CN1304574C

CN1304574C - 适于原核表达系统的重组人促红细胞生成素基因及其表达载体

Info

Publication number: CN1304574C
Application number: CNB2005100509972A
Authority: CN
Inventors: 葛永红; 严君喜; 陈智勇
Original assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Current assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2005-02-05
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2025-02-05
Also published as: CN1657619A

Abstract

本发明涉及能在原核系统中高效表达的重组人促红细胞生成素基因、其表达载体、宿主细胞。通过对已知的hEPO基因的碱基序列进行重新设计，消除大肠杆菌稀有密码子，而代之以大肠杆菌偏爱密码子，获得了高效表达的重组基因。本发明所涉及的EPO为无糖基化的EPO肽链，因生产成本较生产具糖基化的rhEPO低，可直接用于仅用其体外活性而不需体内活性的领域。

Description

适于原核表达系统的重组人促红细胞生成素基因及其表达载体

技术领域

本发明涉及人工合成的人促红细胞生成素基因，具体地说涉及可在大肠杆菌中高效表达的重组人促红细胞生成素基因。

本发明还涉及含有重组人促红细胞生成素的载体和宿主细胞。

本发明还涉及含有本发明重组人红细胞生成素的抗原和肽链蛋白试剂。

背景技术

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种主要由肾脏合成并分泌的糖蛋白激素，能刺激骨髓中的红细胞前体细胞的分化与增殖，在红细胞发育成熟过程中起着重要的作用，是红细胞形成的内源性调节剂，在临床上可用于治疗各种贫血性疾病。

美国科学家在1985年首次成功克隆了人EPO基因，为单考贝基因，定位于第7号染色体长臂7q21-22区域。整个基因由5个外显子和4个内含子组成，编码193个氨基酸。其中前端27个氨基酸为信号肽，成熟蛋白质由165个氨基酸分子组成(EPO分子在后加工修饰过程中其C-末端Arg¹⁶⁶位被切除)。1986-1987年Joseph Eschbath博士等人首次将rhEPO用于临床病人，开始了临床应用验证(Cotes PM，et al.Determination of serum immunoreactive erythropoietin in the investigation oferythrocytosis.N Engl J Med 1986；315：283～287.Eschbach JW，et al.Correction of theanemia of end-stage renal disease with recombinant human erythropoietin：rusults of acombined phase I and II clinical trials.N Engl JMed 1987；316：73～77.Schaefer R M，et，al.Therapy of renal anemia with recombinant human erythropoietin.Dtsch MedWochenschr 1988；113：125～129.Matsumoto T，et al.Effect of recombinant humanerythropoietin on cancer drug-induced-anemia.Br J Haematol 1990；75：463～468.及Adamson J W.Cytokine biology.Implications for transfusion medicine.Cancer1991；67：2708～2711.)。

EPO分子是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，对热(在80℃条件下不变性)和酸碱(稳定范围在PH 3.5～10.0之间)较为稳定。蛋白质肽链中Cys¹⁶¹与Cys⁷、Cys²⁹和Cys³³之间分别形成两对二硫键，其中Cys⁷和Cys¹⁶¹之间的二硫键对于EPO的生物活性至关重要，如果二硫键被还原，EPO将丧失其生物活性。EPO分子的四个糖基化位点分别在Asn³⁸、Asn²⁴、Asn⁸³和Ser¹²⁶上，前三者为N-糖链，后者为O-糖链。糖链的分枝程度不同，有双末梢、三末梢或四末梢，其中四末梢最为常见，由于EPO糖基结构部分占整个分子量的30-40％，其糖链分枝程度的不同使EPO的分子量在30～40KD之间。研究结果表明，糖链的分枝程度对EPO在体内的生物活性有影响，N-端糖链的高度分枝对其维持生物体内生物活性是必要的。去唾液酸或去糖基化不影响在体外的生物活性，但却大大缩短了在体内的半衰期(主要经肝细胞吸附代谢)，结果使其完全不能表现出体内生物学活性。只有EPO分子被充分糖基化后，才能在体内才表现出生物活性。因此糖链结构的存在对EPO在体内的生物活性至关重要。

