CN106132989A - 具有增加的稳定性的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有改进的稳定性的抗体。包括能够结合KIR3DL2多肽的抗体。所述抗体适合治疗以表达KIR3DL2的细胞、特别是CD4+ T细胞为特征的病症，包括恶性疾病如蕈样真菌病和塞扎里综合征，以及表达KIR3DL2的自身免疫性病症。

Description

具有增加的稳定性的人源化抗体
技术领域
本发明提供具有改进的稳定性的抗体。包括能够结合KIR3DL2多肽的抗体。所述抗体适合治疗以表达KIR3DL2的细胞、特别是CD4+T细胞为特征的病症，包括恶性疾病如蕈样真菌病(Mycosis Fungoides)和塞扎里综合征(Sezary Syndrome)，以及表达KIR3DL2的自身免疫性病症。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月14日提交的美国临时申请No.61/953,035的权益；所述临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中；包括任何附图。
序列表的引用
本申请是与序列表一起以电子格式提交的。所述序列表以创建于2015年3月11日的名称为“KIR-5PCT_ST25”的文件形式提供，其大小为49KB。所述序列表的电子格式的信息以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)是一种受体家族，其与C型凝集素受体(CD94-NKG2)一起，被人类NK细胞和T淋巴细胞亚群用于特异性识别MHC I类分子。某些抑制性和活化性KIR具有高度相似的胞外结构域并且被相同的单克隆抗体识别，例如KIR2DL1和KIR2DS1被EB6识别，并且2DL2和2DS2被GL183识别。已经使用三个标准(胞外Ig样结构域(结构域D0、D1、D2)数目、胞质尾长度和序列类比数)将KIR蛋白分类成13个群组，即KIR3DL1–2、KIR3DS1、KIR2DL1–5和KIR2DS1–5。2个结构域的命名2D或3个结构域的命名3D给出Ig样结构域数目；具有长或短胞质域的受体被进一步分成L或S(Pascal V.等,2007,《免疫学杂志(J.Immunol.)》179:1625-1633)。所述抑制性受体具有长(L)胞质尾(即，KIR2DL或KIR3DL)，其含有在KIR与其I类HLA配体接合后变得酪氨酸磷酸化的典型ITIM。所述磷酸化ITIM募集含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(含Src同源2结构域的磷酸酶1和/或含Src同源2结构域的磷酸酶2)，其将细胞底物脱磷酸化，因此中止NK激活信号，即，回避具有适当的自MHCI类表达的靶细胞。具有短(S)胞质尾的受体缺乏ITIM(即，KIR2DS或KIR3DS)。这些激活KIR在其跨膜结构域内含有带电残基，从而促进与信号传导链KARAP/DAP12的相互作用。KIR2DS家族受体的接合已显示导致KARAP/DAP12介导的信号传导事件的级联，最终导致NK细胞溶细胞活性增加和促炎细胞因子如IFN-γ的产生(Pascal等,2007,《免疫学杂志(J.Immunol.)》179:1625-1633)。成熟NK细胞被预测为获得至少一种对自MHC I类分子具特异性的抑制性受体，其通常在功能上优于潜在自身反应性激活分子。提议NK细胞的反应代表KIR和其他受体的活化性和抑制性信号传导的综合结果。
已经研究KIR3DL2作为治疗涉及表达KIR3DL2受体的CD4+T细胞、特别是CD4+T细胞的恶性疾病(包括恶性疾病如蕈样真菌病和塞扎里综合征)的靶标(参见例如PCT公开WO2010/081890和WO02/50122)。KIR3DL2的配体HLA-B27与脊柱关节病(SpA)强烈相关，脊柱关节病是以强直性脊柱炎(AS)为代表的一组使人衰弱的炎性关节炎病症。通过B27二聚体进行的KIR3DL2连接促进Th17和NK细胞亚群的存活(Bowness等,(2011),《免疫学杂志(Journal of immunology)》186:2672-2680；Chan等,(2005),《关节炎和风湿病(ArthritisRheum)》52:3586-3595)。已经表明，在具有SpA的患者中存在增加比例的表达KIR3DL2的致病性Th17和NK细胞亚群。研究强烈表明，KIR3DL2-B27相互作用在SpA中发挥重要作用并且KIR3DL2是一种有前途的治疗靶标。
已经报道了针对各种KIR3D多肽具反应性的抗体的存在。已经报道了两种抗KIR3DL2抗体的存在：Q241和Q66(Pende等,(1996),《实验医学杂志(J Exp Med)》184:505-518)。然而，这两种抗体是IgM同种型(五聚体)并且不容易适合制药用途；此外，如果它们的可变区被放在二价IgG型抗体的情况下，则其亲和力预期将是低的。报道了产生另一种抗体的被称为“AZ158”的细胞(Parolini,S.等,(2002)《白细胞分型(Leucocyte typing)》VII.D.Mason编辑,牛津大学出版社,牛津.415-417；PCT公开WO2010/081890)。抗体5.133可获自Miltenty Biotech(Auburn CA)。两种抗体AZ158和5.133都结合KIR3DL2以及KIR3DL1(和此外高度同源的KIR3DS1)。KIR3DL2和KIR3DL1共有相对高的氨基酸同一性并且结合KIR3DL2的各种HLA配体也被KIR3DL1识别。尽管存在产生AZ158、Q241和Q66的免疫化，但仍需要在治疗和其他应用中的改进的抗体。
发明内容
在一个方面，提供具有人类框架的抗KIR3DL2抗体，其在药物制剂中具有高亲和力抗原结合和稳定性。本发明人开发了具有不同单基因和嵌合性人类框架的抗体并且发现在重链中残基39处和在轻链中残基38处(Abnum)的某些氨基酸提供强烈增加的物理稳定性。
已经使用抗体2B12和10G5的抗原组合区开发了示例性抗体。在2013年9月17日提交的PCT申请号PCT/EP2013/069302中描述了抗体2B12和10G5CDR。抗KIR3DL2mAb 2B12和10G5具有既不结合密切相关的(通过同源性)KIR3DL1也不造成KIR3DL2内化的有利特性。KIR3DL2内化强烈阻碍了基于ADCC的方法。所述抗体当具有适当同种型(例如IgG1)时能够介导ADCC，但也能够抑制KIR3DL2-HLA B27二聚体与KIR3DL2的相互作用。值得注意的是，可以在不造成受体内化的情况下实现配体阻断。因此阻断KIR3DL2的一种或多种天然配体的抗体非常适于以消耗性或非消耗性mAb形式治疗或预防炎性病症。由所述抗体结合的KIR3DL2上的表位已经被确定，因为抗体10G5和2B12都失去与在残基I60和G62处具有取代的KIR3DL2突变体的结合。抗体10G5进一步失去与在残基P14、S15和H23处以及在残基R13、A25和Q27处具有取代的KIR3DL2突变体的结合。所述抗体在如在细胞表面上表达的天然构型中彼此竞争结合于KIR3DL2多肽。
在一个实施方案中，本发明提供人源化2B12或10G5抗体。在一个实施方案中，本发明提供在轻链和/或重链中具有嵌合性人类框架的人源化2B12或10G5抗体。提供这类人源化抗体的框架区(FR)中用于氨基酸取代的示例性互补决定区(CDR)残基或序列和/或位点，所述人源化抗体具有改进的特性，例如，较低的免疫原性、改进的抗原结合或其他功能特性和/或改进的物理化学特性，例如，更好的稳定性。在一个实施方案中，所述人类框架序列包含回复突变。
本文提供的框架和可变区在药物制剂中存在的条件下在2B12和10G5上赋予高的物理稳定性和低的聚集倾向。特别是，提供具有拥有基本上人类框架区的2B12或10G5的抗原组合区的抗体，其中所述抗体在其重链中包含在位置39处的谷氨酰胺(Q)并且在其轻链中包含在位置38(Abnum编号)处的谷氨酰胺。不希望受理论束缚，但据信，当在轻链中残基38(Abnum编号)处存在谷氨酰胺时，在VH_Q39与VL_Q38之间建立H键(参见图1)，从而导致所述抗体的更大物理稳定性。这两个H键可使mAb的四级结构稳定化，从而防止负责蛋白质聚集的疏水部分的暴露。
在一个实施方案中，所述抗体具有人类VH和VL受体框架，其中所述抗体在其重链中包含在残基39处的谷氨酰胺残基并且在其轻链中包含在残基38处的谷氨酰胺。VH和/或VL人类受体框架相比于天然存在的人类受体框架可包含回复突变(例如在一个或多个框架区中对相应供体残基的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代)。任选地，所述抗体结合于与抗体2B12或10G5相同的表位。
在一个实施方案中，所述抗体包含源自人类VH7亚群的重链框架1(FW1)和2(FW2)。任选地，所述抗体包含源自人类VH7亚群的重链框架3(FW3)。任选地，所述抗体包含源自JH6亚群的重链框架4(FW4)。在一个实施方案中，所述抗体包含VK1和/或VK4亚群任选地组合JK4亚群的轻链受体框架。任选地，所述抗体包含源自人类VK1亚群的轻链FW1和源自人类VK4亚群的轻链FW2和轻链FW3。任选地，所述抗体包含源自JK4亚群的轻链FW4。
在一个实施方案中，提供结合KIR3DL2的分离的单克隆抗体，其包含含有抗体2B12的重链CDR1、2和3以及人类VH7亚群任选地组合JH6亚群的人类重链受体框架的重链，和含有抗体2B12的轻链CDR1、2和3以及VK1和/或VK4亚群任选地组合JK4亚群的人类轻链受体框架的轻链。在一个实施方案中，所述重链框架包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，所述轻链框架包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，所述重链框架包含(总计)一个、两个或三个回复突变。在一个实施方案中，所述轻链框架包含(总计)一个或两个回复突变。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有抗体2B12的重链CDR1、2和3以及人类重链受体框架的重链，其中框架1(FW1)和2(FW2)源自人类VH7亚群。任选地，框架3(FW3)源自人类VH7亚群。任选地，框架4(FW4)源自JH6亚群。任选地，所述抗体包含含有抗体2B12的轻链CDR1、2和3以及VK1和/或VK4亚群任选地组合JK4亚群的人类轻链受体框架的轻链。任选地，轻链FW1源自人类VK1亚群并且轻链FW2和轻链FW3源自人类VK4亚群。任选地，轻链FW4源自JK4亚群。在一个实施方案中，所述重链框架包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，所述轻链框架包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，所述重链框架包含(总计)一个、两个或三个回复突变。在一个实施方案中，所述轻链框架包含(总计)一个或两个回复突变。
在一个实施方案中，所述VH7亚群基因是IGHV7-4(例如IGHV7-4-1*02，编码以SEQID NO:53示出的氨基酸序列的基因)。在一个实施方案中，所述VK1亚群基因是IGKV1-39，例如，编码以SEQ ID NO:44示出的氨基酸序列的基因。在一个实施方案中，所述VK4亚群基因是IGKV4-1，例如，编码以SEQ ID NO:45示出的氨基酸序列的基因。
在一个实施方案中，提供结合KIR3DL2的分离的单克隆抗体，其包含含有抗体10G5的重链CDR1、2和3以及源自人类VH1亚群(例如IGHV1-46)的人类重链受体框架的重链，和含有抗体10G5的轻链CDR1、2和3以及源自VK1亚群(例如IGKV1-NL1)的人类轻链受体框架的轻链。在一个实施方案中，所述重链框架包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，所述轻链框架包含一个或多个回复突变。
在一个实施方案中，所述抗体包含具有VH1和/或VH7亚群组合JH6亚群的人类重链受体框架，和VK1和/或VK4亚群组合JK4亚群的人类轻链受体框架。
在另一个方面，本发明提供分离的人源化抗体，其结合人类KIR3DL2多肽并包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；在VH结构域的位置39处的谷氨酰胺(Q)残基和在VL结构域的位置38处的谷氨酰胺。所述位置39处的谷氨酰胺(Q)残基可天然存在于人类VH框架序列中，或者可通过序列的氨基酸取代或其他修饰引入。
在一个实施方案中，提供包含抗体2B12或10G5的重链和轻链CDR1、2和3的人源化抗体。在一个实施方案中，提供包含人类受体框架的抗体，其结合KIR3DL2多肽而基本上不结合KIR3DL1多肽，其中所述抗体包含抗体2B12或10G5的重链和轻链CDR1、2和3，其中一个或多个人类框架区包含氨基酸取代。任选地，所述取代是回复突变。任选地，所述取代是本文公开的取代。任选地，所述抗体在其重链中包含在残基39处的谷氨酰胺并且在其轻链中包含在残基38处的谷氨酰胺。
在一个方面，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)分别包含SEQ ID NOS:18(HCDR1)、SEQ ID NOS:19(HCDR2)和SEQ ID NO:20(HCDR3)的序列的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和
(b)分别包含SEQ ID NO:21、22和23的序列的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。任选地，所述抗体具有VH1和/或VH7亚群组合JH6亚群的人类重链受体框架，和VK1和/或VK4亚群组合JK4亚群的人类轻链受体框架。任选地，所述人类轻链和/或重链受体框架包含取代(例如回复突变)。
任选地，在本文关于2B12抗体的任何实施方案中，所述重链框架可在选自以下的位置具有一个或多个取代：残基2、38、39、40、43、48、68、72c、9和108(Abnum编号)，包括其任何组合。任选地，在本文关于2B12抗体的任何实施方案中，所述轻链框架在选自以下的位置具有一个或多个取代：残基3、8、9、21、43、71、78和104(Abnum编号)，包括其任何组合。在一个实施方案中，取代是回复突变。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含选自2B12-H0、-H1、-H2、-H3和-H4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自2B12-L0、-L1、-L2、-L3和-L4的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含选自SEQ ID NO:29-33的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含选自SEQ ID NO:24-28的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID N:29的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID N:24的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID N:31的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化2B12单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，重链可变区在一个、两个、三个或四个其框架区中包含一个或多个回复突变。在一个实施方案中，轻链可变区在一个、两个、三个或四个其框架区中包含一个或多个回复突变。
