JP2001519647A - 標的細胞中へのウイルスおよび粒子の取り込みおよびインターナリゼーションのためのレセプター特異的キメラウイルス表面ポリペプチド - Google Patents
標的細胞中へのウイルスおよび粒子の取り込みおよびインターナリゼーションのためのレセプター特異的キメラウイルス表面ポリペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
ウイルスおよび非ウイルス粒子は、ウイルス表面ポリペプチドの一部およびLDLレセプターファミリーのレセプターに特異的なリガンドの一部を含むように構築されたキメラウイルス表面ポリペプチドによって取り込まれ得る。キメラによって取り込まれた粒子は、キメラが設計されたレセプターの型に特異的な細胞を標的し得、そしてこれらの細胞中にインターナライズされ得る。本発明の例示的なモデルは、uPAに結合されたuPARを発現する細胞を標的化し、そしてLRP細胞表面レセプターとの接触の際にインターナライズ可能な複合体を形成するために、SERPIN（例えば、PAI-1）のリガンド部分を用いて構築されたキメラを含む。従って、粒子が標的細胞中にインターナライズされる場合、それは、ウイルスまたは非ウイルス粒子に含まれる、発現のためのポリペプチドをコードする任意のゲノムまたはポリヌクレオチドである。従って、細胞特異的遺伝子治療プロトコルは、本発明によって達成される。
Description
【発明の詳細な説明】
標的細胞中へのウイルスおよび粒子の取り込みおよびインターナリゼーション
のためのレセプター特異的キメラウイルス表面ポリペプチド
発明の分野
本発明は、標的細胞への遺伝子、タンパク質、リボザイム、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド、低分子、および他の治療剤の送達方法に関する。特に、本発明
は、種々の分子および細胞応答を開始、アテニュエート、または阻害するために
、細胞における発現のためのコード配列、タンパク質、リボザイム、アンチセン
スオリゴヌクレオチド、低分子、および他の治療剤を含む細胞の内容物を含むウ
イルスまたは粒子の標的細胞中へのインターナリゼーションの方法に関する。本
発明はまた、ウイルスまたは粒子への組み込みのためのキメラウイルス表面ポリ
ペプチド、および標的細胞中へ改変された粒子およびその分子の内容物をインタ
ーナライズするためのレセプター特異的リガンドのリガンド部分の添加によって
改変された粒子に関する。キメラウイルス表面ポリペプチド、キメラをコードす
るポリヌクレオチド配列、キメラを組み込んだウイルスまたは粒子、標的細胞よ
ってインターナライズされたウイルスまたは粒子、それらの表面にインターナラ
イズし得るリガンド部分を有する改変された粒子、および細胞特異的様式におい
て標的細胞にウイルスまたは粒子を標的するために本発明の方法を用いる疾患の
処置方法が、本明細書中で請求される。
発明の背景
遺伝子治療の出現は、動物における非発現遺伝子の発現の見込み（promise）
をもたらしてきた。遺伝子治療は、コード領域のウイルスまたは非ウイルス送達
によって達成され得る。異種遺伝子のウイルス送達は、Connellyら、Human Gene
Therapy 6:185-193(1995)に記載のアデノウイルスベクター、Kaplittら、Natur
e Genetics 8:148-211(1994)に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、およびKimu
raら、Human Gene Therapy 5:845-852(1994)に記載のレトロウイルス送達
を用いていくつかの成功をもって達成されてきた。他のレトロウイルスベクター
、ならびに組換えレトロウイルスはまた、PCT出願PCT/US 89/01139およびPCT/US
90/04652に記載されている。組織特異的ウイルス送達はまた、レトロウイルス
ベクターおよびKasaharaら、Science 266:1373-1376(1994)およびY.W.KanのPCT
出願93/25234に記載のポリペプチドホルモンエリトロポエチンおよびウイルス中
で操作したエクトトロピック（ectotropic）モロニーマウス白血病ウイルスのen
vタンパク質の一部を含むキメラタンパク質を用いて、いくつかの成功をもって
達成されてきた。
非ウイルス送達は、Zhuら、Science 261:209-211(1993)に記載の異種タンパク
質のコード配列を含む裸のDNAプラスミドの注入によって達成されてきた。非ウ
イルス送達はまた、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクター
にコード配列を挿入し、次いで、この構築物を、細胞標的リガンド（例えば、Wu
およびWu、J．Biol．Chem．(1987)262:4429-4432に記載のアシアロオロソムコイ
ド（asialoorosomucoid）；Huckedら、Biochem．Pharmacol．40:253-263(1990)
に記載のインシュリン；Plankら、Bioconjugate Chem．3:533-539(1992)に記載
のガラクトース；Midouxら、Nucleic Acids Res．21:871-878（1993）に記載の
ラクトース；またはWagnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3410-3414(1990
)に記載のトランスフェリン）に結合させた合成遺伝子移入分子（例えば、重合D
NA結合カチオン様ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）とともにインキ
ュベートすることによって達成されてきた。
他の送達系は、Nabelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:11307-11311(1993)
、およびPhilipら、Mol．Cell Biol．14:2411-2418(1994)に記載のような種々の
組織特異的または遍在的に活性なプロモーターの制御下で、遺伝子を含むDNAを
カプセル化するためのリポソームの使用を包含する。リポソームはまた、タンパ
タ質および非タンパク質治療剤を含む他の治療剤の送達に適切である。使用のた
めに適切なさらなる非ウイルス送達は、Woffendinら、Proc．Natl．Acad．Sci．
USA（1994）91(24):11581-11585に記載の機械的送達系（例えば、成体分解アプ
ローチ）を包含する。さらに、このようなおよび他の治療剤のコード配列および
発現産物（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、光重合ヒドロゲル
物質の沈着（deposition）を介して送達され得る。コード配列の送達のために使
用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、米国特許第5,149,65
5号に記載のような小型（hand held）遺伝子移入パーティクルガンの使用；米国
特許第5,206,152号およびPCT出願WO 92/11033に記載のような移入遺伝子を活性
化するための電離放射線の使用を包含する。
ウイルスおよび非ウイルス送達の両方の当該分野において現在存在する限定は
、ウイルスまたは他の粒子の維持された高レベルの組織特異的取り込みを達成す
る限定された成功を包含する。コード配列の発現が１つの細胞型において所望さ
れるが、ウイルスが多くの細胞型に感染する場合、または一般に送達系において
、特定の細胞集団が送達された治療薬をインターナライズし、そして使用するこ
とが所望されるが、その代わりとして治療薬が非特異的な様式で細胞中にインタ
ーナライズされて、標的細胞集団への治療用量は減少する場合、非特異的ウイル
スおよび粒子インターナリゼーションが有する問題が、遺伝子治療において生じ
る。
従って、標的細胞におけるウイルスまたは他の粒子のインターナリゼーション
の特異性を増大させる方法を考案することが所望される。
発明の要旨
標的細胞へのインターナリゼーションのための分子の内容物を含むウイルスま
たは粒子の送達における使用のための、リガンドとウイルス表面タンパク質との
キメラをコードするキメラポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的であ
る。上記のキメラは、LDLレセプターファミリー由来のレセプターのリガンドの
全部または一部をコードするポリヌクレオチド配列、およびウイルス表面タンパ
ク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む。キメラポリヌ
クレオチドの発現産物は、ウイルスまたは粒子の取り込みのための取り込み凝集
を形成し得、そしてレセプターを発現する標的細胞へのキメラウイルス表面ポリ
ペプチドによって取り込まれるウイルスまたは粒子のインターナリゼーションの
ためのレセプターと結合対を形成し得るキメラウイルス表面ポリペプチドを形成
し得る。ここで、ウイルスまたは粒子は標的細胞への送達のための分子の内容物
を含む。
ウイルスまたは粒子の内容物の送達のためのウイルスまたは粒子のインターナ
リゼーションのための細胞の標的化のために、ウイルスまたは粒子の取り込みの
ためのキメラポリペプチドを提供することが、本発明のさらなるの目的である。
上記の内容物は、LDLレセプターファミリー由来のレセプターのリガンドの全部
または一部を含むポリペプチド配列を含み、そしてまたウイルス表面タンパク質
の全部または一部を含むさらなるポリペプチド配列を含み、その結果、ウイルス
または粒子の取り込みのためのこれらのキメラポリペプチドの取り込み凝集体を
作製し得て、レセプターを発現する細胞を標的化するための取り込みウイルスま
たは取り込み粒子を形成する。リガンドが、取り込みウイルスまたは取り込み粒
子のインターナリゼーションのためのレセプターと結合対を形成するとき、レセ
プターを発現する細胞の標的化が生じる。ウイルスまたは粒子は、標的細胞への
送達のための分子の内容物（標的細胞中での発現のための遺伝子、および標的細
胞への送達のための全ての種類の治療薬を含むが、これらに限定されない）を含
有し得る。
ウイルスまたは粒子を標的化およびインターナライズする方法を提供すること
が、本発明の別の目的である。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）LDLレ
セプターファミリー由来のレセプターのリガンドの全部または一部を含むポリペ
プチド配列を含み、そしてウイルス表面タンパク質の全部または一部を含むさら
なるポリペプチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするキメラポリヌク
レオチドを構築する工程、（ｂ）キメラポリヌクレオチドを発現させてキメラウ
イルス表面ポリペプチドを形成させる工程、（ｃ）キメラウイルス表面ポリペプ
チドを、取り込みウイルスまたは取り込み粒子を形成するための分子の内容物を
含有するウイルスまたは粒子の表面に取り込む工程、（ｄ）取り込みウイルスま
たは取り込み粒子のレセプターを発現する標的細胞との接触を生じる工程、（ｅ
）ウイルスまたは粒子を、リガンドとレセプターとの結合によって標的細胞中に
インターナライズさせる工程。
粒子中に含まれる分子の内容物のインターナリゼーションのための、標的細胞
への送達のために設計された改変された粒子を提供することが本発明のさらなる
目的である。上記の改変された粒子は、LDLレセプターファミリー由来のレセプ
ターのリガンドの全部または一部から作製されたポリペプチド部分である分子の
内容物を含む粒子を含み、これは粒子とリガンド部分が連結して、粒子の分子の
内容物の標的細胞への送達のための改変された粒子を形成する様式において設計
される。
本発明のさらなる目的は、SERPIN（セリンプロテアーセインヒビター）（特に
、PAI-1）を含む（TFPIもまた含む）本発明のキメラウイルス表面ポリペプチド
のリガンド部分を提供することである。
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかと
なる。しかし本発明の好ましい実施態様が示される一方で、この詳細な説明は例
示のみのために与えられる。なぜなら、本発明の精神および範囲内での種々の変
更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。本発明
は、本発明の要素の作用のいずれの理論にもまた限定されない。
発明の詳細な説明
本発明は、ウイルス表面タンパク質、細胞表面レセプター、およびこれらのレ
セプターのリガンドのインターナリゼーション機構を用いる、遺伝子または他の
治療薬の送達方法を表す。
過去の遺伝子送達のためのキメラポリペプチドを含む代表的な場合において、
リガンドはウイルスまたは他の遺伝子送達粒子で発現され、そしてこのリガンド
はレセプターを発現する細胞に結合しそしてこれによりインターナライズされる
。この事象の特異性は、標的細胞を含む種々の細胞型上のレセプターの量および
