CN103391787A - uPAR拮抗剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的抑制剂。所产生的抑制剂是二价uPAR配体，这些配体含有通过支架连接的不同构型的细胞外蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和细胞外基质蛋白玻连蛋白(VN)的受体结合域。本发明还涉及用作药物(具体地用于治疗癌症)和诊断目的的上述分子。
Description
技术领域
本发明涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)抑制剂。所产生的抑制剂是二价uPAR配体，该配体含有通过支架连接的不同构型的细胞外蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和细胞外基质蛋白玻连蛋白(VN)的受体结合域。这种抑制剂与uPAR的结合形成一种复合物，其中uPA和VN的结合位点同时被占据，因而有效地阻断该受体的蛋白水解活性和信号转导活性。
背景技术
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR，也称为CD87)是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚骨固定在质膜上的膜糖蛋白。大量的体外、体内和临床证据表明，uPAR在大范围的病理过程(包括肿瘤生长、浸润和转移、炎症疾病和病毒感染)中起着重要作用。因此，有效干扰uPAR功能的药物可为多种病理状态提供新的治疗方案。
uPAR在调节细胞外蛋白水解、细胞粘附、迁移、浸润和增殖中的活性，需要uPAR与其两个得到确认的配体(丝氨酸蛋白酶尿激酶(uPA)和细胞外基质(ECM)蛋白玻连蛋白(VN))之间的分子相互作用(Blasi&Carmeliet,2002；Smith&Marshall,2010)。uPA与uPAR的结合通过加速细胞表面纤溶酶原活化来促进细胞外蛋白水解，同时VN的结合迫使细胞粘附到ECM，从而通过p130Cas和ERK1/2信号转导通路的整联蛋白依赖性活化来增强迁移和增殖信号转导。已有人广泛地研究了体内uPA与uPAR之间相互作用的重要性，并且通常是利用多种特异性拮抗剂(包括抗体、重组蛋白、合成肽以及低分子量化合物)来确定。尽管有许多文献记载了与VN相互作用的重要性(Madsen等人，2007；Smith等人，2008)，即该相互作用对于uPAR信号转导活性是至关重要的，但对该体内相互作用的重要性尚没有论述。在使用过度表达不同的uPAR突变体的人癌细胞的肿瘤生长的异体移植小鼠模型中，作者近来已证明uPAR在加速肿瘤生长中的活性确实需要与VN的相互作用(制备中的文稿)，从而支持该相互作用确实是相关抗癌靶标的假设。
有数个国际专利申请公开了尿激酶受体的肽配体，例如WO01/17544。具体地，WO97/35969公开了能够与uPAR结合并且抑制整联蛋白与玻连蛋白结合的肽。该文献并未提及uPA结合。
另外，WO2008/073312涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体表位和由其获得的单克隆抗体。该文献公开了对尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)为特异性的抗体及其抗原结合片段、以及它们在治疗或预防癌症中的用途。具体地，该公开的抗体对uPAR上的特定表位是特异性的。
WO2005116077确定了对二元uPA-uPAR复合物、包含uPA-uPAR的三元复合物以及uPAR与例如整联蛋白的除uPA之外的蛋白的复合物为特异性的抗体或其它配体。这些抗体抑制uPA和uPAR的复合物与其它分子间的相互作用。这种抗体和其它配体是用于诊断和治疗方法，特别是针对癌症。
Tressler RJ等人(APMIS.1999年1月；107(1):168-73)公开了基于生长因子结构域的人和鼠尿激酶的尿激酶受体拮抗剂。这种拮抗剂显示对它们的同源受体具有亚纳摩尔级亲和力。通过制备与人IgG恒定区的结合体而对这些分子作进一步的修饰，由此产生亲和力高且体内半衰期长的分子。通过噬菌体展示和肽类似物合成的组合已获得较小的肽抑制剂。所有这些分子抑制uPA的生长因子结构域与uPA受体的结合并且增强uPA受体与玻连蛋白的结合。
为了论述在疾病状态下体内uPAR:VN相互作用的重要性并且为了将此知识转化到临床上，需要强效和特异性的药物。本发明描述了uPAR:VN拮抗剂的工程改造、表达、纯化和性质，该拮抗剂的效力是目前可获得抑制剂的大约1000倍。
发明内容
本发明涉及新型尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)抑制剂的概念、结构和验证。所形成的抑制剂分子(称为uPAR-锁和uPAR-锁V2，也称为uPAR-锁分子)是二价uPAR配体，该配体含有紧靠在常用支架上的细胞外蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和细胞外基质蛋白玻连蛋白(VN)的受体结合域。这种抑制剂与uPAR的结合形成一种复合物，其中uPA和VN的结合位点同时被占据，因而有效地阻断该受体的蛋白水解活性和信号转导活性。
本发明的抑制剂分子代表了一种物理和功能性uPAR/VN相互作用和uPAR/uPA相互作用的强效拮抗剂。
非常有利的一点在于本发明的抑制剂分子可在不刺激VN与受体的结合的情况下将uPAR中的uPA结合袋作为标靶。事实上，大部分(如果不是全部)的与uPAR的uPA结合袋相结合的药物是uPAR:VN相互作用的激动剂，因此引起信号转导。相反，本发明的uPAR锁分子阻断信号转导。
另外，对于uPAR锁分子的使用不存在种特异性障碍。在对针对uPA:uPAR相互作用的药物进行评价时的主要问题在于这些药物表现出显著的种特异性，以至难以在异种移植模型中测试化合物的可靠性。可以通过改变效应子结构域的种类来源来简单地“设置”uPAR锁的特异性。
本发明的拮抗剂分子显示优异的药物特性，例如由于Fc标签所造成的长体内半衰期。另外，本发明的拮抗剂分子是由人序列构成，因此是非免疫原性的。
uPAR锁分子被设计成起阻断剂的作用。uPAR锁分子对uPAR的高亲和力和特异性以及Fc部分的存在使得该分子通过例如与合适的效应分子(如放射性核素、毒素等)的偶联而适用于以uPAR为标靶的诊断和/或治疗。
因此，本发明的拮抗剂分子具有多方面的临床应用。
因此本发明的目的是提供一种包含两个多肽的二聚体分子，该多肽是选自下组：
包含来自SEQ ID No.1的aa.11至aa.42的uPA的生长因子样结构域(GFD结构域)的第一多肽、或由来自uPA直向同源基因的相应区域所编码的多肽、或者其功能突变体或衍生物或类似物；以及
包含来自SEQ ID No.2的aa.5至aa.39的VN的生长调节素B结构域(SMB结构域)的第二多肽、或由来自VN直向同源基因的相应区域所编码的多肽、或者其功能突变体或衍生物或类似物；
其中，所述两个多肽通过分子支架相互连接。
优选地，在上述二聚体分子中：
第一多肽还包含来自SEQ ID No.2的aa.5至aa.39的SMB结构域、或由VN直向同源基因的相同区域所编码的多肽、或者其功能突变体或衍生物或类似物；并且
第二多肽还包含来自SEQ ID No.1的aa.11至aa.42的GFD结构域、或由uPA直向同源基因的相同区域所编码的多肽、或者其功能突变体或衍生物或类似物。
本发明的二聚体分子可通过本技术领域已知的任何方式获得。
衍生物可以是具有更长或更短的序列(即被修饰)以耐受酶类等的多肽。
在本发明的二聚体分子中，GFD区域优选地基本上由SEQ ID No.1的aa.8至aa.48组成，更优选地由SEQ ID No.1的aa.1至aa.48组成。
在本发明的二聚体分子中，SMB区域优选地由SEQ ID No.2的aa.1至aa.41组成。
在更优选的实施方式中，第一和第二多肽：
