CN102206272B - 生产重组α1-抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供生产复性的α1-抗胰蛋白酶(AAT)的方法。复性方法包括首先将变性的重组AAT多肽在高pH的离液剂中溶解,接着是在所设定的条件下复性,复性过程包括在低浓度的离液剂和聚乙二醇(PEG),甘油或蔗糖,或去污剂中缓慢的降低pH或者保持一定的pH。
Description
技术领域
本发明涉及到生产重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽的方法。
背景技术
嗜中性粒细胞(Neutrophils)可以通过毛细孔不受阻碍的进入肺;他们是肺内免疫系统抵抗入侵致病微生物的重要的免疫中介。发炎反映的一个结果是嗜中性粒细胞释放出广谱的防卫分子,包括反应性种类的氧分子,阳离子多肽,类二十烷酸,和蛋白酶。(Lee et al.,Am.J.Perspir.Crit.Care Med.164:896-904,2001.)需要注意的是,这些分子的失控释放可以导至严重的肺损坏。
人白细胞弹力蛋白酶(HLE),亦称为人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),是一个在正常炎症反应中从嗜中性粒细胞的嗜苯胺篮颗粒释放出的丝氨酸蛋白酶(Shapiro,Eur.Respir.J.Suppl.44:30s-32s,2003.)。在正常的体内平衡的条件下,α1-抗胰蛋白酶(AAT)充当一个对HLE蛋白水解的重要调控剂,从而防止了对肺胞细胞基质的破坏。AAT是一个主要在肝细胞内合成的53KD的糖蛋白,但也在嗜中性粒细胞,单核细胞,和巨噬细胞内合成。AAT合成后分泌到血浆中,但它的主要作用部位是肺软细胞组织(Moragaet al.,J.Biol.Chem.275:7693-7000,2000.)。除了HLE,AAT也抑制由嗜中性粒细胞释放到肺中的其他两个蛋白酶:组织蛋白酶G(catG)和蛋白酶3(Pr3)。CatG和Pr3可能也通过降解弹力素和其他细胞外蛋白造成肺损坏。AAT可能防止这种损坏。然而HLE蛋白酶被认为是造成肺损坏的元凶(Korkmaz et al.,Amer.J.Resp.Cell Mol.Biol.32:553-559,2005.)。
由于HLE和可能的其他蛋白酶的失控作用,AAT遗传缺乏使患者易罹患早期遗传性肺气肿(Crystal et al.,Hosp.Pract.(Off Ed).26(2):81-4,88-9,93-4;1991.)。为了恢复肺的正常功能和缓解遗传性肺气肿,必须进行大量的和频繁的AAT注射。现在市场上的AAT是从合并的血清分离出来(例如ZemairaRTM,ProlastinRTM),但面临着供不应求的局面。由于市场供给的限制,AAT还没有被适当的验证在其他呼吸症方面的应用。AAT可能亦可用于治疗因吸烟,囊肿性纤维化,肺高压,肺纤维症,及慢性阻塞性肺疾病(COPD)等所造成的肺气肿(Cantin et al.,J.Aerosol.Med.15:141-148,2002;Cowan etal.,Nat.Med.6:698-702,2000;Obayashi et al.Chest 112:1338-1343,1997.)。
人AAT是一个已经被克隆并在包括大肠杆菌和真菌表达系统内表达的包含394个氨基酸的蛋白(Bollen et al.,DNA 2:255-264,1983;Kurachi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:6826-6830,1981;Johansen et al.,Mol.Biol.Med.4:291-305,1987;Kwon et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1247:179-184,1995.)。据报道删除人AAT的前5个或者10个氨基酸导致在大肠杆菌中的高表达,并且所产生的删除N-端的AAT衍生物表现出与真正的人AAT等同的抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶的比活力(Johansen et al.,Mol.Biol.Med.4:291-305,1987.)。人AAT表达为一个418个氨基酸的前体,然后24个氨基酸前体被切除,从而产生394个氨基酸的最终产物。AAT的天然产物有3个糖基化位点。自然型和有些疾病类型的2.0埃的AAT的晶体结构已经解出并进行了深入的研究(Elliottet al.,Protein Sci.9:1274-1281,2000.)。
因为如大肠杆菌的原核细胞缺乏将蛋白糖基化的生化机理,所以大肠杆菌生产的AAT没有糖基化。研究证明非糖基化AAT在体内半衰期较糖基化的减少6倍,限制了它的医疗效果(Weber et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.126(1):630-5,1985.)。文献报导,很多生物分子的体内半衰期可以通过聚乙二醇化(pegylation)延长,并且在Cys232的聚乙二醇化延长了AAT的半衰期(Cantin et al.,Am.J Respir.Cell Mol.Biol.27:659-665,2002;Graddis et al.,Curr.Pharm.Biotechnol.3(4):285-97,2002;Molineux,Cancer Treat.Rev.28 Suppl A:13-6,2002.)。
大肠杆菌表达的包涵体复性方法已经发表。请见例证:U.S.Pat.No.6,583,268;U.S.Pub.Nos.US 2003/070242;US 2003/0199676;US 2004/0265298;和US 2005/0227920;和PCT Pub.Nos.WO 03/039491;WO 2004/094344;WO 01/55174;WO 2005/05830。
在此引用的所有专利、专利申请和出版物均全文引入作为参考。需要指出的是,本发明背景部分中参考某一出版物并不表示承认所述出版物构成了本发明所指的现有技术。
发明概述
本发明提供生产具有生物活性的α1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽的新的复性方法。本方法用少数步骤,即可利用变性的AAT多肽产生正确复性的,具有高度活性的AAT多肽。在某些实施例中,此方法利用原始的细菌生产的AAT多肽(从细胞糊状物或包涵体)生产正确复性的,高活性的AAT多肽。
在某一方面,本发明提供生产复性的重组AAT多肽的方法,包括:a)用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂和还原剂,并且其具有约8.5到约11.0的pH,由此产生溶解的AAT多肽溶液;b)通过将上述溶解的AAT多肽溶液加至复性缓冲液中的方法将上述溶解的AAT多肽溶液快速稀释,由此产生稀释 的溶解的AAT多肽溶液。其中的复性缓冲液包含Tris、甘油、蔗糖、或聚乙二醇(PEG),或者上述的任何组合;及c)将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至约7.5到约8.5,其中所述pH的降低用至少约20小时完成,由此产生了复性的AAT多肽。
在某些实施例中,离液剂为尿素,其浓度可以为约8M。在另外的实施例中,离液剂为盐酸胍,其浓度可以为约6M。
在某些实施例中,利用复性缓冲液将溶解的AAT多肽溶液稀释约20倍。
在某些实施例中,复性缓冲液中包含Tris作为缓冲液。在某些实施例中,复性缓冲液包含甘油,蔗糖,或其任何组合。例如,复性缓冲液可以包含约5%至约30%的甘油,约5%至约40%的蔗糖,或约10%的甘油和约10%的蔗糖。在某些实施例中,复性缓冲液包含聚乙二醇(PEG)。在某些实施例中,PEG的分子量是约200至约20,000道尔顿。在某些实施例中,PEG的分子量是约200道尔顿。在某些实施例中,PEG的分子量是约600道尔顿。在某些实施例中,复性缓冲液可以进一步包含去污剂,例如吐温-20,吐温-80,脱氧胆酸钠,胆酸钠,和氧化三甲胺(TMSO)。
在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液约为pH 8.5至约为pH 10.8。在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液约为pH 10.0至约为pH 10.8。在某些实施例中,溶解缓冲液和/或复性缓冲液约为pH 8.5,约为pH 9.0,约为pH 10,约为pH 10.5,或约为pH 10.8。在某些实施例中,溶解缓冲液和复性缓冲液具有等同的pH。
在某些实施例中,将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至约8.0。
在某些实施例中,此方法进一步包含在用复性缓冲液稀释溶解的AAT多肽溶液之前,用溶解缓冲液II调解溶解的AAT多肽溶液的A280到约2.0至约10.0(例如约2.0至约5.0)。
