CN112057633A

CN112057633A - 一种增强肿瘤对药物敏感性的方法

Info

Publication number: CN112057633A
Application number: CN202011061326.7A
Authority: CN
Inventors: 华子春; 朱波; 闫瑞英
Original assignee: Nanjing Jiruikang Biotechnology Research Institute Co Ltd
Current assignee: Nanjing Jiruikang Biotechnology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开了一种增强肿瘤对药物敏感性的方法，包括如下步骤：通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对药物的敏感性。通过RNA干扰、反义核酸抑制尿激酶原受体uPAR的表达，实现增强肿瘤细胞对药物的敏感性。本发明通过uPAR调控铁死亡来增强肿瘤细胞对药物治疗的敏感性。通过uPAR调控铁死亡来增强肿瘤细胞对药物治疗的敏感性，将调控肿瘤细胞外基质的uPAR与铁死亡连锁在一起。

Description

一种增强肿瘤对药物敏感性的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种增强肿瘤对药物敏感性的方法。

背景技术

uPAR是一个多功能分子，其最初被发现在细胞外基质降解中发挥关键作用，近些年的研究表明uPAR与细胞增殖、迁移、凋亡等表型密切相关(Wang Y，Medicinal researchreviews.2001；21(2):146-70.)。研究指出uPAR可以通过与跨膜整合素相互作用来调控胞质信号通路，从而参与细胞增殖、基因表达调控、迁移等的生化作用机制。生理条件下，正常组织uPAR表达量低，但在炎症反应或创伤愈合等病理过程中，uPAR水平上调。uPAR在肿瘤细胞中表达水平较高。uPAR可在肿瘤细胞及肿瘤微环境细胞中表达。uPAR及其配体uPA的表达水平在肿瘤进展过程中常呈动态变化，这通常与肿瘤、血管组织或肿瘤组织良性组织的边界有关。间质中表达的uPAR可以促进肿瘤的蛋白水解，也可以促进肿瘤进一步恶化。体液中游离可溶性的uPAR(suPAR)现在研究被认为是癌症不良预后的一个重要标志物，此外，切割形式的uPAR有化学趋化活性，意味着更高的uPA活化水平，也更能作为癌症标志物(RaschMG等，Frontiers in bioscience:a journal and virtual library.2008；13:6752-62.)。移植瘤实验发现，用完整的suPAR蛋白处理细胞，可以封闭掉膜上uPAR与integrin的相互作用，从而减少细胞表面纤溶酶原的激活和抑制肿瘤细胞生长(Kruger A等，Cancer genetherapy.2000；7(2):292-9.)。

癌症已经成为全球人口死亡的主要原因之一。而在众多的癌症治疗策略中，化疗在临床一线癌症治疗里一直占据着重要的地位。化疗，也即是药物治疗，利用药物去抑制或杀死肿瘤细胞，从而减轻症状或者延长晚期癌症患者的寿命。相比于手术或放疗，它是一种窗口广泛、全身性的治疗方法，对各种实体肿瘤、原发肿瘤、转移肿瘤均具有一定的治疗作用。然而大量的事实表明这些药物制剂在临床治疗的后期往往呈现较低的治疗效果甚至无效，探究原因主要是由于肿瘤多药耐药性(MDR)的发生(Saha R N等，Molecular membranebiology,2010,27(7):215–231)。肿瘤多药耐药一般也称为交叉耐药，即癌细胞对长期使用的药物产生抗性的同时，对其他抗癌药物(化学结构、作用机制存在差异)也会产生对抗性。通常，亲脂性药物极易诱使恶性癌细胞产生多药耐药性，如阿霉素、长春碱类、紫杉醇等。此外，对一些亲水性药物，如顺铂、五氟尿嘧啶，肿瘤细胞也会发展不同的药物抗性机制，从而介导细胞耐药(Martin H L等,Breast cancer:targets and therapy,2014,6:1–10；Shukla S等，Current drug targets,2011,12(5):621–630.)。因此，如何有效地克服肿瘤MDR，提高肿瘤细胞对药物的敏感程度，成为当前研究者急需解决的问题。

