CN102471382A - Tlr3 结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性地结合TLR3的并且任选地进一步调节例如抑制信号传送的抗体(例如单克隆抗体)、抗体片段、以及它们的衍生物。本发明还涉及产生这类抗体的细胞；制造这类抗体的方法；这类抗体的片段、变异体、以及衍生物；包括以上物质的药用组合物；使用这类抗体来诊断、治疗或预防疾病例如自身免疫性疾病、炎性疾病等的方法。

Description

TLR3 结合剂
发明领域
本发明涉及特异性地结合TLR3的并且任选地进一步调节例如抑制信号传送的抗体(例如单克隆抗体)、抗体片段、以及它们的衍生物。本发明还涉及产生这类抗体的细胞；制造这类抗体的方法；这类抗体的片段、变异体、以及衍生物；包括以上物质的药用组合物；使用这类抗体来诊断、治疗或预防疾病例如自身免疫性疾病、炎性疾病等的方法。
背景
果蝇toll蛋白控制着背腹模式形成，并且被认为代表一种古老的宿主防御机制。在人体中，TLR被认为是先天免疫性的一种重要的组成部分。在蛋白链的全部长度内，人类和果蝇Toll蛋白序列显示出同源性。人类Toll样受体的家族包括10个高度保守的受体蛋白，TLR1-TLR10。与果蝇toll类似，人类TLR是I型跨膜蛋白，该跨膜蛋白具有一个由富含亮氨酸重复体(LRR)结构域组成的细胞外结构域，该结构域识别病原体相关分子模式(PAMP)；以及一个胞质域，该胞质域与人类白细胞介素-1(IL-1)受体的胞质域同源。类似于果蝇toll和IL-1受体这两者的信号传导途径，人类Toll样受体通过NF-κB传导途径传送信号。
尽管不同哺乳动物的TLR共有许多特征以及信号传导机理，它们的生物学功能是非常不同的。部分原因是由于以下事实，即四种不同接合体分子(MyD88，TIRAP，TRIF和TRAF)以不同的组合与TLR相结合并且介导不同的信号传导途径。此外，同一个TLR的不同配体可以优选地激活不同信号传导途径。而且，TLR差异性地表达于不同的造血细胞和非造血细胞中。因此，对TLR配体的应答不仅取决于被TLR激活的信号传导途径，而且还取决于表达单独TLR的细胞的性质。
由于Toll样受体3(TLR3)信号传送已经牵涉炎性以及自身免疫性病症，所以TLR3作为治疗目标物已经受到显著关注。专利申请WO98/50547提供了hTLR3蛋白的核苷酸和氨基酸序列。LeBouteiller等人在(2005)J.Biol.Chem.280(46)：38133-38145)披露了一种抗TLR3抗体结合细胞表面TLR3的用途。抗体C1130据称对TLR3具有激活性，并且已经在WO 2007/051164中进行了说明。在Cavassani等人在(2008)J.Exp.Med.205：2609-2621中说明了抑制TLR3的多克隆抗体。WO 03/106499和松本(Matsumoto)等人在(2003)J.Immunol.171：3154-3162说明了相应于抗体克隆TLR3.7的一种抗体(eBioScience公司，圣地亚哥)，据报告该抗体结合并且抑制细胞表面的TLR3而不是细胞区域的TLR3或髓系DC中的TLR3。WO 06/060513说明了一种抗体C1068，该抗体据报告在上皮细胞中抑制了细胞因子产生，这些上皮细胞据报告在细胞表面上表达了TLR3。C1068据称与抗体TLR3.7竞争结合到TLR3上(参见WO2010/051470)。PCT专利申请WO2010/051470提供了抗TLR3抗体。这类抗体据称阻断了dsRNA并且被提出可以防止dsRNA结合到TLR3上。用于研究用途的其他抗TLR3抗体包括来自研发系统(R&DSystems)公司的多克隆抗TLR3抗体，来自Abcam的抗体40C1285以及抗体619F7、713E4、716G10、IMG-5631以及-IMG-5348(都来自Imgenex公司)。
然而，尽管至今已经产生了数种抗-TLR3抗体，这些抗体通常仅旨在用于研究目的，而不是用于治疗用途。如在此进一步所说明，本披露显示目前可获得的抗TLR3抗体，尽管它们在一些研究环境中可以用于进行实验观察，但它们并非最适合用作治疗剂例如调节TLR3。因此存在提供定向到TLR3上的改进抗体的一种需要。
发明概述
一方面，本发明提供了包括多种单克隆抗体的新颖组合物，以及使用这些化合物的方法，这些单克隆抗体包括但不限于特异性地结合人类TLR3的抗体片段、以及衍生物。一方面，这些抗体抑制TLR3信号传送而不阻断TLR3配体结合到TLR多肽上。一方面，在酸性调节下并且具体地是细胞酸化亚细胞区室中所面对条件的代表性条件下(例如，细胞内吞途径内体的区室、溶酶体的区室)，这些抗体结合人类TLR3。这类酸性条件总体上特征为pH低于约pH 6.5、或在约pH 4.5至6.5之间、或约pH 5.6。
在此任何一个实施方案的一个方面中，在细胞酸化亚细胞的区室中(例如，细胞内吞途径内体的、溶酶体的区室)这些抗体调节，任选地抑制TLR3信号传送。
在此任何一个实施方案的一个方面中，在一种树突细胞(DC)(例如，一种髓样DC，单核细胞衍生的DC)中这些抗体调节，任选地抑制TLR3信号传送。
在此任何一个实施方案的一个方面中，这些抗体可以任选地被表征为与中性条件相比，在酸性条件下对于结合人类TLR3不具有实质性更低的亲和性(例如，其中结合到TLR3上的KD降低不超过0.2-、0.3-、-0.4、0.5-、1.0-、或1.5-log10)。这些中性条件总体上的特征为pH在6.6至7.4之间，例如在胞质溶胶中发现的稍微碱性的pH 7.2。任选地，与中性条件下相比，这些抗体在酸性条件下对于结合人类TLR3不具有实质性不同(更低或更高)的亲和性(例如，其中在中兴和酸性条件下结合到TLR3上的KD的差异不超过0.2-、0.3-、0.4、0.5-、1.0-、或1.5-log10)。
在此任何一个实施方案的其他方面中，在酸性条件下这些抗体的TLR3二价结合亲和性任选的特征可以是平均KD为不大于约(即，亲和性大于)100、50、10、5、或1纳摩尔，优选地亚纳摩尔或任选地不大于约300、200、100或10皮摩尔。
在此任何一个实施方案的其他方面中，这些抗体抑制TLR3信号传送，而不阻断TLR3配体结合到TLR3多肽上。TLR3配体总体上将是一种配体而不是一个抗TLR3抗体，并且可以是一个天然发生的或非天然发生的TLR3配体，任选地是一个dsRNA基配体，例如聚AU(聚腺苷酸:聚尿苷酸)或聚IC(聚肌苷酸:聚肌胞苷酸)。具体而言，诸位发明人已经证实即使当TLR3配体例如dsRNA已经结合到TLR3多肽上时，根据本发明的抗体还能够抑制TLR3信号传送。即使在预激活条件下(例如在IFNα存在下)，根据本发明的抗体还能够抑制TLR3信号传送。根据本发明的抗体据信对于治疗患有一种确诊的自身免疫性疾病(例如天然发生的TLR3配体例如dsRNA和/或患病细胞中存在IFNα，并且特别是当IFNα水平高时)的病人是有效的。即使TLR3配体结合位点被dsRNA分子占据，这些抗体还可以具有结合TLR3的优点，从而潜在地允许更宽范围的总体结合。
本披露显示了在酸性条件下结合人类TLR3的抗体在细胞(髓样树突细胞(MdDC)；单核细胞衍生的DC(MoDC))中具有较强的能力来调节、具体地是抑制TLR3信号传送，这些细胞仅表达TLR3或TLR3的表达主要在它们的胞质区室中3，并且主要在细胞内吞途径的区室(例如内体)中。这些抗体结合到TLR3中的一个区域上，该区域不涉及结合到dsRNA上，并且在酸性条件下这些抗体不阻止dsRNA结合到TLR3上。这些组合物和方法对于多数应用是有用的，并且尤其非常适合调节TLR3信号传送(例如，体内)，其中胞质溶胶的(例如定位于细胞内吞途径区室的)TLR3被靶向。调节胞质溶胶TLR3信号传送对于治疗和预防一种疾病可能是有用的，对于该疾病而言在酸性胞质溶胶区室(例如，在内体中)中在表达TLR3的DC或其他细胞中调节TLR3信号传送是有益的。例如，在DC中抑制TLR3信号传送(例如通过由DC抑制细胞因子产生而观察到)可以用来治疗或预防炎症或自身免疫性障碍，因为DC具有一种良好证明的能力，可以从凋亡或坏死细胞中吸收抗体(艾伯特(Albert)在(2004)Nat.Rev.Immunol.4：223-231)，包括在组织坏死期间急性炎症期间(Cavassani等人于2008年)。任选地，这些抗体抑制TLR3信号传送，例如抑制通过TLR3配体刺激TLR3受体而诱导的细胞因子产生(例如IP10)。
内体和溶酶体是细胞内部的膜结合区室，形成了细胞内吞途径的一部分，并且由于内体膜泵送质子的ATP酶的作用通常是酸性的。在巨噬细胞中对原位溶酶体pH最早期的测量发现pH为4.7-4.8；涉及受体介导的细胞内吞作用的成纤维细胞内体的pH经确定为约5.5。TLR3的早期研究确认它表达于单核细胞衍生的DC中的胞质溶胶中，并且它可能将其配体结合到该细胞内吞途径的亚细胞区室中(松本(Matsumoto)等人在(2003)J.Immunol.171：3154-3162)。到目前为止TLR3已报道表达于树突细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞、T细胞、上皮细胞、成纤维细胞以及肝细胞中的细胞内体区室中，尽管在细胞表面上，具体地是在上皮细胞上并且在一些炎症情况下也在巨噬细胞上发现了TLR3(Cavassani等人于2008年，同上)已经显示内体酸化作用在TLR3信号传送方面发挥作用，因为在DC中用氯喹(一种内体酸化抑制剂)处理抑制了TLR3信号传送。与在酸性条件下失去亲和性的抗体相比，在此提供的相应于酸化内体区室的酸性条件下(例如pH约5.6，或小于约6.5)结合TLR3的抗体具有一种优点，该优点允许有效地高亲和性结合到内体区室中TLR3上、并且任选地对其进行进一步调节，并且因此可以将它们的作用更多地施加到细胞表面TLR3上。举例说明的这些抗体在DC中的TLR3上具有强抑制活性，这些DC已知主要在胞质体区室中表达TLR3。
在一个实施方案中，本发明提供了多种单克隆抗体，这些单克隆抗体特异性地结合人类TLR3并且抑制TLR3信号传送，例如抑制通过TLR3配体刺激TLR3受体而诱导的细胞因子产生，而不阻断TLR3的一个配体(例如，TLR3的一种天然或合成的配体、一种基于核苷酸的配体、一种dsRNA、病毒dsRNA、聚IC、聚AU)结合到TLR3多肽上。当这类抗体结合TLR3多肽时，dsRNA仍然可以结合这些TLR3多肽，减少了可用于结合到剩余未结合抗体的TLR3上的dsRNA和/或其它dsRNA受体(即RIG-I、MDA-5、TLR7等)，由此潜在地降低了不希望的副作用例如毒性增加、不适当的信号级联放大激活等，并且导致了由dsRNA诱导信号传送而引起的多种病症，例如慢性炎症。这类抗体组合物和方法对于多种应用，具体地是对于治疗或预防与TLR3信号传送相关的疾病是有用的，并且就它们的作用机理来看，本发明的这些抗体可以用于使TLR3多肽无应答或对其进行抑制。任选地，该抗体可以表征为不可检出地降低TLR3的双链RNA配体结合到TLR3多肽上。在酸性条件下，例如在酸化内体区室中所面对条件的代表性条件下，该抗体还可能或不可能以高亲和性结合到人类TLR3上。在一个实施方案中，其中寻找一种可以被TLR3抑制信号传送的抗体，有利的是正如在此说明的酸性条件下，并且具体地在细胞酸化内体区室中所面对条件的代表性条件下，特异性地结合TLR3并且抑制TLR3信号传送、而不阻断TLR3的双链RNA配体结合到TLR3多肽上的抗体能够额外地结合并抑制人类TLR3。
在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，任选地在酸性和/或中性条件下该抗体与单克隆抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3中的任何一项或其任何组合竞争结合到TLR3多肽上。在一个实施方案中，任选地在酸性和/或中性条件下，本发明的一种抗体与选自下组的一种抗体竞争结合到TLR3多肽上，该组的组成为：
(a)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一个VH区和一个VL区，
(b)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 10以及11(29H3)的一个VH区和一个VL区，
(c)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 18以及19(28F11)的一个VH区和一个VL区，
(d)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 26以及27(23C8)的一个VH区和一个VL区，以及
(e)一种对应地具有SEQ ID NOS 34以及35(34A3)的一个VH区和一个VL区的抗体。
在一个实施方案中，该抗体与抗体31C3和29H3竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中，该抗体与抗体31C3和23C8竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中，该抗体与抗体31C3和28F11竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中该抗体与抗体31C3和34A3竞争结合到TLR3多肽上。在一个实施方案中，该抗体与抗体29H3和23C8竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中该抗体与抗体29H3和28F11竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中，该抗体与抗体29H3和34A3竞争结合到TLR3多肽上。在一个实施方案中，该抗体与抗体23C8和28F11竞争结合到TLR3多肽上；在一个实施方案中，该抗体与抗体23C8和34A31竞争结合到TLR3多肽上。在一个实施方案中，该抗体与抗体28F11和34A3竞争结合到TLR3多肽上。
在一个实施方案中，本发明的抗体包括一个轻链，该轻链包括：
(a)一种选自SEQ ID NOS：61、64以及65的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；
(b)一种选自SEQ ID NOS：62、66以及67的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列；和/或
(c)一种选自SEQ ID NOS：63、68、69以及70的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包括一个重链，该重链包括：
(a)一种选自SEQ ID NOS：71至76的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；
(b)一种选自SEQ ID NOS：77至81的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；和/或
(c)一种选自SEQ ID NOS：82至85的重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体是选自下组，该组的组成为：
(a)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：4、5以及6中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：7、8以及9中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(b)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：12、13以及14中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：15、16以及17中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(c)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：20、21以及22中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：23、24以及25中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(d)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：28、29以及30中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：31、32以及33中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；以及
(e)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：36、37以及38中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：39、40以及41中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
任选地，其中在所述序列的任何一项中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，该抗体结合到与单克隆抗体31C3、29H3、23C828F11或34A3中任何一个或其任何组合相同的TLR3表位上。在另一个实施方案中，该抗体包括抗体31C3的一个抗原结合区。在另一个实施方案中，该抗体包括抗体29H3的一个抗原结合区。在另一个实施方案中，该抗体包括抗体23C8的一个抗原结合区。在另一个实施方案中，该抗体包括抗体28F11的一个抗原结合区。在另一个实施方案中，该抗体包括抗体34A3的一个抗原结合区。在另一个实施方案中，该抗体包括一个轻链，该轻链包括该31C3、29H3、23C8、28F11或34A3轻链可变区序列中的一个、两个或全部三个CDR，和/或一个重链，该重链包括该31C3、29H3、23C8、28F11或34A3重链可变区序列中的一个，两个或全部三个CDR。在另一个实施方案中，该抗体是31C3、29H3、3C8、28F11或34A3或它们的一个片段或衍生物，任选地融合到一个人类Fc区上。抗体29H3.7和31C3.1已经于2009年7月3日保存在法国巴黎F-75724 Docteur路25号巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)，对应的编号为CNCM I-4187和CNCM I-4186。抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3的抗原结合区也披露于SEQ ID NOS 2至41中。
在本发明的一个方面中，根据本发明的一种抗体的轻链得自一种核酸序列或由其编码，该核酸序列源自选自针对V基因的VK 19-14、VK aq4、VK 12-41以及VK 12-44以及针对J基因的JK2的一个VL基因重排。
在本发明的一个方面中，根据本发明的一种抗体的重链得自一种核酸序列或由其编码，该核酸序列源自选自针对V基因的VH36-60.a1.85、VHL558.1以及VH J558.2以及针对J基因的JH4或JH2的一个VH基因重排。
在本发明的另一个方面中，该抗体具有由自下组的序列中的一个或多个CDR，该组的组成为：SEQ ID NOS：4至9、12至17、20至25、28至33、36至41、其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个抗原可被一种不同的氨基酸取代。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体特异性地结合TLR3，其中该抗体具有以下特性中的一项或多项：
a.在酸性pH下对于TLR3多肽具有亚纳摩尔的亲和性，例如pH小于约6.5，或在约4.5至6.5之间或约pH 5.6；或
b.在一种TLR3配体的存在下能够抑制TLR3信号传送；或
c.在炎症背景下(例如在炎性细胞因子例如IFNα的存在下)能够抑制TLR3信号传送；或
d.与31C3、29H3、28F11、23C8或34A3竞争结合到TLR3多肽上；
e.不与dsRNA竞争结合到TLR3多肽上。
在一个实施方案中，该抗体具有上述特性(a)和(b)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)、(c)和(d)；或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(a)和(c)；(a)、(c)和(d)；或(a)、(c)、(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(a)和(d)；(a)和(e)；或(a)、(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(b)和(c)；(b)、(c)和(d)；或(b)，(c)，(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(b)和(d)；(b)和(e)；或(b)、(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(c)和(d)；(c)和(e)；或(c)、(d)和(e)。在一个实施方案中，该抗体具有特性(d)和(e)。在另一个实施方案中，该抗体额外地具有在此说明的抗TLR3抗体的任何一种特性。
在另一个实施方案中，在此任何一个实施方案的抗体能够被在其表面上表达TLR3多肽的细胞内化。
在本发明的任何一个方面的一个实施方案中，列于SEQ ID中的这些氨基酸序列包括一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在另一个实施方案中，在本发明的任何一个实施方案中，该实施方案可以涵盖一种氨基酸序列，该氨基酸序列与一个具体的SEQ ID NO中的氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、或99％的一致性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种单克隆抗-TLR3抗体，该抗体具有与选自下组的一种抗体相同的表位特异性，该组的组成为：31C3、29H3、28F11、23C8以及34A3。
在一个实施方案中，该抗体是嵌合体，例如含有一个非鼠类的，任选地一个人类的恒定区。在一个实施方案中，该抗体是人的或人源化的。在另一个实施方案中，该抗体是一种小鼠抗体。在另一个实施方案中，该抗体基本上不能结合到其他人类TLR(例如TLR4)上。
在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，该抗体的同种型是IgG，任选地是IgG1或IgG3。在一个实施方案中，该抗体包括一个Fc结构域或是被FcγR结合的一个同种型。
在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，该抗体是选自以下各项的一种抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多种不同抗体片段的一种多特异性的抗体。在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，该抗体不包括一个Fc结构域或是一种基本上不被FcγR结合的同种型。在一个实施方案中，该抗体是一种IgG4或IgG2同种型。如实例中所证明的，本发明的抗体的F(ab′)2片段保留了它们在DC中调节TLR3信号传送的能力，并且因此被DC吸收(尽管它们缺少Fc结构域)。之前通常认为，抗体可以至少部分地通过Fc受体介导的摄入(人类DC表达数种Fcγ受体(FcγR)，包括I型(FcγRI、CD64)和II型(FcγRII、CD32))进入DC中内体通道。不结合FcγR的同种型和形式可以调节DC中TLR3的发现使得开发抗体成为可能，这些抗体保留着所希望的特征、而没有诱导不希望的去除表达TLR3的细胞的风险(例如通过FcγR-介导的抗体依赖性细胞毒性)。例如，经修饰以降低其FcγR结合的IgG4同种型或其他IgG同种型可以使用其有利的药理特性，例如血清半衰期，同时在例如DC中调节TLR3信号传送、而不诱导细胞死亡。在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，抗TLR3抗体抑制了TLR3信号传送并且包括IgG4或IgG2同种型的一个恒定区。在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，抗TLR3抗体抑制了TLR3信号传送并且包括基本上不结合FcγR的的一个恒定区。
在另一个实施方案中，该抗体连接或共价结合到一个可检出的或毒性的部分上。
在另一个方面，本发明提供了一种产生本发明的抗TLR3抗体的细胞，例如一种杂交瘤或重组体宿主细胞。在一个实施方案中，该细胞是克隆31C3、29H3、23C8、28F11或34A3。在一个相关联的方面中，本发明提供了一种杂交瘤，该杂交瘤包括：a)一种来自非人类哺乳动物宿主的B细胞，该宿主已经用一种抗原进行了免疫，该抗原包括被31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗体特异性识别的TLR3表位，融合到b)一种无限增殖化细胞上，其中该杂交瘤产生一种单克隆抗体，该单克隆抗体特异性结合到该表位上。在这些方面的一个实施方案中，该单克隆抗体结合到与抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3相同的表位上。任选地，该细胞产生一种抗体，该抗体具有抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3的抗原结合区。
在另一个方面，本发明提供了一种测试抗体的方法，该方法包括以下步骤：对抗体进行测试以确定它是否：
a)抑制了TLR3信号传送，任选地不阻断TLR3配体(例如dsRNA)结合到TLR3多肽上，和/或
b)与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗体竞争结合到TLR3多肽上，和/或
c)在酸性条件下、并且具体地是在细胞酸化亚细胞区室中所面对条件的代表性条件下(例如约pH 5.6，在约pH 4.5至约6.5之间)结合人类TLR3；任选地其中与中性条件下的结合相比，在酸性条件下对于TLR3的亲和性并非显著不同(例如减少)。
任选地，该方法包括根据子步骤(a)和(b)、子步骤(a)和(c)、子步骤(b)和(c)或子步骤(a)、(b)和(c)对抗体进行测试。
任选地，该方法进一步包括在酸性条件下和/或与中性条件相比在亲和性方面没有降低时在以下情况下选择抗体的一个步骤：如果确定该抗体抑制TLR3信号传送、如果确定该抗体与抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争结合到TLR3多肽上，和/或如果确定该抗体结合人类TLR3。任选地，对该抗体进一步测试它在树突细胞中调节例如抑制TLR3信号传送的能力，并且如果确定在DC中该抗体调节TLR3信号传送将其选出。任选地，对如此选出的抗体进行选择以用于治疗或预防疾病(例如，抑制TLR3信号传送的抗体可以用于炎性和自身免疫性障碍中)。任选地，产生了一定数量的如此选出的抗体(例如，在一种重组体宿主细胞中)。
在另一个方面，本发明提供了在哺乳动物受试者体内、具体是在人类受试者体内产生一种特异性地结合到TLR3上的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：产生多种抗体(例如，通过用包括TLR3多肽的免疫原来免疫一种非人类哺乳动物)；并且从所述多种抗体中选择一种抗体，该抗体：
a)抑制了TLR3信号传送，任选地不阻断TLR3配体(例如dsRNA)结合到TLR3多肽上，和/或
b)与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗体竞争结合到TLR3多肽上，和/或
c)在酸性条件下，并且具体地在细胞酸化亚细胞区室中所面对条件的代表性条件下(例如约pH 5.6，在约pH 4.5至约6.5之间)结合人类TLR3；任选地其中与在中性条件下的结合相比较，在酸性条件下对于TLR3的亲和性并非显著不同的(例如减少)。
任选地，该方法包括根据子步骤(a)和(b)、子步骤(a)和(c)、子步骤(b)和(c)或子步骤(a)、(b)和(c)来选择抗体。任选地，该方法进一步包括选择一种有能力在树突细胞中调节例如抑制TLR3信号传送的抗体，并且如果确定在DC中该抗体调节TLR3信号传送则将其选出。
在另一个方面，本发明提供了一种对抗体进行测试的方法，包括：a)提供一种测试抗体；并且b)对所述测试抗体是否诱导细胞表面上TLR3的表达量降低进行评估，c)如果所述抗体未诱导细胞表面上TLR3的表达量降低，选择所述测试抗体作为用于治疗一种疾病的候选物(例如在此披露的任何一种疾病)。
在另一个方面，本发明提供了对抗体进行测试的一种方法，包括：a)提供一种测试抗体；b)在酸性条件下(例如在pH 5.6下)对所述测试抗体的结合亲和性进行评估；并且c)如果在酸性条件下所述抗体具有结合亲和性(例如，亚纳摩尔亲和性，与中性条件下相比亲和性并未显著降低等)，选择所述测试抗体作为用于治疗一种疾病的候选物。
