CN105793285A - 多亚基结构的亚基的结合结构域用于将药物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开,多亚基结构的亚基和一个生物活性实体的缀合物用于将生物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途。
Description
技术领域
本文记载了一种通过使用多亚基结构的亚基的结合结构域作为靶向和有效载荷递送实体,将药物活性实体直接靶向递送至多亚基结构上其作用位点的方法。
发明背景
在WO2002/24219中,记载了一种分离的蛋白质复合物,其包括生长因子、生长因子结合蛋白和玻连蛋白。还记载了通过给药所述蛋白质复合物来调节细胞增殖和/或迁移的方法,用于伤口愈合、皮肤修复和组织替代治疗的目的。
在WO2009/033095中,记载了人源化抗-PAI-1抗体及其抗原结合片段的组合物,其将PAI-1转换成其潜伏形式。记载的另一个方面涉及通过将PAI-1转换成其潜伏形式或提高蛋白水解断裂而结合和中和PAI-1的抗体。记载的另一个方面涉及抑制或中和PAI-1的人源化抗体的用途,其用于与PAI-1相关的疾病或病症的检测、诊断或治疗,或其组合。
在WO2009/131850中,记载了一种用于治疗患者青光眼或升高的IOP的方法,包括将有效量的包含抑制PAI-1表达或PAI-1活性的药剂的组合物给药于患者。
即使不是全部,也有许多靶向递送方法具有物种限制的缺陷,即,例如,对于实验动物中的替代物研究,很难获知物种交叉反应方法。
即使不是全部,也有许多用于靶向递送的方法是特定靶标特异性的。
在WO2009/089059中,记载了PAI-1功能的治疗性抑制剂及其使用方法。WO2012/085076记载了uPAR-拮抗剂及其用途。在WO2012/035034中,记载了包含丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-指多肽和第二个肽、多肽或蛋白质的融合多肽,以及所述多肽的用途。
发明概述
已经发现,多亚基结构(例如,多亚基蛋白质)的亚基的结合结构域可以用于将治疗活性实体(例如,抑制性多肽)靶向递送至多亚基结构。
已经发现,源自多亚基结构的亚基的结合结构域的特异性结合相互作用可以用于靶向递送已经与结合结构域缀合的治疗活性实体。
本文中记载的用途和方法是基于对多亚基结构的单个亚基之间存在的特异性结合相互作用(尤其是其特异性的识别特征)的利用。尽管可以将治疗活性实体与全尺寸亚基缀合,但有利的是减小缀合物的大小,以允许重组生产和以可接受的剂量施用。因此,优选只使用亚基的结合结构域,用于正确识别并靶向多亚基结构的其他亚基。
本文中记载的一个方面是,多亚基结构的亚基的结合结构域与(正好)一个生物活性实体的缀合物用于将生物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途。
在一个实施方案中,亚基的结合结构域可以可逆地与多亚基结构结合和自多亚基结构解离。
在一个实施方案中,结合结构域所来自的亚基是多亚基结构的第二大亚基或多亚基结构的最小亚基。
在一个实施方案中,多亚基结构是二亚基结构或三亚基结构或四亚基结构。
在一个实施方案中,多亚基结构是多亚基蛋白质,其中至少所述亚基或全部单独亚基彼此非共价地结合。
在一个实施方案中,生物活性实体是药物活性实体。在一个实施方案中,生物活性实体是治疗活性多肽。
在一个实施方案中,缀合物是重组缀合物。
在一个实施方案中,缀合物进一步包括半衰期延长实体。在一个实施方案中,半衰期延长实体选自聚(乙二醇)、人血清白蛋白或其片段和抗体Fc-区。
在一个实施方案中,结合结构域和治疗活性多肽和半衰期延长实体彼此独立地直接缀合或通过肽接头彼此缀合。
已经发现,在本文中记载的缀合物中,单一一个生物活性实体的效力足以诱导PAI-1的潜伏。
在一个实施方案中,缀合物在N-末端至C-末端方向中包括生物活性实体和多亚基结构的亚基的结合结构域。
在一个实施方案中,缀合物进一步包括抗体Fc-区。在一个实施方案中,抗体Fc-区在缀合物的C-末端。
已经发现,当人IgG重链Fc-区是IgG1亚类并起始于位置221(对应于SEQIDNO:01至SEQIDNO:12的位置1)的天冬氨酸时,例如,与起始于位置217(根据人IgG1的KabatEU索引编号)的脯氨酸的人IgG重链Fc-区相比,缀合物中的生物活性实体的效力提高。在一个实施方案中,人IgG重链Fc-区从Asp221延伸至重链的羧基末端。在一个优选的实施方案中,重链Fc-区具有选自SEQIDNO:01至SEQIDNO:12的氨基酸序列。
在一个实施方案中,多亚基结构的亚基的结合结构域是玻连蛋白的SMB结构域,而生物活性实体是PAI-1的反应中心环(RCL)。
在一个实施方案中,缀合物在N-末端至C-末端方向中包括玻连蛋白的SMB结构域和PAI-1的一个反应中心环(RCL)和抗体Fc-区。
本文中记载的一个方面是重组产生的、非共价结合的多亚基蛋白质的亚基的结合结构域和生物活性多肽的缀合物,其特征在于:
-多亚基蛋白质是二亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的较小亚基,或
-多亚基蛋白质是三亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的最小亚基或第二大亚基,或
-多亚基蛋白质是四亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的最小亚基或第二小亚基或第二大亚基。
本文中记载的一个方面是,一种用于将生物活性多肽靶向递送至其作用位点的方法,其特征在于生物活性多肽的作用位点在多亚基蛋白质上,并且(正好)一个生物活性多肽与多亚基蛋白质的亚基的结合结构域缀合。