因此，要提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，以实现肿瘤患者对化疗的响应程度，提高化疗治疗有效性，延长肿瘤患者的生存寿命，这是本发明要解决的问题。

目前，缺乏有效的增强肿瘤对药物敏感性的方法。

发明内容

本发明的主要目的是通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，调节铁死亡信号途径，增强人肿瘤细胞对抗癌药物索拉非尼、爱拉斯汀的敏感性，进而为抗肿瘤药物的研发及联合应用提供了一种增强肿瘤对药物敏感性的方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种增强肿瘤对药物敏感性的方法，包括如下步骤：通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对药物的敏感性。

进一步地，通过RNA干扰、反义核酸抑制尿激酶原受体uPAR的表达，实现增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

进一步地，能够同时显著下调铁死亡相关基因uPAR、SLC7A11、SLC3A2、FPN1、TFR1、FtL1、FtH、GAPDH的表达水平，通过调节铁死亡信号路径而增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

更进一步地，所述的uPAR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的uPAR的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的SLC7A11的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的SLC7A11的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的SLC3A2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述的SLC3A2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述的FPN1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述的FPN1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述的TFR1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述的TFR1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；所述的FtL1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述的FtL1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；所述的FtH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述的FtH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述的GAPDH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，所述的GAPDH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

进一步地，通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对抗癌药物索拉非尼、爱拉斯汀的敏感性。

本发明所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述抗肿瘤药物通过联合治疗进行应用。

有益效果：本发明通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，调节铁死亡信号途径，增强人肿瘤细胞对抗癌药物索拉非尼、爱拉斯汀的敏感性。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:(1)通过uPAR调控铁死亡来增强肿瘤细胞对药物治疗的敏感性。

(2)通过uPAR调控铁死亡来增强肿瘤细胞对药物治疗的敏感性，将调控肿瘤细胞外基质的uPAR与铁死亡连锁在一起。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为本发明的不同给药浓度对细胞活力的影响图；

图1A为本发明的不同浓度的Erastin处理Mock和AS-uPAR细胞后细胞活力的变化图；

图1B为本发明的不同浓度的Sorafenib处理Mock和AS-uPAR细胞后细胞活力的变化图；

图2为本发明的uPAR对铁死亡相关基因的表达水平的影响图；

其中，SLC7A11和SLC3A2组成铁死亡的主要信号通路system Xc-，起摄取胱氨酸、外排谷氨酸，保证谷胱甘肽合成的作用；FPN1是目前唯一被发现的铁外排蛋白；FtH和FtL1分别是组成铁蛋白的重链亚基和轻链亚基；TFR1是负责摄入铁的最重要的基因。

图3为本发明的NC VS si-uPAR铁死亡相关基因表达水平的变化图；

图3A为本发明的在WT HCT116细胞中瞬转si-uPAR干扰片段后uPAR的表达水平降低图；

图3B为本发明的uPAR表达水平的灰度分析图；

图3C为本发明的在WT HCT116细胞中抑制uPAR的表达后铁死亡相关基因表达水平的变化图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例1

如图1所示，本发明的一种增强肿瘤对药物敏感性的方法，包括如下步骤：通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对药物的敏感性。

通过RNA干扰、反义核酸抑制尿激酶原受体uPAR的表达，实现增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

能够同时显著下调铁死亡相关基因uPAR、SLC7A11、SLC3A2、FPN1、TFR1、FtL1、FtH、GAPDH的表达水平，通过调节铁死亡信号路径而增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

如图2所示，所述的uPAR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的uPAR的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的SLC7A11的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的SLC7A11的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的SLC3A2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述的SLC3A2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述的FPN1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述的FPN1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述的TFR1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述的TFR1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；所述的FtL1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述的FtL1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；所述的FtH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述的FtH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述的GAPDH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，所述的GAPDH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对抗癌药物索拉非尼、爱拉斯汀的敏感性。

本发明所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物通过联合治疗进行应用。

实施例2

HCT116是人结肠癌细胞，本发明使用该细胞系作为验证的主要模型。对该细胞系的antisense-uPAR稳定细胞系(AS-UPAR)及其对照细胞系(Mock)的构建和验证和siRNA的设计源自前期工作(Xiufeng Liu等，Apoptosis，2014，19:1532–1544)