在一个示例性的实施例中,生产复性的重组AAT多肽的方法包括:a)用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,所述溶解缓冲液包含约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约1mM EDTA,约100mMβ-巯基乙醇,约pH 10.5,由此产生溶解的AAT多肽溶液;b)用溶解缓冲液II调解溶解的AAT多肽溶液的A280到约2.0。此溶解缓冲液II包含约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约1mM EDTA,约10mMβ-巯基乙醇,约10mM二硫苏糖醇(DTT),约1mM还原的谷胱甘肽(GSH),并且其pH约为10.5;c)通过将上述调解后的溶解的AAT多肽溶液加至约20倍体积的复性缓冲液中的方法将上述溶解的AAT多肽溶液快速稀释,此复性缓冲液包含约20mM Tris,pH约10.5,及任何的1)约10%至约30%甘油,2)约10%至约30%蔗糖,3)约20%甘油和约20%蔗糖,4)约10%甘油和约10%蔗糖,和5)约5%至约10%聚乙二醇(PEG);和d)将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至约7.6,其中所述pH的降低用至少约20小时至4天完成,由此产生了复性的AAT多肽。在某些变更中,复性缓冲液进一步包含约0.005%至约0.02%吐温-20(Tween 20)。
在另一个示例性的实施例中,生产复性的重组AAT多肽的方法包括:a)用pH 10.5的溶解缓冲液II溶解变性的AAT多肽,由此产生溶解的AAT多肽溶液;b)通过将上述溶解的AAT多肽溶液加至约20倍体积的复性缓冲液中的方法将上述溶解的AAT多肽溶液快速稀释,此复性缓冲液包含约20mM Tris和约20%蔗糖,pH约10.5;和c)将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至约7.6,其中所述pH的降低用至少约20小时完成,由此产生了复性的AAT多肽。
在另一方面,本发明亦提供生产复性的重组AAT多肽的方法,包括:a)用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂和还原剂,并具有pH约8.5至约10.5,由此产生溶解的AAT多肽溶液;b)用pH约8.5至约10.5的复性缓冲液稀释溶解的AAT多肽溶液,由此产生稀释的溶解的AAT多肽溶液,其中的复性缓冲液包含甘油,蔗糖,或聚乙二醇(PEG),或任何组合;c)将稀释的溶解的AAT多肽溶液在约16℃至约20℃孵育至少约16小时;d)将稀释的溶解的AAT多肽溶液在约4℃进一步孵育约24至约72小时;和e)将稀释的溶解的AAT多肽溶液交换成具有pH约7.5至约8.5的缓冲液,由此产生复性的AAT多肽。在某些变通中,在步骤e)中的缓冲液具有与复性缓冲液相同的配方。
在某些实施例中,本方法进一步包括在步骤e)之前浓缩稀释的溶解的AAT多肽溶液的方法。例如,可以用超滤浓缩方法将AAT多肽溶液浓缩10-200倍。在某些变通中,步骤e)可以通过透析或分子排阻色谱法实现。
在某些实施例中,离液剂是约8M浓度的尿素。在其他实施例中,离液剂是约6M浓度的盐酸胍。
在某些实施例中,以约20倍的比例将溶解的AAT多肽溶液稀释到复性缓冲液中。
在某些实施例中,复性缓冲液包含Tris作为缓冲。在某些实施例中,复性缓冲液包含甘油,蔗糖,或其任何组合。例如,复性缓冲液可以包含约5%至约20%甘油,约10%至约20%蔗糖,或约10%甘油和约10%蔗糖。在某些变通中,复性缓冲液包含聚乙二醇(PEG)。在某些变通中,PEG的分子量为约200至约20,000道尔顿。在某些变通中PEG的分子量为约200道尔顿。在某些实施例中,PEG的分子量为约200至约20,000道尔顿。在某些实施例中PEG的分子量为约600道尔顿。在某些实施例中,复性缓冲液可以进一步包含一种或几种去污剂,如吐温-20(Tween 20),吐温-80(Tween80),脱氧胆酸钠,胆酸钠,和氧化三甲胺(TMSO)。
在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液的pH约为8.5。在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液的pH约为9.0。在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液的pH约为9.5。在某些实施例中,溶解缓冲液或复性缓冲液的pH约为10.0。在某些实施例中,溶解缓冲液和复性缓冲液的pH等同。
在某些实施例中,此方法进一步包含在用复性缓冲液稀释溶解的AAT多肽溶液之前用溶解缓冲液II将溶解的AAT多肽溶液的A280调节为约2.0至约10.0(例如约2.0至约5.0)。
在一个例证性的实施例中,生产复性的重组AAT多肽的方法包括:a)用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,所述溶解缓冲液包含约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约1mM EDTA,约100mMβ-巯基乙醇,约pH 10.5,由此产生溶解的AAT多肽溶液;b)用溶解缓冲液II调解溶解的AAT多肽溶液的A280到约2.0。此溶解缓冲液II包含约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约1mM EDTA,约10mMβ-巯基乙醇,约10mM二硫苏糖醇(DTT),约1mM还原的谷胱甘肽(GSH),并且其pH约为10.5;c)通过将上述溶解的AAT多肽溶液加至约20倍体积的复性缓冲液中的方法将上述溶解的AAT多肽溶液快速稀释,此复性缓冲液包含约20mM Tris,pH约10.5,及任何的1)约10%至约30%甘油,2)约10%至约30%蔗糖,3)约20%甘油和约20%蔗糖,4)约10%甘油和约10%蔗糖,和5)约5%至约10%聚乙二醇(PEG);d)在20℃将稀释的溶解的AAT多肽溶液孵育至少16小时;e)进一步在4℃将稀释的溶解的AAT多肽溶液孵育约24至约72小时;f)用超滤法将稀释的溶解的AAT多肽溶液浓缩;和g)用分子筛色谱法将稀释的溶解的AAT多肽溶液交换为具有约20mM Tris,约0.2MNaCl,约10%甘油或约15%蔗糖,约1mM DTT,约pH 7.6的缓冲液,由此产生复性的AAT多肽。在某些实施例中,复性缓冲液和在步骤g)中的缓冲液进一步包含约0.005%的吐温-20(Tween 20)。
下面的实施例可以应用于此处所描述的任何方法。
在某些实施例中,AAT多肽是人的AAT多肽(SEQ ID NO:1)。在某些实施例中,在SEQ ID NO:1中的氨基酸1-15的氨基酸残基被删除。对于N-端删除的AAT多肽,为了在大肠杆菌内表达,将蛋氨酸加在N-端作为第一个氨基酸。在某些实施例中,AAT多肽包含SEQ ID NO:1中的氨基酸2-394,3-394,4-394,5-394,6-394,7-394,8-394,9-394,10-394,或11-394。在某些实施例中,AAT多肽包含SEQ ID NO:3中的序列。
在某些实施例中,此方法进一步包括用化学修饰法将聚乙二醇(PEG)连接到AAT多肽上的方法。在某些实施例中,将聚乙二醇(PEG)分子连接到AAT多肽的Cys232氨基酸上,其中的氨基酸Cys232是基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中,聚乙二醇(PEG)分子具有分子量约为20kD至约为40kD。
本发明方法在起始的过程中可以包含附加的步骤。因此在某些实施例中本方法包括在初始步骤中溶解包含变性的AAT多肽细菌宿主细胞并收集变性的AAT多肽。某些附加的实施例也包括洗涤变性的AAT多肽。
本发明方法在结束的过程中亦可以包含附加的步骤。因此在某些实施例中本方法亦包括纯化复性的AAT多肽,例如用分子排阻色谱(SEC),阴离子交换色谱,疏水交换色 谱,或任何这些步骤的组合。比如SEC后进行阴离子交换,及进一步进行疏水交换色谱,及根据需要交换这些步骤的任何次序。
本发明亦提供将正确复性的AAT多肽从不正确复性的或非复性的AAT多肽中纯化出来的方法,此方法包括:a)在盐的作用下将不正确复性的或非复性的AAT多肽与疏水作用层析树脂结合;和b)收集没有同树脂结合的正确复性的AAT多肽。在某些实施例中,其中所述的盐是硫酸铵[(NH4)2SO4],氯化钠(NaCl),或氯化钾(KCl)。在某些实施例中,其中所用硫酸铵的浓度约为0.25M至约为1.2M。在某些实施例中,其中所用氯化钠的浓度约为1.0M至约为3.5M。在某些实施例中,其中所用氯化钾的浓度约为1.0M至约为3.5M。在某些实施例中,正确复性的AAT多肽来源于细菌包涵体。
本发明亦提供由本方法生产的AAT多肽。在某些实施例中,此AAT多肽是非糖基化的AAT多肽。在某些实施例中,由本方法生产的AAT多肽具有约至少任何80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,和99%的纯度。