在一个方面，提供药学上可接受的活性制剂，其包含：(a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的IgG抗体分子，其包含含有选自2B12-H0、-H1、-H2、-H3和-H4的氨基酸序列的重链；和含有选自2B12-L0、-L1、-L2、-L3和-L4的氨基酸序列的轻链；(b)缓冲体系，例如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠；(c)等渗剂，任选地NaCl；和(d)聚山梨醇酯80，在6.5至8、任选地约7.4的pH下。在一个方面，提供药学上可接受的活性制剂，其包含：(a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的抗体；(b)约10mM缓冲剂，例如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠；(c)等渗剂，任选地约9mg/ml NaCl；和(d)聚山梨醇酯80，在6.5至8、任选地约7.4的pH下。
在一个方面，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:2(HCDR1)、SEQ ID NO:3(HCDR2)和SEQ ID NO:4(HCDR3)的序列的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和
(b)分别包含SEQ ID NO:5、6和7的序列的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。任选地，所述抗体具有VH1亚群组合JH6亚群的重链人类受体框架，和VK1亚群组合JK2亚群的轻链人类受体框架。任选地，所述抗体具有拥有包含取代(例如回复突变)的人类受体框架的重链。
任选地，在本文关于10G5抗体的任何实施方案中，所述重链框架可在选自以下的位置处具有一个或多个取代：残基5、11、12、13、20、38、40、48、66、67、69、71、72a和75(Abnum编号)，包括其任何组合。任选地，在本文关于10G5抗体的任何实施方案中，所述轻链框架在选自以下的位置处具有一个或多个取代：残基17、18、40、45、48、70、76和100(Abnum编号)，包括其任何组合。在一个实施方案中，取代是回复突变。
在一个实施方案中，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)包含选自10G5-H0、-H1、-H2、-H3、-H4、-H5和-H6的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自10G5-L0、-L1、-L2、-L3、-L4和-L5的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)包含选自SEQ ID NO:13-17的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含选自SEQ ID NO:8-12的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，提供人源化10G5单克隆抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个方面，提供药学上可接受的活性制剂，其包含：(a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的IgG抗体分子，其包含含有选自10G5-H0、-H1、-H2、-H3、-H4、-H5和-H6的氨基酸序列的重链和含有选自10G5-L0、-L1、-L2、-L3、-L4和-L5的氨基酸序列的轻链；(b)缓冲体系，例如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠；(c)等渗剂，任选地NaCl；和(d)聚山梨醇酯80，在6.5至8、任选地约7.4的pH下。在一个方面，提供药学上可接受的活性制剂，其包含：(a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的抗体；(b)约10mM缓冲剂，例如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠；(c)等渗剂，任选地约9mg/ml NaCl；和(d)聚山梨醇酯80，在6.5至8、任选地约7.4的pH下。
在一个实施方案中，所述抗体结合于KIR3DL2多肽等位基因*002、*003、*005、*007和/或*008中的1、2、3、4或5种。任选地，所述抗体对于与在表面表达特定KIR3DL2等位基因(例如等位基因_*001、*002、*003、*005、*007和/或*008)的细胞的结合具有不大于5μg/ml、任选地不大于3μg/ml、不大于2μg/ml、不大于1μg/ml或不大于0.5μg/ml的EC50。在一个方面，提供在配体(HLA)结合区(例如HLA结合袋)中或至少部分地在KIR3DL2蛋白的HLA结合面上结合KIR3DL2多肽的抗体。
在一个方面，提供结合包含残基I60和/或G62(关于SEQ ID NO:1)的表位的抗体，和/或所述抗体与在残基I60和/或G62处具有突变(关于SEQ ID NO:1，例如I60N、G62S)的KIR3DL2多肽的结合降低。在一个方面，提供如下抗体，其结合包含KIR3DL2多肽的残基R13、A25和/或Q27的表位，和/或与在残基R13、A25和/或Q27(关于SEQ ID NO:1)处具有突变的KIR3DL2多肽的结合降低。例如，抗体与具有突变R13W、A25T和/或Q27R的KIR3DL2多肽的结合可降低。任选地，所述表位另外或可选地包含残基P14、S15和/或H23(关于SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体与在残基P14、S15和/或H23处具有突变(关于SEQ ID NO:1，例如P14S、S15A、H23S)的KIR3DL2多肽的结合降低。
在其他方面，本发明提供包含这类药剂和载体的药物组合物，并提供包含这类药剂与例如细胞毒性剂或可检测剂结合的结合物。在其他方面，本发明提供编码这类药剂的核酸和载体，以及含有这类核酸和/或载体的宿主细胞。此外提供通过培养这种宿主细胞以使得产生核酸来制造药剂的重组方法。在其他方面，本发明提供制造物品，其包含含有这类药剂的容器和指导使用者治疗患者中的病症如癌症或自身免疫性疾病的说明书。任选地，所述物品可包含含有另一种药剂的另一个容器，其中说明书指导使用者利用抗体与药剂组合来治疗病症。本发明还提供使用本发明的药剂任选地结合另一种抗癌或抗炎剂来治疗患者中的病症如癌症、炎性病症或自身免疫性病症的方法。
本文其他地方可进一步描述本发明的这些和其他有利的方面和特征。
附图说明
图1示出抗体结构的建模，显示当在轻链中残基38处和在重链中残基39处存在谷氨酰胺时，可在VH_Q39与VL_Q38之间建立H键，这可以解释这类抗体的更大的物理稳定性。
图2示出植入Raji-KIR3DL2高5M IV并用抗体2B12-H2L1的剂量反应进行IP处理的CB17-SCID小鼠(n＝8/组)的存活曲线。从第1天起开始治疗。实验结束于第58天。
具体实施方式
引言
本公开的抗体能够直接地和特异性地靶向表达KIR3DL2的细胞，特别是CD4+、KIR3DL2+T细胞，而不靶向其他细胞如KIR3DL1+细胞(或KIR3DL2+KIR3DL1+细胞、KIR3DS1+细胞；或KIR3DS1KIR3DL2+细胞)，并且不内化到KIR3DL2+细胞中。此外提供抑制KIR3DL2的天然配体的结合(或配体诱导的KIR3DL2信号传导)的抗体。本公开提供具有这类特性的抗体，并且其彼此竞争结合于包括由SEQ ID NO:1的成熟KIR3DL2多肽的氨基酸残基1-98限定的结构域0的KIR3DL2+区域。
KIR3DL2(CD158k)是具有约140kD的三个Ig结构域分子的二硫键连接的同型二聚体，描述于Pende等,(1996),《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》184:505-518中，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。KIR3DL1(CD158e1)是约70kD的单体分子，描述于Colonna和Samaridis(1995),《科学(Science)》268(5209),405-408中；HLA结合袋已经描述于Vivian等,(2011),《自然(Nature)》479:401-405中。KIR3DL2的天然配体尤其包括HLA-A和HLA-B多肽，特别是HLA-A3和HLA-A11(参见Hansasuta等,(2004),《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》34:1673-1679)和HLA-B27。HLA-B27(关于HLA-B27基因的组织、序列和表达，参见例如Weiss等,(1985),《免疫生物学(Immunobiology)》170(5):367-380；并且关于HLA-B27多聚体和HLA-B272同型二聚体，参见Allen等,(1999),《免疫学杂志(J.Immunol.)》162:5045-5048和Kollnberger等,(2007),《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》37:1313-1322)。如本文所用，“KIR3D”是指单独或共同地任何KIR3D受体(例如KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DS1)，并且术语“KIR3D”可被术语“KIR3DL1、KIR3DL2和/或KIR3DS1”代替。类似地，“KIR3DL”是指单独或共同地任何KIR3DL受体(例如KIR3DL1、KIR3DL2)，并且术语“KIR3DL”可被术语“KIR3DL1和/或KIR3DL2”代替。术语“KIR3D”、“KIR3DL”、“KIR3DL1”、“KIR3DL2”、“KIR3DS1”此外各自包括KIR3D基因或其提及的编码蛋白的任何变体、衍生物或同功异型物。已经报道了KIR3D多肽的若干等位基因变体(例如KIR3DL2)，这些变体各自被相应的术语所涵盖。成熟人类KIR3DL2(等位基因*002)的氨基酸序列以SEQ ID NO:1示出，对应于Genbank登录号AAB52520，其中已省略21个氨基酸残基的前导序列，并且对应于IPD KIR数据库(由EMBL-EBI(欧洲生物信息研究所，英国)公开)登录号KIR00066。
KIR3DL2(等位基因*002)的cDNA以Genbank登录号U30272示出。人类KIR3DL2等位基因*002的前体氨基酸序列(包括前导序列)以Genbank登录号AAB52520示出。人类KIR3DL2等位基因*001的氨基酸序列以IPD KIR数据库登录号KIR00065示出。人类KIR3DL2等位基因*003的氨基酸序列以Genbank登录号AAB36593和IPD KIR数据库登录号KIR00067示出。人类KIR3DL2等位基因*004的氨基酸序列以IPD KIR数据库登录号KIR00068示出。人类KIR3DL2等位基因*005的氨基酸序列以IPD KIR数据库登录号KIR00069示出。人类KIR3DL2等位基因*006(成熟)的氨基酸序列以Genbank登录号AAK30053和IPD KIR数据库登录号KIR00070示出。人类KIR3DL2等位基因*007(成熟)的氨基酸序列以Genbank登录号AAK30052和IPD KIR数据库登录号KIR00071示出。人类KIR3DL2等位基因*008的氨基酸序列以Genbank登录号AAK30054和IPD KIR数据库登录号KIR00072示出。人类KIR3DL2等位基因*009的氨基酸序列以IPD KIR数据库登录号KIR00457示出。人类KIR3DL2等位基因*011的氨基酸序列以IPD KIR数据库登录号KIR00544示出。编码KIR3DL1(CD158e2)多肽(等位基因*00101)的cDNA以Genbank登录号L41269示出；编码氨基酸序列以Genbank登录号AAA69870示出。当前导序列以描述KIR3DL2多肽序列的特定SEQ ID NO存在时，本文中对于氨基酸残基位置的任何提及将是对成熟KIR3DL多肽的提及。具有上述登录号的每个数据库记录是以引用的方式并入本文中。
提供使用抗原结合化合物的方法；例如，抑制细胞增殖或活性的方法，将分子递送到细胞(例如毒性分子、可检测标记等)中的方法，靶向、鉴定或纯化细胞的方法，消耗、杀伤或消除细胞的方法，降低细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞、例如表达KIR3DL2多肽的T细胞暴露于结合KIR3DL2多肽的本公开的抗原结合化合物。应理解，对于本公开的目的，“细胞增殖”可能是指细胞生长或增殖(例如，细胞生长、细胞分裂)的任何方面，或细胞周期的任何方面。所述细胞可能在细胞培养物中(体外)或在哺乳动物中(体内)，例如罹患表达KIR3DL2的病变的哺乳动物。此外提供诱导表达KIR3DL2多肽的细胞的死亡或者抑制表达KIR3DL2多肽的细胞的增殖或活性的方法，其包括使所述细胞暴露于连接至毒性剂的结合KIR3DL2多肽的抗原结合化合物，其用量可有效诱导所述细胞的死亡和/或抑制所述细胞的增殖或活性。因此，提供治疗罹患增生性疾病和以表达KIR3DL2多肽的细胞的致病性扩增或激活为特征的任何病状的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用药学上有效量的本文公开的抗原结合化合物。这些病状的实例包括塞扎里综合征、蕈样真菌病、CTCL、外周T细胞淋巴瘤、邻内脏结外PTCL(例如，NK/T-淋巴瘤或肠病相关性T细胞淋巴瘤(EATL))、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、PTCL-NOS(未另外指明)和自身免疫性或炎性病状，例如关节炎、强直性脊柱炎、心血管疾病。
提供生产和使用适于治疗病症(例如癌症、炎性和自身免疫性病症)的抗体和其他化合物的方法，其中消除表达KIR3DL2的细胞将是有用的。涵盖抗体、抗体衍生物、抗体片段和产生其的细胞，也涵盖生产其的方法和使用所述抗体和化合物来治疗患者的方法。
由于本抗体对KIR3DL2具特异性，因此它们可用于多种目的，包括纯化KIR3DL2或表达KIR3DL2的细胞，在体外、离体或体内调节(例如激活或抑制)KIR3DL2受体，靶向表达KIR3DL2的细胞以在体内破坏，或在体内、离体或体外特异性标记/结合KIR3DL2，包括诸如免疫印迹法、IHC分析(即在冷冻活组织检查上)、FACS分析和免疫沉淀等方法。
定义
如本说明书中所用，“一个”可能是指一个或多个。如权利要求书中所用，当结合词语“包含”使用时，词语“一个”可能是指一个或一个以上。如本文所用，“另一个”可能是指至少第二个或更多个。
当使用“包含”时，这可以任选地被“基本上由……组成”或“由……组成”代替。
如本文所用的术语“癌症”和“肿瘤”被定义为细胞或组织的新生长，包含不受控制的和进行性的增殖。在一个特定实施方案中，在自然过程后，癌症是致命的。在特定实施方案中，癌症是侵入性、转移性和/或间变性的(未分化并且丧失彼此定向和向其轴向框架的定向)。
“自身免疫性”病症包括其中由于区分自身与非自身或其他方面的能力破坏而使免疫系统发动针对自身细胞或组织的反应的任何病症、病状或疾病。自身免疫性病症的实例包括类风湿性关节炎、类风湿性血管炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、韦格纳肉芽肿、脊柱关节炎等。“炎性病症”包括以不希望的免疫反应为特征的任何病症。自身免疫性和炎性病症可涉及免疫系统的任何组分，并且可以靶向身体中的任何细胞或组织类型。