a)包含顺序为N末端-SMB结构域-GFD结构域-C末端的序列，并且
b)经由它们的C末端与分子支架连接。
更优选地，SMB结构域与GFD结构域通过第一接头肽相连接。
所述第一接头肽优选地基本上由SEQ ID No.3的序列组成。
在本发明的二聚体分子中，第一和第二多肽各自优选地通过第二接头肽与分子支架连接。
所述接头肽优选地基本上由SEQ ID No.4的序列组成。
本发明二聚体分子的分子支架优选地是免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、化学或肽接头。
在本发明的一个实施方式中，各Fc重链恒定区基本上具有以下序列：
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLXaaCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLXaaSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，其中Xaa可以是Y或T(SEQ ID No.5)。
在一个优选实施方式中，本发明二聚体分子基本上由SEQ ID No.6的序列的第一单体、和SEQ ID No.7的序列的第二单体组成。
在一个优选实施方式中，本发明二聚体分子的第一单体和第二单体具有SEQID No.8的序列。
本发明的另一个目的是提供应用于医疗、优选地用作癌症治疗药的上述二聚体分子。
在一个优选实施方式中，本发明的二聚体分子被偶联到治疗剂，其中该治疗剂优选地是放射性核素或毒素。
本发明的另一个目的是提供用于诊断方法、优选地用于诊断uPAR介导的疾病或肿瘤的上述二聚体分子。
本发明的其它目的是提供一种治疗癌症的方法，包括向需要的对象给予治疗有效量的本发明二聚体分子、包含本发明二聚体分子以及适当的稀释剂或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物还可以包含另一种治疗剂，优选放射性核素或毒素。
本发明另一个目的是提供用于诊断uPAR介导的疾病或肿瘤的试剂盒，该试剂盒包含本发明的二聚体分子。
发明详述
现在将通过参考下图的非限制性实施例来描述本发明。
图1.显示uPAR锁强制接近(forced-proximity)概念的草图。
可以通过受体与uPA的生长因子样结构域(GFD)的结合而竞争性地抑制uPAR在由uPA结合所介导的细胞外蛋白水解中的功能。可以利用VN的生长调节素B结构域(SMB)来竞争性地抑制uPAR在由VN结合所介导的信号转导中的功能。以下D1、D2和D3是uPAR结构域。
(A)GFD和SMB结构域作为竞争性uPAR拮抗剂
使用分离的GFD和SMB的混合物来阻断uPAR功能需要两个连续的一级分子间结合反应(1和2)，并且可根据首先与受体结合的是GFD还是SMB而采用两种途径(A和B)。三元的uPAR:GFD:SMB复合物的总体稳定性因此受体抑制的总体稳定性受到最薄弱的第二结合反应(在此情况下是SMB结合(KD=360nM))的限制。通过实验确定的不连续结合反应的平衡常数可从
等人的(Gardsvoll&Ploug,2007)中获知。
(B)含有GFD和SMB结构域(称为“uPAR锁”)的分子支架的强制接近工程改造
当GFD和SMB通过连接到常用支架(uPAR锁)而强制密切靠近时，受体抑制采用与结合反应相同的顺序。然而，重要的是第二结合反应(A2和B2)现在是零级(即浓度依赖性)分子内重组。因此，在此情况下受体抑制的有效性只受到最强的初始结合反应的限制，在此情况下是GFD部分的结合(预测为KD约为0.29nM)。因此，预计用合适支架所制备的uPAR锁将是比GFD与SMB的混合物强得多(>1000倍)的的uPAR功能拮抗剂。
(C)支架
可以设想出数种不同类型的用于制备uPAR锁的支架。可将GFD和SMB连接到形成共价二聚体的免疫球蛋白重链(Fc)的恒定区。还可用被修饰而形成异源二聚体的亮氨酸拉链序列对GFD和SMB结构域附加标签(Moll等,2001)。另外可以利用合适的接头区将GFD和SMB工程改造成单个多肽。
图2.三元uPAR:GFD:SMB复合物和人免疫球蛋白恒定区的晶体结构。
(A)是uPAR(灰色)、uPA的受体结合区(GFD，黑色)和VN的受体接合区(SMB，白色)之间的三元复合物的晶体结构。图中显示了GFD和SMB的N末端残基(Gln2和Pro8)以及GFD、SMB和uPAR的C末端残基(Lys48、Pro41、Asp274)。注意到GFD(Lys48)的C末端残基与SMB(Pro41)的C末端残基仅相距18.9
并且具有相同极性，极性的方向从受体朝外并且从被结构中uPARC的末端残基(Asp274)增亮的假定膜固定位点朝外。
(B)是二聚的人IgG重链恒定区(Fc)2的晶体结构。N末端残基(下图，Pro238)和C末端残基(上图，Ser444)。注意到，两个多肽的N末端残基以与结合到uPAR的GFD和SMB的C末端残基类似的方式相互间隔。将可被处理以利于异构二聚合(Ridgway等，1996)的两个残基(Tyr407和Thr366，黑色)示于该图的右边和左边。这些结构是来自于蛋白质数据库(PDB)条目3BT2和1H3X并且用MacPyMOL软件详细制作。
图3.(A)uPAR锁转染细胞的条件培养基显示uPAR结合活性。用条件培养基的连续稀释物对用可溶性uPAR(5nM)包被的96孔板进行培养，该培养基是来自于用GFD/FcK和SMB/FcH(即，uPAR-lock)共同转染的Phoenix细胞。利用检测人Fc的第二试剂对结合的uPAR进行检测。图中示出了与uPAR包被的孔的总结合(方块)、与非包被孔的非特异性结合(三角)和特异性结合(圆圈)。
(B)预计的uPAR锁结构和通过SDS-PAGE纯化的蛋白的外形的草图。uPAR锁是GFD/FcK(FcK=Fc“钮(Knob)”=携带Thr366Fc的Fc->Tyr取代)和SMB/FcH(FcH=Fc“孔(Hole)”=携带Tyr407的Fc->Thr取代)之间的共价(二硫键)异源二聚体。在非还原(左)和还原(右)条件下利用12%SDS-PAGE分离出3μg的纯化蛋白，用胶体考马斯染色对凝胶进行染色。
图4.uPAR锁的拮抗特性。
(A)Fc标记的uPAR以高亲和力与固定化的uPA结合。用递增浓度的用小鼠Fc标记的uPAR(uPAR/mFc)对固定化的uPA进行培养。在将结合的uPAR/mFc清洗后，利用生物素化的抗小鼠Fc抗体和用铕标记的链霉亲和素进行定量分析。注意到uPAR/mFc显示对固定化的uPA的特异性的高亲和力的结合。
(B)uPAR锁抑制uPAR与固定化的uPA的结合。在递增浓度的uPAR锁(菱形)或uPA(圆圈)存在下，用uPAR/mFc(1nM)对固定化的uPA进行培养。以上述方式对与固定化uPA结合的uPAR/mFc的量进行定量。注意到uPAR锁和uPA两者都是与固定化uPA相结合的uPAR/mFc的竞争性拮抗剂。
(C)uPAR与固定化VN的高亲和力结合需要uPA。用与递增浓度的uPAR混合的uPAR/mFc(5nM)对固定化VN进行培养。清洗后，以上述方式对结合的uPAR/mFc进行定量。注意到uPAR/Fc与固定化VN的结合需要uPA。
(D)uPAR锁抑制uPA致uPAR与VN的结合。用uPAR/mFc(1nM)、uPA(5nM)和递增浓度的uPAR锁(菱形)或uPA(圆圈)对固定化VN进行共同孵育。清洗后，以上述方式对结合的uPAR/mFc进行定量。注意到，与uPA相反，uPAR锁是uPAR与固定化VN的结合的拮抗剂。
图5.uPAR锁特异性地抑制uPAR介导的对VN的细胞粘附。在50nM uPAR锁存在或不存在的情况下将模拟转染的293/uPART54A细胞接种(20.000/孔)到用VN包被的96孔的E板中。通过在实时细胞分析仪(RTCA)中每两分钟一次测定阻抗(细胞指数)达3小时，而对细胞粘附进行定量分析。当基底细胞粘附(由αvβ5整联蛋白介导，(Madsen等人，2007))达到稳定状态时，向各孔中添加uPA直至最终浓度为10nM以引起uPART54A与VN结合并且继续记录。注意到uPAR锁完全抑制了uPA致293/uPART54A细胞的细胞粘附增长(在添加uPA之后对曲线进行比较)。uPAR锁不影响整联蛋白介导的粘附(在添加uPA之前对曲线进行比较)并且uPA不调节用空pcDNA5/FRT-TO载体(293/模拟)转染的细胞的粘附。