通过DNA重组技术，将人EPO基因转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后，可由CHO细胞大量合成重组的人EPO(rhEPO)。rhEPO分子由肽链及不同糖基化程度的几个糖链结构组成，分子大小和生物学活性等方面均与人内源性EPO相同，但在唾液酸含量上存在微小的差别。EPO去糖基后虽然在体外有生物活性，但在体内生物活性丧失。1989年6月美国Amgen公司生产的rhEPO正式获得美国FDA注册许可，用于临床治疗慢性肾衰竭合并贫血症。讫今为止近十年的临床应用的结果表明rhEPO的疗效显著，副作用小，在美国的年销售额就达数十亿美元，是讫今开发的最为成功的生物技术药品之一。

但由于其价格相对昂贵，使用频度较高，造成医疗总体费用太高。为了减轻病人在使用rhEPO时的费用负担，使更多的适应症病人能够有能力接受rhEPO治疗，国内外许多厂家都在研究增加rhEPO的生物利用度，减少注射剂量或次数的方法。Amgen公司第二代长效的EPO制剂(Aranesp)已在2002年获得美国FDA批准上市销售。

rhEPO自1989年投入临床使用迄今已十年，其临床适应症已由最初的治疗慢性肾功能衰竭(CRF)合并贫血扩展到多种贫血性疾病的治疗，包括肿瘤及肿瘤化疗所致的贫血，骨髓增生异常综合征贫血(Myelodysplastic Syndrome，MDS)，齐多夫定(zidovudine)治疗的AIDS病人以及采用自体输血的手术病人等。临床上针对不同适应症病人，人们采用各自相应的治疗措施已取得了较为肯定和满意的结果。

目前认为EPO的糖结构对维持其体内生物效应具有重要的作用。但是目前对EPO糖基化在EPO表达其生物活性中具体作用的报道相对较少，同时对EPO的活性部位也有多种说法(周廷冲，马贤凯，唐佩弦等。多肽生长因子基础与临床。中国科学技术出版社。)。现在大量有关EPO研究都是针对糖基化的EPO，有关hEPO基因克隆、在COS和CHO等哺乳动物细胞系中获得高效表达的研究很多，可能是基因结构的原因以及EPO蛋白质的特殊性，目前检索到的有关对hEPO基因在E.coli中表达研究以及对原核表达系统表达的EPO的相关性质的研究等方面的报道较少，如：文献Expression and mutagenesis of recombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli，Biochemica et Biophysica Acta 1261(1995)35-43，Roslyn M.Bill etc.；Expression and mutagenesis ofrecombinant human and murine erythropoietins in Escherichia coli，Biochimica et Biophysica Acta1261(1995)35-43.Roslyn M.Bill etc.；Ash to Lys mutations at three sites which are N-glycosylated in themammalian protein decrease the aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin，ProteinEngineering，Vol.14 no.2 pp.135-140，2001，Linda O.Narhi etc.

在原核表达系统中表达的EPO蛋白，尽管由于缺少糖基化而在体内不具有活性，但由于原核系统生产成本大大低于真核系统，而且研究表明肽链上的糖基化程度与其体内活性正相关而与体外活性无关，因此对于非体内应用的EPO蛋白，依然可以通过原核表达系统来制备。为了研究原核表达系统表达的EPO相关性质，我们曾经构建过几种不同的原核表达载体，但EPO的表达量都比较少，只能通过ELISA方法检测到目的蛋白，SDS-PAGE电泳基本不能看到表达条带。

