CN1134111A - 使用胰岛素样生长因子结合蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用包括IGFBP-1或IGFBP-1的修饰形式在内的胰岛素样生长因子结合蛋白质(“IGFBP”)作为治疗剂的方法。修饰形式包括接合到聚合物的IGFBP-1和两个接合到聚合物之相对两端上的IGFBP-1分子。该方法包括给具有IGF相关病症的患者使用足以产生治疗效果的IGFBP，它包括IGFBP-1或修饰形式的IGFBP-1。本发明还涉及可用于该方法的非磷酸化的IGFBP。

Description

使用胰岛素样生长因子结合蛋白质的方法
发明的所属领域
本发明涉及使用胰岛素样生长因子结合蛋白质1(IGFBP-1或BP-1)作为治疗剂。
发明的背景
循环胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)是结构上彼此相关并与胰岛素相关的7kDa蛋白质。IGF-I和IGF-II是体内大多数细胞的生长和分化因子并以高浓度存在于血清中(IGF-I约为300ng/ml，IGF-II约为1000ng/ml)。IGF-I的循环水平主要是由生长激素(GH)决定，后者刺激肝脏产生IGF-I。据信生长激素的大多数生长促进作用是由IGF-I介导的。
还存在有组织IGF。如用凝胶层析法测知的，组织IGF-I具有比循环IGF更大的表观分子量(约2 6 kDa)(Rom，W.N.et al.，J.Clin，Invest.，82：1685-1693(1988))。
已显示IGF-I和IGF-II在许多病症下起作用。这些疾病包括例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、肝癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、血管再狭窄(restenosis)、肢端巨大症、肥胖、肿瘤诱发的低血糖症、肺纤维化、糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病。
Daughaday(Endocrinol.127：1-4，1990)讨论了胰岛素样生长因子在人肿瘤中的作用。例如，如Cullen等人在CancerInvestigation，9：443-454(1991)中所报导的，据信IGF-I和IGF-II对于包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、Wilm氏瘤及横纹肌肉瘤在内的多种肿瘤起到自分泌或旁分泌生长因子作用。如Yee等人在Cancer Res.，48：6691-6696(1988)中以及Osborne等人在Mol.Endocrinol.3：1701-1709(1989)中所报导的，已证明多种原发性肿瘤过量表达IGF-I或IGF-II并表达这些生长因子的受体。大量体外研究显示，由上述一些肿瘤衍生的人细胞系在对IGF-I和IGF-II反应中发生增殖。在有的情况下显示出细胞系可产生IGF-I或IGF-II，并具有IGF-I和IGF-II的细胞表面受体。在有些例子，特别是乳腺癌中，已证明肿瘤周围的体细胞分泌造成旁分泌生长关系的IGF-I和IGF-II。
在美国，乳腺、肺和结肠癌是影响到达500,000人的三种最常见的癌症。可显示IGF-I和IGF-II在这些癌症生长中的作用的最强有力的证据是，实验表明抗IGF-I受体的抗体可阻断裸鼠体内由衍生于这些类型人肿瘤的大量细胞系导致的肿瘤形成。
如Tricoli等人在Cancer Research，46：6169-6173(1986)中所报导的，对人结肠癌活体组织的分析显示，在所分析的40％肿瘤中IGF-II过量表达10至50倍。IGF-II过量表达的水平与侵入肠壁的程度相关。
Nakanishi等人(J.Clin.Invest.，82：354-359，(1988))已报导。IGF-I可介导入小细胞肺癌细胞系NCI-H345和NCI-N417的自分泌增殖。
卵巢癌细胞系OVCAR-3、OVCAR-7和PEO4表达IGF-ImRNA。Yee等人在Cancer Res.，51：5107-5112(1991)中报导，原发性和转移卵巢癌组织也表达IGF-I mRNA及I型IGF受体mRNA。
Blatt等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.123：373-376(1984))和Canalis(J.Clin.Invest.66：709-719(1980))报导了正常和恶性骨细胞都可分泌IGF-I并对IGF-I有反应。
在肝组织中，IGF-II mRNA表达在发育上受到调节。Cariani等人(J.Hepatology，13：220-226(1990))报导，在北美土拨鼠、人和大鼠的肝癌组织中测到了IGF-II mRNA水平的增加。
三个人前列腺癌细胞系，即PC-3 DU-145和LNCa FGC均产生实质量的IGF-I并持续呈现自动磷酸化的IGF-I受体(Pietrzkowsky，Z.et al.，Cancer Research，53：1102-1106(1993))。Pietrzkowsky等人报导，所有这三个细胞系的生长均受到IGF-I受体RNA之反义寡脱氧核苷酸，或者受到与IGF-I竞争结合其受体的IGF-I肽类似物的抑制。
横纹肌肉瘤是儿童最常见的软组织肉瘤，并且似乎从发育的横纹肌生成细胞产生的。EI-Badry等人(Cell Growth &Differentiation，1：325-331(1990))曾述及在横纹肌肉瘤组织中出现升高水平的IGF-II mRNA。
如上文提出的，胰岛素样生长因子与某些非癌疾病如肢端巨大症和血管再狭窄有关。肢端巨大症起因于生长激素(GH)的过度产生。生长激素通过刺激IGF-I的产生起作用。因此，肢端巨大症与IGF-I水平的增加有关。
大约25-55％经受血管成形术手术的患者在6个月内发生血管再狭窄即动脉血管再闭塞。动脉内膜层增厚是其主要原因。内膜增厚是因平滑肌增生和细胞外基质成分分泌造成的。如Cercek等人(Circulation Research，66：1755-1760(1990))报导的。已表明在血管成形手术后剥脱的动脉中IGF-I基因表达被诱导了9倍。IGF-I基因表达的时间进程和水平是与平滑肌细胞增生密切相关的。如Khorsandi等人(J.Clin.Invest.，90：1926-1931(1992))所报导的，杂交研究表明分裂中的平滑肌细胞显示出增加了IGF-I基因的表达。如Khorsandi等人(Atherosclerosis，93：115-122(1992))所报导的，其他研究工作表明，有低循环IGF-I水平的动物(因切除其脑垂体所致)在血管成形术后更大程度地减少了内膜增厚。
与某些肿瘤有关的低血糖症很长时间以来就被人们所知道。在从再发性低血糖症患者体内切除的平滑肌肉瘤中，观察到有不寻常高水平的IGF-II mRNA和IGF-II免疫反应性肽(Daughaday，W.H.，et al.，New England Journal of Medicine，Vol.319，No.22：1434-1440(1988))。在切除平滑肌肉瘤后，低血糖症有所缓解。研究肿瘤诱发的低血糖症的其他人报导，发现在肿瘤治疗前血浆IGF-II水平升高，而在肿瘤治疗后则可促进IGF-II水平降低及低血糖症恢复(Axelrod，L.and Rou，D.，New England.Journalof Medicine，Vol.319，No.22：1477-1479(1988))。
体内给予IGF-I也可诱发低血糖症(Lewitt，M.S.，et al.，Endocrinology，Vol.129，No.4：2254-2256(1991))。Lewitt等人还报导了体外研究显示IGFBP-1可抑制葡萄糖掺入大鼠脂肪组织的脂肪酸中。
在肺纤维化组织中，被活化的肺泡巨噬细胞数目增加并且在肺泡壁中有纤维母细胞的过多积聚。纤维母细胞分泌细胞外胶原蛋白基质。纤维母细胞和基质分泌引起肺泡壁增厚并造成肺泡-毛细血管单位的损失，已表明被激活的肺泡巨噬细胞可释放IGF-I以作为纤维母细胞的复制信号(Rom，W.N.et al，J.Clinic.Invest.，82：1685-1693(1988))。已证明来自肺间质病变患者的肺泡巨噬细胞自发分泌这种IGF-I(Bitterman，P.S.et al.，J.Chin，Invest.，72：1801-1813(1983))。目前，肺瘤和非肿瘤性疾病的治疗方法包括手术、放射治疗、化学疗法及激素治疗。例如，可用外科手术、放疗和化学治疗剂治疗如乳腺、肺、卵巢、结肠以及骨肉瘤等不同癌症。用于治疗这些癌症的化学治疗剂包括氟嘧啶和烷基化剂。这两类药物均表明有明显的毒性，例如包括骨髓抑制、免疫抑制、中性白细胞减少、胃肠毒性、肾毒性及外周神经病变。另外，尚没有已知治疗肝癌的有效化学治疗剂。外科手术是高度侵害性的并且是不可预见后果的，而放射治疗则在定位点上是非特异的。激素疗法具有不利的付作用如不期望的毛发生长和情绪改变。
已证明抗I型IGF-I受体的抗体在体外阻断IGF-I反应性瘤细胞系的生长。研究表明，抗IGF-I受体的抗体阻断移植到免疫缺陷裸鼠体内的某些乳腺和肺癌细胞的生长(Arteaga et al.，J.Clin，Invest.，84：l418-1423(1989))：Zia et al.，Proc.Amer.Assoc.for Cancer Research，33：270，Abstract 1616(1992))。
如Trojan等人(Proceedings of the National Academyof Science，89：4874-4878(1992))所述，已显示IGF-I基因的反义序列阻断移植到大鼠体内的恶性大鼠神经胶质瘤细胞系的生长。但使用反义序列进行基因治疗仍处于早期发展阶段。
因此，需要有一种抑制IGF在上述肿瘤和病症中所发挥的作用的药剂。本发明提供了这样一种称为IGFBP-1的抑制IGF在这些疾病中的不适当作用的IGF抑制剂。
发明的概要
本发明涉及使用胰岛素样生长因子结合蛋白质(IGFBP)作为治疗利以治疗或预防IGF相关病症的方法。在本发明的特定实施方案中，结合蛋白质是IGFBP-1，也称为“BP-1”。本发明还涉及使用修饰形式的IGFBP作为治疗剂的方法。例如，修饰形式的IGFBP-1包括连接到聚合物上的IGFBP-1或连接到聚合物上的2或多个IGFBP-1分子。该方法包括给具有IGF相关病症的患者使用足以引起治疗效果的包括例如IGFBP-1或修饰形式之IGFBP-1在内的IGFBP。就IGFBP-1来说，可望当患者的血流中循环IGFBP-1的水平在大约每毫升0.1μg至300μg时，即可达到治疗效果。其中可以使用IGFBP，特别是IGFBP-1治疗或预防的病症的例子包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、肝癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、血管再狭窄、肢端肥大症、肥胖、肿瘤诱发的低血糖症、肺纤维化、糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病。本发明还涉及含有IGFBP，特别是IGFBP-1或经修饰形式的IGFBP-1的药物组合物，以及使用该药物组合物治疗或预防IGF相关病症的方法。
本发明的详细描述
IGF-I和IGF-II的不适当表达和利用是造成许多病症的因素。预期给予IGFBP特别是IGFBP-1可以对与IGF，特别是IGF-I或IGF-II的不适当表达或利用相关的病症发挥有用的治疗作用。因此，本发明涉及使用足以引起治疗效果量的IGFBP，包括IGFBP-1或经修饰形式的IGFBP-1，以治疗有IGF相关病症的患者或预防IGF相关病症的方法。
对本说明书中使用的术语限定如下：
术语“可接受的药物载体”是指生理上相容的，含水或不含水溶剂。
除另外指出者外，术语“IGF-I”是指含有与天然IGF-I有相同氨基酸序列的蛋白质，或含有与天然IGF-I相同的氨基酸序列同时加有N-末端甲硫氨酸的蛋白质(met-IGF-I)。
术语“IGF”是指与包括例如IGF-I、IGF-II、(des 1-3)IGF-I、met-IGF-I、胰岛素在内的I型IGF的受体结合的任何多肽，以及与I型受体结合的任何活性片段。Blundell和Humbel(Nature，287：781-787(1980))描述了该激素家族。
