KR20170002368A - 증가된 안정성을 가진 인간화 항체 - Google Patents

증가된 안정성을 가진 인간화 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 안정성을 가진 항체를 제공한다. KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합 가능한 항체가 제공된다. 항체는, 균상 식육종 및 세자리 증후군과 같은 악성 종양을 포함하는, KIR3DL2-발현 세포, 특히 CD4+ T 세포를 특징으로 하는 장애, 및 KIR3DL2-발현 자가면역 장애의 치료에 적합하다.

Description

증가된 안정성을 가진 인간화 항체{HUMANIZED ANTIBODIES WITH INCREASED STABILITY}
발명의 기술분야
본 발명은 개선된 안정성을 가진 항체를 제공한다. KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합 가능한 항체가 포함된다. 항체는, 균상 식육종 및 세자리 증후군(Sezary Syndrome)과 같은 악성 종양을 포함하는, KIR3DL2-발현 세포, 특히 CD4+ T 세포를 특징으로 하는 장애, 및 KIR3DL2-발현 자가면역 장애의 치료에 적합하다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제61/953,035호(출원일: 2014년 3월 14일)의 유익을 주장하며; 이 기초 출원의 개시내용은 임의의 도면을 비롯하여 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원되고 있다. 서열 목록은 49 KB 크기로 2015년 3월 11일에 작성된 "KIR-5 PCT_ST25"라는 제목의 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
살해세포 면역글로불린 유사 수용체(Killer immunoglobulin-like receptor: KIR)는, C-형 렉틴 수용체(CD94-NKG2)와 함께, MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하기 위하여 인간 NK 세포 및 T-림프구 서브세트에 의해 이용되는 수용체의 패밀리이다. 소정의 저해 및 활성화 KIR은 고도로 유사한 세포외 도메인을 갖고 단클론성 항체에 의해 인식되며, 예컨대, KIR2DL1과 KIR2DS1은 둘 다 GL183에 의해서 EB6 및 2DL2 및 2DS2에 의해 인식된다. 3가지 기준(세포외 Ig-유사 도메인(도메인 D0, D1, D2)의 개수, 세포질 테일 길이 및 서열 유사성)이 KIR 단백질을 13개 군, 즉, KIR3DL1 내지 2, KIR3DS1, KIR2DL1 내지 5 및 KIR2DS1 내지 5로 구분하는데 이용되어 왔다. 두 도메인에 대한 2D 또는 세 도메인에 대한 3D 명명법은 Ig-유사 도메인의 개수를 부여하며; 길거나 짧은 세포질 도메인을 가진 수용체는 더욱 L 또는 S로 분류된다(Pascal V. et al., 2007 J. Immunol. 179:1625-1633). 저해 수용체는, 그의 HLA 클래스 I 리간드의 KIR 결합 시 타이로신 인산화되는 기본형의 ITIM을 함유하는 긴(L) 세포질 테일(즉, KIR2DL 또는 KIR3DL)을 소유한다. 인산화된 ITIM은, 단백질 타이로신 포스파타제인 Src 상동성 2 도메인-함유 포스파타제 1 및/또는 Src 상동성 2 도메인-함유 포스파타제 2를 함유하는 Src 상동성 2 도메인을 동반하며, 이들은 세포 기질을 탈인산화시키므로, NK 활성화 신호를 중단시키며, 즉, 적절한 자기-MHC 클래스 I 발현을 가진 표적 세포를 할애한다. 짧은(들) 세포질 테일을 가진 수용체는 ITIM(즉, KIR2DS 또는 KIR3DS)을 결여한다. 이들 활성화 KIR은 신호전달 사슬 KARAP/DAP12와의 상호작용을 용이하게 하는 그들의 막관통 도메인 내에 하전된 잔기를 함유한다. 수용체의 KIR2DS 패밀리의 결합은 KARAP/DAP12-매개 신호전달 이벤트의 캐스케이드를 초래하여 증가된 NK 세포 세포용해 활성 및 IFN-γ 등과 같은 전염증성 사이토카인의 생산에 이르는 것으로 판명되었다(Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179: 1625-1633). 성숙 NK 세포는 자기-MHC 클래스 I 분자에 특이적인 적어도 하나의 저해 수용체를 획득할 것으로 예상되며, 이것은 일반적으로 잠재적으로 자가-반응성 활성화 분자에 비해서 기능적으로 우세하다. NK 세포의 반응이 KIR 및 기타 수용체에 의한 활성화 및 저해 신호전달 둘 다의 통합된 성과를 나타내는 것이 제안되어 있다.