分布に依存する。この場合、レセプターがすでにそれに結合したリガンドを有す
る場合、例えば、エリスロポイエチンがEPOレセプターに結合している場合、遺
伝子送達粒子はその細胞に結合し得ない(PCT出願93/25234に記載)。
本発明は、LDLレセプターファミリーのレセプターに特異的なリガンドまたは
リガンドの一部を含むキメラウイルス表面タンパク質を表す。これらのリガンド
の使用により、レセプターがリガンドに結合してそれにより他のリガンドの結合
ができなくなる、特異性の低下の傷害が克服される。本発明において、遺伝子送
達粒子はリガンドで修飾され、これは他のリガンド：レセプター複合体を認識す
る。特に、例えば、PAI-1リガンドを発現している遺伝子送達粒子は、uPARレセ
プターに結合した活性な２本鎖のuPAを認識しそしてこれに共有結合する。
本発明の実施例によれば、例えば細胞表面プラスミノーゲン活性化に積極的に
関与し、そしてuPAに結合した活性なレセプターを提示する細胞のみが、遺伝子
送達粒子によって標的化される。粒子：uPA：uPAR複合体の形成後、粒子表面で
のuPAに結合されたuPARへのPAI-1の結合により媒介され、粒子の効率的なインタ
ーナリゼーションがLRPまたは関連するスカベンジャーレセプターへの輸送を介
して起こる。本発明の方法により、標的細胞に対する特異性の増強が達成される
。
本発明は、LDLレセプターファミリーの全てのリガンドを包含する。従って、L
DLレセプターファミリーのレセプターを発現する細胞型に基づいて、そしてまた
LDLレセプターファミリーのリガンドに結合する他のリガンドに結合する他のレ
セプターを発現する細胞タイプに基づいて、標的細胞インターナリゼーションの
特異性が達成され得る。そして、後者は、１つ以上のポリペプチドのリガンド複
合体として、そしてなお細胞に送達されるべきもとの粒子に連結しており、これ
は、LDLレセプターファミリーのレセプターに結合し、そしてインターナライズ
される。
本明細書中に記載される本発明は、以前に刊行された著作、および係属特許出
願を利用する。例として、このような著作は、科学的文献、特許出願または係属
特許出願からなる。本明細書中で援用する全ての著作(特許および特許出願を含
む)は、参考として援用される。
本発明は、以下の本明細書中で援用する定義に照らしてよりよく理解され得る
。定義
本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド」または「コード配列」は、特定の
アミノ酸をコードするRNAまたはDNAのいずれか、あるいはその相補鎖をいう。ポ
リヌクレオチドはまた、ポリペプチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドまたはリボザイム)をコードし得ない。DNAまたはRNAは、１本鎖または２本鎖
であり得る。
本明細書中で使用する用語「キメラポリヌクレオチド」は、１つ以上のタンパ
ク質のコード配列の一部を含むポリヌクレオチド配列をいう。ここで、タンパク
質は、天然には、同じ核酸分子と互いに近接してコードされない。キメラポリペ
プチドを形成するためには、２つ以上のタンパク質のコード配列が組換えDNA技
術の分野で通常行われている技術により単離されそして連結される。キメラポリ
ヌクレオチド分子は、適切な宿主細胞中またはインビボでのキメラの発現のため
に１つ以上の調節配列を含む。調節配列は、コード配列の１つに天然に付随し得
るか、または１つ以上のコード配列に対して異種であり得る。各コード配列は、
それ自身の調節配列を有し得る。キメラポリヌクレオチド発現産物は、２つの天
然に存在しない関連するポリペプチドの部分のキメラである。
本明細書中で使用する用語「リガンドおよびウイルス表面タンパク質のキメラ
」は、リガンドの一部およびウイルス表面タンパク質の一部をコードするキメラ
ポリヌクレオチドの発現産物でをいう。キメラは、リガンド部分が天然の環境で
リガンドが結合するレセプターに結合し得るように、キメラウイルス表面タンパ
ク質がウイルス表面に取り込まれてキメラウイルスエンベロープを形成し得るよ
うに、そしてキメラウイルス表面が天然の環境と同じ量のウイルスゲノムを取り
囲み得るように、構築される。従って、キメラは、２機能性ポリペプチドまたは
多機能性ポリペプチドであり、少なくともこれを含むリガンドの機能およびウイ
ルス表面タンパク質の機能を保持している。
本明細書中で使用する用語「取り込み凝集」は、ウイルスまたは粒子が表面タ
ンパク質に囲まれるかまたはカプセル化されて表面タンパク質に囲まれるかまた
は取り込まれる小胞を形成する現象をいう。用語「取り込み凝集」は、ウイルス
または粒子を小胞に取り込むように機能する表面タンパク質またはキメラ表面ポ
リペプチドのプールを記載する。従って、小胞は、それが取り込まれる表面タン
パク質の質によって部分的に定義される。小胞は、ウイルスまたは粒子であり得
、そしてそれが取り込まれる表面タンパク質の特異性に基づいて標的細胞にイン
ターナライズされ得る。
用語「調節配列」は、遺伝子配列の発現に影響し得るかまたはこれを行い得る
１つ上のエレメントをコードする核酸配列をいう。調節配列は、遺伝子配列がそ
の制御に供される位置にある場合はその転写または翻訳を含む。このような調節
配列は、例えば、最小プロモーター配列、完全なプロモーター配列、エンハンサ
ー配列、上流活性化配列(「UAS」)、オペレーター配列、下流末端配列、ポリア
デニル化配列、翻訳の開始を最適化のための最適な５'リーダー配列、およびShi
ne-Dalgano配列であり得る。あるいは、調節配列は、エンハンサー/プロモータ
ーエレメントの組合せを含み得る。目的の遺伝子の発現に適した調節配列は、構
築物が発現されるべき宿主系に依存して異なる。本明細書中での使用に適切な調
節配列の選択は、当業者の能力の範囲内である。真核生物において、例えば、こ
のような配列は、１つ以上のプロモーター配列および／または転写終結配列を含
み得る。本明細書中での使用に適した調節は配列は、原核生物供給源、真核生物
供給源、ウイルス、ウイルスベクター、バクテリオファージ、または線状または
環状プラスミドを含む任意の供給源に由来し得る。本明細書中の調節配列はまた
、合成配列(例えば、１つの遺伝子のUASを別の遺伝子(例えば、GAPDH/ADH2ハイ
ブリッドプロモーター)由来の必須プロモーターの残りと組み合わせることによ
って作製される配列)であり得る(米国特許第4,876,197号、および同第4,880,734
号に記載)。本明細書中の使用に適する調節配列は、所望の宿主細胞内での発現
のためのプロモーターとの使用に適合性である任意の調節配列であり得る。例え
ば、酵母での発現のためには、酵母系由来の調節配列が所望される。調節配列は
、本明細書中での使用のために選択されるプロモーターに天然に関連する配列で
あり得るか、または合成配列、または部分的に合成されるか部分的に誘導された
ものであり得る。本明細書中での使用に適する調節配列は、構成的に活性である
プロモーター、あるいは誘導可能または調節可能なプロモーターを含む、任意の
プロモーターであり得る。プロモーターは、天然に由来し得るかまたは合成的に
作製され得る。これらは、任意の遺伝子、ウイルス、原核生物、または真核生物
に由来し得る。真核生物遺伝子は、酵母または他の真菌、昆虫、哺乳動物または
鳥類の遺伝子であり得る。適切なプロモーターの例は、発現系に関連する部分で
以下に記載する。
本発明のエレメントに関連して本明細書中で使用される用語「タンパク質」ま
たは「ポリペプチド」または「ペプチド」は、発現されるかまたは調節される遺
伝子の産物を含む。本発明のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、異
種遺伝子のウイルス感染またはウイルス複製のために標的化される細胞上でウイ
ルスを取り囲みそして細胞表面レセプターに結合するためのキメラポリペプチド
を作る、リガンドまたはリガンドの一部であり得る。タンパク質、ポリペプチド
、またはペプチドは、ウイルス感染のために標的化される細胞上でウイルスを取
り囲みそして細胞表面レセプターに結合するためのキメラポリペプチドを作る、
ウイルス表面の一部である。本発明のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチ
ドはまた、ウイルス感染細胞での発現のために、ウイルスゲノムに存在する非ウ
イルスコード配列によって発現される非ウイルスポリペプチドであり得る。本明
細書中で使用する用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、または「ペプチド」
はまた、短縮型、改変体、対立遺伝子、および成熟タンパク質の誘導体である、
「成熟タンパク質」およびその「アナログ」、およびその「一部」を包含する。
「リガンドの一部」および「ウイルス表面タンパク質の一部」に関連する本明
細書中で使用する用語「の一部」は、生物学的に活性なリガンドまたはウイルス
表面タンパク質の全コード配列または発現産物の一部をいい、そしてこの部分は
また、リガンドまたはウイルス表面タンパク質の生物学的活性を保持している。
生物学的活性は、例えば、リガンドの場合は、リガンド結合である：そしてウイ
ルス表面タンパク質の場合は、例えば、ウイルスまたは粒子を取り囲む、エンベ
ロープ化する、またはカプセル化する能力である。ウイルス表面タンパク質の生
物学的活性はまた、ウイルスまたは粒子をカプセル化する膜にアンカーされるよ
うになる、ウイルス表面タンパク質の能力によって示される。用語タンパク質ま
たはポリペプチドのように、本明細書中で使用する用語「の一部」はまた、成熟
タンパク質およびそのアナログの一部をいう。アナログは、成熟タンパク質の短
縮型、改変体、対立遺伝子、および誘導体であり得る。他に特に述べない限りは
、「アナログ」は、「成熟タンパク質」の生物活性の１つ以上を有する。従って
、成熟タンパク質のアミノ酸配列と同一であるかまたはこれに対して少なくとも
60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、そして最も好ましくは90％のアミ
ノ酸配列の相同性を含む(ヒト由来であってもヒト由来でなくても)ポリペプチド
が、この定義に含まれる。
本明細書中で使用する用語「に由来する」は、ウイルス「のウイルス表面に由
来する」ウイルス表面タンパク質の一部の場合、本発明のキメラウイルス表面タ
ンパク質を構築するために使用されるウイルス表面タンパク質の一部が天然のウ
イルスのウイルス表面タンパク質に対して高い配列相同性を有することを示す。
本明細書中で使用する用語「改変体」は、「タンパク質の改変体」または「ポ
リペプチドの改変体」または「タンパク質またはポリペプチドの部分の改変体」
をいう。本明細書中で使用する用語「改変体」は、アミノ酸の置換、欠失、また
は挿入を含むタンパク質またはポリペプチド、あるいはタンパク質またはポリペ
プチドの一部をいう。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であり得るか、また
はグリコシル化部位、リン酸化部位、アセチル化部位を変化させるか、または機
能には必要でない一つ以上のシステイン残基の置換または欠失によるミスフォー
ルディングを最少化するためなどのように、非必須アミノ酸残基を排除するため
の置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の、一般的な電
荷、疎水性／親水性、および／または立体的容積を保存している置換である。例
えば以下の群のメンバー間の置換は、保存的置換である；Gly/Ala、Val/Ile/Leu
、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、およびPhe/Trp/Yyr。本明細書中のアナログはさ
らに、タンパク質の生物活性を有する、ペプトイドとしてもまた知られている１
つ以上のペプチド模倣物質(mimic)を有するペプチドを含む。また、この定義に
は、１つ以上のアナログアミノ酸(例えば、天然でないアミノ酸など)を含むポリ
ペプチド、置換結合ならびに当該分野で公知の他の改変体が含まれるが、これら
は天然に存在するものおよび天然に存在しないもの両方である。用語ポリペプチ
ドはまた、ポリペプチドの発現後の改変(例えば、グリコシル化、アセチル化、
リン酸化など)を除外しない。
本明細書中で使用する用語「リガンド」は、細胞表面タンパク質レセプターの
ような、レセプターを結合する分子または分子の複合体をいう。リガンドは、ペ
プチド、ポリペプチド、タンパク質、レセプターと結合対を形成し得る任意の他
の分子、またはこれを形成し得る１つより多い分子の任意の複合体であり得る。
リガンドはまた、リガンドの結合部分が保持され、そしてリガンドのその部分が
なおレセプターと結合するようなリガンド部分であり得る。リガンドはまた、レ
セプターと結合する複合体部分であり得、この部分はレセプターと結合する能力
およびポリペプチドまたは複合体のポリペプチドに結合した状態を維持する能力
を保持している。リガンドがリガンド複合体である場合、それは少なくとも１つ