在另一个方面，本发明提供了一种对抗体进行测试的方法，包括：a)提供一种测试抗体；b)对于在TLR3配体例如dsRNA的存在下所述测试抗体是否能够结合TLR3蛋白进行评估；并且c)如果在TLR3配体的存在下所述抗体能够结合TLR3蛋白，则选择所述测试抗体作为用于治疗一种疾病的候选物。
在另一个方面，本发明提供了一种对抗体进行选择的方法，包括：a)提供一种测试抗体；b)对于在炎性细胞因子例如IFNα的存在下所述测试抗体是否能够结合TLR3蛋白进行评估；并且c)选择所述测试抗体作为用于治疗一种疾病的候选物。
在另一个方面，本发明提供了一种对抗体进行测试的方法，包括：a)提供一种测试抗体；b)对所述测试抗体是否能够被例如表达TLR3的细胞内化进行评估；并且c)如果所述抗体能够被内化，优选地其中该抗体能够例如在2小时内迅速内化，则选择所述测试抗体作为用于治疗一种疾病的候选物。在一个实施方案中，该疾病是一种炎性紊乱。在一个实施方案中，该疾病是一种癌症。
在一个实施方案中，所制备的这些抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，该方法进一步包括一个步骤，其中对所述抗体特异性地结合到人类TLR3多肽上的能力进行评估。在一个实施方案中，对抗体结合到其他TLR家族成员上的能力进行了评估。在另一个实施方案中，该方法进一步包括制造所选的单克隆抗体片段或衍生物的步骤。在一个实施方案中，这些片段或衍生物选自下组，该组的组成为：Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、双抗体、单链抗体片段、包括多种不同抗体片段的多特异性的抗体、人源化抗体、以及嵌合体抗体。在另一个实施方案中，该非人类哺乳动物是一种小鼠。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防病人体内疾病的一种方法，包括将本发明的一种TLR3抗体给予该病人。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将一种适当的额外的治疗剂(例如具体是当该TLR3抗体抑制TLR3信号传送时)给予病人的步骤，可以从下组中选择一种额外的试剂，该组的组成为：免疫调节剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗生素、抗炎剂等。特别是当TLR3抗体被表达TLR3的细胞内化和/或连接到一种毒素或细胞毒性药物上以去除表达TLR3的细胞(例如，一种癌细胞)时，可以从下组中选出一种额外的试剂，该组的组成为：一种抗癌剂、一种细胞毒性试剂等。一方面，本发明提供了用于治疗或预防选自下组的一种疾病的方法，该组的组成为：自身免疫性疾病、炎症、变态反应、哮喘、感染、骨质疏松症、硬化(肝硬化，cirrhosis)以及脓毒症，癌症或在此考虑的其他疾病，该方法包括向需要它的病人给予一个治疗有效量的抑制性TLR3抗体。将该抗体使用持续长以治疗或预防所述疾病。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于诊断测定或更通常地用于体外检测TLR3多肽的任何测定。一方面，本发明提供了检测TLR3多肽的一种体外方法(例如在生物样品中)，包括使一种TLR3多肽(例如，表达TLR3多肽的一种细胞，一种纯化的TLR3多肽、一种生物样品等)与本发明的一种单克隆抗体相接触，并且对该抗体结合到该TLR3多肽上进行检测。
可以在此的其他地方进一步说明本发明的这些和额外的有利方面和特征。
附图简要说明
图1显示了髓样DC上TLR3激活标志物的抑制作用，图1A：CD86表达水平，图1B：IL-6分泌，图Figure 1C：IP-10分泌。与对照相比较，所有图都显示抗体31C3抑制了TLR3配体诱导的应答。
图2显示了MdDC上TLR3激活标志物的抑制作用，图2A：CD86表达水平，图2B：IP-10分泌。与对照相比较，所有图都显示抗体29H3抑制了TLR3配体诱导的应答。
图3显示了将抗体31C3的F(ab)’2片段与纯化的全31C3抗体(由“Pur”指示)相比较，TLR3激活标志物对髓样DC的抑制作用。图3A：CD86表达水平，图3B：IP-10分泌。这些图显示抗体31C3的F(ab)’2片段抑制TLR3配体诱导应答的效果与纯化的全31C3抗体一样好。
图4显示了将抗体29H3的F(ab)’2片段与纯化的全29H3抗体(由“Pur”指示)相比较，TLR3激活标志物对MdDC的抑制作用。图4A：CD86表达水平，图4B：IP-10分泌。这些图显示抗体29H3的F(ab)’2片段抑制TLR3配体诱导应答的效果与纯化的全29H3抗体一样好。
图5显示了结合亲和性的比较，即与可商购的抗体相比较，根据本发明的抗体对TLR3芯片具有更强的结合。
图6显示在聚AU(一种针对TLR3受体的配体)存在或不存在下根据本发明的抗体结合到TLR3芯片上。该图显示本发明的抗体的结合并不阻断dsRNA结合到TLR3 dsRNA固定位点上。
图7显示在TLR3芯片上29H3的存在阻断了31C3的结合，并且反之亦然。这些结果往往显示这两种抗体竞争一个重叠的或高度相似的表位。
图8显示人类TLR3蛋白的胞外结构域的分子表面图形(通过计算机模型设计而产生)。
图9显示在基于荧光素酶的报告基因活性(293T-TLR3-ISRE)中针对TLR3信号传送抑制作用的一个测定结果，其中荧光素酶的倍数增加指示为聚AU剂量的一个函数。简言之，在报告基因测定中在抗TLR3抗体31C3存在下使用dsRNA TLR3促效剂来诱导TLR3信号传送，并且对TLR3信号传送进行评估。与不具有TLR3抑制活性的对照性抗TLR3抗体相比较，抗体31C3以剂量依赖方式强烈地抑制TLR3信号传送。
图10A显示了与对照物(无Ab：空心圆点)相比较，使用293T-TLR3荧光素酶测定法，用根据本发明的商品化TLR3.7抗体(黑色圆点)、28F11(空心三角形)、23C8(空心正方形)以及31C3(黑色正方形)抗体对TLR3信号传送的剂量依赖性抑制。图10B显示了在一个测定中与31C3(黑色正方形s)、23C8和34A3(黑色三角形)抗体相比较得到的相同结果。
图11显示与无抗体(黑色圆点)的情况相比较，在不同条件下31C3(空心正方形)或23C8(黑色正方形)抗TLR3抗体的作用。IP-10分泌作用在坐标轴上以ng/ml指示，添加的dsRNA的剂量在轴线上以μg/ml指示。图11A表示在标准条件下(无预激活)TLR3信号传送的抑制作用。图11B表示用聚AU进行预刺激的TLR3信号传送的抑制作用。图11C表示用IFNα进行预刺激的TLR3信号传送的抑制作用。
图12显示了动力学测定的结果。图12A以ng/ml表示针对31C3抗体的IP-10分泌作用(取决于聚AU剂量)，图12B表示23C8抗体的结果。在dsRNA之前1小时30分钟(黑色交叉)、同时(黑色加号“+”)、或在dsRNA之后1小时30分钟(空心方形)将TLR3 mAb加入介质中，dsRNA单独(黑色圆点)提供作为阳性对照。
图13显示了在体外表达TLR3的细胞中通过31C3 mAb特异性识别人类TLR3。对于HEK 293T对照细胞以及用人类TLR3转染的293T细胞显示了用31C1 mAb进行细胞内FACS染色的直方图。未染色代表用对照同种型IgG1得到的荧光强度范围。
图14显示了在髓样DC上TLR3诱导的激活标志物以及细胞因子分泌的抑制作用，图14A：IP-10分泌作用，图Figure 14B：CD86表达水平。所有图形都显示与对照物相比较，抗体31C3(黑色圆点)、28F11(黑色三角形)以及23C8(黑色方形)(在此以50μg/ml剂量显示)抑制了TLR3配体诱导的应答。
图15A和15B显示了根据本发明的抗体的结合亲和性。图15A显示了与可商购的(即TLR3.7)抗体相比较，根据本发明的抗体对于TLR3芯片具有更强的结合。图15B显示当所述芯片之前已经用31C3抗体饱和时，根据本发明的抗体结合到TLR3芯片上。组图15A和15B中给出的结合水平比较说明了当该芯片之前已经用31C3抗体饱和时，根据本发明的抗体与hTLR3的结合受到破坏，相反地，在31C3抗体存在或不存在下商品化的TLR3.7抗体保持相同的结合水平。
图16A和16B显示在聚AU(一种用于TLR3受体的配体)存在或不存在下根据本发明的28F11、34A3和23C8抗体结合到TLR3芯片上。这些图形显示本发明的抗体结合并不阻断dsRNA结合到TLR3 dsRNA固定位点上。
图17显示34A3抗体单独结合到rhTLR3上(实线)或结合到用31C3饱和的芯片上(虚线)。该图显示了这两个抗体与31C3竞争结合到hTLR3上。
图18显示了根据本发明的抗体的CDR的系统树。图18A显示用于轻链CDR的系统树，并且图18B显示了用于重链CDR的系统树。这些图形显示在抗体28F11(28.2)、31C3(31)和23C8(23)之间存在着高度CDR同源性，并且表示在氨基酸序列方面23H3(29)和34A3(34)具有更多差异。
图19A和B显示了在髓样DC上由34A3抗体抑制了TLR3激活标志物。图19A：IP-10分泌作用，图19B：IL-6分泌作用。所有图都显示与对照物(无Ab-空心圆点)和31C3(黑色方形，作为阳性对照)相比较，抗体34A3(黑色三角形)抑制了TLR3配体诱导的应答。
图20显示了如实例8中说明的内化作用测定的FACS分析。图20A表示阴性对照，表示在缺少连接TLR3蛋白的抗体下293T-ISRE/TLR3细胞的标准荧光。图20B是阳性对照，指示在293T-ISRE/TLR3细胞系中TLR3的表达水平。图20C和D对应地表示在24小时和2小时孵育之后与31C3偶联的TLR3蛋白的比例。图20D和20F显示了与图20B相比较类似的荧光，证实了TLR3被抗体31C3结合并未下调TLR3在293T-ISRE/TLR3细胞系上的表达。
图21A和21B显示在聚AU(一种用于TLR3受体的配体)存在或不存在下根据本发明的28F11、34A3和23C8抗体结合到TLR3芯片上。这些图形显示本发明的抗体的结合并不阻断dsRNA结合到TLR3dsRNA固定位点上。
发明详细说明
介绍
本发明提供了用于产生和使用抗体并且特别是适合用于预防和治疗多种紊乱(例如自身免疫障碍、炎症、变态反应、哮喘、硬化、骨质疏松症、感染、癌症以及脓毒症)的调节TLR3的抗体的新方法。抗体、抗体衍生物、抗体片段、以及产生它们的细胞也涵盖在内，同样也涵盖了产生以上物质的方法以及使用这些抗体和化合物来治疗或诊断病人的方法。
尽管在抗体中高亲和性是令人希望的，但通常据报告亲和性在高皮摩尔至低纳摩尔范围内的全部抗体在体外已经是亲和性成熟的。科学文献已经提出存在着100pM的体内亲和性上限，并且提出其出现可能是因为在正常免疫应答期间产生对抗原具有超过所估计上限的亲和性的抗体的B细胞将不具有选择性优势。然而，存在着高亲和性抗体的实例，包括抗-TNF-α抗体“TSK114”，它以约5.3pM结合亲和性(K(D))结合到人类TNF-α上，据称它比临床上相关的英利昔单抗(Remicade)和阿达木单抗(Humira)mAbs的结合亲和性高约1000倍和100倍(宋(Song)等人在(2008)Exp.Mol.Med.40(1)：35-42)。有可能的是高亲和性抗体的获得取决于抗原，而现今可得到的TLR3抗体最多显示纳摩尔亲和性。然而本发明的抗-TLR3抗体证明了非常高的亲和性(高至10皮摩尔，并且大于100皮摩尔，包括在中性和酸性条件下保持这类亲和性的两种抗体)。
本发明至少部分是基于以下发现：在相应于酸化内体区室中所面对条件对应的酸性条件下单克隆抗体特异性地并且有效地结合TLR3。在所评估的多种抗体中，存在着某些抗体在酸性条件下以高亲和性保持结合到TLR3上，而其他抗体例如可商购的那些抗体以及针对TLR3结合或TLR3调节而选择的其他抗体失去了亲和性(尽管最初展示对TLR3较高(例如，高出2-log10)的亲和性)，和/或甚至在中性条件下具有低亲和性。所使用的酸性条件是pH 5.6，这类似于在酸化内体区室中观察到的情况，相应于据信在炎性病症中发生TLR3信号传送的条件。
通常，已知酸性条件影响蛋白质的结构并且影响蛋白质-蛋白质相互作用。例如，已知的是在内体的酸性条件下未结合到其他肽上的MHC II类肽被迅速降解。然而，在本文中，抗体在pH 5.6的酸性条件下失去其与固定的TLR3的高结合亲和性之前已经在酸性条件下(pH 3)进行了纯化。不希望被理论束缚，这表明失去结合亲和性并不是由于酸性条件下抗体的内在不稳定性(降解)，而是因为抗体与它们的靶抗原之间相互作用的改变。
据信由于pH改变而引起的抗体-TLR3相互作用的改变影响了dsRNA与TLR3的相互作用，因为仅在酸性pH下TLR3配体poly(I-C)结合并且激活TLR3。多项研究已报告poly(I-C)(以及其他dsRNA)在中性pH下在正静电势的TLR3区域中结合TLR3，在酸性条件下(即，在pH 4.5至6.5的范围内，或约5.6的酸性条件)可能经历静电势的改变。然而，本发明的抗体据信结合了一个表位，当环境被酸化时该表位未经历静电势的显著改变(或经历比例如正静电势的区域更小的改变)，这样使得这些抗体的结合亲和性基本上保持不变。一方面，其自身就可以显示针对TLR3的抗体亲和性，因为与在中性条件下相比较，在酸性条件下这些抗体不没有显著不同(更低和/或更高)的结合人类TLR3的亲和性(例如，其中结合到TLR3上的KD相差不超过0.2-、0.3-、0.4-、0.5-、1.0-、或1.5-log10)。对于抗体31C3和29H7而言，在酸性和中性条件下结合到TLR3上的KD相差小于0.5-log10。据信在中性pH下本发明的抗体所结合的表位具有负静电势。TLR3蛋白表面上的负性、正性或中性的静电势区域示于图8中或也示于Choe et al.(2005)Science309：581-585的图5D中，其披露内容通过引用结合在此。通过干扰dsRNA配体结合到TLR3上而抑制TLR3的抗体将有可能结合到TLR3未糖基化表面上C端附近的正性或中性的静电势区域上，并且因此结合在TLR3的一个区域中，该区域经历了静电势的较大改变，与此同时本发明的抗体似乎结合到不涉及结合dsRNA配体的TLR3的一个区域上，尽管如此例如通过抑制TLR3采取最终传导信号所需要的一种构象而保留了抑制TLR3蛋白信号传送的能力。
本发明至少部分地还基于高亲和性的单克隆抗体的发现，这些抗体特异性地并且有效地抑制TLR3信号传导途径。诸位发明人已经鉴别出存在于人类TLR3上的表位，包括由抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3识别的表位，这些抗体在抑制TLR3信号传送方面、并且在抑制响应于用TLR3配体刺激而所致的细胞因子释放方面是特别有效的。
本发明中抑制TLR3信号传送的抗体在治疗和/或抑制自身免疫性疾病、炎性疾病以及其他抑制TLR3信号传送有益的疾病方面将是特别有用的。自身免疫性疾病和炎性疾病是由于对抗通常存在于体内的物质和组织的身体过度激活的免疫应答。在自身免疫性疾病和炎性疾病这两方面，这些病症通过人体适应性或先天免疫系统的异常反应而产生。在自身免疫性疾病方面，病人的免疫系统被激活对抗机体自身的蛋白。在炎性疾病方面(包括可以导致炎性病症的感染)，它是免疫系统的过度反应，以及其随后的下游信号传送(TNF，IFN等)，这引发了很多问题。这些自身免疫性疾病是由于识别自身抗原并且介导组织破坏的T细胞和B细胞增殖。很长时间以来，病毒感染被怀疑激发或明显地参与了自身免疫性疾病。在兰(Lang)等人在(J.Clin.Invest.116：2456-2463，2006)中，已经证明这些病毒可以通过另一种机制启动自身免疫损伤。
近来已经确认dsRNA是TLR3的配体(Alexoupoulou等人在(2001)，Nature 413：732-738)，并且最近还已经更多地显示出从损伤组织或多种组织中释放的RNA还可能作为TLR3配体来起作用(Kariko等人在(2004)J.Biol.Chem.)。通过免疫复合物内TLR内源性RNA配体不适当地激活TLR几乎确定地是造成多种炎性疾病和自身免疫性疾病发病机理的一个重要因素。近期的文章表明了TLR3对炎性疾病(Cavassani等人于2008年)的作用，因为在脓毒症或自身免疫性疾病期间观察到TLR3配体放大了高炎性应答、这些自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎(Bokarewa等人在(2008)Eur J.Immunol.)、全身性红斑狼疮(Rahman等人在(2006)Springer Sem.inImmunopathol)以及糖尿病(自然杂志(Nature Med)，2005年)。还已经报道TLR3可以在病毒感染方面(例如Western Reserve牛痘苗病毒)出现有害作用，其中TLR3有助于病毒复制、有害的肺部炎症、以及白细胞募集到肺中，造成死亡率增加；或在西尼罗病毒(WNV)方面出现有害作用，其中TLR3允许病毒越过血脑屏障(BBB)并且引起致命性脑炎。在相应于内体(例如，像在髓样DC中)中条件的pH条件下抑制TLR3的本发明的抗体在治疗和预防这些病症方面将是有用的，包括但不限于病毒感染其本身以及由病毒感染所引起或增强的病症(例如自身免疫性病症或炎性病症)。
Zorde-Khvalevsky等人在(2009)Hepatology 49报道了在缺少TLR3时在肝部分切除之后肝细胞细胞增殖加速，而IL-6和可溶性白细胞介素-6受体(sIL-6R)的水平显著地降低，并且进一步地在肝部分切除之后在肝细胞中诱导TLR3信号传送，导致了NF-kB的激活，并且在枯否(Kupffer)细胞中激活的TLR3的存在抑制了NF-kB的激活。因此，发现TLR3信号传送减弱了肝再生的启动；因此本发明的抗TLR3抗体可以用于诱导肝再生的方法中，具体地是用于治疗和预防涉及肝损伤的疾病(例如硬化)或已知引起诸如酒精中毒、乙型肝炎或丙型肝炎感染或脂肪肝疾病的肝损伤疾病。
金姆(Kim)等人在(2009)Immunol.Lett中报道了TLR3在RA滑膜中通过刺激人类单核细胞直接促进破骨细胞分化、以及通过在RA-FLS中间接地诱导RANKL表达，以直接和间接的方式促进破骨细胞形成。在RA滑膜中RANKL的表达促进了破骨细胞的分化，并且RANKL抗体在治疗骨质疏松症方面抗(狄诺塞麦(denosumab)，安进(Amgen)公司)是有效的。因此，本发明的抗-TLR3抗体可以用来治疗和预防炎性骨组织破坏，例如骨质疏松症(特别地是在RA病人体内)。
Wen等人在(2004)J.Immunol.172：3172-3180表明可以通过一种病毒样刺激物来诱导自身免疫性疾病，并且鉴别TLR3能够介导治疗这样的诱导作用。这些结果表明聚IC与胰岛素一起、而并非单独使用胰岛素或其他TLR配体(CpG、LPS、PGN)在小鼠模型中能够诱导自身免疫性糖尿病以及胰岛的凋亡。此外，与其他TLR相比较，在所有个体体内TLR3显示出最高的表达水平。因此，本发明的抗-TLR3抗体可以用来治疗和预防糖尿病以及胰岛素自身免疫性疾病。
在酸性条件下结合TLR3的本发明的抗体通常会以高亲和性结合细胞表面TLR3以及内体TLR3，这样使得这些抗体在任何靶向TLR3(例如调节)有用的情况下(例如，治疗或预防疾病)将是有用的。在一些炎症病例中已经发现TLR3位于巨噬细胞表面并且当氯喹中和内体酸化作用时阻断了TLR3，尽管如此TLR3还是展示了一定的抗炎活性(Cavassani等人于2008年，同上)。然而，本发明的抗体在治疗或预防疾病方面与其他抗体相比将具有最大的优点，对于这些疾病在细胞溶胶(例如内体)区室中调节(例如，抑制)TLR3信号传送是有用的或需要的，并且调节这些区室的TLR3信号传送的相对重要程度可以取决于疾病情况。这种疾病的一个实例是类风湿性关节炎；内体区室表达的TLR3据信在类风湿性关节炎中起重要作用，因为用氯喹(一种内体酸化作用的抑制剂)治疗抑制了TLR3信号传送并且抑制了从来自患有类风湿性关节炎的病人的滑液培养物中生成炎性细胞因子(圣心(Sacre)等人在(2008)J.Immunol.181：8002-8009)。内体区室表达的TLR3据信在多种其他疾病中起重要作用，在这些疾病中DC(例如髓样DC)涉及疾病恶化，因为mDC具有良好证明的从凋亡或坏死细胞中吸收抗原的能力(包括组织坏死期间急性炎症期间)。
因为本发明的抗体对于TLR3是特异性的，它们还可以用于其他目的，包括纯化TLR3或表达TLR3的细胞，在体外、离体或体内调节(例如，激活或抑制)TLR3受体，靶向表达TLR3的细胞以进行体内破坏，或在体内、离体或体外地特异性地标记/结合TLR3，包括用于多种方法，例如免疫印迹法、IHC分析、即在冰冻活检、FACS分析、以及免疫沉淀作用上。
定义
如在此使用的，“TLR3配体”是指可以在体外、离体或体内特异性地结合到TLR3上并且改变其活性的任何化合物。该化合物可以是一种天然发生的配体(例如通常是dsRNA或病毒dsRNA)或一种合成的配体(例如聚IC或聚AU)。该化合物可以是任何类型的分子，包括无机或有机的化合物或元素，例如蛋白质(例如抗体)、核酸、碳水化合物、脂类、或任何其他分子实体。另外，这类化合物能够以任何方式(包括激活或抑制)、并且通过任何机理(包括以类似于一种天然发生的配体的方式通过结合到受体上并且触发或关闭活性、或通过结合到受体上并且阻断与其他配体接触)来调节TLR3受体。优选地，该配体激活该受体，并且以此状态可以用于诱导表达TLR3的细胞产生细胞因子。
如在此使用的术语“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体。取决于重链中恒定区的类型，抗体可以指定为以下五个大类中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM。这些中有几个被进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。一种示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括一种四聚物。每个四聚体是由两个相同对的多肽链组成的，每一对具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的一个可变区，主要负责抗原识别。术语可变的轻链(VL)和可变的重链(VH)对应地是指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区被对应地称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”以及“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG和/或IgM是本发明中所采用的优选类别的抗体，其中IgG是特别优选的，因为它们是在生理状况下最常见的抗体，并且因为它们在实验室条件下最易于制备。优选地，本发明的抗体是一种单克隆抗体。特别优选地是人源化的、嵌合体的、人类的、或在其他方面人类适合的抗体。“抗体”还包括在此说明的任何一种抗体的任何一种片段或衍生物。
术语“特异地结合到”是指优选地在一种竞争性结合测定法中一种抗体可以结合到结合配偶体上(例如TLR3)，正如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估。用于确定特异性结合的竞争性结合测定法以及其他方法在以下进行进一步说明，并且在本领域内是熟知的。
当一种抗体据称与一种特定的单克隆抗体(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)“竞争”时，这是指在一个结合测定法中该抗体使用重组体TLR3分子或表面表达的TLR3分子与该单克隆抗体竞争。例如，如果在一个结合测定中一种测试抗体降低了31C3、29H3、23C8、28F11或34A3结合到TLR3多肽或表达TLR3的细胞上，则该抗体被称对应地与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3“竞争”。
如在此使用的术语“亲和性”是指一种抗体结合到一个表位上的强度。一种抗体的亲和性通过解离常数Kd(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为1/Kd。用于确定mAb亲和性的优选的方法可以在以下文献中找到：哈洛(Harlow)等人，抗体(Antibodies)：实验指南(A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约(N.Y.)，1988年)，Coligan等人编辑，CurrentProtocols in Immunology，格林(Greene)出版联合和威力出版公司(WileyInterscience)，纽约(N.Y.)，(1992年，1993年)以及Muller，Meth.Enzymol.92：589-601(1983)，这些参考文献通过引用将其整体结合在此。本领域所熟知的用于确定mAb亲和性的一种优选并且标准的方法是使用Biacore(生物分子相互作用分析仪)仪器。
在本发明的上下文中，“决定簇”指明多肽上相互作用或结合的一个位点。
术语“表位”被定义为一种抗原决定簇，并且是结合了抗体的抗原上的区或区域。一个蛋白表位可以包括直接涉及结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效地阻断的氨基酸残基(即抗体“足迹”内的氨基酸残基)。只有复合抗原分子上最简单的形式或最小的结构区域可以与例如一种抗体或一种受体结合。表位可以是直链或构象性的/结构性的。术语“直链的表位”被定义为由多个氨基酸残基组成的一个表位，这些氨基酸残基在氨基酸的线性顺序上(一级结构)是连续的。术语“构象性表位或结构性表位”被定义为由氨基酸残基构成的一个表位，这些氨基酸残基不全是连续性的，并且因此表示了通过分子折叠(二级、三级和/或四级结构)而彼此邻近的氨基酸线性序列的分离的部分。构象性表位取决于三维结构。因此，术语“构象性”通常与“结构性”可互换地使用。
提及“免疫原片段”，在此它是指能够引发例如以下免疫应答的任何一种多肽片段或肽片段(i)产生结合所述片段的抗体和/或结合包括所述片段的任何形式的分子的抗体，这些分子包括膜结合的受体以及从中衍生的突变体，(ii)刺激T细胞应答，该应答涉及T细胞与包括任何一种MHC分子以及从所述片段衍生的一种肽的双分子复合体反应，(iii)结合转化的载体，例如噬菌体或表达对哺乳动物免疫球蛋白进行编码的基因的细菌。可替代地，免疫原片段还指能够引发如以上定义的免疫应答的任何一种结构，例如通过共价连接而连接到一种载体蛋白上的肽片段、氨基酸序列中包括所述肽片段的一种嵌合体重组体多肽构建体，并且尤其地包括用一种cDNA转染的细胞，该cDNA序列包括对所述片段进行编码的一个部分。
“毒性”或“细胞毒性”肽或小分子涵盖了可以减慢、停止或逆转细胞增殖、以任何可检出的方式降低其活性、或直接或间接地将其杀死的的任何一种化合物。优选地，毒性或细胞毒性化合物通过直接地杀死这些细胞、通过引起凋亡或其他方式来起作用。如在此使用的，毒性“肽”可以包括任何一种肽、多肽、或这类物质的衍生物，包括具有非天然氨基酸或修饰连接的肽衍生物或多肽衍生物。毒性“小分子”可以包括任何一种毒性化合物或元素，优选地其大小为小于10kD、5kD、1kD、750D、600D、500D、400D、300D、或更小。
“人类适用的”抗体是指可以安全地用于人体、用于例如在此说明的治疗方法的任何一种抗体、衍生的抗体、或抗体片段。人类适用的抗体包括所有类型的人源化的、嵌合体的、或完全人类抗体，或以下任何抗体，在这些抗体中至少有一部分抗体是从人类衍生的或通过其他方式进行了修饰，从而避免了当使用天然的非人类抗体而经常引起的免疫应答。
为了本发明的目的，“人源化”或“人类的”抗体是指一种抗体，其中一种或多种人类免疫球蛋白的恒定和可变框架区与一种动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)相融合。这类抗体被设计成保持衍生出这些结合区的非人类抗体的结合特异性，但是却要避免对抗非人类抗体的免疫反应。这类抗体可以从转基因小鼠或其他动物体内得到，这些小鼠或动物已经被“工程化”从而产生响应于抗原激发的特异性人类抗体(参见，例如，Green等人在(1994)Nature Genet 7：13；郎博格(Lonberg)等人在(1994)《自然》(Nature)368：856；Taylor等人在(1994)Int Immun 6：579，其全部传授内容通过引用结合在此)。还可以通过遗传学或染色体转染方法、以及噬菌体展示技术来构建完全人类抗体，所有这些在本领域内是已知的(参见，例如，McCafferty等人(1990)《自然》(Nature)348：552-553)。还可以通过体外刺激的B细胞来产生人类抗体(参见，例如，美国专利号5,567,610以及5,229,275，它们通过引用以其全部内容结合在此)。
“嵌合体抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或它的一个部分被改变、替换或交换，这样使得该抗原结合位点(可变区)连接到一个不同的或改变的类别、效应物功能和/或种类的恒定区上或为该嵌合体抗体提供新特性的一种完全不同的分子上，例如一种酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或它的一个部分用具有一种不同或改变的抗原特异性的可变区来改变、替换或交换。