研究资料表明影响真核基因在E.coli中高效表达的因素很多，如基因的二级结构、基因的5′端和3′端稳定性、SD序列的位置以及密码子的偏爱性等(Chen.T.InouyeM.Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expressionpreforential usage of minor codons within the first 25 codons of the E.coli gene.NucleiAcids Research 1990.18：1465～1473.)。同时，对真核和原核基因的密码子的差异性研究也很多，发现如果稀有密码子过多，其表达量较低(Zhang S，zubay G，Goldman E.Low-usage codons in E.coli.yeast.fruit fly and primates.Gene.1991.105：61～72.及Sorensen M A，Kurland CG.Pedersen S.Codon usage determines translation rate in E.coli.J.Mol.Biol.1989.207：365～377.)。而在EPO基因中，我们发现E.coli稀有密码子占到12％，可能是制约hEPO在E.coli中高效表达的主要原因之一，因此可以通过密码替换来改变基因结构，从而构建在大肠杆菌中能高效表达EPO的工程菌株。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可在原核生物特别是大肠杆菌中高效表达的重组人促红细胞生成素基因序列。

本发明的另一个目的在于提供包含本发明重组基因的质粒和宿主表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有本发明重组人促红细胞生成素的抗原和肽链蛋白试剂。

根据本发明的一方面，新的可表达人促红细胞生成素的基因的构建是通过对已知的人促红细胞生成素(hEPO)基因的碱基序列进行重新设计，消除大肠杆菌稀有密码子，而代之以大肠杆菌偏爱密码子，并适量调整GC含量，同时在目的基因片段的两端增加3个酶切位点。密码替换前后的对照如表1所示，为方便比较按50个碱基一组分列，表中给出的是替换前后的全部cDNA序列：

表1hEPO基因密码替换前后对照表

根据本发明的另一方面，含有重组hEPO基因的质粒载体通过将合成的hEPO基因经酶切后连接进入质粒而构建成本发明的质粒载体。在本发明的一个实施方案中，合成的hEPO基因中含有BamH I和EcoR I酶切位点，经双酶切后，与同样含有该两个酶切位点的PBV₂₂₀质粒连接。

根据本发明的再一方面，用获得的本发明的重组质粒载体转化大肠杆菌而得到本发明的含有重组hEPO基因的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，将质粒载体转化大肠杆菌DH₅α，涂布含氨苄青霉素的LB平板得转化子。挑取转化子，提取质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切分析，筛选含有hEPO基因片段的重组质粒转化细胞。

根据本发明的又一方面，提供含有本发明重组人红细胞生成素的抗原和肽链蛋白试剂，可用于制备抗EPO单克隆抗体的抗原，也可用于制备检测所用的阳性对照标准。也可用于免疫动物的EPO抗原；或制备成EPO阳性对照标准品，用于EPO免疫检测的试剂盒，如反相血凝、放射免疫、酶联免疫等方法；以及用于EPO依赖细胞系的培养或以之检测EPO体外活性的标准品等等。

本发明通过密码替换来改变基因序列，构建了新的表达人促红细胞生成素蛋白的基因及其表达载体。结果发现密码替换后，hEPO能在E.coli中高效表达，为研究原核系统表达的EPO的相关性质提供了基础。本发明所涉及的EPO为无糖基化的EPO肽链，因生产成本较生产具糖基化的rhEPO低，可直接用于仅用其体外活性而不需体内活性的领域。

本发明的制备重组hEPO的方法中，构建高效表达的工程菌在保证产物高表达的前提下，采用高密度发酵技术，提高菌体发酵密度，不仅能减少培养体积，而且有利于下游纯化，很大程度上降低各种成本。

附图说明

图1为本发明的质粒构建步骤示意图；

图2为本发明构建的基因在E.coli中的表达产物SDS-PAGE图；

图中：1：阴性对照

2、3、4、5、6：PBV₂₂₀-hEPO/DH₅α

图3为本发明的rhEPO Western blot结果；

图中：1：阴性对照

2：试管表达产物

3：发酵罐表达产物

图4示出培养温度对本发明rhEPO表达影响的电泳图；

图中：1：蛋白分子量标记(14,400、20,100、30,000、43,000、67,000、94,000)