の他のポリペプチドと複合体化し、そしてレセプターの結合部位を形成するポリ
ペプチドを含み得る。リガンドまたはリガンド複合体とレセプターとの間の結合
は、結合対が形成されるための高親和性として特徴付けられる；結合対は、非共
有結合または共有結合を形成し得る。レセプターと結合するリガンド複合体の例
は、uPAまたはtPAに結合したSERPIN PAI-1が挙げられる。天然の環境において、
uPAは、細胞表面上でuPARに結合されている。uPAは、PAI-1と共有結合し、そし
てuPARから分離した複合体を形成する。uPA：PAI-1複合体は、やはり細胞表面上
でLRPと結合する。LRPは、複合体のPAI-1でまたはPAI-1およびuPAの両方で結合
し得る。結合により、LRP媒介性機構による細胞への複合体のインターナリゼー
ションが進行する。リガンドはリガンド複合体の一部であり、リガンド部分はポ
リペプチドまたはリガンド複合体のポリペプチドと結合する能力を少なくとも保
持しており、そしてまたそれが特異的なLDLレセプターファミリーのレセプター
と結合する能力を少なくとも保持している。
本明細書中で使用する用語「レセプター」は、リガンドと結合して結合対を形
成するタンパク質分子をいう。レセプターは細胞表面上で発現される。リガンド
のレセプターへの結合により、しばしば細胞応答(例えば、リガンド：レセプタ
ー結合対のインターナリゼーション、または細胞表面上でのレセプターの凝集)
が開始する。細胞表面レセプターの例として、LDLレセプターファミリーのレセ
プター、SERPIN：プロテアーゼ複合体を結合するレセプター、PAI-1およびPAI-1
に結合した複合体を結合し、そしてインターナライズするレセプター、LRPレセ
プター、gp330レセプター、およびTFRIに結合し、そしてインターナライズする
レセプターが挙げられる。
本明細書中で使用する用語「LDLレセプターファミリー」は、低密度リポタン
パク質レセプターのファミリーをいう。このファミリーは、低密度リポタンパク
質レセプター(LDLR)、超低密度リポタンパク質レセプター-1および超低密度リポ
タンパク質レセプター-2(VLDLR-1およびVLDLR-2)、低密度リポタンパク質レセプ
ター関連タンパク質(LRP)、糖タンパク質330、ならびにYochemおよびGreenwald
、
Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4572-4576，(1993)に開示される、Caenorhabdl
tis elegans(C．elegans)中で同定されたgp-330様タンパク質を含むが、これら
に限定されない。これらのレセプターおよびその機能は、Stricklandら、FASEB
J．9:890-898(1995)による総説(本明細書中で援用される)に一般的に開示される
。
本明細書中で使用する用語「SERPIN」は、セリンプロテアーゼインヒビターで
ある分類のタンパク質をいう。この分類には、例えば、PAI-1、α-1-抗トリプシ
ン、およびα-1-抗キモトリプシンのようなタンパク質が含まれる。
本明細書中で使用する用語「PAI-1」は、プラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター-1をいう。PAI-1の単離およびクローニングは、Pannekoekら、EMBO，
5:2539-2544(1986)に開示される。
本明細書中で使用する用語「tPA」は、組織型プラスミノーゲンアクチベータ
ーである、組織型プラスミノーゲンを活性化し得るプロテアーゼをいう。
本明細書中で使用する用語「uPA」は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチ
ベーターである、ウロキナーゼプラスミノーゲンを活性化し得るプロテアーゼを
いう。
本明細書中で使用する用語「uPAR」は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチ
ベーターレセプターをいう。uPARは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベー
ター(uPA)を結合する細胞表面レセプターである。
本明細書中で使用する用語「TFPI」は、組織因子系凝固インヒビターをいう。
本明細書中で使用する用語「PSA」は、前立腺特異的抗原をいう。
本明細書中で使用する用語「結合対」は、分子の対をいい、通常、タンパク質
／タンパク質対をいうが、タンパク質／DNA対またはタンパク質／RNA対を除外し
ない。ここで、対の成分はランダムな分子よりも高い親和性で互いに特異的に結
合し、その結果、結合の際に、例えばリガンド／レセプター相互作用の場合、結
合対は細胞応答または細胞内応答を誘発する。リガンドは、１つのポリペプチド
分子であり得るか、または１つ以上のポリペプチド分子と複合体化してリガンド
複合体を形成するポリペプチド分子であり得る。リガンド複合体は、レセプター
と結合し、そしてリガンド対を形成し得る。本発明の重要な局面は、本発明のレ
セプターのリガンドが、１つのポリペプチドリガンドに特異的であることに加え
て、１つより多いポリペプチドのリガンド複合体に特異的であることである。本
発明の１つの目的であるインターナリゼーションの特異性は、LDLレセプターフ
ァミリーのレセプターと結合し得ると共に複合体化した１つより多いポリペプチ
ドを含むリガンドによって部分的に作られると考えられる。結合対は、正式には
、リガンドまたはリガンド複合体であり、そして結合対は、結合が生じたときに
複合体およびレセプターによって形成される。結合対の結合部位は、リガンドの
任意の部分またはリガンド複合体であり得る。従って、例えば、レセプターは、
２つのポリペプチドリガンド複合体の両方のポリペプチドの一部と結合し得るか
、または複合体のポリペプチドの一方のみと結合し得る。結合対は、リガンドと
レセプターとの間、またはリガンド複合体とレセプターとの間の共有結合の形成
によって形成され得る。結合対の形成からもたらされ得る応答は、例えば、細胞
表面レセプターに結合したリガンドまたはリガンド複合体のインターナリゼーシ
ョンを包含する。レセプターとリガンドまたはリガンド複合体との間の結合対は
また、次の細胞応答(例えば、リガンド複合体／レセプター結合対のインターナ
リゼーション)を促進するための別のレセプターまたは別のポリペプチド分子の
会合によって補助され得る。リガンド／レセプター結合対の例は、PDGF(血小板
由来増殖因子)とPDGFレセプター(細胞表面レセプター)との間で形成される対で
ある。結合対の別の例は、細胞表面上でLRPと結合するリガンド複合体u-PA：PAI
-1である。異なる結合対の例は、抗原／抗体対であり、ここで、抗体は宿主の抗
原での免疫によって産生される。特異的な結合は、結合相互作用の解離定数が低
いことを示し、これにより非特異的なバックグラウンドの結合から特異的な結合
が識別される。
本明細書中で使用する用語「ウイルス表面タンパク質」は、ウイルスのウイル
ス表面を作るタンパク質またはポリペプチドをいう。本発明に有用なウイルス表
面タンパク質としては、レトロウイルスを含むエンベロープを有するウイルス、
および例えば、アデノウイルスを含むエンベロープを有さないウイルスが挙げら
れる。従って、ウイルス表面タンパク質は、任意のウイルス表面タンパク質から
選択され得る。これらには、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単
純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、インフルエンザ
ウイルス、シンドビスウイルス、および水泡性口炎ウイルス、レトロウイルス、
単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス由
来のカプシドタンパク質が挙げられる。
本明細書中で使用する用語「ウイルスのインターナリゼーション」または「粒
子のインターナリゼーション」は、細胞表面のレセプターとウイルス表面タンパ
ク質のリガンド部分との接触による、または細胞表面のレセプターと粒子に固定
されたリガンドとの接触による、ウイルスまたは粒子または小胞の宿主細胞への
インターナリゼーションをいう。次いで、ウイルスまたは粒子は、レセプターと
ウイルス表面タンパク質または改変された粒子のいずれかのリガンド部分との間
でリガンド対が形成された後、必要に応じて、インターナライズされる。
本明細書中で使用する用語「粒子」は、宿主細胞中でのコード配列の発現のた
めのポリヌクレオチドコード配列(調節配列もまた含む)をカプセル化し得る任意
の小胞をいう。粒子は、例えば、ウイルス粒子または非ウイルス粒子であり得る
。ウイルス粒子は、エンベロープを有するウイルス粒子またはエンベロープを有
さないウイルス粒子であり得、そしてウイルスゲノムおよび異種ポリヌクレオチ
ド配列を含み得る。例示的なウイルス粒子は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、インフ
ルエンザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、および水泡性
口炎ウイルスに由来し得る。例示的な非ウイルス粒子は、リポソームを含み、こ
れは、例えば、米国特許第5,422,120号、WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/144
45、およびEP 524.968 B1に開示される。特に、異種小胞リポソーム粒子を含む
。MAYBE ADD SOME REFERENCE TO HBV，36 SERIES-BARB'S POINT 7-DOUBLE CHECK
．
本明細書中で使用する用語「改変された粒子」は、リガンド部分の付加に伴い
変化して、その結果リガンド部分がLDLレセプターファミリーのレセプターと結
合対を形成し得る、任意の小胞または粒子をいう。リガンド部分はまた、ウイル
ス表面タンパク質部分に結合され得る。リガンドは、LDLレセプターファミリー
のメンバーと結合する任意のリガンドであり得る。リガンドは、リガンド全体ま
たはその生物学的に活性な部分であり得、これによりリガンド部分はレセプター
と結合対を形成する能力を保持している。リガンド部分は、化学的架橋またはUV
光架橋を含むがこれらに限定されない当該分野で標準的な、ペプチドまたはポリ
ペプチドをタンパク質以外の分子に固定することによって、粒子または小胞に固
定される。ポリヌクレオチドコード領域は、リガンド部分が粒子または小胞に固
定される前または後に、粒子または小胞に取り込まれる。宿主細胞での発現のた
めのコード配列および調節配列を含む改変された粒子は、粒子に固定されたリガ
ンドが宿主細胞表面上に存在するレセプターと結合対を形成するときに、宿主細
胞にインターナライズされる。
例示的な発現系が、ウイルスゲノムへの取り込みのため、または粒子もしくは
小胞への取り込みのため、および動物での発現のための動物の宿主細胞へのイン
ターナリゼーションのための、ベクター中の組換えコード配列の構築のために以
下に記載する。さらに、発現系は、リガンドおよびウイルス表面タンパク質の一
部を含むキメラウイルス表面タンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドの
構築およびキメラウイルス表面タンパク質の発現に有用である。以下の発現系は
また、リガンドのレセプターを発現する宿主細胞による粒子または小胞のインタ
ーナリゼーションのための、発現されそして粒子または小胞に固定されたリガン
ドの一部のコード領域の構築に有用である。リガンド部分は、ペプチドまたはポ
リペプチドであり得、そしてそれが由来するリガンドが天然の環境下で結合する
レセプターと結合対を形成する生物学的活性を保持している。
以下の方法論は当業者が本発明を実施し得るに十分な詳細な説明を含むと考え
られるが、特に例示しない他のアイテム(例えば、プラスミド)が、以下に記載さ
れる標準的な組換えDNA技術を用いて構築されそして精製され得る。United Stat
es Dept．of HHS，NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH(NIH)GUIDELINES FOR RECOMBI
NANT DNA RESEARCHに記載される現在の規制下で、例えば、Sambrookら、（1989
）MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第２版(Cold Spring Harbor Press
，Cold Spring Harbor，N.Y.)、およびAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLEC
ULAR BIOLOGY(1994)、(Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons
，New York，N．Y.)。これらの参考文献は、以下の標準的な方法の手順を含む：
プラスミドを用いるクローニング手順、宿主細胞の形質転換、細胞培養、プラス