在一个实施方案中,亚基的结合结构域可以可逆地与多亚基蛋白质结合以及自多亚基蛋白质解离。
在一个实施方案中,亚基是多亚基蛋白质的第二大亚基或多亚基蛋白质的最小亚基。
在一个实施方案中,多亚基蛋白质是二亚基蛋白质或三亚基蛋白质或四亚基蛋白质。
在一个实施方案中,多亚基蛋白质的至少所述亚基或全部单独亚基彼此非共价地结合。
在一个实施方案中,生物活性实体是治疗活性多肽。
在一个实施方案中,缀合物是重组缀合物。
在一个实施方案中,缀合物进一步包括半衰期延长实体。在一个实施方案中,半衰期延长实体选自聚(乙二醇)、人血清白蛋白或其片段和抗体Fc-区。
在一个实施方案中,结合结构域和治疗活性多肽和半衰期延长实体彼此独立地直接缀合或通过肽接头彼此缀合。
附图描述
图1:包含PAI-1的反应中心环(RCL)、玻连蛋白的SMB结构域和人Fc-区的缀合物的一般结构;1:PAI-1的反应中心环,2:肽接头,3:SMB结构域,4:Fc-区。
图2:如本文中记载的缀合物的作用模式,用包含PAI-1的反应中心环(RCL)、玻连蛋白的SMB结构域和人Fc-区的缀合物以及PAI-1和玻连蛋白的二亚基结构来举例说明。
图3:对非糖基化的人PAI-1的作用的剂量-应答曲线。
图4:对糖基化的人PAI-1的作用的剂量-应答曲线。
发明详述
如本文中记载的用途和方法是基于对多亚基结构的单独亚基之间存在的特异性结合相互作用,尤其是其特异性的识别特征,的利用。尽管可以将治疗活性实体与全尺寸亚基缀合,但减小缀合物的大小是有利的,可以允许重组生产以及以可接受的剂量施用。因此,优选只使用亚基的结合结构域,用于正确识别并靶向多亚基结构的其他亚基。
冠词“a”和“an”在本文中用于指一或超过一个(即,至少一个)所述冠词的语法对象。例如,“an”抗体表示一个抗体或超过一个抗体。
术语“至少一个”(atleastone)表示一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个。术语“至少两个”表示两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个。
术语“生物活性实体”表示,有机分子,例如,生物大分子,如肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或合成蛋白质,当将其施用于人造生物系统(如使用细胞系或病毒的生物试验)中、或体内施用于动物(包括但不限于鸟类或哺乳动物,包括人类)时,其引起生物学效应。所述生物学效应可以是,但不限于,酶抑制或激活,结合受体或配体,在结合位点或周围,引发信号或调节信号。生物活性多肽没有限制,例如,免疫球蛋白,或激素,或细胞因子,或生长因子,或受体配体,或激动剂或拮抗剂,或细胞毒性剂,或抗病毒剂,或成像剂,或酶抑制剂,酶激活剂或酶活性调节剂,如变构物质。在一个实施方案中,生物活性实体是生物活性多肽。在一个实施方案中,生物活性多肽是治疗活性多肽。在一个实施方案中,治疗活性多肽是线性多肽并且具有10至250个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中,治疗活性多肽具有10至100个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中,治疗活性多肽具有10至50个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中,生物活性实体是完整的抗体轻链或重链,或scFv或scFab或单域抗体,或单链抗体。
可以通过化学方式和通过重组来进行生物活性实体与结合结构域的“缀合”。对于重组缀合,生物活性实体和结合结构域的编码核酸直接连接或使用连续并在阅读框内编码接头肽的间插序列连接。对于化学缀合,可以通过不同的方法来缀合生物活性实体和结合结构域,如化学结合,或通过特异性结合对来结合。在一个实施方案中,通过复合物的所述部分的氨基酸序列的N-末端和/或ε-氨基基团(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基基团、羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团,和/或复合物的碳水化合物结构的糖醇基团进行化学结合,而实现化学缀合。在一个实施方案中,通过特异性结合对,将生物活性实体与结合结构域缀合。
本文中的术语“Fc-区”用来定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个优选实施方案中,人IgG重链Fc-区从Asp221延伸至重链的羧基末端。然而,Fc-区的C-末端赖氨酸(Lys447)或末端甘氨酸(Gly476)和赖氨酸(Lys477)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出,Fc-区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统,也称为EU索引进行,如Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242中的描述。“Fc-区”是公知的术语,可以基于抗体重链的木瓜蛋白酶切割来定义。在一个实施方案中,如本文中记载的缀合物可以包括人Fc-区或源自人来源的Fc-区。在进一步的实施方案中,Fc-区是亚类IgG4的人抗体的Fc-区、或亚类IgG1、IgG2或IgG3的人抗体的Fc-区——其经修饰从而不能检测到Fcγ受体(例如,FcγRIIIa)结合和/或C1q结合。在一个实施方案中,Fc-区是人Fc-区,并且尤其是来自人IgG4亚类的Fc-区或来自人IgG1亚类的突变Fc-区。