CN1680449A - 聚乙二醇修饰后具有体内生理活性的重组促红细胞生成素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物(PEG－EPOP)，将无体内活性因而不具备作为贫血纠正药物使用价值的重组人促红细胞生成素蛋白(rhEPOP)，经聚乙二醇(PEG)化学修饰，获得具有体内促红细胞生成活性的产物。本发明特别揭示了可以用原核表达系统获得低成本的EPOP，由此获得低成本的PEG－EPOP，生产治疗贫血性疾病药物及升高红细胞药物。
Description
技术领域
本发明涉及以聚乙二醇对无体内生理活性的重组促红细胞生成素蛋白(EPOP)进行修饰，而获得的具有促红细胞生成作用的体内生理活性的结合物(PEG-EPOP)。
发明背景
人红细胞生成素(human Erythropoietin，hEPO)是一种主要由肾脏合成并分泌的糖蛋白激素，在胚胎期EPO产生于肝脏，出生后4个月转由肾脏产生。其生理作用是刺激骨髓红细胞前体细胞的分化与增殖，在红细胞发育成熟过程中起着重要的作用，是红细胞生长的内源性调节剂。
早年从再生障碍性贫血病人的尿中、胎肾细胞的培养液中可获得较多的hEPO，但并不能满足临床需求。1985年，应用基因重组技术获得重组人EPO(rhEPO)，开始了工业化生产EPO的历史，使EPO在临床上广泛应用成为可能。1989年6月美国Amgen公司生产的rhEPO正式获得美国FDA注册许可，商品名为“EPOGENEPOETIN ALFA”，用于治疗慢性肾衰竭(CRF)合并贫血症，取得了巨大的成功。目前世界上已有多家公司开发生产rhEPO，近十多年的临床应用的结果表明rhEPO的疗效显著，副作用小，是治疗各类贫血的特效药物，也是当前最为成功的基因工程治疗药物。随着人们对EPO的研究日益深入，其临床适应症将进一步扩大，目前适用于：(1)慢性肾衰合并贫血的治疗：此类贫血的一个主要原因是EPO生成缺乏，EPO可谓替代治疗方法，其疗效达95％以上，使血红蛋白含量(Hb)及红细胞压积(Hct)增高，贫血改善，出血时间缩短，生活质量提高，输血次数减少，也有利于施行肾移植的病人；(2)艾滋病(AIDS)病人伴贫血，尤其应用AZT治疗的病人常易伴发贫血，EPO治疗有效；(3)肿瘤病人化疗所致贫血，尤其使用顺铂常出现明显贫血，EPO治疗有效；(4)慢性病贫血，如类风湿性关节炎、肿瘤病人，当伴发贫血而需输血维持治疗者，EPO可使部分病人减少输血的次数；(5)造血干细胞疾病的贫血，如骨髓增生异常综合征(MDS)、再生障碍性贫血等的病人，若需反复输血亦难以维持者，可试用EPO，约25％～30％病人可使贫血改善，减少输血次数；(6)自体供血输注：美国血库协会规定，择期手术的病人，如矫形手术者宜取自血贮存，以备手术时输注，术前3周开始用EPO，Hb上升明显时取血400ml贮存，采集3次备用，可以满足病人的需要。使用EPO可以提高贮血质量，减少贮血数量；(7)早产儿贫血的防治：50～100IU/kg，每周3次，于出生后开始，连用4周。可以预计：EPO在一个相当长的时期内都将是贫血治疗的一线药物。
在采用蛋白质药物治疗过程中，常因其较短的血浆半衰期而使其生物利用度降低，这在EPO这样的激素类蛋白质上表现得尤为明显。机体通过肾脏细胞上的氧分压感受器调节EPO的分泌量，通过肝细胞快速灭活释放到血浆中的EPO，由此建立维持红细胞压积相对恒定的灵敏调节机制：既可在贫血时大量促进红细胞的释放，又可防止过量释放红细胞造成血粘稠度过高等不利后果。在使用rhEPO对贫血疾病的治疗中，此机制大大减低了rhEPO的生物利用度，造成用药剂量的增加，而由于rhEPO昂贵的价格也造成治疗费用的增加；同时由于EPO受体数量的限制，此机制也限制了加大用药剂量获得更高治疗效果的能力，在实际的治疗中，大多数情况下需采用每周3剂的治疗方案，只在贫血症状纠正后的维持治疗中可视情形降低用药剂量及用药频次至每周2剂或每周1剂。
EPO分子是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，对热(在80℃条件下不变性)和酸碱(稳定范围在PH 3.5～10.0之间)较为稳定。蛋白质肽链中Cys161与Cys7、Cys29和Cys33之间分别形成两对二硫键，其中Cys7和Cys161之间的二硫键对于EPO的生物活性至关重要，如果二硫键被还原，EPO将丧失其生物活性。EPO分子的四个糖基化位点分别在Asn38、Asn24、Asn83和Ser126上，前三者为N-糖链，后者为O-糖链。糖链的分枝程度不同，有双末梢、三末梢或四末梢，其中四末梢最为常见。研究结果表明，糖链的分枝程度对EPO在体内的生物活性有影响，N-端糖链的高度分枝对其维持生物体内生物活性是必要的。去唾液酸或去糖基化不影响在体外的生物活性，但却大大缩短了在体内的半衰期(主要经肝细胞吸附代谢)，结果完全丧失了在体内的生物学活性。只有EPO分子被充分糖基化后，才能在体内表现出生物活性。因此糖链结构的存在对EPO在体内的生物活性至关重要。也就是说只有真核细胞表达的EPO在体内才具有生物活性。由于EPO糖基结构部分占整个分子量的30～40％且有高度的不均一性，其糖链分枝程度的不同使EPO的分子量在30～40KD之间(Wasley LC，Linderberg G，Fishman L，et al.The importance of N-and O-linked oligosaccharides for thebiosynthesis and in vitro and vivo biological activities of erythropoietin.Blood 1991，77(3)：419-434.)。众多关于EPO的研究均证实了以上结论，因此普遍的观点认为重组EPO必须以真核细胞表达，如文献马培奇。促红细胞生成素及其临床用途与市场前景。《中国医药情报》1999年第5卷第1期，P11)。