KIR3DL2는 균상 식육종 및 세자리 증후군과 같은 악성 종양을 포함하는, KIR3DL2 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포, 특히 CD4+ T 세포와 연루된 악성 종양의 치료를 위한 표적으로서 연구되어 왔다(예컨대 PCT 공보 WO2010/081890 및 WO02/50122 참조). KIR3DL2의 리간드인 HLA-B27은, 강직성 척추염(Ankylosing Spondylitis: AS)으로 대표되는 쇠약화 염증성 관절염의 군인 척추관절염(Spondyloarthritides: SpA)과 강하게 연관된다. B27 2량체에 의한 KIR3DL2 결찰은 Th17 및 NK 세포 서브세트의 생존을 촉진시킨다(Bowness, et al. (2011) Journal of immunology 186:2672-2680; Chan, et al. (2005) Arthritis Rheum 52:3586-3595). SpA 환자에서 KIR3DL2를 발현하는 증가된 비율의 병원성 Th17 및 NK 세포 서브세트가 있는 것으로 판명되었다. 연구는, KIR3DL2-B27 상호작용이 SpA에 있어서 중추적인 역할을 하고 KIR3DL2가 유망한 치료 표적인 것을 강하게 시사한다.
각종 KIR3D 폴리펩타이드에 대해 반응성인 항체의 존재가 보고되어 있었다. 2종의 항-KIR3DL2 항체, 즉, Q241 및 Q66의 존재가 보고되어 있었다(Pende, et al. (1996) J Exp Med 184:505-518). 그러나, 이들 2종의 항체는 IgM 동형(isotype)(5량체)으로 이루어져, 약제학적 용도에 용이하게 적합하지 않으며; 나아가, 그들의 가변 영역이 2가의 IgG 유형 항체의 맥락에서 놓여 있다면, 그들의 친화도는 낮을 것으로 예상된다. 또 다른 항체를 생산하는 "AZ158"로서 지칭되는 세포가 보고되어 있었다(Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415-417; PCT 공보 WO2010/081890). 항체 5.133은 밀테니 바이오텍사(Miltenyi Biotech)(캘리포니아주의 오반에 소재)로부터 입수 가능하다. 두 항체 AZ158 및 5.133은 KIR3DL1(그리고 추가로 고도로 상동성인 KIR3DS1)뿐만 아니라 KIR3DL2와도 결합한다. KIR3DL2 및 KIR3DL1은 비교적 높은 아미노산 동일성을 공유하고, KIR3DL2와 결합하는 각종 HLA 리간드가 또한 KIR3DL1에 의해 인식된다. AZ158, Q241 및 Q66를 유발시키는 면역화에도 불구하고, 치료적 및 기타 응용에서 개선된 항체에 대한 요구가 있다.
일 양상에 있어서, 약제학적 제형에서 높은 친화도 항원 결합 및 안정성을 둘 다 지니는 인간 프레임워크를 가진 항-KIR3DL2 항체가 제공된다. 본 발명자들은 상이한 단일-유전자 및 모자이크 인간 프레임워크를 가진 항체를 개발하였고, 중쇄에서 39번 잔기와 경쇄에서 38번 잔기(애브넘(Abnum))에 소정의 아미노산이 강하게 증가된 물리적(physical) 안정성을 제공하는 것을 발견하였다.