图6.(A)uPAR锁和对照突变体的草图。如上所述，uPAR锁是在Fc标记的GFD和SMB结构域之间的异源二聚体。GFD/GFD和SMB/SMB杂合体以与uPAR锁相同的方式构成，但在两个多肽上具有GFD或SMB结构域。对于一些实验使用GFD/GFD与SMB/SMB的混合物，因为其具有与uPAR锁相同的结构域组成，但GFD和SMB结构域位于独立的支架上。
(B)uPAR锁和对照蛋白的物理外形。在非还原(左)和还原(右)条件下利用10%SDS-PAGE分离出3μg的纯化蛋白，用胶体考马斯染色对凝胶进行染色。
(C)使递增浓度的uPAR锁(圆圈)、GFD/GFD(方块)、SMB/SMB(头朝上的三角形)和GFD/GFD+SMB/SMB(头朝下的三角形)与固定化的uPAR结合。利用检测人Fc的第二试剂对结合的蛋白进行检测。注意到在使用uPAR锁时观察到最强的结合。
(D)uPAR锁和对照蛋白对uPAR/mFc与固定化uPA的结合的抑制。用uPAR/mFc(1nM)与递增浓度的uPAR锁的混合物对固定化uPA进行培养，用图4B中所示的测定对结合的uPAR/mFc进行定量分析。注意到含有GFD结构域的所有制剂都起到竞争性uPAR/uPA相互作用拮抗剂的作用。
图7.uPAR锁对uPAR介导的针对VN的细胞粘附的抑制活性需要GFD与SMB之间的强制接近。
在uPAR-lock(红色)、GFD/GFD(黄色)、SMB/SMB或GFD/GFD+SMB/SMB(蓝色)存在或不存在的情况下，将293/uPAR(A)和293/uPART54A(B)细胞(20.000/孔)接种在VN包被的96孔E板中并使其粘附。在接种两小时后，向孔中添加uPA至10nM，再继续进行2小时的细胞粘附测定。注意到uPAR锁抑制uPA非依赖性的uPAR介导的针对VN的细胞粘附(组图7A中，在添加uPA之前对红色与黑色曲线进行比较)以及uPA诱导的粘附(在组图7A和7B中，在添加uPA之后对红色与黑色曲线进行比较)。相反，GFD/GFD和GFD/GFD+SMB/SMB都是uPAR介导的VN粘附的强激动剂(组图7A和7B中，在添加uPA之前对黄色和绿色曲线与黑色曲线进行比较)。SMB/SMB大部分无效。
图8.uPAR锁抑制uPAR介导的细胞迁移并且需要GFD和SMB之间的强制接近。将293/uPAR细胞接种在含有含血清的完全培养基中的12孔板中，使其粘附一夜。次日用不含有uPAR锁(左)或者含有uPAR锁(中)或GFD/GFD+SMB/SMB(均为20nM，右)的完全培养基代替原培养基并转移到延时显微镜下。如前所述(Madsen等人，2007)记录随机细胞迁移，通过人工细胞跟踪利用ImageJ软件进行定量分析。各点代表单个细胞。图中示出了平均迁移速度(+/-95%置信区间)。通过非参数分析对数据进行分析并进行校正以便用于多个比较(***P<0.001、**P<0.01、以及ns P>0.05)。注意到uPAR锁显著地抑制293/uPAR细胞的迁移。
图9.同源二聚体uPAR锁变体的抑制活性。(A)显示在单条多肽链中含有GFD和SMB结构域的同源二聚体uPAR锁变体的结构的草画。如上所示，uPAR锁是二硫键连接的异源二聚体，其中GFD和SMB位于两个不同的多肽上并且用含钮和孔变体的人Fc恒定区标记以有利于异构二聚合。相反，GFD-SMB/mFc和SMB-GFD/mFc是在同一多肽链上同时含有GFD和SMB结构域的同源二聚体。(B)将表达人uPAR的293细胞接种在包被有VN的96孔E板上，并转移到实时细胞分析仪(RTCA，xCELLigence，SP罗氏公司(SP Roche Corp.))中。以有规律间隔记录电抗阻(称为细胞指数，CI)，该电阻抗是细胞粘附的衡量尺度。当CI达到稳定状态时，表示细胞完全粘附，向各孔中加入3倍稀释曲线的SMB-GFD/mFc直至图中所示的最终浓度。将E板返回至分析仪中并继续以有规律间隔测定阻抗。组图C中添加抑制剂的时间点(T=0)和用于计算剂量反应曲线的时间点(T=1h)都用垂直点线表示。这些曲线显示作为时间(X轴)的函数的归一化细胞指数(NCI,Y-轴)。将所有细胞指数归一化至即将添加抑制剂前所测定的细胞指数。(C)为了测定IC50值，在添加试剂后1小时所测定的NCI是根据在相同时间点经载体处理的细胞的NCI%而计算(ΔNCI,Y轴)，并根据抑制剂浓度(X轴)变化而作图。利用Prism5软件拟合S型剂量反应曲线(可变斜率)，并且显示这些曲线的衍生的IC50值。
图10.uPAR锁V2活性和原理的证明(A)显示异源二聚体uPAR锁和异源二聚体uPAR锁V2、以及其在SMB结构域中携带单个氨基酸取代(D22A)的变体的结构的草图，其中所述取代减弱了此结构域与uPAR的相互作用(Okumura Y等人，JBiol Chem2002)。uPAR锁V2与图9A中所示的SMB-GFD/mFc相同，唯独除了uPAR锁V2中的恒定区(Fc)是从人IgG中获得。(B)将表达人uPAR的293细胞接种在包被VN(1-66)/FcRAD的96孔E板中，并转移到实时细胞分析仪(RTCA，xCELLigence，SP罗氏公司(SP Roche Corp.))中。以uPAR锁和uPAR锁V2的稀释曲线处理细胞，以如图9所示方式计算剂量反应曲线。(C)使用D22A取代的uPAR锁V2变体实施与组图B相同的实验。应注意这些变体刺激粘附。
图11.通过uPAR锁V2抑制肿瘤体内生长。uPAR锁V2对前列腺癌体内生长的影响。经皮下途径对雄性Balb C nu/nu小鼠接种(1×106)PC-3细胞。经腹腔内途径用载剂(PBS)、10.0mg/kg对照小鼠免疫球蛋白或uPAR锁V2处理动物。每周对肿瘤测量2次，以“材料和方法”中所描述的方式测定肿瘤体积。与对照的显著性差异用星号表示(*P<.05,**P<.01以及***P<.001)。
图12.uPAR锁V2降低PC-3肿瘤细胞增殖并且促进体内细胞凋亡。
对雄性无胸腺nu/nu小鼠皮下接种PC-3细胞，以如下方式处理：每周2次经腹腔内途径注射PBS或10.0mg/kg的uPAR锁V2。在异种移植8周后，收集肿瘤并以“材料和方法”节中所描述的方式进行免疫组化分析(组图A)。图中示出Ki-67和半胱天冬蛋白酶3染色并且用Dapi对细胞核进行复染色。组图B中示出了对数据的定量分析。
图13.采用uPAR锁的肿瘤靶向
向携带PC-3肿瘤的小鼠注射Alexa488标记的uPAR锁V2或Alexa488标记的小鼠IgG，24小时后切除肿瘤并利用荧光显微镜进行分析。在从用经标记的uPAR锁V2注射的动物中所取出的肿瘤中可以观察到明显的荧光区域(右图中画出的区域)，而在从用标记的鼠IgG处理的小鼠中所取出的肿瘤中并未发现类似区域。显示代表性的显微照片。
实验步骤
uPA、VN和uPAR的氨基酸序列
西文草体表示的是具有单个肽(Met-20-Gly-1)的人uPA的氨基酸序列，西文粗体表示的是成熟蛋白(Ser1–Leu411)，粗体/下划线表示的是与uPAR结合的生长因子样结构域(GFD,Ser1–Lys48)：
西文草体表示的是具有单个肽(Met-19–Ala-1)的人VN的氨基酸序列，西文粗体表示的是成熟蛋白(Asp1–Leu459)，粗体/下划线表示的是与uPAR结合的生长调节素B结构域(SMB,Asp1–Pro41)：
西文草体表示的是具有单个肽(Met-22–Gly-1)的人uPAR的氨基酸序列，西文草体和下划线表示的是添加与Gly283连接的糖脂膜锚定物后在合成期间所去除的C末端肽(Ala284–Thr313)，粗体表示的是成熟蛋白(Leu1–Gly283)：
表达载体构建
