CN111087475A

CN111087475A - Fgf21融合蛋白及抑制其降解的方法

Info

Publication number: CN111087475A
Application number: CN201911359029.8A
Authority: CN
Inventors: 李宇晟; 李利佳; 陈超; 欧晓涛; 尚龙; 万志滔; 杨佩; 向婷; 陈小锋; 李文佳
Original assignee: Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co Ltd
Current assignee: Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co Ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111087475B

Abstract

本发明公开了一种FGF21融合蛋白，所述融合蛋白包括：(1)：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的胰高血糖素样多肽1(GLP‑1)变体、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的连接肽、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融合蛋白。本发明还公开了抑制FGF21融合蛋白降解的方法，包括在培养基中添加C1蛋白酶抑制剂。本发明的方法可有效抑制FGF21融合蛋白的降解。

Description

FGF21融合蛋白及抑制其降解的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种FGF21融合蛋白及抑制FGF21融合蛋白降解的方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)，是一种具有多效性的类荷尔蒙蛋白，本身并无促纤维素生长的作用，是糖脂代谢的关键调控蛋白，作为葡萄糖和脂质内稳态的重要代谢调节物质发挥作用。

有文献报道，在稳定表达重组FGF21的CHO细胞中，FGF21容易出现降解，降解处于从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间肽键位置，该降解源于CHO细胞自身的蛋白酶。

Takeshi Shimomura等公开了CHO-322细胞表达的重组人载脂蛋白E(Apo-E)在无血清培养基中降解为24KDa及23KDa的片段，在含胎牛血清培养基中，降解得到抑制。从胎牛血清中分离纯化抑制剂分子，将其加至无血清培养的CHO-322培养基，添加剂量与降解情况呈明显依赖性，上清中可检测到完整的Apo-E。(Takeshi Shimomura，Suppression of thedegradation of recombinant human apolipoprotein E by a protease inhibitorobtained from fetal bovine serum in serum-free culture，Cytotechnology.1991May；6(1):1-11.)

Weng,Yan等公开了在稳定表达重组FGF21的CHO细胞中，FGF21容易出现降解，降解处于从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间肽键位置，该降解源于CHO细胞自身的蛋白酶。(Weng,Yan,et al."Glyco-engineered Long Acting FGF21 Variant with OptimalPharmaceutical and Pharmacokinetic Properties to Enable Weekly to TwiceMonthly Subcutaneous Dosing."Scientific Reports 8.1(2018):1-15.)

近年来，为了开发FGF21在制药方面的用途，人们在增加FGF21在体内的稳定性、延长半衰期等方面做出了多种尝试，如在FGF21天然序列的基础上进行不同位点的突变或插入氨基酸或脂肪链或删除部分氨基酸、采用成熟的偶联和修饰技术等。

但对序列进行的各类突变和修饰，存在非常高的技术门槛。第一，若添加或修改的氨基酸数量过多，在很大程度上会引起分子免疫原性的增加，诱发机体产生有害的免疫反应，导致抗药抗体的产生。第二，对分子的改造往往需要考虑改造前后氨基酸残基的电荷、亲疏水性、二级结构倾向性及药效活性，是基于计算机理论模拟的结果，需要丰富的知识储备。另外，设计分子变体及后续验证，需要耗费大量时间。

因此，需要开发操作简单且能更有效的抑制FGF21降解的试剂和/或方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案。

第一方面，本发明提供一种FGF21融合蛋白，所述融合蛋白包括：(1)：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的连接肽、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融合蛋白。

第二方面，本发明提供一种编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：(1)：编码胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、编码连接肽的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、编码人IgG4变体抗体的Fc部分的SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列和编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体的SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含前述的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统包含前述的表达载体。

作为本发明的一个具体实施方式，所述表达系统为宿主细胞，优选CHO宿主细胞。

第五方面，本发明提供一种用于培养前述的表达系统的培养基，所述培养基中包含C1蛋白酶抑制剂；优选地，所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

作为本发明的一个具体实施方式，所述培养基中C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16μg/mL，优选为2-8μg/mL。

第六方面，本发明提供一种抑制FGF21融合蛋白降解的方法，所述方法包括在培养所述FGF21融合蛋白的培养基中添加C1蛋白酶抑制剂；优选地，所述FGF21融合蛋白具有Arg与Tyr之间的肽键；更优选地，所述FGF21融合蛋白具有从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间的肽键。

作为本发明的一个具体实施方式，所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；优选地，培养基中所述C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16μg/mL，更优选为2-8μg/mL。

