CN106565845A - 抗uPAR抗原的人源化抗体H5L5及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗uPAR抗原的人源化抗体H5L5及其应用。本发明首先提供了一种IgG(命名为H5L5抗体)，其重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列1自N末端第50‑54位氨基酸残基、第69‑85位氨基酸残基和第118‑126位氨基酸残基所示，其轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列3自N末端第44‑53位氨基酸残基、第69‑75位氨基酸残基和第108‑115位氨基酸残基所示。本发明提高的H5L5抗体与人uPAR蛋白具有良好的结合活性，可以显著抑制肿瘤细胞迁移，在治疗肿瘤的领域具有广阔的应用前景。

Description

抗uPAR抗原的人源化抗体H5L5及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗uPAR抗原的人源化抗体H5L5及其应用。
背景技术
肿瘤细胞的浸润和转移是其离开原始部位，迁移到临近的基底膜侵入周围的组织，或穿透血管壁转移并浸润较远位置的过程。尿激酶型纤溶酶原激活系统(uPAS)在肿瘤细胞的浸润与转移过程中发挥重要的作用。该系统由尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinaseplasminogen activator，uPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogenactivator receptor，uPAR)和两个纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1和PAI-2)组成。uPA其初始分泌时是无活性的蛋白酶原，随后蛋白酶原水解成有活性的分子量是50KD糖蛋白。uPAR又称CD87，其缺乏跨膜与胞内区，是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白质，由D1、D2与D3三个同源域组成。
国内外许多研究表明，uPAR在许多肿瘤细胞尤其是头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、前列腺癌等实体瘤细胞中高表达而在正常细胞中低表达。基于uPAR在肿瘤细胞的黏附、迁移、免疫应答、损伤修复、浸润与转移中的重要作用，因此其可作为抗肿瘤药物的重要靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗uPAR抗原的人源化抗体H5L5及其应用。
本发明首先提供了一种IgG(命名为H5L5抗体)，其重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列1自N末端第50-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-126位氨基酸残基所示，其轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列3自N末端第44-53位氨基酸残基、第69-75位氨基酸残基和第108-115位氨基酸残基所示。
所述重链可变区具体如序列表的序列1自N末端第20-137位氨基酸残基所示。
所述轻链可变区具体如序列表的序列3自N末端第21-126位氨基酸残基所示。
所述重链具体可为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自N末端第20-467位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质。
所述轻链具体可为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列3自N末端第21-232位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所示的蛋白质。
编码所述IgG的基因也属于本发明的保护范围。
编码所述IgG的重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)序列表的序列2自5’末端第77-1420位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2自5’末端第20-1423位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表的序列2所示的DNA分子。
编码所述IgG的轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：
(4)序列表的序列4自5’末端第80-715位核苷酸所示的DNA分子；
(5)序列表的序列4自5’末端第20-718位核苷酸所示的DNA分子；
(6)序列表的序列4所示的DNA分子。
本发明还保护H5L5抗体在制备用于抑制癌细胞迁移的药物中的应用。所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。
本发明还保护H5L5抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。所述癌症具体可为结肠癌。所述癌症具体可为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞引起的癌症。所述癌症具体可为结肠癌细胞引起的癌症。所述结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。
本发明还保护H5L5抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：
(f1)检测癌细胞；
(f2)结合癌细胞；
(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)；
(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)。
所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。
本发明还保护一种产品，其活性成分为H5L5抗体；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：
(f1)检测癌细胞；
(f2)结合癌细胞；
(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)；
(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)。
所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。
本发明提高的H5L5抗体与人uPAR蛋白具有良好的结合活性，可以显著抑制肿瘤细胞迁移，在治疗肿瘤的领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为洗脱曲线。
图2为H5L5溶液的10％SDS-PAGE图谱。