本发明还提供药物组合物,其中包含所述AAT多肽和可接受的药用赋形剂。本发明还提供包含所描述的AAT多肽的药剂盒。这些通常在合适的包装中和提供适当说明的药剂盒可以被用于治疗AAT缺乏症(包括遗传和非遗传的)的患者。
附图简述
图1显示成熟型天然的人AAT的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和成熟型天然的人AAT的cDNA序列(SEQ ID NO:2)。
图2显示合成cDNA序列(SEQ ID NO:4)和翻译的蛋白质序列(SEQ ID NO:3):此序列是优化的在大肠杆菌中表达的截短的AAT多肽(Δ5-AAT)序列。此截短的AAT多肽是从成熟的AAT多肽派生出来,其序列缺乏1-5氨基酸残基但是另加一个蛋氨酸作为蛋白表达的起始氨基酸。
图3显示非还原SDS-PAGE,证明大肠杆菌生产的非聚乙二醇修饰的(unpegylated)和聚乙二醇修饰的(pegylated)Δ10-AAT多肽(分别为线道2和3)和Δ5-AAT多肽(分别为线道4和5)可以被纯化到几乎同质性。每一个SDS-PAGE都显示了标准分子量(线道1和6)。
图4表示不同来源的AAT对HLE或PPE活性抑制的比较。显示复性和纯化的聚乙二醇修饰的和非修饰的Δ5-AAT多肽与商业的全长人AAT(糖基化的)的活性抑制的比较,此抑制为阻碍人中性粒细胞弹性蛋白酶(HLE)和猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreaticelastase,PPE)的酶活性。
Series 1=非聚乙二醇化Δ5AAT多肽对HLE;
Series 2=聚乙二醇化Δ5AAT多肽对HLE;
Series 3=(糖基化)商业全长AAT对PPE;
Series 4=非聚乙二醇化Δ5AAT多肽对PPE。
图5A和图5B显示聚乙二醇修饰的Δ5-AAT多肽的SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱图。
图5A显示聚乙二醇非修饰的和修饰的Δ5-AAT多肽的SDS-PAGE。线道1:非聚乙二醇修饰的Δ5-AAT多肽;线道2:聚乙二醇修饰的Δ5-AAT多肽;及线道3:标准分子量。
图5B显示聚乙二醇修饰反应后的Δ5-AAT多肽的MALDI-TOF质谱图。每一个所标志峰的分子量皆描述于峰的上方。例如,Δ5-AAT多肽(非聚乙二醇修饰的)的分子量为43996.34道尔顿,而聚乙二醇反应试剂Mal-PEG 20的分子量为22063.92道尔顿。所以成功反应的聚乙二醇修饰的Δ5-AAT的分子量为65324.02道尔顿,与质谱图所得到的分子量非常接近。此数据证明Δ5-AAT已经被聚乙二醇成功修饰。
图6显示从疏水作用层析柱所收集的AAT多肽馏分的SDS-PAGE。线道1-6显示非还原SDS-PAGE;而线道7显示还原的SDS-PAGE。线道1显示标准分子量。线道2显示在1M(NH4)2SO4存在下从疏水作用层析柱流出液所收集的含AAT多肽的馏分。线道3-6显示在将1M(NH4)2SO4从缓冲液中去除后洗脱液中含AAT多肽的馏分。线道7显示与线道2相同的馏分但还原的SDS-PAGE。
图7显示复性和纯化的Δ5-AAT多肽与ZemariaTM抑制PPE的活性抑制比较。
图8为图7的图解表。
发明详述
本发明提供生产重组的,具有生物活性的AAT多肽的方法。
除非另外指明,本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。以上所述均在本领域技术范围之内。参见,例如分子克隆实验室手册:Molecular Cloning:a laboratory manual,3nd edition Sambrook,et al.(2001);Current Protocols In Molecular Biology F.M.Ausubel,et al.eds.,(1987);the series MethodsIn Enzymology,Academic Press,Inc.;PCR 2:A Practical Approach,M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor,eds.(1995),and Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow and Lane,eds.(1988)。
需要指出的是,文中使用的单数形式除非特别指明均包括复数形式。
当用“大约”或“约”描述一个范围,此术语同时应用于值域的低限和高限。例如,“约X到Y”的意思是“从约X到约Y”。引用的“大约”或“约”一个值或所 指参数包括(所描述的)实施例中的值或参数。例如,在描述中所指“大约X”或“约X”包括对“X”的描述。
需要理解的是这里描述的发明的方面和实施例包含对其他方面和实施例的“包括”和/或“基本包括”。
A.AAT多肽
AAT多肽(与AAT,AAT蛋白互换应用)包含任何天然存在的品种(例如来源于任何哺乳动物,包括人,侍养动物,体育动物,宠物,灵长目动物,马,狗,猫,小鼠和大鼠等的全长蛋白),具有生物活性的多肽片断(例如蛋白N-端一个或多个氨基酸切除的人AAT片断),和突变体(包括天然存在和非天然存在的),包括不明显影响生物特性的功能等同的变异体和具有增加或减少活性的变异体(例如对人白细胞弹力蛋白酶活性的抑制)。变异体的例子包括替换一个或多个氨基酸的AAT(例如保守的替换),不明显的改变复性和/或蛋白活性功能的一个或多个氨基酸的切除或增加。
AAT多肽,包括变异体,多肽片断,AAT多肽的修饰形式(包括天然存在的AAT),融合蛋白和本发明的连接体,可以用下列的一种或多种特性鉴别:(a)抑制白细胞弹力蛋白酶(例如人白细胞弹力蛋白酶(HLE))活性的能力;(b)抑制猪胰弹力蛋白酶活性的能力;(c)抑制组织蛋白酶(cathepsin G(catG)(例如人catG))活性的能力;(d)抑制蛋白酶3(proteinase 3(例如人Pr3))活性的能力;和(e)防止HLE造成的肺伤害。从而所有的AAT多肽(包括变异体,片断,和修饰的形式)皆具有以上所描述的功能。抑制可以是完全的或部分的,例如,至少抑制酶活性的约50%,至少约60%,至少约70%,至少约80%,至少约90%,至少约95%,或100%。
在某些实施例中,AAT多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中,AAT多肽包含在SEQ ID NO:1中1-15氨基酸中的一个或多个氨基酸残基被删除。在某些实施例中,AAT多肽包含不同的N-端截除的AAT片断。例如AAT多肽包含SEQ IDNO:1中的氨基酸2-394,3-394,4-394,5-394,6-394,7-394,8-394,9-394,10-394,或11-394。对N-端截除的AAT多肽,为了多肽表达,如在大肠杆菌内表达,可以把蛋氨酸加在N-端作为第一个氨基酸。在某些实施例中,AAT多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或被SEQ ID NO:4中核酸序列编码的氨基酸序列。AAT多肽实施例中包括融合蛋白(N-端融合或C-端融合)。
本发明的AAT变异体可以包括不会明显改变蛋白活性的一个或多个氨基酸的取代,删除或增加。变异体可以从自然突变或人工操作获得。变化可以是次要性的,例如对复性和活性没有显著影响的保守的氨基酸取代。对本领域技术人员显而易见的重组DNA技术可以被用来创造新奇的突变蛋白或包括单个或多个氨基酸取代,删除,或增加 的突变体。如此修改过的多肽可以显示,例如,增强的活性,增加的稳定性,或降低的活性。此外,与自然多肽相比,它们可能以更高的产量和更好的溶解性被纯化,至少在一定的纯化和保存条件下。异变体亦包括那些在有一个或多个氨基酸残基被删除,增加,或取代后能产生出在所选择的宿主细胞中更适合于表达,放大,等等的多肽。所以AAT亦包括单个或多个氨基酸取代,删除,或增加的AAT衍生物和类似物,此类AAT衍生物和类似物在宿主细胞中可能更适合于表达,放大,等等。在某些实施例中,AAT异变体的氨基酸序列至少大约70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%与AAT(例如从哺乳动物的,及人的AAT)等同。AAT异变体的例证描述于美国专利Nos.4,732,973,5,134,119,和4,711,848:这些专利全部以引用的方式并入本文中。
如果两个氨基酸序列在如下列描述的最大相符比对时相同,则两个多肽序列可以说是“等同的”。两个序列之间的比较通常用通过确定局部序列的相似性的比较视窗的方法进行。这里所用的“比较视窗”是参考一个至少20个邻近位置的片断,通常大约30到75,大约40到50,其中的序列最佳比对后可以与具有相同数目的邻近位置的参考序列比较。