CCK8探究uPAR对铁死亡的影响

a)uPAR参与调控Erastin介导的铁死亡：收集HCT116 Mock和AS-uPAR两种细胞至EP管内，用细胞计数仪分别计数，调整细胞浓度，混匀后加入到96孔板之中。每孔200μL体积含10000个细胞。待所有孔加完后，在96孔板周围孔中加入PBS 100μL，减少培养基挥发所造成的实验误差；细胞过夜培养，待细胞密度生长至50％-60％时进行给药(Erastin)。每个实验组设置5个给药浓度，每个药物浓度设置5个复孔：HCT116 Mock：加药浓度为0、2.5、5、10、20、40(μM)。AS-uPAR：加药浓度为0、2.5、5、10、20、40(μM)。24h后，吸掉96孔板中的液体，每孔加入100μL含10％CCK8溶液的完全培养基，注意不要产生气泡，37℃培养箱中继续培养1h；酶标仪检测吸光度(检测波长450nm，参考波长650nm)。

b)uPAR参与调控Sorafenib介导的铁死亡：收集HCT116 Mock和AS-uPAR两种细胞至EP管内，用细胞计数仪分别计数，调整细胞浓度，混匀后加入到96孔板之中。每孔200μL体积含10000个细胞；细胞过夜培养，待细胞密度生长至50％-60％时进行给药(Sorafenib)。每个实验组设置5个给药浓度，每个药物浓度设置5个复孔：HCT116 Mock：加药浓度为0、5、10、20、40、80(μM)。AS-uPAR：加药浓度为0、5、10、20、40、80(μM)。24h后，吸掉96孔板中的液体，每孔加入100μL含10％CCK8溶液的完全培养基，注意不要产生气泡，37℃培养箱中继续培养1h；酶标仪检测吸光度(检测波长450nm，参考波长650nm)。

实施例3

HCT116 Mock和AS-uPAR细胞中提取总RNA

从细胞培养箱中取出长满HCT116 Mock和AS-uPAR细胞的小培瓶，小心吸出培养基，2mL PBS润洗3次，最后吸出PBS。加入1mL Trizol试剂裂解细胞5min。将上述含有细胞的混悬液取出，放于1.5mL EP管内，加入200μL的氯仿，盖上管盖，剧烈震荡20s，在室温静置3min。4℃离心机12000rpm离心10min，混合物分为两层，RNA位于上层的上清中。之后的操作均需使用无核酶枪头。使用移液枪小心吸取500μL上清液，并转移到无核酶的EP管中，再加入500μL异丙醇，将管中的液体轻轻混匀，室温静置10min，4℃离心机12000rpm离心10min，弃上清，EP管底部可见白色RNA沉淀。使用1mL 75％乙醇(DEPC水配制)润洗一次，4℃，8000rpm离心5min，弃上清。最后自然干燥5min以除去残留的乙醇，然后加入50μL DEPC水，轻轻洗涤沉淀。测完RNA浓度和A260/A280后即得到质量合格的HCT116 Mock和AS-uPAR细胞总RNA。

实施例4

uPAR与铁死亡相关基因引物序列的合成

如图2所示，根据查阅文献或通过Snapgene软件设计各自上下游引物序列，具体引物序列如下所示：

uPAR-F:ACTCTGGCCGGGCTGTCACCTATT；

uPAR-R:ATTCATGGGGCCTCGGCAGTCTAT；

SLC7A11-F:GCCACTGTTCATCCCAGCTTTGTT；

SLC7A11-R:ACCACCTGGGTTTCTTGTCCCATA；

SLC3A2-F:CTGGTGCCGTGGTCATAATC；

SLC3A2-R:GCTCAGGTAATCGAGACGCC；

FPN1-F:GATCCTTGGCCGACTACCTG；

FPN1-R:CACATCCGATCTCCCCAAGT；

TFR1-F:ATCGTGTCATGAGAGAAGGTCC；

TFR1-R:CTTCCCAGATGGTTTGAAGAGC；

FtL1-F:CCCCCATCTCTGTGACTTCC；

FtL1-R:GAAGAGATACTCGCCCAGCC；

FtH-F:AGAACTACCACCAGGACTCAG；

FtH-R:AGTAGTAAGACATGGACAGGTAAAC；

GAPDH-F:TGCACCACCAACTGCTTAGC；

GAPDH-R:GGCATGGACTGTGGTCATGAG.