如本文所用的术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。取决于重链中的恒定域的类型，抗体被分成以下五种主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的几种被进一步分成子类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每个链的N端限定主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。IgG和/或IgM是本文使用的抗体的优选种类，其中IgG是特别优选的，因为它们是生理状况中最常见的抗体并且因为它们在实验室环境中最容易制得。优选地，所述抗体是单克隆抗体。特别优选的是人源化、嵌合、人类或其他适合人类的抗体。“抗体”还包括任何本文描述的抗体的任何片段或衍生物。
术语“特异性结合”是指抗体可以优选在竞争性结合测定法中结合于结合搭配物，例如KIR3DL2，如使用蛋白质的重组形式、其中的表位或分离靶细胞的表面上存在的天然蛋白质所评估。竞争性结合测定法和用于测定特异性结合的其他方法在下文进一步描述并且是本领域中众所周知的。
当抗体被称为与特定单克隆抗体(例如2B12、10G5)“竞争”时，它是指在使用重组KIR3DL2分子或表面表达的KIR3DL2分子的结合测定法中所述抗体与单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体降低结合测定法中的2B12或10G5与KIR3DL2多肽或表达KIR3DL2的细胞的结合，则所述抗体被称为分别与2B12或10G5竞争。
如本文所用的术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]的解离常数Kd给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度并且[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka由1/Kd定义。用于测定mAb的亲和力的方法的实例可见于Harlow等,《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)；Coligan等编,《当代免疫学实验手册(Current Protocols inImmunology)》,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)；和Muller,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》92:589-601(1983)中，所述参考文献整体以引用的方式并入本文中。本领域中众所周知用于测定mAb亲和力的一种标准方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)。
如本文所用，“决定子”指示多肽上的相互作用或结合位点。
术语“表位”是指抗原决定子，并且是抗体所结合抗原上的地区或区域。蛋白质表位可包含直接牵涉于结合中的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即在抗体的“足迹”内的氨基酸残基。它是最简单的形式或者可以与例如抗体或受体组合的复合抗原分子上的最小结构区域。表位可以是线性的或构象/结构的。术语“线性表位”被定义为由氨基酸的线性序列上的连续氨基酸残基构成的表位(主要结构)。术语“构象或结构表位”被定义为由并非全部连续的氨基酸残基构成的表位并且因此代表通过分子折叠而彼此接近的氨基酸的线性序列的分隔部分(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于三维结构。术语“构象”因此通常可与术语“结构”互换使用。
术语“胞内内化”或“内化”当提及KIR3DL2多肽和/或结合其的抗体时是指与将分子从细胞的胞外表面转运到细胞的胞内表面的过程相关的分子、生物化学和细胞事件。负责分子的胞内内化的过程是众所周知的并且尤其可以涉及以下分子的内化：胞外分子(例如激素、抗体和小的有机分子)；膜相关分子(例如细胞表面受体)；和结合至胞外分子的膜相关分子的复合物(例如，结合至跨膜受体的配体或结合至膜相关分子的抗体)。因此，“诱导和/或增加胞内内化”包含其中起始胞内内化和/或增加胞内内化的速率和/或程度的事件。
关于表达KIR3DL2的细胞的术语“消耗性”是指可以杀伤、消除、裂解或诱导这种杀伤、消除或裂解以不利地影响样品中或受试者中存在的表达KIR3DL2的细胞的数目的工艺、方法或化合物。
术语“药剂”在本文中用于指示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。
术语“毒性剂”和“细胞毒性剂”涵盖可以减缓、停止或逆转细胞增殖，以任何可检测方式降低其活性或者直接或间接地杀伤它们的任何化合物。优选地，细胞毒性剂主要通过直接干扰细胞的功能而造成细胞死亡，并且包括(但不限于)烷化剂、肿瘤坏死因子抑制剂、螯合剂、微管抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。如本文所用的“毒性有效负载(toxic payload)”是指当递送至细胞时导致细胞死亡的足够量的细胞毒性剂。毒性有效负载的递送可通过施用足够量的包含抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂的免疫结合物来实现。毒性有效负载的递送也可通过施用足够量的包含细胞毒性剂的免疫结合物来实现，其中所述免疫结合物包含识别并结合抗体或抗原结合片段的二级抗体或其抗原结合片段。
对于本文中的目的，“人源化”或“人类”抗体是指其中源自一个或多个人类免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)融合的抗体。这类抗体被设计成保持产生结合区的非人类抗体的结合特异性，但避免针对非人类抗体的免疫反应。这类抗体可以获自已经“工程改造”以产生针对抗原激发的特异性人类抗体的转基因小鼠或其他动物(参见例如Green等,(1994),《自然遗传学(Nature Genet)》7:13；Lonberg等,(1994),《自然(Nature)》368:856；Taylor等,(1994),《国际免疫学(Int Immun)》6:579，其整个教导内容以引用的方式并入本文中)。完全人类抗体也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有方法和技术都是本领域中已知的(参见例如McCafferty等,(1990),《自然(Nature)》348:552-553)。人类抗体也可通过体外活化B细胞来产生(参见例如美国专利No.5,567,610和5,229,275，其以全文引用的方式并入)。
“嵌合抗体”是如下抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、代替或交换以使得抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的类别、效应功能和/或种类的恒定区，或者向嵌合抗体赋予新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、代替或交换。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C端片段，例如，人类γ重链或其在其他类型的抗体重链中的对应序列(例如，对于人类抗体为α、δ、ε和μ)的约氨基酸(aa)230至约aa 450，或其天然存在的异型。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域中充分理解的术语，并且是指其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后造成所述靶细胞裂解的细胞介导的反应。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指实质上或基本上不含如在其天然状态中所发现通常伴随组分的物质。纯度和均质性通常是使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定的。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“重组”当关于例如细胞、核酸、蛋白质或载体使用时指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而修饰，或者所述细胞是源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞在完全表达或不表达下，表达在细胞的天然(非重组)形式内不存在的基因，或表达以其他方式异常表达的天然基因。
术语“修饰”当提及氨基酸(例如，“氨基酸修饰”)的序列时是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“修饰”或“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指蛋白质序列中的给定位置处的氨基酸被另一种氨基酸代替。例如，取代P14S是指母体多肽的变体，其中位置14处的脯氨酸被丝氨酸代替。多肽的“变体”是指具有与参考多肽、通常是天然或“亲本”多肽基本上相同的氨基酸序列的多肽。所述多肽变体可在天然氨基酸序列内的某些位置处具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
如本文所用，术语“结合”多肽或表位的抗体指示在特异性和/或亲和力下结合所述决定子的抗体。
术语“同一性”或“相同的”当在两种或更多种多肽的序列之间的关系中使用时是指如通过两种或更多种氨基酸残基串之间的匹配数所确定的多肽之间的序列相关程度。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的两种或更多种序列中的较小者与间隙比对(如果存在的话)之间的相同匹配百分比。相关多肽的同一性可以通过已知方法容易地计算。这类方法包括(但不限于)以下文献中所述的那些：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,NewYork,1988；《生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)》,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；《序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)》,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994；《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis inMolecular Biology)》,von Heinje,G.,Academic Press,1987；《序列分析入门(SequenceAnalysis Primer)》,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等,《工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》48,1073(1988)。
用于确定同一性的优选方法被设计成提供所测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法描述于公开可用的计算机程序中。用于确定两种序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序套装，包括GAP(Devereux等,《核酸研究(Nucl.Acid.Res.)》12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215,403-410(1990))。BLASTX程序可公开获自美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)和其他来源(BLAST手册,Altschul等,NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894；Altschul等,同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
抗体和表位
本发明在某种程度上是基于如下发现：可以并入抗体CDR的修饰人类受体框架序列以使得所得抗KIR3DL2可变区保持结合人类KIR3DL2的D0结构域的能力。
这些人源化可变区和含有其的抗体可以结合包含残基I60和/或G62的KIR3DL2(SEQ ID NO:1)的区段。任选地，所述抗体结合包含残基I60和/或G62中的一个或多个而非残基R13、A25和/或Q27的表位。任选地，所述抗体结合包含残基I60和/或G62中的一个或多个以及残基P14、S15和/或H23中的一个或多个的表位。
除非另外说明，否则在本公开中通篇使用关于免疫球蛋白的Abnum氨基酸编号命名法(参见Abhinandan和Martin,(2008),《分子免疫学(Molecular Immunology)》45:3832-3839，其公开内容以引用的方式并入)。使用Abnum系统的序列编号也可以在http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum自动生成。然而，应理解，本领域技术人员可以使用可选的编号系统并鉴定对应于Abmum编号的位置。对于相应的重链和轻链中的残基38和39，Abnum位置对应于Kabat编号系统中的相同位置(Kabat等,(1991),《具免疫学重要性的蛋白序列(Sequences of Protein of Immunological Interest)》,第5版,United States PublicHealth Service,National Institute of Health,Bethesda,MD)。
当所述抗体在VL结构域序列中包含残基38处的谷氨酰胺时，优选的人类VH受体框架在VH结构域序列中包含残基39处的谷氨酰胺。
在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VH1以及JH6的重链框架，任选地所述抗体包含IGHV1-46*03以及IGHJ6*01。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VK1的轻链框架，任选地IGKV1-NL1*01。
在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VH1和/VH7以及JH6的重链框架，任选地所述抗体包含IGHV7-4-1*02和IGHV1-c*01以及IGHJ6*01。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VK1和VK4的轻链框架，任选地IGKV4-1*01和IGKV1-39*01，以及JH4，任选地IGKJ4*01。
所述人源化抗体还可在人类框架序列中包含一个或多个回复突变，以例如增强所述人源化抗体的亲和力、稳定性或其他特性。
在另一个方面，提供作为2B12或10G5的人源化形式的特定人源化抗体。这类抗体的特征通常在于包含来自人类框架序列中的2B12或10G5CDR的关键氨基酸残基。
抗体10G5