在一个实施方案中,Fc-区来自人IgG1亚类,具有突变L234A和L235A。尽管IgG4显示出降低的Fcγ受体(FcγRIIIa)结合,其他IgG亚类的抗体显示出强烈的结合。然而,Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc碳水化合物的丧失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和His435是如果改变则也将提供降低的Fcγ受体结合的残基(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund,J.等,FASEBJ.9(1995)115-119;Morgan,A.等,Immunology86(1995)319-324;EP0307434)。在一个实施方案中,本文中记载的缀合物涉及IgG4亚类的Fcγ受体结合、或在L234、L235和/或D265中具有突变的IgG1或IgG2亚类的Fcγ受体结合,和/或含有PVA236突变。在一个实施方案中,突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236(PVA236表示IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸代码给出)或IgG4的EFLG被PVA替代)。在一个实施方案中,突变是IgG4的S228P,以及IgG1的L234A和L235A。抗体的Fc-区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。不结合Fcγ受体和/或补体因子C1q的复合物不引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
IgG1同种型的野生型人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:01).
具有突变L234A、L235A的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有T366S、L368A和Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有L234A、L235A以及T366S、L368A、Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:05).
具有L234A、L235A和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有L234A、L235A和P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有P329G和T366S、L368A、Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有P329G和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有L234A、L235A、P329G和T366S、L368A、Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:11).
具有L234A、L235A、P329G和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:12).
IgG4同种型的野生型人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:13).
具有S228P和L235E突变的IgG4同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:14).
具有S228P、L235E和P329G突变的IgG4同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有S228P、L235E、P329G和T366S、L368A、Y407V突变的IgG4同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
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具有S228P、L235E、P329G和T366W突变的IgG4同种型的变体人Fc-区的多肽链具有以下氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:17).
术语“肽接头”表示天然和/或合成来源的氨基酸序列。其由线性氨基酸链组成,其中20种天然产生的氨基酸是单体构建模块。肽接头具有1至50个氨基酸的长度,在一个实施方案中,为1至28个氨基酸,在进一步的实施方案中,为2至25个氨基酸。肽接头可以含有重复的氨基酸序列或天然多肽的序列。接头通过允许实体正确呈现而具有确保彼此缀合的实体可以实现其生物活性的功能。在一个实施方案中,肽接头富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基排列在例如不超过五个氨基酸的小重复单位中,如GS(SEQIDNO:18)、GGS(SEQIDNO:19)、GGGS(SEQIDNO:20)和GGGGS(SEQIDNO:21)。该小重复单位可以重复一次至五次。在该多聚体单位的氨基-和/或羧基-末端,可以添加多达六个另外的任意天然氨基酸。其他合成的肽接头可以由单种氨基酸组成,其重复10至20次,并且可以在氨基-和/或羧基-末端包括多达六个另外的任意天然氨基酸。所有肽接头均可以由核酸分子编码,并且因此可以重组表达。因为接头自身是肽,所以通过接头连接的多肽可以通过在两个氨基酸之间形成的肽键而连接接头。