可以用下列软件进行为了比较序列的最佳比对:应用缺省参数用Lasergene生物信息软件套餐中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)。此程序的实施已描述于下列参考文献中的几个比对方案:Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of ProteinSequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G.andSharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153;Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17;Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105;Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA;Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
理想的是,“序列等同百分比”的决定方法可以用在一个至少20位点的比较窗比较两个最佳比对的序列。当与对比序列(不包含增加或删除)进行两个序列的最佳比对时,其中在比较窗内的多肽序列部分可以包含增加或删除(例如缺口)百分之20或更少,通常百分之5到15,或百分之10到12。此百分比的计算方法是:决定两个序列中在同位点等同氨基酸的数目以得到相配位置数,用此相配位置数除以在对比序列中总的位点数,所得结果再乘以100以得到序列等同百分比。
AAT多肽异变体亦包括包含AAT多肽的融合蛋白。具有生物活性的AAT多肽可以融合于其他序列,这些序列可以促进将多肽结合于支撑或载体,或促进复性和/或纯化(例如,抗原决定部位(epitopes)如Myc,从流感病毒红血球凝聚素衍生的HA,His-6,FLAG,或His-Tag)。这些序列可以融合于AAT多肽的N-端或C-端。另外,蛋白或多肽可以融合于其他增加功能的多肽,或确定在细胞中的定位,例如分泌序列。以上所述的生产重组融合蛋白的方法在所属领域是熟知的。这些重组融合蛋白可以用所述的或其他所属领域是熟知的方法生产,复性,和提纯。
AAT多肽的变异体也包括任何在这里所描述的融合蛋白实施物的连接物,例如,AAT多肽连接或融合于一个延长半衰期的部分,比如一个PEG或多肽。
AAT异变体亦包括功能等同异变体。功能等同异变体可以用下列的一种或多种标准鉴别:(a)抑制白细胞弹力蛋白酶(例如人白细胞弹力蛋白酶(HLE))活性的能力;(b)抑制猪胰弹力蛋白酶活性的能力;(c)抑制组织蛋白酶(cathepsin G(catG)(例如人catG))活性的能力;(d)抑制蛋白酶3(proteinase 3(例如人Pr3))活性的能力;和(e)防止HLE造成的肺伤害。AAT多肽异变体的生物活性可以用本领域熟知的和下面所述的方法测验。在某些实施例中,功能等同异变体具有至少约任何的50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,或95%的活性,此活性是通过与全长天然AAT比较,应用一种或多种以上所描述的活性分析方法(或本领域熟知的方法)。
B.AAT多肽复性方法
本发明的方法是常规的应用含有AAT多肽的包涵体生产AAT多肽的方法,所述包涵体是用经改造用于生产AAT多肽的细菌(如大肠杆菌)细胞中形成的,但任何来源的变性的AAT多肽都可以应用。此处所描述的方法亦可以用于生产任何所述的AAT异变体。所述AAT多肽可以依据实施者的期望,来源于任何合适的物种,来源于任何天然的或非天然的序列。图1显示成熟型人AAT基因的全长编码序列。另外,改变的AAT基因,例如为提高在宿主细胞中表达而做出的“沉默”变化的基因(“最佳化”序列),或具有一个或多个氨基酸序列变化的编码突变体AAT多肽基因亦可以应用。
重组宿主细菌(如大肠杆菌)可以用任何方便的技术经改造用来生产任何蛋白(包括AAT蛋白和AAT异变体蛋白)。尽管也可使用基于噬菌体基因组DNA的表达载体,但最常见的是将编码所需融合蛋白的DNA序列插入到提供合适的转录和翻译调控序列的质粒表达载体的适当位点。尽管也可使用组成型转录调控序列,但通常优选可被宿主细胞周围环境的改变(例如添加可引起转录调控序列应答的底物或假底物)诱导的转录调控序列。另外作为本领域的标准方法,还优选在表达载体中包含正筛选标记(例如β-乳糖酶基因,其可引起氨苄西林抗性),以便从不含表达载体的细菌宿主细胞中筛 选出含表达载体的宿主细胞。本发明提供包含任何所述AAT蛋白和AAT异变体蛋白核苷酸编码的多(聚)核苷酸和籽粒。
细菌宿主细胞一般在适合于宿主细胞和表达载体的条件下,在液体生长培养基中培养以生产AAT多肽。理想的是,将宿主细胞在细菌发酵罐中培养以获得最大产量,但其他任何简便的培养方法也可接受(例如摇瓶,尤其是用于少于1升的培养物)。对本领域技术人员而言显而易见的是,精确的生长条件、培养基补料的时间和速度以及诱导剂的添加(如果需要的话)应根据宿主细胞和表达构建体而改变。
将细菌宿主细胞培养至所需要的密度(以及经任何必须的表达诱导)后,收集所培养的细胞。尽管可以采用任何其他方便的技术,但收集一般通过将生长培养基离心而方便的实现。所收集的宿主细胞可以在这一阶段进行洗涤以除去痕量的生长培养基,最常用的方法是在一种简单的缓冲液中重悬然后离心(或其他方便的细胞收集方法)。此后,所收集的细菌宿主细胞(“细胞糊状物”)可以立即按照本发明进行处理,亦可以冰冻储存至以后处理。
将细胞糊状物中的细胞裂解,使之释放出含AAT多肽的包涵体。理想的是,在一定的条件下裂解,在所述条件下细胞残片可以被充分破碎,以至于在低速离心时不会在沉淀中出现。通常情况下,将细胞在约pH 5到9(优选约6到8)的缓冲液中悬浮,并使用约0.01到2M(优选约0.1到0.2M)离子强度(使用基本上为0的离子强度显然是不合适的)。可用任何合适的盐(包括NaCl)来维持适当的离子强度水平。悬浮于上述缓冲液后,将细胞利用常规技术裂解,例如机械方法如冻/融循环,使用Manton-Gaulin压碎机、弗氏压碎机或超声震荡器,或者通过化学或酶学方法诸如用溶菌酶处理。通常期望在低温条件下(即低于20℃)进行细胞裂解和细菌细胞收集。
可以利用任何方便的技术(例如离心)从裂解的细胞糊状物中收集包涵体,然后洗涤。如果需要,可以洗涤收集的包涵体。包涵体的洗涤一般是通过在洗涤缓冲液中重悬,然后再将包涵体重新收集来进行,其中所述的缓冲液一般为裂解缓冲液,优选其中加有去污剂(例如1%TRITON X- )。其后,将洗涤过的包涵体在溶解缓冲液中溶解。溶解缓冲液含有高浓度的离液剂、将溶液缓冲至高pH的pH缓冲剂以及一种或多种还原剂。溶解缓冲液还可以任选含有其他试剂,如氧化还原剂、阳离子螯合剂以及用于中和可破坏蛋白质的自由基的清除剂。
本发明的溶解缓冲液使用尿素作为示例性的离液剂,但也可以使用盐酸胍。溶解缓冲液中尿素的实用浓度包括约5M到约8.5M、约6M到约8.5M、约7M、或约8M。当离液剂为盐酸胍时,实用浓度包括约4M到8M,或约5.5M到约6.5M,或约6M。
溶解缓冲液的pH可以较高,即高于pH 8.0,例如pH 9.0。溶解缓冲液的实用pH水平为约8.0到约11.0,约9.0到约11.0,约9.5到约10.5,约10.0到约10.5,约10,约10.5,或约10.8。对本领域技术人员显而易见的是,尽管可以在约pH 8到约pH 9或10 之间起缓冲作用的pH缓冲剂尤其有用,但任何在高pH下能有效起缓冲作用的pH缓冲剂(或缓冲剂的组合)都是有用的。有用的pH缓冲剂包括Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(4-丁磺酸)、TAPS([(2-羟基-1,1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙氨酸),AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)等等。加入的pH缓冲剂的浓度应提供有效的pH缓冲作用,例如从约50到约150mM,约75到约125mM,或约100mM。
溶解缓冲液中包含还原剂以还原二硫键并维持半胱氨酸残基的还原形式。可以使用的还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇,或类似的还原剂等。
溶解缓冲液还可以包括其他成分。例如,溶解缓冲液可以包含阳离子螯合剂如双价阳离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)。EDTA或EGTA可以加入到溶解缓冲液中,其浓度为约0.5到约5mM,通常为约1mM。另外,溶解缓冲液中亦可以含有自由基清除剂以减少或消除自由基介导的蛋白质破坏,尤其当使用尿素作为离液剂且预期将含有尿素的蛋白质溶液储存相当长的时间时。适宜的自由基清除剂包括甘氨酸(例如浓度约为0.5至约2mM,或约1mM)以及其他氨基酸和氨类化合物。
溶解缓冲液II的示例之一由下列浓度的化合物组成:约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约10mM β-巯基乙醇,约10mM二硫苏糖醇(DTT),和约1mM还原型谷胱甘肽(GSH),约1mM EDTA,pH约10.5。
另一个溶解缓冲液II的示例由下列浓度的化合物组成:约8M尿素,约0.1MTris,约1mM甘氨酸,约10mM β-巯基乙醇,约10mM二硫苏糖醇(DTT),和约1mM还原型谷胱甘肽(GSH),约1mM EDTA,pH约8.5到约10.0.