抗体10G5的人源化VH和VL氨基酸序列的实例分别以SEQ ID NO:13-17和8-12示出。在一个方面，提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化抗体，其中所述抗体包含：包含以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列SYTMH或其至少3或4个氨基酸的序列的HCDR1区；包含以SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列YINPSSGYTENNRKF或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列的HCDR2区；包含以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列LGKGLLPPFDY或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列的HCDR3区；包含以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列RASENIYSNLA或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列的LCDR1区；包含以SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列AATNLAD或其至少3、4或5个连续氨基酸的序列的LCDR2区；包含以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列QHFWGTPYT或其至少、5、6、7或8个连续氨基酸的序列的LCDR3区。
在一个方面，本发明提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化10G5抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L2；
(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L3；和
(g)人类框架序列。
在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VH1以及JH6的重链框架，任选地所述抗体包含IGHV1-46*03以及IGHJ6*01。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VK1的轻链框架，任选地IGKV1-NL1*01。
任选地，所述人类框架包含一个或多个突变，例如回复突变。实施例1示出10G5可变区的框架和回复突变的鉴定。相比于嵌合10G5，所测试的这些突变体在测定法中使用的两种mAb浓度下显示类似的结合概况。本发明的实施方案因此包括在使用Abnum编号的以下残基中的任何一个或多个(或其任何组合)具有回复突变的已回复突变的10G5重链变体：
10G5VH：5、11、12、13、20、38、40、48、66、67、69、71、72a、75。
本发明的其他实施方案因此包括在以下残基中的任何一个或多个(或其任何组合)具有回复突变的已回复突变的10G5轻链变体：
10G5VL：17、18、40、45、48、70、76、100。
所述人源化抗体还可在人类框架序列中包含一种或多种另外的突变(例如回复突变)，以例如增强所述人源化抗体的亲和力、稳定性或其他特性。
在一个方面，提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化10G5抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L2；
(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L3；和
(g)人类框架序列，其中谷氨酰胺(Q)残基存在于VH结构域的位置39处和VL结构域的位置38处。任选地，所述人类框架序列还包含一个或多个回复突变。
位置39处的谷氨酰胺(Q)残基可天然存在于人类VH框架序列中，或者可通过序列的氨基酸取代或其他修饰来引入。
在另一个方面，本发明提供人源化抗体，其包含与SEQ ID NO:13-17的10G5的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或更大同一性)的VH结构域。在另一个特定方面，本发明提供结合KIR3DL2的人源化抗体，其包含(a)包含并入人类VH结构域中的非人类CDR残基的VH结构域，其中所述VH结构域与SEQ ID NO:13-17的人源化10G5VH具有至少约80％(例如至少90％、95％、97％、98％)同一性，和(b)(a)包含并入人类VL结构域中的非人类CDR残基的VL结构域，其中所述VL结构域与SEQ ID NO:8-12的人源化10G5VL具有至少约80％(例如至少90％、95％、97％、98％)同一性。
抗体2B12
抗体2B12的人源化VH和VL氨基酸序列的实例分别以SEQ ID NO:24-28和29-33示出。在一个方面，提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化抗体，其中所述抗体包含：包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列TAGMQ或其至少3或4个连续氨基酸的序列的HCDR1区；包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列WINSHSGVPKYAEDFK或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列的HCDR2区；包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列GGDEGVMDY或其至少、5、6、7或8个连续氨基酸的序列的HCDR3区；包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列KASQDVSTAVA或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列的LCDR1区；包含如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列WTSTRHT或其至少3、4或5个连续氨基酸的序列的LCDR2区；和/或包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列QQHYSTPWT或其至少4、5、6、7或8个连续氨基酸的序列的LCDR3区。
在本文任何实施方案中，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个的特征可在于：其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或具有与相应SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR组共有至少70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化2B12抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L2；
(f)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L3；和
(g)人类框架序列。
在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VH1和/或VH7以及JH6的重链框架，任选地所述抗体包含IGHV7-4-1*02和/或IGHV1-c*01，以及IGHJ6*01。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含来自人类亚群VK1和/或VK4的轻链框架，任选地IGKV4-1*01和/或IGKV1-39*01，以及来自JH4的轻链框架，任选地IGKJ4*01。
任选地，人类框架包含一种或多种突变，例如回复突变。实施例1示出2B12可变区中的框架和回复突变的鉴定。相比于嵌合2B12，所测试的这些突变体在测定法中使用的两种mAb浓度下显示类似的结合概况。本发明的实施方案因此包括在使用Abnum编号的以下残基中的任何一个或多个(或其任何组合)具有回复突变的已回复突变的2B12重链变体：
2B12VH：2、38、39、40、43、48、68、72c、91、108。
本发明的其他实施方案因此包括在以下残基中的任何一个或多个(或其任何组合)具有回复突变的已回复突变的2B12轻链变体：
2B12VL：3、8、9、21、43、71、78、104。
所述人源化抗体还可在人类框架序列中包含一种或多种另外的突变(例如回复突变)，以例如增强所述人源化抗体的亲和力、稳定性或其他特性。
在一个方面，提供结合人类KIR3DL2多肽的分离的人源化2B12抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L2；
(f)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L3；和
(g)人类框架序列，其中谷氨酰胺(Q)残基存在于VH结构域的位置39处和VL结构域的位置38处。任选地，所述人类框架序列还包含一个或多个回复突变。
在另一个方面，本发明提供人源化抗体，其包含与SEQ ID NO:29-33的2B12或人源化2B12的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或更大同一性)的VH结构域。在另一个特定方面，本发明提供结合KIR3DL2的人源化抗体，其包含(a)包含并入人类VH结构域中的非人类CDR残基的VH结构域，其中所述VH结构域与SEQID NO:29-33的人源化2B12VH具有至少约80％(例如至少90％、95％、97％、98％)同一性，和(b)(a)包含并入人类VL结构域中的非人类CDR残基的VL结构域，其中所述VL结构域与SEQID NO:24-28的人源化2B12VL具有至少约80％(例如至少90％、95％、97％、98％)同一性。
所述位置39处的谷氨酰胺(Q)残基可天然存在于人类VH框架序列中，或者可通过序列的氨基酸取代或其他修饰引入。
所述10G5或2B12抗体还可包含人类IgG恒定域(例如IgG1、IgG4)。任选地，所述恒定域是包含修饰以增加Fc受体结合的IgG1结构域。任选地，所述恒定域是包含修饰以降低Fc受体结合的IgG结构域(例如IgG1、IgG4)。
对于人源化抗体的重组产生，可以根据标准重组方法将人源化VH和VL区或其变体形式克隆到编码来自人类抗体的全长或截短的恒定区的表达载体中(参见例如Sambrook等,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)。结果是表达并分泌相关人源化抗体分子的转染细胞系，其包含所选的VH和VL区和恒定区。编码人类抗体的恒定区的cDNA序列是已知的。
如果需要的话，人源化抗体的类别也可通过已知方法“切换”。类别切换技术可用于将一种IgG子类转换成另一种，例如，从IgG1转换成IgG2。因此，本发明抗体的效应功能可出于各种治疗用途通过同种型切换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体而改变。
涵盖各种形式的人源化抗体(例如10G5和2B12)。例如，所述人源化抗体可为抗体片段，例如Fab或其他类型的本文所述的片段。可选地，所述人源化抗体可为全长或完整的抗体，例如全长或完整的IgG1或IgG4抗体。所述恒定区还可根据已知方法修饰。例如，在IgG4恒定区中，残基S241可突变成脯氨酸(P)残基以允许在铰链处的完全二硫键形成(参见例如Angal等,《分子免疫学(Mol Immunol.)》1993；30:105-8)。
在一个实施方案中，当需要KIR3DL2阻断(例如KIR3DL2被其HLA配体结合的抑制)而不消耗(例如经由CDC或ADCC)表达KIR3DL2的细胞时，所述人源化抗体是全长IgG4抗体或其片段。在一个实施方案中，当需要消耗(例如经由CDC或ADCC)表达KIR3DL2的细胞时，所述人源化抗体是全长IgG1抗体或其包含结合于Fc受体的Fc区的片段(例如CD16)。所述抗体还可包含含有修饰例如以增加Fc受体结合的人类IgG1恒定域。
鉴于抗KIR3DL2抗体(特别是非内化抗体)诱导ADCC和CDC的能力，所述抗体还可以被制成具有增加其结合Fc受体的能力的修饰，其可以影响效应功能如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬作用，以及免疫调节信号如淋巴细胞增殖和抗体分泌的调节。典型的修饰包括包含至少一种氨基酸修饰(例如取代、缺失、插入)和/或改变类型的糖基化(例如，低岩藻糖化)的修饰人类IgG1恒定区。这些修饰可以影响与如下Fc受体的相互作用：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD 16)是激活性(即，免疫系统增强性)受体，而FcγRIIB(CD32B)是抑制性(即，免疫系统衰减性)受体。修饰可例如增加Fc结构域与效应(例如NK)细胞上的FcγRIIIa的结合。修饰的实例提供于2013年9月17日提交的PCT/EP2013/069302中，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗体在Fc区的CH3结构域中包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)。在其他实施方案中，包含变体Fc区的抗体在Fc区的CH2结构域中包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)，其被定义为从氨基酸231延伸到氨基酸341。在一些实施方案中，抗体包含至少两个氨基酸修饰(例如，具有2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)，其中至少一个这种修饰是在CH3区中并且至少一个这种修饰是在CH2区中。也涵盖在铰链区中的氨基酸修饰。在一个实施方案中，涵盖Fc区的CH1结构域中的氨基酸修饰，其被定义为从氨基酸216延伸到氨基酸230。可进行Fc修饰的任何组合，例如以下文献中公开的不同修饰的任何组合：美国专利No.US,7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,416,727；7,371,826；7,355,008；7,335,742；7,332,581；7,183,387；7,122,637；6,821,505和6,737,056；PCT公开No.WO2011/109400；WO 2008/105886；WO 2008/002933；WO 2007/021841；WO 2007/106707；WO 06/088494；WO 05/115452；WO 05/110474；WO 04/1032269；WO 00/42072；WO06/088494；WO 07/024249；WO 05/047327；WO 04/099249和WO 04/063351；以及Lazar等,(2006),《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》103(11):405-410；Presta,L.G.等,(2002),《生物化学会译刊(Biochem.Soc.Trans.)》30(4):487-490；Shields,R.L.等,(2002),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》26；277(30):26733-26740；和Shields,R.L.等,(2001),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(9):6591-6604。
