CN103157117A - 一种调控肿瘤对trail耐受性的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物，所述药物包含序列为的microRNA及其变体；SEQ IDNO.1-2所示microRNA与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，抑制DR5基因的表达，提高肿瘤对TRAIL的耐受性；SEQ IDNO.3-4所示microRNA不与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，提高DR5基因的表达，降低肿瘤对TRAIL的耐受性。所述microRNA通过对DR5基因表达的调控，达到调控肿瘤细胞对TRAIL耐受性的目的。

Description

一种调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物
发明领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是含有microRNA的调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物。
背景技术
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是近几年新发现的TNF家族新成员,在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常组织不敏感。在美国的临床I期实验数据已经表明它的安全有效，目前正在进行II/III期临床研究。TRAIL主要是通过与细胞表面的受体结合来发挥诱导细胞凋亡的功能，死亡受体DR4和DR5是TRAIL的2个特异性的受体，由于这两个受体仅存在于肿瘤中，所以TRAIL对正常细胞无毒副作用。虽然TRAIL为肿瘤治疗提供新的途径，但是在临床和实验室研究中发现，大约有50%的肿瘤细胞对TRAIL具有一定的耐受性，即用TRAIL去处理肿瘤细胞时，肿瘤细胞没有明显的凋亡现象发生。
MicroRNA（miRNA）是长度为20～24个核苷酸的非编码小RNA，可以通过与靶点的结合而特异性的抑制目标基因的表达。近十年来，研究者发现microRNA在胚胎发育以及细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程中发挥着极其重要的功能。到目前为止，已经有几个microRNA能调控肿瘤对TRAIL的耐受性，例如，microRNA-221/222能通过下调PTEN和TIMP3表达减弱TRAIL对非小细胞肺癌的治疗效果（Garofalo M,Di Leva G,Romano G,Nuovo G,Suh SS,Ngankeu A,Taccioli C,Pichiorri F,Alder H,Secchiero P,Gasparini P,GonelliA,Costinean S,Acunzo M,Condorelli G,Croce CM.miR-221&222regulate TRAIL resistanceand enhance tumorigenicity through PTEN and TIMP3downregulation.Cancer Cell2009;16:498-509）；而相反的，microRNA-130和microRNA-212能通过靶标PED提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性（Incoronato M,Garofalo M,Urso L,Romano G,Quintavalle C,Zanca C,Iaboni M,Nuovo G,Croce CM,Condorelli G.miR-212increases tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand sensitivity in non-small cell lung cancer by targeting the antiapoptoticprotein PED.Cancer Res2010;70:3638-3646.Acunzo M,Visone R,Romano G,Veronese A,Lovat F,Palmieri D,Bottoni A,Garofalo M,Gasparini P,Condorelli G,Chiariello M,Croce CM.miR-130a targets METand induces TRAIL-sensitivity in NSCLC by downregulating miR-221and222.Oncogene2012;31:634-642）。最近,microRNA-25被报道能通过调控DR4的表达而提高胆管癌细胞对TRAIL的耐受性（Razumilava N,Bronk SF,Smoot RL,Fingas CD,Werneburg NW,Roberts LR,Mott JL.miR-25targets TNF-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)death receptor-4and promotesapoptosis resistance in cholangiocarcinoma.Hepatology2012;55:465-475）。
发明内容
因此，针对肿瘤细胞对TRAIL具有耐受性的问题，本发明提供含有microRNA的调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物，其特征在于，所述药物含有序列为SEQ ID NO.1-4所示microRNA及其变体。
优选地，SEQ ID NO.1-2所示microRNA及其变体与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，抑制DR5基因的表达，提高肿瘤对TRAIL的耐受性。
优选地，SEQ IDNO.3-4所示microRNA及其变体不与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，提高DR5基因的表达，降低肿瘤对TRAIL的耐受性。
优选地，SEQ ID NO.1所示的microRNA为microRNA-133a；SEQ ID NO.2所示的microRNA为microRNA-133b。
优选地，SEQ ID NO.3所示的microRNA为microRNA-133a的反义序列；SEQ ID NO.4所示的microRNA为microRNA-133b的反义序列。
优选地，所述microRNA通过化学合成得到或来自生物体样本。
进一步优选地，所述生物体样本为组织或细胞。
优选地，所述的microRNA是一种TRAIL治疗的诊断标志或者治疗靶标。
优选地，所述的肿瘤包括所有的实体瘤及白血病。
进一步优选地，所述的肿瘤是神经胶质瘤。
本发明调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物，所含microRNA及其反义序列通过对DR5基因表达的调控，达到调控肿瘤细胞对TRAIL耐受性的目的。所述microRNA能够通过降低DR5的表达从而提高TRAIL在神经胶质瘤细胞中的耐受性，其反义序列则明显的提高了DR5的表达而促进了TRAIL诱导的细胞凋亡。所以microRNA-133a/b有可能作为TRAIL肿瘤治疗的一个诊断标志或者分子靶标。