实施例5

如图3所示，逆转录获取HCT116 Mock和AS-uPAR细胞cDNA

提取两细胞总RNA(方法如上)，将提取所得的两种细胞RNA置于65℃水浴锅中，水浴5min变性后，立即放在冰上冷却。使用购自TOYOBO公司的逆转录试剂盒进行逆转录实验。在无RNA酶的PCR反应管中混合下列组分：Nuclease-free Water:up to 20μL；5×RTBuffer:4μL；RT Enzyme Mix:1μL；Primer Mix:1μL；RNA:1pg-2μg。将上述组分在反应管中混合完成后，置于PCR仪器中，反应条件设置为：37℃，15min逆转录反应；98℃，5min酶失活反应。反应结束后，放置4℃保存备用。

实施例6

实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)

将上述逆转录反应所获得cDNA稀释100倍作为模板与各自上下游引物搭配好，以备接下来的实验。Q-PCR反应体系：cDNA:7.6μL；上游引物:1μL；下游引物:1μL；2×SYBRGreen Master Mix:10μL；50×Rox Reference Dyel:0.4μL。Q-PCR程序设定：95℃10min；98℃15s；60℃1min；95℃15s。使用

法进行定量分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京吉芮康生物科技研究院有限公司

<120> 一种增强肿瘤对药物敏感性的方法

<130> 2020

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(uPAR-F)

<400> 1

actctggccg ggctgtcacc tatt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(uPAR-R)

<400> 2

attcatgggg cctcggcagt ctat 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(SLC7A11-F)

<400> 3

gccactgttc atcccagctt tgtt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(SLC7A11-R)

<400> 4

accacctggg tttcttgtcc cata 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SLC3A2-F)

<400> 5

ctggtgccgt ggtcataatc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SLC3A2-R)

<400> 6

gctcaggtaa tcgagacgcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(FPN1-F)

<400> 7

gatccttggc cgactacctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(FPN1-R)

<400> 8

cacatccgat ctccccaagt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(TFR1-F)

<400> 9

atcgtgtcat gagagaaggt cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(TFR1-R)

<400> 10

cttcccagat ggtttgaaga gc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(FtL1-F)

<400> 11

cccccatctc tgtgacttcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(FtL1-R)

<400> 12

gaagagatac tcgcccagcc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(FtH-F)

<400> 13

agaactacca ccaggactca g 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(FtH-R)

<400> 14

agtagtaaga catggacagg taaac 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(GAPDH-F)

<400> 15

tgcaccacca actgcttagc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(GAPDH-R)

<400> 16

ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims

1.一种增强肿瘤对药物敏感性的方法，其特征在于包括如下步骤：通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对药物的敏感性。

2.根据权利要求1所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法，其特征在于：通过RNA干扰、反义核酸抑制尿激酶原受体uPAR的表达，实现增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

3.根据权利要求1所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法，其特征在于：能够同时显著下调铁死亡相关基因uPAR、SLC7A11、SLC3A2、FPN1、TFR1、FtL1、FtH、GAPDH的表达水平，通过调节铁死亡信号路径而增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

4.根据权利要求3所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法，其特征在于：所述的uPAR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的uPAR的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述的SLC7A11的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的SLC7A11的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的SLC3A2的上游引物的核苷酸序列如SEQID No.5所示，所述的SLC3A2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述的FPN1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述的FPN1的下游引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示；所述的TFR1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述的TFR1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；所述的FtL1的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示，所述的FtL1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；所述的FtH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述的FtH的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示；所述的GAPDH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，所述的GAPDH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

5.根据权利要求4所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法，其特征在于：通过下调尿激酶原受体uPAR的表达，增强人肿瘤细胞对抗癌药物索拉非尼、爱拉斯汀的敏感性。

6.权利要求1所述的增强肿瘤对药物敏感性的方法在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物通过联合治疗进行应用。