用于Fc标记SMB和GFD的表达载体是基于pFRT/TO-Fc质粒(Madsen等人，2007)，但导入许多修饰以促进不同编码区的改组以及提高蛋白产率并且允许通过特异性蛋白酶切割从重组蛋白中去除Fc标记。首先，通过定点突变利用寡核苷酸dXu/dXd破坏位于Fc编码区的载体序列下游的XhoI限制性位点。其次，将通过对寡核苷酸PreF/PreR进行退火所制备的编码PreScission蛋白酶的切割序列的接头插入到位于信号肽/Fc连接处的XhoI位点。为了去除存在于构建体Fc区中的内含子(发现这可以提高重组蛋白质的产率)，而将载体转移到CHO细胞中，提取RNA、逆转录、利用寡核苷酸hVNukpn/FcNr扩增cDNA。PCR产物用Kpn1/NotI消化并且用于取代产生pFRT/TO-Fc的亲本载体的相应片段。为了瞬时蛋白表达，将Fc盒经KpnI/NotI转移至产生pN1-Fc的pEGFP-N1载体(克隆泰克公司(Clontech Inc.))中。通过定点突变利用寡核苷酸对FcKnobF/FcKnobR和FcHoleF/FcHoleR将钮(Knob)和孔(hole)突变(T366Y和Y407T,(Ridgway等人，1996))导入到Fc区中，形成载体pN1-FcK和pN1-FcH。编码信号肽(阴性氨基酸是指信号肽序列)和VN的SMB结构域(Met-19至Pro41，
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKP(SEQ ID No.10的aa1-60)，西文草体所表示的信号肽是通过利用寡核苷酸hVNukpn/SMBRV2以及pN1-FcK和pN1-FcH中的克隆的KpnI/XhoI扩增VN cDNA而形成。编码信号肽和uPA中GFD结构域(氨基酸Met-20至Lys48，
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(SEQ ID No.9的aa1-68)(其中草体表示信号肽)的序列是通过利用寡核苷酸ATFkpnF/GFDRV来扩增人uPA cDNA而产生，并且以SMB所述的方式被克隆。此克隆策略形成由GFD(残基1-48，(SEQ ID No.1))或SMB(残基1-41，(SEQ ID No.2))所构成的成熟融合蛋白，该GFD或SMB通过GSGLELEVLFQGPIE(SEQ ID No.4)接头与人IgG1的铰链区和Fc区相连。通过用寡核苷酸URfSK/uPARXd扩增人uPAR cDNA并将产物KpnI/XhoI克隆到pFRT/TO-Fc中，而形成用于Fc标记的uPAR的表达载体。用于用鼠免疫球蛋白重链恒定区(mFc)标记的uPAR的表达载体，是通过组装(uPAR cDNA，用URfSK/UpreR2D扩增，用KpnI/XhoI消化)和pEGFP-N1(经消化的KpnI/XhoI)中的IgG1cDNA(克隆IRAVp968B035D，获自imaGenes GmbH，用mFcU/mFcD扩增，用XhoI/NotI消化)而形成。所得到的成熟嵌合蛋白(uPAR/mFc)是由人uPAR残基1-277、LEVLFQGPLEAGAG(SEQ ID No.36)接头和小鼠免疫球重链的氨基酸216-441(根据(Adetugbo,1978)编号)组成。
所有编码区域的预测序列是通过测序而确定。
寡核苷酸序列：
dXu 5’-gtaaatgagcggccgcgtcgagtctagaggg-3’(SEQ ID No.12)
dXd 5’-ccctctagactcgacgcggccgctcattta-3’(SEQ ID No.13)
PreF 5’-tcgagctggaagttctgttccaggggccca-3’(SEQ ID No.14)
PreR 5’-agctacccggggaccttgtcttgaaggtcg-3’(SEQ ID No.15)
hVNukpn 5’-cggggtaccatggcacccctgaga-3’(SEQ ID No.16)
FcNr 5’-ttgcggccgctcatttacccggagacag-3’(SEQ ID No.17)
FcKnobF 5’-aaccaggtcagcctgtactgcctggtcaaaggc-3’(SEQ ID No.18)
FcKnobR 5’-gcctttgaccaggcagtacaggctgacctggtt-3’(SEQ ID No.19)
FcHoleF 5’-ggctccttcttcctcaccagcaagctcaccgtg-3’(SEQ ID No.20)
FcHoleR 5’-cacggtgagcttgctggtgaggaagaaggagcc-3’(SEQ ID No.21)
ATFkpnF 5’-gcggtacccgccaccatgagagccctgctggcgcgc-3’(SEQ ID No.22)
GFDRV 5’-gcctcgagtcctgatccttttgacttatctatttcaca-3’(SEQ ID No.23)
SMBRV2 5’-gcctcgagtcctgatccgggcttgcactcagccgt-3’(SEQ ID No.24)
URfSK 5’-gcgtcgacggtacccgccaccatgggtcacccgccgctgctg-3’(SEQ ID No.25)
uPARXd 5’-agcctcgagcccactgcggtactggacatc-3’(SEQ ID No.26)
UpreR2D
5’-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccac-3’(SEQ IDNo.27)
mFcU 5’-gcctcgaggcaggagcaggacccagggattgtggttgtaa-3’(SEQ ID No.28)
mFcD 5’-gcgcggccgctcatttaccaggagagtg-3’(SEQ ID No.29)
uPAR锁的组合物
以上述方式构建的uPAR锁的组合物是一种分子，具体地是二硫键连接的异源二聚体，由两种多肽GFD/Fc和SMB/FcH构成，具有以下氨基酸组成(N至C末端，IUPAC)：
GFD/FcK
由以下构成：
草体：人工接头区**以及
*更短和更长的uPA片段也可起作用。包含氨基酸11-42的序列(下划线表示)可以代表最小功能序列。
**不同长度和序列的接头区可起同样好或更好的作用。最小长度可以是零(即没有接头)。
***在此实验中应用“调节钮”置换来提高在表达期间所形成的异源二聚体的量，但预计对异源二聚体的抑制性质没有任何影响。
SMB/FcH
由以下构成：
草体：人工接头区**以及
粗体西文草体：含有“孔”取代(T366Y，下划线表示)***的人免疫球蛋白(IgG)铰链区和恒定区(Fc)
*更短和更长的VN片段也可起作用。含有氨基酸5-39的序列(下划线表示)可代表最小功能序列。
**不同长度和序列的接头区可有同样好或者更好的作用。最小长度可以是零(即没有接头)。
***该实验中采用的“孔”取代提高表达期间所形成异源二聚体的量，但预测对异源二聚体的抑制性质无任何影响。
重组蛋白的表达和纯化
Phoenix细胞(半融合的10cm板)用预加温的无血清DMEM清洗一次，加入8ml的OptiMEM(英杰公司(Invitrogen))。为得到uPAR锁(即GFD/SMB-FcK/H)，根据生产商说明书使用Fugene转染试剂(罗氏公司(Roche))用pN1-GFD/FcK与pN1-SMB/FcH的混合物(3+3μg/10板)转染培养物。分别通过共转染pN1-GFD/hFcK+pN1-GFD/hFcH和pN1-SMB/hFcK+pN1-SMB/hFcH来表达对照蛋白GFD/GFD和SMB/SMB。将转染的培养物保留6-8天，之后收集上清液并过滤(0.45μm)。将蛋白质在蛋白质A琼脂糖上纯化，用0.1M pH=2.8的甘氨酸、0.5M NaCl洗脱并且用PBS充分透析。
体外结合试验
