JP2013542186A - セルピンフィンガー融合ポリペプチド - Google Patents
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- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
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-
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Abstract
Description
セリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)は、多数の生理学的経路、例えば、炎症、凝固、線維素溶解、アポトーシス、および細胞外マトリクスリモデリングを制御する。セルピンの反応性ループは、セリンプロテアーゼにより切断され、セリンプロテアーゼは、触媒部位の破壊を介して不活性化される。
‐セルピンフィンガーポリペプチド、および
‐さらなるポリペプチド
を含み、該さらなるポリペプチドが、阻害、活性化、結合、または標識などの生物学的活性を発揮する任意のポリペプチドであり得る、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。
‐ペプチド性リンカーポリペプチド、
‐プロテアーゼ切断部位、
‐タグ
をさらに含む。
本明細書において、
‐セルピンフィンガーポリペプチド、および
‐さらなるポリペプチド
を含み、該さらなるポリペプチドが、阻害、活性化、結合、または標識などの生物学的活性を発揮する任意のポリペプチドであり得る、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。
より選択される。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、
である。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドは、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビン由来である。
などの、5個までのアミノ酸残基の小さな反復単位において配置される。反復単位は、多量体単位を形成するように2〜5回反復されてもよい。多量体単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基が付加されてもよい。他の合成ペプチド性リンカーポリペプチドは、例えば、リンカー
におけるセリンのように、10〜20回反復される単一のアミノ酸残基から構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基を含んでもよい。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドは、抗体ヒンジ領域、
より選択される。すべてのペプチド性リンカーポリペプチドは、核酸分子によりコードされ得、かつ従って、組み換えで発現させることができる。ペプチド性リンカーポリペプチドは、それ自体ポリペプチドであるため、セルピンフィンガーポリペプチドは、2個のアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してペプチド性リンカーポリペプチドに連結される。
であり、N末端および/またはC末端のリンカーを有するかまたは有さないかのいずれかであり、該リンカーは、独立してかつ個々に、S、またはG、またはSGより選択される。
組み換えDNA技術
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているような標準的な方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学用試薬を、製造業者の指示に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により調製した。所望の遺伝子セグメントを、遺伝子合成により調製した。合成した遺伝子断片を、特定の発現ベクター中にクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列を、DNA塩基配列決定法により確認した。
結合体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280 nmでの光学密度(OD)を測定することにより決定した。
発現プラスミドの作製
融合ポリペプチドFP-1、FP-2、およびFP-3を、組み換え手段により調製した。それらを、大腸菌における高レベル発現のための担体タンパク質としてコアストレプトアビジンを用い、大腸菌においてより大きな融合タンパク質として発現させた。トリプシン(FP-1およびFP-2)またはエンドプロテイナーゼLysC(FP-3)のいずれかを用いたインビトロの酵素的切断により、所望のポリペプチドを放出させた。
ポリペプチドFP-1(SEQ ID NO: 76=GR+SEQ ID NO: 05+SEQ ID NO: 52+SEQ ID NO: 37)、FP-2(SEQ ID NO: 77=GR+SEQ ID NO: 82+SEQ ID NO: 75+SEQ ID NO: 13)、およびFP-3(SEQ ID NO: 78=GR+SEQ ID NO: 83+SEQ ID NO: 50+SEQ ID NO: 40)を、それぞれ独自のトリプシンまたはLysCエンドプロテイナーゼ切断部位を含有するGRまたはGKプロテアーゼリンカーを介して、コアストレプトアビジン配列(SEQ ID NO: 81)に融合させた。
プラスミド4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)は、大腸菌におけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-リピート;EP-B 1 422 237において報告されている)由来の3142塩基対の長さのEcoRI/CelII断片の、435塩基対の長さのコアストレプトアビジンをコードするEcoRI/CelII断片とのライゲーションにより生成した。
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322由来の複製開始点(Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90による2517-3160位の塩基対に対応する)、
‐大腸菌pyrF変異体株の相補によるプラスミド選択を可能にする(ウラシル栄養要求性)、オロチジン5'-ホスファートデカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のURA3遺伝子(Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)、
‐以下で作られているコアストレプトアビジン発現カセット
‐Stueber, D.ら(下記参照)による合成リボゾーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーター(Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)、
‐コアストレプトアビジン遺伝子、および
‐2種のバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414)およびfdターミネーター(Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58)、ならびに
‐大腸菌由来のlacI抑制遺伝子(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。
a)プラスミド4981
プラスミド4981(4981-SAC-セルピン1-T1249)は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-1タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheI/CelII-F1遺伝子セグメント(F1ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 84)