术语“IGF相关病症”是指由IGF、IGF结合蛋白质或IGF受体的过量表达或产生不足，IGF与结合蛋白质或受体的不适当或不充分地结合导致的或与之相关的已有或潜在的不利生理病症，以及其中给予使用IGFBP，特别是IGFBP-1缓解或减少病症的任何疾病。IGF相关病症还指其中给正常患者使用包括IGFBP-1在内的IGFBP具有预期效果的病症。IGF相关病症的例子包括乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、横纹肌肉瘤、卵巢癌、肝癌、肢端巨大症、肥胖、肿瘤诱发的低血糖症、肺纤维化、血管再狭窄、糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病。
术语“患者”是指需要治疗IGF相关病症的包括人在内的任何动物。
术语“IGFBP”是指六种已知IGF结合蛋白质中的任何一种，或这些与IGF结合的结合蛋白质的片段。在血中循环的IGF-I和IGF-II与六种特异性结合蛋白质结合是已知的。结合蛋白质结合血液中95％或更多的IGF。一种理论是当被结合蛋白质结合时，IGF-I和IGF-II即不能与介导其生物功能的某些细胞表面受体相互作用。
IGF结合蛋白质-1是一种23kDa IGF结合蛋白质。IGFBP-1在生长停滞期间(如饥饿和糖尿病)在体内表达，提示IGFBP-1起到IGF-I抑制剂的作用。Oh等人(Endocrinol.132：1337-1344(1993))报导，IGF-I和IGF-II对IGFBP-1有基本上相当的亲和性。
羊水是IGFBP-1的天然来源并含有磷酸化和非磷酸化形式的这种结合蛋白质(Jones，J.I.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.88：7481-7485(1991))。磷酸化的BP-1比非磷酸化的BP-1对IGF-I的亲和性更高(Jones，J.I.et al.，J.Biol.Chem.，268，2：1125-1131(1993))。Jone等人推测磷酸化的BP-1是细胞生长抑制剂，而非磷酸化的BP-1是细胞生长刺激剂。在细菌中表达的重组产生的BP-1是非磷酸化的，并且已显示可增强IGF-I的效应(Iadin，D.et al.，J.CellularBiochemistry，Supplement 17E：127(1993))。
但本文提供的数据证明，非磷酸化的IGFBP-1在体外和体内也可以抑制细胞生长。具体地说，已发现衍生于细菌的重组BP-1抑制伴随某些IGF相关病症的损伤性细胞生长。
因此，用于本发明方法的IGFBP-1可以是磷酸化的或非磷酸化的。从而，可以从如羊水的天然来源中纯化或者可按照本领域已知的重组方法生产用于本发明的BP-1。成熟IGFBP-1的氨基酸序列是：Ala-Pro-Trp-Gln-Cys-Ala-Pro-Cys-Ser-Ala-Glu-Lys-Leu-Ala-Leu-Cys-Pro-Pro-Val-Ser-Ala-Ser-Cys-Ser-Glu-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys-Pro-Met-Cys-Ala-Leu-Pro-Leu-Gly-Ala-Ala-Cys-Gly-Val-Ala-Thr-Ala-Arg-Cys-Ala-Arg-Gly-Leu-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Pro-Gly-Glu-Gln-Gln-Pro-Leu-His-Ala-Leu-Thr-Arg-Gly-Gln-Gly-Ala-Cys-Val-Gln-Glu-Ser-Asp Ala-Ser-Ala-Pro-His-Ala-Ala-Glu-Ala-Gly-Ser-Pro-  Glu-Ser-Pro-Glu-Ser-Thr-Glu-Ile-Thr-Glu-Glu-Glu-Leu-Leu-Asp-Asn-Phe-His-Leu-Met-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-His-Ser-Ile-Leu-Trp-Asp-Ala-Ile-Ser-Thr-Tyr-Asp-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-His-Val-Thr-Asn-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Glu-Pro-Cys-Arg-Ile-Glu-Leu-Tyr-Arg-Val-Val-Glu-Ser-Leu-Ala-Lys-Ala-Gln-Glu-Thr-Ser-Gly-Glu-Glu-Ile-Ser-Lys-Phe-Tyr-Leu-Pro-Asn-Cys-Asn-Lys-Asn-Gly-Phe-Tyr-His-Ser-Arg-Gln-Cys-Glu-Thr-Ser-Met-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Leu-Cys-Trp-Cys-Val-Tyr-Phe-Trp-Asn-Gly-Lys-Arg-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Glu-Ile-Arg-Gly-Asp-Pro-Asn-Cys-Gln-Ile-Tyr-Phe-Asn-Val-Gln-Asn(sEQ ID NO.：1).
信号序列的氨基酸序列是：Ser-Glu-Val-Pro-Val-Ala-Arg-Val-Trp-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Val-Gln-Val-Gly-Val-Thr-Ala-Gly(SEQ ID No.：2).
依据SEQ ID NO：1，本领域技术人员可以化学合成编码IGFBP-1的DNA。另外，本领域技术人员也可以基于SEQ ID NO：1设计寡核苷酸探针，以分离基因组DNA或mRNA并产生cDNA。可以用编码IGFBP-1的DNA转化宿主以重组生产该蛋白质。
例如，可以在使用T7启动子系统的E.coli BL21/DE3中表达作为包涵体中之不溶性蛋白质的BP-1。Studier，F.W.和Moffatt，B.(J.Mol.Biol.189：113-30(1986))描述了BL21/DE3菌株。另外也可以使用TAC启动子系统。在E.coli中，重组表达的BP-1包含在可溶性部分中。该不溶性蛋白质不适当地折叠并且是无活性的。可以将该蛋白质溶解在6M胍和还原剂中。将混合物稀释10倍并允许BP-1重新折叠过夜，以使BP-1变性并折叠成其适当的构象。IGFBP-1含有18个半胱氨酸残基，据信所有这些半胱氨酸均参予形成二硫桥键。尽管BP-1中有大量的半胱氨酸残基，但蛋白质还是重新折叠形成单一的主要形式。可以使用一系列Q-琼脂糖和丁基-琼脂糖柱纯化重新折叠的蛋白质。每10升发酵液纯化的BP-1的产率约1.5g。
也可以在Jones，J.I.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.88：7481-7485(1991)和J.Biol.Chem.，268，2：1125-1131(1993)，两文献均列为本文参考文献)列举的哺乳动物表达系统中表达IGFBP-1。为了在哺乳动物系统中表达，可以使用编码成熟蛋白质和信号序列的DNA。本领域技术人员可以按需要选择任何适当的载体和表达系统。
可以通过增加包括IGFBP-1在内的IGFBP的循环半寿期来提高其治疗实用性。已知例如通过将聚乙二醇(PEG)等惰性聚合物链共价结合到蛋白质上以增加蛋白质的分子量，即可提高蛋白质在体内的循环半寿期(如参见Davis et al.，Biomedical Polymers：PolymerieMaterials and Pharmaceuticals for Biomedical Use，pp.441-451(1980))。PEG与蛋白质共价结合本文称为“PEG化”(“PEGylation”)。术语“PEG化的”(“PEGylated”)是指与聚合物结合的。
PEG化的一种有用方法包括产生突变型蛋白，该突变蛋白上有用来与被巯基特异性反应基团激活的聚合物结合的半胱氨酸残基。可以使用本领域已知的诱变技术制备突变型蛋白。例如，可以用半胱氨酸残基取代一个或多个特定氨基酸，或在氨基酸之间或N或C末端上插入半胱氨酸残基以产生IGFBP-1突变型蛋白。可望这样的非固有半胱氨酸残基将是“游离的”，即未参予形成分子内二硫键。非固有半胱氨酸残基可以被取代或插入IGFBP-1分子的暴露于蛋白质表面上的区域中，并且未参予受体结合或与IGF结合。半胱氨酸的一个插入或取代位点可出现在BP-1蛋白质分子的中间部分。据信半胱氨酸可以被取代或插入基于SEQ ID NO：1之残基数码的氨基酸60至180之间。特别有用的突变型蛋白包括在98和101位上的半胱氨酸残基取代这些位置上天然存在之丝氨酸的蛋白质。
将惰性聚合物链分子结合到一个或多个IGFBP-1分子上产生进一步修饰的IGFBP-1形式，即也称为“PEG化的IGFBP-1”的IGFBP-1-聚合物结合体。PCT申请公开No.WO92/16221中讨论了将巯基特异性反应基团与聚合物偶联的问题(该文献列为本文参考文献)。如果半胱氨酸突变型蛋白质通过巯基特异性反应基因被偶联到聚合物上，则可望所形成的结合物是在非固有半胱氨酸处结合到蛋白质上。但在突变型蛋白的再折叠期间，非固有半胱氨酸可能会参予形成二硫键，从而游离出一个用来PEG化的固有半胱氨酸。在这种情况下，聚合物即在该固有半胱氨酸残基处结合。可以使用肽图谱法确定特定的PEG化位点。
还期望有含有2个IGFBP-1分子的，即在聚合物分子的每一末端各有一个的“哑铃状”分子。
使用常规方法，和PCT申请公开No.WO92/16221中描述的技术(该文献列为本文参考文献)，以及本文提供的技术，本领域技术人员可以很容易地确定用于制备这些包括IGFBP-1在内的经修饰IGFBP的适当pH、蛋白质浓度，及蛋白质对聚合物的比例。
本发明进一步提供在药用可接受的载体上含有包括IGFBP-1在内的IGFBP的药物组合物。一种载体是生理盐溶液，但也可以使用其他可接受的药用载体。在一个实施方案中，期望由载体和IGFBP-1卡成生理上可相容的，缓慢释放的配制品。这样一种载体中的基本溶剂在性质上可以是含水的或不含水的。另外，载体可含有用来改变或维持配制品的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速度或气味的其他医药学上可接受的辅助剂。同样，载体还可含有用于改变或维持IGFBP-1的稳定性、溶解速度、释放，或吸收的其他医药学上可接受的辅助剂。这些辅助剂是那些通常或常规用于配制以单位剂量或多剂量形式给药之制剂的物质。
一旦配制了治疗组合物，即可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体制剂、或脱水或冻干粉来储存于无菌容器中。这样的配制品可以以直接使用的形式或需要在给药前重新溶解的形式储存。这种配制品的优选储存条件是至少低至4℃并更好是在-70℃的温度下。另外，也可在或接近生理pH的条件下储存并施用这种含有IGFBP-1的配制品。目前相信在高pH(即大于9)或低pH(即低于4)条件下储存和施用此配制品是不理想的。
可以经静脉内、非肠道的、肌肉内、皮下、关节内注射途径，或以灌注液、吸入喷雾剂、口服活性配制品或栓剂形式使用本发明的药物组合物。为了达到并维持所期望的IGFBP-1剂量，可以重复给药。这种方法想使IGFBP-1在患者血流中保持预定的浓度范围。据信使血流中IGFBP-1的循环浓度保持在每毫升0.1μg至300μg即可有效地治疗IGF相关病症。给药频率将取决于所使用的配制品中IGFBP-1的药物动力学参数。
本发明的方法部分基于下列实施例中所述的实验结果。简单地说，本发明人发现IGFBP-1可体外阻断IGF-I和IGF-II对乳腺癌、结肠癌和骨肉瘤细胞的促有丝分裂作用。雌激素通过使细胞分泌IGF-I或IGF-II而至少部分地刺激乳腺癌生长。
抑制结肠癌生长所需的BP-1浓度为1-10μg/ml。一种结肠癌细胞系可生长于无血清培养基中、推测是因它产生了其自身的生长因子。用高浓度的BP-1至少使该细胞系在无血清培养基中的生长受到50％的抑制。
本发明人已证明，IGFBP-1抑制IGF-I对骨肉癌细胞的促有丝分裂作用。大约12倍摩尔过量的IGFBP-1.使50ng/ml IGF-I对大鼠骨肉瘸细胞的促有丝分裂作用抑制达50％。
还表明IGFBP-1抑制平滑肌细胞对IGF-I的增殖反应。在大鼠血管成形术后给予IGFBP-1明显地抑制了因平滑肌增生和细胞外基质沉淀所致的内膜增厚。这些结果表明IGFBP-1在治疗或预防血管再狭窄中是有用的。
在切除垂体的大鼠体内，IGFBP-1抑制了IGF-I和生长激素的生长促进作用。另外，IGFBP-1、其突变型蛋白以及PEG化的IGFBP-1抑制了IGF-I对小鼠3T3成纤维细胞生长的刺激作用。
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