术语“聚(乙二醇)”表示含有聚(乙二醇)作为必需部分的非蛋白质残基。这样的聚(乙二醇)残基可以含有结合反应所需要的其它化学基团,其可以来自该分子的化学合成,或可以是用于分子的不同部分的最佳距离的间隔物。这些其它化学基团不用于聚(乙二醇)残基分子量的计算。此外,这样的聚(乙二醇)残基可以由共价连接在一起的一个或多个聚(乙二醇)链组成。具有超过一个PEG链的聚(乙二醇)残基称为多臂或支链聚(乙二醇)残基。可以通过将聚环氧乙烷添加至不同的多元醇,包括丙三醇、季戊四醇(pentaerythriol)和山梨糖醇,来制备支链聚(乙二醇)残基。支链聚(乙二醇)残基记载于例如EP0473084,US5,932,462中。在一个实施方案中,聚(乙二醇)残基具有20kDa至35kDa的分子量,并且是线性聚(乙二醇)残基。在另一个实施方案中,聚(乙二醇)残基是具有35kDa至40kDa分子量的支链聚(乙二醇)残基。
“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物,而不管是天然产生的或合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”;而由两个或更多个多肽组成的分子或包括一个超过100个氨基酸残基的多肽的分子,可以称为“蛋白质”。多肽也可以包括非氨基酸组分,如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以通过表达多肽的细胞来添加,并且可以随着细胞的类型而不同。在本文中根据氨基酸主链结构或编码其的核酸来定义多肽。添加物,如碳水化合物基团,通常没有规定,但可以存在。
在一个实施方案中,生物活性实体是治疗活性多肽。术语“治疗活性多肽”表示,为批准作为人治疗剂而在临床研究中进行测试并且可以给药于个体用于疾病治疗的多肽。
如本领域技术人员已知的,能够使用重组DNA技术生产核酸和/或多肽的各种衍生物。这样的衍生物可以例如在一个单独的位置或几个位置通过置换、改变、交换、缺失或插入而被修饰。例如,修饰或衍生可以通过定点诱变来进行。这样的修饰可以通过本领域技术人员容易地进行(参见,例如,Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆:实验室手册),ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社),纽约,USA(1999))。重组技术使得本领域技术人员能够用外源性(异源)核酸转化各种宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译,即表达机器,使用相同的元件,但属于不同物种的细胞可能具有例如不同的所谓的密码子使用。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由不同的核酸来编码。此外,由于遗传密码的简并性,不同的核酸可以编码相同的多肽(参见,例如,Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆:实验室手册),ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社),纽约,USA(1999);Hames,B.D.和Higgins,S.J.,Nucleicacidhybridization–apracticalapproach(核酸杂交-一种实践方法),IRL出版社,牛津,英国)。
基因的表达可以是瞬时表达或永久性表达。目标多肽一般是分泌的多肽并且因此含有N-末端延伸(也称为信号序列),其是转运/分泌多肽通过细胞壁进入胞外介质所需的。通常,信号序列可以源自任何编码分泌多肽的基因。如果使用异源信号序列,优选其可以被宿主细胞识别和加工(即,被信号肽酶切割)。为了在酵母中分泌,例如,可以用源自分泌基因的同源酵母信号序列来替代待表达的异源基因的天然信号序列,如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)α-因子前导序列,第二个描述于US5,010,182中)、酸性磷酸酶信号序列、或白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶信号序列(EP0362179)。在哺乳动物细胞表达中,目标蛋白的天然信号序列是合适的,但其他哺乳动物信号序列也可以是适宜的,如来自相同或相关物种的分泌多肽(例如,来自人或鼠来源的免疫球蛋白)的信号序列、以及病毒分泌信号序列,例如,单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列。编码这种前区段的DNA片段在读框内与编码目标多肽的DNA片段连接,即,可操作地连接。
可以在真核细胞和原核细胞,如CHO细胞、HEK细胞和大肠杆菌中重组产生多肽。如果在原核细胞中生产多肽,通常以不溶的包涵体形式获得。可以从原核细胞和培养基容易地回收包涵体。以包涵体不溶形式获得的多肽必须进行溶解,之后可以实施纯化和/或再折叠程序。
多种不同的蛋白质纯化方法是成熟建立的并且被广泛应用,如使用微生物蛋白的亲和色谱(例如,蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如,阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式离子交换)、嗜硫吸附(例如,使用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水性相互作用或芳族吸附色谱(例如,使用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和色谱(例如,使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻色谱、和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(参见,例如,Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