の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。
プラスミド4982(4982-SAC-セルピン2-T651)は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-2タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の181塩基対の長さのNheI/CelII-F2遺伝子セグメント(F2ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 85)
の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。
プラスミド4983(4983-SAC-セルピン3-T2635)は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-3タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheI/CelII-F3遺伝子セグメント(F3ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 86)
の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。
大腸菌におけるコアストレプトアビジン融合タンパク質の発現
コアストレプトアビジン融合タンパク質4981、4982、および4983の発現のために、大腸菌栄養要求性(PyrF)の相補により抗生物質フリーのプラスミド選択を可能にする大腸菌宿主/ベクター系を使用した(例えば、EP-B 0 972 838および米国特許第6,291,245号参照)。
大腸菌K12株CSPZ-2(leuB, proC, trpE, thi-1, ΔpyrF)を、前の段階において得られた発現プラスミド(それぞれ4981、4982、および4983)で形質転換させた。形質転換したCSPZ-2細胞を、最初に37℃で寒天プレート上で増殖させ、その後、0.5%カザミノ酸(Difco)を含有するM9最小培地中で振盪培養において0.6〜0.9の550 nmでの光学密度(OD550)まで増殖させ、続いて、IPTG(1〜5 mmol/lの最終濃度)で誘導した。
発現解析のために、3 OD550nm単位(1 OD550nm=1の550 nmでのODを有する1 mlの細胞懸濁液)の遠心分離した培養培地由来の細胞沈殿物を、0.25 mlの10 mmol/lリン酸カリウム緩衝液、pH 6.5に再懸濁し、超音波処理(50%強度での30秒の2パルス)により細胞を溶解した。不溶性の細胞成分を沈降させ(遠心分離、14,000 rpm、5分)、上清を1/5の容積の5×SDS試料緩衝液と混合した(1×SDS試料緩衝液:50 mmol/lトリス-HCl、pH6.8、1% SDS、50 mmol/l DTT、10%グリセロール、0.001%ブロモフェノールブルー)。不溶性の細胞破片分画(沈殿物)を、0.3 mlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁し、試料を5分間、95℃でインキュベーションして、再び遠心分離した。続いて、タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685)により分離し、クマシーブリリアントブルーR色素で染色した。
コアストレプトアビジン融合タンパク質の組み換え生産のための大腸菌の10 lの高細胞密度発酵
前培養:
前培養物を調製するために、1000 mlエルレンマイヤーフラスコにおいて、300 mlのM9プラス培地(0.5%カザミノ酸、ならびに各々0.9 g/lのTrp、Pro、およびLeuを追加したM9培地)に、それぞれプラスミド4981、4982、および4983で形質転換した大腸菌CSPZ-2の1 mlのグリセロールストックを接種した。3.0のOD578nmに達するまで、約6時間、37℃で、150 rpmの傍心振盪機上で培養物をインキュベーションした。
発酵の初めに、前培養物を10リットルの発酵槽中に移した。主培養を、グルコースの代わりに1.4%グリセロール、2%カザミノ酸、ならびに各々0.1%のアミノ酸Trp、Leu、およびProを含有する、規定されたM9塩培地において、20のOD578nmまで増殖させた。続いて、培養へのグリセロール酵母用量(ストック溶液:30%酵母エキスおよび33%グリセロール)の供給を開始し、その流速を、培養物のpH値の動向に応じて0.8〜3.5 ml/分の間で変動させ、それにより補正液(H3PO4、KOH)のいかなるさらなる添加も回避した。pHは、pH 7.0に維持し、撹拌機速度を制御することにより、pO2値を50%に保持した。70のOD578nmで、1.5 mmol/l IPTGを添加した。160〜180のOD578nmで、発酵を終了した。
発酵槽の内容物を、フロースルー遠心分離(13,000 rpm、13 l/h)で遠心分離し、収集した生物体量を、さらなる加工処理まで-20℃で保存した。
細胞溶解およびIBの調製
200 g大腸菌細胞(湿重量)を1リットルの0.1 mol/lトリス-HCl、pH7.0に0℃で懸濁し、300 mgリゾチームを添加して、20分間、0℃でインキュベーションした。続いて、高圧分散により機械的に、細胞を完全に溶解し、2 mlの1 mol/l MgCl2および10 mg DNAseを添加することにより、30分間、25℃で、DNAを消化した。その後、500 mlの60 mmol/l EDTA、6%Triton X-100、および1.5 mol/l NaCl、pH 7.0を溶解溶液と混合し、さらに30分間、0℃でインキュベーションした。続いて、不溶性成分(細胞破片およびIB)を、遠心分離により沈降させた。沈殿物を、1リットルの0.1 mol/lトリス-HCl、20 mmol/l EDTA、pH 6.5に懸濁し、30分間、25℃でインキュベーションして、遠心分離により、IB調製物を単離した。
F1、F2、およびF3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質の可溶化、酵素による放出、ならびにF1、F2、およびF3ポリペプチドの精製
前実施例において得られた封入体を、2回、各々100mMリン酸カリウム緩衝液、pH 6.5、500 mM塩化ナトリウム、20 mM EDTA、および再蒸留水で、洗浄した。10 mlの30 mM水酸化カリウム溶液の添加により、1グラム(湿重量)の沈殿した封入体を溶解させた。30分の撹拌後、1 Mホウ酸の添加により、pH値をpH 8.9に変化させた。可溶化およびpH調整の後、F1およびF2を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、トリプシン(1:25000 w/w)で酵素的に消化し、他方、F3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、LysC(1:20000 w/w;10μlの10μM LysC溶液)で酵素的に消化した。溶液を、15℃で一晩インキュベーションした。10倍モル過剰のアプロチニンの添加により、トリプシン消化を停止させた。rec SerETIアフィニティークロマトグラフィーにより、残留プロテアーゼを精製して除去した。F3のLysC消化は、rec SerETIアフィニティークロマトグラフィーのみにより停止させた。
融合ポリペプチドおよびα1-アンチトリプシンのタンパク質複合体の形成