图3为细胞划痕实验的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pcDNA-3.3载体(线性质粒)：Invitrogen公司，目录号K8300-01。pOptiVEC载体(线性质粒)：Invitrogen公司，目录号12744-017。293F细胞：Thermo公司产品，目录号R79007。SW480细胞(人结肠癌细胞)：ATCC，目录号 CCL-228。 I培养基(Opti-MEMI Reduced Serum Medium)：Invitrogen公司，目录号31985-062。脂质体(293fectinTMTransfection Reagent)：Invitrogen公司，目录号12347-019。FreestyleTM293表达培养基(FreeStyleTM293Expression Medium)：Invitrogen公司，目录号12338-018。重组人uPAR蛋白(简称uPAR-ECD)：义翘神州生物技术有限公司，货号10925-H08H-100。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
实施例1、抗体的发现
发明人基于大量摸索、分析、验证，进行计算机建模和改造，设计了一种新的抗uPAR抗原的抗体(命名为H5L5抗体)。H5L5抗体为IgG，其重链如序列表的序列1所示，其轻链如序列表的序列3所示。
序列表的序列1中，自N末端第1-19位氨基酸残基组成前导肽，第20-137位氨基酸残基组成重链可变区VL(其中，第50-54位氨基酸残基组成CDR1、第69-85位氨基酸残基组成CDR2、第118-126位氨基酸残基组成CDR3)，第138-235位氨基酸残基组成重链恒定区CH1，第236-250位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge、第251-361位氨基酸残基组成重链恒定区CH2、第362-467位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的多肽。序列表的序列2中，自5’末端第20-76位核苷酸编码前导肽，第77-430位核苷酸编码VH，第431-724位核苷酸编码CH1，第725-769位核苷酸编码Hinge，第770-1102位核苷酸编码CH2，第1103-1420位核苷酸编码CH3，第1421-1423位核苷酸为终止密码子。
序列表的序列3中，自N末端第1-20位氨基酸残基组成前导肽，第21-126位氨基酸残基组成轻链可变区VL(其中，第44-53位氨基酸残基组成CDR1、第69-75位氨基酸残基组成CDR2、第108-115位氨基酸残基组成CDR3)，第127-232位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的多肽。序列表的序列4所示的DNA分子自5’末端第20-79位核苷酸编码前导肽，第80-397位核苷酸编码VL，第398-715位核苷酸编码CL，第716-718位核苷酸为终止密码子。
实施例2、抗体的制备
一、重组质粒的构建
1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入pOptiVEC载体，得到重组质粒pOptiVEC/H5。
2、将序列表的序列4所示的DNA分子插入pcDNA-3.3载体,得到重组质粒pcDNA-3.3-L5。
二、H5L5抗体的制备
1、取15μg重组质粒pOptiVEC/H5和15μg重组质粒pcDNA-3.3-L5，用 I培养基定容至1ml，轻轻混匀。
2、取60μl脂质体，用 I培养基定容至1ml，轻轻混匀后室温孵育5min。
3、将步骤1的溶液和步骤2的溶液混匀，室温孵育20-30min。
4、取125ml细胞培养瓶，加入用FreestyleTM 293表达培养基悬浮的293F细胞(293F细胞含量为3×107个细胞)。
5、将2ml完成步骤3的溶液加入完成步骤4的细胞培养瓶中，在37℃、8％CO2、150rpm振荡的条件下培养6-9天。
6、完成步骤5后，12000rpm离心15min，收集上清，调pH至6.0-7.0，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
7、取步骤6得到的滤液，采用Bio-Rad Duo-Flow蛋白纯化系统(760-0135)进行纯化。
Bio-Scale Mini Affi-prep proteinA亲和层析柱(伯乐公司，货号732-4602)：柱体积为5毫升预装柱。
结合缓冲液(pH7.5)：含3M NaCl的20mM的磷酸盐缓冲液。
洗脱缓冲液(pH2.8)：0.1M柠檬酸盐缓冲液。
流速：2ml/min。
过程：(1)用50ml结合缓冲液平衡柱子；(2)上样3ml步骤6得到的滤液；(3)用50ml结合缓冲液洗涤柱子；(4)用25ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集保留UV280大于0.05AU的过柱后溶液。整个过程的洗脱曲线见图1。
8、取步骤7得到的过柱后溶液，立刻用Tris-HCl溶液(pH9.0)调pH至7.0，然后使用截留分子量为10kD的超滤管(Millipore公司，Amicon Ultra-4)进行浓缩换液处理(浓缩换液采用的缓冲液为PBS缓冲液)，得到的溶液即为含H5L5抗体的溶液，命名为H5L5溶液。H5L5溶液的10％SDS-PAGE图谱见图2(图2中的泳道1和泳道2都是H5L5溶液)。
三、ATN615抗体的制备
ATN615抗体是一种靶向uPAR的单克隆抗体，该抗体与人uPAR亲和力较高且不影响uPAR蛋白与uPA的结合。ATN615抗体，其重链如序列表的序列5所示，轻链如序列表的序列7所示。序列表的序列6所示的双链DNA分子编码序列表的序列5所示的多肽。序列表的序列8所示的双链DNA分子编码序列表的序列7所示的多肽。
参照步骤一和步骤二，制备得到ATN615溶液。
四、空载体试验
用pOptiVEC载体代替重组质粒pOptiVEC/H5，用pcDNA-3.3载体代替重组质粒pcDNA-3.3-L5，依次进行步骤二的1至7，洗脱过程中不显示任何洗脱峰。
实施例3、亲和力检测
一、ELISA检测
1、包被
取酶标板，每孔加入100μl包被液，4℃孵育过夜。包被液的制备方法：用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液将uPAR-ECD稀释，得到蛋白浓度为2ng/μl的溶液。
2、封闭
完成步骤1后，取所述酶标板，用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)，然后每孔加入200μl 10％小牛血清，置37℃孵育2小时。
3、加样
完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入100μl待测样本溶液，37℃孵育2小时，然后用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)。待测样本溶液为实施例2制备的H5L5溶液的稀释液或实施例2制备的ATN615溶液的稀释液，用PBS缓冲液作为溶剂进行稀释。待测样本溶液的蛋白浓度为0.125μg/ml或0.0625μg/ml。
4、加酶标抗体
完成步骤3后，取所述酶标板，每孔加入100μl酶标抗体(山羊抗人IgG-HRP,中杉金桥，货号ZB-2304)，37℃孵育2小时，然后用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)。