4℃下将96孔免疫板(NUNC公司MaxiSorb，blackwell)用稀释于包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH=9.6)中的前uPA或VN(100μl,10nM)包被。将平板用清洗缓冲液(含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(PBS-T))清洗，在室温下用封闭缓冲液(含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS)对非特异性结合位点封闭(0.15ml/孔)1-2小时。用PBS-T清洗后，在稀释缓冲液中所制备的激动剂和待测试拮抗剂存在或不存在下用uPAR/mFc(1nM)对各孔进行培养。在室温下进行1-2小时结合，用清洗缓冲液将板清洗3次。通过顺序培养对结合的uPAR/mFc用生物素化的羊抗鼠Fc抗体(西格玛公司(Sigma))和Eu3+标记的链霉亲和素(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))进行检测。采用DELFIA实验方案用Envision Xcite微孔板检测仪(帕金埃尔默公司((Perkin Elmer))通过解离强化的时间分辨荧光测定法对结合的Eu3+进行定量分析。
细胞系
通过含有野生型人uPAR cDNA(293/uPAR)、含有Thr54Ala取代(293/uPART54A)的pcDNA5/FRT-TO表达载体或者如前详述的空表达载体(293/模拟)(Madsen等人，2007)的HEK293Flp-In T-Rex细胞(英杰公司(Invitrogen Corp.))的稳定转染，而形成293/uPAR、293/uPART54A和293/模拟细胞系。
粘附测定
将细胞接种在E板(罗氏公司(Roche))的孔中，使用实时细胞分析仪(RTCA，xCELLigence SP，罗氏公司)以规则间隔监测细胞粘附。RTCA系统测定结合在组织培养物96孔E板的底部的交叉指形微电极的电阻抗。在电极顶部存在细胞影响电极/溶液界面的局部离子环境，从而导致增加电阻抗。细胞粘附越强，电阻抗的增加就越大。
迁移检测
用配备有控制CO2和温度的培养室的倒置奥林巴斯IX80显微镜(OKOlab)在37℃、5%CO2下进行延时活细胞成像。将细胞以1×105个细胞/孔的融合率覆盖在12孔板(Nunc公司)中。在含血清生长培养基中进行延时成像。通过10×(uPlanFLN10×Ph1,N.A.0.30；奥林巴斯(Olympus))物镜观察细胞，每5分钟对细胞进行一次拍照达5小时。采集系统包括数码相机(滨松Orca-ER公司(Hamamatsu Orca-ER)和系统控制软件奥林巴斯ScanR(System Control Software Olympus ScanR)。用ImageJ1.42q调节图像的亮度/对比度、光滑度和清晰度并且始终应用于整个图像。利用插入式“手动追踪”用ImageJ1.42q对细胞迁移速度进行定量分析。在实验中，跟踪随机选择的细胞并且计算这些细胞在整个实验中的平均迁移速度。
SMB-GFD/mFc和GFD-SMB/mFc的克隆
通过用取自uPAR/mFc表达载体的小鼠Fc区取代(Xho1/Not1)pFRT/TO-Fc的人Fc区，而产生用小鼠IgG恒定区(pFRT/TO-mFc)标记的重组蛋白的表达载体。为了形成GFD-SMB嵌合体，用寡核苷酸ATFkpnF/GLINKR扩增人uPA cDNA并且用寡核苷酸SLINKF/SMBRV2扩增人VN cDNA。纯化这两种PCR产物并且用寡核苷酸ATFkpnF/SMBRV2共同扩增。为了形成GFD-SMB嵌合体，用寡核苷酸hVnUkpn/SLINKR扩增人VN cDNA并且用寡核苷酸GLINKF/GFDRV扩增人uPAcDNA。纯化这两种PCR产物并且用寡核苷酸VnUkpn/GFDRV共同扩增。用Kpn1/Xho1把GFD-SMB和SMB-GFD嵌合体克隆到pFRT/TO-mFc中以形成编码GFD-SMB/mFc和SMB-GFD/mFc的表达载体。通过用Kpn1/Xho1将SMB-GFD嵌合体克隆到pFRT/TO-Fc中，而形成对用人Fc标记的SMB-GFD嵌合体进行编码的表达载体(SMB-GFD/Fc,uPAR-锁V2)。
重组蛋白的表达和纯化
将pFRT/TO-GFD-SMB/mFc、pFRT/TO-SMB-GFD/mFc和pFRT/TO-SMB-GFD/Fc表达载体转染到CHO Flp-In细胞(Invitrogen(英杰)公司)中,以如前所述的方式在无血清条件下表达该重组蛋白(Madsen等人，JCB2007)。通过标准蛋白A亲和层析法将从条件培养基中纯化出重组嵌合体，用PBS充分透析。
寡核苷酸序列：
异种移植实验
从查尔斯河公司(Charles River)获得6周龄的雄性Balb C nu/nu小鼠。在接种前，将在含血清培养基中生长的PC-3细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗，通过胰蛋白酶消化收集，以200rpm离心7分钟。将细胞(1.0×106)重新悬浮于200μl的含20%基质胶的PBS中。通过给小鼠腹膜内(i.p)内注射三溴乙醇而实施麻醉，在麻醉小鼠的右侧用26号针皮下(s.c.)接种1.0×106个细胞。在异种移植5天后，将动物随机分入用载体(n=5,PBS)、非免疫小鼠IgG1(n=5、10mg/kg)每周两次腹膜内处理动物的2个对照组，以及用uPAR锁V2(n=5、10mg/kg)处理动物的实验组。每周两次监测肿瘤发生和生长达7周。根据以下公式确定肿瘤体积：肿瘤体积＝较短直径2×较长直径/2。将没有发生可触摸肿瘤的两只小鼠(一个来自IgG对照组，一个来自uPAR-锁V2组)从分析中排除。在PBS和IgG处理的动物的肿瘤生长之间无显著性差异(数据未示出)，收集来自这些小鼠的数据(n=9)用于与实验uPAR-锁V2组(n=4)的比较。以均值±SE的方式对数据进行分析，通过未配对、双尾、等方差、t检验对实验数据进行分析。
GFD-SMB/mFc、SMB-GFD/mFc和MB-GFD/hFc(uPAR-锁V2)的比较
上述构建体的组合物是一种分子，具体地是二硫键连接的由两个多肽GFD-SMB/mFc或SMB-GFD/mFc或SMB-GFD/hFc所构成的异源二聚体，具有以下的氨基酸组成(N至C末端，IUPAC)：
GFD-SMB/mFc是由人uPA的残基1-49(GFD，纯文本)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID No.3)接头(用下划线表示)、人VN的残基2-41(SMB，)、GSGLEAGAG(SEQ ID No.34的aa104-112)接头(用下划线草体 表示)和来自小鼠免疫球蛋白的重链恒定区(mFc,
组成。
SMB-GFD/mFc
SMB-GFD/mFc是由人VN的残基1-41(SMB，纯文本)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID No.3)接头(用下划线表示)、人uPA的残基8-48(GFD，
)、GSGLEAGAG(SEQ ID No.34的aa104-112)接头
和来自小鼠免疫球蛋白的重链恒定区(mFc,)组成。
GFD-SMB/hFc(uPAR锁V2)是由人VN*的残基1-41(SMB，纯文本)(对应于SEQ ID No.2)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID No.3)接头**(用下划线表示)、人uPA***的残基8-48(GFD，
)(对应于SEQ ID No.1的aa8-48)、GSGLELEVLFQGPIE(SEQ ID No.4)接头**(用下划线西文草体表示)和来自小人免疫球蛋白的重链恒定区(hFc，西文草体)组成。
*更短和更长的VN片段也可起作用。由氨基酸5-39的序列(灰色阴影)组成的序列可代表最小功能序列。
**不同长度和序列的接头区可起同样好或更好的作用。最小长度可以是零(即没有接头)。
***更短和更长的uPA片段也可起作用。包含氨基酸11-42的序列(用粗体和下划线表示)可以代表最小功能序列。
免疫组织化学分析