已经发现,多亚基结构(例如,多亚基蛋白质)的亚基的结合结构域可以用于将治疗活性实体(例如,抑制性多肽)靶向递送至多亚基结构。
已经发现,源自多亚基结构的亚基的结合结构域的特异性结合相互作用可以用于已与结合结构域缀合的治疗活性实体的靶向递送。
本文记载的一个方面是,多亚基结构的亚基的结合结构域和生物活性实体的缀合物用于将生物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途。
为了用本文中记载的缀合物置换天然亚基,优选地,可以靶向其中的亚基可以可逆地结合和解离的那些多亚基结构。因此,在一个实施方案中,亚基的结合结构域可以可逆地与多亚基结构结合并自多亚基结构解离。
为了不干扰多亚基结构的整体结合,有利的是,选择尽可能小的亚基以从其衍生结合结构域。在一个实施方案中,结合结构域所来自的亚基是多亚基结构的第二大亚基或多亚基结构的最小亚基。
为了确立本文中记载的缀合物在患者循环中的治疗相关水平,合适的是缀合物具有在数天或数周范围的半衰期。因此,在一个实施方案中,缀合物进一步包括半衰期延长实体。在一个实施方案中,半衰期延长实体选自聚(乙二醇)、人血清白蛋白或其片段,以及抗体Fc-区。
本文中记载的一个方面是,重组产生的、非共价结合的多亚基蛋白质的亚基的结合结构域和生物活性多肽的缀合物,其特征在于
-多亚基蛋白质是二亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的较小亚基,或
-多亚基蛋白质是三亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的最小或第二大亚基,或
-多亚基蛋白质是四亚基蛋白质,并且所述亚基是多亚基蛋白质的最小或第二小或第二大亚基。
本文中记载的一个方面是,一种用于将生物活性多肽靶向递送至其作用位点的方法,其特征在于生物活性多肽的作用位点在多亚基蛋白质上,并且生物活性多肽与多亚基蛋白质的亚基的结合结构域缀合。
以下使用包含作为治疗活性多肽的PAI-1反应中心环、作为结合结构域的玻连蛋白SMB结构域、和用于半衰期提高的Fc-区的缀合物,来举例说明本发明。本实施例不构成对本文中记载的方法的范围的限制,其只是本文中所呈现构思的一个实例。
PAI-1是分泌的50kDa糖蛋白,其不可逆地抑制参与纤溶酶原激活级联的两类丝氨酸蛋白酶,即组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)。以此功能,PAI-1控制止血(血液凝固和纤维蛋白溶解)以及组织重塑(胞外基质的更新和降解)。此外,结合玻连蛋白(VN)时,PAI-1还抑制激活的蛋白C(APC),其是通过干扰凝血酶激活级联而发挥有效抗凝剂作用的另一种丝氨酸蛋白酶。除了其抗凝活性,APC还发挥广谱的细胞保护作用,包括抑制炎症、防止细胞凋亡和稳定内皮屏障功能。
在正常生理中,PAI-1在肾组织中低水平表达。然而,在病理状况下,在急性和慢性人肾病中,常驻肾细胞和浸润的炎性细胞都合成PAI-1。我们提出假设,对升高的PAI-1活性的药理学抑制可以以两种方式提供益处:i)纤溶酶原激活的去抑制,在慢性纤维性肾病中诱导胞外基质的更动态的更新;和ii)防止PAI-1介导的APC失活,以促进抗炎和细胞保护功能,特别是在急性肾损伤中。
对于PAI-1介导的疾病的治疗,所基于的一般概念是,通过促进潜伏态的形成来降低活性抑制性PAI-1的量和/或抑制玻连蛋白(VN)结合PAI-1。
为了促进潜伏态的形成,已经产生了包括PAI-1的反应中心环(RCL)、玻连蛋白的SMB结构域和人Fc-区的缀合物。该缀合物的一般结构显示于图1中,而作用方式显示于图2中。
为了评价本文中记载的根据本发明的缀合物的体外/体内功效,使用了PAI-1潜伏诱导抗体(参见,例如,US2009/0081239)。因为不需要/不期望抗体相关的效应子功能,因此使用的抗体是具有突变SPLE(S228PL235E)的人IgG4亚类。参照抗体以下称为PAI1-0001(在鼠IgG1Fc-区的情况中)和PAI1-0046(在人IgG4SPLEFc-区的情况中)。
抗体重链的氨基酸序列为:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFTMTLDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKDVSGFVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:22)。
抗体轻链的氨基酸序列为:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNIIKQKNCLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:23)。
本文中记载的一个方面是,包含SEQIDNO:22的重链可变结构域的重链CDR且包含SEQIDNO:23的轻链可变结构域的轻链CDR的潜伏诱导抗人PAI-1抗体。
在一个实施方案中,抗体包含SEQIDNO:22的重链可变结构域和SEQIDNO:23的轻链可变结构域。