2：在30℃培养

3：在28℃培养

4：在35℃培养

5：阴性对照

图5为培养时间对本发明rhEPO表达影响的电泳图；

2：培养5hr

3：培养4hr

4：培养3hr

5：培养2hr

6：阴性对照

图6为密码修改前后hEPO的表达对照图；

2：PBV220-EPO-DH₅α，密码未修改，未诱导表达的对照样品

3：PBV220-EPO-DH₅α，密码未修改，诱导表达的样品

4：PBV220-EPO-DH₅α，密码已修改，未诱导表达的对照样品

5：PBV220-EPO-DH₅α，密码已修改，诱导表达的样品

图7为两种氨基酸序列(167AA和166AA，均包括第一位Met)的EPO蛋白表达对照图；

图中：1：密码修改后，表达的167AA(含167位Arg)样品

2：密码修改后，表达的166AA(不含167位Arg)样品

3：1之诱导表达前对照样品

4：2之诱导表达前对照样品

具体实施方式

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述，说明但不限制本发明。

【实施例1】重组人促红细胞生成素基因(rhEPO)的合成和表达载体构建

1.菌株及质粒

质粒PBV₂₂₀全长3.66Kb，串联噬菌体P_LP_R启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄青霉素抗性，制备方法见含P_LP_R启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990，6(2)：11，该质粒由作者赠送。大肠杆菌菌株DH₅α购自于GIBCO公司DH₅α标准株。

2.工具酶及试剂

限制性内切酶BamH I、EcoR I、T4连接酶以及Taq DNA聚合酶购于Roche公司，质粒纯化试剂盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)购于Promega公司，蛋白分子量标记购于华美公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。

3.人促红细胞生成素基因的合成

人体内表达的EPO分子由166个氨基酸构成的糖基化蛋白质，在后加工修饰过程中其C-末端Arg¹⁶⁶位被切除，成为由165个氨基酸组成的成熟hEPO。hEPO的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白质一级结构的氨基酸序列如SEQ IDNO.2。其中大肠杆菌稀有密码子的比例占到12％。为了让基因最佳化表达，我们通过对基因的重新设计和合成，消除稀有密码子而利用最佳化密码子。将hEPO中的绝大部分稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并适量调整GC含量，同时在目的基因片段的两端增加3个酶切位点：EcoR I：GAATTC；Nde I：CATATG；BamH I：GGATCC。密码替换前后对照如表1中所示，替换后合成的序列中编码序列如SEQ ID NO.3所示。由于大肠杆菌基因表达以甲硫氨酸起始，实际得到的肽链在SEQ ID NO.2序列N端多一个甲硫氨酸，共167个氨基酸的肽链，蛋白一级结构没有其它改变。

4.序列合成方法：

方法参考Jelenkovic G，Billings S，Chen Q，et al.Transformation of eggplant withsynthetic ccryIIIA gene produces a high level of resistance to the Colorado potatobeetle.J Amer Soc Hort Sci，1998.123(1)：19～25，采用全基因合成的方法，首先使用设计软件设计长度约为80nt的oligo，这些oligo之间互相形成约18nt的overlap，然后进行多轮PCR扩增后得到全长基因，电泳回收后进行克隆，再测序得到序列正确的克隆。

为了合成表达成熟hEPO的165个氨基酸(由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列缺少第166位精氨酸)的基因序列，设计如下两条引物，用PCR法从含有经密码替换后的EPO基因的质粒中重新扩增出缺少第166位精氨酸密码(CGT)的EPO基因(以下步骤和实施例均使用如SEQ ID NO.4所示的表达165个氨基酸的基因序列)，按上述方法同样获高效表达，见图7。同样，在大肠杆菌中表达的肽链为N端增加一个甲硫氨酸共166个氨基酸的肽链。

引物：5’GAG GAA TTC ATA TGG CTC CGC CGC GTC TG 3’

5’CAG CTG GGA TCC TCA ATC ACC GGT ACG GCA 3’

5.重组质粒构建和筛选鉴定

将经测序正确的目的基因用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切得到编码序列(SEQ ID NO.4)，电泳后回收后与用限制性内切酶BamH I和EcoR I同样双酶切的PBV₂₂₀质粒连接。连接产物转化大肠杆菌DH₅α，涂布含氨苄青霉素的LB平板得转化子。挑取转化子，提取质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切分析，筛选含有hEPO基因片段的重组质粒转化子。