对于免疫组织化学分析，切除原发性肿瘤，在4%多聚甲醛(福尔马林)中固定，埋在最佳切削温度(OCT)树脂(Killik，BIO-OPTICA公司)中。组织块以8μm切片，固定在带正电荷的载玻片上用于免疫染色。在Ki-67染色中，在4℃下用丙酮将切片保温1分钟。用PBS清洗载玻片，接着在培养前缓冲液(含6%BSA和10%FBS的PBS)中在室温下封闭1小时。将玻片用Ki-67抗体(以1:500稀释)在4℃下保温一夜，接着用PBS清洗。在检测中，使用抗兔Cy3(1:200)和DAPI(1:2500)。玻片用Vectamount AQ固定。在凋亡细胞的检测中，用80%乙醇在室温下将切片保温1分钟。用PBS清洗玻片，接着在培养前缓冲液中在室温下封闭1小时。在4℃下进行一夜的一级抗体(切割的半胱天冬蛋白酶，1:200)培养，接着用PBS清洗。对Ki-67染色的玻片进行检测。在细胞增殖和凋亡的定量分析中，分别以10倍的放大倍数对各动物共分析24个切片。数据是以每个视野中阳性细胞的平均数来表示。
在肿瘤成像实验中，根据生产商说明书用Alexa488染料标记uPAR-lockV2和小鼠IgG。携带PC-3肿瘤的小鼠(异种移植后8周)经腹腔内途径注射50μg标记蛋白，24小时后收集肿瘤。以免疫组织化学分析中所述的方式处理肿瘤组织。
结果
uPAR锁的基本原理
uPA的生长因子样结构域(GFD)和VN的生长调节素B结构域(SMB)含有完整分子的所有uPAR结合决定簇，但缺乏它们的细胞内蛋白水解和细胞信号转导的生物活性。因此，这些结构域分别是uPAR:uPA和uPAR:VN相互作用的特异性竞争性拮抗剂。对uPA和VN介导的uPAR生物活性的完全抑制需要占据受体的两个结合位点，这可以用图1A所示的单独的GFD和SMB结构域来实现。抑制需要两个连续的一级分子间结合反应(1和2)，可以根据哪个配体先与受体结合来采用两个途径(A和B)。该方法的uPAR体内抑制的有效性受到不同相互作用的亲和力的限制，因此受到可在体内达到及维持的GFD和SMB的浓度的限制。因为GFD和SMB结构域相当小，所以它们很可能从循环中被快速清除。因为SMB结构域对uPAR的亲和力(KD=360nM)比GFD与受体的亲和力(KD=0.29nM)弱大约1000倍(Gardsvoll&Ploug,2007)，所以此结构域的结合尤其可能限制此方法的有效性。
为了显著改善使用GFD和SMB阻断uPAR功能的有效性，作者做出以下假设：通过与普通支架相连接而使两个结构域强制接近，由此可得到一种相比单独结构域(图1B)更显著改善抑制特性的化合物(称为uPAR锁)。在uPAR锁中，因为GFD和SMB结构域位于普通支架上，所以抑制所必需的第二结合反应(A2和B2)现在为零级分子间重排反应(即，非浓度依赖性)。由于预测此第二结合反应的有效性比分子间结合反应高出几个数量级，因而uPAR锁的抑制活性将只受到初始结合(反应A1或B1)和支架设计的好坏的限制。因此，uPAR锁是比GFD更强的uPA拮抗剂(相似的结合速率，降低的解离速率)并且是比SMB强很多的VN拮抗剂(>1000倍)(相似的结合速率，显著降低的解离速率)。
GFD/SMB支架可以与图1C中所示方式不同的方式而形成。可将GFD和SMB结构域连接到免疫球蛋白重链恒定区(Fc)各分离的共价异源二聚体。所需的GFD/SMB支架也可使用形成类似亮氨酸拉链的二聚体的肽序列而形成。最后，GFD和SMB结构域可表达为含有合适接头的单个多肽。例如，在本研究中使用免疫球蛋白支架。更长或更短的GFD和SMB片段也可起作用。另外，GFD和SMB可从直向同源基因中获得。改变将GFD和SMB连接到支架的接头的长度和序列可进一步提高活性。也可导入改善uPAR结合的SMB和GFD中的突变。亮氨酸拉链和单个肽支架方法也适用。“uPAR锁”并非必须是基于GFD和SMB结构域。这些产生阻段的结构域中的一个或两个可被其它的uPAR结合结构域(如抗体片段)或肽所取代，所述其它结构域或肽在与uPA结合位点和/或VN结合位点相同或重叠的位点上与uPAR结合。
uPAR锁的构建
uPAR、uPA(ATF)的氨基末端片段和VN的生长调节素B结构域的三元复合物的晶体结构(Huai等人，2008)的检测表明uPA和VN的uPAR的肽骨架紧邻一些位置。具体地，uPA中的Lys48和VN中的Pro41仅相距大约
(图2A)。这些位置的uPA和VN肽骨架极性大致平行，从受体指向外部并远离膜锚定位置。将uPA和VN的残基1-48(即GFD)和1-41(即SMB)经由C末端连接到普通支架，因此预测形成有利于两个结构域与uPAR同时性或结构性结合的嵌合体。
为了将GFD和SMB连接到普通支架上，作者选择人IgG的恒定区(Fc)，因为这些与位于附近的两个N端形成稳定的二聚体(图2B)。对于GFD，作者构建了编码成熟多肽(称为GFD/Fc)的表达载体，该多肽是由以下部分构成：人uPA的氨基酸
1-48(SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(SEQ ID No.1))、含有PreScission蛋白酶切割位点的短接头区(GSGLELEVLFQGPIE(SEQ ID No.4))、和人IgG1免疫球蛋白重链的铰链区和恒定区
(PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No.5，其中位于150的Xaa是T，位于191的Xaa是Y))。相应的SMB/Fc多肽具有人VN的氨基酸1-41(DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKP(SEQ IDNo.2))和相同的接头和Fc区域(Fc区域除了钮和孔突变以外是相同的)。
为了有利于Fc标记GFD与SMB之间的异构二聚合，作者通过修饰Fc区域而携带如前所述的“钮”(T366Y,FcK)或“孔”(Y407T,FcH)取代基(Ridgway等人，1996)。在哺乳动物中共同表达嵌合蛋白GFD/FcK和SMB/FcH，产生主要(>90%)的产物GFD/FcK-SMB/FcH异源二聚体(即uPAR锁)以及少量的(总量<10%)(GFD/FcK)2和(SMB/FcH)2同源二聚体及GFD/FcK和SMB/FcH单体。
uPAR锁特异性地与uPAR结合
为了确定uPAR锁的受体结合活性，利用以等量的GFD/FcK和SMB/FcH表达载体进行共转染的Phoenix细胞的条件培养基的系列稀释物对经固定的可溶uPAR进行培养。清洗后，利用顺序培养用生物素化抗人Fc抗体和铕标记链霉亲和素对结合的uPAR锁进行检测。如图3A中所示，uPAR锁转染细胞的条件培养基确实具有特异性和剂量依赖性的uPAR结合活性。
uPAR锁的纯化
为了更好地描述uPAR锁的特征，通过标准蛋白A亲和层析法从转染细胞的条件培养基中纯化出蛋白。当在非还原条件下利用SDS-PAGE(图3B)进行分析时，uPAR锁具有～75kDa的表观分子量，这与从氨基酸组成中所预测的分子量非常一致。在还原条件下，观察到代表MB/FcH和GFD/FcK单体的两个主要肽(40和45kDa)。由于这两个肽之间的分子量存在小的差异，因而不可能可靠地估计异构二聚合的有效性。
uPAR锁是uPA/uPAR相互作用的竞争性拮抗剂
为了测试uPAR锁作为uPAR:uPA相互作用的拮抗剂的活性，作者采用结合测试，在该测试中让用小鼠Fc标记的纯化uPAR(uPAR/mFc)结合到固定的uPA(图4A)。在此测试中，uPAR/mFc以饱和方式并且以高亲和力与uPA结合。为了测定uPAR锁的拮抗剂特性，作者采用了将固定浓度的uPAR/mFc(5nM)与递增浓度的uPAR锁或uPA相混合的相同测试(图4B)。在此测试中，uPAR锁和uPA以非常相似的剂量依赖性(uPA IC50=0.21nM,uPAR锁IC50=0.31nM)抑制uPAR/mFc与固定的uPA的结合，并且记载了uPAR锁确实是uPAR:uPA相互作用的有效竞争性抑制剂。
uPAR锁是uPA/VN相互作用的强效拮抗剂