ミドDNA精製、DNAのフェノール抽出、DNAのエタノール沈澱、アガロースゲル電
気泳動、アガロースゲルからのDNAフラグメントの精製、ならびに制限エンドヌ
クレアーゼおよび他のDNA改変酵素反応。細菌細胞における発現
細菌において使用するための制御エレメントは、プロモーター（必要に応じて
、オペレーター配列を含む）およびリボソーム結合部位を含む。有用なプロモー
ターは、糖代謝酵素（例えば、ガラクトース、ラクトース（lac）、およびマル
トース）由来の配列を含む。さらなる例は、トリプトファン（trp）のような生
合成酵素、βラクタマーゼ（bla）プロモーター系、バクテリオファージλPLお
よびＴ７由来のプロモーター配列を含む。さらに、tacプロモーターのような合
成プロモーターが用いられ得る。βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター
系は、Changら、Nature(1978)275:615、およびGoeddelら、Nature(1979)281:544
に記載され；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系
は、Goeddelら、Nucleic Acids Res.(1980)8:4057およびEP36,776に記載され、
およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターは、米国特許第4,551
,433号およびdeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:21-25に記載されてい
る。しかし、真核生物タンパク質の発現に有用である他の既知の細菌性プロモー
ターもまた、適切である。当業者は、例えば、Siebenlistら、Cell(1980)20:269
に記載されるように、任意の要求される制限部位を補充するためにリンカーまた
はアダプターを用いて、このようなプロモーターを目的のコード配列に作動可能
に連結し得る。一般に、細菌系に用いるためのプロモーターはまた、標的ポリペ
プチドをコードするDNAに作動可能に連結したShine-Dalgarno（SD）配列を含む
。ネイティブな標的ポリペプチドシグナル配列を認識もプロセスもしない原核生
物宿主細胞にとって、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニ
シリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群より選択さ
れる原核生物シグナル配列によって置換され得る。プラスミドpBR322の複製起点
は、ほとんどのグラム陰性細菌に対して適切である。
前述の系は、特にEscherichia coli適合性である。しかし、細菌宿主における
使用のための多数の他の系は、グラム陰性またはグラム陽性生物（例えば、特に
Bacillus spp.、Streptococcus spp.、Streptomyces spp.、P.deruginosaのよう
なPseudomonas種、Salmonella typhimurium、またはSerratia marcescans）を含
む。これらの宿主に外因性DNAを導入する方法は、典型的に、CaCl2または二価カ
チオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用を含む。DNAはまた、Sambrookら(1989
)（前掲）において一般的に記載されるように、エレクトロポレーション、核注
入、またはプロトプラスト融合によって、細菌細胞に導入され得る。これらの例
は、制限というよりはむしろ例示である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタ
ンパク質分解性酵素を分泌するべきである。あるいは、インビトロでのクローニ
ング法（例えば、PCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応）が適切である。
本発明の標的ポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、Samb
rookら（前掲）において一般的に記載されるように、適切な培地中で培養される
。酵母細胞における発現
発現および形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターの
いずれか）は、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現
ベクターは、特に、以下の酵母のために開発されてきた：Saccharomyces cerevi
siae(Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1978）75:1929；Itoら、J.Bacteriol
(1983)153:163に記載される)；Candida albicans(Kurtzら、Mol.Cell.Biol.(198
6)6:142に記載される)；Candida maltosa(Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)2
5:141に記載される)；Hansenula polymorpha(Gleesonら、J.Gen.Microbiol.(198
6)132.3459およびRoggenkampら、Mol.Gen.Genet.(1986)202:302に記載される)；
Kluyveromyces fragilis（Dasら、J.Bacteriol.(1984)158:1165に記載される）
；Kluyveronyces lactis（De Louvencourtら、J.Bacteriol.(1983)154:737およ
びVan den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135に記載される）；Pichia guille
rimondil（Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985):25;141に記載される；Pichia p
astoris（Creggら、Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376、ならびに米国特許第4,837,14
8号および同第4,929,555号に記載される）；Schizosaccharomyces pombe（Beach
およびNurse,Nature(1981)300:706に記載される）；およびYarrowia lipolytica
（Davidowら、Curr.Genet.(1985)10:380およびGaillardinら、Curr.Gene
t.(1985)10:49に記載される）、A.nidulansのようなAspergillus宿主（Ballance
ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-289；Tilburnら、Gene(1983)2
6:205-221およびYeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-1474に記載
される）、およびA.niger（KellyおよびHynes,EMBO J.(1985)4:475479に記載さ
れる）；Trichoderma reesia（EP244,234に記載される）、および糸状菌（例え
ば、WO91/00357に記載されるNeurospora Penisillium Tolypocladium）。
酵母ベクターのためのコントロール配列は既知であり、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ADH）(EP284,044に記載される）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グル
コース-６-ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド-３-ホスフェート-
デヒドロゲナーゼ（GAPまたはGAPDH）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルベートキナーゼ（PyK）（EP32
9,203に記載される）のような遺伝子由来のプロモーター領域が挙げられる。酸
ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を
提供する（Myanoharaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1に記載される）。
酵母宿主で使用するための他の適切なプロモーター配列は、３-ホスホグリセレ
ートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Chem.(1980)255:2073に記載される）、また
はピルベートデカルボキシラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、およ
びホスホグルコースイソメラーゼのような他の解糖酵素（Hessら、J.Adv.Enzyme
Reg.(1968)7:149およびHollandら、Biochemistry(1978)17:4900に記載される）
のプロモーターを包含する。生育条件によって制御される転写のさらなる利点を
有する誘導性酵母プロモーターとしては、上記の一覧およびアルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素の他のプロモーター領
域が挙げられる。酵母発現における使用のために適切なベクターおよびプロモー
ターは、Hitzeman、EP073,657にさらに記載される。酵母エンハンサーはまた、
酵母プロモーターとともに用いるのに有利である。さらに、天然には存在しない
合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、ある酵母
プロモーターの上流活性化配列（UAS）は、別の酵母プロモーターの転写活性化
領
域に結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを生じる。このようなハイブリ
ッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域に連結されるADH調節配列が
挙げられる（米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号に記載される）。ハ
イブリッドプロモーターの他の例としては、ADH2、GAL4、GAL10、またはPH05の
いずれかの調節配列からなり、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性
化領域に結合されるプロモーターが挙げられる（EP164,556に記載される）。さ
らに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼに結合しそして転写を開始し
得る非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。
酵母発現ベクターにおいて含まれ得る他の制御エレメントは、例えば、GAPDH
およびエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター（Hollandら、J.Biol.Chem.(1981
)256:1385に記載される）、および分泌についてのシグナル配列をコードするリ
ーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、酵母インベルター
ゼ遺伝子（EPO12,873およびJP62,096,086に記載される）、α因子遺伝子（米国
特許第4,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号；EP324,274；お
よびWO89/02463に記載される）のような分泌された酵母タンパク質の遺伝子由来
であり得る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリー
ダー）もまた、酵母の分泌を提供する（EPO60,057に記載される）。
酵母宿主に外因性DNAを誘導する方法は、当該分野に周知であり、そして代表
的には、スフェロプラストまたはアルカリ性カチオンで処理した無傷の酵母細胞
のいずれかの形質転換を包含する。
酵母への形質転換は、Van Solingenら、J.Bact.(1977)130:946およびHsiaoら
、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1979)76:3829に記載される方法に従って実施され
得る。しかし、細胞にDNAを導入する他の（例えば、核注入、エレクトロポレー
ション、またはプロトプラスト融合による）方法はまた、一般に、Sambrookら（