附图说明
图1是5种神经胶质瘤细胞对TRAIL的耐受性图。其中，图1中A为MTT法测定5种神经胶质瘤细胞的增殖结果；图1中B为PI染色法测定5种神经胶质瘤细胞的凋亡结果。
图2是microRNA在不同TRAIL耐受型的神经胶质肿瘤中的表达结果图。
图3是生物信息学软件预测microRNA与DR5结合的示意图。
图4是体外生物学功能实验验证microRNA与DR5结合的数据结果图。
图5是microRNA-133a对神经胶质瘤细胞的TRAIL的耐受性的影响结果图。
上述图中，U87、M059K、M059J、A172和T98G为5中神经胶质瘤细胞株，购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)；miR-133a代表microRNA-133a，miR-133b代表microRNA-133b，anti-133a代表microRNA-133a的反义序列；Mock代表空白对照，NC代表阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体情况做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明中的“microRNA”可以是化学合成的，也可以是从存在该基因序列的细胞、组织中提取的。所述的组织可以选肿瘤病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。
本发明中的“样本”指的是潜在的可能含有SEQ ID NO.1-4所示序列的一切离体样本，优选是来自人体的样品。更优选地是来自肿瘤组织的样品。当然抽提出的血总RNA的纯化样品也能够作为本发明的样本。
本发明中的“microRNA-133a”指的是包含SEQ ID NO.1所示的序列或其同源序列的microRNA。本领域中已知各种来源的microR-133a，例如人、黑猩猩、鼠等，这些同源序列均包含在本发明的术语“microRNA-133a”中。本发明中microRNA-133a变体包含上述天然存在的microRNA-133a序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物化学修饰，且仍然具有生物学活性的衍生RNA。MicroRNA-133b、microRNA-133a的反义序列和microRNA-133b的反义序列及他们的变体的意义及范围参照上述解释。
本发明中的“肿瘤治疗”指的是各种实体瘤以及白血病，优选地是神经胶质瘤。
本发明中的“调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物”的“药物”还可以包括治疗或预防肿瘤的其它活性成分或辅助成分。
实施例一、神经胶质瘤细胞TRAIL的耐受性
以5种常见的神经胶质瘤细胞为模型，用不同浓度的TRAIL（50ng/ml;100ng/ml）分别进行处理，采用细胞增殖（MTT法）和PI染色法测定了5种神经胶质瘤细胞对TRAIL的耐受性。经统计分析发现，以U87细胞为标准，M059K和M059J属于TRAIL耐受型细胞株，而A172和T98G属于TRAIL敏感型细胞株。结果见图1。
实施例二、microRNA-133a/b在不同TRAIL耐受型的神经胶质瘤细胞中的表达
采用实时荧光定量PCR技术测定了microRNA-133a和microRNA-133b在不同TRAIL耐受型的神经胶质瘤细胞中的表达。统计分析发现，microRNA-133a和microRNA-133b在TRAIL耐受型细胞株中表达被上调；而在TRAIL敏感型的细胞株中表达被抑制。结果见图2。
实施例三、生物信息学预测microRNA-133a可能与DR5基因3’-UTR结合
采用生物信息学软件TargetScan预测发现，hsa-microRNA-133a可能与DR5基因3’-UTR结合，结果见图3所示。
实施例四、体外生物学实验证明microRNA-133a抑制DR5的表达
将microRNA-133a分别转染到U87，M059J及A172细胞内72小时后，收集细胞，分别提取RNA和蛋白进行Q-PCR和Western blotting检测DR5的表达，结果表明不管在mRNA水平还是蛋白水平，microRNA-133a明显的下调DR5的表达，并且microRNA-133a的反义序列（anti-microRNA-133a）却上调它的表达。因此，上述体外生物学功能实验证实，microRNA-133a可与DR5基因3’-UTR结合，从而抑制DR5的表达，结果见图4。
实施例五、microRNA-133a对神经胶质瘤细胞的TRAIL耐受性的影响
采用细胞增殖（MTT法）和PI染色法测定了microRNA-133a对神经胶质瘤细胞的TRAIL耐受性的影响。经统计分析，microRNA-133a增加了神经胶质瘤细胞的TRAIL的耐受性，而其反义序列却降低了神经胶质瘤细胞的TRAIL的耐受性，促进了TRAIL诱导的凋亡。结果见图5。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure IDA00002935757400011

Claims (10)

1.一种调控肿瘤对TRAIL耐受性的药物，其特征在于，所述药物含有序列为SEQ IDNO.1-4所示microRNA及其变体。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，SEQ ID NO.1-2所示microRNA及其变体与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，抑制DR5基因的表达，提高肿瘤对TRAIL的耐受性。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，SEQ ID NO.3-4所示microRNA及其变体不与死亡受体DR5基因3’-UTR结合，提高DR5基因的表达，降低肿瘤对TRAIL的耐受性。
4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的microRNA为microRNA-133a；SEQ ID NO.2所示的microRNA为microRNA-133b。
5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，SEQ ID NO.3所示的microRNA为microRNA-133a的反义序列；SEQ ID NO.4所示的microRNA为microRNA-133b的反义序列。
6.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述microRNA通过化学合成得到或来自生物体样本。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述生物体样本为组织或细胞。
8.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述的microRNA是一种TRAIL治疗的诊断标志或者治疗靶标。
9.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述的肿瘤包括所有的实体瘤及白血病。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述的肿瘤是神经胶质瘤。
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