在一个实施方案中,抗体具有人亚类IgG1的Fc-区,具有突变L234A、L235A和任选的P329G。
在一个实施方案中,抗体具有人亚类IgG4的Fc-区,具有突变S228P、L235E和任选的P329G。
本文中记载的一个方面是,重组产生的、人玻连蛋白的SMB结构域和PAI-1潜伏诱导多肽的缀合物。
在一个实施方案中,潜伏诱导多肽具有氨基酸序列
GTVASSSTAVIVSAR(SEQIDNO:24)
在优选的实施方案中,潜伏诱导多肽具有氨基酸序列
GTVASSSTAVIVSAS(SEQIDNO:25)
在一个实施方案中,SMB结构域具有氨基酸序列
ESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAEC(SEQIDNO:26)
在一个实施方案中,缀合物在潜伏诱导多肽和SMB结构域之间包括肽接头。
在一个实施方案中,肽接头具有25至35个氨基酸残基的长度。
在一个实施方案中,肽接头是(GGGGS)6(SEQIDNO:27)。
在一个实施方案中,缀合物进一步包括抗体Fc-区。
在一个实施方案中,抗体Fc-区是人亚类IgG1的,具有突变L234A、L235A和任选的P329G。
在一个实施方案中,抗体Fc-区是人亚类IgG4的,具有突变S228P、L235E和任选的P329G。
在一个实施方案中,缀合物在N-至C-末端方向包括
-SEQIDNO:24或25的PAI-1潜伏诱导多肽,
-SEQIDNO:27的肽接头,
-SEQIDNO:26的SMB结构域,
-SEQIDNO:07或15的抗体Fc-区。
在一个实施方案中,缀合物具有氨基酸序列
GTVASSSTAVIVSARGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:28)。该缀合物在以下称为PAI1-0004。
在一个实施方案中,缀合物具有氨基酸序列
GTVASSSTAVIVSARGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:29)。该缀合物在下文中称为PAI1-0005。
在一个实施方案中,缀合物具有氨基酸序列
GTVASSSTAVIVSASGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:30),该缀合物在下文中称为PAI1-0036。
以上列出的参照抗体和缀合物已经在实施例1中列出的PAI-1抑制试验中进行了测试。针对非糖基化和糖基化的人PAI-1,测定的IC50值显示于下表中。
可看到,根据本发明构思的缀合物与参照抗体相比,是更有效的潜伏诱导(抑制)化合物。参照抗体显示出对糖基化的人PAI-1较低的亲和性(较高的IC50值),而本文中记载的缀合物显示出对两种形式的人PAI-1(即,糖基化的和非糖基化的)相当的亲和性。
相应的剂量应答曲线显示于图3和4中。
此外,在权利要求中,词语“包括(comprising)”不排除其他要素或步骤,并且不定冠词“a”或“an”不排除复数。单个单位可以满足权利要求中所述的几个特征的功能。与属性或数值组合的术语“基本上”、“约”、“大约”等特别地也定义确切地该属性或确切地该数值。权利要求中的任何参照符号不应当认为是构成对范围的限制。
提供以下的实施例、序列和附图来帮助理解本发明,本发明的真实范围描述于后附权利要求中。可以理解,在所述程序中可以进行改变,而不脱离本发明的精神。
实施例
实施例1
融合蛋白的产生
重组DNA技术
按照Sambrook,J.等,Molecularcloning:Alaboratorymanual(分子克隆:实验室手册);ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社),冷泉港,纽约,1989中所述的,使用标准方法操纵DNA。根据制造商的说明,使用分子生物学试剂。
基因合成
根据给定的说明,在Geneart(雷根斯堡,德国)订购了基因合成片段。合成编码RCL-SMB-Fc融合蛋白的所有基因区段,具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’-末端DNA序列(所述前导肽用于蛋白质在真核细胞中的靶向分泌)、和位于合成基因的5’和3’末端的独特限制性位点。
DNA序列测定
通过在SequiserveGmbH(Vaterstetten,德国)进行的双链测序,测定了DNA序列。
DNA和蛋白序列分析以及序列数据管理
版本10.2的GCG's(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)软件包和版本11.0的Infomax'sVectorNT1Advancesuite用于序列创建、作图、分析、注解和说明。
表达载体
为了表达期望的融合分子,使用表达质粒用于瞬时表达(例如,在HEK293-F细胞中),其基于带CMV-内含子A启动子的cDNA组织。
除了抗体表达盒,载体还含有:
-复制起点,其允许质粒在大肠杆菌中复制,和
-β-内酰胺酶,其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单位由以下元件组成:
-5’端独特的限制性位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子,
-接着是内含子A序列,
-人抗体基因的5’-非翻译区,
-免疫球蛋白重链信号序列,
-RCL、SMB和人抗体IgG1铰链及结构域CH2和CH3的融合蛋白的基因。
-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区域,和
-3’端独特的限制性位点。
对于瞬时和稳定转染,通过从转化的大肠杆菌培养物(NucleobondAX,Macherey-Nagel)的质粒制备,制备了大量质粒。