前掲）に記載されるように使用され得る。
酵母分泌のために、ネイティブな標的ポリペプチドシグナル配列は、酵母イン
ベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。
２μのプラスミド起源由来の複製起点は、酵母に適切である。酵母において使用
するための適切な分泌遺伝子は、Kingsmanら、Gene(1979)7:141またはTschemper
ら、Gene(1980)10:157に記載される酵母プラスミドに存在するtrp1遺伝子である
。trp1遺伝子は、トリプトファン中で生育する能力を欠失する酵母の変異株につ
いての選択マーカーを提供する。同様に、Leu2欠損酵母株（ATCC 20,622または3
8,626）は、Leu2遺伝子を保有する既知のプラスミドによって相補される。
酵母においてこのポリペプチドを細胞内で産生するために、酵母タンパク質を
コードする配列は、発現の際に酵母細胞によって細胞内で切断され得る融合タン
パク質を産生するように、ポリペプチドのコード配列に連結され得る。このよう
な酵母リーダー配列の１つの例は、酵母ユビキチン遺伝子である。昆虫細胞における発現
バキュロウイルス発現ベクター（BEV）は、発現される外来遺伝子のコード配
列が、ウイルス遺伝子（例えば、SmithおよびSummers、米国特許第4,475,051号
に記載されるポリヘドリン）の代わりにバキュロウイルスプロモーターの後ろに
挿入される組換え昆虫ウイルスである。
本明細書における発現構築物としては、昆虫細胞系の感染または形質転換のた
めの中間体として有用なDNAベクター包含する。このベクターはバキュロウイル
ス転写プロモーターをコードするDNAを一般に含み、必要に応じてしかし好まし
くは、その下流に所望のタンパク質の分泌を指向し得る昆虫シグナルDNA配列、
そして外来タンパク質をコードする外来遺伝子の挿入部位、バキュロウイルスプ
ロモーターの転写制御の下に配置されるシグナルDNA配列および外来遺伝子が続
く。本明細書中における外来遺伝子は、ポリペプチドのコード配列である。
本明細書中で使用するプロモーターは、一般に昆虫（例えば、Orders Lepidop
tera、Diptera、Othoptera、Coleoptera、およびHymenoptera）を感染する任意
の500を越えるバキュロウイルス由来のバキュロウイルス転写プロモーター領域
であり得る。例えば、Autographo californica MNPV、Bombyx mori NPV、rricho
plusia ni MNPV、Rachlplusia ou MNPV、またはGalleria mellonella MNPV、Aed
es aegypti、Drosophila melanogaster、Spdoptera frugiperda、およびTrichop
lusia niのウイルスDNAを包含するがこれらに限定されない。従って、バキュロ
ウイルス転写プロモーターは、例えば、バキュロウイルス即時型初期遺伝子IEI
またはIENプロモーター；39Kおよび遅延型初期遺伝子を含むHindIIIフラグメン
トからなる群より選択されるバキュロウイルス遅延型初期遺伝子プロモーター領
域と組み合わせた即時型初期遺伝子；または、バキュロウイルス後期遺伝子プロ
モーターであり得る。即時型初期または遅延型初期プロモーターは、転写エンハ
ンサーエレメントを用いて増強され得る。
本明細書中の使用のために特に適切なのは、DNAインサートの高レベルの発現
にを指向するバキュロウイルスの強力なポリヘドリンプロモーター（Friesenら(
1986)THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES（W.Doerfler編）の「The Regul
ation of Baculovirus Gene Expression」；EP127,839およびEP155,476に記載さ
れる）；およびp10タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーター（Vlakら
、J.Gen.Virol.(1998)69:765-776に記載される）である。
本明細書中で使用するプラスミドはまた、通常、ポリヘドリンポリアデニル化
シグナル（Millerら、Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177に記載される）ならびに
原核生物アンピシリン耐性（amp）遺伝子およびE.coli中での選択および増殖の
ための複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAはまた含まれ得、
そして一般に昆虫またはバキュロウイルスの分泌されるタンパタ質についての遺
伝子（例えば、Carbonellら、Gene(1988)73:409に記載されるバキュロウイルス
ポリヘドリン遺伝子）、ならびにヒトαインターフェロン（Maedaら、Nature(19
85)315:592-594に記載される）；ヒトガストリン放出ペプチド（Lebacq-Verheyd
enら、Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129に記載される）；ヒトIL-2（Smithら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:8404に記載される）；マウスIL-3（Miyajimaら、Ge
ne(1987)58:273に記載される）；およびヒトグリコセレブロシダーゼ（Martinら
、DNA(1998)7:99に記載される）をコードする遺伝子に由来するような哺乳動物
シグナル配列に由来する。
宿主由来の多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容され
る昆虫宿主細胞（例えば、Spodoptera frugiperda（毛虫）、Aedes aegypti（蚊
）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）
、およびBombyx mori宿主細胞）が、同定されており、そして本明細書中で用い
られ得る。例えば、Luckowら、Bio/Technology(1988)6:47-55、Millerら、G
ENETIC ENGINEERING（Stelow,J.K.ら、編）、第８版（Plenum Publising，1986
）277-279頁、およびMaedaら、Nature,(1985)315:592-594における記載を参照の
こと。種々のこのようなウイルス株は、一般に入手可能である（例えば、Autogr
apha californica NPVのL-1変異体およびBombyx mori NPVのBm-5株）。このよう
なウイルスはSpdoptera frugiperda細胞のような宿主細胞のトランスフェクショ
ンのためのウイルスとして用いられ得る。
ポリヘドリンプロモーターに加えて、他のバキュロウイルス遺伝子は、バキュ
ロウイルス発現系において有利に用いられ得る。これらは、発現される間のウイ
ルス感染の相により、即時型初期（α）、遅延型初期（β）、後期（γ）、また
は超後期（very late）（δ）を含む。これらの遺伝子の発現は連続して、おそ
らく、転写調節の「カスケード」機構の結果として生じる。従って、即時型初期
遺伝子は、他のウイルス機能の非存在下で感染後即時に発現され、そして１つ以
上の得られた遺伝子産物は、遅延型初期遺伝子の転写を誘導する。いくつかの遅
延型初期遺伝子産物は、次に後期遺伝子の転写を誘導し、そして最後に、超後期
遺伝子は、一つ以上の初期クラス由来の以前に発現された遺伝子産物の制御下で
発現される。この調節カスケードの関連する十分に定義された成分は、IEIであ
り、Autographo californica核多角体ウイルス（AcMNPV）の好ましい即時型初期
遺伝子である。IEIは、他のウイルス機能の非存在下に抑制され（pressed）、そ
して遅延型初期クラスのいくつかの遺伝子（好ましくは39K遺伝子（Guarinoおよ
びSummers,J.Virol.(1986)57:563-571、ならびにJ.Virol.(1987)61:2091-2099に
記載される）ならびに後期遺伝子（GuannoおよびSummers,Virol.(1988)162:444-
451に記載される）を含む）の転写を刺激する産物をコードする。
上記のような即時型初期遺伝子は、遅延型初期カテゴリーのバキュロウイルス
遺伝子プロモーターと組合せて用いられ得る。即時型初期遺伝子とは異なり、こ
のような遅延型初期遺伝子は、他のウイルス遺伝子または即時型初期遺伝子の遺
伝子産物のようなような遺伝子産物の存在を必要とする。即時型初期遺伝子の組
合せは、39Kのような任意のいくつかの遅延型初期遺伝子プロモーター領域、ま
たはバキュロウイルスゲノムのHindIIIフラグメント上に見出される遅延型初期
遺伝子プロモーターの一つを用いて作製され得る。この例において、39Kプロモ
ーター領域は、発現される外来遺伝子に連結され得、その結果、発現は、IEIの
存在によってさらに制御され得る（L.A.GuarinoおよびSummers(1986a);前掲;Gua
rinoおよびSummers(1986b)J.Virol.,(1986)60:215-223、およびGuarinoら(1986c
),J.Virol.(1986)60:224-229に記載される）。
さらに、即時型初期遺伝子と遅延型初期遺伝子プロモーター領域との組合せが
用いられる場合、異種遺伝子の発現の増強は、遅延型初期遺伝子プロモーター領
域との直接シス連結におけるエンハンサー配列の存在によって実現され得る。こ
のようなエンハンサー配列は、即時型初期遺伝子またはその産物が制限される状
況において、遅延型初期遺伝子発現のこれらの増強によって特徴づけられる。例
えば、hr5エンハンサー配列は、遅延型初期遺伝子プロモーター領域（39K）に直
接シスで連結され得、それによって、クローン化された異種DNAの発現を増強す
る（GuarinoおよびSummers(1986a)、(1986b)、およびGuarinoら(1986c)に記載さ
れる）。
ポリヘドリン遺伝子は、超後期遺伝子として分類される。それゆえ、ポリヘド
リンからの転写は、未知の、しかしおそらく多数の他のウイルスおよび細胞性遺
伝子産物の先の発現を必要とする。ポリヘドリンプロモーターのこの遅延型発現
のために、当該分野における技術水準のBEV（例えば、米国特許第4,475,051号中
にSmithおよびSummersによって記載された例示的なBEV系）は、ウイルスゲノム
の残余からの遺伝子発現の結果としてのみ、そしてウイルス感染が良好に行われ
た後にのみ外来遺伝子を発現する。これは、既存のBEVの使用の制限を示す。新
規に合成されたタンパク質をプロセスする宿主細胞の能力は、バキュロウイルス
感染の進行につれて減少する。従って、ポリヘドリンプロモーターからの遺伝子
発現は、新規に合成されたタンパク質をプロセスする宿主細胞の能力が、ヒト組
織プラスミノーゲンアクチベーターのような特定のタンパク質について潜在的に
減少する場合に生じる。結果として、BEV系における分泌性糖タンパク質の発現
は、クローン化された遺伝子産物の不完全な分泌に起因して複雑化され、それに
よって不完全にプロセスされた形態において細胞内でクローン化された遺伝子の
産物を捕捉する。
昆虫シグナル配列が外来タンパク質（これは切断されて成熟タンパク質を産生
し得る）を発現するために用いられ得ることが認識されているが、本発明は、好
ましくは、発現される遺伝子に適切な哺乳動物シグナル配列を用いて実施される
。
本明細書において適切な例示的な昆虫シグナル配列は、鱗翅目の脂肪動員物質
ホルモン（AKH）ペプチドをコードする配列である。AKHファミリーは、昆虫のエ
ネルギー基質動員および代謝を調節する短くブロックされたニューロペプチドか
らなる。好ましい実施態様において、鱗翅目のManduca sexta AKHシグナルペプ
チドをコードするDNA配列が用いられ得る。直翅目のSchistocerca gregaria遺伝
子配座由来のシグナルペプチドような他の昆虫AKHシグナルペプチドはまた、有
利に使用され得る。別の例示的な昆虫シグナル配列は、CP1、CP2、CP3、またはC
P4のようなキイロショウジョウバエ外皮タンパク質をコードする配列である。
現在、AcNPVに外来遺伝子を誘導するために本明細書中で用いられ得る最も一
般的に用いられる転移ベクターは、pAc373である。当業者に公知である多くの他
のベクターもまた、本明細書中で用いられ得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発
現系についての材料および方法は、Invitrogen(San Diego CA)のような会社から
キットの形態（「MaxBac」キット）で市販されている。本明細書中で利用される
技術は、一般的に当業者に公知であり、そしてSummersおよびSmith、A MANUAL O
F METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES、Te