通过本发明的方法，可使分泌至培养基中的FGF21融合蛋白避免被蛋白酶降解。在培养基中添加C1蛋白酶抑制剂，可有效解决FGF21融合蛋白的降解问题，尤其是具有Arg与Tyr之间的肽键的FGF21融合蛋白的降解问题。

本发明所用的C1蛋白酶抑制剂为人血浆C1抑制剂(human plasma C1inhibitor)，又称C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor，C1-INH)或C1抑制物(C1inhibitor)，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。在探索过程中，发明人尝试使用其他类型广谱蛋白酶抑制剂或培养添加物，结果对降解并无改善效果。另外，发明人还通过更改培养基改变表达产物的糖基化程度，结果对降解情况也没有改善。

经过大量的努力和实验，发明人意外地发现在FGF21融合蛋白的细胞培养阶段添加C1蛋白酶抑制剂至培养基中，培养结束后采用质谱检测分泌表达的融合蛋白降解情况，C1蛋白酶抑制剂的高浓度添加组(2μg/mL)可抑制蛋白降解，中浓度添加组(1μg/mL)可部分抑制降解，然而低浓度添加组(0.5μg/mL)降解蛋白占比较多，因此可得出结论，即添加一定浓度C1蛋白酶抑制剂可有效抑制FGF21融合蛋白的降解，所述降解为FGF21融合蛋白的Arg与Tyr之间肽键位置的降解。

发明人进一步将C1蛋白酶抑制剂的浓度增大至8μg/mL和16μg/mL，发现两组添加浓度，均可有效抑制产物降解，但16μg/mL添加组的细胞活率及活细胞密度略低。综合发明人的研究成果可得出，C1蛋白酶抑制剂的添加浓度可为1-16μg/mL，优选的添加浓度可为2-8μg/mL。

有益效果

本发明通过大量的实验研究发现，在抑制FGF21融合蛋白的降解方面，更换不同培养基，或是添加培养添加物人血清白蛋白HSA，以及尝试了很多种蛋白酶抑制剂，却都不能改善FGF21融合蛋白的降解(详见对比例2-6)。然而，发明人最终意外地发现在细胞培养(特别是CHO细胞培养)过程中添加某种特定的蛋白酶抑制剂(即C1蛋白酶抑制剂或C1-INH)，可以有效降低表达的FGF21融合蛋白的降解。在培养基中添加本发明的C1蛋白酶抑制剂，可有效抑制FGF21融合蛋白的Arg与Tyr之间肽键位置的降解。本发明的方法操作简便，抑制FGF21融合蛋白降解的效果稳定。

根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见以下表格：

残基	保守性替换	残基	保守性替换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见以下表格：

附图说明

图1.表达GLP-1类似物和FGF21类似物的表达载体图谱。

图2.添加不同浓度的C1蛋白酶抑制剂的培养上清纯化后的质谱检测图。

图3.对一系列融合蛋白进行非还原SDS-PAGE的检测图，其中：

M：蛋白标记物，6：8μg/mL C1抑制剂添加组，

8：16μg/mL C1抑制剂添加组，9：未添加C1抑制剂添加组。

图4.分别采用KD-CHOM(M1～M5)培养基的还原质谱检测图。

图5.分别采用Cellvento 200和KD-CHOM(B1-1，B1-2，B1-3)培养基的还原质谱检测图。

图6.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂SIMGA-P1860的非还原质谱检测图。

图7.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂PMSF的还原质谱检测图。

图8.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EGTA的还原质谱检测图。

图9.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂Chymostatin的还原质谱检测图。

图10.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂Ebelactone B的还原质谱检测图。

图11.添加不同浓度的培养添加物HSA的还原质谱检测图。

附图标记说明：

1：降解的蛋白 2：未降解的蛋白

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：表达载体的构建

构建一种融合表达GLP-1类似物和FGF21类似物的基因工程细胞株。

依据CHO的偏好密码子优化融合蛋白序列A-B-C-D-E-F，其中A为信号肽，B为胰高血糖素样肽-1变体(GLP-1)，C为连接肽，D为IgG4变体，E为连接肽，F为FGF21变体。

A：信号肽

核苷酸序列(SEQ ID NO:1)

atgcggtttttcttcgtgttcctggccatcgtgctgtttcagggcatccacgga

氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

MRFFFVFLAIVLFQGIHG

B：GLP-1变体

核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

cacggagaaggaacctttacctccgacgtgtcttcttacctggaggaacaggcagctaaggagtttatcgcttggctggtgaaaggaggagga

氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG

C：连接肽

核苷酸序列(SEQ ID NO:5)

ggaggaggaggatccggaggaggaggatccggaggaggaggatcc

氨基酸序列(SEQ ID NO:6)

GGGGSGGGGSGGGGS

D：IgG4变体

核苷酸序列(SEQ ID NO:7)

gaatctaagtacggacctccttgtcctccttgtccagctccagaagcagcaggaggaccttcagtgtttctgtttcctcctaagcctaaggataccctgatgatctccagaacaccagaagtgacttgcgtggtggtggacgtgtctcaggaagatccagaagtgcagttcaattggtacgtggacggagtggaagtgcataacgctaagaccaagcctagagaggagcagttcaactccacctatagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcatcaggattggctgaacggaaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggactgccttcttccatcgagaagacaatctccaaggctaagggacagcctagagaacctcaggtgtatacactgcctccttctcaggaagagatgaccaagaaccaggtgtctctgacttgtctggtgaagggcttctatccttctgatatcgccgtcgagtgggaatctaacggacagccagagaacaactacaagaccacacctccagtgctggattcagacggatccttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaaatctaggtggcaggaaggaaacgtgttctcttgttccgtgatgcacgaagctctgcataaccactacacccagaagtctctgtctctgtctctggga

氨基酸序列(SEQ ID NO:8)

ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

E：连接肽，序列同C

F：FGF21变体

核苷酸序列(SEQ ID NO:9)

catcctattccagattcttctcctctgctgcagtttggaggtcaggtgagacagagatacctgtacacagatgacgctcagcagacagaagctcatctggaaatcagagaagacggaacagtgggaggagcagcagatcagtctccagaatctctgctgcagctgaaagctctgaagccaggagtgattcagatcctgggagtgaagacctccagatttctgtgtcagagaccagacggagctctgtacggatctctgcattttgacccagaggcttgttccttcagagaaagactgctggaagacggatacaacgtgtatcagagcgaagctcacggactgcctctgcatctgccaggaaataagtctcctcatagagatccagctcctagaggaccagctagatttctgcctctgccaggactgcctccagctctgccagaacctccaggcatcctggctcctcagcctccagacgtgggatcttcagatcctctgcatatggtgggagcttctcagggactgtctccttcttacgcttct

氨基酸序列(SEQ ID NO:10)

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRERLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLHMVGASQGLSPSYAS

由基因合成服务公司合成上述序列，通过酶切将片段(X，即A-B-C-D-E-F对应的核苷酸序列)连接至载体pcDNA3.1的对应酶切位点之间，将该载体转化大肠杆菌DH5α感受态，经酶切验证得到克隆正确的pcDNA3.1-X菌株。经质粒抽提得到表达融合蛋白A-B-C-D-E-F的表达载体，构建的表达载体如图1所示。

实施例2：构建CHO稳转细胞池

构建表达融合蛋白A-B-C-D-E-F的CHO稳转细胞池。

将实施例1中构建的表达载体使用限制性内切酶线性化处理，乙醇沉淀后经过酚氯仿抽提后，溶解待用。

将CHOK1宿主细胞用Cellvento CHO 200培养基复苏培养后，当细胞密度约8×10⁵cell/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×10⁷cell，线性化质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL Cellvento CHO 200培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在20mL Cellvento CHO 200培养基中重悬加压培养。当细胞密度约0.6×10⁶cell/mL时，对获得的混合克隆株用Cellvento CHO 200培养基进行传代，传代细胞密度约0.3×10⁶cell/mL。当细胞存活率约90％时，获得CHOK1稳转细胞池。

实施例3：质谱检测

将获得的CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基，加入C1抑制剂至培养基，分别为高浓度添加组(2μg/mL)、中浓度添加组(1μg/mL)、低浓度添加组(0.5μg/mL)，37℃，8％CO₂条件下培养3天后，降温至30℃继续培养4天。经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明，高浓度添加组能抑制FGF21融合蛋白降解，且抑制效果呈剂量依赖性，添加浓度越高，降解蛋白占比越少(参见图2)。

C1蛋白酶抑制剂的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)如下：

>NP_000053.2血浆蛋白酶C1抑制剂前体[现代人(Homo sapiens)]

MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA

实施例4：非还原SDS-PAGE检测

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基，加入C1蛋白酶抑制剂至培养基，分别为8μg/mL、16μg/mL，37℃，8％CO₂条件下培养3天后，降温至30℃继续培养4天。收集培养上清，Protein A层析柱进行纯化，对一系列的融合蛋白进行非还原SDS-PAGE检测。完整未降解的分子量约103Kda，主要降解蛋白的分子量约68.4Kda(参见图3)。

从图3中可看出，泳道6和泳道8均未见降解蛋白条带，而泳道9出现大量降解蛋白条带。

8μg/mL C1抑制剂添加组放瓶的活细胞密度为4.94×10⁶cells/mL，细胞活率为98.99％；16μg/mL C1抑制剂添加组放瓶的活细胞密度为9.05×10⁵cells/mL，细胞活率为93.18％。

对比例1

将CHOK1稳转细胞池分别接种至KD-CHOM(M1～M5，B1-1，B1-2，B1-3)及Cellvento200共9种培养基，37℃，8％CO₂，130rpm培养3天后，降温至30℃培养，其余条件不变，4天后收集培养上清，ProteinA纯化经DTT还原后，进行质谱检测。理论上，完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明大部分产物发生降解，说明更换培养基对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图4和图5)。

对比例2

SIMGA-P1860蛋白酶抑制剂为多种蛋白酶抑制剂混合物，组成成分为抑肽酶Aprotinin、抑氨肽酶Bestatin、E-64、亮肽素Leupeptin、胃蛋白酶抑制剂A，可抑制细胞释放到培养基中的氨肽酶(如亮氨酸氨基肽酶、氨基肽酶B和三氨基肽酶)、丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶原、尿激酶、激肽释放酶、人白细胞弹性蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶(如钙蛋白酶，木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L)、天冬氨酸蛋白酶。

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200(原工艺配方)，37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养3天，第3天实验组加入蛋白酶抑制剂，添加终浓度分别为抑制剂稀释200倍、400倍、800倍。第5天收集培养上清，ProteinA纯化后样品进行质谱检测。因样品未经DTT还原，理论上，完整未降解的分子量约103Kda，主要降解蛋白的分子量约68.4Kda。

结果表明大部分产物发生降解，表明添加广谱蛋白酶抑制剂对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图6)。

对比例3

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200，同时添加终浓度0.1mM、0.5mM、1mM的PMSF。37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养培养3天，降温至30℃继续培养至4天。收集上清经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。理论上完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明大部分产物发生降解，表明添加PMSF对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图7)。

对比例4

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200，同时添加终浓度1μM、5μM、10μM的EGTA。37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养培养3天，降温至30℃继续培养至4天。收集上清经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。理论上完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明大部分产物发生降解，表明添加EGTA对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图8)。

对比例5

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200，同时添加终浓度50μM、100μM的Chymostatin。37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养培养3天，降温至30℃继续培养至4天。收集上清经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。理论上完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明大部分产物发生降解，表明添加Chymostatin对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图9)。

对比例6

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200，同时添加终浓度5μM、10μM的Ebelactone B。37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养培养3天，降温至30℃继续培养至4天。收集上清经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。理论上完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

结果表明大部分产物发生降解，表明添加Ebelactone B对改善FGF21融合蛋白的降解无明显作用(参见图10)。

对比例7

将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基，加入HSA至培养基，HSA添加量为1％、0.3％、0.5％、0.1％，37℃，130rpm，8％CO₂条件下培养4天，转移至30℃继续培养2天后收集培养上清，经ProteinA纯化及DTT还原后，进行质谱检测。理论上完整未降解的分子量约51.5Kda，主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。

添加HSA组，大部分目的产物发生降解(参见图11)。

由以上对比例1-7的结果可知，在不同的培养基以及各种浓度的不同蛋白酶抑制剂的作用下，FGF21均出现大部分降解。与之相比，结合图2和图3，由本发明的实施例3和4的检测结果可知，本发明的C1蛋白酶抑制剂能够明显抑制FGF21融合蛋白的降解。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司

<120> FGF21融合蛋白及抑制其降解的方法

<130> RYP1910528.8

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcggtttt tcttcgtgtt cctggccatc gtgctgtttc agggcatcca cgga 54

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Arg Phe Phe Phe Val Phe Leu Ala Ile Val Leu Phe Gln Gly Ile