                    实施例1
A.IGFBP-1的纯化和再折叠
以40ml/10g细胞膏的浓度将表达IGFBP-I的E.coli细胞悬浮在缓冲液A(50mM Tris、pH7.5，20mM NaCl和/或1mMDTT)中，并使France细胞破碎器以1800psi的压力破碎细胞。以20,000xg离心细胞悬液30分钟，并以SDS-PAGE法分析细胞沉淀和上清的等分样品。沉淀中存在相当于IGFBP-1的主带，而上清中则没有。将沉淀悬浮于缓冲液A(40ml/10g细胞膏)中，再次以20,000xg离心30分钟。此洗涤过程重复2次。使用毛玻璃匀浆器将含有IGFBP-1的最终沉淀悬浮于6M胍、50mM Tris，pH7.5，6mM DTT(25ml/10g细胞)中。将悬液于室温下保温15分钟。以20,000xg离心30分钟以除去未溶解的蛋白质。IGFBP-I的终浓度为1.0mg/ml。对沉淀和上清液的SDS-PAGE分析显示，IGFBP-1只存在于上清中。
对变性并还原的IGFBP-1进行三步骤再折叠处理。
a)向上清液中加入氧化态谷胱甘肽，即混合的二硫化物生成剂(GSSG)至终浓度为25mM，并于室温下保温15分钟。
b)然后用50mM Tris、pH9.7将溶液逐步稀释10倍并加入苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM。蛋白质的终浓度为100μg/ml。
c)将再折叠混合物于4℃保温过夜，然后以20,000xg离心15分钟。对沉淀和上清液的SDS-PAGE分析显示上清液含有相对均质的IGFBP-1。
用缓冲液C(0.05％TFA)将上清液的等分样品(50μl)稀释至200μl，注射至反相柱(RP-4，1×250mm，Synchrom)上，并使用流速为0.1ml/分钟的线性梯度(增加1％缓冲液D/分钟)，用80％乙腈、0.042％TFA(缓冲液D)洗脱。
于68分钟时洗脱代表再折叠之IGFBP-1的单一主峰。在5M胍、50mM Tris pH7.5、100mM DTT中完全还原并变性后，再折叠之IGFBP-1的保留时间变为71.0分钟。这些结果表明，在所述条件下IGFBP-1再折叠成单一的优势蛋白质。对在68.0分钟洗脱的IGFBP-1的N末端序列分析给出序列Met Ala Pro Trp Gln CysAla Pro…(SEQ ID NO：3).该序列与人IGFBP-1的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO：1)相匹配，不同的只是重组蛋白质的N末端上多一个甲硫氨酸残基。
B.再折叠之IGFBP-1的分离
将从含有正确再折叠之IGFBP-1的590g E.coli膏制备的再折叠混合物(15000ml)浓缩到1800ml，对20mM磷酸钠(pH6.0)透析，以10,000xg离心30分钟以除去沉淀的E.coli蛋白质，并加于预先用同样缓冲液平衡过的Q-Sepharose(Pharmacia/LKB，Piscataway，NJ)柱(5.0×60cm)上。以20ml/分钟的流速用5000ml达到0.5M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。每份收集25ml。在0.3-0.4M NaCl时洗脱出单一主峰；用反相层析柱(RP-4，1×250mm Synchrom)分别分析每部分的100μl等分样品。收集合并含有优势正确再折叠之IGFBP-1(根据RP-4分析结果确定的)的部分(900ml)，将pH调到7.5，将导电率调至1mM NaCl(95毫欧姆)，并加于预先用20mM HEPES(pH7.5)、1.0MNaCl以30ml/分钟的流速平衡过的Toyopearl butyl-650S疏水作用柱(5×5cm)(Supelco，Bellefonte，PA)上。
以40ml/分钟的流速用1500ml达到20mM HEPES，pH7.5的线性梯度洗脱蛋白质。在5-15％乙醇处洗脱出单一宽峰。用RP-4反相层析法和SDS-PAGE法分析各峰部分的等分样品(10μl)。合并含有纯的(95％)正确再折叠之IGFBP-1的各部分，浓缩至6-8mg/ml并检测其生物活性。在下列所有使用IGFBP-1的实验中，均使用重组体E.coli表达的IGFBP-1。
                        实施例2
            IGFBP-1抑制IGF-I和生长激素
            在大鼠体内的生长促进作用
从动物体切除垂体以去掉生长激素的来源并致使其生长停止。可按Schoenle等人(Nature，296：252-253(1982))所述方法经注射外源生长激素或IGF-I，以刺激切除垂体的动物生长。在该模型中试验皮下给予IGFBP-1对IGF-I和生长激素刺激生长的影响。经检测体重增加和胫骨骺宽度估计动物生长情况。
A.IGF-I实验
由商业来源(Charles River，Wilmington，MA)得到体重为120-130g的手术切除了脑垂体的雄性Sprague Dawley大鼠。在实验开始前2至3周监测大鼠的体重，以证实脑垂体已完全切除。研究中排除每周体重增加2g以上的大鼠。用0.2ml载体溶液(40mMHEPES、100mM NaCl)、单一IGF-I(80μg)、单一IGFBP-1或以不同摩尔比例与BP-1合并的IGF-I(80μg)，在大鼠颈背部每天两次皮下注射，连续注射8天。试验的IGFBP-1：IGF-I的摩尔比例为0.04∶1至5∶1。每天测体重。在接受最后一次注射后12小时杀死动物。切掉动物的右和左胫骨，用福尔马林固定，在矢状面上断裂其远端并按Greenspan(Endocrinology，45：455-463(1949))所述用硝酸银染色。钙化的组织染成深褐色，并且软骨的增殖带呈现为有清晰界限的白色带状。用装有精细测微镜片的立体显微镜测量软骨骺板。得出约10个通过各骨骺的读数。计算每只大鼠的右和左胫骨之联合读数的平均值。
几次实验的结果总结于表1中。注射载体的大鼠在试验的8天期间没有增加体重，而注IGF-I的大鼠在该期间里每只大鼠平均体重增加了大约6克。以5∶1的IGFBP-1：IGF-I处理的大鼠没有显示明显的体重增加，表明在该模型中过量IGFBP-1阻断了IGF-I的生长促进作用。以相对于IGF-I以1∶1和0.2∶1的摩尔比例注射IGFBP-1对IGF-I刺激的生长产生了50-75％的抑制作用。在所有接受IGFBP-1的各组中没有检测到单用IGF-I刺激的生长增进。另外，单虫给予IGFBP-1也没有明显的生长促进作用。给用相对于IGF-I的摩尔比例为5∶1和1∶1的IGFBP-1，可见对IGF-I刺激的胫骨骨骺宽度加大具有统计学上显著的抑制作用(表1)。这些数据表明IGF8P-1抑制由IGF-I刺激的骨和软骨生长。
                      表1
            皮下注射IGFBP-1对IGF-I刺激的
             体重和胫骨骺宽度增加的影响
    IGF-I*(μg/注射)   IGFBP-1*(μg/注射)    IGFBP-1：IGF-1摩尔比     体重增加(克)    胫骨骺宽度**(mm)
0 0 0∶0 0.9±0.8 0.124±0.003
80 0 0∶1 5.6±0.8 0.175±0.006
    80     9.6     0.04∶1     4.7±0.5     0.165±0.010
    80     48     0.2∶1     1.8±0.8     0.181±0.007
    80     240     1∶1     2.6±0.9     0.144±0.008
    80     1200     5∶1     1.4±0.3     0.133±0.006
    0     9.6     0.04∶0     -2.6±0.6     0.126±0.007
    0     48     0.2∶0     -0.5±0.5     0.136±0.005
    0     240     1∶0     -0.25±0.5     0.132±0.005
    0     1200     5∶0     -1.3±0.4     0.124±0.003
*    大鼠每天接受两次注射。
**    数值是每组8至15只大鼠的平均数±平均数的标准差。
B.生长激素实验
本实验的设计与IGF-I实验相同，不同的只是大鼠接受生长激素而不是IGF-I注射。在不同的注射部位皮下注射生长激素和IGFBP-1。以每次注射10mg/kg的量每天注射两次IGFBP-1，这个剂量等于上述实验中以5∶1过量摩尔比例的给药量。以每次注射15毫单位的量每天注射两次人脑垂体产生的生长激素(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。这一生长激素剂量比前述实验中所用的IGF-I在大鼠体内激发了更强的生长反应。在6天给药期间平均每只用生长激素处理的大鼠体重增加12克(表2)。用IGFBP-1处理的大鼠体重增加约受到75％的抑制。相对于用载体处理动物，生长激素刺激的胫骨骨骺宽度约增加两倍(表2)。合用IGF3P-1则使生长激素刺激的胫骨骨骺宽度增加受到约75％的抑制(表2)
                      表2
           皮下注射IGFBP-1对生长激素刺激
             的体重和胫骨骨骺宽度的影响
生长激素(每次注射) IGFBP-1*(μg/注射)     体重增加*(克)     胫骨骺宽度**(mm)
    0     0     -1.2±0.9     0.154±0.009
    15mU     0     12±1.3     0.314±0.014
    15mU     1200     3.4±1.1     0.195±0.010
*    大鼠每天接受两次注射。
**    数值为每组5只大鼠的平均值±平均值的标准差。
上述实验表明，IGFBP-1在大鼠体内能够抑制IGF-I和生长激素的生长促进作用。
实施例3
IGFBP-1在体外抑制人乳腺癌细胞的生长
针对人乳腺癌细胞系检测IGF-I、IGF-II和IGFBP-1的生物学作用。人乳腺癌细胞系MCF7得自位于Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(登记号HTB22)。细胞维持于含有10％小牛血清、10μg/ml胰岛素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、10μg/ml链霉素和非必需氨基酸(Irvine Scientific)的Eagle氏极限必需培养基(得自Mediatech，Merndon，VA)中。为了进行细胞增殖试验，经用胰蛋白酶和EDTA简单处理从平皿中离散出MCF7细胞。以加在无血清培养基(含有1mg/ml牛血清白蛋白、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和非必需氨基酸的Eagle氏极限必需培养基)中每孔2×104个细胞的量，将细胞铺敷于96孔组织培养板(CostarCorporation，Cambridge，MA)中。以200μl的终体积向各孔中加入不同稀释度的IGF-I、IGF-II或IGFBP-1。37℃保温4天后，向各孔中加入20μl浓度为5mg/ml的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物；可得自SigmaChemical Company，编目号N5655)。将细胞继续于37℃保温6小时。加入50μl含50％二甲基甲酰胺、20％十二烷基硫酸钠(pH4.7)的溶液，以溶解细胞和水解的MTT。37℃保温过夜后，用VMAX动力学微量平板读数器(Molecular Devices Corporation，Palo Alto，CA)在570nm处测定液体的光密度并减去650nm光密度本底，以定量水解的MTT。
如根据细胞培养物的光密度增加所证实的，IGF-I和IGF-II均引起了MCF7细胞的增殖(表3)。IGF-I刺激MCF7细胞增殖的能力约比IGF-II强5倍。在IGF-I浓度约为1-120ng/ml，IGF-II浓度约为10-1200ng/ml时出现MCF7细胞增殖。IGFBP-1以一种剂量依赖方式抑制IGF-I和IGF-II刺激的MCF7细胞增殖(表4和5)。这是在渐增量的IGFBP-1存在下，将MCF7细胞与60ng/ml的IGF-I或300ng/ml的IGF-II一起保温后测知的。除不含血清或胰岛素外，所使用的组织培养基与用来维持细胞生长的培养基相同。