术语“Fc结构域“、”“Fc部分”以及“Fc区”是指一条抗体重链的C端片段，例如从氨基酸约(aa)230至约aa 450的人类γ重链或它在其他类型的抗体重链中(例如针对人类抗体的α、δ、ε以及μ)的对应物序列，或它的一种天然发生的同种异型。除非另外说明，否则贯穿本披露使用了针对免疫球蛋白通常所接受的Kabat氨基酸编号(参见卡巴特(Kabat)等人在(1991)Sequences of Protein of Immunological Interest，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院，贝塞斯达市，马里兰州)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指基本上或实质上不含有如在其天然状态下所发现的通常伴随它的组分的材料。典型地使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法来确定纯度和均匀性。制剂中存在的主要类型的蛋白基本上是纯的。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可以互换地使用，指多个氨基酸残基的聚合物。这些术语应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用到天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物上。
当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语“重组体”指示该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入一种异源核酸或蛋白，或改变一种天然核酸或蛋白而进行修饰，或指示该细胞是从这样修饰的一种细胞衍生的。因此，例如，这些重组体细胞表达在细胞的天然形式(非重组体)中未发现的基因或表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。
在本发明的上下文中，术语“结合”一种共同决定簇的抗体表明一种抗体，该抗体以特异性和/或亲和性结合所述决定簇。
产生抗-TLR3抗体
本发明的抗体特异性地结合TLR3。此外，在相应于酸化内体区室中所要面对的条件的酸性条件下本发明的抗体结合TLR3。此外，本发明的抗体能够抑制TLR3信号传导途径。抑制性抗体特异性地抑制TLR3信号传导途径的能力使它们用于多种应用，具体地是用于治疗或预防抑制TLR3信号传导途径是令人希望的疾病，即避免如在此说明的进一步的细胞因子和趋化因子分泌以及细胞激活。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合人类TLR3，并且与单克隆抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争结合到人类TLR3上。通过于2009年7月3日保存在法国巴黎F-75724Docteur路25号巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)，编号CNCM I-4187下的31C3.1的细胞产生抗体31C3。通过于2009年7月3日保存在法国巴黎F-75724 Docteur路25号巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)，编号CNCM I-4187下的29H3.7的细胞产生抗体29H3。
“TLR3”、“TLR3多肽”以及“TLR3受体”，可互换使用，在此用来指Toll样受体3(Toll样受体(TLR)家族的一个成员)。人类TLR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中(NCBI登录号NP_003256，其披露的内容通过引用结合在此)。在NCBI登录号NM_003265中说明了人类TLR3mRNA序列。在PCT专利公开号WO 98/50547中也说明了人类TLR3序列，其披露的内容通过引用结合在此。
一方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与单克隆抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争，并且识别与单克隆抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上或实质上相同或相同的TLR3分子上的表位或“表位位点”，结合到它们上，或针对它们具有免疫特异性。在其他实施方案中，该单克隆抗体由抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3组成或是它的一种衍生物或片段。
应当理解的是，尽管优选的抗体结合到与抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3相同表位上，本发明的抗体可以识别TLR3多肽的任何一个部分并且对抗它而产生。例如，TLR3的任何一个片段(优选地但并非专一指人类TLR3，或TLR3片段的任何组合)可以用作抗原来产生抗体，并且本发明的抗体可以识别TLR3多肽内任何一个位置处的表位，只要它们能够在表达TLR3的细胞上(例如如在此说明的MdDC或MoDC)这样作用即可。在一个实施方案中，所识别的表位存在于细胞表面上，即它们可以接近存在于细胞之外面的抗体。最优选地，该表位是被抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3特异性识别的表位。另外，识别TLR3内独特表位的抗体可以组合地用于例如以不同个体之间最大效能以及宽度结合到TLR3多肽上。
可以通过本领域已知的多种技术来产生本发明的抗体。典型地，它们可以通过用一种免疫原来免疫一种非人类动物(优选小鼠)，该免疫原包括一种TLR3多肽，优选一种人类TLR3多肽。T这种LR3多肽可以包括一种人类TLR3多肽的全长序列，或它的一个片段或衍生物，典型地是一种免疫原片段，即包括暴露于表达TLR3多肽的细胞表面上的一个表位(优选地被31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗体识别的表位)的多肽的一部分。这类片段典型地包含至少约7个连续氨基酸的成熟多肽序列，甚至更优选地是至少约10个连续氨基酸的成熟多肽序列。片段典型地基本上是从受体的胞外结构域衍生的。在一个优选的实施方案中，在质膜中，典型地在细胞表面上该免疫原包括一种野生型人类TLR3多肽。在一个具体实施方案中，该免疫原包括完整的细胞，具体是完整的人类细胞(任选被处理的或裂解)。在另一个优选实施方案中，该多肽是一种重组TLR3多肽。
用抗原来免疫非人类哺乳动物的步骤能够以本领域熟知的、用于在小鼠体内刺激抗体产生的任何方式来实现(参见，例如，E.Harlow(哈洛)和D.Lane(莱恩)，抗体(Antibodies)：实验指南(A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约(NY(1988)，1988年)，其全部披露内容通过引用结合在此)。该免疫原任选地用一种佐剂(例如完全的或不完全的弗氏佐剂)悬浮或溶于一种缓冲剂中。确定免疫原量值、缓冲剂类型以及佐剂量质的方法对于本领域普通技术人员而言是熟知的，并且在本发明内不以任何形式进行限制。对于不同的免疫原而言，这些参数是不同的，但是易于说明。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫作用的位置和频率在本领域内也是熟知的。在一个典型的免疫实验方案中，在第1天用抗原腹膜内注射非人类动物并且在约1周之后再次注射。随后在约第20天进行该抗原的记忆注射，任选使用一种佐剂(例如不完全弗氏佐剂)。记忆注射是以静脉内方式进行的并且可以重复连续好几天。随后在第40天以静脉内或腹膜内方式进行加强注射，典型地不使用佐剂。这种实验方案导致在约40天后产生抗原特异的产生抗体的B细胞。还可以使用其他实验方案，只要它们导致生成表达一种抗体的B细胞，该抗体针对免疫中所使用的抗原。
对于多克隆抗体制剂而言，从一种经免疫的非人类动物得到血清，并且通过熟知的技术分离在此提出的抗体。血清可以使用以上提出的连接到固体载体上的免疫原中的任何一项来亲和纯化，从而得到与TLR3多肽进行反应的抗体。
在一个替代的实施方案中，分离了来自一种非人类哺乳动物的淋巴细胞，使其体外生长，并且然后暴露于经细胞培养的抗原。然后收集这些淋巴细胞，并且执行以下说明的融合步骤。
对于优选的单克隆抗体而言，下一步是从经免疫的非人类哺乳动物体内分离脾细胞，并且随后将这些脾细胞与一种无限增殖化细胞融合从而形成一种产生抗体的杂交瘤。从一种非人类哺乳动物体内分离脾细胞在本领域内史熟知的，并且典型地涉及从一种已麻醉的非人类哺乳动物体内取出脾，将它切成小块，并将脾膜中的脾细胞挤压通过细胞过滤网的尼龙网而进入一种适当的缓冲液中，从而产生一种单细胞悬浮液。将这些细胞洗涤、离心并且再悬浮于一种裂解任何红细胞的缓冲液中。将该溶液再次离心，并且将球粒中剩余的淋巴细胞最终再悬浮于新鲜的缓冲液中。
一旦在单细胞悬浮液中分离并且存在，这些淋巴细胞可以融合到一种无限增殖细胞系中。典型地这是一种小鼠骨髓瘤细胞系，尽管在本领域中用于产生杂交瘤的多种其他无限增殖细胞系是已知的。优选的鼠类骨髓瘤系包括但不限于：从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可以从美国圣地亚哥市萨克研究院细胞分配中心得到)、X63 Ag8653以及SP-2细胞(可以从美国马里兰州罗克韦尔市美国种质保存中心得到)衍生的骨髓瘤系。使用聚乙二醇或类似物进行融合。然后，将得到的杂交瘤在选择性培养基中生长，这些选择性培养基包含抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或生存的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地应当包括次黄嘌呤、氨蝶呤、以及胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
杂交瘤典型地生长于巨噬细胞的滋养层上。这些巨噬细胞优选地是来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝动物，并且典型地在将杂交瘤铺板之前用不完全弗氏佐剂或类似物预处理数天。在Goding，“MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，”第59页-103页(美国学术出版社(Academic Press)，1986年)中说明了融合方法，其披露内容通过引用结合在此。
允许这些细胞在选择性培养基中生长足够时间用于形成克隆以及产生抗体。这通常是在约7天至约14天之间。
然后，针对抗体的产生对杂交瘤克隆进行测定，这些抗体特异性地结合到TLR3多肽基因产物上，任选地被抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3特异性地识别的表位上。该测定法典型地是一种比色ELISA型测定法，尽管可以使用可适用于杂交瘤生长的这些孔的任何一种测定法。其他测定法包括放射性免疫测定或荧光激活细胞分选。对所希望的抗体产生呈阳性的孔进行检查以确定是否存在一种或多种不同的克隆。如果存在一种以上克隆，可以将这些细胞再克隆并且生长以确保仅有一种单细胞产生生成所希望抗体的克隆。典型地，还可以针对结合TLR3多肽(例如，如以下说明的、包埋于石蜡中的组织切片中的、表达TLR3的细胞)的能力对这些抗体进行测试。
被证实产生本发明的一种单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基中(例如DMEM或RPMI-1640)较大量地生长。可替代地，这些杂交瘤制备可以作为动物体内的腹水肿瘤在体内生长。
在充分生长以产生所希望的单克隆抗体之后，将包含单克隆抗体(或腹水流体)的生长培养基与细胞分开，并且对其中存在的单克隆抗体进行纯化。纯化典型地是通过凝胶电泳法、透析、使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖的色谱法，或连接到固体载体(例如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠粒(例如，在Antibody Purification Handbook，Biosciences(生物科学)，出版号18-1037-46，Edition AC中所说明的全部，其披露内容通过引用结合在此)上的抗小鼠Ig来实现的。典型地，所结合的抗体通过使用低pH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱上洗脱，其中含抗体的馏分被立即中和。根据需要将这些馏分收集、透析并且浓缩。
典型地将具有单个清楚克隆的阳性孔再克隆并且再测定，以确保仅检测并且产生一种单克隆抗体。
正如例如在Ward等人在Nature(《自然》)，341(1989)，第544页中披露的(其全部披露内容通过引用结合在此)，还可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体。
可以使用多种免疫筛选测定法中任何一种容易地确定结合到TLR3上，具体地是与单克隆抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上或实质上相同表位上的一种或多种抗体的身份，在这些免疫筛选测定法中可以对抗体竞争进行评估。许多这类测定是常规地进行的，并且是本领域熟知的(参见例如于1997年8月26日发布的美国专利号5,660,827，具体地其内容通过引用结合在此)。应当理解的是，实际上不再以任何方式要求对在此说明的抗体所结合的表位进行确定以便鉴别结合到与在此说明的单克隆抗体相同的或基本上相同的表位上的抗体。
例如，当有待检查的测试抗体获自不同来源的动物时，或甚至具有不同的Ig同种型时，可以使用一种简单的竞争测定法，其中将对照(例如，31C3、29H3、23C8、28F11或34A)和测试抗体混合(或预吸附)并且应用到含有TLR3多肽的样品上。基于蛋白质印迹法的实验方案和使用BIACORE分析适合用于这类竞争研究。
在某些实施方案中，在应用到TLR3抗原样品上之前人们将对照抗体(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)与不同量值的测试抗体预先混合(例如约1∶10或约1∶100)持续一段时间。在其他实施方案中，可以在暴露于TLR3抗原样品期间将对照与不同量值的测试抗体简单地混合。只要人们可以将已结合的抗体与游离的抗体区别开来(例如，通过使用分离技术或洗涤技术来去除未结合的抗体)，并且将31C3、29H3、23C8、28F11或34A3与测试抗体区别开来(例如，通过使用种属特异性或同种型特异性的二抗、或通过用一种可检出的标记物来特异性地标记31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)，人们可以确定这些测试抗体是否降低了31C3、29H3、23C8、28F11或34A3结合到抗原上，指示该测试抗体识别与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上相同的表位。在缺少完全不相关的抗体时(标记的)对照抗体的结合可被用作对照高值。可以通过将标记的(31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)抗体与完全相同类型的(31C3，29H3，23C8，28F11或34A3)未标记的抗体一起孵育得到对照低值，其中会发生竞争并且降低已标记的抗体的结合。在一个测试测定中，在测试抗体的存在时经标记的抗体反应性出现显著降低表明一种识别基本上相同的表位的测试抗体，即该抗体与经标记的(31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)抗体“交叉反应”或与之竞争。当31C3、29H3、23C8、28F11或34A3∶测试抗体的比例在约1∶10至约1∶100之间时将31C3、29H3、23C8、28F11或34A3与TLR3抗原的结合减低至少约50％，例如至少约60％，或更优选地至少约80％或90％(例如，约65％-100％)的任何何测试抗体被认为是结合到与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这样的测试抗体可以将31C3、29H3、23C8、28F11或34A3与TLR3抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。
还可以通过例如流式细胞计量测试对竞争作用进行评估。在这种测试中，可以将带有给定TLR3多肽的细胞首先与例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3一起孵育，并且然后与标有一种荧光染料或生物素的测试抗体一起孵育。如果当与饱和量的31C3、29H3、23C8、28F11或34A3预孵育时得到的结合是不用31C3、29H3、23C8、28F11或34A3预孵育抗体所得到的结合(如通过荧光所测量)的约80％，优选地是约50％，约40％或更少(例如，约30％，20％或10％)，则可以说该抗体与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争。可替代地，如果在用饱和量的测试抗体来预孵育带有经标记的(通过一种荧光染料或生物素)31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗体的细胞时得到的结合是未经该测试抗体预孵育所得到的结合的约80％，优选地约50％，约40％，或更低(例如，约30％，20％或10％)，则可以说抗体与31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争。
还可以使用一种简单竞争测定，其中测试抗体被预吸附并且以饱和浓度施用到固定着TLR3抗原的表面上。在这种简单的竞争测定中，该表面优选地是一种BIACORE芯片(或适合用于表面等离子共振分析的其他介质)。然后在TLR3饱和浓度下将对照抗体(例如，31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)与该表面接触，并且测量对照抗体的TLR3和表面结合。将对照抗体的结合与在缺少测试抗体时对照抗体与包含TLR3的表面的结合进行比较。在一个测试测定中，在测试抗体的存在下包含TLR3的表面被对照抗体结合的显著降低表明该测试抗体识别与对照抗体基本上相同的表位，这样使得该测试抗体与对照抗体进行“交叉反应”。将对照(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)抗体与TLR3抗原的结合降低至少约30％或更多，优选地约40％的任何测试抗体抗原被认为是结合到与对照(例如，31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)基本上相同表位或决定簇上的抗体。优选地，这样的测试抗体可以将对照抗体(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)与TLR3抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％，至少约70％，或更多)。应当理解的是对照和测试抗体的顺序可以逆转。即，在一个竞争测定中可以首先将对照抗体结合到表面上并且之后将测试抗体与该表面接触。优选地，首先将对TLR3抗原具有较高亲和性的抗体结合到该表面上，正如所预期的二抗结合的降低(假设这些抗体是交叉反应的)将是较大规模的。这类测定的另外的实例提供于例如Saunal(1995)J.Immunol.Methods183：33-41中，其披露的内容通过引用结合在此。
能够以本领域普通技术人员已知的多种方式来确定抗体是否结合在表位区域中。作为这类作图/表征方法的一个实例，可以使用化学修饰TLR3蛋白中暴露的胺/羧基、通过表位“足迹法”确定抗TLR3抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及反向交换，其中保护参与蛋白结合的主链酰胺基团免受反向交换并且因此将保持被氘化。可以在这一点上通过胃蛋白酶水解作用、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱法来鉴别相关区域。参见，例如Ehring H，AnalyticalBiochemistry，Vol.267(2)pp.252-259(1999)Engen，J.R.和Smith，D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。适当的表位鉴别技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地将游离抗原和与结合抗原肽复合的抗原的二维NMR谱图中信号的位置进行比较。典型地用15N对该抗原进行选择性核素标记，这样使得在NMR谱图中可以看到仅相应于抗原的信号以及没有来自该抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比较，在复合物谱图中由涉及与抗原结合肽相互作用的氨基酸所产生的抗原信号典型地将移动位置，并且用这种方法可以鉴别涉及该结合的氨基酸。参见，例如，Ernst Schering Res FoundWorkshop.2004；(44)：149-67；黄(Huang)等人在Journal of Molecular Biology，Vol.281(1)pp.61-67(1998)；以及Saito和Patterson，Methods.1996 Jun；9(3)：516-24。
还可以使用质谱法进行表位作图/表征。参见，例如，Downward，JMass Spectrom.2000 Apr(2000年4月)；35(4)：493-503以及Kiselar和Downard，Anal Chem.1999 May 1(1999年5月1日)；71(9)：1792-801。在表位作图以及鉴别时，蛋白酶消化技术也可能是有用的。可以通过蛋白酶消化(例如通过以相当于TLR3约1∶50的比率使用胰蛋白酶或在pH 7-8下进行o/n消化)，随后针对蛋白身份进行质谱(MS)分析来确定抗原决定簇相关区域/序列。被抗TLR3粘合剂保护而免受胰蛋白酶切割的肽可以随后通过将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体孵育的、并且之后经历例如通过胰蛋白酶来消化的样品进行比较来鉴别(由此显示粘合剂的足迹)。在类似的表位表征方法中还可以或可替代地可以使用其他酶像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。而且，酶消化可以提供一种快速方法来用于分析一种潜在的抗原决定簇序列是否在TLR3多肽的一个区域内，该区域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能的是不相关的。关于类似技术的讨论参见例如Manca，Ann Ist Super Sanita.1991；27：15-9。
定点诱变是用于说明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白片段中每个残基都用一个丙氨酸残基替换，并且测量结合亲和性的结果。如果该突变导致结合亲和性显著降低，它最可能涉及结合。可以使用对结构性表位具有特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来证实该丙氨酸取代不影响蛋白的整体折叠。参见，例如，Clackson和Wells，Science(科学)1995；267：383-386；以及Wells，Proc Natl Acad Sci USA 1996；93：1-6。
还可以将电镜法用于表位“足迹法”。例如王(Wang)等人，Nature(《自然》)1992(年)；355：275-278使用冷冻电子显微镜术、三维图像重建、以及X射线晶体法的协同应用来确定天然锡兰豇豆花叶病毒的衣壳表面上的一个Fab片段的物理足迹。
用于表位评估的其他形式的“无标记”测定包括表面等离振子共振(SPR，BIACORE)以及反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，
Figure BDA0000129597990000371
等人，Journal Of Molecular Recognition 1990；3：208-14；Nice等人，J.Chroma-togr.1993；646：159-168；Leipert等人，Angew.Chem.Int.Ed.1998；37：3308-3311；等人，Biosensors and Bioelectronics(生物传感器与生物电子学)2002；17：937-944。
还应当注意的是可以在此说明的示例性竞争测定的一项或多项中鉴别出结合与本发明抗体相同的或基本上相同表位的抗体。
一旦鉴定出抗体能够结合TLR3和/或具有其他所希望的特性，典型地还可以使用标准方法(包括在此说明的那些方法)针对它们结合其他多肽(包括不相关的多肽以及其他TLR家族成员(例如人类TLR1，2，或4-10))的能力对它们进行评估。理想地是，这些抗体仅以显著的亲和性结合到TLR3上(例如人类TLR3)，不以显著水平结合到不相关的多肽上或其他TLR家族成员上(例如，TLR2或TLR4；在NCBI登录号NP_612564中发现在氨基酸残基1-23处包括一个信号肽的人类前体TLR4的氨基酸序列，其披露内容通过引用结合在此)。然而，应当理解的是，只要与针对其他TLR家族成员(或其他不相关多肽)的亲和性相比较，对于TLR3的亲和性是显著地更大的(例如5x、10x、50x、100x、500x、1000x、10,000x、或更大)，则这些抗体适合用于本方法中。
还可以在非人类灵长类动物体内(例如，食蟹猴、或其他哺乳动物，例如小鼠)对抗体结合到表达TLR3的细胞上进行评估。因此本发明提供了一种抗体，以及它们的片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物特异性地结合TLR3，并且此外它们结合来自非人类灵长类动物的TLR3(例如，食蟹猴)。任选地，对细胞摄入或定位，任选地在亚细胞区室中的定位(例如内吞途径)进行评估以选择易于摄入细胞中和/或摄入细胞区室中的一种抗体(其中表达TLR3)。通常在细胞中测量细胞摄入或定位，在这些中寻找到抗体或抗体据信例如在DC中发挥其活性。可以通过标准方法(例如通过使用标记有可检出部分(例如荧光部分)的抗体的共聚焦染色)对细胞摄入或定位进行评估。
当在脊椎动物或细胞中免疫并且产生抗体时，可以执行特定的选择来分离所要求的抗体。在此方面，在一个具体的实施方案中，本发明还涉及产生这类抗体的方法，包括：(a)用一种包括TLR3多肽的免疫原来免疫一种非人类哺乳动物；以及(b)从所述免疫的动物体内制备抗体；以及(c)从步骤(b)中选择能够结合TLR3的抗体。可以在相应于细胞溶胶区室(例如，内体区室)中那些情况的酸性条件下(例如pH在约5.5至6.5之间)对结合到TLR3上对这些抗体进行测试。
可以确定在酸性条件下这些抗体针对人类TLR3的二价结合亲和性。可以例如通过不大于约(例如亲和性好于)100、60、10、5、或1纳摩尔，优选地亚纳摩尔或任选地不大于约300、200，100或10皮摩尔的平均KD对抗体进行表征。例如可以通过将重组产生的人类TLR3蛋白固定在芯片表面上，随后使用溶液中有待测试的抗体来确定KD(例如，如在本发明实例中所示)。为了选择在酸性和中性条件下保持类似结合性的抗体，人们可以设法将观察到的、在中性pH(例如7.2)和酸性pH(例如，在4.5-6-5范围内的pH)下结合性之间的差异降至最低，例如其中在酸性pH下结合亲和性并非显著低于在非酸性pH下观察到的情况(例如，其中结合到TLR3上的KD降低不大于0.2-、0.3-、0.5-、1.0-、或1.5-log10)。在一个实施方案中，该方法进一步包括一个步骤(d)，从(b)中选择能够与抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3竞争结合到TLR3上的抗体。
在任何一个实施方案的一个方面中，根据本发明制备的抗体是单克隆抗体。在另一个方面，根据本发明的方法用于产生抗体的非人类动物是一种哺乳动物，例如一种啮齿动物、牛、猪、家禽、马、兔、山羊、或绵羊。本发明的抗体涵盖31C3、29H3、23C8、28F11或34A3。然而，应当理解的是可以使用在此说明的方法得到其他抗体，并且因此本发明的抗体可以是除了31C3、29H3、23C8、28F11或34A3之外的抗体。另外，本发明的抗体可以任选地被特化为除了抗体TLR3.7(eBioScience公司，圣地亚哥)、WO06/060513的抗体C1068、WO 2007/051164的抗体C1130中任何一项，WO2010/051470披露的抗体中任何一项(例如抗体1-19和F17-F19，抗体40C1285(Abcam)，或抗体619F7、713E4、716G10、IMG-5631、IMG-315或IMG-5348(都来自Imgenex公司))或上述各项的衍生物(例如这些衍生物全部地或部分地包括抗原结合区)之外的抗体。
根据一个替代的实施方案，编码结合TLR3多肽上存在的一个表位的DNA从本发明的杂交瘤中分离出，并且被置于一种适当的表达载体中用于转染到适当的宿主中。然后该宿主用于重组产生该抗体、或其变异体，例如该单克隆抗体的一种人源化形式、该抗体的活性片段，嵌合体抗体(包括该抗体的抗原识别部分)、或包括一个可检出部分的形式。