抗KIR3DL2抗体可包含变体Fc区，其中所述变体Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)，以使得所述分子相对于包含野生型Fc区的分子具有增强的效应功能，任选地其中所述变体Fc区包含在位置221、239、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、332、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439中的任何一个或多个处的取代。在一个实施方案中，抗KIR3DL2抗体可包含变体Fc区，其中所述变体Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)，以使得所述分子相对于包含野生型Fc区的分子具有增强的效应功能，任选地其中所述变体Fc区包含在位置239、298、330、332、333和/或334中的任何一个或多个处的取代(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)。
在一个实施方案中，具有变体或野生型Fc区的抗体可具有增加抗体的Fc受体结合能力的改变的糖基化模式。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述并且可以用作其中表达重组抗体以从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。参见例如Shields,R.L.等,(2002),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》277:26733-26740；Umana等,(1999),《自然生物技术(Nat.Biotech.)》17:176-1；以及欧洲专利No:EP 1,176,195；PCT公开WO 06/133148；WO 03/035835；WO 99/54342，其各自以全文引用的方式并入本文中。在一个方面，所述抗体是在其恒定区中被低岩藻糖化。这些抗体可包含氨基酸改变或者可能不包含氨基酸改变，但在特定条件下产生或处理以得到这种低岩藻糖化。在一个方面，抗体组合物包含本文描述的嵌合、人类或人源化抗体，其中所述组合物中的至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或基本上所有的抗体物质具有包含缺乏岩藻糖的核心碳水化合物结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的恒定区。在一个实施方案中，提供不含包含具有岩藻糖的核心碳水化合物结构的抗体的抗体组合物。所述核心碳水化合物优选将是在Asn297的糖链。
产生抗KIR3DL2抗体
所述抗体可通过本领域中已知的多种技术来产生。通常，它们是通过用包含KIR3DL2多肽、优选地人类KIR3DL2多肽的免疫原对非人类动物、优选地小鼠进行免疫化而产生的。还可通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体。
本发明还提供编码本文描述的抗KIR3DL2抗体的分离核酸，以及包含这种核酸的载体和宿主细胞。在一个方面，提供编码根据本发明的药剂的核酸片段。在一个方面，编码根据本发明的药剂的核酸片段，其选自DNA和RNA片段。此外提供使用重组技术产生这种抗KIR3DL2抗体的方法，例如，培养包含这种核酸或载体的合适的宿主细胞以使得所述核酸被表达并产生人源化抗体。在培养之前，宿主细胞可例如与包含编码重链可变域的核酸的载体和与包含编码轻链可变域的核酸的载体共转染。此外，可使用已知技术从宿主细胞培养物回收和/或纯化抗体。下文进一步描述有用的载体、宿主细胞和技术。
一般来说，对于抗体的重组产生，将编码抗体的核酸分离并插入可复制载体中以用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达，其通常可操作地连接至一种或多种表达控制元件。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离并测序。许多载体是已知和可用的。所述载体组分通常包括(但不限于)以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
一种或多种结合于KIR3DL2、特别是与单克隆抗体10G5或2B12实质上或基本上相同的表位的抗体的鉴定可以使用其中可以评估抗体竞争的多种免疫学筛选测定法中的任一种容易地确定。许多这种测定法是通常实施并且本领域中众所周知的(参见例如美国专利No.5,660,827)。应理解，本文所述抗体所结合表位的实际确定并非是鉴定结合于与本文所述的单克隆抗体相同或基本上相同的表位的抗体所需的任何方式。多种测定法中的任一种可用于评估抗体与人类KIR3DL2的结合。尤其基于ELISA、放射免疫测定法、Western印迹法、BIACORE和其他竞争测定法的方案都适合使用并且是本领域中众所周知的。
例如，当待研究的测试抗体获自不同来源动物或甚至具有不同的Ig同种型时，可使用简单的竞争测定法，其中将对照(抗体如10G5或2B12)和测试抗体混合(或预吸附)并施加到含有KIR3DL2多肽的样品。基于western印迹法和使用BIACORE分析的方案适合用于这种竞争研究中。
在某些实施方案中，将对照抗体(10G5或2B12)与不同量的测试抗体(例如，约1:10或约1:100)预混合一段时间，然后施加到KIR3DL2抗原样品。在其他实施方案中，在暴露于KIR3DL2抗原样品期间可以将对照和不同量的测试抗体简单地混合。只要可以区分结合抗体与游离抗体(例如，通过使用分离或洗涤技术来消除未结合抗体)和区分10G5或2B12与测试抗体(例如，通过使用物种特异性或同种型特异性二级抗体或通过用可检测标记来特异性标记10G5或2B12)，可以确定测试抗体是否降低10G5或2B12与抗原的结合，这表明测试抗体基本上识别与10G5或2B12相同的表位。在不存在完全不相关抗体情况下的(被标记的)对照抗体的结合可以充当对照高值。可以通过将被标记的(10G5或2B12)抗体与完全相同类型的未被标记的抗体(10G5或2B12)一起温育来获得对照低值，其中将发生竞争并降低被标记抗体的结合。在测试测定法中，在测试抗体存在下的被标记抗体反应性的显著降低指示识别基本上相同表位的测试抗体，并且与被标记的(10G5或2B12)抗体“交叉反应”或竞争。在10G5或2B12:测试抗体介于约1:10与约1:100之间的任何比率下，将10G5或2B12与KIR3DL2抗原的结合降低至少约50％、例如至少约60％、或更优选地至少约80％或90％(例如，约65-100％)的任何测试抗体被视为与10G5或2B12基本上相同的表位或决定子结合的抗体。优选地，这种测试抗体将10F6与KIR3DL2抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。
还可以通过例如流式细胞术测试来评估竞争。在这种测试中，带有给定KIR3DL2多肽的细胞可以首先与例如10G5或2B12一起温育，然后与用荧光色素或生物素标记的测试抗体一起温育。如果在与饱和量的10G5或2B12预温育后获得的结合是通过在不存在用10G5或2B12预温育的情况下的抗体获得的结合(如借助于荧光所测量)的约80％、优选地约50％、约40％或更小(例如，约30％、20％或10％)，则所述抗体被称为与10F6竞争。可选地，如果在用饱和量的测试抗体预温育的细胞上用被标记的10G5或2B12抗体(通过荧光色素或生物素)获得的结合是在不存在用测试抗体预温育的情况下获得的结合的约80％、优选地约50％、约40％或更小(例如，约30％、20％或10％)，则所述抗体被称为与10G5或2B12竞争。
还可使用简单竞争测定法，其中测试抗体被预吸附并以饱和浓度施加到固定KIR3DL2抗原的表面。简单竞争测定法中的表面优选是BIACORE芯片(或适合表面等离子体共振分析的其他介质)。然后使对照抗体(例如，10G5或2B12)在KIR3DL2饱和浓度下与表面接触并且测量KIR3DL2和对照抗体的表面结合。将对照抗体的这种结合和对照抗体与含KIR3DL2表面在不存在测试抗体情况下的结合进行比较。在测试测定法中，在测试抗体存在下对照抗体对含KIR3DL2表面的结合的显著降低指示所述测试抗体基本上识别与所述对照抗体相同的表位，以使得所述测试抗体与所述对照抗体“交叉反应”。将对照(例如10G5或2B12)抗体与KIR3DL2抗原的结合降低至少约30％或更多、优选地约40％的任何测试抗体可视为结合于与对照(例如，10G5或2B12)基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，这种测试抗体将使对照抗体(例如，10G5或2B12)与KIR3DL2抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％或更大)。应理解，对照和测试抗体的次序可颠倒：也就是说，对照抗体可首先结合于表面并且其后在竞争测定法中使测试抗体与表面接触。优选地，首先使对于KIR3DL2抗原具有较高亲和力的抗体结合于表面，如所预期，关于第二抗体(假定所述抗体是交叉反应的)所见的结合降低将具有更大量值。这种测定法的其他实例提供于例如Saunal(1995),《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》183:33-41，其公开内容以引用的方式并入本文中。
优选地，识别KIR3DL2表位的单克隆抗体将与相当大百分比或甚至所有相关细胞、例如恶性CD4+T细胞、来自SS或MF患者的细胞上存在的表位反应，但不会与其他细胞(即，不表达KIR3DL2的细胞)显著反应。在一个方面，抗KIR3DL2抗体结合KIR3DL2但不结合KIR3DL1和/或KIR3DS1。
在一些实施方案中，所述抗体将结合于来自一个或多个具有以KIR3DL2阳性细胞表达为特征的疾病的个体、即作为使用抗KIR3DL2抗体用一种本文所述方法治疗的候选者的个体的表达KIR3DL2的细胞。因此，一旦获得特异性识别细胞上的KIR3DL2的抗体，则可以测试其结合于从具有诸如SS或MF的病症的患者获得的KIR3DL2阳性细胞(例如恶性CD4+T细胞)的能力。特别是，在用一种本发明抗体治疗患者之前，测试抗体结合从患者(例如在血液样本中)获得的恶性细胞的能力以最大化所述疗法将在患者中有利的可能性将是有利的。
在一个实施方案中，在免疫测定法中验证抗体以测试其结合于表达KIR3DL2的细胞、例如恶性CD4+T细胞、促炎性CD4+细胞的能力。例如，从多名患者取得外周血淋巴细胞(PBL)，并且例如通过流式细胞术使用相关抗体从PBL富集CD4+T细胞(对于恶性CD4+细胞，参见例如Bagot等,(2001),《血液(Blood)》97:1388-1391，其公开内容以引用的方式并入本文中)，或者通过在MACS柱(Miltenyi Biotec)上进行磁性分离来分离出CD4+CD28-细胞部分。然后使用本领域技术人员众所周知的标准方法来评估给定抗体结合细胞的能力。发现结合于来自显著百分比的个体或患者(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多)的相当大比例(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的已知表达KIR3DL2的细胞、例如T细胞的抗体适用于本文，都出于诊断目的以测定患者中恶性T细胞的存在或水平或者用于本文描述的治疗方法中，例如，用于增加或降低恶性T细胞数目或活性。为了评估抗体与细胞的结合，所述抗体可以直接或间接地被标记。当间接地被标记时，通常添加二级被标记抗体。然后可以使用例如细胞荧光分析(例如FACScan)来检测抗体与细胞的结合。这些方法是本领域技术人员众所周知的。
可以本领域技术人员已知的方式来确定抗体是否在表位区域内结合。作为这种定位/表征方法的一个实例，可使用KIR3DL2蛋白中的暴露胺/羧基的化学修饰通过表位“足迹”来确定抗KIR3DL2抗体的表位区域。参见例如Ehring H,《分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)》,第267(2)卷,第252-259页(1999)；Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001),《分析化学(Anal.Chem.)》73,256A-265A。合适的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位定位(NMR)。参见例如Ernst Schering Res Found Workshop.2004；(44):149-67；Huang等,《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》,第281(1)卷,第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,方法(Methods.)1996年6月；9(3):516-24。还可以使用质谱法来进行表位定位/表征。参见例如Downard,《质谱学杂志(J Mass Spectrom.)》2000年4月；35(4):493-503；以及Kiselar和Downard,《分析化学(Anal Chem.)》1999年5月1日；71(9):1792-801。定点诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白质区段内的每个残基被丙氨酸残基代替，并且测量结合亲和力的后果。参见例如Clackson和Wells,《科学(Science)》1995；267:383-386；和Wells,《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》1996；93:1-6。用于表位评估的其他形式的“无标记”测定法包括表面等离子体共振(SPR、BIACORE)和反射干涉光谱法(RifS)。参见例如等,《分子识别杂志(Journal Of Molecular Recognition)》1990；3:208-14；Nice等,《色谱学杂志(J.Chromatogr.)》1993；646:159-168；Leipert等,《德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)》1998；37:3308-3311；等,《生物传感器和生物电子学(Biosensors andBioelectronics)》2002；17:937-944。
此外应注意到，在示例性竞争测定法或2013年9月17日提交的PCT申请号PCT/EP2013/069302中描述的与KIR3DL2突变多肽结合的测定法中的一种或多种中，可以鉴定结合与本文所述的抗体相同或基本上相同的表位的抗体。测量抗KIR3DL2抗体与用KIR3DL2突变体转染的细胞的结合并与抗KIR3DL2抗体结合野生型KIR3DL2多肽(SEQ ID NO:1)的能力进行比较。如本文所用的抗KIR3DL2抗体与突变KIR3DL2多肽之间的结合降低是指存在结合亲和力的降低(例如，如通过已知方法如表达特定突变体的细胞的FACS测试或通过与突变多肽结合的Biacore测试所测量)和/或抗KIR3DL2抗体的总结合能力的降低(例如，如通过抗KIR3DL2抗体浓度相对于多肽浓度的曲线图中的Bmax降低所证实)。结合显著降低指示突变残基直接牵涉于与抗KIR3DL2抗体的结合中或者当抗KIR3DL2抗体结合于KIR3DL2时与结合蛋白紧密接近。抗体表位因此将优选包括这种残基并且可包括与这种残基相邻的其他残基。