PBS(リン酸緩衝生理食塩水、1 mM KH2PO4、10 mM Na2HPO4、105 mM NaCl、2.7 mM KCl)中の25μMα1-アンチトリプシンを、37℃で、4〜5倍過剰の融合ポリペプチド(例えば、125μM)と共に24時間インキュベーションした。より長いインキュベーション時間を用いても、タンパク質複合体のさらなる形成はもたらされなかった。インキュベーション後、サイズ排除濾過により、タンパク質複合体を、複合体形成していないセルピンフィンガーポリペプチドから分離した。ほぼ同一の分子量の分子を含む分画を、混ぜ合わせた。混ぜ合わせた分画を濃縮し、試料をSDS-PAGEゲルにアプライした。SDS-PAGEゲル上の個々のバンドを、1D-Image-Master(Amersham Bioscience)を用いて分析し、タンパク質複合体の分画を定量化して、分子量の差を測定した。混ぜ合わせて濃縮した分画の活性を、BIAcoreにより測定した(図3参照)。反応混合物において、二量体α1-アンチトリプシン(125 kDa、約14%)、タンパク質複合体(60 kDa、約15%)、および単量体α1-アンチトリプシン(55 kDa)が検出された。
BIAcore解析
すべての表面プラズモン共鳴測定を、BIAcore 3000機器(GE Healthcare Biosciences AB, Sweden)上で、25℃で行った。化学的に調製したHIV HR1ペプチド
を、製造業者の指示(GE Healthcare Biosciences AB, Sweden)に従って、CM5バイオセンサーチップ上に固定化した。融合ポリペプチドを25 nMの濃度に希釈し、50μl/分の流速で5分にわたって注入した。その後、様々な混ぜ合わせた分画から得られたタンパク質複合体を、250 nMおよび80 nMの濃度になるよう同一緩衝液中に希釈し、50μl/分の流速で5分にわたって注入した。後に、センサーチップを、1分間、PBS、pH 8.0、0.005%(v/v)Tween 20で再生させた。データ解析を、BIAevaluationソフトウェア(BIAcore, Sweden)で行った(図4参照)。
[本発明1001]
セルピンフィンガーポリペプチドおよび生物学的活性ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
[本発明1002]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位のアミノ酸残基がグルタミン酸であることを特徴とする、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1003]
セルピンフィンガーポリペプチドが、8〜14個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を有することを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1004]
生物学的活性ポリペプチドが、HIV融合インヒビターポリペプチドであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1005]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、TEAAGAMFLEAIVM(SEQ ID NO: 03)、TEAAGAMFFEAIPM(SEQ ID NO: 05)、SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO: 07)、TEAAGATAVVIA(SEQ ID NO: 08)、またはSEAAASMFLEAI(SEQ ID NO: 11)より選択されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1006]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、SEAAASTAVVIA(SEQ ID NO: 07)、またはSEAAASMFLEAI(SEQ ID NO: 11)であることを特徴とする、本発明1005の融合ポリペプチド。
[本発明1007]
セルピンフィンガーポリペプチドと生物学的活性ポリペプチドとの間に、GGSGG(SEQ ID NO: 12)のアミノ酸配列を有するペプチド性リンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1008]
HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列が、MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO: 13)であることを特徴とする、本発明1004〜1007のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1009]
本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチドとセルピンとのタンパク質複合体。
[本発明1010]
セルピンがα1-アンチトリプシンおよびアンチトロンビンより選択されることを特徴とする、本発明1009のタンパク質複合体。
[本発明1011]
薬剤としての使用のための、本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1012]
ウイルス感染症の処置における使用のための、本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1013]
HIV感染症の処置における使用のための、本発明1004〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1014]
本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビンの使用。
[本発明1015]
‐本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体、および
‐α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビン
を含む、キット。
Claims (15)
- セルピンフィンガーポリペプチドおよび生物学的活性ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
- セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位のアミノ酸残基がグルタミン酸であることを特徴とする、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- セルピンフィンガーポリペプチドが、8〜14個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 生物学的活性ポリペプチドが、HIV融合インヒビターポリペプチドであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- セルピンフィンガーポリペプチドと生物学的活性ポリペプチドとの間に、GGSGG(SEQ ID NO: 12)のアミノ酸配列を有するペプチド性リンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとセルピンとのタンパク質複合体。
- セルピンがα1-アンチトリプシンおよびアンチトロンビンより選択されることを特徴とする、請求項9記載のタンパク質複合体。
- 薬剤としての使用のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。
- ウイルス感染症の処置における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。
- HIV感染症の処置における使用のための、請求項4〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビンの使用。
- ‐請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体、および
‐α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビン
を含む、キット。
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