对于IGF-I，试验的IGFBP-1浓度范围为6至13,600ng/ml。在IGFBP-1浓度约为180ng/ml，即相当于IGF-I∶IGFBP-1为大约1∶1摩尔比时出现大约50％的生长抑制作用(表4)。当IGFBP-1浓度超过4000ng/ml，即相当于使用约20倍摩尔过量的IGFBP-1时，达到基本上完全的生长抑制。
对于IGF-II，所试验的IGFBP-1浓度范围约为30ng/ml至23,000ng/ml。在IGFBP-1浓度约为840ng/ml即稍大于IGF-I∶IGFBP-1约为1∶1的摩尔浓度比时，使IGF-II生长反应受到约50％的抑制(表5)。当IGFBP-1浓度超过22,000ng/ml，即相当于稍大于20倍摩尔过量的IGFBP-1时，出现基本上完全的生长抑制作用。
                        表3
         IGF-I和IGF-II对MCF-7乳腺癌细胞生长的刺激作用
IGF-I*(ng/ml)       O.D.**570-650nm     IGF-II*(ng/ml)     O.D.**570-650nm
    0     0.121     0     0.121
    1     0.140     10     0.139
    2     0.140     19     0.149
    4     0.150     38     0.181
    8     0.169     75     0.195
    15     0.189     150     0.216
    30     0.217     300     0.256
    60     0.273     600     0.321
    120     0.330     1200     0.411
*    IGF-I和IGF-II浓度值四舍五入取最接近的整数。**   570nm处光密度减去650nm处光密度。为一式三孔的平均值。
标准偏差小于平均值的11％。
                   表4
        IGFBP-1对IGF-I刺激的MCF-7
        乳腺癌细胞生长的抑制作用
IGFBP-1*(ng/ml) IGF-I(ng/ml) O.D.**570-650nm ％抑制率
    0     0     0.260
    0     60     0.610     0％
    6     60     0.543     19％
    19     60     0.472     39％
    56     60     0.489     35％
    168     60     0.443     48％
    504     60     0.372     68％
    1,511     60     0.330     80％
    4,533     60     0.286     93％
    13,600     60     0.242     105％
*    IGFBP-1浓度值四舍五入取最接近的整数。**   570nm处光密度减去650nm处光密度。为一式三孔的平均值。
标准偏差小于平均值的8％。
                      表5
               IGFBP-1对IGF-I刺激的MCF-7
                乳腺癌细胞生长的抑制作用
    IGFBP-1(ng/ml)     IGF-II(ng/ml)     O.D.*570-650nm     ％抑制率
    0     0     0.126
    0     300     0.357     0％
    31     300     0.345     5％
    93     300     0.299     25％
    280     300     0.277     35％
    839     300     0.243     49％
    2,519     300     0.181     76％
    7,556     300     0.161     85％
    22,667     300     0.144     92％
*   570nm处光密度减去650nm处光密度。为一式三孔的平均值。
标准偏差小于平均值的11％。
实施例4
IGFBP-1在体外抑制人结肠癌细胞系的生长
试验IGF-I和IGFBP-1对多株人结肠癌细胞系的生物学作用。6株人结肠癌细胞系得自位于Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心。这些细胞系是SK-CO-1(HTB 39)、LS174T(CL 188)、DLD-1(CC1 221)、HT-29(HTB 38)、COLO-205(CCL 222)和Caco-2(HTB 37)，括号内的号是指ATCC登记号。之所以选择这些细胞系是因为按照ATCC目录中提供的说明，它们都能在裸鼠体内生成肿瘤。将细胞维持在含有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle氏极限必需培养基(Mediatech，Herndon，VA)中。
按下述方法检测IGF-I对这6株结肠癌细胞系的作用。当细胞达到90-100％汇合时，经用胰蛋白酶/EDTA溶液作简单处理可从平皿上溶散细胞。将细胞洗几次，计数并以1×105个/ml的浓度重新悬浮于无血清培养基(含有2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle氏极限必需培养基)中。在96孔组织培养平板(Corning Glass Works，Rochester，NY)的每个孔中加入100μl细胞悬浮液，在各孔中加入100μl含有不同量IGF-I的无血清培养基，并用吸移法轻轻混合各培养物。将平板于37℃保温3天。此时，使用结晶紫染料检测法定量细胞数。抽掉培养基并在每孔内加入150μl结晶紫染料[2g结晶紫(Aldrich ChemicalCompany，Inc.，Milwaukee，WI)溶解于含270ml 37％甲醛和20ml磷酸钾pH7.0的溶液中]。20分钟后抽出液体并用磷酸盐缓冲盐水将细胞洗3次。在每孔内加入200μl抽提缓冲液(50％乙醇、0.1M柠檬酸钠pH4.2)并在室温下将平板放置过夜。第二天使用微量平板读数器(Molecular Devices，Palo Alto，CA)测出小孔的570nm光密度。
如根据细胞培养物的光密度增加所证实的，所有6株细胞系均在对IGF-I反应中增殖(表6和7)。Caco-2细胞系在无血清培养基中生长良好，提示它可产生一种或多种内源性生长因子。IGF-I可增加Caco-2细胞系在无血清培养基中的生长(表6)。在所试验的条件下，检测的其他结肠癌细胞系在无血清培养基中没有表现明显的细胞增殖。但正如由培养物的光密度增加所证实的，它们都在对IGF-1的反应中发生增殖(表6和7)。
                          表6
               IGF-I对人结肠癌细胞系生长的刺激作用
    IGF-I*(ng/ml)                          O.D.**570nm
SK-CO-1 CaCO-2 DLD-1 COLO-205 LS174T
    0  0.156     1.253     0.474     0.138     0.144
    1  0.174     1.402     0.493     0.154     0.165
    4  0.218     1.472     0.497     0.163     0.195
    16  0.337     1.796     0.532     0.178     0.242
    63  0.368     1.923     0.558     0.189     0.236
    250  0.391     2.022     0.634     0.219     0.225
    1000  0.376     1.943     0.721     0.218     0.212
*    IGF-I浓度值四舍五入取最接近的整数。**   570nm处光密度一式三孔的平均值。
             表7
IGF-I对人HT一29结肠癌细胞生长的刺激作用
    IGF-I*(ng/ml)     O.D.**570 nm
    0     0.434
    1     0.557
    3     0.627
    13     0.694
    53     0.665
    213     0.631
    850     0.627
*    IGF-I浓度值四舍五入取最接近的整数。
**   570nm处光密度一式三孔的平均值。
然后检测IGFBP-1对这些细胞系生长的作用。与其测定IGFBP-1对IGF-I刺激的细胞生长的作用，不如测定IGFBP-1是否能在血清存在下抑制细胞的生长，这样更能代表体内状态。经用胰蛋白酶/EDTA简单处理，从培养板中离散出细胞，洗细胞，以1×105个细胞/ml的浓摩将细胞再悬浮于含4％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle氏极限必需培养基中，并在96孔组织培养板的每孔中加入100μl细胞悬液。用含有2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清Eagle氏极限必需培养基将IGFBP-I稀释成不同的浓度并在96孔培养板的每孔中加入100μl该混合物。经轻轻抽吸混合细胞培养物并于37℃保温3天。最终血清浓度为2％。此时使用如上文所述的结晶紫染料检验法定量细胞数目，于2％血清存在下，IGFBP-1致使其中4株细胞系(Caco-2、COLO-205、HT-29和SK-CO-1)的生长反应受到明显抑制(表8和9)。当IGFBP-1水平达到每毫升几百毫微克之前可看到小的生长抑制作用。观察到的最大生长抑制率在30％至100％之间(IGFBP-1水平为10-20μg/ml)。IGFBP-1对LS 174T和DLD-1细胞系的血清刺激生长影响较小(IGFBP-1水平在10-20μg/ml时，最大抑制率分别为9和22％)。未检测血清中游离IGF-I和IGF-II的浓度。
                                       表8
                    IGFBP-1对血清刺激的人结肠癌细胞系生长的抑制作用
    血清(％)   IGFBP-1*(ng/ml)        CaCO-2        COLO-205        HT-29
 O.D.**570nm     ％抑制率 O.D.**570nm     ％抑制率 O.D.**570nm     ％抑制率
    0     0  1.253 0.138 0.145
    2     0  1.999     0％ 0.574     0％ 0.556     0％
    2     3  2.076     -10％ 0.591     -4％ 0.510     11％
    2     16  2.023     -3％ 0.542     7％ 0.483     13％
    2     80  1.926     10％ 0.581     -2％ 0.497     14％
    2     400  1.741     35％ 0.466     25％ 0.407     36％
    2     2,000  1.526     63％ 0.386     43％ 0.344     52％
    2     10,000  1.266     98％ 0.304     62％ 0.300     62％
*    IGFBP-1浓度值四舍五入后取最接近的整数。
**   570nm的处光密度。一式三孔的平均值。
                    表9
         IGFBP-1对血清刺激的人SK-CO-1
          结肠癌细胞系生长的抑制作用
    血清(％)     IGFBP-1*(ng/ml)     SK-CO-1
    O.D.**570nm       ％抑制率
    0     0     0.156
    2     0     0.507     0％
    2     1     0.519     -3％
    2     6     0.514     -2％
    2     32     0.496     3％
    2     160     0.432     21％
    2     800     0.406     29％
    2     4,000     0.395     32％