通常，本文的抗KIR3DL2抗体对于KIR3DL2多肽的亲和力在约104至约1011M-1(例如，约108至约1010M-1)范围内。例如，如通过例如表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)所测定，抗体可关于KIR3DL2具有小于1×10-9M的平均解离常数(Kd)。在一个更具体的示例性方面，抗体对于KIR3DL2可具有约1×10-8M至约1×10- 10M、或约1×10-9M至约1×10-11M的Kd。
可例如通过不大于约(即更好亲和力)100、60、10、5或1纳摩尔浓度的平均Kd来表征抗体。可例如通过将重组产生的人类KIR3DL2蛋白固定在芯片表面上，接着施用有待在溶液中测试的抗体来测定Kd。
一旦获得抗原结合化合物，通常将对以下进行评估：内化(抗体优选将不会内化)到表达KIR3DL2的靶细胞中，和/或造成KIR3DL2内化到表达KIR3DL2的靶细胞中的能力，诱导ADCC或CDC，抑制表达KIR3DL2的靶细胞的促炎活性和/或增殖和/或造成表达KIR3DL2的靶细胞的消除。可以在所述方法的任何合适阶段评估抗原结合化合物内化或诱导ADCC、CDC或通常导致表达KIR3DL2的靶细胞的活性的消除或抑制的能力，例如如在本文提供的实施例中。这种评估可用在指定用于治疗用途的抗体(或其他化合物)的鉴定、产生和/或开发中涉及的多个步骤中的一个或多个。
如本文所用，非“内化”或不“内化”的抗KIR3DL2抗体是在结合于哺乳动物细胞上的KIR3DL2(即细胞表面KIR3DL2)后基本上不被细胞摄取(即进入细胞)者。非内化抗体当然将包括抗体片段、人类或人源化抗体和抗体结合物。
可以通过各种测定法，包括2013年9月17日提交的PCT申请号PCT/EP2013/069302(其公开内容以引用的方式并入本文)中描述的实验实施例中所述的那些，来确定抗KIR3DL2抗体在结合哺乳动物细胞上的KIR3DL2后是否内化，或KIR3DL2多肽是否经历胞内内化(例如在被抗体结合后)。
测试ADCC通常涉及评估细胞介导的细胞毒性，其中通过带有Fc受体的效应细胞(而不涉及补体)来识别具有结合的抗KIR3DL2抗体的表达KIR3DL2的靶细胞(例如Cou-L细胞、塞扎里综合征细胞或在其表面表达KIR3DL2的任何细胞)。不表达KIR3DL2抗原的细胞可以任选地用作对照。通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标记物(例如CD107动员)的增加来评估NK细胞毒性的活化。优选地，相比于对照抗体(例如不结合于KIR3DL2的抗体、具有鼠类恒定区的KIR3DL2抗体)，所述抗体将在靶细胞存在下诱导细胞因子产生、细胞毒性标记物表达或靶细胞裂解增加至少20％、50％、80％、100％、200％或500％。在另一个实施例中，检测靶细胞的裂解，例如在铬释放测定法中，优选地所述抗体将诱导至少10％、20％、30％、40％或50％的靶细胞裂解。当对抗原结合化合物测试其(a)诱导ADCC和(b)内化到表达KIR3DL2的细胞和/或诱导KIR3DL2内化的能力时，所述测定法可以任何次序进行。
在其他实施方案中，对所述抗体测试其干扰KIR3DL2的HLA配体(例如B27二聚体(B272)四聚体)与KIR3DL2多肽的结合的能力。参见例如PCT申请号PCT/EP2013/069302中所述的测定法。
药物制剂
在一个方面，提供用作药物的根据本发明的药剂。
在一个方面，提供用作治疗恶性肿瘤、炎性病症或自身免疫性疾病的药物的根据本发明的药剂。
在一个方面，提供用作用于消除或消耗人类患者中的表达KIR3DL2的细胞的药物的根据本发明的药剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含如本文所述的抗体以及一种或多种载体的药物组合物。
因此，本发明的一个目的是提供一种药物制剂，其包含以1mg/ml至500mg/ml的浓度存在的这种抗体，并且其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。所述制剂还可包含缓冲体系、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂，即，包含水的制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮液。在另一个实施方案中，所述药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。同样，术语“水溶液”被定义为包含50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”被定义为包含50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，所述药物制剂是冷冻干燥的制剂，在使用之前医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，所述药物制剂是不经过任何先前溶解的即用型干燥制剂(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。
在另一个方面，所述药物制剂包含这种抗体和缓冲剂的水溶液，其中所述抗体以1mg/ml或高于1mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有约6.0至约8.0的pH。
在一个实施方案中，所述制剂的pH是至少约6并且使用小于约8(并且更通常小于约7.7、7.6或7.5)(例如，在6-7.4范围内，例如6-7.4，例如6-7、6.2-7、6.4-7.4、6.5-7.5、6.7-7.7或约7、约7.4等)。
在另一个实施方案中，所述缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰基甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、三(羟基甲基)-氨基甲烷、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含药学上可接受的防腐剂。所述防腐剂可选自例如苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇，和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(3-对氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)或其混合物。所述防腐剂可例如以0.1mg/ml至20mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、5mg/ml至10mg/ml、或10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参考《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》,第19版,1995。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含等渗剂。所述等渗剂可例如选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维钠。在一个实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少一个--OH基团的C4-C8烃并且包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，所述糖醇添加剂是甘露糖醇。上文提及的糖或糖醇可单独或组合使用。对于使用量没有固定的限制，只要所述糖或糖醇可溶于液体制剂中并且不会不利地影响使用本发明方法达到的稳定化效果即可。所述糖或糖醇浓度可例如介于约1mg/ml与约150mg/ml之间。所述等渗剂可以例如1mg/ml至50mg/ml、1mg/ml至7mg/ml、8mg/ml至24mg/ml、或25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些特定等渗剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参考《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第19版,1995。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含螯合剂。所述螯合剂可以例如选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐，和其混合物。所述螯合剂可例如以0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、或2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些特定螯合剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。螯合剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参考《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》,第19版,1995。
所述制剂可能或可能不包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参考《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy)》,第19版,1995。更具体地，本发明的组合物可以是稳定化液体药物组合物，其治疗活性组分包括在以液体药物制剂形式储存期间可能显示聚集体形成的多肽。“聚集体形成”意指导致形成可保持可溶性的低聚体或从溶液中沉淀的大的可见聚集体的多肽分子之间的物理相互作用。“在储存期间”意指液体药物组合物或制剂一旦制备而不立即施用至受试者。相反，在制备后，它被包装成以液体形式、冷冻状态或稍后重配成液体形式的干燥形式或适合施用至受试者的其他形式储存。“干燥形式”意指通过冷冻干燥(即，冻干)、喷雾干燥或空气干燥将液体药物组合物或制剂干燥。在液体药物组合物储存期间由多肽形成聚集体可能不利地影响所述多肽的生物活性，从而导致药物组合物的治疗功效的损失。此外，当使用输注系统施用含多肽的药物组合物时，聚集体形成可造成其他问题，例如管道、膜或泵的堵塞。
本发明的药物组合物可能或可能不进一步包含足以降低组合物储存期间的多肽聚集体形成的量的氨基酸基质。“氨基酸基质”意指氨基酸或氨基酸组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。当使用氨基酸组合时，全部氨基酸可以其游离碱形式存在，全部可以其盐形式存在，或者一些可以其游离碱形式存在，而其它以其盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明组合物的氨基酸是带有带电荷侧链的那些，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体(即，L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合可存在于本发明的药物组合物中，只要所述特定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在即可。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可与这些氨基酸的类似物一起配制。
在本发明的另一个实施方案中，当充当治疗剂的多肽是包含至少一个易于进行氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，可添加甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基向甲硫氨酸亚砜的氧化。“抑制”意指甲硫氨酸氧化物质随时间的最少累积。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽以其适当的分子形式更大滞留。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。待添加的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量以使得甲硫氨酸亚砜的量可为管理机构所接受。通常，这是指所述组合物含有不大于约10％至约30％甲硫氨酸亚砜。通常，这可通过添加甲硫氨酸以使得添加至甲硫氨酸残基的甲硫氨酸的比率在约1:1至约1000:1、例如10:1至约100:1范围内来实现。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。在本发明的另一个实施方案中，所述稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的盐(例如氯化钠)。这些特定稳定剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。
所述药物组合物还可包含其他稳定剂，其进一步增强其中的治疗活性多肽的稳定性。本发明特定关注的稳定剂包括(但不限于)甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽免于甲硫氨酸氧化；和非离子型表面活性剂，其保护多肽免于与冷冻-解冻或机械剪切相关的聚集。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含表面活性剂。所述表面活性剂可例如选自洗涤剂，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙酰化单酸甘油酯，脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆如F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)，聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(tween，例如Tween-20、Tween-40、Tween-80和Brij-35)，单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物，二酸甘油酯或其聚氧乙烯衍生物，醇类，甘油，凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸以及乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰基和肉豆蔻酰基衍生物，和极性头基即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇的修饰，和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油磷脂(例如脑磷脂)，甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷)，鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)，十二烷基磷酸胆碱，鸡蛋溶血卵磷脂，梭链孢酸衍生物(例如牛磺-二氢夫西地酸钠等)，长链脂肪酸和其盐C6-C12(例如油酸和辛酸)，酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα酰化衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的Nα酰化衍生物，包含中性氨基酸和两种带电荷氨基酸的任何组合的三肽的Nα酰化衍生物，DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙(CAS登记号[128-49-4])，多库酯钾(CAS登记号[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)，辛酸钠，胆酸或其衍生物，胆汁酸和其盐和甘氨酸或牛磺酸结合物，熊脱氧胆酸，胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘氨胆酸钠，N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐，阴离子型(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂，两性离子型表面活性剂(例如N-烷基-N,N-二甲基铵基-1-丙磺酸盐、3-氯酰胺基-1-丙基二甲基铵基-1-丙磺酸盐)，阳离子型表面活性剂(季铵基质)(例如十六烷基-三甲基溴化铵、西吡氯铵)，非离子型表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃葡糖苷)，泊洛沙胺(例如Tetronic，其是由环氧丙烷和环氧乙烷依序加成到乙二胺上而获得的四官能嵌段共聚物)，或者所述表面活性剂可选自咪唑啉衍生物，或其混合物。这些特定表面活性剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。