基于以上对自然hEPO的认识，目前用于药物生产的rhEPO均采用真核细胞表达系统，而对EPO特性及药效改进的研究也集中于采用真核细胞表达系统所获得的rhEPO上。为增加rhEPO的药效，目前有两种较成功的方法，一是对现有的rhEPO进行化学修饰，如在00898956专利申请中，公开一种EPO与PEG的偶联物，其通过将EPO糖蛋白共价连接1～3个低级烷氧基聚乙二醇(PEG)基团进行修饰，而提高了EPO的循环半衰期和血浆滞留时间，并降低了EPO的清除率和提高其体内活性。另一是通过基因工程的方法改变EPO肽链中的部份氨基酸以增加糖基化位点进而增加糖基化程度，参见美国专利US5856298以及Amgen Inc.One Amgen Center Drive Thousand Oaks，California产品AranespTM说明书。
尽管以上改进取得了明显增加rhEPO血浆半衰期的效果，但其依然是采用现行rhEPO药品生产工艺所用的真核细胞表达系统，生产成本应与现行产品相当。
在申请人的另一个较早的专利申请中(申请号：200410021859.7)，通过对已知的hEPO基因的碱基序列进行重新设计，消除大肠杆菌稀有密码子，而代之以大肠杆菌偏爱密码子，并适量调整GC含量，成功地构建了可在原核系统(例如大肠杆菌中)高效表达的重组基因和载体系统。虽然表达的重组人促红细胞生成素蛋白(EPOP)由于缺乏糖基化修饰而在体内不具有生理活性，但原核系统生产成本大大低于真核系统，这样制备的无体内活性的EPOP可用于例如制备EPO肽链蛋白试剂、也可用于免疫动物的EPO抗原；或制备成EPO阳性对照标准品，用于EPO免疫检测的试剂盒，如反相血凝、放射免疫、酶联免疫等方法。
发明内容
本发明提供一种PEG-EPOP结合物，采用无糖基化因而无体内活性的促红细胞生存素(EPO)蛋白(EPOP)，如：本发明提供的由原核表达系统获得无体内生物活性的EPO蛋白，再利用PEG对EPOP进行化学修饰，获得具有体内促红细胞生成作用生理活性的产物(PEG-EPOP)。
本发明还提供PEG-EPOP结合物在制备治疗贫血性疾病药物及升高红细胞药物中的用途。
根据本发明的一方面，提供式(I)结构的PEG-EPOP结合物：
mPEG-X-EPOP
(I)
式(I)中，mPEG的分子结构式为
其中k为100～1000的整数，分子量为5000～40000道尔顿；
X为NH或O，表明PEG对EPOP化学修饰的共价连接方式；
EPOP为重组EPO蛋白，为无体内生物活性的EPO蛋白，与天然EPO或真核表达系统表达获得的重组EPO相比缺少糖链部份，在动物实验中观察不到促红细胞生成的体内生理活性，但是具有EPO特有的体外细胞学活性。
本发明中所指无体内生理活性或无体内生物活性，是指按一般治疗使用剂量，在实验动物体内用目前已知的检测方法，检测不出明显的促红细胞生长的生理作用，即EPOP不具备作为贫血纠正药物使用的价值；当然，不排除采用更大剂量或更高灵敏度的检测方法可检测到较微弱体内活性的可能。
在本发明中，无体内生理活性的EPOP可以有多种来源，凡肽链结构与天然EPO相近的同源肽链，无论是人工合成的，还是通过原核系统或真核系统表达的，甚至经过改造的，例如在本发明实施例1、2中通过原核系统表达的具有166个氨基酸或167个氨基酸的肽链，因为缺乏糖链而不具备体内生理活性，都可以作为本发明PEG修饰的原料，从而获得具有体内生理活性的产物。
为了低成本地获得大量无体内活性的EPO蛋白，在本发明的一个实施方案中，首先构建可利用大肠杆菌系统高效表达的重组EPO基因和工程菌，其表达的重组EPOP无体内活性，然后以此EPOP为基础，用PEG2NHS-20K对其进行化学修饰，经修饰后的PEG-EPOP结合物在动物体内表现出明显的促红细胞生成的体内生理活性。
本发明采用原核表达系统获得无体内生物活性的EPOP，再采用PEG对EPOP进行化学修饰，获得PEG-EPOP结合物，并在动物实验中观察到具有体内活性。如以此PEG-EPOP结合物制成治疗贫血性疾病的药物，因原核表达系统在生产成本和规模成本上显著降低，比真核表达系统具有的巨大优势，可明显地降低病人的治疗用药费用。
附图说明
图1为重组EPOP原核表达系统质粒构建图。
图2PEG-EPO体内生理活性检测实验，用R-500分析仪测定网织红细胞百分数：
图中：纵坐标为网织红细胞百分数，横坐标为采血时间(1、2、3、4分别代表于注射样品后第四、五、六、七日采血)
0#：阴性对照
1#：rhEPO阳性对照
2#：重组EPOP，未修饰对照
3#：PEG-EPOP结合物，修饰后产物
图3为两种氨基酸序列(167AA和166AA)的EPO蛋白表达对照图；
图中：1：密码修改后，表达的167AA(含167位Arg)样品