将包涵体/溶解缓冲液混合物孵育以使其完全溶解。孵育时间通常从约6小时到约24小时,且更惯常的从约8小时到约14小时或约12小时。包涵体/溶解缓冲液混合物的孵育可以在低温下进行,通常在约4℃到约10℃下进行。
待孵育完成后,将包涵体/溶解缓冲液混合物澄清以除去不溶性残渣。混合物的澄清可以通过任意一项便利的方法完成,例如过滤(如通过使用深芯滤器)或离心。澄清应在低温下进行,例如在约4℃到约10℃下进行。
随后将澄清的混合物稀释至合适的蛋白质浓度以利于复性。蛋白浓度可以利用任意一项方便的技术确定,例如Bradford测定法、280nm光吸收(A280)等等。本发明人发现在本发明的方法中使用A280为约2.0到约10.0(例如,下列任何的大约浓度2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,和10.0)的溶液都是合适的。例如,蛋白的最终浓度在2mg/ml是合适的。尽管混合物一般不会保存超过4周,但如果需要,该混合物可以冷藏(例如在4℃下)保存等待以后处理。一个示例性的溶解缓冲液II由下列浓度的化合物组成:约8M尿素,约0.1M Tris,约1mM甘氨酸,约10mM β-巯基乙醇,约 10mM二硫苏糖醇(DTT),和约1mM还原型谷胱甘肽(GSH),约1mM EDTA。为调节用的溶解缓冲液II的pH可以与溶解包涵体的溶解缓冲液相同。
将调整浓度后的包涵体溶液首先快速稀释于复性缓冲液中。稀释的过程可以用将包涵体溶液加入到复性缓冲液中的方法进行。可将包涵体溶液用复性缓冲液稀释约10倍到约100倍,约10倍到约50倍,约10倍到约25倍,约15倍到约25倍,或约20倍。稀释包涵体溶液的过程降低了尿素和蛋白质浓度,在此过程中失活的蛋白质(包涵体)被复性。稀释后的蛋白质终浓度可以从约0.01mg/ml到约1mg/ml,约0.1mg/ml到约0.5mg/ml。
复性缓冲液中可含有能够缓冲pH的缓冲液及0种、1种、或多种助复性化合物。复性缓冲液中亦含有甘油,糖(如蔗糖和麦芽糖),或聚乙二醇(PEG),或这些化合物的任何组合。包含在复性缓冲液中的甘油的浓度可以为约5%到约30%,约5%到约20%。在某些实施例中,在复性缓冲液内甘油的浓度为约10%或30%。复性缓冲液可以包含约10%到约30%的蔗糖,例如约25%。在某些实施例中,复性缓冲液含有约15%的蔗糖,约10%的甘油和约10%的蔗糖,或约20%的甘油和约20%的蔗糖。为了帮助复性和保持复性蛋白的稳定,复性缓冲液亦可以包含聚乙二醇(PEG),例如,分子量为从约200到约20,000道尔顿,约5%到约10%的PEG可以包含于复性缓冲液中。在某些实施例中,PEG的分子量为约200道尔顿,约300道尔顿,约400道尔顿,约600道尔顿,约10000道尔顿,或约20,000道尔顿。复性缓冲液中亦可以包含低浓度的离液剂,还原剂,和双价阳离子螯合剂。复性缓冲液中亦可以进一步包含附加的试剂,如自由基清除剂。
在某些实施例中,将包涵体溶液快速的稀释到复性缓冲液中。文中所述的“快速”稀释是指稀释过程在短于约25分钟内进行,并且稀释过程通常是在约2分钟到约25分钟,或约5分钟到约20分钟。在快速稀释过程完成后,通常将稀释的溶解的AAT多肽溶液保持1-2小时。
复性缓冲液的pH可以与溶解缓冲液的相同或不同。复性缓冲液中的pH缓冲剂可以是任何在pH约为8至约为9或约为10或约为10.5的水平下有效的缓冲剂或缓冲剂的组合。有用的pH缓冲剂包括Tris(三(羟甲基)氨基甲烷),Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸),HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(4-丁磺酸),TAPS([(2-羟基-1,1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙氨酸),或AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)等等。加入的pH缓冲剂的浓度应提供有效的pH缓冲作用,例如从约10到约150mM,约50到约125mM,或约100mM。
双价阳离子螯合剂可以是任何可以有效螯合Ca++和其他双价阳离子的分子。示例性的用于复性缓冲液中的阳离子螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇双(2-氨基乙基 醚)四乙酸(EGTA)。当用EDTA或EDTA为双价阳离子螯合剂时,它们在复性缓冲液中的浓度为约0.5至约5mM,通常为约1mM。
复性缓冲液中也可以包含一种或多种去污剂,例如吐温-20,吐温-80,脱氧胆酸钠,胆酸钠,和氧化三甲胺(TMAO)。例如复性缓冲液可以包含从约0.001%到约0.02%(如约0.005%到约0.02%)浓度范围的吐温-20或吐温-80。在另一个例证中,复性缓冲液可以包含约0.1%的脱氧胆酸钠,约0.1%的胆酸钠,或0.025%的TMAO。
可用于复性缓冲液中的其他成分包括自由基清除剂。可以加入自由基清除剂以减少或消除自由基介导的蛋白质损坏,尤其当使用尿素作为离液剂且预期将含有尿素的蛋白质溶液储存相当长的时间时,合适的自由基清除剂包括甘氨酸(例如大约0.5至约2mM,或约1mM)。
一个示例性的复性缓冲液包含约20mM Tris,约10%甘油或约15%蔗糖,pH约10.5或约8.5。另一个示例性的复性缓冲液包含约20mM Tris,约5%到约10%PEG,pH约10.5或约8.5。
在某些实施例中,利用适当的酸将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH从高pH缓慢降低至约中性pH。在某些变更中,pH被降低至约7.5到约8.5(例如,到约pH 8)。降低pH所用时间为约20-24小时到约10天,约20到约50小时,约20到约40小时,约20到约30小时,约24到约40小时。降低pH所用时间至少为约20小时,至少为约24小时,至少为约30小时,至少为约40小时,至少为约48小时,至少为约50小时,至少约4天,至少约5天,至少约6天,至少约8天,至少约10天。在某些实施例中,降低pH所用时间为约2-5天。在某些实施例中,降低pH所用时间为约6-10天。在某些实施例中,降低pH所用时间为约10-15天。用于调节pH的合适的酸取决于复性缓冲液中使用的pH缓冲剂。例如,当缓冲剂为Tris时,应使用盐酸(HCl)调节pH。
pH调节完成后,将复性反应孵育约1至2个小时到约18至24个小时。根据操作者的选择和可利用的条件,复性反应及孵育可以在室温(例如约18-20℃)或稍微降低的温度(例如约14-16℃)下进行。
在另外的实施例中,在所用复性缓冲液的pH为约8.5到约10的情况下,在约16℃到约20℃孵育稀释的溶解的AAT多肽溶液至少约16小时,然后再在4℃孵育约24小时到约72小时。下一步将AAT多肽溶液交换到pH约7.5到约8.5的缓冲液中。此缓冲液可以与复性缓冲液的剂型相同。缓冲液交换可以用透析或分子排阻层析法进行。在缓冲液交换前,可以将样品浓缩(例如用超滤法)。在某些实施例中,所用复性缓冲液的pH为约8.5,溶液在约16℃到约20℃孵育16小时。在进行纯化之前,复性的AAT多肽可以在4℃保存2-7天。
复性反应后,将正确复性的AAT多肽浓缩和进一步纯化。复性蛋白质的浓缩可以利用任何方便的技术完成,例如超滤、透析、层析(如离子交换层析、疏水相互作用或 亲和层析)等等。在可行的情况下,浓缩步骤优选在低温(例如约4-10℃)下进行。如果需要,浓缩步骤亦可以包括缓冲液交换,以在蛋白纯化前交换成期望的一定浓度的缓冲液及盐,或者调节,交换,及去除复性缓冲液中的去污剂。
通常任何方便的蛋白纯化方案都可以在此应用。在某些实施例中,两种层析方法可以用于纯化。例如分子排阻层析(SEC)和/或离子交换层析可以在此应用。
在某些变更中,复性的AAT多肽可以从杂质中纯化出来。例如,AAT多肽可以从可能干扰其治疗应用的杂质中纯化出来。杂质可以包括酶,激素,或其他细菌细胞或细胞培养液来源的蛋白或非蛋白物。在某些变更中,复性的AAT多肽可以纯化至高于任何的由重量测量的约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,和约99%。蛋白组合物的纯度可以用任何本领域熟知的方法确定,例如Lowry方法,氨基酸序列分析法,及用考马斯蓝或银染的还原或非还原的SDS-PAGE。在某些变更中,可用切向流过滤法浓缩复性的蛋白和分子排阻层析(SEC)纯化浓缩的蛋白。可以用任何方便的可以将正确复性的AAT多肽与非正确复性的或非复性的AAT多肽分开的层析介质进行分子排阻层析(SEC)。本发明人发现具有分离蛋白分子量约104到约6×105道尔顿的介质皆可以应用于此步骤。示例性的SEC介质包括Sephacryl-300和Superdex-75。如果需要,此步骤亦可用于进行缓冲液交换。确切的SEC条件依赖于所选择的层析介质,是否进行缓冲液交换,下步纯化步骤的需求,和其他本领域技术人员熟知的因素。
正确复性的AAT多肽可以进一步用离子交换层析纯化,例如用示例3中显示的HiTrapQ XL阴离子交换柱。