细胞培养技术
按照CurrentProtocolsinCellBiology(细胞生物学通用实验方案)(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑),JohnWiley&Sons,Inc.中所述的,使用标准细胞培养技术。
HEK293-F系统中的瞬时转染
根据制造商的说明(Invitrogen,USA),使用FreeStyleTM293表达系统,通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染,表达了RCL-SMB-Fc融合蛋白。简而言之,在37℃/8%CO2,在FreeStyleTM293表达培养基中培养悬浮的FreeStyleTM293-F细胞,并在转染当天,将细胞以1-2×106活细胞/ml的密度接种于新鲜培养基中。对于250ml最终转染体积,使用325μl293fectinTM(Invitrogen,德国)和500μg质粒DNA,在I培养基(Invitrogen,USA)中制备了DNA-293fectinTM复合物。转染后7天,通过在14000g离心30分钟并通过除菌滤器(0.22μm)过滤,来收集含有融合蛋白的细胞培养物上清液。将上清液储存在-20℃直至纯化。
蛋白质测定
根据Pace等,ProteinScience,1995,4,2411-1423,使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测定280nm光密度(OD),确定纯化的融合蛋白的蛋白质浓度。
上清液中的融合蛋白浓度测定
通过蛋白A-HPLC色谱,测量了细胞培养物上清液中的融合蛋白的浓度。简而言之,在50mMK2HPO4,300mMNaCl,pH7.3中将含有结合蛋白A的融合蛋白的细胞培养物上清液上样于HiTrap蛋白A柱(GEHealthcare),并用550mM乙酸pH2.5在DionexHPLC系统上从基质洗脱融合蛋白。通过UV吸光度和峰面积积分,定量了洗脱的蛋白质。将纯化的标准IgG1抗体用作标准品。
融合蛋白的纯化
使用蛋白A-SepharoseTM(GEHeathcare,瑞典)通过亲和色谱,以及通过Superdex200大小排阻色谱,从细胞培养物上清液纯化了融合蛋白。简而言之,将除菌过滤的细胞培养物上清液上样于用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4,1mMKH2PO4,137mMNaCl和2.7mMKCl,pH7.4)平衡的HiTrapProteinAHP(5ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH2.8洗脱融合蛋白,并用0.1ml1MTris,pH8.5中和含蛋白质的级分。然而,合并洗脱的蛋白质级分,并用AmiconUltra离心过滤设备(MWCO:30K,Millipore)浓缩至3ml的体积并上样于用20mM组氨酸,140mMNaCl,pH6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml16/60凝胶过滤柱(GEHealthcare,瑞典)。将具有少于5%高分子量聚集物的含纯化融合蛋白的级分合并,并作为1.0mg/ml等份试样储存于-80℃。
SDS-PAGE
根据制造商的说明,使用了Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。特别地,使用了4-20%TRIS-甘氨酸Pre-Cast凝胶和TRIS-甘氨酸SDS跑胶缓冲液。在跑胶前,通过加入样品还原剂,实现样品的还原。
分析性大小排阻色谱
通过HPLC色谱,用大小排阻色谱测定了融合蛋白的聚集和寡聚状态。简而言之,将蛋白A纯化的融合蛋白施加于AgilentHPLC1100系统上的300mMNaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4,pH7.5中的TosohTSKgelG3000SW柱上,或施加于DionexHPLC-System上的2×PBS中的Superdex200柱(GEHealthcare)上。通过UV吸光度和峰面积积分,定量了洗脱的蛋白质。将BioRad凝胶过滤标准151–1901用作标准品。
质谱
通过电喷雾离子化质谱(ESI-MS),测定和证实了融合蛋白的总的去糖基化质量。简而言之,用100mMKH2PO4/K2HPO4,pH7中的50mUN-糖苷酶F(PNGaseF,ProZyme),将100μg纯化的融合蛋白在高达2mg/ml的蛋白质浓度下在37℃去糖基化12-24h,并随后通过SephadexG25柱(GEHealthcare)上HPLC脱盐。在去糖基化和还原后,通过ESI-MS测定了还原链的质量。简而言之,用60μl1MTECP和50μl8M盐酸胍孵育115μl中的50μg抗体,并随后脱盐。通过配备有NanoMate源的Q-StarEliteMS系统上的EMI-MS,测定了总质量和还原链的质量。
实施例2
PAI-1抑制试验