使用常规步骤可以很容易对编码本发明单克隆抗体的DNA(例如抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)进行分离和测序(例如，通过使用寡核苷酸探针，这些探针能够特异性地结合到对鼠类抗体的重链和轻链进行编码的基因上)。一旦分离，该DNA被置于表达载体中，然后将这些载体被转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，这些细胞不另外产生免疫球蛋白，从而在重组体宿主细胞中得到单克隆抗体的合成。如在本说明书的其他地方所说明，可以出于多个目的中任何一项(例如，用于人源化抗体、产生片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列)而例如在抗原结合位点中对这类DNA序列进行修饰，从而优化该抗体的结合特异性。
在细菌中对编码该抗体的DNA进行重组体表达是本领域熟知的(参见，例如，Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5，pp.256(1993)；和Pluckthun，Immunol.130，p.151(1992))。
对抗体调节TLR3信号传送的能力进行评估
在某些实施方案中，本发明的抗体能够调节，例如抑制TLR3多肽的信号传送，并且因而调节了表达TLR3的细胞的活性或行为。例如，这些抗体可以抑制表达TLR3的细胞的激活(例如，它们可以抑制TLR3信号传导途径)，任选地不阻断结合到天然的或内源配体的TLR3上(例如dsRNA)；任选地它们可以在TLR3配体的存在下阻断TLR3蛋白形成同型二聚体的能力，因此阻断引信号传送级联放大。因此，这些抗体称为“中和化”或“抑制性”或“阻断性”抗体。除了其他用途之外，这类抗体用于降低表达TLR3的免疫细胞的活性，例如用于治疗或预防涉及表达TLR3的细胞过量活性或数量的病症，或其中降低表达TLR3的细胞的活性可以改善、防止、消除、或以任何方式改进该病症或其任何症状。
可以使用一系列细胞测定法来对抗体调节TLR3信号传送的能力进行评估。可以使用大量测定法中任何一项(包括分子的、基于细胞的、以及基于动物的模型)来对抗TLR3抗体调节表达TLR3的细胞活性的能力进行评估。例如，可以使用基于细胞的测定法，其中将表达TLR3的细胞暴露于dsRNA、病毒dsRNA、聚IC、或聚AU、或另一种TLR3配体，并且对该抗体破坏配体的结合或刺激受体的能力进行评估(正如所确定的，例如通过检查在此提出的TLR3细胞活性的任何一项，例如干扰素表达、NFkB活性、NK细胞激活等)。用于这些测定法中的TLR3配体可以是处于任何适当形式，包括但不限于作为一种纯化的配体组合物、以与多种非TLR3配体一起的混合物形式、以天然发生的组合物形式、在细胞中或在细胞表面上、或由细胞分泌(例如，在该测定法中使用产生配体的细胞)、在溶液中或在固体载体上。
还可以在缺少配体下通过将细胞暴露于抗体本身、并且对它在细胞活性或行为的任何一个方面上的作用进行评估而对表达TLR3的细胞的活性进行评估。在这类测定中，在缺少配体下得到表达TLR3的细胞其活性的基线水平(参见以下，例如细胞因子产生、增殖)，并且对抗体或化合物改变基线活性水平的能力进行检测。在一个这样的实施方案中，使用一种高通量筛选方法来鉴别能够影响受体激活的化合物。
可以使用影响TLR3活性的任何适当的生理学改变来对测试抗体或抗体衍生物进行评估。例如，人们可以测量多种作用，例如基因表达的改变(例如，NFkB应答基因)、蛋白质分泌(例如，干扰素)、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP、或cAMP)，或活性(例如激活NK细胞的能力)。在一个实施方案中，通过检测细胞因子(例如响应TLR3的细胞因子、促炎细胞因子)的产生对受体的活性进行评估。
可以使用多种可读出系统中的任何一种对TLR3调节进行评估，主要基于TLR/IL-1R信号传导途径，涉及例如MyD88独立型/TRIF依赖型信号传导途径，涉及例如IRF3、IRF7、IKKε和/或TBK1(Akira和Takeda(2004)Nature Review Immunol.4：499-511)信号传导途径。这些途径激活了激酶，包括KB激酶复合物。可以通过对TLR信号传送的任何一个方面进行检查而对TLR3激活进行评估。例如，TLR信号传送的激活在以下方法触发了改变：蛋白-蛋白相互结合(例如，TRIF与TBK和/或IKKε)、蛋白的细胞内定位(例如NK-kB移动进入细胞核中)、以及基因表达(例如在NK-kB敏感性基因的表达方面)、以及细胞因子产生(例如，IFN-IFN-γ、IL-6、IP10、MCP-1、IL-6、IP10、MCP-1的产生和分泌)。任何一种这样的改变可以被检测并且用于检测TLR3激活。在一个实施方案中，通过在培养18-20小时之后收集上清液并且通过夹心ELISA测量IFN-γ、IL-6、IP-10和/或MCP-1来检测TLR3刺激作用。在另一个实施方案中，通过在培养18-20小时之后收集上清液并且通过夹心ELISA测量IFN-γ、IL-6、IP-10和/或MCP-1来检测TLR3刺激作用。
在一个实施方案中，使用天然表达TLR3的细胞，例如DC(例如髓样DC或单核细胞衍生的DC)。在另一个实施方案中，使用包含一种报告基因构建体的细胞，当TLR3刺激时该构建体引起一种可检出基因产物的表达以及随之而来信号传导途径的激活。对于这些测定法而言特别有用的报告基因和报告基因构建体包括：例如可操作地连接到一个启动子上的报告基因，该启动子对NF-kB或对具体地由TRIF、IRF3、IRF7、IKKε、TBK1介导的信号敏感。这类启动子的实例包括但不限于用于IL-α、IL-6、IL-8、IL-12p40、IP-10、CD80、CD86、以及TNF-α的那些启动子。可操作地连接到TLR敏感的启动子上的报告基因可以包括但不限于一种酶(例如，荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)、一种生物发光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP，例如，美国专利号5,491,084)、蓝色荧光蛋白(BFP，例如美国专利号6,486,382等)、一种表面表达的分子(例如，CD25、CD80、CD86)，以及一种分泌的分子(例如，IL-1、IL-6、IL-8、IL-12p40、TNF-α)。参见，例如Hcker H等人在(1999)EMBO J.18：6973-82；Murphy TL等人在(1995)Mol Cell Biol 15：5258-67，它们披露的内容通过引用结合在此。适合使用的报告基因质粒是可商购的(加利福尼亚州圣地亚哥市InvivoGen)。在一个实施方案中，该测定法包括在制造用来表达人类TLR3多肽的宿主细胞中确定在对TLR3信号传导(例如ISRE，即IFN-刺激的应答元件)应答的启动子的控制下测试组合物是否诱导荧光素酶表达(或其他报告基因)。
在依赖于酶活性读数的测定中，底物可以作为该测定的一部分来供应，并且检测可以涉及以下方面的测量：化学发光、荧光、显色、放射性标记物的结合、耐药性、光密度或酶活性的其他标志物。对于依赖于分子的表面表达的测定而言，可以使用流式细胞计数法(FACS)分析或功能性测定来实现检测。可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或生物测定法来测定分泌的分子。在本领域中许多这些和其他适当的读出系统是熟知的并且是可商购的。优选地，该报告基因系统(无论使用哪一种)是可定量的。
在另一个实施方案中，在非人类灵长类动物体内评估了这些抗体对表达TLR3的细胞的作用。例如，将包括本发明的一种抗TLR3抗体的药用组合物给予一个非人类灵长类动物体，该动物或者是健康的亦或患有一种病症，例如一种自身免疫性疾病或炎症，并且评估了这种给药对例如该灵长类动物体内表达TLR3的细胞的数量或活性、细胞因子的存在和/或水平方面，或在病症进展方面的作用。在这些TLR3相关参数中任何一项中产生可检出改变的任何一种抗体或抗体衍生物或片段是用于在此说明的方法中的候选物。
在此说明的任何一项测定中，细胞中TLR3刺激的活性的任何可检出测量值增加或降低5％、10％、20％、优选地30％、40％、50％、最优选地60％、70％、80％、90％、95％、或更大表明该测试抗体适合用于本发明的方法。
当对抑制性抗TLR3抗体进行评估时，可以有利地选择抗体以改变与炎症或自身免疫性相关的任何参数。例如，可以选择抗体来降低细胞中的激活作用，特别是促炎细胞因子的产生。例如这些细胞可以获自患有炎性或自身免疫性疾病的个体。
抗体CDR序列
在本发明的任何一个实施方案的一个方面中，抗体可以包括具有根据选自式(I)至(XX)对应式的CDR1、2和/或3序列的一个重链和/或轻链。在此的任何一个实施方案中，具体的HCDR1-3或LCDR-1-3可以被限定为具有式(I)至(XX)的一个序列。在一个优选的实施方案中，该抗体包括包含这三个LCDR的一个轻链以及包含这三个HCDR的一个重链。任选地，提供了一种抗体，其中这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到IgG型的一个免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选是一个IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方案中，LCDR1具有式(I)：
R-A-S-E-N-I-Y-S-Xaa1-L-A(I)(SEQ ID NO：61)，
其中，Xaa1可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa1可以是Ser、Tyr或Asn。
在一个实施方案中，LCDR2具有式(II)：
Xaa2-A-K-T-L-A-E(II)(SEQ ID NO：62)，
其中，Xaa2可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa2可以是Asn或Tyr。
在一个实施方案中，LCDR3具有式(III)：
Q-H-H-Y-G-T-P-Xaa3-T(III)(SEQ ID NO：63)，
其中，Xaa3可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa3可以是Tyr、Phe、Pro。
在一个实施方案中，LCDR1具有式(IV)：
Xaa4-A-S-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(IV)(SEQ ID NO：64)，其中Xaa4至Xaa12可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa4可以是Arg、Ser或Lys，和/或Xaa5可以是Glu、Ser或Gln、和/或Xaa6可以是Asn或Ser、和/或Xaa7可以是Ile或Val，和/或Xaa8可以是一个缺失，Tyr或Arg，和/或Xaa9可以是Ser或Thr，和/或Xaa10可以是Tyr、Asn或Ser、和/或Xaa11可以是Leu、Met或Val、和/或Xaa12可以是Ala或Phe。
在一个实施方案中，LCDR1具有式(V)：
Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-L-A-Xaa17(V)(SEQ ID NO：65)
其中Xaa13至Xaa17可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa13可以是Leu、Asn或Tyr、和/或Xaa14可以是Ala或Thr，和/或Xaa15可以是Lys或Ser，和/或Xaa16可以是Asn或Thr，和/或Xaa17可以是Glu或Ser。
在一个实施方案中，LCDR2具有式(VI)：
Xaa18-A-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23(VI)(SEQ ID NO：66)其中Xaa19至Xaa23可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa18可以是Tyr，Asn或Leu，和/或Xaa19可以是Ser或Lys，和/或Xaa20可以是Asn或Thr，和/或Xaa21可以是Leu或Arg，和/或Xaa22可以是Ala或His，和/或Xaa23可以是Thr或Glu。
在一个实施方案中，LCDR2具有式(VII)：
L-Xaa24-S-N-Xaa25-Xaa26-Xaa27(VII)(SEQ ID NO：67)
其中Xaa24至Xaa27可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa24可以是Thr或Ala，和/或Xaa25可以是Leu或Arg，和/或
Xaa26可以是Ala或His，和/或Xaa27可以是Ser或Thr。
在一个实施方案中，LCDR3具有式(VIII)：
Q-Xaa28-Xaa29-Xaa30-G-Xaa31-P-Xaa32-T(VIII)(SEQ ID NO：68)
其中Xaa28至Xaa32可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa28可以是His或Gln，和/或Xaa29可以是His或Trp，和/或Xaa30可以是Tyr或Thr，和/或Xaa31可以是Thr或Asn，和/或Xaa32可以是Tyr，Phe或Pro。
在一个实施方案中，LCDR3具有式(IX)：
Xaa33-Xaa34-H-Xaa35-Xaa36-Xaa37-P-Xaa38-T(IX)(SEQ ID NO：69)
其中Xaa33至Xaa38可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa33可以是Gln或Leu，和/或Xaa34可以是His或Gln，和/或Xaa35可以是Trp或Tyr，和/或Xaa36可以是Asn或Gly，和/或Xaa37可以是Tyr或Thr，和/或Xaa38可以是Tyr，Phe或Pro。
在一个实施方案中，LCDR3具有式(X)：
Xaa39-Q-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-P-Xaa44-T(X)(SEQ ID NO：70)
其中Xaa40至Xaa44可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa39可以是Gln或Leu，和/或Xaa40可以是Trp或His，和/或Xaa41可以是Thr或Trp，和/或Xaa42可以是Gly或Asn，和/或Xaa43可以是Asn或Tyr，和/或Xaa44可以是Pro或Tyr。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XI)：
G-Y-S-F-T-G-Y-Xaa45-Xaa46-H(XI)(SEQ ID NO：71)
其中Xaa45至Xaa46可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa45可以是Phe或Tyr，和/或Xaa46可以是Met或Ile。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XII)：
G-Y-S-F-T-Xaa47-Y-Xaa48-M-H(XII)(SEQ ID NO：72)
其中Xaa47至Xaa48可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa47可以是Gly或Ala，和/或Xaa48可以是Phe或Tyr。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XIII)：
G-Y-S-F-T-Xaa49-Y-Y-Xaa50-H(XIII)(SEQ ID NO：73)
其中Xaa49至Xaa50可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa49可以是Gly或Ala，和/或Xaa50可以是Ile或Met。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XIV)：
G-Y-Xaa51-F-T-Xaa52-Y-Xaa53-Xaa54-Xaa55(XIV)(SEQ ID NO：74)其中Xaa51至Xaa55可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa51可以是Val或Ser，和/或Xaa52可以是Thr、Gly或Ala和/或Xaa53可以是Ser，Tyr或Phe，和/或Xaa54可以是Ile或Met，和/或Xaa55可以是Tyr或His。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XV)：
G-Y-S-Xaa56-T-Xaa57-G-Y-Xaa58-Xaa59-H(XV)(SEQ ID NO：75)
其中Xaa56至Xaa59可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa56可以是Ile或Phe，和/或Xaa57可以是一个缺失或Ser，和/或Xaa58可以是Ser、Tyr或Phe，和/或Xaa59可以是Trp，Ile或Met。
在一个实施方案中，HCDR1具有式(XVI)：
G-Y-Xaa60-Xaa61-T-Xaa62-Xaa63-Y-S-Xaa64-Xaa65(XVI)(SEQ ID NO：76)其中Xaa60至Xaa65可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa60可以是Val或Ser，和/或Xaa61可以是Phe或Ile，和/或Xaa62可以是Thr或Ser，和/或Xaa63可以是缺失或Gly，和/或Xaa64可以是Ile或Trp，和/或Xaa65可以是Tyr或His。
在一个实施方案中，HCDR2具有式(XVII)：
R-I-N-P-Y-Xaa66-G-A-T-S-Xaa67-N-Xaa68-N-F-K-D(XVII)(SEQ ID NO：77)
其中Xaa66至Xaa68可以是一个保守的或不保守的取代或一起缺失或插入，优选地，其中Xaa66可以是Asn或Tyr，和/或Xaa67可以是缺失或Tyr，和/或Xaa68可以是Arg或Gln.。
在一个实施方案中，HCDR2具有式(XVIII)：
R-I-N-P-Y-Xaa66-G-A-T-S-Y-N-Q-N-F-K-D(XVIII)(SEQ ID NO：78)
其中Xaa66可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa66可以是Asn或Tyr。
在一个实施方案中，HCDR2具有式(XIX)：
R-I-N-P-Y-N-G-A-T-S-Y-N-Xaa68-N-F-K-D(XIX)(SEQ ID NO：79)
其中Xaa68可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa68可以是Arg或Gln。
在一个实施方案中，HCDR2具有式(XX)：
Y-I-Xaa69-Xaa70-Y-Xaa71-G-Xaa72-T-Xaa73-Y-N-Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78(XX)(SEQ ID NO：80)
其中Xaa69至Xaa78可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa69可以是Asp或His，和/或Xaa70可以是一个缺失或Pro，和/或Xaa71可以是Ser或Asn，和/或Xaa72可以是Ile或Asp，和/或Xaa73可以是Ser或Asn，和/或Xaa74可以是Gln或Pro，和/或Xaa75可以是Lys或Ser，和/或Xaa76可以是Phe或Leu，和/或Xaa77可以是Lys或Arg，和/或Xaa78可以是Gly或Ser。
在一个实施方案中，HCDR2具有式(XXI)：
Xaa79-I-Xaa80-Xaa81-Y-Xaa82-G-Xaa83-T-Xaa84-Xaa85-N-Xaa86-Xaa87-Xaa88-Xaa89-Xaa90(XXI)(SEQ ID NO：81)
其中Xaa79至Xaa90可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa79可以是Arg或Tyr，和/或Xaa80可以是Asn、Asp或His，和/或Xaa81可以是一个缺失或Pro，和/或Xaa82可以是Tyr、Asn或Ser，和/或Xaa83可以是Ile、Asp或Ala，和/或Xaa84可以是Ser或Asn，和/或Xaa85可以是一个缺失或Tyr，和/或Xaa86可以是Pro、Arg或Gln，和/或Xaa87可以是Ser、Lys或Asn，和/或Xaa88可以是Phe或Leu，和/或Xaa89可以是Lys或Arg，和/或Xaa90可以是Asp或Gly。
在一个实施方案中，HCDR3具有式(XXII)：
Xaa91-Xaa92-G-Xaa93-Xaa94-Y-Xaa95-F-D-Y(XXII)(SEQ ID NO：82)
其中Xaa91至Xaa95可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa91可以是Asp或Ser，和/或Xaa92可以是Asp或Gly，和/或Xaa93可以是Gly或Asn，和/或Xaa94可以是Asn或Thr，和/或Xaa95可以是Pro或一个缺失。
在一个实施方案中，HCDR3具有式(XXIII)：
Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-Y-Xaa101-Xaa102-D-Y(XXIII)(SEQ ID NO：83)
其中Xaa96至Xaa102可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa96可以是S或D，和/或Xaa97可以是G、T D，和/或Xaa98可以是G、K或一个缺失，和/或Xaa99可以是G、L、N或一个缺失，和/或Xaa100可以是Y、T、G、N，和/或Xaa101可以是P、G或一个缺失，和/或Xaa102可以是M、F或L。
在一个实施方案中，HCDR3具有式(XXIV)：
Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108-Xaa109-F-D-Y(XXIV)(SEQ ID NO：84)
其中Xaa103至Xaa109可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa103可以是A sp、Ser、Glu，和/或Xaa104可以是Asp或Gly，和/或Xaa105可以是Gly或Asn，和/或Xaa106可以是Asn、Tyr或Gly，和/或Xaa107可以是Asn、Thr或Tyr，和/或Xaa108可以是Tyr或Gly，和/或Xaa109可以是Tyr、Pro或一个缺失。
在一个实施方案中，HCDR3具有式(XXV)：
Xaa110-G-Xaa111-Xaa112-Y-Xaa113-Xaa114-Xaa115-D-Y(XXV)(SEQ ID NO：85)
其中Xaa110至Xaa115可以是一个保守的或不保守的取代或一个缺失或插入，优选地，其中Xaa110可以是Glu或Asp，和/或Xaa111可以是Asn或一个缺失，和/或Xaa112可以是Tyr或一个缺失，和/或Xaa113可以是Tyr或Gly，和/或Xaa114可以是Tyr或Gly，和/或Xaa115可以是Met或Phe。
在一个实施方案中，本发明的一种抗体可以包括一个轻链，该轻链包括：
a种选自SEQ ID NOS：61、64以及65的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；和/或
b种选自SEQ ID NOS：62、66以及67的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列；和/或
c种选自SEQ ID NOS：63、68、69以及70的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的一种抗体可以包括一个重链，该重链包括：
a种选自SEQ ID NOS：71至76的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；和/或
b种选自SEQ ID NOS：77至81的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；和/或
c种选自SEQ ID NOS：82至85的重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列。
抗体29H3
已经将产生抗体29H3的细胞存放在CNCM，登录号为I-4187；也已经对抗体29H3进行了测序。重链可变区的氨基酸序列列出为SEQ IDNO：10，轻链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：11。对该重链和轻链可变区进行编码的核酸序列对应地列于SEQ ID NOS 53以及54中。在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体29H3基本上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括一种抗体29H3的抗原结合区。在此的任何一个实施方案中，抗体29H可以通过其氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，该单克隆抗体包括29H3的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括29H3的重链可变区。根据一个实施方案，该单克隆抗体包括29H3重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该抗体进一步包括29H3的可变的轻链可变区或29H3轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地任何一个或多个所述轻链或重链CDR可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包括部分或全部的抗体29H3的抗原结合区的这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到一个IgG型免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选地一个IgG1或IgG4同种型。在另一个优选实施方案中，该抗体是29H3。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化的多肽，该多肽编码一种抗体，其中该抗体包括：一个VHCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：12中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：13中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：14中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：15中所给出的氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：16中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；和/或一个VLCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：17中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在又另一个方面中，本发明提供了一种抗体，该抗体包括各自具有至少三个CDR的一个重链和/或一个轻链，其中该至少三个CDR中的一个、两个或三个具有针对对应的重链和轻链的序列SEQ ID NO：12至14以及15至17，并且在酸性条件下它们的抗体特异性地结合到TLR3上。
在另一个方面，本发明提供了结合人类TLR3的一种抗体，该抗体包括：
a SEQ ID NO：10的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO：11的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO：10的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO：11的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO：12、13和14中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
e对应地如SEQ ID NO：15、16和17中所示的轻链(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
f如SEQ ID NO：12、13和14中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO：15、16和17中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
g与具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