正确复性的AAT多肽可以进一步在高盐下用疏水交换层析与非正确复性的AAT多肽分离,所述疏水交换层析包括,例如苯基琼脂糖凝胶(phenyl-sepharose)层析,丁基琼脂糖凝胶(butyl-sepharose)层析,及辛基琼脂糖凝胶(octyl-sepharose)层析等。在一定的盐浓度下(例如约0.25到约1.2M的(NH4)2SO4,或约1.5到约3.5M的NaCl),不正常复性的或非正确复性的AAT多肽与树脂结合,但正确复性的AAT多肽从树脂流过。例如,(NH4)2SO4和NaCl等盐可以在此应用。在一个实施例中,将在20mM Tris,1M(NH4)2SO4,7.5%蔗糖,0.005%吐温-20,1mM DTT,pH 7.6中的AAT多肽上样于苯基琼脂糖凝胶柱,然后在流出液馏分中收集到含有正确复性的AAT多肽。
可以对复性的AAT多肽进行修饰以增加其在个体(如人)体内的半衰期。例如,可以对AAT多肽聚乙二醇化(pegylation)以最低限度的减少失活及降低体内清除。任何已知的聚乙二醇化方法都可以应用。例如请见:Cantin et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:659-665,2002;Travis et al.,Methods Enzymml.80:754-766,1981;Reberts et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476,2002。示例4详细的描述了其中的一个聚乙二醇化方法。在某些实施例中,应用分子量约20到约40kD的PEG对AAT多肽进行聚乙二醇化。在某些实施例中,PEG具有分子量约21kD。在某些实施例中,PEG分子被 连接到AAT多肽的Cys232上,其中Cys232的氨基酸序列值是根据SEQ ID NO:1的序列系统。与没有修饰的AAT多肽相比,修饰的AAT多肽的半衰期可以增加至少约10%,至少约20%,至少约30%,至少约50%,至少约100%,至少约2倍,至少约5倍,至少约10倍。
由按照本发明方法生产的复性的AAT多肽的生物活性可以利用任何可接受的本领域技术人员熟知的活性测定方法进行测定。例如见:Cantin et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:659-665,2002;Travis et al.,Methods Enzymml.80:754-766,1981。示例3描述了一个测定AAT多肽活性的示例性的方法:此例用合成底物测量了抑制人白细胞弹力蛋白酶(HLE)和猪胰弹力蛋白酶的体外活性。其他活性测定方法包括将AAT多肽和HLE应用于动物,然后测量由AAT多肽的抗-HLE活性所产生的对肺的保护:Cantin et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:659-665,2002。例如,可以将AAT多肽对小鼠进行鼻腔滴注,然后滴注HLE。用血红蛋白含量作为指数来确定HLE-居间的肺伤害:Cantin et al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:464-469,1998。
本领域技术人员可以充分理解的是,所有浓度和pH值均无需精确,并且对某一给定值的参考反应了本领域的标准方法,但并不意味着该数值不能改变。
C.药物组合物、治疗应用和药剂盒
本发明也提供所述的包含有生物活性的AAT多肽组合物(包括药品组合物)。此组合物亦可以包含药用赋形剂。AAT多肽可以是冻干制剂或液体制剂的形式。药用赋形剂是在所用的药量和浓度下对使用方无毒,可以包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐;盐如氯化钠;糖如蔗糖;及/或聚乙二醇(PEG)。见Remington:The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。可以制备出不同给药途径的AAT多肽制剂,如为静脉注射(IV)的液体或冻干制剂,及为深肺给药的干粉制剂或气化制剂。这些试剂对本领域技术人员是显而易见的。见,例如,“DrugDelivery to the Lung,Bisgaard H.,O′Callaghan C and Smaldone GC,editors,New York;Marcel Dekker,2002”。
本发明所述AAT多肽可以用此处所描述的任何方法制备。在某些实施例中,AAT多肽从细菌(如大肠杆菌)包涵体产生。在某些实施例中,AAT多肽是非糖基化的。在某些实施例中,AAT多肽具有至少约任何80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,和99%的纯度。在某些实施例中,AAT多肽的比活力(例如用猪胰弹力蛋白酶抑制测定)每毫克总蛋白不少于约任何0.3,0.35,0.4,0.45,0.5,0.55,0.6,0.65,0.7,0.75,0.8,0.85,0.9,和0.95毫克的活性AAT多肽。
本发明也提供包含所述AAT多肽的治疗应用药剂盒。本发明的药剂盒包含一个或多个含有AAT多肽的容器。此容器可以是小药水瓶,瓶子,广口瓶,或灵活的包装。例如,AAT多肽可以用一次性应用的小药水瓶包装,每瓶含有500毫克或1,000毫克的活性AAT多肽。此药瓶可以有一个无菌通入口(例如一个可以被皮下注射针头刺穿的瓶塞)。另外可预期的是用特殊装置组合起来的包装,例如吸入器,鼻给药装置(例如喷雾器)或输入装置如微泵。至少一种活性药剂是AAT多肽。此药剂盒也可以进一步包括第二个药物的有效成分。包装容器中亦可以包含根据本发明所描述方法的应用说明书。一般地,这些说明书包括根据本发明所描述方法的用AAT多肽治疗疾病的应用方法说明。此说明书可以进一步包括应用AAT多肽治疗疾病的说明,例如,治疗与AAT缺乏有关的疾病。说明一般包括使用剂量,使用时间,和治疗所述疾病的应用途径。本发明药剂盒提供的使用说明一般在标签上或说明书上(例如包含于试剂盒中的纸张上)书写说明,但机器可读的说明(例如装载于磁片上或光盘上的说明)亦可以接受。此药剂盒也可以包括干粉或喷雾器肺部给药的装置。
下列实施例提供例证,但不限制本发明。
实施例
实施例1
用降低pH方法复性重组AAT多肽
质粒构造和表达。用PCR扩增法得到编码Δ5-AAT多肽(SEQ ID NO:3)的DNA片断(SEQ ID NO:4)。Δ5-AAT多肽缺乏图1显示的SEQ ID NO:1所示的1-5氨基酸序列,并在起始位置人工附加了蛋氨酸以促进在大肠杆菌中表达。编码Δ5-AAT多肽的DNA多(聚)核苷酸序列为了在大肠杆菌中最佳表达已经进行了优化。为了蛋白表达,将上述PCR产物克隆于包括多克隆位点的修饰的pET11a籽粒。在PCR,连接,和转化入BL21(DE3)菌株后,选择单克隆菌落扩增,并最终对所选择的载体进行DNA序列测定,以保证得到正确的DNA序列。所得载体为pET11-Δ5-AAT。
用DNA片断(SEQ ID NO:2)构建表达全长人AAT或缺乏SEQ ID NO:1中1-10,但在起始位置附加蛋氨酸的Δ10-AAT多肽载体的方法与以上所描述的相同。所得载体为pET11-AAT和pET11-Δ10-AAT。
将pET11-Δ5-AAT,pET11-AAT,和pET11-Δ10-AAT表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株内,表达和包涵体纯化基本按发表的程序进行(Kim,YT et al.2002 Eur JBiochem 269:5668-5677;Lin,XL et al.1994 Methods Enzymol 241:195-224;Lin,X U.S.Pat.No.6,583,268),并简要描述如下。将转化的细菌铺在含有氨苄西林的ZB平板上。选择 单个菌落并用其接种含有氨苄西林的100ml ZB培养基(10g/L NZ-胺-A(SIGMA)和5g/L NaCl),并在37℃生长过夜(约16小时)。将100ml起始培养物中的20ml再接种至1L含氨苄西林的LB培养基,并将其在37℃震摇温育至600-nm的光密度(OD600)达到0.4-0.6。然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至0.5mM以诱导AAT表达,并将培养基继续摇动3个小时。用多个1L培养瓶及高密度发酵罐法可进行大量表达。
pET11-AAT的表达水平非常低,但pET11-Δ5-AAT和pET11-Δ10-AAT的表达水平达到了可以接受的水平。
复性之前的包涵体处理:从细菌收集包涵体。通过离心收集细胞,然后在含有1%Triton-X- 的20ml TN(150mM NaCl,50mM Tris,pH 8.0)中悬浮。向其中加入10mg溶菌酶,并将细胞悬浮在-20℃冰冻过夜。然后将裂解物溶化并加入20μl 1M硫酸镁和100μl 0.01mg/ml DNAase。搅动细胞,并将其温育至释放的DNA完全溶解。其后用250ml含有1%Triton-X- 的TN稀释裂解物并搅动混合2-4小时。通过离心收集包涵体,并将其继续洗涤3次(通过重悬浮和离心)。不言而喻,所收集的包涵体中含有AAT多肽。