为了测试uPAR锁作为uPAR:VN相互作用的拮抗剂的活性，作者采用了结合试验，其中在uPA的存在下使uPAR/mFc与固定的VN相结合(图4C)。在此测试中，uPAR/mFc与固定的VN以uPA依赖性的方式以高亲和力与固定的VN结合。为了测试uPAR锁的活性，作者实施了实验，其中将固定浓度的uPAR/mFc(1nM)和过量的uPA(5nM)与递增浓度的PAR-lock或uPA相混合，以便进行比较(图4D)。在此测试中，uPAR锁是uPAR与固定VN结合的非常强效的抑制剂(IC50=0.22nM,95%置信区间为0.19–0.25nM)。这与uPA形成鲜明对比，其需要uPAR与VN结合(图4C)并且即使过量存在也不抑制明显的相互作用(图4C和图4D)。这些实验表明uPAR锁是uPAR:VN体外相互作用的强效拮抗剂。
uPAR锁是uPAR介导的对VN的细胞粘附的强效功能抑制剂
为了评估uPAR抑制活细胞中uPAR信号转导的活性，作者使用实时细胞分析仪(RTCA,xCELLigence SP,罗氏公司)通过阻抗测定对细胞针对VN包被孔的粘附进行了定量分析(图5)。在这些实验中，作者使用了表达条件uPAR突变(uPART54A,(Madsen等人，2007))的293细胞，该293细胞在uPA不存在下显示非常低的VN结合活性而在uPA存在下表现出完全活性。当把293/模拟和293/uPART54A细胞接种在VN上时，它们微弱地粘附到基质，正如细胞指数的时间依赖性增加并且在1-1.5个小时后到达稳定状态所表明。随后添加uPA导致293/uPART54A细胞的粘附快速明显的增加(Madsen等人，2007)，正如这里由细胞指数的显著增加(黑线)所证明。向对照细胞(293/模拟)中添加uPA并不促进细胞粘附(Madsen等人，2007)，因为这些不表达uPAR并且始终不引起细胞指数的显著变化(棕色线)。当在uPAR锁存在下接种293/uPART54A细胞(红线)时，初始阶段的细胞粘附与未经处理或模拟物转染的细胞相似，从而表明uPAR锁不影响基底整联蛋白介导的细胞粘附。重要的是，用uPAR锁处理几乎完全消除了由于添加uPA所引起的293/uPART54A细胞指数的增加。这些数据表明uPAR锁是uPA诱导、uPAR介导、针对VN的细胞粘附的强效且特异性的抑制剂。
GFD与SMB之间的强制接近有助于uPAR锁在拮抗uPA:uPAR相互作用中的活性
uPAR的锁构造的基本原理预测通过连接到普通支架而使GFD与SMB的结构域之间形成强制接近对于其强效拮抗活性是必需的。为了通过实验来证明此预测，作者构建了uPAR锁的变体，这些变体具有相同支架但携带如图6A所示的两个GFD结构域(称为GFD/GFD)或者两个SMB结构域(称为SMB/SMB)。将这些蛋白的SDS-PAGE凝胶示于图6B。将重组SMB/SMB和GFD/GFD蛋白以及这些蛋白(GFD/GFD+SMB/SMB)的1:1混合物与固定uPAR的结合，与uPAR锁与固定uPAR的结合进行了比较(图6C)。GFD/GFD与SMB/SMB的1:1混合物是特别好的对照，因为此样品具有与uPAR锁相同的GFD、SMB和支架结构域的定量组成，但GFD和SMB结构域位于单独的支架上。除了SMB/SMB外，所有的蛋白制剂都显示与uPAR的剂量依赖性结合，其中uPAR锁结合是最强的。这与GFD和“驱动”相互作用的uPAR之间的高亲和力相互作用的预测是一致的。与uPAR锁相比GFD/GFD+SMB/SMB混合物的结合较差的事实支持以下假设：uPAR锁上的SMB结构域使其与uPAR的相互作用稳定。另外，对相同的蛋白制剂测试了它们与uPAR/mFc对固定化uPA的结合的竞争中的活性。获得了非常相似的结果(图6D)。在该此测试中，GFD/GFD制剂比uPAR锁更具活性与以下事实一致：在相等浓度的uPAR锁(即GFD/SMB)和GFD/GFD中，后一种蛋白含有两倍数量的高亲和力uPAR结合域(即它是二价的同源二聚体)。
GFD和SMB之间的强制接近对于uPAR锁对uPAR介导的细胞粘附的功能性拮抗活性是必需的
为了确定GFD与SMB之间非常接近对于uPAR介导的细胞针对VN的粘附的抑制活性的重要性，作者测定了293/uPAR(图7A)和293/uPART54A(图7B)细胞粘附到固定VN的过程中的阻抗变化。在293/uPAR细胞中，与未处理细胞(黑线)相比uPAR锁(红线)减小基底细胞对VN的粘附，并且消除了对uPA的反应。在相同的细胞中，SMB/SMB(蓝线)基本上没有活性，而GFD/GFD(黄线)和GFD/GFD+SMB/SMB(绿线)显示拮抗活性。在293/uPART54A细胞中，uPAR锁无拮抗活性并且完全阻断uPA引起的细胞粘附。在这些细胞中，GFD/GFD嵌合体以及GFD/GFD+SMB/SMB混合物的拮抗作用甚至更加显著，并且SMB/SMB嵌合体没有活性。这些数据清楚地表明uPAR锁中的GFD和SMB结构域的紧密靠近负责分子在细胞对VN粘附中的uPAR信号传导并且对其是需要的。
GFD和SMB之间的强制接近对于uPAR锁对uPAR介导的细胞迁移的功能拮抗活性是必需的
在细胞粘附的下游，293细胞中的uPAR表达也刺激在血清包被表面上的随机细胞迁移(Madsen等人，2007)。一致地，作者发现uPAR锁高度地显著抑制293/uPAR细胞的基底迁移(图8)。此uPAR锁活性需要SMB与GFD结构域之间的强制接近。
uPAR锁V2
有可能产生含有在单个多肽中的SMB和GFD结构域的uPAR锁的变体，并且可能具有若干益处。第一，这些变体的制造较不复杂，因为仅需表达一条多肽。第二，当存在于单个多肽链中时SMB和GFD结构域的数量始终是相同的，从而防止不需要的非抑制性和/或激动剂变体的形成，如SMB/Fc和GFD/Fc，这两者以低水平存在于需要异构二聚合的uPAR锁制剂中。
考虑到此目的，我们构建了嵌合体，其中将SMB和GFD结构域工程改造入单个多肽链中并且加上C末端小鼠Fc标记。制备两种变体。第一种(SMB-GFD/mFc)是由N末端SMB结构域、接头、GFD结构域和C末端小鼠免疫球蛋白恒定区(mFc)构成。第二种(GFD-SMB/mFc)具有相同构成但使SMB和GFD结构域的相对位置颠倒。将示出这些分子的结构的草图示于图9A。这些同源二聚体蛋白在CHO细胞中被表达并且利用蛋白质A亲和层析法进行纯化。为了确定GFD-SMB/mFc和SMB-GFD/mFc的功能性抑制活性，我们测定了它们在抑制uPAR介导的针对VN的粘附中的有效性(图9，组图B和C)。正如从图9B可见，SMB-GFD/mFc嵌合体引起了表达uPAR的293细胞针对VN的粘附的快速剂量和时间依赖性降低。将用SMB-GFD/mFc、GFD-SMB/mFc和uPAR锁处理1小时的剂量反应曲线示于图9C，并且表明SMB-GFD/mFc嵌合体(IC50=6.3nM)的效力是uPAR锁(IC50=17nM)或GFD-SMB/mFc嵌合体(IC50=20nM)的大约3倍。因为这些试剂的制备是用于人用的目的，所以我们重新克隆了SMB-GFD嵌合体，使其具有人Fc标记并且将此化合物称为uPAR锁V2。这些数据表明可形成具有在相同多肽链中的SMB和GFD结构域的功能性uPAR锁变体，并且这些效应子结构域(即，SMB和GFD)的重组甚至可获得更强效的抑制剂。另外，实验记载了当形成uPAR锁样的嵌合体时允许存在很大程度的柔性。
正如从图9B和图9C所示实验中可见，由uPAR锁变体所产生的293/uPAR细胞对VN的粘附的最大抑制是不完全的，最大抑制为大约60%。此残留的细胞粘附可能是由整联蛋白介导的细胞对VN的粘附所引起，其不能被uPAR锁抑制。为了直接地解决此可能性，我们重复了粘附实验，在实验中用uPAR结合中具有完全活性的重组蛋白VN(1-66)/FcRAD代替VN包被(Madsen等人，JCB2007)，但由于VN的45RGD47序列中的单个氨基酸取代，因而在整联蛋白的结合中有缺陷。如图10B中可见，uPAR锁V2几乎完全抑制293/uPAR细胞粘附，而在uPAR锁事件中甚至在最高测试浓度下仍观察到残留粘附(约20%)。另外，uPAR锁V2(0.59nM)的IC50优于uPAR锁(2.3nM)的IC50。