该方法基于Lawrence等,Eur.J.Biochem.186(1989)523-533描述的试验原理。将规定量的活性PAI-1蛋白与规定量的丝氨酸蛋白酶混合,所述丝氨酸蛋白酶可以被活性PAI-1可逆地阻断。通过添加生色肽来定量测定残余的丝氨酸蛋白酶活性,所述生色肽通过丝氨酸蛋白酶的水解导致吸光度或荧光的提高。用规定浓度的测试化合物预先孵育活性PAI-1蛋白可以导致PAI-1的潜伏诱导(抑制)。通过测量丝氨酸蛋白酶活性的成比例提高(即,吸光度或荧光的提高),测定由测试化合物引起的PAI-1抑制程度。在试验中使用测试化合物的连续稀释,获得剂量应答曲线,从该曲线可以得出测试化合物的效力(IC50值)。IC50值表示,观察到丝氨酸蛋白酶活性50%提高时引起PAI-1活性50%抑制的测试化合物的浓度。在黑色96-孔平底微滴定平板(Costar3915)中,在每孔100μl体积中,进行典型的PAI-1抑制试验。包括测试化合物、活性PAI-1、丝氨酸蛋白酶和生色肽的所有组分在试验缓冲液(50mMTris-HClpH7.5,含有150mMNaCl,0.01%Tween80和0.1mg/ml无脂肪酸BSA)中稀释。在每个孔中,将60μl试验缓冲液与10μl10倍浓缩的测试化合物和10μl10倍浓缩的活性人PAI-1蛋白(重组非糖基化人PAI-1,Roche批次#10_02,在大肠杆菌中作为N-末端6×His标记的融合蛋白生产,1μg/ml;或重组糖基化人PAI-1,MolecularInnovations产品#GLYHPAI-A,在昆虫细胞中产生,0.25μg/ml)混合。在37℃下孵育90分钟后,加入10μl10倍浓缩的丝氨酸蛋白酶(rPA=tPA缺失变体BM06.022,Roche批号#PZ0606P064,批次#G366,150ng/ml)。在37℃下孵育30分钟后,加入10μl10倍浓缩的生色肽(SpectrofluortPA,AmericanDiagnostica产品#444F,100μM)。在37℃再孵育2小时前和后,立即用荧光读板器(在358nm下激发,在440nm下发射)测量每个孔中的荧光。从t=2小时的荧光减去t=0小时的荧光的差,计算荧光强度的净增加。包括不含测试化合物的对照反应来定义该试验的动态范围。使用丝氨酸蛋白酶和使用活性PAI-1蛋白的反应代表下限(0%rPA活性,100%PAI-1活性);使用丝氨酸蛋白酶但不含PAI-1蛋白的反应代表上限(100%rPA活性,0%PAI-1活性)。
Claims (21)
1.多亚基结构的亚基的结合结构域和一个生物活性实体的缀合物用于将生物活性实体靶向递送至多亚基结构的用途。
2.根据权利要求1的用途,其特征在于,亚基的结合结构域可以可逆地与多亚基结构域结合和自多亚基结构解离。
3.根据权利要求1至2任一项的用途,其特征在于,结合结构域来自的亚基是多亚基结构的第二大亚基或多亚基结构的最小亚基。
4.根据权利要求1至3任一项的用途,其特征在于,多亚基结构是二亚基结构或三亚基结构或四亚基结构。
5.根据权利要求1至4任一项的用途,其特征在于,多亚基结构是多亚基蛋白,其中至少所述亚基或全部单独亚基彼此非共价地结合。
6.根据权利要求1至5任一项的用途,其特征在于,生物活性实体是治疗活性多肽。
7.根据权利要求1至6任一项的用途,其特征在于,缀合物是重组缀合物。
8.根据权利要求1至7任一项的用途,其特征在于,缀合物在N-末端至C-末端方向包括生物活性实体和多亚基结构的亚基的结合结构域。
9.根据权利要求1至8任一项的用途,其特征在于,缀合物进一步包括抗体Fc-区。
10.根据权利要求1至9任一项的用途,其特征在于,多亚基结构的亚基的结合结构域是玻连蛋白的SMB结构域,而生物活性实体是PAI-1的反应中心环(RCL)。
11.根据权利要求1至10任一项的用途,其特征在于,缀合物在N-末端至C-末端方向包括玻连蛋白的SMB结构域和PAI-1的一个反应中心环(RCL)和抗体Fc-区。
12.一种用于将药物活性多肽靶向递送至其作用位点的方法,其特征在于,药物活性多肽的作用位点在多亚基蛋白上,并且一个药物活性多肽与多亚基蛋白的亚基的结合结构域缀合。
13.根据权利要求12的方法,其特征在于,亚基的结合结构域可以可逆地与多亚基蛋白结合和自多亚基蛋白解离。
14.根据权利要求12至13任一项的方法,其特征在于,亚基是多亚基蛋白的第二大亚基或多亚基蛋白的最小亚基。
15.根据权利要求12至14任一项的方法,其特征在于,多亚基蛋白是二亚基蛋白或三亚基蛋白或四亚基蛋白。
16.根据权利要求12至15任一项的方法,其特征在于,多亚基蛋白的至少所述亚基或全部单独亚基彼此非共价地结合。
17.根据权利要求12至16任一项的方法,其特征在于,缀合物是重组缀合物。
18.根据权利要求12至17任一项的方法,其特征在于,缀合物在N-末端至C-末端方向包括药物活性多肽和多亚基结构的亚基的结合结构域。
19.根据权利要求12至18任一项的方法,其特征在于,缀合物进一步包括抗体Fc-区。
20.根据权利要求12至19任一项的方法,其特征在于,多亚基结构的亚基的结合结构域是玻连蛋白的SMB结构域,而药物活性多肽是PAI-1的反应中心环(RCL)。
21.根据权利要求12至20任一项的方法,其特征在于,缀合物在N-末端至C-末端方向包括玻连蛋白的SMB结构域和PAI-1的一个反应中心环(RCL)和抗体Fc-区。
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Citations (2)
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EP2906237B1 (en) | Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs |
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Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160720 |
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REG | Reference to a national code |
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