h与具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在此任何一个实施方案的另一个方面中，重链和轻链的CDR 1、2以及3的任何一项可以表征为具有一个氨基酸序列，该序列与对应SEQ ID NO中所列的特定CDR或CDR组享有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与上述(a)至(h)的一种单克隆抗体竞争TLR3结合。
抗体31C
已经将产生抗体31C3的细胞存放在CNCM，登录号为I-4186；也已经对抗体31C3进行了测序。重链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：2，并且轻链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：3。对该重链和轻链可变区进行编码的核酸序列对应地列于SEQ ID NOS 51以及52中。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体31C3基本上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括一种抗体31C3的抗原结合区。在此任何一个实施方案中，抗体31C3可以通过其氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，该单克隆抗体包括31C3的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括31C3的重链可变区。根据一个实施方案，该单克隆抗体包括31C3的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该抗体进一步包括31C3的可变的轻链可变区或31C3轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地任何一个或多个所述轻链或重链CDR可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包括部分的或全部的抗体31C3的抗原结合区的这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到一个IgG型免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选是一个人类IgG1或IgG4同种型。在另一个优选实施方案中，该抗体是31C3。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化的多肽，该多肽编码一种抗体，其中该抗体包括：一个VHCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：4中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：5中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：6中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR2区，该区包括如SEQID NO：8中列出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：9中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在又另一个方面中，本发明提供了一种抗体，该抗体包括各自具有至少三个CDR的一个重链和/或一个轻链，其中该至少三个CDR中的一个、两个或三个具有针对对应的重链和轻链的序列SEQ ID NO：4至6以及7至9，并且在酸性条件下它们的抗体特异性地结合到TLR3上。
在另一个方面，本发明提供了结合人类TLR3的一种抗体，该抗体包括：
a SEQ ID NO：2的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO：3的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
cSEQ ID NO：2的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO：3的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO：4和5中所示的重链CDR 1和2(HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；任选地其中该重链包括如SEQ ID NO：4、5和6中所示的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
e如SEQ ID NO：7、8和9中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
f如SEQ ID NO：4、5和6中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO：7、8和9中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
g与具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
h与具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在此任何一个实施方案的另一个方面中，重链和轻链的CDR 1、2以及3的任何一项可以表征为具有一种氨基酸序列，该序列与对应SEQ ID NO中所列的特定CDR或CDR组享有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与上述(a)至(h)的一种单克隆抗体竞争TLR3结合。
抗体23C8
已经对抗体23C8进行了测序。重链可变区的氨基酸序列列出为SEQID NO：26，并且轻链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：27。对该重链和轻链可变区进行编码的核酸序列对应地列于SEQ ID NOS 57以及58中。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体23C8基本上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体23C8的一个抗原结合区。在此任何一个实施方案中，抗体23C8可以通过其氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，该单克隆抗体包括23C8的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括23C8的重链可变区。根据一个实施方案，该单克隆抗体包括23C8的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该抗体进一步包括23C8的可变的轻链可变区或23C8的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地任何一个或多个所述轻链或重链CDR可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包括部分或全部的抗体23C8的抗原结合区的这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到IgG型的一个免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选是一个人类IgG1或IgG4同种型。在另一个优选的实施方案中，该抗体是23C8。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化的多肽，该多肽编码一种抗体，其中该抗体包括：一个VHCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：28中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：29中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：30中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：31中所给出的氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：32中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR3区，该区包括如SEQ IDNO：33中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在又另一个方面中，本发明提供了一种抗体，该抗体包括各自具有至少三个CDR的一个重链和/或一个轻链，其中该至少三个CDR中的一个、两个或三个具有针对对应的重链和轻链的序列SEQ ID NO：28至30以及31至33，并且在酸性条件下它们的抗体特异性地结合到TLR3上。
在另一个方面，本发明提供了结合人类TLR3的一种抗体，该抗体包括：
a SEQ ID NO：26的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO：27的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO：26的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO：27的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO：28和29中所示的重链CDR 1和2(HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；任选地其中该重链包括如SEQ ID NO：28、29和30中所示的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
e如SEQ ID NO：31、32和33中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
f如SEQ ID NO：28、29和30中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO：31、32和33中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
g与具有SEQ ID NO：26氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
h与具有SEQ ID NO：27氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在此任何一个实施方案的另一个方面中，重链和轻链的CDR 1、2以及3的任何一项可以表征为具有一种氨基酸序列，该序列与对应的SEQ IDNO中所列的特定CDR或CDR组享有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与上述(a)至(h)的一种单克隆抗体竞争TLR3结合。
抗体28F1
经对抗体28F11进行了测序。重链可变区的氨基酸序列列出为SEQ IDNO：18，并且轻链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：19。对该重链和轻链可变区进行编码的核酸序列对应地列于SEQ ID NOS 55以及56中。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体28F11基本上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体28F11的一种抗原结合区。在此任何一个实施方案中，抗体28F11可以通过其氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，该单克隆抗体包括28F11的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括28F11的重链可变区。根据一个实施方案，该单克隆抗体包括28F11的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该抗体进一步包括28F11的可变的轻链可变区或28F11的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地任何一个或多个所述轻链或重链CDR可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包括部分或全部的抗体28F11的抗原结合区的这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到IgG型的一个免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选是一个人类IgG1或IgG4同种型。在另一个优选实施方案中，该抗体是28F11。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化的多肽，该多肽编码一种抗体，其中该抗体包括：一个VHCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：20中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：21中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：22中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：23中所给出的氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：24中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：25中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在又另一个方面中，本发明提供了一种抗体，该抗体包括各自具有至少三个CDR的一个重链和/或一个轻链，其中该至少三个CDR中的一个、两个或三个具有针对对应的重链和轻链的序列SEQ ID NO：20至22以及23至25，并且在酸性条件下它们的抗体特异性地结合到TLR3上。
在另一个方面，本发明提供了结合人类TLR3的一种抗体，该抗体包括：
a SEQ ID NO：18的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO：19的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO：18的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO：19的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO：20和21中所示的重链CDR 1和2(HCDR1，HCDR2)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；任选地其中该重链包括如SEQ ID NO：20、21和22中所示的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
e如SEQ ID NO：23，24和25中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
f如SEQ ID NO：20、21和22中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO：23、24和25中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
g与具有SEQ ID NO：18氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
h与具有SEQ ID NO：19氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在此任何一个实施方案的另一个方面中，重链和轻链的CDR 1、2以及3的任何一项可以表征为一种氨基酸序列，该序列具有与对应的SEQ IDNO中所列的特定CDR或CDR组享有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与上述(a)至(h)的一种单克隆抗体竞争TLR3结合。
抗体34A3
已经对抗体34A3进行了测序。重链可变区的氨基酸序列列出为SEQID NO：34，并且轻链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO：35。对该重链和轻链可变区进行编码的核酸序列对应地列于SEQ ID NOS 59以及60中。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体34A3基本上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体34A3的一种抗原结合区。在此任何一个实施方案中，抗体34A3可以通过其氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，该单克隆抗体包括34A3的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括34A3的重链可变区。根据一个实施方案，该单克隆抗体包括34A3的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该抗体进一步包括34A3的可变的轻链可变区或34A3的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地任何一个或多个所述轻链或重链CDR可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包括部分的或全部的抗体34A3的抗原结合区的这些轻链和/或重链可变区中任何一项被融合到IgG型的一个免疫球蛋白恒定区上，任选是一个人类恒定区，任选是一个人类IgG1或IgG4同种型。在另一个优选实施方案中，该抗体是34A3。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化的多肽，该多肽编码一种抗体，其中该抗体包括：一个VHCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：36中列出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：37中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VHCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：38中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR1区，该区包括如SEQ ID NO：39中所给出的氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR2区，该区包括如SEQ ID NO：40中所给出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；一个VLCDR3区，该区包括如SEQ ID NO：41中列出的一种氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在又另一个方面中，本发明提供了一种抗体，该抗体包括各自具有至少三个CDR的一个重链和/或一个轻链，其中该至少三个CDR中的一个、两个或三个具有针对对应的重链和轻链的序列SEQ ID NO：36至38以及29至41，并且在酸性条件下它们的抗体特异性地结合到TLR3上。
另一个方面，本发明提供了结合人类TLR3的一种抗体，该抗体包括：
a SEQ ID NO：34的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO：35的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO：34的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO：35的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO：36、37和38中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
e如SEQ ID NO：39、40和41中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
f如SEQ ID NO：36、37和38中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO：39、40和41中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
g与具有SEQ ID NO：34氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代；或
h与具有SEQ ID NO：35氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％一致的轻链可变区，其中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一种不同的氨基酸取代。
在此任何一个实施方案的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2以及3的任何一项可以表征为一种氨基酸序列，该序列具有与对应的SEQ ID NO中所列的特定CDR或CDR组享有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与上述(a)至(h)的一种单克隆抗体竞争TLR3结合。
在本发明的任何一个抗体中，例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3，所指定的可变区以及CDR序列可以包括保守的序列修饰。保守的序列修饰是指未显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加以及缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变以及PCR介导的诱变)将多种修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸的取代典型地是以下取代，其中用具有类似理化特性的侧链的一个氨基酸残基来替换一个氨基酸残基。所指定的可变区以及CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。当进行取代时，优选的取代应当是保守修饰。在本领域中已经确定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且经改变的抗体可以使用在此说明的测定法来测试所保留的功能(即，在此给出的特性)。
术语“一致性”或“一致的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间序列关联性程度，正如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配数量所确定。“一致性”用通过一种特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决的间隙比对(如果存在话)测量了两个或更多个序列中较小者之间一致性匹配的百分比。可以通过已知的方法容易地计算相关多肽的一致性。这类方法包括但不限于在以下文献中所说明的方法：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press(牛津大学出版社)，New York(纽约)，1988；Biocomputing(生物计算)：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress(美国学术出版社)，New York(纽约)，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press(美国胡马纳出版社)，New Jersey(新泽西州)，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(美国学术出版社)，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press(斯托克顿出版社)，New York(纽约)，1991；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.48，1073(1988)。
用于确定一致性的优选的方法经设计以给出所测试序列之间的最大匹配。在公开地可得到的计算机程序中说明了确定一致性的方法。用于确定两个序列之间一致性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，该程序包包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.12，387(1984)；Genetics Computer Group，威斯康辛大学，麦迪逊市，威斯康辛州。)、BLASTP、BLASTN、以及FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其他来源(BLAST手册，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，同上)得到。熟知的Smith Waterman(史密斯特曼)算法还可以使用来确定一致性。
根据AbM(Oxford Molecular的AbM抗体模拟软件定义)、Kabat以及Chothia定义系统，已经将根据本发明的抗体的CDR的序列汇总于以下表A中。将在此说明的氨基酸序列根据Abm、Kabat以及Chothia编号系统编号。尽管可以将任何适当的编号系统用于指定的CDR区上，在无任何其他说明时在此使用的编号是Abm。使用以下的指示已经建立起这种编号：CDR-L1：起始：大致残基24，残基之前：通常是一个Cys，残基之后：通常是一个Trp(典型地是Trp-Tyr-Gln，但也可以是Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)，长度：10至17个残基；CDR-L2：起始：在L1的末端之后通常16个氨基酸，残基之前：通常是Ile-Tyr(但也可以是Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe)，长度：通常是7个残基；CDR-L3，起始：通常在L2末端之后33个残基，残基之前：通常是Cys，残基之后：通常是Phe-Gly-Xaa-Gly，长度：7至11残基；CDR-H1，起始：大致残基26(通常是在一个Cys之后4个残基)(Chothia/AbM定义，Kabat定义是在5个残基之后起始)，残基之前：通常是Cys-Xaa-Xaa-Xaa，残基之后：通常是一个Trp(典型地是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile，Trp-Ala)，长度：10至12个残基(AbM定义，Chothia定义排除了最后4个残基)；CDR-H2，起始：通常在CDR-H1的Kabat/AbM定义的末端之后15个残基，残基之前：通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但有很多变化，残基之后：Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala)，长度：Kabat定义为16至19个残基；AbM(以及Chothia)定义为提前7个残基结束；CDR-H3，起始：通常是CDR-H2末端之后的33个残基(通常在一个Cys之后2个残基)，残基之前：通常是Cys-Xaa-Xaa(典型地Cys-Ala-Arg)，残基之后：通常是Trp-Gly-Xaa-Gly，长度：3至25个残基。
根据本发明的这些抗体的可变链的序列列于以下表B中，信号肽序列用斜体字表示，并且CDR以粗体字提供。术语x/x指示两个所指氨基酸中任何一个可以存在于特定的氨基酸残基上，例如术语F/S是指在给定位置上该氨基酸可以是苯丙氨酸亦或丝氨酸。在此任何一个实施方案中，一个VL或VH序列可以被指定或编号从而包含或缺少该信号肽或其任何一个部分。
在一个实施方案中，本发明的抗体是人类或小鼠IgG1同种型。在另一个实施方案中，本发明的抗体是人类IgG4同种型。在一个实施方案中，本发明的抗体是保留其结合和/或功能特性的抗体片段。
表A
表B.