重组质粒的构建路线见图1。

6.EPO基因在大肠杆菌中的表达

将重组子接种于5ml LB培养基中，在30℃，180rpm摇床培养14h左右。然后以1∶30的比例转入LB培养基中，30℃培养4h左右(A₆₀₀≈0.8时)。再以42℃诱导培养4h。取培养物1ml，离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定所表达的蛋白质。

【实施例2】重组人促红细胞生成素的制备

高密度发酵培养的培养基及培养条件：

1.LB种子培养基：每立升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，PH7.0，高压灭菌，使用时加入氨苄青霉素至100ug/ml。

2.发酵用培养基：每10L含K₂HPO₄12g，KH₂PO₄·3H₂O 20g，NaCl 20g，MgSO₄·7H₂O 10g，葡萄糖500g，酵母粉480g，蛋白胨430g，高压灭菌后使用。

3.发酵培养：将保存的菌种划平皿，挑取单个菌落，接种于LB种子培养基中，培养14～16h后，再以1∶30的比例扩大培养12h。然后接种于NBSMPP-40发酵罐中培养，在培养过程中每间隔1个小时补料一次，并根据菌体生长情况调整PH和氧溶解度(DO)。

【实施例3】结果测定

1.EPO体外细胞学活性测定

方法：参考《MTT比色法与ELISA法测定rhEPO体外生物学活性的比较[细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Immunol)2000；16(5)]韩蕾，韩为跃》，收获菌体以超声波破菌后离心。上清液直接进行UT7细胞活性检测，沉淀以6倍体积的7M尿素溶解后进行UT7细胞活性检测。标准品为rhEPO(麒麟鲲鹏公司利血宝)3000IU/瓶(2ml)。

结果：对照的载体菌上清及沉淀溶解液中均未测得UT7细胞活性。构建的工程菌破菌上清液测得8IU/ml，沉淀溶解液400倍稀释后测得700IU/ml。

2.密码修改前后及诱导前后的hEPO表达量测定

将获得的hEPO与对照组比较，结果见图6。

3.rhEPO的DNA序列测定

构建的重组质粒DNA序列测定的结果与设计的序列完全一致，且氨基酸序列与文献(Goldwasser E，et，al.Erythropoietin：the primary regulator of red cellformation.In：sporn MB.Roberts AB.Eds.Peptide growth factors and their receptors.Berlin：Springer-verlag.1990：747～770.)报道的rhEPO氨基酸序列除起始甲硫氨酸外完全一致。

4.EPO高效表达及Western blot鉴定

SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定结果显示，摇瓶培养和发酵罐培养均得到高表达，表达量达到30％左右，而且高表达的条带都具有rhEPO抗原性，见图2、图3。

【实施例4】各种条件对表达产物的影响

1.温度对表达产物的影响

通过比较发现，工程菌在30℃培养42℃诱导时，目的蛋白表达量最高，达到33％；在35℃进行培养时，虽然细菌的生长较快，菌密度明显增加，但hEPO表达量却很低，为20％；在28℃时培养，细菌生长速率较慢，菌密度增加缓慢，但工程菌hEPO的表达量较高，达到25％。见图4。

2.培养时间对表达产物的影响

研究发现细菌培养15h左右开始升温诱导，大约诱导4h左右，表达量可以达到34％；如果诱导时间逐步缩短，目的蛋白的表达量有所减少；但是通过SDS-PAGE电泳综合比较，大约诱导3h左右，情况比较好。一是目的蛋白表达量相对较高，达到28％，而且杂蛋白的量也不高，更加有利于下游纯化工作，见图5。

3.溶氧量与培养基对表达产物的影响

通过实验发现，在发酵过程中，溶氧量控制在20％时，表达产物的量比较高，杂蛋白较少；同时在培养过程中应根据OD值的变化适时补充葡萄糖、酵母粉和蛋白胨，葡萄糖的浓度应维持在1g/L左右，以利于细菌生长。