    2     20,000     0.386     34％
*    IGFBP-1浓度值四舍五入后取最接近的整数。
**   570nm的处光密度。一式三孔的平均值。
                    实施例5
        IGFBP-1体外抑制人骨肉瘤细胞系的生长
使用大鼠骨肉瘸细胞系UMR-106 (CRL 1661)检测BP-1抑制IGF-I刺激的骨肉瘤生长的能力。UMR-106(CRL 1661)细胞系得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。细胞被维持于含有7％小牛血清、100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的Ham氏F12培养基(可得自Mediatech，Herndon，VA)中。细胞在对IGF-I反应中发生增殖。将细胞加于48孔组织培养板(Costar Corporation，Cambridge，MA)的各小孔中。当细胞逐渐汇合时(37℃保温约3天后)，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗2次并在没有小牛血清的上述培养基中预保温24小时。预保温后，除去培养基并换成0.5ml含有IGF-I之系列稀释液(1-1,000ng/ml)的无血清Ham氏F12培养基中。将平板于37℃继续保温20-24小时。然后于37℃用0.5μCi的3H-胸苷(NEN research products，Dupont Co.，Boston，NA)脉冲处理4小时，并用冷PBS洗细胞3次。向细胞中加入冷的7％三氯乙酸(J.T.Baker Inc.，Phillipsburg，NJ)从沉淀DNA。用95％乙醇淋洗细胞后，加入0.3M NaOH溶解细胞。收集等分样品，用闪烁计数器计数以测定掺入DNA中的3H-胸苷的量。所有检测均以一或3孔进行。
如表10中所示，IGF-I引起掺入DNA中的3H-胸苷呈剂量依赖性增加。最大反应为不加IGF-I时所看到之反应水平的约6倍以上。在不同的实验中IGF-I的ED50值范围为4-20ng/ml。
           表10IGF-I对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞生长的刺激作用
    IGF-I*(ng/ml) cpms**
    0     34,624
    1     40,636
    2     54,814
    4     99,715
    8     145,525
    16     141,274
    31     187,174
    63     189,257
    125     194,254
    250     184,857
    500     212,929
    1000     197,268
*    IGF-I浓度值四舍五入取最接近的整数。**   每分钟计数，一式三孔的平均值。
使用作了如下改变的上述检测法检测IGFP-1对IGF-I刺激的UMR-106细胞生长的作用。保温步骤后将细胞加在含50ng/mlIGF-I和不同浓度之BP-I(200至16000ng/ml)的Ham氏F12培养基中保温。培养基还含有2mM胍、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。37℃保温20-24小时后，用0.5μCi 3H-胸苷脉冲处理细胞达4小时，用冷PBS洗3次，并用冷7％三氯乙醇沉淀DNA。用95％乙醇淋洗细胞、溶解于0.3M NaOH中并在闪烁计数器中计数等分样晶。
其中一个实验的结果示于表11中。数据表明，IGFBP-1抑制IGF-I对骨肉瘤细胞的促有丝分裂作用。约20倍摩尔过量的IGFBP-1(2,000ng/ml)使50ng/ml IGF-I的促有丝分裂作用受到50％的抑制。如用50-100倍摩尔过量的OGFBP-1(8,000-16,000ng/ml)贝可见50ng/ml IGF-I的促有丝分裂作用基本上完成被抑制。在这些实验中为抑制IGF-I的作用所需的IGFBP-I的量大于在其他实验中用其他细胞系观察到的IGFBP-1使用量。这种情况可能是由于在该实验中50ng/ml IGF-I产生了最大促有丝分裂反应。
                表11
       IGFBP-1对IGF-I刺激的大鼠骨肉瘤
          UMR-106细胞生长的抑制作用
   IGF-1(ng/ml)     IGFBP-1(ng/ml) cpms* ％抑制率
    0     0     32,145
    50     0     188,933     0％
    50     200     172,513     10％
    50     400     173,234     10％
    50     800     157,475     20％
    50     2,000     112,265     49％
    50     4,000     78,041     71％
    50     8,000     51,470     88％
    50     16,000     34,448     99％
*每分钟计数，一式三孔的平均值。
                    实施例6
        IGFBP-1抑制平滑肌细胞的生长
试验IGFBP-1以确定其能否抑制平滑肌细胞对IGF-I的增殖反应。大鼠平滑肌细胞样细胞系A10得自位于Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(目录编号CRL 1476)。B.W.Kimes和B.L.Brandt(Experimental Cell Research，98：349-366(1976))已鉴定了A10细胞系的特征。细胞维持在含有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Dulbecco氏改动的Eagle氏培养基，得自Mediatech，Inc.Herndcn，VA)中。为进行增殖试验、经用胰蛋白酶/FDTA溶液简单处理从培养板中离散出细胞，用含血清培养基洗一次，用无血清培养基洗两次后，使用血细胞计数器计数。以2×105细胞/ml的浓度将细胞再悬浮于含有2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清DMEM培养基中。在96孔组织培养板(Corning GlassWorks，Rochester，NY)的每个孔内等分加入100μl细胞悬液。向适当的孔内加入100μl含有渐增量之IGF-I(0、2、20、200或2000ng/ml)的无血清培养基，并将平板子37℃保温3天。此时即使用实施例3中所述的结晶紫染料检测法定量细胞数。
如根据孔内容物之光密度的增加所测知的，IGF-I引起了细胞数目的剂量依赖性增加(表12)。当IGF-I浓度为100ng/ml时出现最大增殖反应。
    表12
IGF对大鼠的A-10平滑肌细胞
   生长的刺激作用
    IGF-I(ng/ml)     O.D.*570nm
    0     0.318
    1     0.317
    10     0.451
    100     0.577
    1000     0.536
*570nm处光密度，6孔的平均值。
使用上述细胞增殖检测法检测重组IGFBP-1对IGF-I刺激的A-10细胞生长的作用。使用相同方式进行检测，但其中试验孔内含有100ng/ml IGF-I。有些孔还含有浓度范围为1-10,000ng/ml的IGFBP-1。
如由细胞培养物的光密度增加所证实的，IGFBP-1引起了细胞数目的剂量依赖性增加(表13)。当IGF3P-1浓度为1000ng/ml时、其降低细胞数目达到如没有加任何外源IGF-I的水平(称为基线增殖)。当浓度为10μg/ml时，IGFBP-1降低细胞数目低于如细胞在无血清培养基中生长的水平，此提示大鼠A-10细胞产生内源IGF-I或IGF-II。这些数据表明，IGFBP-1抑制平滑肌细胞对IGF-I的增殖反应。
                       表13
           IGFBP-1对IGF-I刺激的大鼠A-10
             平滑肌细胞生长的抑制作用
        实验1          实验2
 IGFBP-1(ng/ml)      IGF-I(ng/ml)     O.D.*570nm   ％抑制率     O.D.*570nm   ％抑制率
    0     0     0.192     0.230
    0     100     0.290  0     0.353  0
    10     100     0.253  38％     0.334  19％
    100     100     0.249  42％     0.282  59％
    1,000     100     0.197  95％     0.236  95％
    10,000     100     0.157  136％     0.183  137％
*570nm处光密度，三孔的平均值。
                    实施例7
        IGFBP-1突变型蛋白的制备A.IGFBP-1突变型蛋白的构建
对包含于质粒pJU1021(ATCC登记号No.67730)中的IGFBP-1DNA序列进行诱变、以构建两个IGFBP-1突变型蛋白，即C98和C101。在C98突变型蛋白中，成熟蛋白质序列98位上的丝氨酸已改变成半胱氨酸残基。在C101突变型蛋白中，成熟蛋白质101位上的丝氨酸已改变成半胱氨酸残基。残基编号是基于SEQ ID NO：1。使用聚合酶链式反应(PCR)技术进行诱变。
使用质粒T88IQ：IGFBP-1 DNA作为起始模板DNA制备C98突变型蛋白。质粒pT88：IGFBP-1含有质粒pT88IQ的野生型IGFBP-1编码序列。
表达载体pT88IQ是表达载体pT3XI-2的衍生物。按下述方法构建载体pT3XI-2。用于该构建的起始质粒是购自Pharmacia的质粒pKK223-3。质粒pKK223-3携带有四环素抗性的部分基因。用质粒pBR322携带的完整四环素抗性基因取代该非功能性基因。用SphI完全消化并用BamHI部分消化质粒pKK223-3。凝胶纯化4.4千碱基对片段并与合成的衔接头(SEQ ID NO：4)
5’    GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3’
3’    __ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5’
       BglII           ClaI和来自pBR322(PL Biochemicals，27-4891-01)四环素抗性基因之ClaI、SphI消化产物的539碱基对DNA片段连接。所得质粒被命名为pCJ1。
然后将购自New England Biolabs(Beverly，Massachusetts)的XhoI接头插入质粒pCJI的PvuII位点以形成质粒pCJX-1。这一插入破坏了控制质粒拷贝数的rop基因。然后从质粒pMC9(Calos etal.，1983)中纯化含有lacI基因的EcoRI片段，并插入带有XhoI至EcoRI衔接头的XhoI位点。然后经用EcoRI和PstI切割用含有附加位点的多接头(SEQ ID NO：5)：
     5’ AATTCCCGGG TACCAGATCT GACTCACTAGTCTGCA  3’
         3’ GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5’置换质粒pKK223-3中的多接头区。如此得到的质粒载体被称为pCJXI-1。
最后，用具有与被亚硫酸氢盐诱变破坏之限制性酶HindIII、BamHI和SalI识别位点相似的基因取代四环素抗性基因。使用下述方法突变pBR322的四环素抗性基因。用HindIII切割质粒pBR322，然后用亚硫酸氢钠诱变(Shortle and Botstein，1983)。连接被诱变的DNA以形成环形DNA，然后用HindIII切割以使任何逃脱诱变的质粒线性化。用此消化混合物转化E.coli JM109(Yanisch-Perron etal.，1985)。分离四环素抗性菌落并检查质粒的四环素抗性基因中HindIII位点的丢失情况。将此被成功地突变的质粒称为pT1。按相似方法诱变pT1中的BamHI位点，得到质粒pT2。反复诱变质粒pT2以除去SalI位点，形成质粒pT2。分离携带了已突变之四环素抗性基因的pT3中的ClaI-StyI片段，并用至取代pCJXI-1的同源片段以形成pT2XI-2。已突变的四环素抗性基因仍编码功能性蛋白质。按下述方法在tac启动子区域的下游导入一个多接头，除其他位点外该多接头中还含有适用于在E.coli中表达克隆基因的BamHI和KpnI限制性位点。