在另一个实施方案中，所述制剂还包含蛋白酶抑制剂如EDTA(乙二胺四乙酸)和苄脒盐酸盐，但也可使用其他市售蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的使用特别可用于包含蛋白酶的酶原的药物组合物中以抑制自动催化。可能的是，其他成分可存在于本发明的肽药物制剂中。这些额外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒介物、蛋白质(例如，人类血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这些额外成分当然不应该不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。
含有根据本发明的抗体的药物组合物可在若干部位施用至需要这种治疗的患者，例如，在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在旁路吸收部位，例如在动脉中、在静脉中、在心脏中施用，和在涉及吸收的部位，例如在皮肤中、在皮肤下、在肌肉中或在腹部中施用。
根据本发明的药物组合物的施用可通过若干施用途径中的任一种，例如，皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、经舌、舌下、经颊、口腔中、经口、胃和肠中、经鼻、经肺(例如，通过细支气管和肺泡或其组合)、表皮、真皮、透皮、经阴道、经直肠、经眼，例如通过结膜、输尿管和肠胃外，施用至需要这种治疗的患者。
本发明的组合物可以若干剂型中的任一种施用，例如，以溶液、悬浮液、乳液、微乳液、多重乳液、泡沫剂、药膏、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、冲洗剂、胶囊(例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊)、栓剂、直肠胶囊、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏、注射溶液、原位转化溶液(例如原位凝胶化、原位固化、原位沉淀、原位结晶)、输注溶液和植入物形式。根据本文所述的任一个方面的制剂的稳定性可尤其基于高分子量杂质(例如，表明制剂中的抗体分子的聚集(多聚体)的杂质)的缺乏来表征。在一个方面，根据本发明的制剂可表征为具有小于约10％(例如约5％或更小)的高分子量(HMW)杂质含量，在约5℃下持续至少一天，例如至少约一周，例如至少约2周、至少约1个月、至少约2个月、或甚至至少约3个月的储存期。
在本发明的一个实施方案中，包含所述抗体的药物制剂稳定1年以上，任选地2年储存期，任选地3年储存期。在本发明的另一个实施方案中，包含所述抗体的药物制剂稳定持续4周以上的使用期和3年以上的储存期。在本发明的另一个实施方案中，包含所述抗体的药物制剂稳定持续4周以上的使用期和两年以上的储存期。在本发明的甚至另一个实施方案中，包含所述抗体的药物制剂稳定持续2周以上的使用期和两年以上的储存期。
在一个方面，本发明提供包含氯化钠作为张力调节剂的制剂。
在一个实施方案中，本发明提供其中在制剂中并入磷酸钠或柠檬酸钠(基质)缓冲剂的制剂。
在一个实施方案中，本发明提供其中在制剂中并入聚山梨醇酯80作为表面活性剂的制剂。
根据本发明的任一个方面的制剂可具有任何合适浓度的抗体。通常，所述浓度是约0.05mg/mL至约10mg/mL(例如，约1mg/mL至约5mg/mL)。在一个示例性方面，所述制剂以相对浓缩的抗体制剂形式提供，其可为例如具有约10mg/mL的浓度的有待在施用(通常通过静脉内施用或直接肠胃外注射)前稀释的制剂。在另一个示例性方面，所述制剂以相对稀释制剂形式提供，例如准备输注/注射的制剂，其中所述制剂中的抗体浓度是约0.05mg/mL或约0.1mg/mL。
在一个方面，所述制剂具有约1mg/mL的抗体浓度。
在一个示例性方面，本发明提供从成分混合物制备的药学上可接受的活性制剂，其包含：(a)一定量的本公开的IgG抗体分子以使得所述制剂中的抗体浓度是约0.5mg/mL至约10mg/mL；(b)磷酸钠(例如，磷酸氢二钠/磷酸二氢钾)、柠檬酸钠(例如柠檬酸钠/柠檬酸)或硼酸钠(硼酸钠/硼酸)；(c)氯化钠；和(e)聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.7至7.7、或约7.4的pH。
其他方面和优点将在以下实验部分中公开，所述实验部分应该被视为说明性的，而不限制本申请的范围。
实施例
实施例1-通过CDR移植产生人源化抗KIR3DL2抗体
在2013年9月17日提交的PCT申请号PCT/EP2013/069302中获得抗KIR3DL2抗体作为人源化候选物。
首先通过重链和轻链的互补决定区(CDR)移植，接着引入回复突变来进行人源化。用于建模和设计的小鼠亲本基因和人类基因列于下表1中。使用CHO细胞产生抗体。
表1：亲本和人源化抗体的种系基因
*IMGT名称和命名
#这个序列是指档案AJ851868中的VHVGAM3.8.a6.115生殖系基因。
其连接至IMGT数据库中的小家鼠IGHV12-1-1，但两个序列不是严格相同的。
抗体10G5
下面比对10G5轻链的人源化蛋白序列。10G5-LC以SEQ ID NO:34示出。IGKV1-NL1以SEQ ID NO:35示出。Hum2C4以SEQ ID NO:36示出。3RKD以SEQ ID NO:37示出。在10G5-LC中对CDR加下划线并且在-L1至-L5变体中对回复突变加下划线。
人源化抗体2C4(抗ErbB2；pdb 1S78和1L7I)和小鼠抗体8C11(抗戊型肝炎病毒衣壳蛋白；pdb 3RKD)被用作结构前瞻性评估的模板。亲本JK区段保持未被修饰以及亲本框架2(FW2)的游标区(Vernier zone)残基(包括相邻的侧接残基)。因此，使用L2轻链作为额外回复突变的基础起始模板。
最后选择四个轻链L2、L3、L4和L5用于抗体产生。
下面比对10G5重链的人源化蛋白序列。10G5-HC以SEQ ID NO:38示出。IGHV1-46以SEQ ID NO:39示出。1i9r以SEQ ID NO:40示出。1it9以SEQ ID NO:41示出。1E60以SEQ IDNO:42示出。在10G5-HC序列中对CDR加下划线并且在-H1至-H6变体中对回复突变加下划线。
人源化抗Fas抗体HFE7A(pdb 1IT9)、人源化抗CD40-L抗体5C8(pdb1I9R)和小鼠抗HIV-1衣壳蛋白p24抗体13B5(pdb 1E6O)被用作结构前瞻性评估的模板。基于3D结构研究，五个FW3游标区残基中的三个保持未被修饰。FW2的游标区残基也未被修饰。因此，H3重链被用作额外回复突变的基础起始模板。选择四个重链H3、H4、H5和H6用于抗体产生。
抗体2B12
通过嵌合性方法将两种人类VK基因用于CDR移植。FW1来自IGKV1-39，并且FW2和FW3来自IGKV4-1。
下面比对人源化轻链蛋白序列。2B12-LC以SEQ ID NO:43示出。IGKV1-39以SEQ IDNO:44示出。IGKV4-1以SEQ ID NO:45示出。1NCA以SEQ ID NO:46示出。1ZA6以SEQ ID NO:47示出。1PG7以SEQ ID NO:48示出。1b2w以SEQ ID NO:49示出。1fvd以SEQ ID NO:50示出。2fgw以SEQ ID NO:51示出。在2B12-LC序列中对DR加下划线并且在–L0至–L4变体中对回复突变加下划线。
人源化抗TAG-72抗体CC49(pdb 1ZA6)、人源化抗组织因子抗体D3H44(pdb 1PG7)、人源化抗p185HER2抗体4D5(pdb 1FVD)、人源化抗γ干扰素抗体(pdb 1B2W)、人源化抗CD18抗体(pdb 2FGW)和来自流感病毒亚型N9抗体NC41(pdb 1NCA)的小鼠抗神经氨酸酶被用作结构前瞻性评估的模板。FW3的游标区残基保持未被修饰。因此，L1轻链被用作额外回复突变的基础起始模板。最后选择四个轻链L1、L2、L3和L4用于抗体产生。
通过嵌合性方法将两种人类VH基因用于CDR移植。FW1和FW3来自IGHV7-4-1*02并且FW2来自IGHV1-c*01。
下面比对人源化重链蛋白序列。2B12-HC以SEQ ID NO:52示出。IGHV7以SEQ IDNO:53示出。IGHV1-c以SEQ ID NO:54示出。1BJ1-H以SEQ ID NO:55示出。9046-H以SEQ IDNO:56示出。在2B12-HC序列中对CDR加下划线并且在–H1至–H4变体中对回复突变加下划线。
人源化抗VEGF中和抗体(pdb 1BJ1)和泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)抗体(9046-H)分别被用作结构前瞻性评估和主要序列比较的模板。基于1BJ1 3D结构研究，FW2VH/VL界面残基Lys39保持未被修饰以及FW3Phe正好位于最后的Cys上游。因此，H1重链被用作额外回复突变以及H3和H4变体产生的基础起始模板。可选地，还包括保持IGHV7-4-1的三个FW的变体(H2)。
最后选择四个2B12重链H1、H2、H3和H4用于抗体产生。
下文示出所产生的2B12和10G5轻链和重链可变区的氨基酸序列(L表示轻链，H表示重链)。
10G5-L0:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLLYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
10G5-L2:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:9)
10G5-L3:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:10)
10G5-L4:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:11)
10G5-L5:
DIQMTQSPSSLSASVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)
10G5-H0:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGYTENNRKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)
10G5-H3:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTENNRKFKDKTTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:14)
10G5-H4:
QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTENNRKFKDKTTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:15)
10G5-H5:
QVQLVQSGAELARPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTENNRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:16)
10G5-H6:
QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTENNRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:17)
2B12-L0:
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:24)
2B12-L1:
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:25)
2B12-L2:
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:26)
2B12-L3:
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:27)
2B12-L4:
DIVMTQSHKFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:28)
2B12-H0:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINSHSGVPKYAEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:29)
2B12-H1:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWMGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:30)
2B12-H2:
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:31)
2B12-H3:
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:32)
2B12-H4:
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKTPGKGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:33)
构建抗体2B12和10G5中的每一种的16种人源化变体，其相比于亲本嵌合形式含有不同的回复突变(用鼠类来源的氨基酸代替人类框架残基)。下文在表2和表3中组合示出，在作为人类IgG1抗体的CHO细胞中成功地产生所有抗体变体。
表2：M-K323-10G5抗体变体的组合共转染
表3：M-K323-2B12抗体变体的组合共转染
2B12-L1 2B12-L2 2B12-L3 2B12-L4 2B12-L亲本
2B12-H1 2B12-H1L1 2B12-H1L2 2B12-H1L3 2B12-H1L4
2B12-H2 2B12-H2L1 2B12-H2L2 2B12-H2L3 2B12-H2L4