1 5 10 15

His Gly

<210> 3

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cacggagaag gaacctttac ctccgacgtg tcttcttacc tggaggaaca ggcagctaag 60

gagtttatcg cttggctggt gaaaggagga gga 93

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaggaggag gatccggagg aggaggatcc ggaggaggag gatcc 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaatctaagt acggacctcc ttgtcctcct tgtccagctc cagaagcagc aggaggacct 60

tcagtgtttc tgtttcctcc taagcctaag gataccctga tgatctccag aacaccagaa 120

gtgacttgcg tggtggtgga cgtgtctcag gaagatccag aagtgcagtt caattggtac 180

gtggacggag tggaagtgca taacgctaag accaagccta gagaggagca gttcaactcc 240

acctatagag tggtgtccgt gctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cggaaaggag 300

tacaagtgca aggtgtccaa caagggactg ccttcttcca tcgagaagac aatctccaag 360

gctaagggac agcctagaga acctcaggtg tatacactgc ctccttctca ggaagagatg 420

accaagaacc aggtgtctct gacttgtctg gtgaagggct tctatccttc tgatatcgcc 480

gtcgagtggg aatctaacgg acagccagag aacaactaca agaccacacc tccagtgctg 540

gattcagacg gatccttctt cctgtactcc aagctgaccg tggacaaatc taggtggcag 600

gaaggaaacg tgttctcttg ttccgtgatg cacgaagctc tgcataacca ctacacccag 660

aagtctctgt ctctgtctct ggga 684

<210> 8

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 9

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catcctattc cagattcttc tcctctgctg cagtttggag gtcaggtgag acagagatac 60

ctgtacacag atgacgctca gcagacagaa gctcatctgg aaatcagaga agacggaaca 120

gtgggaggag cagcagatca gtctccagaa tctctgctgc agctgaaagc tctgaagcca 180

ggagtgattc agatcctggg agtgaagacc tccagatttc tgtgtcagag accagacgga 240

gctctgtacg gatctctgca ttttgaccca gaggcttgtt ccttcagaga aagactgctg 300

gaagacggat acaacgtgta tcagagcgaa gctcacggac tgcctctgca tctgccagga 360

aataagtctc ctcatagaga tccagctcct agaggaccag ctagatttct gcctctgcca 420

ggactgcctc cagctctgcc agaacctcca ggcatcctgg ctcctcagcc tccagacgtg 480

ggatcttcag atcctctgca tatggtggga gcttctcagg gactgtctcc ttcttacgct 540

tct 543

<210> 10

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 11

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ala Ser Ser Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln

20 25 30

Asp Pro Glu Ser Leu Gln Asp Arg Gly Glu Gly Lys Val Ala Thr Thr

35 40 45

Val Ile Ser Lys Met Leu Phe Val Glu Pro Ile Leu Glu Val Ser Ser

50 55 60

Leu Pro Thr Thr Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ala Thr Lys Ile Thr Ala

65 70 75 80

Asn Thr Thr Asp Glu Pro Thr Thr Gln Pro Thr Thr Glu Pro Thr Thr

85 90 95

Gln Pro Thr Ile Gln Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gln Leu Pro Thr Asp

100 105 110

Ser Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr

115 120 125

Leu Cys Ser Asp Leu Glu Ser His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp

130 135 140

Ala Leu Val Asp Phe Ser Leu Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met

145 150 155 160

Lys Lys Val Glu Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser

165 170 175

Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn

180 185 190

Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln

195 200 205

Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile

210 215 220

Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser

225 230 235 240

Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp

245 250 255

Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn

260 265 270

Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val

275 280 285

Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp

290 295 300

Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile

305 310 315 320

Lys Val Pro Met Met Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile

325 330 335

Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn

340 345 350

Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu

355 360 365

Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu

370 375 380

Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg

385 390 395 400

Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu

405 410 415

Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu

420 425 430

Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu

435 440 445

Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val

450 455 460

Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val

465 470 475 480

Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr

485 490 495

Asp Pro Arg Ala

500

Claims

1.FGF21融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：(1)：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的连接肽、SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括：(1)：编码胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、编码连接肽的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、编码人IgG4变体抗体的Fc部分的SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体的SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包含权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统为宿主细胞，优选CHO宿主细胞。

6.用于培养权利要求4或5所述的表达系统的培养基，其特征在于，所述培养基中包含C1蛋白酶抑制剂；优选地，所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基中C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16μg/mL，优选为2-8μg/mL。

8.抑制FGF21融合蛋白降解的方法，其特征在于，在培养所述FGF21融合蛋白的培养基中添加C1蛋白酶抑制剂；优选地，所述FGF21融合蛋白具有Arg与Tyr之间的肽键；更优选地，所述FGF21融合蛋白具有从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间的肽键。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，培养基中所述C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16μg/mL，优选为2-8μg/mL。