如在pT3XI-2中一样，被克隆的含有pT88IQ载体之基因的表达是由tac启动子驱动的。转译在独特的NdeI识别序列CATATG的ATG(消除了下游NdeI位点，从而使该起始位点NdeI序列成为独特的)处开始。在NdeI位点的下游有一个多接头，利于插入所需的基因。另外，用截短的片段(其除去了lacZ启动子及作为lac阻遏物结合位点的操纵基因区域)取代含有LacI区域的XhoI片段。置换中的lacI区域还携带IacIq突变-导致lac阻遏物产生增加的单碱基置换(Muller-Hillet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)59：1259-1264(1968))。
pT3XI-2和pT88IQ间的特异性差别如下：
1.克隆位点区。
在多接头的EcoRI位点上游和多接头之下游末端处的HindIII位点间，下列135mer序列(SEQ ID NO：6)被取代：5’＞CACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTFGTTTFAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCCGGGTACCGTCGACGAGCTCTTCGAACTAGTCCGCGGT＞3’
该序列在表达起始密码子处含有NdeI位点(划下线处)和含有BamHI、XmaI、KpnI、SalI、SacI、BstBI、SpeI和SacII之识别位点的多接头。
2.下游NdeI位点。
在pT3XI-2克隆区域的大约2.4kb下游有一个NdeI位点。除去该位点从而使得如上所述的起始密码子处的NdeI位点成为pT88IQ中唯一的Nde位点。该位点从5′＞CATATG＞3′至5′＞CATATATG＞3′，从而除掉NdeI识别序列。
3.IacIq区域
pT3XI-2中含有lacI区域的两个XhoI位点间的区域被下面1230碱基序列所取代：
pT88IQ的lacIq序列(1230bp)(SEQ ID NO：7)
CCATGGCTGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT
TGCGTFGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTGTCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGAGAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCCAGGGTG GTTTTTCTTTTCACCAGTGA GACGGGCAAC AGCTGATTGC CCTTCACCGCCTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTC CACGCTGGTTTGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGTTTGATG GTGGTTGACGGCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCCCACTACCGAG ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCGGTAATGGCGC GCATTGCGCC CAGCGCCATC TGATCGTTGGCAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT CATTCAGCATTTGCATGGTT TGTTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCGCCTFCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATTTGA TTGCGAGTGAGATATTTATG CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGACAGAACTTAAT GGGCCCGCTA ACAGCGCGAT TTGCTGGTGACCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT CGCGTACCGTCTTCATGGGA GAAAATAATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTCAGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCAGCTTCCACAG CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGTTAATGATCAG CCCACTGACG CGTTGCGCGA GAAGATTGTGCACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT TCGTTCTACCATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAGATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGCCAGACTGGAG GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTGCCCGCCAGTT GTTGTGCCAC GCGGTTGGGA ATGTAATTCAGCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC GCGTTTTCGCAGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTCTGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACGTTACTGGTTT CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTCCGGGCGCTAT CATGCCATAC CGCGAAAGGT TTTGCACCATTCGATGGTGT CGGAATTAAT TCAGCCATGG
该被取代的区域除掉lacZ启动子和作为lac阻遏物之结合位点的操纵基因区域。其还含有致使lac阻遏物合成增加的lacIq突变(Muller-Hill et al，文献出处同上)。
经用限制性酶XbaI和HindIII消化，从质粒pJU1021中分离IGFBP-1 DNA序列，并使用NA-45滤膜按制造前提供的说明书以琼脂糖凝胶电泳法纯化之(Schleicher and Schuell，Keene，NH)。将分离出的IGFBP-1 DNA片段克隆到已用)XbaI和HindIII消化并按上述方法经凝胶电泳纯化的质粒pT88IQ中。将此正确地再构建的质粒定名为pT88IQ：IGFBP-1。在PCR诱变反应中使用的5′寡核苷酸引物(IGFBP-1-5′)具有序列5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTACTTTAAGAAGGA 3’(SEQ ID NO.：8).3′寡核苷酸引物(IGFBP-1-C98)具有序列5′CAGGAGCTCCTCCTCAGTTATCTCCGTGCTCTCTGGGCATTCAGGGCTCCCTGCCTCTGCAGCATGGGG 3’(SEQ ID NO.：9).在含有10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，25mM MgCl2，0.001％明胶，各500μM dATP、dCTP、DGTP和TTP，各30pmoleIGFBP-l-5′和IGFBP-1-C98引物，1-10ng pT88IQ：IGFBP-1质粒DNA及5单位“AmpliTaq”Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus，由Roche Molecular Systems，Inc.Branchburg，NJ出售)的50μl反应混合物中进行PCR反应。PCR反应条件是开始在96℃保温3分钟，35次循环(96℃反应1分钟，66℃反应1分钟，72℃反应1.5分钟)，最后于72℃保温10分钟。
使用经琼脂糖凝胶纯化的含有作为起始模板DNA之野生型IGFBP-1编码序列的DNA片段制备C101突变型蛋白。经用NdeI和HindIII消化质粒pJU1020得到IGFBP-1编码序列，并用琼脂糖凝胶电泳法纯化约0.8kb的IGFBP-1编码DNA片段。PCR诱变反应中使用的5′寡核苷酸引物与用于构建S98C突变蛋白的引物(IGFBP-1-5′)相同。3′寡核苷酸引物(IGFBP-1-C101)具有序列5′CCCGAGCTCCTCCTCAGTTATCTCCGTGCACTCTGGGCTTTCAGGGCTCCCTGC 3’(SEQ ID NO.：10)。在含有10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％明胶，各200μM dATP、dCTP、DGTP和TTP，20pmoleIGFBP-1-5′和IGFBP-1-C101引物以及2.5单位“AmpliTaq”Taq DNA聚合酶的100μl反应混合物中进行PCR反应。PCR反应条件是95℃反应1分钟，50℃反应1分钟，72℃反应1分钟-计30次循环，然后72℃保温10分钟。
PCR后，使反应混合物通过ChromaSpin 100柱(ClonTech，PaloAlto，CA，目录编号K1332-2)，以除去核苷酸和未被掺入的DNA引物。用XbaI和SacI消化DNA片段并按上述程序经琼脂糖凝胶电泳纯化正确大小的片段(约0.43kb)。将纯化的DNA片段与XbaI＋SacI消化的pT88IQ：IGFBP-1质粒DNA连接。用连接混合物转化E.coli菌株DH5α(可得自ClonTeeh Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)并铺敷在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。从各次转化得到的几个菌落中制备质粒DNA并测定跨越被插入区的两股核苷酸的序列。选择各突变蛋白的有正确序列的质粒。将其定名为克隆C101-3(C101突变蛋白)和C98-12(C98突变蛋白)。
然后将突变的IGFBP-1基因再转回质粒pT5T中(Eisenberg S.P.et al.，Nature，343：341-346(1990))。为此，用NdeI和HindIII消化得自克隆C101-3和C98-12的质粒DNA，凝胶纯化含有突变体IGFBP-1基因的约800bp带，并将它连接到已用同样的限制性酶消化的pT5T质粒DNA上。用连接混合物转化E.coli菌株BL21/DE3并铺敷在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。从各次转化得到的几个菌落中制取质粒DNA。将具有正确序列的克隆定名为pT5T：IGFBP-1-C98(C98突变蛋白)和pT5T：IGFBP-1-C101(C101突变蛋白)。B.洗过的包涵体的制备
在10升发酵罐中培养表达C98或C101突变型蛋白的E.coli细胞。将从发酵罐中得到的细胞以6ml缓冲液/克细胞的比例重新悬浮于破胞缓冲液(50mM Tris，25mM NaCl，1mM二硫苏糖醇(“DTT”)，pH7.5)中。使用French细胞挤压器以10,000psi的压力破碎细胞。将悬浮液以17,700xg离心30分钟。将含有包涵体的沉淀再悬浮于破胞缓中液中以清洗之，然后再次以17,700xg离心。可冷冻保存洗过并再次离心的沉淀以待进一步处理。沉淀中所含蛋白质的约80％是突变型蛋白。C.突变型蛋白再折叠
首先使用细胞匀浆器将沉淀溶解于6M盐酸胍、50mM Tris，6mM DTT，pH7.5中(每10ml缓冲液溶解1g沉淀)以使各突变型蛋白变性。
向溶解的沉淀中加入氧化态谷胱甘肽(“GSSG”)至其终浓度为23mM，以开始再折叠。将溶液于室温保温15分钟，之后逐步用50mM Tris(pH9.7)稀释至蛋白质终浓度为100μg/ml，且谷胱甘肽终浓度为0.6M。用考马斯兰蛋白质检测法检测蛋白质浓度(Pierce，Rockford，IL)。然后加入半胱氨酸和苯甲基磺酰氟使其终浓度分别为5.6mM和1mM。将再折叠溶液于4℃保温过夜。