2：密码修改后，表达的166AA(不含167位Arg)样品
3：1之诱导表达前对照样品
4：2之诱导表达前对照样品
具体实施方式
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述，说明但不限制本发明。
【实施例1】由原核表达系统表达的重组EPOP的制备
1.菌株及质粒
质粒PBV220全长3.66Kb，串联噬菌体PLPR启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄青霉素抗性，制备方法见含PLPR启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990，6(2)：11，该质粒由作者赠送。大肠杆菌菌株DH5α购自于GIBCO公司DH5α标准株。
2.工具酶及试剂
限制性内切酶BamH I、EcoRI、T4连接酶以及Taq DNA聚合酶购于Roche公司，质粒纯化试剂盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)购于Promega公司，蛋白分子量标记购于华美公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。
3.人促红细胞生成素基因的合成
人体内表达的EPO分子是由166个氨基酸构成的糖基化蛋白质，在后加工修饰过程中其C-末端Arg166位被切除，成为由165个氨基酸组成的成熟hEPO。hEPO的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白质一级结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。其中大肠杆菌稀有密码子的比例占到12％。为了让基因最佳化表达，我们通过对基因的重新设计和合成，消除稀有密码子而利用最佳化密码子。将hEPO中的绝大部分稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并适量调整GC含量，同时在目的基因片段的两端增加3个酶切位点：EcoR I：GAATTC；Nde I：CATATG；BamH I：GGATCC。密码替换前后对照如表1中所示，替换后合成的序列中编码序列如SEQ ID NO.3所示。由于大肠杆菌基因表达以甲硫氨酸起始，实际得到的肽链在SEQ ID NO.2序列N端多一个甲硫氨酸，共167个氨基酸的肽链，蛋白一级结构没有其它改变。
表1 hEPO基因密码替换前后对照表
4.序列合成方法：
方法参考Jelenkovic G，Billings S，Chen Q，et al.Transformation of eggplant withsynthetic ccryIIIA gene produces a high level of resistance to the Colorado potatobeetle.J Amer Soc Hort Sci，1998.123(1)：19～25，采用全基因合成的方法，首先使用设计软件设计长度约为80nt的oligo，这些oligo之间互相形成约18nt的overlap，然后进行多轮PCR扩增后得到全长基因，电泳回收后进行克隆，再测序得到序列正确的克隆。
为了合成表达成熟hEPO的165个氨基酸(由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列缺少第166位精氨酸)的基因序列，设计如下两条引物，用PCR法从含有经密码替换后的EPO基因的质粒中重新扩增出缺少第166位精氨酸密码(CGT)的EPO基因(如SEQ ID NO.4所示的表达165个氨基酸的基因序列)，按上述方法同样获高效表达，见图3。同样，在大肠杆菌中表达的肽链为N端增加一个甲硫氨酸共166个氨基酸的肽链。
引物：5’GAG GAA TTC ATA TGG CTC CGC CGC GTC TG 3’
5’CAG CTG GGA TCC TCA ATC ACC GGT ACG GCA 3’
5.重组质粒构建和筛选鉴定
将经测序正确的目的基因用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切得到编码序列(SEQ ID NO.4)，电泳后回收后与用限制性内切酶BamH I和EcoR I同样双酶切的PBV220质粒连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素的LB平板得转化子。挑取转化子，提取质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切分析，筛选含有hEPO基因片段的重组质粒转化子。
重组质粒的构建路线见图1。
6.EPO基因在大肠杆菌中的表达
将重组子接种于5ml LB培养基中，在30℃，180rpm摇床培养14h左右。然后以1∶30的比例转入LB培养基中，30℃培养4h左右(A600≈0.8时)。再以42℃诱导培养4h。取培养物1ml，离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定所表达的蛋白质。
7.高密度发酵培养的培养基及培养条件：