xas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555号、Texas A&M Universi
ty(1987)；Smithら、Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156、ならびにLucknowおよびSum
・res(1989)に十分に記載されている。これらは、例えば、ATGからATTのポリヘ
ドリン開始コドンの変更、およびATTから32塩基対下流のBamHIクローン化部位を
導入するpVL985の使用を包含する（LucknowおよびSummers(1989)17:31に記載さ
れる）。
従って、例えば、本発明のポリペプチドの昆虫細胞発現のために、公知の技術
を用いて、所望のDNA配列が転移ベクターに挿入され得る。昆虫細胞宿主は、挿
入された所望のDNAを含む転移ベクターを用い、野生型バキュロウイルスのDNAゲ
ノムとともに、通常は、同時トランスフェクションによって、同時形質転換され
得る。ベクターおよびウイルスゲノムは組換えされて、容易に同定および精製さ
れ得る組換えウイルスを生じ得る。パッケージされた組換えウイルスは、昆虫宿
主細胞に感染して、所望のポリペプチドを発現するために用いられ得る。
本明細書において適用される他の方法は、昆虫細胞培養の標準的な方法であり
、同時トランスフェクションおよびプラスミドの精製は、SummersおよびSmith(1
987)（前掲）に記載されている。この参考文献はまた、AcMNPV転移ベクターへの
遺伝子のクローニング、プラスミドDNAの単離、AcmMNPVゲノムへの遺伝子の転移
、ウイルスDNA精製、組換えタンパク質の放射性標識、および昆虫細胞培養培地
の調製の標準的な方法に関する。ウイルスおよび細胞の培養についての手順は、
VolkmanおよびSummers,J.Virol.(1975)19:820-832およびVolkmanら、J.Virol.(1
976)19:820-832に記載される。哺乳動物細胞における発現
本発明のポリペプチドの哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとし
て、以下が挙げられる：SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、マウス乳ガ
ンウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）
、および単純ヘルペスウイルスプロモーターなど。マウスメタロチオネイン遺伝
子由来のプロモーターのような、他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物
構築物における使用が見出されている。哺乳動物発現は、プロモーターに依存し
て、構成的であるかまたは調節される（誘導可能である）かのいずれかであり得
る。代表的には、転写終結配列およびポリアデニル化配列がまた、翻訳停止コド
ンの3'に配置されて存在する。好ましくは、ポリペプチドのコード配列の５’に
配置される、翻訳の開始の最適化のための配列がまた、存在する。転写ターミネ
ーター／ポリアデニル化シグナルの例として、上記のSambrookら（1989）に記載
されるSV40由来のものが挙げられる。スプライスドナー部位およびアクセプター
部位を含むイントロンもまた、本発明の構築物中に設計され得る。
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増大させるた
めに本明細書中で使用され得る。例として以下が挙げられる：Dijkemaら、EMBO
J．(1985)4:761に記載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、およびGorman
ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1982b）79:6777に記載されるようなラウス肉
腫ウイルスの長末端反復（LTR）由来のエンハンサー／プロモーター、およびB
oshartら、Cell（1985）41:521に記載されるようなヒトサイトメガロウイルス。
リーダー配列もまた存在し得、これは、哺乳動物細胞中で外来タンパク質の分泌
を提供するためにシグナルペプチドをコードする配列を含む。好ましくは、リー
ダーフラグメントと目的の遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在
し、その結果、リーダー配列が、インビボまたはインビトロのいずれかで切断さ
れ得る。アデノウイルス３部リーダーは、哺乳動物細胞中での外来タンパク質の
分泌のために提供されるリーダー配列の例である。
一旦完成すると、哺乳動物発現ベクターは、任意のいくつかの哺乳動物細胞を
形質転換するために使用され得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導
入方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン媒介性トランスフェクシ
ョン、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロト
プラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの
カプセル化、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動
物細胞宿主系の形質転換の一般的な局面は、Axelによる米国特許第4,399,216号
に記載されている。発明の実施 一般的記載
細胞が、細胞または組織特異的様式での送達のための分子の内容物を含むウイ
ルスまたは粒子を用いて標的化され得ることが、本明細書中で認識された。分子
の内容物は、標的細胞中での発現のための遺伝子を含み、そして治療剤または他
の分子もまた含む。LDLレセプターファミリーの細胞表面レセプターへの結合の
ためのリガンド部分、およびウイルスまたは粒子の取り込みのためのウイルス表
面タンパク質の部分を含む、キメラウイルス表面ポリペプチドが本明細書中に記
載される。
本発明に従って、ウイルスまたは粒子はキメラウイルス表面ポリペプチドによ
って取り込まれ、そしてキメラのリガンド部分に結合するレセプターを発現する
細胞を標的化するために使用される。取り込まれるウイルスは、アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびBKウイル
ス
を含むが、これらに限定されない任意のウイルスであり得る。これらのウイルス
のウイルスゲノムが、標的細胞中での異種ポリペプチドの発現のために特に十分
に都合が良いが、標的細胞中で異種ポリペプチドを発現し得る任意のウイルスゲ
ノムが本発明によって意図される。取り込まれてインターナライズされる粒子は
、標的細胞への分子の内容物に含まれ、そして送達され得る任意の粒子であり得
る。本発明に有用な粒子の例として、例えば、異種小胞性リポソームおよびシク
ロデキストリンリポソームを含むリポソームが挙げられるが、これらに限定され
ない。リポソームは、下記の改変された粒子の構築のための本発明においてもま
た有用である。一旦、キメラのリガンド部分が細胞表面レセプターに結合すると
、ウイルスまたは粒子は、おそらくレセプター／リガンドインターナライゼーシ
ョン機構を通じてインターナライズされる。一旦細胞の内部に入ると、ウイルス
または粒子の内容物が放出される。しかし、本発明は、本発明がどのように作用
するかのいかなる理論にも制限されない。
実施例１ キメラウイルス表面ポリペプチドの設計
本発明のキメラウイルス表面ポリペプチドは、以下の２つの部分からなる：ウ
イルス表面タンパク質部分およびリガンド部分。本発明のウイルス表面タンパク
質部分は、エンベロープされたもしくはエンベロープされていない任意のウイル
ス由来であり得る。キメラのウイルス表面タンパク質部分は、例えば、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、
レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林
ウイルス、または水痘性口内炎ウイルスの表面タンパク質由来であり得る。ウイ
ルス表面タンパク質部分は、完全なウイルス表面タンパク質またはその部分であ
り得る。ウイルス表面タンパク質の部分は、ウイルスまたは粒子に表面タンパク
質を取り込むことを可能にする部分を含む。
キメラのリガンド部分は、LDL-レセプターファミリーのレセプターに特異的な
リガンド由来である。このリガンド部分は、全てのリガンドまたはその部分のみ
からなり得る。リガンドの不可欠な部分は、レセプターに結合するか、またはレ
セプター−リガンド相互作用が生じることを可能にするリガンドの部分である。
キメラは、レセプターに対するリガンドの結合を天然の分子よりもいくらか拡大
することを可能にし、そして維持するように構築される。リガンドは、例えば、
以下を含むがこれらに限定されないLDL-レセプターの公知のリガンドから選択さ
れる：例えば、PAI-1、プロテアーゼnexin 1、α-1-抗トリプシンおよびα-1-抗
キモトリプシンを含むセリンプロテアーゼインヒビター（SERPIN）。リガンドは
また、例えば、TFP1、およびLDL-レセプターファミリーのレセプターに結合する
ことが公知の他のリガンドでもあり得る。
本発明のリガンドは、互いに複合体化する１つ以上のポリペプチドのリガンド
という用語でもまた定義され得、そして複合体としてLDL-レセプターファミリー
のレセプターに結合し得る。このような複合体の例として、uPAに結合するPAI-1
、tPAに結合するPAI-1、およびPSAに結合するα-1-抗トリプシンが挙げられる。
PAI-1：uPA複合体は、例えば、細胞表面のLRPに結合する。リガンド複合体が本
発明のリガンド部分の基礎を形成する場合、リガンド部分は、レセプターに結合
するため、および細胞へのレセプター媒介性インターナライゼーション機構によ
る複合体のインターナリゼーションに必要なリガンド複合体の部分を含む。
実施例２ キメラは細胞表面タンパク質または複合体に特異的である
本発明以前の代表的な場合、リガンドは、ウイルスまたは他の遺伝子送達粒子
上で発現され、そしてこれはレセプターを発現する細胞に結合し、そしてそれに
よってインターナライズされる。この事象の特異性は、標的細胞を含む種々の細
胞型上でのレセプターの量および分布に依存する。この場合、レセプターが、そ
れに結合したリガンドを既に有している（例えば、EPOレセプターに結合したエ
リスロポエチン）時は、遺伝子送達粒子は細胞に結合することができない。本明
細書中に記載される本発明の場合、遺伝子送達粒子は、リガンド：レセプター複
合体を認識するリガンドで修飾される。本発明の特定の実施態様において、PAI-
1を発現する遺伝子送達粒子は、uPARレセプターに結合した２本鎖uPAを活性化す
るために、認識し、そして共有結合する。この方法において、細胞表面プラスミ
ノーゲン活性化に積極的に関与し、そしてuPAを結合した活性なレセプターを示
す細胞のみが、遺伝子送達粒子により標的化される。粒子：uPA：uPAR複合体の
形成後、粒子の効果的なインターナライゼーションが、LRPへの輸送または関連
するスカベンジャー（scavenger）レセプターを介して生じる。従って、本発明
は、標的細胞について増強された特異性を達成する。実施例３ キメラウイルス表面ポリペプチドの構築
キメラウイルス表面ポリペプチドの構築を、組換えDNA技術の当該分野で公知
の技術を使用して達成する。キメラがウイルスに感染した細胞で発現される場合
、キメラの発現に続いて、細胞からウイルスが出芽し、そしてキメラによって取
り込まれてウイルスの外部のエンベロープ上にキメラを示すウイルスを生じる。
キメラが独立して構築され、そしてウイルスまたは粒子中に取り込まれ得る組成
物を形成するために使用される場合、キメラは、例えば、本明細書中に開示され
る技術を含む当該分野で公知の任意の発現系によって構築され、そして発現され
得る。一旦、キメラが発現されると、これは、ウイルス粒子と混合されるか、ま
たはキメラによるウイルスもしくは粒予の取り込みのための他の粒子と混合され
る組成物を形成するために使用される。
実施例４ 取り込まれた粒子は標的細胞に曝される
キメラウイルス表面ポリペプチドによって取り込まれたウイルスまたは粒子を
、次いで、標的細胞への曝露のために動物に投与する。本発明の標的細胞は、以
下を含むが、これらに限定されないLDLレセプターファミリーのレセプターを発
現する：LDLR、VLDLR-1、VLDLR-2、LRP、およびgp330。本発明は、本発明がどの
ように作用するかのいかなる理論にも制限されないが、先行技術を超える本発明
の特定の利点は、LDLレセプターファミリーのレセプターに結合するリガンドが
それらのレセプターへの結合後にインターナライズされることである。リガンド
が上記のキメラの必須の部分である場合、キメラによって取り込まれるウイルス
ま
たは粒子は、レセプターへの結合後に、そのリガンド部分を用いてインターナラ