在C4反相层析柱(RP-4，1×250mM，Synchrom，Lafayette，IN)上分析100μl再折叠溶液的等分样品以监测再折叠情况。用2％乙腈(CH3CN)，0.05％三氟乙酸(“TFA”)平衡C4柱。将100μl再折叠溶液的等分样品注射到平衡过的柱上，并使用达到60％CH3CN，0.05％TFA、以2％/分钟改变缓冲液B的线性梯度，以0.25ml/分钟的流速进行洗脱。对于每种突变型蛋白，重新折叠的蛋白质均比还原并变性的但未重新折叠的蛋白质早大约2分钟作为尖峰被洗脱。D.重新折叠的突变型蛋白的纯化
用具有3kDa截留分子量的Amico S10Y3超滤膜(AmicondiVision of WR Grace and Co.，Beverly Massachusetts)将再折叠溶液浓缩约10倍，并对20mM磷酸钠(pH6.0)透析。将透析的溶液以17,700xg离心30分钟并通过0.2μ滤膜过滤上清液。将过滤后的蛋白质以20ml/分钟的速度加于预先用20mM磷酸钠(pH6.0)平衡过的Q-Separose阴离子交换柱(5×30cm，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分钟的流速用达到20mM磷酸钠、0.5M NaCl pH6.0的线性梯度(5倍柱体积)洗脱结合的蛋白质。以每管25ml收集洗脱物。各突变型蛋白均在大约0.2-0.25M NaCl处被洗脱。使用与上述监测再折叠的相同条件在C4反相柱(RP-4，1×250mm，Synchrom，Lafayette，IN)上分析，或用SDS-PAGE法分析各管内容物。
合并含有重新折叠之突变型蛋自的各管(即在0.2-0.25M NaCl时洗脱的各管)，并透析到20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.5中。以25ml/分钟将经过透析的材料上样于预先用20mMTris-HCl，1M NaCl(pH7.5)平衡过的Butyl Sepharose(Supelco，Bellefonte，PA)疏水作用柱(5×8cm，Pamacia Biotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分钟的流速，用达到20mM Tris，0 NaCl，25％乙醇(pH7.5)的线性梯度(10-15倍柱体积)洗脱结合的蛋白质。在大约15-20％乙醇浓度处洗脱作为不对称峰的各突变型蛋白。
使用上述监测重新折叠所用的同样条件在C4反相层析柱(RP-4，1×250mm，Synchrom，Lafayette，IN)上，或使用SDS-PAGE法分析含蛋白质各管(在15-20％乙醇处洗脱的)的100μl等分样品。合并含有纯化之突变型蛋白的各管，浓缩到大约0.8mg/ml并透析到20mM Tris，250mM NaCl(pH7.4)中。按实施例9中所述方法检测纯化之再折叠突变型蛋白的生物活性。
                实施例8
IGFBP-I突变型蛋白的PEG化
使用平均分子量为20kDa，具有结合(CH3O-(CH2CH2O)n-NHCOCH2CH2-N)之巯基特异性顺丁烯二酰亚胺反应性基团的单个氧基PEG(其中n是单体单位的数目)对C98和C101突变型蛋白进行PEG化处理。PCT申请公开No，WO92/16221(列为本文参考文献)中讨论了其他适用PEG顺丁烯二酰亚胺试剂的制备和使用。
在重新折叠期间，被取代的半胱氨酸残基(分别为C98和C101中的CYS98或CYS101)可与谷胱甘肽形成混合的二硫化物以成为Cys-S-S-GSH，或与半胱氨酸形成二硫化物以成为Cys-S-S-Cys。相应地，在与PEG试剂反应时没有可用的游离巯基，因此，在与PEG试剂反应之前纯化的突变型蛋白被部分还原。
室温下，在20mM Tris，(pH7.4)，250mM NaCl中以DTT对蛋白质摩尔比为5.625∶1的比例，使纯化的突变型蛋白(0.45mg/ml)与DFT反应2小时，以完成部分还原反应。经酸化至pH5.5而终止还原作用。对10mM乙酸钠(pH5.5)透析后除去DTT。
室温下，在15mM乙酸钠，26mM磷酸钠(pH7.0)，120mMNaCl中，以PEG对蛋白质的摩尔比为4∶1的比例(蛋白质终浓度为0.33mg/ml)，使部分还原的突变型蛋白分别与PEG试剂反应。对反应混合物的SDS-PAGE分析显示大约50％部分还原的突变型蛋白被转化成具有近似表观分子量为大约67kDa的单PEG化的蛋白质(C98-PEG，C101-PEG)。呈现大的表观分子量的部分原因是PEG与凝胶相互作用所致。
将反应混合物调到含20mM磷酸钠(pH6.5)。以20ml/分钟的加样速度将反应混合物加样于用20mM磷酸钠(pH6.5)平衡过的Q-A Q Sepharose阴离子交换柱(5×10cm PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。以20ml/分钟的流速，用达到20mM磷酸钠、1M NaCl(pH6.5)的线性梯度(10倍柱体积)洗脱结合的蛋白质。在大约0.2M NaCl处洗脱C98和C101 PEG化的突变型蛋白。每管收集25ml，并用SDS-PAGE分析等分样品，收集在非还原SDS-PAGE上产生相当于PEG化突变型蛋白之单一优势带的含PEG化C98或C101的各管，并按实施例9中所述方法进行生物学活性检测。
                        实施例9
IGFBP-1和其突变型蛋白抑制IGF-I刺激的3T3细胞的生长
使用结晶紫染料检测法检测细胞增殖情况。在96孔明胶包被的培养板上进行检测。以25,000细胞/孔的量将Balb/c 3T3成纤维细胞铺敷在200μl含0-850ng/ml IGF-I的无血清DMEM(Dulbecco氏改善的Eagle氏培养基，Mediatech，Herndon，VA)中。在此期间，用150μl含0.2％结晶紫、10％甲醛、10mM磷酸钾(pH7.0)的溶液替换培养基。室温保温20分钟后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将小孔洗3次，并经与每孔200μl的50％乙醇/0.1M柠檬酸钠(pH4.2)一起保温而释放出与细胞结合的染料。第二天读出570nm处吸光率。表13中所示的结果表明，重组体IGF-I以剂量依赖方式刺激3T3成纤维细胞的增殖。在IGF-I浓度约为20-60ng/ml时呈现最大增殖。ED50约为5-20ng/ml。
将细胞与一组不同量的IGF-I和渐增量的结合蛋白质共保温，检测IGFBP-1、C98和C101突变型蛋白，及PEG化的突变型蛋白对IGF-1刺激的3T3成纤维细胞增殖的影响。以25,000细胞/孔的量将Balb/c 3T3成纤维细胞铺敷在含有21ng/ml IGF-I和不同量IGFBP-l及不同的突变型蛋白(0ng/ml-11.520ng/ml)的200μl无血清DMEM中。将细胞继续保温72小时并按上述方法处理。
所示结果表明，未PEG化的和PEG化的C98和C101突变型蛋白的生物活性与野生型重组体IGFBP-1的活性差不多(表14-18)。在所述条件下抑制50％的21ng/ml IGF-I活性所需的IGFBP-1浓度(IC50)，对于野生型IGFBP-1、IGFBP-1突变型蛋白和PEG化的IGFBP-1大约为200-300ng/ml。
                 表14
     IGF-I对3T3成纤维细胞生长的抑制作用
    IGF-I(ng/ml)     吸光率*(570nm)     S.E.**
    850.00     1.587     0.076
    212.50     1.627     0.053
    53.13     1.662     0.039
    13.28     1.495     0.029
    3.32     1.112     0.037
    0.83     0.920     0.019
    0.21     0.915     0.020
    0.05     0.897     0.014
    0.01     0.862     0.011
    0.00     0.781     0.016
*     吸光率数值为12份样品的平均值。**    S.E.代表平均值的标准差。
            表15
      C98突变型蛋白对3T3成纤维细胞
         生长的剂量依赖性抑制作用
    C98突变型蛋白(ng/ml)     *570nm吸光率     **S.E.
    11520.00     0.941     0.085
    2880.00     1.001     0.033
    720.00     1.161     0.028
    180.00     1.580     0.013
    45.00     1.775     0.023
    11.25     1.787     0.006
    2.81     1.797     0.016
    0.70     1.747     0.011
    0.18     1.818     0.004
    0     1.800     0.016
*    吸光率数值是一式三份样品的平均值。
**   S.E.代表平均值的标准差。
            表16
   C101突变型蛋白对3T3成纤维细胞
     生长的剂量依赖性抑制作用
    C101突变型蛋白(ng/ml)   吸光率570nm     S.E.
    11520.00     0.930     0.058
    2880.00     1.032     0.033
    720.00     1.108     0.052
    180.00     1.413     0.052
    45.00     1.656     0.057
    11.25     1.620     0.039
    2.81     1.641     0.064
    0.70     1.593     0.015
    0.18     1.584     0.050
    0     1.5l6     0.052
吸光率数值是一式三份样品的平均值。S.E.代表平均值
的标准差。
              表17
 C98 PEG化突变型蛋白对3T3成纤维细胞
      生长的剂量依赖性抑制作用
 C98-PEG化突变型蛋白(ng/ml)    吸光率570nm     S.E.
    11520.00     0.915     .015
    2880.00     0.957     .019
    720.00     1.049     0.044
    180.00     1.302     0.034
    45.00     1.473     0.028
    11.25     1.595     0.031
    2.81     1.620     0.028
    0.70     1.581     0.019
    0.18     1.585     0.015
    0     1.699     0.024
吸光率数值是一式三份样品的平均值。S.E.代表平均值的标准差。
                   表18
     C101 PEG化突变型蛋白对3T3成纤维细胞
           生长的剂量依赖性抑制作用
C101-PEG化突变型蛋白(ng/ml)     吸光率570nm     S.E.
    11520.00     0.956     0.041
    2880.00     1.008     0.016
    720.00     1.082     0.027
    180.00     1.299     0.030
    45.00     1.505     0.061
    11.25     1.596     0.020
    2.81     1.589     0.011
    0.70     1.564     0.003
    0.18     1.577     0.020
    0     1.614     0.016
吸光率数值是一式三份样品的平均值。S.E.代表平均值
的标准差。
                 表19
       野生型IGFBP-1对3T3成纤维细胞
         生长的剂量依赖性抑制作用
    WT IGFBP-1(ng/ml)     吸光率570nm  S.E.