Figure BDA0000129597990000671
Figure BDA0000129597990000681
根据本发明的抗TLR3抗体的轻链和重链的测序导致了识别涉及这类抗体产生的基因重排(汇总于以下表C中)。(所指示的基因序列可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi检索到)。图18A和18B表示轻链和重链的系统树(通过Phylip′s Drawtree产生)，指示了抗体28F11、31C3以及23C8之间高度的同源性。
表C
以下表D提供了在氨基酸方面对于每种抗体而言不同CDR之间的百分比序列一致性。
表D
CDR VL
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   33.33   88.89   92.59   37.04
  29H3   100.00   33.33   29.63   29.63
  23C8   100.00   88.89   33.33
  28F11   100.00   33.33
  34A3   100.00
CDR1 VL
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   45.45   90.91   90.91   27.27
  29H3   100.00   45.45   27.27   27.27
  23C8   100.00   90.91   27.27
  28F11   100.00   36.36
  34A3   100.00
CDR2 VL
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   14.29   85.71   100.00   28.57
  29H3   100.00   14.29   14.29   42.86
  23C8   100.00   85.71   28.57
  28F11   100.00   28.57
  34A3   100.00
CDR3 VL
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   33.33   88.89   85.71   33.33
  29H3   100.00   44.44   27.27   22.22
  23C8   100.00   88.89   44.44
  28F11   100.00   44.44
  34A3   100.00
CDR VH
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   39.47   78.38   70.27   50.00
  29H3   100.00   44.74   39.47   39.47
  23C8   100.00   70.27   52.63
  28F11   100.00   47.37
  34A3   100.00
CDR1 VH
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   54.55   80.00   80.00   45.45
  29H3   100.00   63.64   63.64   45.45
  23C8   100.00   80.00   45.45
  28F11   100.00   54.55
  34A3   100.00
CDR2 VH
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   35.29   94.12   82.35   64.71
  29H3   100.00   35.29   29.41   35.29
  23C8   100.00   88.24   70.59
  28F11   100.00   58.82
  34A3   100.00
CDR3 VH
  31C3   29H3   23C8   28F11   34A3
  31C3   100.00   40.00   50.00   44.44   40.00
  29H3   100.00   40.00   30.00   40.00
  23C8   100.00   30.00   30.00
  28F11   100.00   20.00
  34A3   100.00
表E提供了使用LALIGN软件针对每种抗体计算出的不同VL与VH(斜体字)核苷酸序列之间的一致性百分比。
表E
Figure BDA0000129597990000701
Figure BDA0000129597990000711
表F提供了使用LALIGN软件针计算出的不同的VL与VH(斜体字)氨基酸序列之间的一致性百分比。
表F
Figure BDA0000129597990000712
本发明单克隆抗体的片段和衍生物
本发明抗体的片段和衍生物(它们被如在本申请书中使用的术语“抗体”或“抗体类”所涵盖，除非另外说明或与上下文明显矛盾)，优选一种31C3、29H3、23C8、28F11或34A3-样抗体，可以通过本领域已知的技术来产生。“片段”包括完整抗体的一个部分，总体上是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F (ab′)2、以及Fv片段；双抗体；任何一种抗体片段，该片段具有由一种邻接的氨基酸残基的连续序列组成的一级结构的一种多肽(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽、或它的一个片段，该片段包含该轻链可变结构域的三个CDR，而没有一个相关联的重链部分以及(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽、或其一个片段，该片段包含重链可变区的三个CDR，而没有一个相关联的轻链部分；以及由多个抗体片段形成的多特异性抗体。
可以使用标准方法得到本发明抗体的片段。例如，可以根据常规的技术通过蛋白酶消化这些分离的抗体来产生Fab或F(ab′)2片段。应当理解的是，可以使用已知的方法来修饰免疫反应性片段，以便例如减缓体内清除率并且得到更理想的药代动力学曲线用聚乙二醇(PEG)来修饰该片段。在例如Leong等人，16(3)：106-119(2001)以及Delgado等人，Br.J.Cancer 73(2)：175-182(1996)中说明了用于将PEG连接并且位点特异性地结合到Fab′片段上的方法，其披露的内容通过引用结合在此。
可替代地，可以对产生本发明的一种抗体(优选地是31C3、29H3、23C8、28F11或34A3-样抗体)的杂交瘤的DNA进行修饰从而编码本发明的一个片段。然后将修饰的DNA插入一种表达载体中并且用来转化或转染一种适当的细胞，该细胞然后表达所希望的片段。
在某些实施方案中，在插入一种表达载体中之前可以例如通过将用于人类重链和轻链恒定区的编码序列替换同源的非人类序列(例如，Morrison等人，PNAS pp.6851(1984))、或通过将一个非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或一部分共价连接到免疫球蛋白编码序列上而对产生本发明的一种抗体(优选地是一种31C3、29H3、23C8、28F11或34A3-样抗体)的杂交瘤的DNA进行修饰。按照这种方法，制备了“嵌合体”或“杂交”抗体，这些抗体具有初始抗体的结合特异性。典型地，这类非免疫球蛋白多肽取代了本发明一种抗体的恒定结构域。
因此，根据另一个的实施方案，本发明的抗体，优选地一种31C3、29H3、23C8、28F11或34A3-样抗体被人源化。根据本发明抗体的“人源化”形式是特异性的嵌合体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，它们包含源于鼠类免疫球蛋白的最小量的序列。大多数情况下，人源化的抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的一个互补决定区(CDR)的残基被来自初始抗体(供体抗体)的一个CDR的残基替换，同时保持所希望的初始抗体的特异性、亲和性、以及能力。
在一些情况中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基抗原被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个、并且典型地两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR区相应于初始抗体的情况，并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白一致序列的情况。人源化抗体还优选地包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的至少一部分。进一步的详细说明，参见Jones等人，Nature(《自然》)，321，pp.522(1986)；Reichmann等人，Nature(《自然》)，332，pp.323(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2，pp.593(1992)；Verhoeyen等人在Science(《科学》)，239，pp.1534；以及美国专利号4,816,567，其全部披露的内容通过引用结合在此)。用于将本发明的抗体人源化方法是本领域熟知的。
选择人类可变区(轻链和重链)用于制造人源化抗体对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳匹配”方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个库筛选本发明抗体的可变结构域序列。然后，将最接近于小鼠序列的人类序列接受为人源化抗体的人类框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.151，pp.2296(1993)；Chothia以及Lesk，J.Mol.196，pp.901)。另一种方法使用了来自所有人类抗体轻链或重链的特定亚组的一致序列的特定框架。相同的框架可以用于多种不同的人源化抗体(Carter等人，PNAS 89，pp.4285(1992)；Presta等人在J.Immunol.，51，p.1993))。
进一步重要的是在保留对TLR3受体具有高亲和性以及其他有利的生物学特性下将这些抗体人源化。为了实现这个目的，根据一个优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型来分析该亲本序列以及不同概念的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。可以得到说明并且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构的计算机程序。检查这些显示允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能方面的可能作用进行分析，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。按照此方式，可以从一致的并且输入的序列中选择并且组合FR残基，这样使得所希望的抗体特征，例如增加一种或多种靶抗原的亲和性得以实现。总体上，CDR残基直接地并且在多数情况下显著地涉及影响抗原结合。
制造“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用Xeno小鼠(Abgenix，费利蒙，加利福尼亚州)作为用于免疫的小鼠。Xeno小鼠是根据本发明的一种鼠类宿主，该小鼠其免疫球蛋白基因被功能性的人类免疫球蛋白基因所替换。因此，由这种小鼠产生的抗体或从这种小鼠的B细胞制造的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。在美国专利号6,162,963中说明了Xeno小鼠，它通过引用以其全部内容结合在此。
还可以按照多种其他技术产生人类抗体，例如通过使用其他转基因动物进行免疫(这些转基因动物已经被工程化以表达一种人类抗体谱(Jakobovitz等人在Nature(《自然》)362(1993)255)或通过使用噬菌体展示方法来选择抗体谱。这类技术对于普通技术人员而言是已知的，并且可以从如在本申请中所披露的单克隆抗体开始来实施。
本发明的抗体，优选31C3、29H3、23C8、28F11或34A3-样抗体还可以被衍生成为“嵌合体”抗体(免疫球蛋白)，其中重链/轻链的一部分与初始抗体中的相应序列是相同的或同源的，而该链的剩余部分与从另一个物种中得到的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中相应序列是相同的或同源的，只要它们展示出所希望的生物活性和结合特异性即可(Cabilly等人，同上；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，pp.6851(1984))。
尽管本发明的抗体具有结合TLR3并且任选地进一步抑制TLR3信号传送的能力，它们还可以用于其他目的，例如偶联到毒素上用于靶向杀死表达TLR3多肽的细胞，例如某些肿瘤细胞，例如黑素瘤或乳房、肺部、食道、胃、喉、肾、或子宫颈的细胞，或潜在地病毒感染的细胞或涉及炎性的细胞。在这类实施方案中，典型地得到了样品(例如，对肿瘤进行活检)以便首先例如使用在此说明的检测方法对这些细胞(例如，肿瘤细胞、感染的细胞、涉及炎症的细胞等)是否表达TLR3进行评估。如果在肿瘤细胞的表面上确实检测出TLR3，则可以给予细胞毒性抗体。然后，该细胞毒性抗体被细胞内化并且毒素在细胞内部被释放，选择性地杀死细胞。因此，这类抗体可以用于治疗癌症或肿瘤的方法中，包括但不限于胆管癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、上皮内瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、以及其他癌症和肉瘤。这些癌症可以是原发的或转移的。
用于增强抗体抗肿瘤效能的一种有效途径涉及将细胞毒性药物或毒素连接到能够被靶细胞内化的mAbs上。这些试剂对应地被称为抗体-药物偶联物(ADC)以及免疫毒素。当施用至病人时，ADC和免疫毒素经由它们的抗体部分结合到靶细胞上并且被内化，从而允许这些药物或毒素发挥它们的作用。参见，例如美国专利申请公开号US2005/0180972A1，US2005/0123536A1。还参见，例如Hamblett等人，Clin Canc Res，10：7063-7070，Oct.15，1999，Law等人，Clin Canc Res，10：7842-7851，Dec.1，2004，Francisco等人，Neoplasia，102(4)：1458-1465，Aug.15，2003，Russell等人，Clin Canc Res，11：843-852，Jan.15，2005，Doronina等人，Nat Biotech，21(7)：778-784，July 2003，所有这些通过引用以其全部内容结合在此。
可以施用所说明的技术制备细胞毒性抗体(Carter等人，Cancer Journal(癌症杂志)，Volume 14，Number 3，May/June 2008(2008年5月或6月)，或Ravi等人，Accounts of Chemical Research 98-107January(1月)2008 Vol.41，No.1)。
优选的毒性或细胞毒性肽或小分子包括可以减慢、停止或逆转细胞增殖、以任何可检出方式降低其活性、或直接或间接地杀死它们的任何一种化合物。优选地，毒性或细胞毒性化合物通过直接地杀死这些细胞、通过引起ADCC或其他方式来起作用。如在此所使用，毒性肽可以包括任何一种肽、多肽、或这类物质的衍生物，包括具有非天然氨基酸或经修饰连接的肽衍生物或多肽衍生物。毒性小分子可以包括任何一种毒性化合物或元件，优选大小为小于10kD、5kD、1kD、750D、600D、500D、400D、300D、或更小。
除了其他目的以外，当本发明的抗体用于诊断目的时，偶联到一个可检出的部分上是有用的。这类目的包括但不限于针对表达TLR3的细胞的存在而对生物样品(例如血样或组织活检)进行测定，并且检测个体体内表达TLR3的细胞的存在、水平、或活性。这类测定和检测方法可以用于本发明的诊断/治疗方法中，例如涉及检测病人细胞中TLR3表达，并且如果确定病人的细胞表达TLR3，随后给予本发明的调节TLR3的抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体用于从生物样品中纯化表达TLR3的细胞。这些生物样品可以获自一位病人，例如用于诊断或体外治疗性目的，或获自个体或非人类灵长类动物体内以得到这类细胞的一个来源用于研究目的。
在一个这样的实施方案中，本发明标记的抗体可以用于FACS分选，以便从生物样品中纯化或分离表达TLR3的细胞。可替代地，在一些实施方案中，本发明的抗体偶联到固体载体上可以用作一种工具，用来对来自生物样品(例如，血样或来自个体的组织活检的细胞)的、表面上带有TLR3受体的细胞进行亲和纯化。纯化方法是本发明的另一个可替代的实施方案，得到的纯化细胞群也是如此。
无论使用哪种分离或纯化表达TLR3的细胞的方法，对于多种目的而言(例如在给予如在此所说明的抗TLR3抗体之前例如用来通过评估表达TLR3的细胞的数量或活性来诊断TLR3相关障碍)这样做的能力是有用的。另外，在研究背景下经纯化的表达TLR3的细胞是有用的，例如用来更好地表征细胞及其不同的特性和行为，并用来鉴别可用来调节它们的行为、活性、存活率或增殖的化合物或方法。
组合物以及在治疗、诊断以及预测方面的用途
如在此所证明，本发明的抗体在调节包括这些多肽的表达TLR3的细胞的活性方面，并且因此在表达这些多肽的细胞(例如表达TLR3的免疫细胞，DC，髓样DC等)的活性或行为方面是特别有效的。在某些实施方案中，这些抗体例如通过阻断TLR3信号传送、任选地不阻断抗原或配体例如dsRNA与受体的相互作用而抑制了TLR3，由此抑制了细胞的增殖或激活。该组合物进一步包括一种药学上可接受的载体。这类组合物被称为本发明的“抗体组合物”。在一个实施方案中，本发明的抗体组合物包括在以上抗体实施方案中所披露的一种抗体。抗体31C3、29H3、23C8、28F11和34A3被被包括在可能存在于本发明的抗体组合物中的抗体范围内。
发明另外提供了在需要它的病人体内调节表达TLR3的细胞活性的一种方法，包括将根据本发明的组合物给予所述病人的步骤。在一个实施方案中，表达TLR3的细胞活性被抑制，其中该病人患有一种疾病或紊乱，其中这样的抑制可能促进、增强、和/或诱导治疗作用(或在至少相当大比例的病人体内促进、增强、和/或诱导这样的作用，其中这些病人患有该疾病或紊乱、以及与通过例如临床测试所确定的病人基本上类似的特征)。
在其他实施方案中，该方法可以包括对所述病人给予一种适当的额外治疗剂的额外步骤，该治疗剂用于对患有或易于患有此病的病人治疗或预防该病；这类试剂的实例包括免疫调节剂、激素试剂、抗炎药物、类固醇、免疫系统抑制剂、皮质类固醇、抗生素、抗病毒药物或附加化合物。可以将这类额外的试剂以一个单剂量形式与所述抗体一起、或以一个分开的剂量形式给予病人。抗体的剂量(或抗体和额外治疗剂的总剂量)足以在病人体内可检出地诱导、促进、和/或增强治疗性应答。当分开给药时，令人希望的是在产生对病人可检出的组合治疗有利的条件下(例如，就定时、给药次数等而言)给予该抗体、片段、或衍生物以及额外的治疗剂。
可以用于这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人类血清白蛋白、缓冲剂物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐类或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐类、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯类、蜡类、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物类、聚乙二醇和羊毛脂。本发明的抗体可以用于调节例如抑制病人体内表达TLR3的细胞其活性的方法。这个方法包括将所述组合物与所述病人接触的步骤。这种方法对于预防和治疗应当是有用的。
对于给予病人的用途，可以配制该组合物以给予病人。本发明的组合物可经口服、胃肠外地、经吸入喷雾、局部地、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式储药器进行给药。在此所用的方法包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤区内以及颅内的注射或输注技术。
本发明的这些组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知技术、使用适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌可注射的制剂还可以是在非毒性的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的一种无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1.3-丁二醇中的一种溶液。可采用的可接受的运载体以及溶剂有水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、非挥发油通常用作一种溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的非挥发油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射物，天然的药学上可接受的油类例如橄榄油或蓖麻油、尤其是它们的聚氧乙烯化的形式也是如此。这些油溶液或混悬液也可以含有一种长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其他常用的表面活性剂例如吐温类、司盘类以及其他乳化剂或生物利用率增强剂(通常用于制造药学上可接受的固体、液体、或其他剂型)也可以用于配制目的。
本发明的组合物能够以任何口服可接受的剂型口服进行给药，包括但不限于：胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用作口服使用的片剂时，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地还加入多种润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式进行口服给药，有用的稀释剂包括例如乳糖。当要求口服使用水性悬浮液时，该活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如是希望，还可以加入某些甜味剂、调味剂和/或着色剂。
可替代地，本发明的组合物能够以栓剂的形式来给药，用于直肠给药。可以通过将该试剂与一种适合的非刺激性赋形剂混合来制备这些物质，这些赋形剂在室温下是固体并且在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔化从而释放药物。这类物质包括可可脂、蜂蜡以及聚乙二醇。
本发明的组合物还可以局部地给药，尤其是当治疗靶位包括通过局部应用易于接近的区域或器官时，包括眼部、皮肤、或下肠道的疾病。很容易制备适当的局部配制品用于这些区域或器官中的每一个。对于局部应用而言，该组合物可以配制在一种适当的软膏中，该软膏含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分。用于本发明的化合物的局部给药的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡、以及水。可替代地，这些组合物可以配制在一种适当的洗液或乳膏中，该洗液或乳膏包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。适合的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、以及水。
下肠道局部应用可以作为直肠栓剂配制品(见上)或适当的灌肠剂配制品而发挥作用。还可以使用贴剂。
本发明的组合物还可以通过鼻用气溶胶或吸入来给药。根据药物配制领域中熟知的技术来制备这类化合物，并且这些化合物可以使用苯甲醇或其他适合的防腐剂、用于增强生物利用率的吸收促进剂、氟烷、和/或其他常规的增溶剂或分散剂被制备为盐水中的溶液。
在临床方面，数种单克隆抗体已经显示是有效的，例如RituxanHerceptin(曲妥珠单抗)或Xolair(奥马佐单抗)，并且类似的给药方案(即，配方和/或剂量和/或给药方案)可以与本发明的化合物一起使用。可以根据针对这些产品的已知方法(例如使用制造商的说明书)来确定本发明的药用组合物中抗体给药的方案和剂量。例如，能够以100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用的小管、按照10mg/mL的浓度供给本发明的药用组合物中存在的抗体。在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80以及注射用无菌水中配制该产品用于静脉给药。将pH调节到6.5。在本发明的药用组合物中抗体示例性的适当剂量范围可以是在约1mg/m2至500mg/m2之间。然而，应当理解的是这些时方案是示例性的，并且考虑到在临床试验中必须确定的药用组合物中特定抗体的亲和性和耐受性可以采用最佳方案和方式。
根据另一个实施方案，本发明的抗体组合物可以进一步包括另一种治疗剂，包括通常用于给予该抗体的特定治疗目的的试剂。该额外的治疗剂通常将以一定剂量存在于组合物中，该剂量典型地用于正在治疗特定疾病或病症的单一疗法的试剂。这类治疗剂包括但不限于：抗炎剂、类固醇、免疫系统抑制剂、抗生素、抗病毒剂以及其他抗体以及它们的片段。