7.1.LB种子培养基：每立升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，PH7.0，高压灭菌，使用时加入氨苄青霉素至100ug/ml。
7.2.发酵用培养基：每10L含K2HPO4 12g，KH2PO4·3H2O 20g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 10g，葡萄糖500g，酵母粉480g，蛋白胨430g，高压灭菌后使用。
7.3.发酵培养：将保存的菌种划平皿，挑取单个菌落，接种于LB种子培养基中，培养14～16h后，再以1∶30的比例扩大培养12h。然后接种于NBSMPP-40发酵罐中培养，在培养过程中每间隔1个小时补料一次，并根据菌体生长情况调整PH和氧溶解度(DO)。
8.纯化：
发酵产物按照本领域技术人员已知的方法分离、纯化蛋白，如文献Asn to Lysmutations at three sites which are N-glycosylated in the mammalian protein decreasethe aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin，Protein Engineering，Vol.14 no.2 pp.135-140，2001，Linda O.Narhi etc.获得来自原核表达系统的重组EPO(EPOP)。
9.EPOP体外细胞学活性测定
9.1.方法：参考MTT比色法与ELISA法测定rhEPO体外生物学活性的比较细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Immunol)2000；16(5)]韩蕾，韩为跃，收获菌体以超声波破菌后离心。上清液直接进行UT7细胞活性检测，沉淀以6倍体积的7M尿素溶解后进行UT7细胞活性检测。标准品为利血宝(麒麟鲲鹏公司)3000IU/瓶(2ml)
9.2.结果：对照的载体菌上清及沉淀溶解液中均未测得UT7细胞活性。构建的工程菌破菌上清液测得8IU/ml，沉淀溶解液400倍稀释后测得700IU/ml。
因此获得的重组EPOP有维持UT7细胞生长的活性，证明所获的重组EPOP肽链具有EPO特有的体外细胞学活性。
【实施例2】PEG-EPOP结合物的制备
本发明涉及以PEG2NHS-20K修饰EPOP，所进行的化学修饰反应式如下：
其中X为NH或O，代表PEG对EPOP化学修饰的共价连接方式，一般为EPO肽链中赖氨酸的侧链氨基(NH)或EPO的N未端氨基，也可以是EPO肽链中如丝氨酸的侧链羟基(OH)。
其中i、j为整数，代表PEG碳链的长度；
根据PEG对EPOP的修饰程度，n为1～5的整数，优选为1；
mPEG的分子结构式为
其中k为100～1000的整数，为i与j之和，使结合物的mPEG部分分子量为5000～40000道尔顿，优选10000～20000道尔顿。
可采用以下方法对获得的重组EPO进行化学修饰：
1.交换缓冲体系(超滤法)：
用预先经0.5mol/L NaOH除热原处理过的超滤器浓缩重组人促红细胞生成素半成品，并对PH8.5、50.0mmol/L磷酸盐缓冲液透滤4次，并用相同缓冲液调整蛋白浓度为1mg/ml。
2.重组EPO的化学修饰反应
取重组EPO样品(1mg/ml)20ml，加入PEG2NHS-20K 100毫克(PEG2NHS为NEKTAR公司产品，产品使用说明见Nektar Molecule Engingeering CATALOG2003)，25℃缓慢搅拌下反应30min，加Gly400毫克终止反应。
在化学修饰中，重组EPO样品的蛋白浓度可以采用0.01～5mg/ml，优选0.1～1mg/ml，在本发明中最优选1mg/ml。活化PEG酯与被修饰蛋白的摩尔比为1∶1～1∶10或更高，如采用PEG2NHS-20K重量比约为2∶1～1∶5，在本发明中优选重量比为1∶5。
3.分离及纯化
3.1.Superdex 200分子筛层析柱：柱大小(26cm×100cm)
3.2.清洗及平衡：用无热原水洗层析柱，流速8～10ml/min，用5倍柱床体积清洗，然后用5倍柱床体积的平衡缓冲液(0.2mol/L NaCl 20mmol/L柠檬酸缓冲液PH7.0)平衡柱。
3.3.上样及洗脱：将促红细胞生成素修饰反应混合物样品进样，进样后用缓冲液(0.2mol.dm-3 NaCl 20mmol.dm-3柠檬酸缓冲液PH7.0)洗脱，OD280nm检测。分别收集第一峰(PEG-EPOP结合物)和第二峰(未反应EPOP)。
【实施例3】PEG-EPOP结合物动物体内促红细胞生成活性的测定之一
1.实验方法：参考《检测EPO体内生物学活性的网织红细胞法的建立 王箐舟、程雅琴 中国生物制品学杂志1997年第10卷第1期》，与文中略有不同的是按作者推荐，现采用仅注射一剂第四日采血的方法。
1.1.重组EPOP样品：依实施例1方法表达制备的EPO蛋白提纯样品，含有N端的甲硫氨酸及C端的精氨酸，共长167个氨基酸的肽链，UT-7检测细胞活性为44000IU/ml；
1.2.PEG-EPOP结合物样品：参照实施例2方法制备的PEG修饰后的PEG-EPOP结合物样品，在本次实验中的具体方法为：5ML前述重组EPOP样品中加入PEG2NHS-20K 50毫克，修饰反应完全后未经分离及纯化，置4度保存供动物实验用。