5、显色
完成步骤4后，取所述酶标板，每孔加入100μl TMB底物溶液(天根生物，PA107-01)，37℃孵育15分钟。
6、终止反应
完成步骤4后，取所述酶标板，每孔加入50μl 2M硫酸溶液。
7、结果判定
将酶标仪(MD190)扫描波长调至OD450，检测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
进行五次重复试验，结果取平均值。
H5L5溶液的稀释液(蛋白浓度为0.125μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.86。H5L5溶液的稀释液(蛋白浓度为0.0625μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.42。ATN615溶液的稀释液(蛋白浓度为0.125μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.55。ATN615溶液的稀释液(蛋白浓度为0.0625μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.26。
结果表明，H5L5抗体对人uPAR蛋白的亲和力显著高于ATN615抗体。
二、流式细胞术检测
1、取对数生长期的SW480细胞，制备成浓度为5×105细胞/ml的细胞悬液。
2、取1个EP管，加入1ml步骤1得到的细胞悬液，4℃、1000rpm离心5min,弃上清，用1ml含1％FBS的PBS缓冲液洗涤一次。
3、完成步骤2后，取所述EP管，加入200μl待测溶液4℃孵育60min，然后4℃、1000rpm离心5min,弃上清，用500μ含1％FBS的PBS缓冲液洗涤一次。
待测溶液为实施例2制备的H5L5溶液的稀释液或实施例2制备的ATN615溶液的稀释液，蛋白浓度为5μg/ml，用PBS缓冲液调整蛋白浓度。
4、完成步骤3后，取所述EP管，加入100μl FITC标记的羊抗人IgG(GAH-FITC，1：32稀释)，4℃避光孵育45min。
5、完成步骤4后，取所述EP管，4℃、1000rpm、离心5min，弃上清，用500μl含1％FBS的PBS洗涤一次。
6、完成步骤5后，取所述EP管，加入300μl含1％FBS的PBS缓冲液重悬细胞后进行流式细胞检测。
进行五次重复试验，结果取平均值。
H5L5抗体与SW480细胞结合的阳性率为99.18％，平均荧光强度为3.17。ATN615抗体与SW480细胞结合的阳性率为98.64％，平均荧光强度为4.96。
结果表明，H5L5抗体可有效的结合SW480细胞，且结合能力高于ATN615抗体。
实施例4、细胞划痕实验
肿瘤细胞最基本的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性的一种方法。
1、用Marker笔在六孔板背后用直尺比着，均匀划横线，每孔5条线。
2、取步骤1的六孔板，每孔加入5×105个SW480细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12小时(细胞铺满孔底)。
3、完成步骤2后，取所述六孔板，用枪头比着直尺，尽量垂直于Marker线划痕，枪头要垂直于皿底。
4、完成步骤3后，取所述六孔板，用PBS缓冲液洗涤三次以去除划下的细胞。
5、完成步骤4后，取所述六孔板，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM培养基，再加入5μL待测溶液(待测溶液为实施例2制备的H5L5溶液或ATN615溶液，使得体系中的抗体浓度为50μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将等体积PBS缓冲液作为待测溶液的阴性对照。分别于培养0h或48h后取样进行拍照，测量划痕间距。
结果见图3。
进行五次重复试验，结果取平均值。
待测溶液为PBS缓冲液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为1cm。待测溶液为H5L5溶液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为4.5cm。待测溶液为ATN615溶液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为4cm。
序列表
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<213> 人工序列
<400> 1
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Phe Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 2
<211> 1423
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagcttaatt gccgccacca tggactggac ctggagggtc ttctgcttgc tggctgtagc 60
tccaggtgct caatccgagg ttcagctggt tcagtcaggt gctgaggtta agaagccagg 120
tgccactgtt aagatttctt gcaaggcttc tggctacact ttctccgatt tctacatcca 180
ctgggttcgt caggctccag gcaagggtct ggagtggatg ggttggatct tccacggttc 240
tgacaacact gagtacaacg agaagttccg tggtcgtgtt actatcactg ctgacacctc 300
cactgatacc ggatacctgg agctgtcctc tctgcgttcc gaggacactg ctgtttacta 360
ctgcgctcgt tggggaccac actggtactt cgacgtgtgg ggtcagggta ctctggtttc 420
tgtttcctca gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag 480
cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt 540
gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct 600
acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg 660
cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa 720
agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact 780
cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc 840
ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa 900
gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga 960
gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctctcc gtcctgcacc aggactggct 1020
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa 1080
aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcctccatc 1140
tcgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc 1200
cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac 1260
gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa 1320
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa 1380
ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1423
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Met Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Tyr Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Pro Trp Ile Phe Glu Ile Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr
100 105 110
Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 4
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagcttaatt gccgccacca tggagacacc cgcccagctg ctgttcctgc tgctgctgtg 60
gctgcccgac accaccggca tgatccagat gactcagtcc ccatcttctg tgtctgcttc 120
cgttggcgac cgtgttacca tcacttgccg tgcttctcag gacgtttctt acatggcttg 180
gtaccagcaa aagccgggta aagctccgaa gccatggatc ttcgagatct ccactctgca 240
gtccggagtt ccatctcgct tctctggttc cggttctggc actgactact ctctgactat 300
caactctctg cagcctgagg acttcgctac ttactactgc cagcagtgga actacccatt 360
cactttcgga ggaggtacta aggtcgagat caagcggacc gtggcggcgc catctgtctt 420
catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggtacc gctagcgttg tgtgcctgct 480
gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc 540
gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag 600
cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 660
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 718
<210> 5
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala Gln Ser Met Gly Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
Phe Thr Asn Phe Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 6
<211> 1426
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagcttaatt gccgccacca tggactggac ctggagggtc ttctgcttgc tggctgtagc 60
tccaggtgct caatccatgg gcgttaagct gcagcaatcc ggcccagagg ttgttaagcc 120
aggtgcttct gttaagatct cctgcaaggc ttctggatac tccttcacta acttctacat 180
ccactgggtt aagcagcgtc caggtcaggg tctggagtgg atcggttgga tcttccacgg 240
ttctgacaac actgagtaca acgagaagtt caaggacaag gctactctga ctgctgacac 300
ttcctctagc actgcttaca tgcagctgtc ctctctgact agcgaggatt ccgctgttta 360
cttctgcgct cgctggggcc cacactggta cttcgacgtt tggggtcagg gtaccactgt 420
taccgtttcc tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa 480
gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 540
ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 600
cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt 660
gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 720
gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga 780
actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat 840
ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 900
caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga 960
ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc tccgtcctgc accaggactg 1020
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga 1080
gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgcctcc 1140
atctcgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1200
tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1260
cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga 1320
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1380
caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1426
<210> 7
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Met Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ile Thr
20 25 30
Ala Ala Ser Leu Gly Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
35 40 45
Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro
50 55 60
Lys Pro Trp Ile Phe Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn
100 105 110
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 8
<211> 721
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagcttaatt gccgccacca tggagacacc cgcccagctg ctgttcctgc tgctgctgtg 60
gctgcccgac accaccggca tggacatcgt gctgacccag tccccagaca tcactgctgc 120
ttctctgggc cagaaggtta ctatcacttg ctctgcttct tccagcgttt cctacatgca 180
ctggtaccag cagaagtccg gcactagccc taagccttgg atcttcgaga tctccaagct 240
ggcttccggc gtgccggctc gcttctccgg ctctggttcc ggcactagct actccctgac 300
catctcttcc atggaggctg aggacgctgc tatctactac tgccagcagt ggaactaccc 360
attcactttc ggcggtggta ctaagctgga gatcaagcgg accgtggcgg cgccatctgt 420
cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctggt accgctagcg ttgtgtgcct 480
gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 540
atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 600
cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 660
agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta 720
g 721

Claims (10)

1.一种IgG，其重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列1自N末端第50-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-126位氨基酸残基所示，其轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列3自N末端第44-53位氨基酸残基、第69-75位氨基酸残基和第108-115位氨基酸残基所示。
2.如权利要求1所述的IgG，其特征在于：
所述重链可变区如序列表的序列1自N末端第20-137位氨基酸残基所示；
所述轻链可变区如序列表的序列3自N末端第21-126位氨基酸残基所示。
3.如权利要求2所述的IgG，其特征在于：
所述重链为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自N末端第20-467位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质；
所述轻链为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列3自N末端第21-232位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所示的蛋白质。
4.编码权利要求3所述IgG的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
编码所述重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)序列表的序列2自5’末端第77-1420位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2自5’末端第20-1423位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表的序列2所示的DNA分子；
编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：
(4)序列表的序列4自5’末端第80-715位核苷酸所示的DNA分子；
(5)序列表的序列4自5’末端第20-718位核苷酸所示的DNA分子；
(6)序列表的序列4所示的DNA分子。
6.权利要求1或2或3所述IgG在制备用于抑制癌细胞迁移的药物中的应用。
7.权利要求1或2或3所述IgG在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
8.权利要求1或2或3所述IgG在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：
(f1)检测癌细胞；
(f2)结合癌细胞；
(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体；
(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1或2或3所述IgG；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：
(f1)检测癌细胞；
(f2)结合癌细胞；
(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体；
(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体。
10.如权利要求6或7或8所述的应用或如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述癌细胞为结肠癌细胞；所述癌症为结肠癌。
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