在另一个实施方案中，具有不同交叉反应性的本发明的一种或多种抗体(例如特异性地结合到该TLR3多肽中不同表位上的抗体)结合成一种单一组合物，从而靶向尽可能多的不同TLR3基因产物，例如造成一个个体体内或不同病人体内多肽的多样性，并且尽可能有效地实施。此外，本发明的抗体组合物还包括识别一种单一TLR3表位的多种抗体。在治疗时这类组合还可以提供更为广泛的效用。
本发明还提供了在需要它的病人体内调节表达TLR3的细胞活性的一种方法，包括将根据本发明的组合物给予所述病人。该方法更家特异性地针对降低病人体内TLR3细胞活性，这些病人患有一种疾病，降低TLR3细胞活性对于该病是有益的(例如自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病、病毒感染)或该疾病是由过量TLR3细胞活性引起或表征的。
以使用本发明的方法的疾病和病症以下所有疾病，其中调节TLR3可以是有利的，包括例如部分地或全部地由TLR3信号传送或由当所述TLR3信号传送时所产生的细胞因子所介导或加剧的疾病。具体地说，当使用抑制TLR3信号传送的抗体时，这类紊乱包括部分地或全部地由TLR3信号传送或由当所述TLR3信号传送时产生的细胞因子所介导或加剧的任何紊乱，除了其他之外还包括免疫性紊乱，例如炎性疾病和自身免疫性疾病。更确切地说，本发明的方法用来治疗多种免疫紊乱以及其他疾病，包括但不限于：自身免疫、炎症、变态反应、哮喘、感染(例如，慢性感染，病毒感染)以及脓毒症。可以用抑制TLR3信号传送的抗体来治疗的疾病的实例包括但不限于：关节炎、全身性红斑狼疮、脓毒症、哮喘、骨质疏松症、对中枢神经系统抗原的自身免疫、自身免疫性糖尿病、炎性肠病、自身免疫性心炎、自身免疫性肝炎。
根据本发明、使用抑制TLR3信号传送的抗体可治疗的其他免疫紊乱除了其他之外还包括自身免疫性紊乱以及炎性紊乱，包括但不限于，克罗恩病、乳糜泻、溃疡性结肠炎、肠道易激综合征、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、糖尿病、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征(GBS)、桥本氏病、红斑狼疮、脱髓鞘病、多发性硬化症、重症肌无力、眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、Ord甲状腺炎、天疱疮、硬化、银屑病、类风湿性关节炎、莱特尔氏综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳氏肉芽肿病、阑尾炎、动脉炎、关节炎、睑炎、细支气管炎、支气管炎、滑囊炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、绒毛膜羊膜炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维组织炎、胃炎、胃肠炎、龈炎、肝炎、化脓性汗腺炎、回肠炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、念珠菌性腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、肺炎、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口炎、滑膜炎、腱炎、扁桃体炎、眼色素层炎、阴道炎、血管炎、以及外阴炎。
本发明的抗体可以包括在试剂盒中。这些试剂盒可以任选地进一步包括任何数量的抗体和/或其他化合物，例如1、2、3、4、或任何其他数量的治疗性抗体和/或化合物。应当理解的是，这些试剂盒的内容物的说明不以任何形式进行限制。例如，该试剂盒可以包含其他类型的治疗性化合物。优选地，这些试剂盒还包括使用这些抗体的说明书，例如在此所述方法的详细说明。
本发明的其他方法和优点将在以下实验章节中进行披露，它应当被认为是说明性的而不限制本申请的范围。
实例
材料与方法
α干扰素(IntronATM)购于Schering Plough(先灵葆雅)公司。肿瘤细胞系：A375恶性黑色素瘤肿瘤细胞系(CRL-1619)购于ATCC。抗体(抗原、供应商，编号)：抗-TLR3抗体pAb，R&D Systems，编号AF1487。仪器：FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences)。
用慢病毒shRNA进行抑制
慢病毒构建体是由Vectalys(法国图卢兹市)制造并产生的，它编码了靶向控制人类TLR3的短发夹RNA(shRNA)。肿瘤细胞被慢病毒制剂感染，并且用嘌呤霉素进一步选择以得到稳定的shTLR3 A375肿瘤细胞。表面等离振子共振(SPR)
(a)通用的Biacore T100方法。在25℃下在一台Biacore T100装置上(Biacore(生物分子相互作用分析仪)通用医疗)进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+缓冲剂(Biacore通用医疗)或10mM乙酸钠pH5.6、150mM NaCl、0.05％P20用作运行缓冲液，并且用Biaevaluation 4.1和Biacore T100评估软件来对传感器感知量进行分析。重组体人类TLR3购于研发系统公司(R&D Systems)。
(b)蛋白质固定。重组体TLR3蛋白被共价地固定到一个Biacore系列5传感器芯片CM5(芯片)的葡聚糖层中的羧基基团上。用EDC/NHS(0.2MN-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、0,05M N-羟基丁二酰亚胺(Biacore通用医疗))将该芯片表面激活。这些蛋白质在结合缓冲液中(10mM乙酸钠，pH 5.6)被稀释到10μg/ml，并且注入直至达到适当的固定水平(即大致为对于结合实验为2000RU，并且对于亲和性实验为600RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(Biacore通用医疗)将剩余的激活的基团失活。
(c)使用HBS-EP+(中性pH)进行抗体结合分析。以10μl/分钟的恒定流速将10μg/ml浓度的抗体注射到这些固定的蛋白上持续2分钟，并且在通过10秒钟注射10mM NaOH、500mM NaCl再生缓冲液进行再生之前允许分离3分钟。通过将可溶性抗体共同注射到参比葡聚糖流动细胞上来进行在线空白校正。
(d)酸性缓冲液(pH 5.6)中的竞争测定流速设定为10μl/分钟，将浓度为50μg/ml(或浓度为100μg/ml的聚AU)的一抗注射2分钟，连续3次，以便使该rhTLR3表面饱和。然后，还以50μg/ml浓度将二抗注射2分钟，并且在通过15秒注射10mM NaOH、500mM NaCl再生缓冲液进行再生之前允许分离3分钟。还在线进行了空白校正，并且减去使用饱和的抗体(或核酸)、之后注射缓冲液的曲线以去除由于第一复合体的分离而造成的信号。将得到的信号与通过将二抗直接注射到该rhTLR3表面上而得到的信号进行比较。
萤虫素酶报告基因测定法
已经建立用作启动子ISRE(IFN-刺激的应答元件)以及报告基因和蛋白质荧光素酶的报告基因测定法.293T细胞系(ATCC，#CRL-1573)用pISRE-luc质粒(#219089-Stratagene)进行稳定转染，进一步选择为诱导对IFN-α刺激的最佳应答并称为对照293T-ISRE。该细胞系进一步用不同的质粒pUNO-hTLR3质粒(#puno-htlr3-InVivogen)来稳定转染，并被称为293T-TLR3-ISRE。在第0天，将细胞以4x105个细胞/mL接种于96孔培养板的完全培养基中(100μl/孔).首先将细胞在37℃下孵育20小时，然后将50μL培养基弃去并且用最终100μL/孔逐渐增加数量的聚AU连同不同浓度的抗TLR3抗体一起来激活细胞。将用新鲜培养基孵育的细胞用作背景荧光素酶活性。在37℃下将细胞孵育6小时。将100μL新融化的Steady Glo(Promega)添加到各孔中，在室温下在黑暗中将这些板孵育10分钟，并且在一台γ计数器(TopCount)装置上以每秒计数(CPS)对各孔中发出的光进行定量。
实例1-产生TLR3特异性单克隆抗体。
免疫#1
初次筛选。为了得到抗TLR3抗体，用重组体人类His-标记的TLR3细胞外结构域重组体蛋白(研发系统公司(R&D systems)，#1487-TR-050)对Balb/c小鼠免疫。小鼠接收了用50μg TLR3蛋白和全弗氏佐剂构成的乳液进行的初次免疫(腹膜内注射)，用由50μg TLR3蛋白和不完全弗氏佐剂构成的乳液进行的第二免疫(腹膜内注射)，以及用10μg TLR3蛋白进行的三次加强(静脉内注射)。将免疫脾细胞与X63.Ag8.653无限增殖的B细胞融合，并且在经辐照的脾细胞存在下培养。得到了40个培养皿，并且在针对TLR3结合的第一筛选中、使用针对检测结合到TLR3上而开发的ELISA对这些培养皿进行评估。简言之，将His标记的重组体TLR3蛋白(研发系统公司(R&D systems)，#1487-TR-050)涂布在Ni-NTA 96孔板上(Qiagen)。将来自杂交瘤培养板的上清液(SN)在TLR3板中孵育，并且用山羊抗小鼠F(ab)IgG-HRP来显示TLR3结合Ig的存在。选择阳性上清液并且针对缺乏与TLR4的结合进行测试。简言之，将His标记的重组体TLR4蛋白(研发系统公司(R&D systems)，#3146-TR-050)涂布在Ni-NTA 96孔板上(Qiagen)。将来自杂交瘤培养板SN在TLR4板中孵育，并且用山羊抗小鼠F(ab)IgG-HRP来显示TLR4结合Ig的存在。选择TLR4进行第二筛选以便对第一筛选中所选择的孔进行辨别，其中使用了来自TLR3特异性抗体的抗His特异性抗体。其次，鉴于TLR3与TLR家族其他成员之间的同源性，最初的评估证明至少一种可商购的单克隆抗体(mAb)在其包装上指示为对TLR3蛋白是特异性的，却还识别了用TLR4稳定转染的石蜡包埋的293T细胞。
二次筛选：选择感兴趣的杂交瘤。使用rec TLR3芯片在Biacore测定中在一个进一步的筛选中保持并且测试了168个上清液，紧接着根据结合到表达人类TLR3的293T细胞进行了不同测定形式。进一步选择用pISRE-luc质粒(#219089-Stratagene)稳定转染的293T细胞系(ATCC，#CRL-1573)，作为对诱导IFN-α刺激的最佳应答，并且称为对照293T细胞。该细胞系进一步用pUNO-hTLR3质粒(#puno-htlr3-InVivogen)或pUNO-hTLR4质粒(#puno-tlr4-InVivogen)进行稳定转染，并且对应地称为293T-TLR3和293T-TLR4。在一个基于FACS的筛选中针对结合到293T-TLR3细胞上而不结合到293T细胞上，并且平行地在一个IHC筛选中针对结合到293T-TLR3细胞上(成为一个冷冻的细胞球粒)而不结合到293T-TLR4细胞上，对上清液进行筛选。还进一步在IHC筛选中针对结合到293T-TLR3细胞上成为一个石蜡包埋的细胞球粒而对在IHC筛选中针对结合到293T-TLR3细胞上成为一个冷冻的细胞球粒所选择的孔进行了测试。简言之，对于FACS筛选而言，通过标记有生物素的山羊抗小鼠多克隆抗体(pAb)、标记有PE的链亲和素来显示在上清液中反应抗体的存在。对于IHC筛选而言，通过标记有生物素的驴抗小鼠pAb(#715-065-150，杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoresearch Laboratories))、标记有过氧化物酶的链亲和素(#E2886，SIGMA)、并且用DAB(#SK-4105，载体实验室(Vector Laboratories))显示而显示在上清液中反应抗体(Abs)的存在。
克隆潜在感兴趣的杂交瘤。通过有限稀释技术在96孔板中克隆从初次筛选中选出的42个潜在地感兴趣的杂交瘤，并且在以下一系列的筛选中对304个亚克隆进行测试。首先，在针对TLR3结合的筛选中使用针对检测与TLR3的结合而开发的相同的ELISA对304个亚克隆进行评估，并且在ELISA测定中针对缺少与TLR4的结合而选择并且测试阳性上清液，产生228个克隆，这些克隆对于TLR3具有选择性。产生TLR3 ELISA中所得DO与TLR4 ELISA中所得DO的比率大于10的所有上清液被选出为对TLR3具有特异性。它们包括来自孔板31的孔C3的上清液(31C3)、来自孔板29的孔H3的上清液(29H3)、来自孔板23的孔E7的上清液(23E7)、来自孔板23的孔C8的上清液(23C8)、以及来自孔板28的孔F11的上清液(28F11)。31C3、29H3、23C8和28F11具有IgG1同种型
在这304个克隆中，在冷冻IHC筛选中针对结合到293T-TLR3细胞上(作为冷冻的细胞球粒)、而不结合到293T-TLR4细胞上而对63个克隆(如所说明在冷冻IHC中从测试阳性的预克隆中选出)进行测试，在冷冻IHC中产生了31个阳性克隆。
用FACS染色呈阳性的71个克隆以及在冷冻IHC中31个阳性克隆中，从304个初始克隆中选择了41个克隆进行深冷保存。
免疫#2
初次筛选。进行了另一系列的免疫以产生不同抗体。使用类似于第一免疫系列的实验安排，将Balb/c小鼠免疫，在经辐照的脾细胞存在下将免疫脾细胞融合并且培养。得到培养皿，并且在针对TLR3结合的第一筛选中使用针对结合到TLR3上的检测而开发的ELISA进行评估。从2840个克隆中选出263个克隆用于二次筛选。
二次筛选：选择感兴趣的杂交瘤。在293T-TLR3细胞上在抑制作用测试中在一个进一步的筛选中保留并且测试263个上清液。选择具有高于95％抑制作用的克隆。它们包括来自孔板34的孔A3的上清液(34A3)。
实例2-TLR3调节
通过从正常的健康人类供体中分离PBMC而从PBMC得到髓样DC(MdDC)。按照一般性技术说明书，用人类CD14微珠粒(MiltenyiBiotech)使用阳性选择从PBMC中纯化出单核细胞。通过对应地以200ng/ml和20ng/ml在人类GM-CSF(Leucomax，SP)和人类IL-4(研发系统公司(R&D Systems))中孵育5-6天将单核细胞进一步衍生成DC(MdDC)。
然后将得到的MdDC以106个细胞/ml一式两份地接种于平底96孔板中。以终体积200μl、连同用指定浓度的抗TLR3抗体将细胞激活20小时。将逐渐增加数量的聚AU(30、100、300和900μg/m1)添加到孔中以得到剂量有效读数。
在刺激20小时之后收集上清液，在-20℃下冷冻，并且使用酶联免疫吸附测定法针对IL-6和IP-10进行进一步测定。然后将细胞收集，针对激活标志物CD86染色(使用一种huCD86小鼠，IgG1，FITC，BD生物科学公司，参考号555657)，使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD生物科学公司)进行检测。
图1和图2说明了抗体31C3和29H3(两者均是IgG1同种型)在CD86细胞激活和IL-6、IP-10分泌作用方面的抑制性特性。而且，抗TLR3抗体31C3.1和29H3.7在体外拮抗TLR3介导的髓样DC激活，这些抗体有效地下调了TLR3介导的CD83/CD86表达并且终止了TLR3介导的细胞因子/趋化因子分泌(具体是IP-10和IL-6)。
通过木瓜蛋白酶切割并且通过离子交换层析法在MonoQ 5/50 GL上纯化从抗体31C3.1和29H3.7产生F(ab)’2片段，通过SDS-PAG对该片段进行分析，并且在CD86细胞激活和细胞因子分泌方面针对抑制作用而对其进行测试。抗体31C3.1和29H3.7的F(ab)’2片段以与全长抗体类似的程度有效地下调了TLR3介导的CD83/CD86表达并且终止了TLR3-介导的细胞因子/趋化因子分泌作用。图3显示了抗体31C3的结果，其中抗体31C3的F(ab)’2片段和全31C3IgG以类似的程度终止了TLR3介导的CD86表达以及IP-10分泌作用，图4显示对于抗体29H3的F(ab)’2片段的相同作用。
在一个类似的实验中，与抗体31C3相比较，对28F11和23C8抗体抑制TLR3信号传送的能力进行评估。在逐渐增加剂量的聚AU的存在下以50μg/ml的浓度对抗体进行测试。这些结果表示于图14A和14B中，表明根据本发明抗体的抑制性特性。
还在一个类似的设置中对抗体34A3进行了测试。这次，用固定剂量的聚AU(300μg/ml)来刺激细胞(MdDC)并且将逐渐增加剂量的抗体添加到培养基中。就IL-6和IP-10的分泌作用而言，与31C3相比较图19A和19B说明了抗体34A3的结果。
实例3-二价亲和性
使用对于SPR第c)项所说明的方法，对抗体29H3.7、23E7.3、31C3.1以及可商购的抗体TLR3.7(eBiosciences)和40C1285(Abcam)的结合特性进行了比较。图5显示了在29H3.7和31C3.1的情况下TLR3的结合亲和性显著地好于可商购抗体的情况。
在中性(pH 7.2)和酸性(pH 5.6)条件下确定了与TLR3的结合，并且计算出K(D)值。结果(2个或3个实验的平均值)示于表1中。在中性pH下，23E7、29H3.7和31C3.1都显示出对于重组人类TLR3大于100皮摩尔(约50皮摩尔)强的并且类似的二价亲和性(KD)。相比之下，抗体TLR3.7(eBiosciences)显示了显著更低的结合亲和性。然而在酸性pH下，23E7失去了大量的结合亲和性并且它的KD是约4纳摩尔。在单独测定中，在相同条件下对31C3、23C8、28F11和34A3的亲和性进行测量，结果表示与表1中和图15中。这些结果表明根据本发明的抗体具有高亲和性，尤其是在酸性pH下。
表1：
Figure BDA0000129597990000891
实例4-表位作图
在酸性pH下进行表位作图。根据针对SPR第d)条说明的方法在pH5.6下进行竞争性测定。图6说明了抗体29H3.7和31C3.1能够结合TLR3而不与polyAU竞争，类似地，图16A和16B说明了抗体28F11、34A3和23C能够结合TLR3而不与聚AU竞争。因此，29H3.7、31C3.1、28F11、34A3和23C8能够抑制dsRNA信号传送而不竞争TLR3上dsRNA的表位。图7说明了抗体29H3.7与31C3.1之间的竞争。由于一种抗体结合到TLR3上破坏了其他抗体结合到TLR3上(一种抗体被其他抗体抑制约90％)，人们可以得出结论这两种抗体竞争TLR3上一个类似的表位。类似地，图15A和15B说明了抗体31C3与抗体TLR307、23C3、28F11和29H3之间的竞争作用。图15A说明了在缺少任何一种竞争抗体的结合情况，而图15B说明了在用31C3饱和hTLR3芯片之后的结合水平。结合水平的损失反映出由31C3抗体所引起的阻碍，并且表明测试抗体之间结合的竞争作用。31C3竞争作用并不影响TLR3.7结合水平，这表明这些抗体竞争不同的表位，而对于所有其他抗体而言结合水平的降低表明它们都与31C3竞争一个类似表位。
在中性pH下进行表位作图。根据针对SPR所说明的方法在pH 7.2下进行竞争性测定。抗体29H3.7和31C3.1彼此竞争结合到TLR3上，因为一个抗体的结合破坏了另一个抗体结合到TLR3上。还用商品化的抗体TLR3.7和抗体23E7.3探索了表位作图。这些抗体都不能与抗体29H3.7和31C3之一竞争结合到TLR3上。然而，抗体TLR3.7的确与抗体23E7.3竞争结合到TLR3上，这表明它们具有重叠的结合位点。
单独在rhTLR3芯片上或在添加34A3之前rhTLR3芯片被31C3抗体饱和的情况下对34A3抗体结合亲和性进行测量。这些结果示于图17中，并且提供以下证据，即这两种抗体竞争结合到hTLR3上，因此就它们的重叠结合位点而言共享了一个共同的表位决定簇。
图8显示了TLR3蛋白的细胞外结构域的人类分子表面图形，这些图形是基于公开可得的数据(作为来自欧洲生物信息研究院(英国茵格斯顿市)的蛋白质数据库(PDB)计划的用于研究生物大分子数据库的来源的数据文件1ZIW)、使用SwissPdb Viewer 4.0(Guex和Peitsch(2007)Electrophoresis 18：2714-2723)、通过计算机模型设计而产生。从这个视角来看，位于左侧的C端和位于右侧的N端显示TLR3面是基本上未糖基化的，另外一面是被碳水化合物广泛地掩蔽的(参见，例如Choe等人在(2005)Science(《科学》)309：581-585)。图8中右手侧的表面图形显示在中性pH下人类TLR3多肽的静电势(绘于分子表面上)。正静电势的主要区域用箭头指示，形成了在C端侧的无糖基化表面上正性和中性电势的一个普通区域。未糖基化表面被信可以用于与配体辅助分子或TLR3单体或其他寡聚体组件相互作用，并且在C端侧面上的正静电势的区域(在最暗的阴影中，通过箭头来指示的主要正电区域)被认为相应于dsRNA结合区。这些区域还显示于Choe等人(2005)的图5中。左手侧的图形指示通过涉及dsRNA结合的突变研究而确定的氨基酸残基，其中残基H539、N541、N466、R489、N517或N540的突变抑制了残余物dsRNA结合(＞80％)，并且其中残基K117、K137和K139的突变抑制了dsRNA结合(＞80％)。在Choe et al.(2005)中提出的模型是TLR3形成了一种同型二聚体，其中二聚作用界面邻近未糖基化表面上的C端区域，并且dsRNA仅结合到TLR3的未糖基化表面上，这样使得这两个TLR3单体可以将dsRNA夹层化成为两个TLR3单体和一个dsRNA链的一种复合体。还提出了涉及由TLR3的多个二聚体结合到较长的dsRNA链上而形成的TLR3的寡聚复合体的一种模型(参见，例如.Bellet al.(2006)PNAS USA 103(23)：8792-8797)。Ranjith-Kumar等人在(2007)J.Biol.Chem.282(10)：7668-7677提出了TLR3能够在缺少配体时以寡聚状态存在，并且dsRNA结合可以引起二聚体重排，导致了单体朝向彼此侧向滑动并且调节以容纳该dsRNA，并且其中得到的构型改变可以刺激TIR结构域的相互作用从而诱导信号传送。因此，一个解释可以是抗TLR3抗体31C3、29H3、23C8、28F11和34A3结合TLR3，例如在未糖基化表面上，并且有可能在中性pH在具有负电荷的表位中，因此该表位不在dsRNA结合到TLR3上的区域中。因此，这些抗体不能阻止dsRNA与TLR3的相互作用，但可以抑制信号传送(例如通过阻止已经结合dsRNA的TLR3二聚体或寡聚物重排、或采取使这些TIR结构域相互作用所要求的构型、或通过干扰TLR3二聚体和/或随后的TLR3-dsRNA三元复合体的正常形成)。
实例5-报告基因测定
在基于荧光素酶报告基因活性方面，针对TLR3信号传送的抑制作用对抗体进行测试(293T-TLR3-ISRE)。已经报道了使用TLR3促效剂例如聚(I:C)结合TLR3受体激活了IFN型途径(包括启动子ISRE)(Wietek等人在J.Biol.Chem.，278(51)，p50923，2003)。简言之，在报告基因测定中在抗TLR3抗体31C3存在下使用dsRNA TLR3促效剂来诱导TLR3信号传送，并且对TLR3信号传送进行评估。这些结果(示于图9中)显示与以前确定的对TLR3信号传送没有影响的对照性抗-TLR3抗体相比较，抗TL3抗体31C3以剂量依赖方式强烈地抑制了TLR3信号传送。
在另一组实验中，将293-huTLR3细胞与不同浓度的抗TLR3 mAb孵育24小时(参见图10A；mAb浓度在对数尺寸上在轴线上以μg/ml表示)紧接着以300μg/ml浓度加入到TLR3促效剂聚AU的培养基中。在24小时之后对荧光素酶表达进行测量。这些结果表示于图10A中，并且IC50表示于以下表2中，这表示根据本发明的抗体具有优异的抑制特性。
表2：
  IC50(μg/ml)
  31C3   2.25
  23C8   1.83
  28F11   5.56
在另一组实验中，用100μg/ml聚AU和测试抗体31C3、23E8和34A3进行相同的抑制测试。计算出IC50值，并且所有这些抗体都具有低于5μg/ml的IC50。此外，34A3显示在低浓度下的一种增强的抑制作用(图10B)。图10A和10B显示增加根据本发明的抗体剂量的抑制特性，TLR3信号传送的抑制作用是剂量依赖性的。这个测定证实了根据本发明的抗体的优异的抑制特性。
在另一个测试中，在一种炎性状态下(在此当IFNα存在时)对根据本发明抗体的抑制特性进行评估。简言之，对三种不同情况进行测试。在情况1中(图11A)，在无任何预处理下对IP-10分泌作用进行评估；在情况2中(图11B)，在用IFNα(1000UI/ml)预处理24小时之后对IP-10分泌作用进行评估；在情况3中(图11C)，在用聚AU(300μg/ml)预处理24小时之后对IP-10分泌作用进行评估，然后添加一个剂量范围的dsRNA(聚IC用于图11A和11B，聚AU用于图11C)以及抗-TLR3抗体(31C3或23C8，浓度为50μg/ml)，并且在24小时之后使用ELISA对IP-10分泌作用进行定量(以μg/ml计)。
这些结果(在图11中表示)表明即使在刺激性分子(dsRNA或炎性细胞因子)的存在下，根据本发明的抗体仍然是TLR3的良好抑制剂。这些情况模拟了预建立的炎性疾病。
实例6-FACS染色
简言之，收集293T或293T-ISRE/TLR3细胞系，将培养基洗涤，并且将细胞固定并且按照制造商的说明书使用来自Beckman Coulter(贝克曼库尔特)的IntraPrepTM渗透试剂进行渗透。然后，在室温下用25μg/mL 31C3抗体将渗透的细胞孵育20分钟，通过标记有FITC的山羊抗-小鼠抗体来进一步显示。这些图形表示于图13中。图13A表示HEK293T细胞系上的阴性对照。图13B表示在HEK293T-TLR3细胞上得到的染色情况。用对照的同种型抗体(而不是31C3抗-TLR3抗体)孵育的细胞是未染色的。
在渗透的细胞中使用抗体31C3得到的染色情况表明在细胞中这些抗体特异性地识别并且结合细胞内人类TLR3。
实例7-动力学研究