2B12-H3 2B12-H3L1 2B12-H3L2 2B12-H3L3 2B12-H3L4
2B12-H4 2B12-H4L1 2B12-H4L2 2B12-H4L3 2B12-H4L4
2B12-H亲本 2B12-H/L亲本
通过流式细胞术滴定使用KIR3DL2阳性细胞系来纯化和分析抗体变体。简言之，在台盼蓝中对RAJI-KIR3DL2细胞系进行计数。细胞被调节为每毫升1百万个。将100μl先前悬浮液转移在96W-U底部微板中(每孔100 000个细胞)。将细胞用100μl/孔染色缓冲液(SB)洗涤1次，并在400g下短暂离心2分钟。对于每种纯化抗体，进行1/3稀释，范围从100μg/ml到2.10-3μg/ml。将50μl的每种稀释液添加至每个孔。将细胞在4℃下温育1小时。将细胞在SB(100μl)中洗涤3次并在400g下短暂离心2分钟。将1/200稀释的山羊抗人类PE(Fc spe)添加至培养板并且将细胞在4℃下温育30分钟。将细胞洗涤2次并且立即在FACS CANTO血细胞计数器上进行分析。所述测定法中的所有上清液都是阳性的，这表明所有人源化变体保持结合于靶抗原。
对于2B12和10G5抗体，似乎所有变体都与亲本嵌合形式同样良好地结合于靶细胞并且彼此之间和与所述测定法中的嵌合抗体无法区分。
通过比较的方式，对于另一种人源化抗KIR3DL2抗体，观测到亲和力的总体损失。对于这种克隆的一些变体，例如H4L1、H4L2和H4L3，将鼠类残基重新引入人类框架序列(回复突变)中轻微改进了与细胞表面抗原的表观结合，但不会恢复完全结合活性。
实施例2–具有降低的聚集倾向的人源化抗KIR3DL2抗体的鉴定
以人类IgG1形式产生的2B12和10G5的人源化变体的聚集倾向关于其制剂的pH进行研究。对于每种mAb，聚集倾向测定法需要约1mg的纯化物质。
研究以下单克隆抗体(mAb)：2B12-H1L1；2B12-H1L2；2B12-H2L1；2B12-H2L2；10G5-H3L2；和10G5-H4L2。
评估这些mAb的聚集倾向随着其制剂pH的变化。选择pH范围为5.5至8的总共五种药学上可接受的缓冲溶液；因此，如表4-8中所示，在最终浓度为1mg/mL的五种制剂中制备每种mAb。
表4：pH＝5.5制剂
成分 作用 数量/浓度
mAb 活性 1mg/mL
柠檬酸钠/柠檬酸 缓冲剂 10mM
NaCl 等渗剂 9mg/mL
聚山梨醇酯80 表面活性剂 0.1mg/mL
注射用水 稀释剂 足量
表5：pH＝6.5制剂
成分 作用 数量/浓度
mAb 活性 1mg/mL
柠檬酸钠/柠檬酸 缓冲剂 10mM
NaCl 等渗剂 9mg/mL
聚山梨醇酯80 表面活性剂 0.1mg/mL
注射用水 稀释剂 足量
表6：pH＝7制剂
成分 作用 数量/浓度
mAb 活性 1mg/mL
磷酸氢二钠/磷酸二氢钾 缓冲剂 10mM
NaCl 等渗剂 9mg/mL
聚山梨醇酯80 表面活性剂 0.1mg/mL
注射用水 稀释剂 足量
表7：pH＝7.4制剂(PBS 1X+聚山梨醇酯80 0.1mg/mL)
成分 作用 数量/浓度
mAb 活性 1mg/mL
磷酸氢二钠/磷酸二氢钾 缓冲剂 10mM
NaCl 等渗剂 9mg/mL
聚山梨醇酯80 表面活性剂 0.1mg/mL
注射用水 稀释剂 足量
表8：pH＝8制剂
成分 作用 数量/浓度
mAb 活性 1mg/mL
硼酸钠/硼酸 缓冲剂 10mM
NaCl 等渗剂 9mg/mL
聚山梨醇酯80 表面活性剂 0.1mg/mL
注射用水 稀释剂 足量
每种纯化mAb的初始溶液以PBS 1X制剂形式供应，通过透析经由缓冲液交换获得其他制剂。
通过测量和比较聚集温度(T聚集)而以实验方式评估每种mAb制剂的聚集倾向。使用热转变稳定性测定方法(TSSA)测量T聚集。使用“热转变稳定性测定”试剂盒(获自Enzo Life Sciences Inc.,Farmingdale,NY)，TSSA测量肽和蛋白质在水溶液中的聚集温度。将待分析样品从0℃加热至100℃并且随着温度升高读取荧光。当将达到聚集温度时，将检测到样品荧光的大量增加。这种荧光测量使用480nm可激发分子转子探头。它与宽pH范围(4-10)相容并且耐受在正常浓度下存在的表面活性剂如聚山梨醇酯80。
结果
结果示于下表9中。对于每种mAb，通过SE-HPLC对PBS 1X+聚山梨醇酯80(0.1mg/mL，pH＝7.4制剂)测量初始纯度％。根据研究方案，指示为取消的操作是因为其值距平均值过远。停止2B12-H2L1在pH 5.5下的中断操作1，认为结果是异常的，因为T聚集值似乎非常高。结果实际上是正常的，但没有足够的mAb产物保持进行第三次有效操作。
表9：
所有抗体在与制剂一致的pH值下都显示稳定性，其避免在长期储存期间mAb的化学降解风险。抗体在等于血液pH的pH＝7.4下显示稳定性并且在长期储存期间mAb的化学降解风险较低。对于所有测试的变体，发现通过凝胶IEF测量的实验pI值在碱性pH范围内(高于pH 9)。因此，在所有测试的pH条件中，2B12和10G5抗体带有净正电荷。对于两种变体，远低于实验pI值的所选pH条件(pH 7.0或7.4)还将确保在水中的高溶解性。
在聚集倾向方面，在2B12的H1L1或H1L2与H2L1或H2L2变体之间存在令人惊讶地大的差距。H2L1或H2L2相比于H1L1或H1L2具有更高的聚集温度并且因此应该具有更好的物理稳定性。这可通过H2重链上位置39(Abnum编号)中的谷氨酰胺(Q)的存在来解释。实际上，通过用Discovery Studio软件对mAb建模，如图1A和图1B中所示在VH_Q39与VL_Q38之间建立两个H键。这两个H键可能稳定化mAb的四级结构，从而防止可能负责蛋白质聚集的某些疏水区域的暴露。
与2B12变体类似，对于也具有在VH_Q39与VL_Q38之间建立的两个H键的mAb 10G5的H3L2和H4L2变体，观测到高的聚集温度。它们也证实良好的物理稳定性。
实施例3–植入Raji-KIR3DL2高的CB17-SCID小鼠在IV模型中的2B12-H2L1剂量反应的功效
这项研究的目的是评估抗体2B12-H2L1是否可以剂量依赖性方式增加静脉内(IV)植入Raji-KIR3DL2人类B肿瘤细胞的CB17-SCID小鼠的寿命。
在已经检查了在表面上表达KIR3DL2并且结合2B12-H2L1抗体的细胞后，对48只SCID小鼠IV植入5M的Raji-KIR3DL2高细胞(传代n 5和97％的存活力)。在植入后第一天开始IP处理并且在0.01、0.1、1μg和10μg/小鼠的剂量下施用抗体一次。
进行6组(n＝8)：
●注射有10μg/小鼠的同种型对照(IC)的对照组
●注射有0.01μg/小鼠的2B12-H2L1的治疗组
●注射有0.1μg/小鼠的2B12-H2L1的治疗组
●注射有1μg/小鼠的2B12-H2L1的治疗组
●注射有10μg/小鼠的2B12-H2L1的治疗组
在IV植入Raji-KIR3DL2高细胞后，用同种型对照处理的小鼠组迅速死亡，中位生存期为20天(表10)。
表10
用所有剂量的2B12处理的群组的存活曲线和生存期中位数相比于对照组显示显著增加(图2)。然而，当小鼠用1μg和10μg的mAb处理时，寿命增加(ILS)百分比更高，而用0.01μg和0.1μg的mAb处理时，无显著增加(表10)。2B12即使在低浓度下也能够诱导ADCC。
结果示于图2中。植入Raji-KIR3DL2高5M IV并用2B12剂量反应IP处理的CB17-SCID小鼠的存活曲线(n＝8/组)。处理从第1天开始。实验结束于第58天。
这项研究表明，用2B12处理即使在低剂量下也显著延长IV模型中的CB17-SCID小鼠的生存期。
所有标题和小标题在本文中仅出于方便目的使用，而不应该被解释为以任何方式限制本发明。除非本文另外说明或者上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的叙述仅旨在充当对落在所述范围内的每个单独数值的单独提及的简写方法，并且每个单独的数值并入本说明书中，就如同它在本文中单独地叙述一样。除非另外说明，否则本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，在适当时，关于特定因素或测量结果提供的所有精确示例性值可以视为也提供由“约”修饰的相应近似测量结果)。
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本说明书中引用的所有出版物和专利申请以全文引用的方式并入本文中，就如同每个单独的出版物或专利申请特定地和单独地以引用的方式并入一样。
虽然前述发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式详细地描述，但本领域普通技术人员鉴于本发明的教导应显而易见的是可在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下对其作出某些变化和修改。

Claims (27)

1.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中所述抗体包含人类重链和轻链可变区框架序列，其中所述重链框架包含在残基39处的谷氨酰胺并且所述轻链框架包含在残基38(Abnum编号)处的谷氨酰胺。
2.如权利要求1所述的抗体，其中参考抗体包含人类IgG同种型的恒定区。
3.如权利要求1至2所述的抗体，其中所述抗体可检测地降低(或消除)所述KIR3DL2与KIR3DL2的HLA天然配体之间的结合。
4.如权利要求1至3所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)KIR3DL2多肽等位基因_*001，(b)KIR3DL2多肽等位基因_*002，和(c)KIR3DL2多肽等位基因_*007，在每种情况下其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
5.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变I60N和G62S的突变KIR3DL2多肽的结合降低。
6.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变R13W、A25T和Q27R的突变KIR3DL2多肽的结合降低。
7.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合，所述抗体对具有氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变KIR3DL2多肽的结合降低。
8.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体当结合于表达KIR3DL2的细胞时不被内化。
9.如权利要求1至8所述的抗体，其中所述抗体可检测地降低所述KIR3DL2与HLA-B27之间的结合。
10.如权利要求1至9所述的抗体，其中所述抗体不会实质上结合于KIR3DL1多肽。
11.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体与选自以下的抗体竞争结合KIR3DL2多肽：
(a)分别包含含有SEQ ID NO:31和25的氨基酸序列的VH和VL区的抗体(2B12)，和
(b)分别包含含有SEQ ID NO:14和9的氨基酸序列的VH和VL区的抗体(10G5)。
12.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含(i)包含分别含有SEQID NO:2(HCDR1)、SEQ ID NO:3(HCDR2)和SEQ ID NO:4(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)的重链，和(ii)包含分别含有SEQ ID NO:5、6或7的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的轻链。
13.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含(i)包含分别含有SEQID NO:18(HCDR1)、SEQ ID NO:19(HCDR2)和SEQ ID NO:20(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)的重链，和(ii)包含分别含有SEQ ID NO:21、22或23的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的轻链。
14.一种结合于KIR3DL2多肽的抗体，其包含：
(a)包含选自10G5-H0、-H1、-H2、-H3、-H4、-H5和-H6的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自10G5-L0、-L1、-L2、-L3、-L4和-L5的氨基酸序列的轻链可变区。
15.一种结合于KIR3DL2多肽的抗体，其包含：
(a)包含选自2B12-H0、-H1、-H2、-H3和-H4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自2B12-L0、-L1、-L2、-L3和-L4的氨基酸序列的轻链可变区。
16.一种结合于KIR3DL2多肽的抗体，其选自：
(a)包含分别含有SEQ ID NO:31和25的氨基酸序列的VH和VL区的抗体，和
(b)包含分别含有SEQ ID NO:31和26的氨基酸序列的VH和VL区的抗体。
17.一种结合于KIR3DL2多肽的抗体，其选自：
(a)包含分别含有SEQ ID NO:14和9的氨基酸序列的VH和VL区的抗体，和
(b)包含分别含有SEQ ID NO:15和9的氨基酸序列的VH和VL区的抗体。
18.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体对于人类KIR3DL2多肽具有小于10-8M的二价结合亲和力(KD)。
19.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含与人类γ1恒定区融合的重链可变区(VH)和与人类κ恒定区融合的轻链可变区(VL)的全长抗体。
20.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有增加与人类FcγIIIA(CD16)受体的结合的氨基酸取代的人类重链恒定区。
21.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中的任一项所述的抗体，和药学上可接受的载体。
22.如权利要求21所述的制剂，其包含：(a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的根据权利要求1至20中的任一项所述的抗体；(b)缓冲体系；和(c)等渗剂，在6.5至8的pH下。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述pH是约7.4。
24.一种用于治疗或预防有需要的患者中的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如权利要求1至20所述的抗体或如权利要求21至23所述的组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是外周T细胞淋巴瘤。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症选自蕈样真菌病和塞扎里综合征。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是炎性或自身免疫性病症。
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