1.3.实验动物：Balb/C纯系小鼠，体重约20克。
1.4.样品以20mM磷酸盐缓冲液50倍稀释，各样品组以背部皮下注射0.2ml，每组3只，给药后第四日眼眶静脉采血，涂片染色，测网织红百分数。
2.结果：
2.1.重组EPOP：2.6％、3.4％、3.7％，均值为3.2％
2.2.PEG-EPOP：9.7％、7.9％、7.5％，均值为8.4％
2.3.阴性对照：2.3％、3.9％、3.4％，均值为3.2％(历史值)
在动物实验中，原核表达的重组EPOP样品未能检测出促红细胞生成作用，而同样量的PEG修饰后PEG-EPOP结合物样品有明显的促红细胞生成作用。说明重组EPOP样品可以通过PEG修饰获得原不具有的促红细胞生成素的体内活性。因此，本实验的结果说明没有体内活性而有体外细胞活性的EPO蛋白可以通过PEG修饰获得促红细胞生成素的体内活性。
【实施例4】PEG-EPOP结合物动物体内促红细胞生成活性的测定之二
1. 实验方法：参考实施例3，每只腹部皮下注射0.2ml，以R-500分析仪代替涂片染色测网织红细胞百分数，并测定注射后第四、五、六、七日的结果。
1.1. 0#：阴性对照共4只，注射生理盐水；
1.2. 1#：rhEPO阳性对照，采用上海复星科技生物克隆公司rhEPO产品贻宝，批号20040101，2000IU/瓶，2ml生理盐水溶解，取200ul，加生理盐水4.8ml稀释，浓度为40IU/ml，分4组每组4只。
1.3. 2#：重组EPOP，未修饰对照样品。依实施例1方法表达制备的EPO蛋白提纯样品，含有N端的甲硫氨酸不含C端的精氨酸，共长166个氨基酸的肽链，UT-7检测细胞活性为30000IU/ml，100倍稀释，浓度300IU/ml。分4组每组4只。
1.4. 3#：PEG-EPOP结合物，前述2#样品的修饰后产物，修饰方法同实施例3，同2#样品稀释分组。
2.实验结果：
见图2，本次实验中重组EPOP仅检测出微弱的体内活性，而在PEG-EPOP结合物中测出明显的体内活性。
上述实施例表明，无体内活性的EPOP，经过本发明方法修饰后的产物，具有良好的体内促红细胞生成的活性，由于成本低廉，应用前景好。
本发明涉及的肽链包括具有天然EPO氨基酸顺序的肽链以及为各种目的改进的同源肽链，如：按本发明中提出的具有166个氨基酸(如果从N端的第一位甲硫氨酸MET起算应为167个氨基酸，本发明的实施例表明具有该甲硫氨酸的EPOP仍具有理论上应有的体外细胞学活性及PEG修饰后的体内生理活性)的天然表达序列以及表达的模拟后加工中切去Arg166的天然肽链，或为它种目的改变部分氨基酸的肽链，如：减少糖基化位点以增加肽链稳定性等等，只要该EPO同源肽链在体内不能表现或仅能表现微弱的EPO生理活性，经PEG修饰后获得较强的体内生理活性，均在本发明的范围内。
本发明涉及的修饰试剂为活化PEG酯，也可采用其它的方法将PEG链与EPOP的肽链共价偶联，包括其它种类的活化基团，或对EPOP肽链的相应位点也进行活化，以及单链、双链或多链的多种结构的mPEG，同样在本发明的范围内。
很显然，以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
重组人促红细胞生成素.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>成都生物制品研究所
<120>聚乙二醇修饰后具有体内生理活性的重组促红细胞生成素
<130>2905
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>501
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(501)
<223>编码人重组人促红细胞生成素基因
<400>1
gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc 48
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc 144
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg 192
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg 240
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat 288
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg 336
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
gga gcc cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct 384
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc 432
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc 480
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