综合这些数据表明uPAR锁V2优于uPAR锁。
概念的证明
预测uPAR锁和uPAR锁V2对uPAR功能的抑制需要SMB和GFD结构域对受体的暂时结合，在图7中对uPAR锁作了大量记载。为了以更好且结论性的方式证实此点，我们制作了SMB结构域中含有单个氨基酸取代的uPAR锁和uPAR锁V2的变体，已知该变体可阻断与uPAR的相互作用(Okumura Y等人，J BiolChem2002)。将这些变体(uPAR锁D22A和uPAR锁V2D22A)的结构域结构示于图10A，除了SMB结构域上的单个Asp22Ala取代外，其余与uPAR锁和uPAR锁V2的结构域相同。当在细胞粘附试验中测试生物活性时(图10C)，uPAR锁D22A和PAR锁V2D22A都没有抑制活性，而事实上却显示剂量依赖性的激动活性。总之，这些数据表明，单个支架上的功能性GFD和SMB结构域的存在是抑制uPAR功能的uPAR锁样抑制剂的基本要求。
uPAR锁V2抑制肿瘤体内生长
为了确定uPAR锁潜在的体内抗肿瘤活性，我们执行了使用前列腺癌异种移植模型的研究。在此模型中，将一百万个PC3细胞经皮下途径接种在雄性Balb Cnu/nu小鼠的右侧。通过腹膜内注射用uPAR锁V2对该异种移植物动物每两周处理1次，通过校准监测肿瘤的体积。如图11所示，用uPAR锁V2处理的动物显示与对照动物相比显著减小的肿瘤体积。经处理的动物显示了大约50%的肿瘤体积减小，这优于其他人使用抑制性抗uPAR抗体ATN-658所观察结果(Rabbani SA等人，Neoplasia2010)。
用uPAR锁处理的动物的PC-3肿瘤中细胞增殖的减少和的细胞凋亡的增加
为了研究在用uPAR锁处理的动物中PC-3肿瘤生长降低的生物原因，我们对取自异种移植8周后动物的肿瘤切片进行了免疫组织化学分析(图12)。为了评估肿瘤细胞增殖我们对增殖细胞抗原Ki-67进行染色，并且为了评估细胞凋亡我们对活化的(切断的)半胱天冬蛋白酶3进行染色。如图12A所示，正如由切断的半胱天冬蛋白酶3活性可证明，从用uPAR锁V2处理的小鼠中获得的肿瘤显示经历凋亡的细胞数显著增加，正如用Ki-67标记的，显示增殖细胞数显著减小。这些数据的定量分析示于图12B。用uPAR锁也得到相同结果。综合这些数据表明，uPAR锁通过促进凋亡并且减少细胞增殖来抑制肿瘤生长。
使用uPAR锁的肿瘤成像和药物递送
除了减少癌生长的直接活性之外，uPAR锁还可潜在地用于成像肿瘤和/或作为药物递送载体。为了直接地证明此可能性，我们用PC-3细胞对小鼠进行异种移植并且使原发性肿瘤在无任何药物介入的情况下生长8周。然后，我们经腹腔内途径向荷瘤小鼠注射50微克的Alexa488标记的uPAR锁V2或Alexa488标记的小鼠IgG。注射标记蛋白24小时后，将肿瘤切除、固定、包埋、切片，用显微镜检测肿瘤组织中的绿色荧光的存在。如图13所示，从用经标记uPAR锁注射的小鼠中获得的肿瘤显示有标记的荧光，而在接受标记的IgG的动物中未观察到相似荧光。用uPAR锁也得到相同结果。尽管这些区域的细胞特性仍然是未知的，但数据清楚地表明uPAR锁能够使荧光染料靶向到肿瘤组织，因此证明uPAR锁可潜在地用于肿瘤成像和/或作为药物递送载体。
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Claims (25)
1.一种包含两种多肽的二聚体分子，所述多肽选自以下组：
包含来自SEQ ID No.1的aa.11至aa.42的uPA生长因子样结构域(GFD结构域)的第一多肽、或由来自uPA直向同源基因的相应区域所编码的多肽、或其功能突变体或衍生物或类似物；以及
包含来自SEQ ID No.2的aa.5至aa.39的VN的生长调节素B结构域(SMB结构域)的第二多肽、或由来自VN直向同源基因的相应区域所编码的多肽、或其功能突变体或衍生物或类似物；
其中，所述两种多肽通过分子支架相互连接。
2.如权利要求1所述的二聚体分子，其特征在于：
所述第一多肽还包含来自SEQ ID No.2的aa.5至aa.39的SMB结构域、或由VN直向同源基因的相同区域所编码的多肽、或者其功能突变体或衍生物或类似物；
并且
所述第二多肽还包含来自SEQ ID No.1的aa.11至aa.42的GFD结构域、或由来自uPA直向同源基因的相同区域所编码的多肽、或其功能突变体或衍生物或类似物。
3.如前述权利要求的任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述GFD结构域基本上由SEQ ID No.1的aa.8至aa.48组成。
4.如前述权利要求的任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述GFD结构域由SEQ ID No.1的aa.1至aa.48组成。
5.如前述权利要求中任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述SMB结构域由SEQ ID No.2的aa.1至aa.41组成。
6.如权利要求2至5中任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述第一和第二多肽：
c)包含顺序为N末端-SMB结构域-GFD结构域-C末端的序列，并且
d)通过它们的C末端与分子支架相连接。
7.如权利要求2至6中任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述SMB结构域通过第一接头肽与GFD结构域相连接。
8.如权利要求7所述的二聚体分子，其特征在于：所述第一接头肽基本上由SEQ ID No.3的序列组成。
9.如前述权利要求中任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述第一和第二多肽各自通过第二接头肽与所述分子支架相连接。
10.如权利要求9所述的二聚体分子，其特征在于：所述接头肽基本上由SEQID No.4的序列组成。
11.如前述权利要求中任一项所述的二聚体分子，其特征在于：所述分子支架是免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、化学或肽接头。
12.如权利要求11所述的二聚体分子，其特征在于：所述每个Fc的重链恒定区基本上具有SEQ ID No.5的序列。
13.如权利要求12所述的二聚体分子，其特征在于：所述分子基本上由SEQ IDNo.6序列的第一单体和SEQ ID No.7序列的第二单体组成。
14.如权利要求12所述的二聚体分子，其特征在于：所述第一和第二单体具有SEQ ID No.8的序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的二聚体分子在医疗中的用途。
16.如权利要求1至14中任一项所述的二聚体分子在癌症治疗中的用途。
17.如权利要求1至14中任一项权利要求所述的二聚体分子，其特征在于：与治疗剂偶联。
18.如权利要求17所述的二聚体分子，其特征在于：所述治疗剂是放射性核素或毒素。
19.如权利要求1至14中任一项所述的二聚体分子在诊断方法中的用途。
20.如权利要求19所述的二聚体分子在uPAR介导的疾病或肿瘤的诊断中的用途。
21.一种治疗癌症的方法，包括向需要的受试对象给予治疗有效量的如权利要求1至14中任一项所述的二聚体分子。
22.一种药物组合物，包含如权利要求1至14中任一项所述的二聚体分子以及合适的稀释剂或赋形剂。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于：还包含另一种治疗剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于：所述治疗剂是放射性核素或毒素。
25.一种用于uPAR介导的疾病或肿瘤的诊断的试剂盒，包含如权利要求1至14中任一项所述的二聚体分子。
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