4.密码修改和诱导对hEPO表达的影响

图6中，由第2、3比较可见，在目的分子量(18～20K)处可见较弱的表达条带，扫描定量占总蛋白量不足1％；由4、5比较可见，在目的分子量(18～20K)处可见较强的表达条带，扫描定量占总蛋白量的25％。

由以上各实施例表明，通过密码替换改变基因序列后，rhEPO能在E.coli中高效表达，因此为原核系统中大规模生产制备hEPO奠定了基础。

构建高效表达的工程菌在保证产物高表达的前提下，采用高密度发酵技术，提高菌体发酵密度，不仅能减少培养体积，而且有利于下游纯化，很大程度上降低各种成本。由于发酵是个动态过程，影响大肠杆菌高密度高表达发酵的因素主要有温度、PH、补料调控、氧溶解度(DO)等方面。根据实际情况，我们研究了温度、培养时间对表达产物的影响；同时在发酵过程中采用间隙补料方式。由于细菌的生长是以指数形式增加，因此它对葡萄糖的要求也以这种形式增加，而我们采取的间隙补料方式即能保证葡萄糖加入量与细菌的生长需求一致，有利于细菌生长，提高目的蛋白的表达。

本发明制备的重组hEPO，其为无糖基化的EPO肽链，因生产成本较生产具糖基化的rhEPO低，目前的研究已经证明肽链上的糖基化程度与其体内活性正相关而与体外活性无关，可直接用于仅用其体外活性而不需体内活性的领域。

本发明所构建的工程菌高效表达的产物经与抗EPO单克隆抗体斑点杂交，可产生阳性斑点；而对照的载体菌不产生阳性斑点。证明本发明所获的EPO肽链具有EPO特有的抗原活性，可开发生产出用于制备抗EPO单克隆抗体的抗原，也可用于制备检测所用的阳性对照标准。因此本发明的hEPO可以用于制备EPO肽链蛋白试剂；也可用于免疫动物的EPO抗原；或制备成EPO阳性对照标准品，用于EPO免疫检测的试剂盒，如反相血凝、放射免疫、酶联免疫等方法。

本发明所组建的工程菌高效表达的产物(SDS-PAGE可见表达条带)经EPO依赖细胞系UT7检测，发现具有EPO特有的维持UT7细胞生长的活性；而对照的载体菌(SDS-PAGE未见表达条带)未检出相应的EPO活性。此实验证明所获的EPO肽链具有EPO特有的体外细胞学活性，可用于制备EPO依赖细胞系生长所必需的细胞因子添加剂。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

重组人促红细胞生成素.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>成都生物制品研究所

<120>适于原核表达系统的重组人促红细胞生成素基因及其表达载体

<130>2832

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(501)

<223>编码人重组人促红细胞生成素基因

<400>1

gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac crc 48

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc 144

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg 192

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg 240

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat 288

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg 336

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

gga gcc cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct 384

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc 432

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc 480

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

tgc agg aca ggg gac aga tga 501

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<400>2

重组人促红细胞生成素.ST25

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>3

<211>501

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(501)

<400>3

gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60

gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact 120

gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct 180

gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg 240

ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt 300

ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc 360

cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa 420

ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct 480

tgccgtaccg gtgatcgttg a 501

重组人促红细胞生成素.ST25

<210>4

<211>498

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(498)

<400>4

gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60

gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact 120

gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct 180

gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg 240

ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt 300

ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc 360

cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa 420

ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct 480

tgccgtaccg gtgattga 498

Claims

1、一种可在原核系统中高效表达的重组人促红细胞生成素基因，其特征在于其具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。

2、含有权利要求1所述基因的重组质粒载体。

3、根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于所述重组质粒载体是将SEQ ID NO.4所示核苷酸序列经酶切后与PBV220连接而构建的。

4、含有权利要求1所述的基因的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。

5、根据权利要求4所述的宿主细胞，特征在于所述宿主细胞是用含有SEQ ID NO.4序列的质粒载体转入大肠杆菌DH5α而制备的。