    11520.00     0.74  0.015
    2880.00     1.799  0.036
    720.00     1.015  0.010
    180.00     1.213  0.026
    45.00     1.351  0.045
    11.25     1.432  0.048
    2.81     1.475  0.074
    0.70     1.538  0.020
    0.18     1.530  0.039
    0     1.583  0.022
                实施例10
IGFBP-1和PEG化的IGFBP-1的药物动力学
使用四只雄性Sprague Dawley大鼠检测药物动力学参数。给两只大鼠静脉注射1mg/kg重组人IGFBP-1团块，两只大鼠静脉注射1mg/kg PEG化的IGFBP-1 C101突变型蛋白团块。按实施例7和8中所述方法制备C101突变型蛋白并使之PEG化注射后0.016、0.083、0.033、0.075、1.5、2、3、5、6、8、10、12、24和48小时抽取尾静脉血液样品。将血样收集到EDTA包被的试管中并离心收集血浆部分。使用Medix Biochemica(Kaumiaihen，Finland)IGFbp-1试验药盒(目录登记号N0.10831 ETNB)以ELISA法检测血浆样品中的IGFBP-1浓度。
计算各试验组中两只大鼠的血浆浓度平均值并使用Rstrip II(Micromath Software，Salt Lake City，Utah)调准两或三条曲线。从配合好曲线中得到数据示于表20中。在注射野生型IGFBP-1和PEG化C101突变型蛋白后ELISA可检测的血浆IGFBP-1分别按照三指数律和双指数律消失。
使用配合好的曲线，按Pharmacokinetics(Gibaldi，M.，andPerrier，D.，Swarbrick ed.，1975)中所示计算出标准药物动力学参数。表21中显示了这些参数。结果表明PEG化可因降低了血浆清除率从而增加了循环时间，致使IGFBP-1的药物动力学效能得到改善。
                     表20
     时间/小时  血浆IGFBP-1(ng/ml)   血浆PEG IGFBP-1(ng/ml)
    0.017     9057±410     18120±430
    0.108     4937±150     17060±280
    0.363     2032±59     15340±2000
    0.751     1060±32     14550±1100
    1.50     385.0±35     12920±12
    2.03     261.0±20     11590±510
    2.99     142.7±0.85     10110±150
    4.97     39.84±3.3     8503±400
    5.97     20.19±1.8     7224±590
    7.97     ND*     4916±250
    9.97     ND     3196±180
    12.0     ND     2258±130
    26.0     ND     450.0±30
    50.0     ND     83.24±1.2
*未测出
                     表21
参数*     野生型IGFBP-1   PEG化的IGFBP-1
初始分布体积，L/kg     0.095     0.063
稳态分布体积，L/kg     0.19     0.074
血浆清除率，mL/分/kg     6.2     0.15
快(初始)半寿期，分钟     2.9
中间半寿期，小时     0.24     3.9
慢(终末)半寿期，小时     1.1     13
血浆平均清除时间，小时     0.52     8.2
*每组两只大鼠的平均值。
                实施例11
    IGFBP-1抑制大鼠的血管再狭窄
在气体血管成形术后，检测大鼠颈动脉中IGFBP-1改变增殖反应的能力。给19只体重约375g的未经受手术的Sprague Dawley大鼠右颈静脉内植入颈静脉导管。一周后检测导管开放性并开始通过系留灌注系统连续进行盐水灌注。Francis，P.C.，et al.，“Continuous Intravenous Infusion in Fisher 344 ratsfor Six Months：A Feasibility Stutly”，ToxicologyMethods，Vol.2，pp.1-13(1992)中介绍了系留灌注系统(该文献列为本文参考文献)。3天后，按Edelman，E.R.andKarnovsky，M.J.，CiFculation，Vol.89，No.2，pp.770-776(1994)(该文列为本文参考文献)所述在左颈内动脉中通过动脉切开对所有动物进行气体血管成形术。将2F Fogarty气球导管(AmericanEdwards Laboratories，Santa Aha，Calif.)推向主动脉弓并拉回，同时用足够的空气将气球吹大以产生抵抗力并剥脱内皮。将此过程重复6次，以确保对动脉造成在血管壁上引起增殖反应所需要的足够损伤。然后连接颈内动脉。将动物分成两组并在血管成形术后立即开始处理并持续14天。组1(N＝9)由静脉内灌流等渗盐(0.25ml/小时)的对照动物组成。组2(N＝10)动物用IGFBP-1处理，以179μg/kg/hr的剂量连续静脉内输注。血管成形术后3、9和14天从尾静脉采血从检测血浆内IGFBP-I水平，使用MedixBiochemica(Kauniainen，Finland)IGFbp-1试验药盒(商品目录编号No.10831 ETMB)以ELISA法检测血浆样品中的IGFBP-I浓度。在采血时中断输注(约15至30分钟)。
在第14天实验结束时，用Francis等人所述的Brevital试验证明导管仍开放。联合使用Aca Promazine Rompun和Ketamine麻醉动物，并通过动脉穿刺给动物输注10％中性缓冲的福尔马林。切除颈动脉并在福尔马林中再放2天，然后进行石腊包埋加工。包埋得自每只动物的包括几乎全长损伤的三个颈动脉段，以保证对所有的组织区域作出估计。收集所有动物的其他组织(肺、心、肝、肾、脾和肾上腺)进行组织学检查，以确定连续输注IGFBP-1的全身作用(如果有的话)。颈动脉切片用苏木精和曙红、Masson’s trichrome和甲苯胺兰染色。其他组织只用苏木精和曙红染色。
实验结束时IGFBP-1的平均血浆水平为3.69±0.64μg/ml。
根据大体评分，以测量新内膜(μm和象素)、新内膜加中膜(象素)和中膜(象素)来确定用IGFBP-I处理动物所产生的作用。还计算出新内膜(象素)对中膜(象素)的比例。评分和检测结果示于表22。对所有6项反应检测进行Wilcoxon Rank-Sum(Mann-Whitney U)试验并使用Natrella，M.G.，ExperimentalStatistics，National Bwreau of Standards Handbook 91，p.T-80(1967)中所列的表测定p值。从Wilcoxon Rank-Sum(Mann-Whitney U)试验得到的p值报告如下。数据显示IGFBP-1显著地减低大鼠的血管再狭窄程度。
对损伤的颈动脉未观察增厚的视为0，严重增厚的视为4，以标记如0、1、2、3和4的评分来粗略估计处理相应的效果。得自处理组和对照组的平均(±标准差)评分分别为1.5±0.27和2.67±0.24。发现这些数值是统计学上有意义的(p＜0.05)。在此粗略估计中，IGFBP-1处理之动物中对血管增厚的抑制率为44％。
也检测新内膜。在相对和彼此垂直的4个点上测定从新内膜的中膜侧到新内膜的内腔侧的距离并确定3个切片的平均值。经处理的和对照组的动物以μm为单位新内膜平均数±S.E.分别为78.50±10.68和139.33±8.91(p＜0.01)。该测量也表明IGFBP-I处理的动物血管内膜增厚受到44％的抑制。
使用Image J系统(可得自S & M Microscopy，ColoradoSprings，CO)进行影象分析，以确定处理组和对照组动物的新生内膜加中膜，单独的新内膜和单独的中膜的面积(3个切片/动物)处理组和对照组动物的以象素为单位的新内膜加中膜面积(平均值±S.E.)分别为25，160.30±1817.42和35，271.1.1±1，403.16(p＜0.01)。该分析表明，用IGFBP-1处理使新内膜增厚减少29％。被处理的动物单独的新内膜的面积(象素)为14,015.40±1,834.24，对照组动物为23,11 9.11±1,200.39，IGFBP-1处理的动物内膜增厚抑制率为39％(p＜0.01)。
最后，计算新内膜对中膜的比例。这一参数也证明了用IGFBP-1处理的有益效果。被处理动物中该比例为1.25±0.17，对照组动物为1.91±0.13。利用这一比例，证明对血管再狭窄的抑制率为35％(p＜0.05)。新内膜对中膜的比例一般是该大鼠模型中用于估计处理相应效果的最可接受的方法(Edelman and Karnovsky，Circulation，Vol.89，No.2(1994))。
                                      表22
动物组号  大体面积     内膜μm   中膜＋内膜(象素)     内膜(象素)    中膜(象素)   内膜∶中膜IA
    2C     3     168     38693     26473     12220     2.2
    3C     2     87     28927     16199     12729     1.27
    4C     4     147     36516     23357     13159     1.78
    6C     2     161     33042     23822     9220     2.6
    7C     3     141     43016     28659     15357     1.83
    8C     2     127     33144     21367     11777     1.81
    9C     3     168     35767     24672     11095     2.23
    10C     2     114     31331     20312     11019     1.84
    11C     3     141     37004     23211     13794     1.66
    均值     2.67     139.33     35271.11     23119.11     12263.33     1.91
    SE     0.24     8.91     1403.16     1200.39     593.32     0.13
    21BP     2     121     29893     19613     10280     1.9
    22BP     0     27     17316     4755     12561     0.37
23BP 2 74 23501 13717 9785 1.39
    24BP     2     87     25148     13986     11161     1.25
    25BP     2     87     29361     17851     11510     1.52
    26BP     0     47     18330     8432     9898     0.83
    27BP     2     34     17132     5676     11456     0.5
    28BP     2     127     31113     20359     10754     1.88
    29BP     2     94     30737     18021     12896     1.4
    30BP     1     87     29072     17744     11328     1.5
    均值     1.50     78.50     25160.30     14015.40     11162.90     1.25
    SE     0.27     10.68     1817.42     1834.24     327.23     0.17
虽然就特定实施方案描述了本发明，但它无意限制本发明，并且本领域技术人员所作改动被认为是落入本发明精神和范围之内的。

Claims (32)

1.治疗患有IGF相关病症之患者的方法，包括给患者使用治疗有效量的IGFBP-1或其被修饰形式的产物。
2.根据权利要求1的方法，包括给所说的患者使用IGFBP-1。
3.根据权利要求2的方法，其中给患者使用的IGFBP-1的量足以使患者血流中IGFBP-1的浓度达到约每毫升0.1μg至300μg。
4.根据权利要求1的方法，包括给所说的患者使用被修饰形式的IGFBP-1。
5.根据权利要求4的方法，其中被修饰形式的IGFBP-1是结合到聚合物上的IGFBP-1。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的聚合物是聚乙二醇。
7.根据权利要求4的方法，其中被修饰形式的IGFBP-1包括2个IGFBP-1分子，其中所说的第一个IGFBP-1被结合到聚合物的一个末端上并且所说的第二个IGFBP-1被结合到聚合物的相反末端上。
8.根据权利要求1的方法，其中IGF相关病症选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、肝癌、横纹肌肉瘤、血管再狭窄、肢端巨大症、肥胖、糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病。
9.根据权利要求8的方法，其中IGF相关病症是乳腺癌。
10.根据权利要求8的方法，其中IGF相关病症是结肠癌。
11.根据权利要求8的方法，其中IGF相关病症是骨肉瘤。
12.根据权利要求8的方法，其中IGF相关病症是肢端巨大症。
13.根据权利要求8的方法，其中IGF相关病症是血管再狭窄。
14.一种药物组合物，含有加在可接受的药物载体中的IGFBP-1或被修饰形式的IGFBP-1。
15.根据权利要求14的药物组合物，其包含加在可接受的药物载体中的IGFBP-1。
16.根据权利要求14的药物组合物，其包含加在可接受的药物载体中的被修饰形式的IGFBP-1。
17.根据权利要求16的药物组合物，其中被修饰形式的IGFBP-1是结合到惰性聚合物链上的IGFBP-1。
18.根据权利要求17的药物组合物，其中惰性聚合物链是聚乙二醇。
19.根据权利要求16的药物组合物，其中被修饰形式的IGFBP-1是结合到惰性聚合物链之相反末端上的IGFBP-1。
20.治疗或预防血管再狭窄的方法，其包括给需要医治的患者使用治疗有效量的能够结合IGF的蛋白质。
21.根据权利要求20的方法，其中所说的蛋白质是IGFBP-1。
22.根据权利要求21的方法，其中所说的蛋白质是被修饰形式的IGFBP-1。
23.根据权利要求22的方法，其中所说的蛋白质是结合到聚合物上的IGFBP-1。
24.根据权利要求23的方法，其中聚合物是聚乙二醇。
25.根据权利要求23的方法，其中被修饰形式的IGFBP-1包含2个IGFBP-1分子，其中所说的第一个IGFBP-1被结合到聚合物的一个末端上并且所说的第二个IGFBP-1被结合到聚合物的相反末端上。
26.根据权利要求1的方法，其中IGFBP-1是未磷酸化的。
27.根据权利要求21的方法，其中IGFBP-1是未磷酸化的。
28.根据权利要求26的方法，其中IGFBP-1是在E.coli中重组产生的。
29.根据权利要求27的方法，其中IGFBP-1是在E.coli中重组产生的。
30.未被磷酸化的并且能够抑制IGF的活性的胰岛素样生长因子结合蛋白质(IGFBP)。
31.根据权利要求30的IGFBP，其中IGFBP是在E.coli中重组产生的。
32.根据权利要求30的IGFBP，其中所说的IGFBP是IGFBP-1或其被修饰的形式。
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