tgc agg aca ggg gac aga tga 501
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>Artificial(人工序列)
<400>2
重组人促红细胞生成素.ST25
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210>3
<211>501
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(501)
<400>3
gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60
gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact 120
gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct 180
gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg 240
ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt 300
ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc 360
cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa 420
ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct 480
tgccgtaccg gtgatcgttg a 501
重组人促红细胞生成素.ST25
<210>4
<211>498
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(498)
<400>4
gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60
gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact 120
gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct 180
gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg 240
ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt 300
ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc 360
cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa 420
ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct 480
tgccgtaccg gtgattga 498
Claims (7)
1、一种促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物，其特征在于将无体内活性的重组人促红细胞生成素蛋白经聚乙二醇化学修饰，获得具有体内促红细胞生成活性的产物。
2、权利要求1所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物，其特征在于其具有式(I)结构：
mPEG-X-EPOP (I)
式(I)中，mPEG的分子结构式为
其中k为100～1000的整数，使结合物的mPEG部分分子量为5000～40000道尔顿；
X为NH或O，代表PEG对EPOP化学修饰的共价连接方式；
EPOP代表无体内活性的重组人促红细胞生成素蛋白。
3、权利要求2所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物，其特征在于其具有式(II)结构：
式(II)中，n为1～5的整数，代表PEG对EPOP的修饰程度；
mPEG的分子结构式为
其中k为100～1000的整数，为i与j之和，使结合物的mPEG部分分子量为5000～40000道尔顿；
X为NH或O，代表PEG对EPOP化学修饰的共价连接方式；
EPOP代表无体内活性的重组人促红细胞生成素蛋白。
4、权利要求2所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物，其特征在于所述EPOP是由原核表达系统表达的。
5、权利要求4所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物，其特征在于所述EPOP是由大肠杆菌表达系统表达的。
6、权利要求1所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物在治疗贫血性疾病药物中的应用。
7、权利要求1所述的促红细胞生成素蛋白的聚乙二醇结合物在制备升高红细胞药物中的应用。
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