AAT多肽的复性。将洗涤的包涵体溶于含高浓度尿素的溶解缓冲液(8M尿素,0.1M Tris,1mM甘氨酸,1mM EDTA,100mM β-巯基乙醇(β-ME),pH 10.5)中,溶解于高OD280(20-40),并在4℃缓慢的搅动12小时。溶解的样品超速离心(30分钟x66,000g)澄清以去除不溶解的杂质,然后用溶解缓冲液II(8M尿素,0.1M Tris,1mM甘氨酸,1mMEDTA,10mM β-巯基乙醇(β-ME),10mM二硫苏糖醇(DTT),1mM还原的谷胱甘肽(GSH),pH 10.5)将溶解的包涵体的OD280调至2.0。
将上述溶解的包涵体快速冲稀至20倍体积的复性缓冲液(20mM Tris,10%甘油,pH 10.5)中,其稀释后的最后OD280为0.1。稀释后,用1M HCl将溶液的pH在2-4天内,逐步的调到7.6。
其他试验过的复性方法包括在复性缓冲液中用高浓度的甘油(20%),或用20%蔗糖取代甘油,或同时用10%蔗糖和10%甘油。在某些实验中,吐温-20(0.005%-0.01%)也被包含在复性缓冲液中。所有这些条件都产生了正确复性的(有活性的)AAT多肽。
实施例2
用固定pH方法复性重组AAT多肽
用固定pH法对表达的AAT多肽包涵体的复性。将实施例1中得到的洗涤的包涵体溶于含高浓度尿素的溶解缓冲液(8M尿素,0.1M Tris,1mM甘氨酸,1mM EDTA,100mM β-巯基乙醇(β-ME),pH 10.5)中,溶解于高OD280(20-40),并在4℃缓慢的搅动12小时。溶解的样品超速离心(30分钟x66,000g)澄清以去除不溶解的杂质。然后用溶解缓冲液II(8M尿素,0.1M Tris,1mM甘氨酸,1mM EDTA,10mM β-巯基乙醇(β-ME),10mM二硫苏糖醇(DTT),1mM还原的谷胱甘肽(GSH),pH 10.5)将溶解的包涵体的OD280调至2.0。将上述溶解的包涵体快速冲稀至20倍体积的复性缓冲液(20mM Tris,10%甘油,pH 8.5)中,其稀释后的最后OD280为0.1。将稀释的溶液于20℃保存16小时,然后在进行实施例3所描述的浓缩,缓冲液交换和纯化前,于4℃保存2-7天。
实施例3
复性的重组AAT多肽的纯化和生物功能测定
将按照实施例1所述生产的Δ5-AAT多肽和Δ10-AAT多肽通过超滤(MilliporePellicon,30,000截流膜)浓缩并通过超速离心(Beckman LE-80K,Type 70 Ti rotor,30,000rpm,30分钟)以去除多余的不可溶残骇。将得到的上清液上样于用缓冲液(含20mMTris,0.2M NaCl,15%蔗糖,0.005%Tween 20,1mM DTT,pH 7.6)平衡的5.0x90-cm Superdex 75(Amersham)SEC柱。通过此柱将单体Δ5-AAT多肽和Δ10-AAT多肽从错误复性的多聚多肽中分离出来。从分离柱中收集10ml的馏分,然后用A280和SDS-PAGE分析。下一步将单体的部分纯化的馏分合并,上样于一个用Pharmacia AKTAFPLC HiTrap Q XL阴离子交换柱(GE Healthcare),在20mM MES pH 6.2含有1mMDTT的缓冲液中用0-1000mM NaCl盐梯度洗脱。用非还原SDS-PAGE分析所述阴离子色层析馏分,然后将高度纯化的馏分合并。合并样品的浓度用本领域技术人员所熟知的光度法(A280)确定。
如图3所示,此方法生产和纯化了几乎同质的Δ5-AAT多肽和Δ10-AAT多肽(在10%甘油复性缓冲液中复性)。
复性和纯化的Δ5-AAT多肽和Δ10-AAT多肽的对蛋白酶抑制的性质通过对人白细胞弹力蛋白酶(HLE)和猪胰弹力蛋白酶(PPE)的抑制作用进行了鉴定,并与从市场得到的从人血浆分离的全长糖基化的AAT(购买于Calbiochem,San Diego,Calif.Cat.#178251)进行了比较。从猪胰中纯化的PPE从Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,cat.#E7885)购买;而从人唾液中纯化的HLE从Molecular Innovations(Southfield,Mich.Cat#HNE)购买。将浓度为0.3nM至14nM范围的人Δ5-AAT多肽或市场购买的从人血浆分离的全长糖基化 的AAT与固定于1.4nM浓度的HLE或PPE在37℃孵育15分钟,然后取出部分孵育液与1mM的弹力酶底物混合,所述底物为N-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide(PPE发色底物)或N-methoxy-succinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilide(HLE发色底物)。用MolecularDevices Spectrophotometer(Spectramax Plus)监测底物水解动力学。确定每一个反应的起始速度,然后再计算相对于对比样品(no AAT or AAT polypeptides)的活性百分比。绘出所述弹力酶的活性百分比对应于在相应反应中AAT多肽:弹力蛋白酶浓度的化学当量分子比的反应图。实验所用的每一个形式的AAT多肽,PPE,和HLE的精确浓度皆在实验之前确定,确定方法是用从ExPASY蛋白组服务器(http://www.expasy.ch)内ProtParam软件程序所提供的每一个蛋白或多肽的已知消光系数。
如图4所示,实施例1所述复性的Δ5-AAT多肽显示了对HLE和PPE活性的抑制,而且此抑制可以与市场获得的人血清AAT相比。实施例2所述复性的Δ5-AAT多肽,及实施例1和2所述复性的Δ10-AAT多肽亦显示了阻碍HLE和PPE活性的功能。
实施例4
复性的重组AAT多肽的聚乙二醇化(pegylation)
首先将在缓冲液20mM MES,200mM NaCl,1mM DTT,pH 6.2中的实施例1和3所述复性及纯化的Δ5-AAT多肽进行缓冲液交换,其目的是除去还原剂DTT及交换成Pegylation反应所需缓冲液。缓冲液交换通过PD-10(BioRad)去盐柱层析进行,此柱先用50mM NaPi,200mM NaCl,pH 7.5缓冲液平衡,然后按制造商的说明书上样和纯化。因为还原剂DTT干扰pegylation反应,所述缓冲液交换通常进行两次以确保样品中没有微量的DTT存在。用摩尔消光法定量Δ5-AAT多肽。将在氩气下储存于-20℃的固体PEG-mal20(大约分子量21KDa的polyethylene glycol maleimide 20,来源于Nektar,Huntsville,Ala.)以约5∶1至10∶1的分子比加入到缓冲液交换后的Δ5-AAT多肽的溶液中,并在37℃孵育30分钟。用加入20mM DTT并继续在37℃孵育5分钟的方法终止反应。将反应混合物用水稀释至少4倍,以将反应液的盐度降至50mM NaCl以下,然后上样于HiTrap Q阴离子交换柱,以将聚乙二醇化和非聚乙二醇化的AAT多肽分开。聚乙二醇化的AAT多肽对HiTrap Q阴离子交换柱的亲和力低于非聚乙二醇化的AAT多肽。这两种形式的AAT在洗脱过程中,于不同的盐梯度馏分中被选择性的分开。
聚乙二醇化反应的成功用SDS-PAGE(图5A)和MALDI-TOF质谱分析(图5B)确定。图4显示所述聚乙二醇化的Δ5-AAT多肽对HLE和PPE酶活性的抑制。图4和图5A和图5B显示Δ5-AAT多肽已经被成功的聚乙二醇化,并且所述聚乙二醇化的Δ5-AAT多肽在抑制HLE和PPE酶活性方面的体外功能特性与非-聚乙二醇化的Δ5-AAT多 肽等同。Δ10-AAT多肽也已经被成功的聚乙二醇化(图3),并且显示保存了抑制弹力酶的活性。
实施例5
用苯基琼脂糖凝胶(phenyl-sepharose)层析将正确复性的和不正确复性的及非复性的AAT多肽分离的方法
进一步用疏水作用层析(HIC),如苯基琼脂糖凝胶层析,纯化用如上所述方法纯化的复性的AAT多肽。用含20mM Tris,1M(NH4)2SO4,10%蔗糖,0.005%Tween 20,1mM DTT,pH 7.6的缓冲液平衡苯基琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)。进一步用苯基琼脂糖凝胶柱纯化在实施例3中所述用分子排阻(SEC)柱和阴离子交换柱纯化的复性的Δ5-AAT多肽。将在平衡苯基琼脂糖凝胶柱同样的缓冲液中的复性的Δ5-AAT多肽上样到所述柱中。不正确复性的或非复性的Δ5-AAT多肽结合在柱中,而正确复性的Δ5-AAT多肽从柱中穿过并被收集和浓缩。所述柱然后用含20mM Tris,7.5%蔗糖,0.005%Tween20,1mM DDT,pH 7.6的缓冲液洗脱,以收集不正确复性的或非复性的Δ5-AAT多肽。用SDS-PAGE(图6)分析从疏水作用层析柱中所收集的Δ5-AAT多肽馏分。对用苯基琼脂糖凝胶柱纯化的Δ5-AAT多肽进行活性测定,并将所测活性与Zemaira α1-蛋白酶抑制剂(人,来源:Aventis Behring L.L.C)活性相比较。