イズされる。
リガンドとレセプターとの結合対がレセプターを発現する細胞へのリガンドの
インターナライゼーションを達成する特定の例は、PAI-1リガンドおよびPAI-1リ
ガンドとの複合体の例である。本発明は機構の理論に制限されないが、PAI-1が
細胞表面でuPAを結合したuPARに結合し、次いで新たに形成されたPAI-1：uPAの
複合体は、さらに細胞表面のLRPに結合すると考えられる。PAI-1はuPAと共有結
合を形成し、これは、このリガンド複合体の効果的なインターナライゼーション
のための部分と考えられる。キメラウイルス表面タンパク質のリガンド部分（例
えば、uPAを結合したuPARに結合するために十分であり、そしてその部分が続くL
RPとの結合についてもまた十分であるPAI-1を含む）がuPAに結合し、次いでLRP
に結合する場合、ウイルスまたは粒子がインターナライズされる。
本発明は機構のいかなる理論にも制限されないが、LRP経路を介するリガンド
のインターナライゼーションは、ウイルスまたは粒子の内容物のプロセシングが
、細胞中のウイルスまたは粒子の内容物の効率的な放出を促進し得る酸性pHを含
む、リソソーム条件下で生じるさらなる利点をもたらし得る。
実施例５ 改変された粒子
本発明はまた、細胞特異的送達のために改変された粒子を含む。この改変され
た粒子は、粒子にLDLレセプターファミリーのレセプターに特異的なリガンドの
部分を接着すること、および粒子およびその分子の内容物のインターナライゼー
ションのための標的細胞に対するリガンドを使用することによって構築する。改
変された粒子は、粒子に接着されたリガンド部分を有する分子の内容物を含む。
リガンド部分は、本明細書中に記載のものを含む、LDLレセプターファミリーの
レセプターのリガンド由来である。リガンド部分は、少なくとも、レセプターへ
の結合に特異的な部分、および粒子に接着させるために十分な部分を保持する。
リガンド部分がリガンド複合体を形成する場合、リガンド部分は、リガンド複合
体を形成するポリペプチドを結合し得るさらなる部分を保持する。リガンドを付
着させて改変された粒子のインターナリゼーションは、細胞表面のレセプターへ
のリガンド部分の結合により生じる。例えば、PAI-1リガンドが使用される場合
、共有結合は、PAI-1を含むリガンド部分と、uPAを結合したuPARとの間で生じる
。リガンド複合体もまた、なお粒子に結合接着し、次いで、細胞表面レセプター
LRPに結合し、そして細胞にインターナライズされる。リガンドまたはリガンド
部分は、化学的架橋、光重合、UV架橋、および当該分野で公知の他の技術を含む
このような操作のための、当該分野で公知の任意の手段によって粒子に接着され
る。
ウイルスおよび粒子の分子の内容物は、標的細胞中でのポリペプチドの発現の
ための、コード配列、ならびにそれらの調節配列およびベクターを含むが、これ
らに限定されない。粒子の分子の内容物はまた、細胞への送達のための、アンチ
センスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのようなポリヌクレオチドを含む。
内容物はまた、ポリペプチドまたはタンパク質、薬物、ペプチドおよびペプトイ
ドを含む低分子、ならびにこれら全ての組み合わせを含む、任意の多数の治療剤
を含有する。改変された粒子に関する場合、改変された粒子はリガンド部分の接
着による粒子の改変の前または後に、分子の内容物で充填され得る。
実施例６ 標的細胞中で発現可能なポリペプチド
本発明によって標的細胞中で発現され得るポリペプチドは、例えば、任意のタ
ンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的活性を有するタンパク質もしくは
ポリペプチドの部分（例えば、サイトカイン、タンパク質ホルモン、酵素、プロ
テアーゼ、プロテアーゼインヒビター、成長因子、分化因子、細胞表面レセプタ
ー、または抗体もしくは抗原を含むが、これらに限定されない）由来のコード配
列を含む、任意のポリペプチドであり得る。
ウイルスベクターを使用するコード配列の送達のために、Jolly、Cancer Gene
Therapy 1:51-64(1994)に記載されるような、多数のウイルスベクターのいくつ
かが使用され得る。例えば、コード配列は、以下のベクターにおける発現のため
に設計されたプラスミド中に挿入され得る：Kimuraら、Humen Gene Therapy（19
94）5:845-852に記載されるレトロウイルスベクター、Connellyら、Human Ge
ne Therapy（1995）6:185-193に記載されるアデノウイルスベクター、Kaplittら
、Nature Genetics（1994）6:148-153に記載されるアデノ随伴ウイルスベクター
、およびシンドビスベクター。これらのベクターを用いる使用に適切なプロモー
ターとして、例えば、モロニーレトロウイルスLTR、CMVプロモーター、およびマ
ウスアルブミンプロモーターが挙げられる。複製不能の遊離のウイルスが産生さ
れ得、そして動物またはヒトに直接注射されるか、またはエキソビボでの自己細
胞の形質導入、続く、Zatloukalら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1994）91:51
48-5152に記載されるようなインビボでの注射によって注射し得る。
ウイルスベクターによる遺伝子治療目的のための送達の際の、インビボでのコ
ード配列の発現が、Gossenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1992）89:5547-55
51に記載されるように、調節された遺伝子発現プロモーターの使用によって最大
効率および安全性について調節され得る。例えば、コード配列は、テトラサイク
リン応答性プロモーターによって調節され得る。これらのプロモーターは、調節
分子での処理によって、ポジティブまたはネガティブな様式で調節され得る。標
的細胞への送達のための他の分子の内容物としてさらに、他の治療剤（例えば、
タンパク質、ポリペプチド、非タンパク質治療剤、リボザイム、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、ペプチド、ペプトイド、他の低分子、および薬物）が挙げら
れ得る。
実施例７ キメラによって取り込まれる粒子の投与
本発明のキメラによって取り込まれる粒子、または改変された粒子は、パーテ
ィクルガン、ポンプ、カテーテル、カニューレ挿入、吸入、または当該分野で公
知の他の手段による局所送達、静脈内送達を含む、動物もしくはヒトへの粒子も
しくはウイルスの送達のための任意の公知の手段によって、投与される。ウイル
スまたは粒子は、DepoformTMおよびFocalgelTMを含むがこれらに限定されない薬
学的に受容可能な組成物中において投与され得る。
一旦、ウイルス、粒子、または改変された粒子がLDLレセプターファミリーの
レセプターを発現する細胞によって動物内にインターナライズされると、リガン
ドは結合対を形成する。一旦、ウイルスまたは粒子が、ウイルスまたは粒子を含
む分子の内容物に依存して細胞内にインターナライズされるとコード配列が発現
されるか、または培養物が細胞内に放出される。
本発明は、特定の実施態様を参照して記載されている。しかし、この出願は、
添付の請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく当業者によって行われ得
る、特定の実施例の改変および置換を含むことが意図される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．標的細胞へのインターナリゼーションのための分子の内容物を含むウイルス または粒子の送達における使用のための、リガンドとウイルス表面タンパク質と のキメラをコードするキメラポリヌクレオチドであって、該キメラポリヌクレオ チドは以下： LDLレセプターファミリー由来のレセプターのリガンドの全部または一部をコ ードする第１のポリヌクレオチド配列、および ウイルス表面タンパク質の全部または一部をコードする第２のポリヌクレオチ ド配列、 を含み、ここで、該キメラポリヌクレオチドの発現産物は、ウイルスまたは粒子 の取り込みのための取り込み凝集を形成し得、そしてレセプターを発現する標的 細胞にキメラウイルス表面ポリペプチドによって取り込まれるウイルスまたは粒 子のインターナリゼーションのためにレセプターと結合対を形成し得る、キメラ ウイルス表面ポリペプチドを形成し、ここで、該ウイルスまたは粒子は、標的細 胞への送達のための分子の内容物を含む、キメラポリヌクレオチド。 ２．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：uPA 複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的細 胞中にインターナライズされる、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 ３．前記キメラウイルス表面ポリペプチドが、脂質二重膜を含むウイルスのウイ ルス表面タンパク質を含む、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 ４．前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項３に記載のキメラポリヌクレ オチド。 ５．前記キメラウイルス表面ポリペプチドが、ウイルス由来のカプシドタンパク 質を含む、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 ６．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：uPA 複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的細 胞中にインターナライズされる、請求項５に記載のキメラポリヌクレオチド。 ７．前記分子の内容物が、標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 ８．ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターか らなる群より選択されるベクターもまた含む、請求項７に記載のポリヌクレオチ ド。 ９．前記分子の内容物が、タンパク質、低分子、リボザイム、およびアンチセン スオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１に記載のキメラポリ ヌクレオチド。 １０．前記LDLレセプターファミリー由来のレセプターが、LDLR、VLDLR-1、VLDL R-2、LRP、およびgp330からなる群より選択される、請求項１に記載のキメラポ リヌクレオチド。 １１．前記標的細胞がまたuPARを発現する、請求項１０に記載のキメラポリヌク レオチド。 １２．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：u PA複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的 細胞中にインターナライズされる、請求項１１に記載のキメラポリヌクレオチド 。 １３．前記リガンドがセリンプロテアーゼインヒビター（SERPIN）である、請求 項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 １４．前記SERPINが、PAI-1、プロテアーゼネキシン１、α-1-抗トリプシン、お よびα-1-抗キモトリプシンからなる群より選択される、請求項１３に記載のキ メラポリヌクレオチド。 １５．前記SERPINがリガンド複合体を形成し、そして該リガンド複合体がLDL-レ セプターファミリー由来のレセプターに結合する、請求項１３に記載のキメラポ リヌクレオチド。 １６．前記リガンドが、組織因子経路インヒビター（TFPI）である、請求項１に 記載のキメラポリヌクレオチド。 １７．前記ウイルス表面タンパク質が、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、 単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、インフルエン ザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、および水疱性口内炎 ウイルスからなる群より選択されるウイルス表面タンパク質由来である、請求項 １に記載のキメラポリヌクレオチド。 １８．前記分子の内容物がウイルスゲノムを含み、そして該ウイルスゲノムがア デノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、お よびBKウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載のキメラポリヌクレ オチド。 １９．前記標的細胞が真核生物細胞である、請求項１に記載のキメラポリヌクレ オチド。 ２０．