ID NO:1的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:2的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:3的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:4的CDRs,作为重链CDRs的SEQ ID NO:5的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:6的CDRs,或作为重链CDRs的SEQ ID NO:7的CDRs和作为轻链CDRs的SEQ ID NO:8的CDRs。
16.权利要求3-15中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含独立地选自由下列各项组成的组的可变重链结构域和可变轻链结构域:
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由SEQ ID NO:2定义的轻链(VL)可变结构域;
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:4定义的轻链可变结构域;
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:6定义的轻链可变结构域;
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由SEQ IDNO:8定义的轻链可变结构域。
17.权利要求3-16中任一项所述的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的重链(VH)可变结构域和由SEQ ID NO:2定义的轻链(VL)可变结构域;由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:4定义的轻链可变结构域;由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:6定义的轻链可变结构域;或由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO:8定义的轻链可变结构域;
选自由氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)、三肽GST、以及SEQ IDNO:36-62和SEQ ID NO:67-70组成的组的接头;和
选自由SEQ ID NO:29-35和SEQ ID NO:73定义的肽的组的抗融合肽。
18.权利要求3-16中任一项所述的缀合物,其特征在于,其包含选自SEQ ID NO:29-35和SEQ ID NO:73的组的抗融合肽。
19.权利要求3-18中任一项所述的缀合物,其特征在于,其包含两个SEQ ID NO:2的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,每个包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域,SEQ ID NO:40的接头和SEQ ID NO:33的抗融合肽,特征在于包含两个SEQ ID NO:4的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,每个包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域,SEQ ID NO:40的接头和SEQ IDNO:33的抗融合肽,特征在于包含两个SEQ ID NO:6的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,每个包含SEQ ID NO:5的重链可变结构域,SEQ IDNO:40的接头和SEQ ID NO:33的抗融合肽,或特征在于包含两个SEQ IDNO:8的轻链可变结构域,两个(2)型缀合物,每个包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域,SEQ ID NO:40的接头和SEQ ID NO:33的抗融合肽。
20.权利要求3-19中任一项的缀合物,其特征在于,所述抗-CCR5抗体是IgG4亚类的,或者是IgG1或IgG2亚类的,具有在氨基酸S228,L234,L235和/或D265的突变,和/或包含PVA236突变。
21.权利要求20所述的缀合物,其特征在于,所述IgG4亚类的抗-CCR5抗体具有突变S228P,并且所述IgG1亚类的抗-CCR5抗体具有L234A和L235A突变。
22.一种生产权利要求1-21中任一项所述的缀合物的方法,其特征在于所述方法包括:
a)在适于表达所述缀合物的条件下,培育包含一种或多种质粒的细胞,所述质粒含有编码权利要求1-21所述的缀合物的一个或多个核酸分子,
b)从所述细胞或细胞培养上清中回收所述缀合物。
23.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1-21中任一项所述的缀合物,以及药用赋形剂或载体。
24.权利要求1-21中任一项所述的缀合物用于制备治疗病毒感染的药物中的应用。
25.权利要求24所述的应用,其特征在于所述病毒感染是HIV感染。
26.权利要求1-21中任一项所述的缀合物在治疗需要抗病毒治疗的患者中的应用。
Applications Claiming Priority (4)
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Country Status (1)
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CN (1) | CN101500615A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023030315A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 康霖生物科技(杭州)有限公司 | 一种用于艾滋病病毒感染基因治疗的基因序列构建体 |
WO2023030312A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 康霖生物科技(杭州)有限公司 | 一种用于艾滋病病毒感染基因治疗的基因序列构建体 |
WO2024008177A1 (en) * | 2022-07-08 | 2024-01-11 | Nanjing Curegene Technology Co., Ltd. | Engineered cells and uses thereof |
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2007
- 2007-08-14 CN CNA2007800294874A patent/CN101500615A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2023030315A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 康霖生物科技(杭州)有限公司 | 一种用于艾滋病病毒感染基因治疗的基因序列构建体 |
WO2023030312A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 康霖生物科技(杭州)有限公司 | 一种用于艾滋病病毒感染基因治疗的基因序列构建体 |
WO2024008177A1 (en) * | 2022-07-08 | 2024-01-11 | Nanjing Curegene Technology Co., Ltd. | Engineered cells and uses thereof |
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