用反应缓冲液(含20mM Tris,38mM NaCl,0.01%Tween 20,pH 8.8)将纯化的Δ5-AAT多肽冲稀至250μg/μl。将PPE(猪胰弹力蛋白酶)溶于反应缓冲液中,然后与不同浓度的Δ5-AAT多肽或 α1-蛋白酶抑制剂在37℃孵育15分钟。将反应混和液进一步用H2O冲稀,然后将底物P-ala-ala-ala(Sigma)加入以启动PPE水解反应。在96-孔板中反应,用405nm光波监测。图7显示不同浓度的复性的Δ5-AAT多肽和Zemaira对PPE活性的抑制(绘制成AAT:PPE的化学计量学)。图8的数据表明复性和纯化的Δ5-AAT多肽与 具有相似的比活。
实施例6
用含有PEG,蔗糖或去污剂的复性缓冲液对重组AAT多肽复性
试验了含有PEG,蔗糖或去污剂的复性缓冲液。用实施例1所述的方法对Δ5-AAT多肽复性,除了所述复性缓冲液含有20mM Tris,pH 10.5,和下列任何一种1)1-10%PEG(PEG200,PEG300,PEG400,PEG600,PEG1000,或PEG3000,皆来源于Sigma, U.S.A.);2)10-20%蔗糖;和3)一种去污剂[如月桂酰肌氨酸钠(源于Arresco),脱氧胆酸钠(NaDeCholate,源于Sigma),胆酸钠(NaCholate,源于Sigma),十六烷基三甲基溴(cetyltrimethylammonium bromide,源于Sigrna),环式糊精(β-cyclodextrin,源于Sigma),嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68,源于Sigma),和氧化三甲胺(TMSO,源于Sigma)]。从测试复性的Δ5-AAT多肽阻断人白细胞弹力蛋白酶(HLE)或猪胰弹力蛋白酶的活性,在所有测试的PEGs中,在复性缓冲液中包含10%PEG200或5%PEG600得到了最高的Δ5-AAT多肽活性。在所测试的去污剂中,脱氧胆酸钠(0.1%),胆酸钠(0.1%),或氧化三甲胺(0.025%)促进Δ5-AAT多肽复性,但效果较PEG略低。
尽管为了清除和易于理解的目的已通过图解和实施例的方式对前述发明进行了详细描述,但是,对本领域技术人员显而易见的是,该发明可以进行某些改变和修饰。因此,上述描述和实施例不应理解为对本发明范围的限制,本发明的范围由所附的权利要求书定义。
Claims (21)
1.生产复性的重组AAT多肽的方法,其特征在于:包括:
a) 用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,由此产生溶解的AAT多肽溶液;所述的溶解缓冲液包含8 M 尿素,0.1 M Tris,1 mM甘氨酸,1 mM EDTA, 100 mM β-巯基乙醇,并且其 pH 为 10.5;
b) 用溶解缓冲液Ⅱ调解溶解的AAT多肽溶液的A280 到2.0 至 10.0;所述的溶解缓冲液Ⅱ包含 8 M 尿素,0.1 M Tris,1 mM甘氨酸,1 mM EDTA, 10 mM β-巯基乙醇, 10 mM 二硫苏糖醇,和 1 mM还原的谷胱甘肽 ,并且其 pH为 10.5;
c)将上述溶解的AAT多肽溶液冲稀到二十倍体积的复性缓冲液中,由此产生稀释的溶解的AAT多肽溶液;
其中的复性缓冲液是:包含20 mM Tris,pH 10.5,和任何的下列成分:1) 5% 至30% 甘油, 2) 10 %至 20% 蔗糖, 3) 5% 至 10%聚乙二醇 ;
d) 将稀释的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至7.5到8.5,其中所述pH的降低用至少20小时完成,由此产生了复性的AAT多肽;
所述的AAT多肽的氨基酸序列是:SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:1的氨基酸序列的10-394;
所述溶解缓冲液和复性缓冲液的pH相同;
所述的变性的AAT 多肽来源于细菌包涵体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的AAT多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的复性缓冲液是20 mM Tris,10%甘油,pH 10.5。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的复性缓冲液是20 mM Tris,10% PEG200,pH 10.5。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的复性缓冲液是20 mM Tris,5% PEG600,pH 10.5。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述复性缓冲液还包含从下一组化合物中所选的去污剂:吐温-20,吐温-80, 脱氧胆酸钠, 胆酸钠,和氧化三甲胺。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤b)中用溶解缓冲液Ⅱ调解溶解的AAT多肽溶液的A280 到2.0 。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的复性缓冲液还包含0.001% 至 0.02% 的吐温-20。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于:还包括纯化所述复性的AAT 多肽。
10.生产复性的重组AAT多肽的方法,其特征在于:包括:
a) 用溶解缓冲液溶解变性的AAT多肽,由此产生溶解的AAT多肽溶液;所述的溶解缓冲液包含8 M 尿素,0.1 M Tris,1 mM甘氨酸,1 mM EDTA, 100 mM β-巯基乙醇,并且其 pH 为 10.5;
b) 用溶解缓冲液Ⅱ调解溶解的AAT多肽溶液的A280 到2.0 至 10.0;所述的溶解缓冲液Ⅱ包含 8 M 尿素,0.1 M Tris,1 mM甘氨酸,1 mM EDTA, 10 mM β-巯基乙醇, 10 mM 二硫苏糖醇,和 1 mM还原的谷胱甘肽 ,并且其 pH为 10.5;
c)将上述溶解的AAT多肽溶液冲稀到二十倍体积的复性缓冲液中,由此产生稀释的溶解的AAT多肽溶液;
其中的复性缓冲液是:包含20 mM Tris,pH 10.5,和任何的下列成分:1) 5% 至30% 甘油, 2) 10 %至 20% 蔗糖, 3) 5% 至 10%聚乙二醇;
d) 将稀释的溶解的AAT多肽溶液在16℃至20℃孵育至少16小时;
e) 进一步将稀释的溶解的AAT多肽溶液在4℃孵育24至72小时;
f) 将稀释的溶解的AAT多肽溶液交换成具有pH7.5至8.5的缓冲液,由此产生复性的AAT多肽;
所述的AAT多肽的氨基酸序列是:SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:1的氨基酸序列的10-394;
所述溶解缓冲液和复性缓冲液的pH相同;
所述的变性的AAT 多肽来源于细菌包涵体。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于:进一步包含在步骤f) 之前将稀释的溶解的AAT多肽溶液浓缩的步骤。
12.如权利要求10所述的方法,其特征在于:用透析或分子排阻层析法执行所述步骤f) 。
13.如权利要求10所述的方法,其特征在于:步骤b)中用溶解缓冲液Ⅱ调节溶解的AAT多肽溶液的A280 到2.0。
14.如权利要求10所述的方法,其特征在于:所述的复性缓冲液还包含0.005% 至 0.02% 的吐温-20。
15.如权利要求1或10所述的方法,其特征在于,还包括将正确复性的AAT多肽从不正确复性的或非复性的AAT多肽中纯化出来的方法,此方法包括:a) 在盐溶液中将不正确复性的或非复性的AAT多肽与疏水作用层析树脂结合;和b) 收集没有同树脂结合的正确复性的AAT多肽。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于:其中所述的盐是下列的任何一种:硫酸铵,氯化钾,或氯化钠。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于:其中所述的盐浓度是0.25 M至1.2 M的硫酸铵,或1.0 M至 3.5 M的 氯化钾,或1.0 M至 3.5 M的氯化钠。
18.包括权利要求1或权利要求10所述方法生产的复性的AAT多肽的组合物在制备治疗AAT缺乏症药物中的应用。
19.如权利要求18所述的应用,其特征在于:所述的组合物还进一步包括药用赋形剂。
20.如权利要求18所述的应用,其特征在于:所述的组合物,其中所述AAT多肽与聚乙二醇 分子以化学修饰的方法结合。
21.包含利用权利要求1或权利要求10 中所生产的复性的AAT多肽的治疗AAT缺乏症的药剂盒。
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