进行另一组测定来确定根据本发明的抗体的抑制动力学。简言之，将MdDC与一种抗TLR3抗体(31C3或23C8，在50μg/ml浓度下)、并且在不同时间设定中聚AU的剂量范围下进行孵育。然后将培养基孵育24小时，并且通过ELISA对IP-10分泌作用进行测量。图12A以ng/ml表示针对31C3抗体IP-10的分泌作用(取决于聚AU剂量)；图12B表示针对23C8抗体的结果。
刺激前：在添加dsRNA之前将抗TLR3抗体孵育1小时30分钟。
共同刺激：同时添加抗TLR3抗体和dsRNA。
刺激后：在添加抗TLR3抗体之前将dsRNA孵育1小时30分钟。
这些结果表明根据本发明的抗体对于TLR3抑制作用是有效的，无论
dsRNA与TLR3蛋白的结合状态如何。这些抗体不与dsRNA的结合位点竞争，但仍然能够抑制TLR3信号传送，即使当dsRNA已经结合到TLR3蛋白上时。
实例8-TLR3内化作用测定
简言之，在37℃下将无抗体或50μg/mL抗-TLR3抗体31C3与活的293T-ISRE/TLR3细胞系一起孵育，持续2小时或24小时。然后将细胞洗涤、固定并且使用来自Beckman Coulter(贝克曼库尔特)的IntraPrep渗透剂进行透化处理。用标记有APC的山羊抗小鼠抗体显示TLR3结合的抗TLR331C3抗体的存在。可替代地，用对照同种型或用在FACS中有效的、不与31C3Ab竞争TLR3结合的TLR3特异性mAb来孵育渗透的细胞(两者都标记有生物素)，并且通过用荧光链亲和素衍生物进行细胞孵育来进一步显示。这些图形表示于图12中。图12A表示阴性对照，表示在缺少连接TLR3蛋白的抗体时293T-ISRE/TLR3细胞的荧光强度。图12C和D对应地表示在24小时和2小时孵育之后通过结合到内化的31C3抗体的TLR3蛋白上而诱导的荧光。图12B指示在不使用31C3抗体预孵育时在293T-ISRE/TLR3细胞系中TLR3表达的稳定态水平。图12D和12F，显示了与图12B相比较类似的荧光，证实了TLR3被抗体31C3结合未下调TLR3在293T-ISRE/TLR3细胞系上的表达。
这些结果显示根据本发明的这些抗体被快速地并且有效地内化，而且没有任何hTLR3的调节作用。这些结果说明了根据本发明的抗体的结合效能。此外，这种快速内化作用提供了这些抗体是用于治疗的有希望的候选物的证据。这类抗体还是与毒性剂结合的有希望的候选物，由此允许特异性靶向表达TLR3的细胞。
[00243]所有标题和小标题在此仅出于方便的目的来使用，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。在所有可能的变体中上述元件的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。在此引证数值的范围仅旨在用作单独地提及每个单独的数值落在该范围内的速记的方法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被结合到本说明书中就像它被单独地在此引证一样。除非另外说明，在此提供的所有确切数值是相应近似值的代表(例如，就特定因子或测量值所提供的所有确切的示例性数值可以被认为还提供了一个对应的近似测量值，当适当时通过“约”来修饰)。
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[00249]尽管以上专利已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，对于本领域普通技术人员而言在本发明的传授内容的启发下应该容易清楚的是，在不偏离随附的权利要求的精神或范围下可以对其进行某些改变以及变更。
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Claims (50)

1.一种特异性地结合TLR3多肽的单克隆抗体，其中所述抗体抑制由该TLR3多肽的信号传送而不阻断dsRNA TLR3配体结合到该TLR3多肽上。
2.如权利要求1所述的抗体，其中任选地在酸性和/或中性条件下所述抗体与选自下组的一种抗体竞争结合到一个TLR3多肽上，该组的组成为：
(a)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 34以及35(34A3)的一个VH区和一个VL区，
(b)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 10以及11(29H3)的一个VH区和一个VL区，
(c)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 18以及19(28F11)的一个VH区和一个VL区，
(d)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 26以及27(23C8)的一个VH区和一个VL区，以及
(e)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一个VH区和一个VL区。
3.如权利要求1-2所述的抗体，其中所述抗体包括一个轻链，该轻链包括：
(a)一种选自SEQ ID NOS：61、64以及65的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；
(b)一种选自SEQ ID NOS：62、66以及67的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列；以及
(c)一种选自SEQ ID NOS：63、68、69以及70的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。
4.如权利要求1-3所述的抗体，其中所述抗体包括一个重链，该重链包括：
(a)一种选自SEQ ID NOS：71至76的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；
(b)一种选自SEQ ID NOS：77至81的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；以及
(c)一种选自SEQ ID NOS：82至85的重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列。
5.一种特异性地结合人类TLR3多肽的单克隆抗体，其中在酸性条件下所述抗体以针对其二价结合亲和性亚纳摩尔KD特异性地结合到该TLR3多肽上。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体调节TLR3信号传送而不阻断一个dsRNA TLR3配体结合到该TLR3多肽上。
7.如权利要求5至6所述的抗体，其中所述抗体抑制TLR3信号传送。
8.如权利要求1-7所述的抗体，其中所述抗体在树突细胞中调节TLR3信号传送。
9.如权利要求1-4以及6-8所述的抗体，其中在酸性条件下所述抗体以针对其二价结合亲和性亚纳摩尔的KD特异性地结合到该TLR3多肽上。
10.如权利要求5-9所述的抗体，其中所述酸性条件包括在4.5至6.5之间的pH。
11.如权利要求1-10所述的抗体，其中在中性条件下所述抗体以针对二价结合亲和性亚纳摩尔的KD特异性地结合到一个TLR3多肽上。
12.如权利要求11所述的抗体，其中所述中性条件包括在6.6至7.4之间的pH。
13.一种任选地在酸性和/或中性条件下与选自下组的一种抗体竞争结合到TLR3多肽上的抗体，该组的组成为：
(a)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 34以及35(34A3)的一个VH区和一个VL区，
(b)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 10以及11(29H3)的一个VH区和一个VL区，
(c)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 18以及19(28F11)的一个VH区和一个VL区，
(d)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 26以及27(23C8)的一个VH区和一个VL区，以及
(e)一种抗体，该抗体对应地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一个VH区和一个VL区。
14.如权利要求1-13所述的抗体，其中该抗体是选自下组，该组的组成为：
(a)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：4、5以及6中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：7、8以及9中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(b)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：12、13以及14中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：15、16以及17中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(c)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：20、21以及22中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：23、24以及25中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(d)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：28、29以及30中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：31、32以及33中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；以及
(e)一种抗体，该抗体对应地具有(i)如SEQ ID NO：36、37以及38中所示的重链CDR 1、2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO：39、40以及41中所示的轻链CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；并且其中在任何一个所述序列中这些氨基酸中的一个、两个、三个或更多个可以被一个不同的氨基酸取代。
15.如权利要求1至14所述的抗体，其中所述抗体是一种小鼠抗体。
16.如权利要求1至14所述的抗体，其中所述抗体是一种嵌合体、人类或人源化抗体。
17.如权利要求1至16所述的抗体，其中所述抗体是一种IgG同种型。
18.如权利要求17所述的载体，其中所述抗体的同种型是一种IgG4。
19.如权利要求1至18所述的抗体，其中该抗体包括一个Fc区，该Fc区基本上不结合FcγR。
20.如权利要求1至19所述的抗体，其中所述抗体是选自以下各项的一种抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多种不同抗体片段的一种多特异性的抗体。
21.如权利要求1至20所述的抗体，其中所述抗体连接或共价结合到一个毒性部分上。
22.如权利要求1至21所述的抗体，其中所述抗体能够被一种表达TLR3的细胞内化，任选被一种癌细胞内化。
23.如权利要求1至20所述的抗体，其中所述抗体被连接或共价结合到一个可检出的部分上。
24.通过嵌合化或人源化如权利要求1至23所述的抗体而得到的一种抗体。
25.一种包括以上权利要求中任何一项所述的抗体的试剂盒，该试剂盒任选地进一步包括一种标记的二抗，该二抗特异性地识别以上权利要求中任何一项所述的抗体。
26.一种产生如权利要求1至24所述抗体的杂交瘤或重组体宿主细胞。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞产生如权利要求13或14所述的一种抗体。
28.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞产生抗体31C3或抗体29H3。
29.一种在哺乳动物受试者体内产生特异性地结合TLR3多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)用包括人类TLR3多肽的一种免疫原来免疫一种非人类哺乳动物；以及b)从所述免疫的动物体内选择一种抗体，在酸性以及中性条件下该抗体以高亲和性结合到该TLR3多肽上并且调节TLR3信号传送。
30.如权利要求29所述的方法，其中与中性条件相比较，所选出的抗体在酸性条件下基本上没有失去对TLR3多肽的结合亲和性。
31.如权利要求29所述的方法，其中选择该抗体来抑制TLR3信号传送而不阻断TLR3配体结合到TLR3多肽上。
32.一种在哺乳动物受试者体内产生特异性地结合TLR3多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)用包括人类TLR3多肽的一种免疫原来免疫一种非人类哺乳动物；以及b)从所述免疫的动物体内选择一种抗体，该抗体抑制TLR3信号传送而不阻断TLR3配体结合到TLR3多肽上。
33.如权利要求29至32所述的方法，其中在步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。
34.如权利要求29至33所述的方法，进一步包括一个步骤，其中对所述抗体特异性结合到人类TLR3多肽上的能力进行评价。
35.如权利要求29至34所述的方法，进一步包括一个步骤，其中对所述抗体与抗体29H3和/或31C3竞争结合到人类TLR3多肽上的能力进行评价。
36.如权利要求29至35所述的方法，进一步包括制造这些选出的单克隆抗体的片段或衍生物的步骤。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述片段或衍生物是选自下组，该组的组成为：Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多种不同抗体片段的多特异性的抗体、人源化抗体、以及嵌合体抗体。
38.一种药用组合物，该组合物包括如权利要求1-23中任何一项所述的一种抗体或根据权利要求24或29至37所述可以得到的一种抗体，以及一种药学上可接受的载体。
39.一种用于治疗或预防选自下组的疾病的方法，该组的组成为：自身免疫性疾病、炎症、变态反应、哮喘、感染、硬化以及脓毒症，所述方法包括向需要它的病人给予一个治疗有效量的如权利要求1-24或38中任何一项所述的一种抗体或药用组合物。
40.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是一种感染。
41.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是与感染相关联的一种炎症。
42.如权利要求39或41所述的方法，其中该疾病是肺部炎症。
43.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是类风湿性关节炎。
44.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是脓毒症。
45.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是硬化。
46.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是糖尿病。
47.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是骨质疏松症。
48.如权利要求39所述的方法，其中该疾病是患有类风湿性关节炎的病人体内的骨质疏松症。
49.如权利要求39至48所述的方法，进一步包括向该病人给予一个适当的额外的选自下组的治疗试剂的步骤，该组的组成为：一种免疫调节剂、一种皮质类固醇、一种免疫抑制剂、一种抗生素、一种抗病毒试剂以及一种抗炎剂。
50.一种用于治疗或预防癌症的方法，包括向需要它的病人给予一个治疗有效量的如权利要求21或22中任何一项所述的一种抗体或药用组合物。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
LT2350304T (lt) 2008-10-31 2017-02-10 Janssen Biotech, Inc. Toll tipo receptoriaus 3 antagonistai
WO2010060186A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
CN102471382A (zh) 2009-07-10 2012-05-23 依奈特制药公司 Tlr3 结合剂
CA2824313A1 (en) * 2011-01-12 2012-07-19 Innate Pharma Tlr3 binding agents
SI3173427T1 (sl) * 2011-03-31 2019-08-30 ADC Therapeutics SA, Protitelesa proti antigenu 1, povezanemu z ledvicami, in antigen vezavni fragmenti le-tega
WO2013078223A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 Children's Hospital & Research Center Oakland Anti-factor h binding protein antibodies and methods of use thereof
CN111298119A (zh) 2012-01-09 2020-06-19 Adc治疗股份有限公司 用于通过使用肾相关抗原1（kaag1）的抑制剂来治疗三阴性乳癌和基底样乳癌的方法
ES2641444T3 (es) 2012-05-09 2017-11-10 Eli Lilly And Company Procedimiento de preparación de cloruros de 4-[[(benzoil)amino]sulfonil]benzoílo y preparación de acilsulfamoilbenzamidas
EP2855527B1 (en) * 2012-05-31 2018-08-01 Innate Pharma Tlr3 binding agents
CA2882594C (en) * 2012-08-21 2019-07-16 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Antibodies to risperidone and use thereof
US10428312B2 (en) * 2013-12-03 2019-10-01 Agency For Science, Technology And Research Cytotoxic antibody
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
RU2764074C2 (ru) 2014-08-28 2022-01-13 Байоатла, Ллк Условно активные химерные антигенные рецепторы для модифицированных т-клеток
RS63698B1 (sr) 2016-05-13 2022-11-30 Bioatla Inc Anti-ror2 antitela, fragmenti antitela, njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe
US20230348571A1 (en) * 2020-04-06 2023-11-02 Vanderbilt University Cross-reactive coronavirus antibodies and uses thereof
AU2022230408A1 (en) * 2021-03-03 2023-09-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services La protien as a novel regulator of osteoclastogenesis

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
PT1798288E (pt) 1997-05-07 2009-12-23 Schering Corp Proteínas receptoras humanas semelhantes a toll, reagentes e métodos relacionados
WO1998056418A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
WO2002072636A2 (en) 2000-12-28 2002-09-19 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
WO2003043583A2 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
WO2003080675A2 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Amrad Operations Pty Ltd MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST INTERLEUKIN-13 RECEPTOR ALPHA 1 (IL-13Rα1)
JP2004016021A (ja) 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
AR051836A1 (es) * 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
JP5199878B2 (ja) 2005-10-27 2013-05-15 セントカー・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３モジュレーター、方法および用途
EP1957539B1 (en) 2005-12-08 2013-04-17 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 (ptk7) and their use
WO2008127347A1 (en) 2006-07-21 2008-10-23 Diadexus, Inc. Pro115 antibody compositions and methods of use
US20100129354A1 (en) 2006-10-27 2010-05-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
US8802103B2 (en) 2007-05-15 2014-08-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US20110076296A1 (en) 2008-04-25 2011-03-31 Innate Pharma S.A. TLR3 Agonist Compositions
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
LT2350304T (lt) 2008-10-31 2017-02-10 Janssen Biotech, Inc. Toll tipo receptoriaus 3 antagonistai
US20130090457A1 (en) 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
MX2011011623A (es) 2009-04-29 2011-11-18 Janssen Biotech Inc Antagonistas del receptor tipo toll 3.
CN102471382A (zh) 2009-07-10 2012-05-23 依奈特制药公司 Tlr3 结合剂
ES2438774T3 (es) 2009-12-11 2014-01-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Anticuerpo que se une a parvovirus H-1
CA2824313A1 (en) 2011-01-12 2012-07-19 Innate Pharma Tlr3 binding agents
EP2855527B1 (en) 2012-05-31 2018-08-01 Innate Pharma Tlr3 binding agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAREN E: "Down modulation of human TLR3 funcition by a monoclonal antibody.", <CELLULAR IMMUNOLOGY >, vol. 248, 31 December 2007 (2007-12-31), XP022401829, DOI: doi:10.1016/j.cellimm.2007.10.002 *

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Publication number Publication date
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