前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９に記載のキメラポリ ヌクレオチド。 ２１．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２０に記載のキメラポリヌク レオチド。 ２２．請求項１に記載のキメラポリヌクレオチドによってコードされる、キメラ ポリペプチド。 ２３．前記標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードする前記ポリヌク レオチドが、サイトカイン、タンパタ質ホルモン、酵素、プロテアーゼ、増殖因 子、分化因子、転写因子、およびレセプターからなる生物学的に活性なタンパク 質の群より選択される、請求項７に記載のキメラポリヌクレオチド。 ２４．前記粒子または改変された粒子が、リポソーム、シクロデキストリンリポ ソーム、および異種水疱性リポソームからなる群より選択される粒子または小胞 である、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。 ２５．ウイルスまたは粒子の内容物の送達のためのウイルスまたは粒子のインタ ーナリゼーションのために、細胞を標的するウイルスまたは粒子を取り込むため のキメラポリペプチドであって、該キメラポリペプチドは以下： LDL-レセプターファミリー由来のレセプターのリガンドの全部または一部を含 む第１のポリペプチド配列、および ウイルス表面タンパク質の全部または一部を含む第２のポリペプチド配列、 を含み、ここで、該キメラポリペプチドは、ウイルスまたは粒子の組み込みのた めの組み込み凝集を含み、レセプターを発現する細胞を標的するために取り込み ウイルスまたは取り込み粒子を形成し、 ここで、該リガンドは、取り込みウイルスまたは取り込み粒子のインターナリ ゼーションのためにレセプターと結合対を形成し、 そしてここで、該ウイルスまたは粒子は、標的細胞への送達のための分子の内 容物を含む、キメラポリペプチド。 ２６．キメラウイルス表面タンパク質が、脂質二重膜を含むウイルス由来のウイ ルス表面タンパク質を含む、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ２７．前記ウイルス表面タンパク質がレトロウイルス由来である、請求項２６に 記載のキメラポリペプチド。 ２８．前記ウイルス表面タンパク質がウイルス由来のカプシドタンパク質である 、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ２９．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：u PA複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的 細胞中にインターナライズされる、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ３０．前記リガンドが、セリンプロテアーゼインヒビター（SERPIN）である、請 求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ３１．前記SERPINが、PAI-1、プロテアーゼネキシン１、α-1抗トリプシン、お よびα-1-抗キモトリプシンからなる群より選択される、請求項３０に記載のキ メラポリペプチド。 ３２．前記リガンドがTFPIである、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ３３．前記レセプターが、LDLR、VLDLR-1、VLDLR-2、LRP、およびgp330からなる 群より選択される、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。 ３４．前記標的細胞がまたuPARを発現する、請求項３３に記載のキメラポリペプ チド。 ３５．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：u PA複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的 細胞中にインターナライズされる、請求項３４に記載のキメラポリペプチド。 ３６．前記リガンドがPAI-1である、請求項３５に記載のキメラポリペプチド。 ３７．前記ウイルス表面タンパク質が、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、 単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、インフルエン ザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、および水疱性口内炎 ウイルスの表面タンパク質からなる群より選択される１つに由来する、請求項２ ５に記載のキメラポリペプチド。 ３８．前記内容物が、標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のキメラポリポリペプチド。 ３９．ウイルスベクター、レトロウイルスベタター、または非ウイルスベクター であるベクターをまた含む、請求項３８に記載のポリペプチド。 ４０．前記内容物が、タンパク質、リボザイム、低分子インヒビター、およアン チセンスオリゴヌクレオチドの群からの１つを含む、請求項２５に記載のキメラ ポリペプチド。 ４１．前記分子の内容物がウイルスゲノムを含む、そして該ウイルスゲノムが、 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、 およびBKウイルスからなる群より選択される、請求項２５に記載のキメラポリペ プチド。 ４２．前記標的細胞が真核生物細胞である、請求項２５に記載のキメラポリペプ チド。 ４３．前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項４２に記載のキメラポリ ペプチド。 ４４．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４３に記載のキメラポリペプ チド。 ４５．前記粒子が、リポソーム、シクロデキストリンリポソーム、および異種小 胞リポソームからなる群より選択される、請求項２５に記載のキメラポリペプチ ド。 ４６．ウイルスまたは粒子を標的化またはインターナライズする方法であって、 以下の工程： （ａ）請求項１に記載のキメラポリヌクレオチドを構築する工程、 （ｂ）該キメラポリヌクレオチドを発現させてキメラウイルス表面ポリペプチ ドを形成する工程、 （ｃ）該キメラウイルス表面ポリペプチドを、取り込みウイルスまたは取り込 み粒子を形成するための分子の内容物を含有するウイルスまたは粒子の表面に取 り込む工程、 （ｄ）該取り込みウイルスまたは該取り込み粒子のレセプターを発現する標的 細胞との接触を生じる工程、 （ｅ）該ウイルスまたは該粒子を、リガンドとレセプターとの結合によって該 標的細胞中にインターナライズさせる工程、 を包含する、方法。 ４７．前記キメラポリヌクレオチドの発現工程が、ウイルスを含む細胞中で生じ る、請求項４６に記載の方法。 ４８．前記レセプターが、LDLR、VLDLR-1、VLDLR-2、LRP、およびgp330からなる 群より選択される、請求項４６に記載の方法。 ４９．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：u PA複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的 細胞中にインターナライズされる、請求項４８に記載の方法。 ５０．前記リガンドがSERPINである、請求項４６に記載の方法。 ５１．前記SERPINが、PAI-1、プロテアーゼネキシン１、α-1-抗トリプシン、お よびα-1-抗キモトリプシンからなる群より選択される、請求項５０に記載の方 法。 ５２．前記リガンドがTFPIである、請求項４６に記載の方法。 ５３．前記ウイルス表面タンパク質が、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、 単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、インフルエン ザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、および水疱性口内炎 ウイルスからなる群より選択される１つ由来の表面タンパク質に由来する、請求 項４６に記載の方法。 ５４．前記ウイルスがウイルスゲノムを含み、そして該ウイルスゲノムがアデノ ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、および BKウイルスからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。 ５５．前記分子の内容物が標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。 ５６．標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド が、サイトカイン、タンパク質ホルモン、酵素、プロテアーゼ、増殖因子、分化 因子、転写因子、およびレセプターからなる生物学的に活性なタンパク質の群か ら選択される、請求項５５に記載の方法。 ５７．前記分子の内容物が、タンパク質、リボザイム、およびアンチセンスオリ ゴヌクレオチドからなる群より選択される１つを含む、請求項４６に記載の方法 。 ５８．前記粒子が、リポソーム、シクロデキストリンリポソーム、および水疱性 口内炎リポソームからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。 ５９．前記粒子に含有される分子の内容物のインターナリゼーションのために、 標的細胞への送達のために設計された改変された粒子であって、以下： 分子の内容物を含有する能力を有する粒子、 LDLレセプターファミリー由来のレセプターのリガンドの全部または一部を含 むポリペプチド部分、 を含み、ここで、該粒子および該リガンド部分は、互いに連結されて、標的細胞 へ該粒子の分子の内容物の送達のための改変された粒子を形成する、改変された 粒子。 ６０．前記分子の内容物が、標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコード するポリヌクレオチドを含む、請求項５９に記載の改変された粒子。 ６１．ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、また非ウイルスベクターか らなる群からの１つから選択されるベクターをまた含む、請求項６０に記載の粒 子。 ６２．前記分子の内容物が、タンパク質、低分子、リボザイム、およびアンチセ ンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される１つを含む、請求項５９に記 載の改変された粒子。 ６３．前記LDLレセプターファミリー由来のレセプターが、LDLR、VLDLR-1、VLDL R-2、LRP、およびgp330からなる群より選択される、請求項５９に記載の改変さ れた粒子。 ６４．前記リガンドが、uPAに結合されたuPARと共有結合を形成してリガンド：u PA複合体を形成し、ここで、該リガンド：uPA複合体がLRPに結合し、そして標的 細胞中にインターナライズされる、請求項６３に記載の改変された粒子。 ６５．前記リガンドがPAI-1である、請求項６４に記載の改変された粒子。 ６６．前記リガンドがセリンプロテアーゼインヒビター（SERPIN）である、請求 項５９に記載の改変された粒子。 ６７．前記SERPINが、PAI-1、プロテアーゼネキシン１、α-1-抗トリプシン、お よびα-1-抗キモトリプシンからなる群より選択される、請求項６６に記載の改 変された粒子。 ６８．前記リガンドが組織因子経路インヒビター（TFPI）である、請求項５９に 記載の改変された粒子。 ６９．前記標的細胞が真核生物細胞である、請求項５９に記載の改変された粒子 。 ７０．前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項６９に記載の改変された 粒子。 ７１．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項７０に記載の改変された粒子 。 ７２．前記標的細胞中での発現のためのポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドが、サイトカイン、タンパク質ホルモン、酵素、プロテアーゼ、増殖因子、 分化因子、転写因子、およびレセプターからなる生物学的に活性なタンパク質の 群より選択される１つである、請求項６０に記載の改変された粒子。 ７３．前記粒子が、リポソーム、シクロデキストリンリポソーム、および異種小 胞リポソームからなる群より選択される、請求項５９に記載の改変された粒子。
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