예시적인 항체는 항체 2B12와 10G5의 항체 조합 영역을 이용해서 개발되었다. 항체 2B12 및 10G5 CDR은 PCT 출원 번호 PCT/EP2013/069302(출원일: 2013년 9월 17일)에 기재되어 있다. 항-KIR3DL2 mAb 2B12 및 10G5는 (상동성에 의해) 밀접하게 관련된 KIR3DL1에 결합하지도 않고, KIR3DL2 내재화를 일으키지도 않는 유리한 특성을 지닌다. KIR3DL2 내재화는 ADCC-기반 접근을 강력하게 방해한다. 항체는 적절한 동형(예컨대 IgG1)일 때 ADCC를 매개할 수 있지만, 또한 KIR3DL2와의 KIR3DL2-HLA B27 2량체 상호작용을 저해할 수 있다. 특히, 리간드 봉쇄는 수용체 내재화를 일으키는 일 없이 달성될 수 있다. KIR3DL2의 하나 이상의 리간드를 차단하는 항체는 따라서 결핍 또는 비결핍 mAb 포맷으로서 염증성 장애를 치료 또는 예방하는데 잘 적합화된다. 항체에 의해 결합된 KIR3DL2에 대한 에피토프는, 두 항체 10G5 및 2B12가 I60 및 G62 잔기에서 치환을 가진 KIR3DL2 돌연변이체에 대한 결합을 상실함에 따라서 결정되었다. 항체 10G5는 또한 P14, S15 및 H23 잔기에서 그리고 R13, A25 및 Q27 잔기에서 치환을 가진 KIR3DL2 돌연변이체에 대한 결합을 상실한다. 항체는 세포의 표면 상에서 발현되는 바와 같은 천연 배치형태에서 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 결합을 위하여 서로 경쟁한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 인간화 2B12 또는 10G5 항체를 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 경쇄 및/또는 중쇄에 모자이크 인간 프레임워크를 가진 인간화 2B12 또는 10G5 항체를 제공한다. 예컨대, 낮은 면역원성, 개선된 항원-결합 또는 기타 기능적 특성 및/또는 개선된 물리화학적 특성, 예컨대, 보다 양호한 안정성 등과 같은 개선된 특성을 가진 이러한 인간화 항체의 프레임워크 영역(FR) 내의 아미노산 치환에 대한 예시적인 상보성-결정 영역(CDR) 잔기 또는 서열 및/또는 부위가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 인간 프레임워크 서열은 복귀 돌연변이를 포함한다.
본 명세서에서 제공된 프레임워크 및 가변 영역은 약제학적 제형에서 발견되는 조건 하에서 높은 2B12 및 10G5에 높은 물리적 안정성과 낮은 응집 경향을 제공한다. 특히, 실질적으로 인간 프레임워크 영역과 함께 2B12 또는 10G5의 항원 조합 영역을 가진 항체가 제공되되, 여기서 항체는 그의 중쇄에 39번 위치에서 글루타민 (Q)을, 그의 경쇄에 38번 위치(애브넘 넘버링)에 글루타민을 포함한다. 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 경쇄에서 38번 잔기(애브넘 넘버링)에 글루타민이 존재할 경우 H-결합이 VH_Q39와 VL_Q38 사이에 구축되는 것으로 여겨지고(도 1 참조), 결과적으로 항체의 물리적 안정성이 보다 커진다. 이들 2개의 H-결합은 mAb의 4차화 구조를 안정화시킬 수 있어, 단백질 응집을 담당하는 소수성 부분의 노출을 방지할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 인간 VH 및 VL 수용체 프레임워크를 갖되, 여기서 항체는 그의 중쇄에서 39번 잔기에 글루타민 잔기를 그리고 그의 경쇄에서 38번 잔기에 글루타민을 포함한다. VH 및/또는 VL 인간 수용체 프레임워크는 천연 유래 인간 수용체 프레임워크에 비해서 복귀 돌연변이(예컨대 프레임워크 영역의 하나 이상에서 대응하는 공여체 잔기에 1, 2, 3 또는 4개 이상의 아미노산 치환)를 포함할 수 있다. 임의로 항체는 항체 2B12 또는 10G5와 동일한 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 인간 VH7 하위군(subgroup)으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 1(FW1) 및 2(FW2)를 포함한다. 임의로, 항체는 인간 VH7 하위군으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 3(FW3)을 포함한다. 임의로, 항체는 JH6 하위군으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 4(FW4)를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 항체는, 임의로 JK4 하위군과 조합된, VK1 및/또는 VK4 하위군의 경쇄 수용체 프레임워크를 포함한다. 임의로, 항체는 인간 VK1 하위군으로부터 유래된 경쇄 FW1과, 인간 VK4 하위군으로부터 유래된 경쇄 FW2 및 경쇄 FW3을 포함한다. 임의로, 항체는 JK4 하위군으로부터 유래된 경쇄 FW4를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 임의로 JH6 하위군과 조합된, 인간 VH7 하위군의 인간 중쇄 수용체 프레임워크와 항체 2B12의 중쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 중쇄, 및 임의로 JK4 하위군과 배합된, VK1 및/또는 VK4 하위군의 항체 2B12 인간 경쇄 수용체 프레임워크의 경쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 경쇄를 포함하는, KIR3DL2에 결합되는 단리된 단클론성 항체가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 (일괄적으로) 1, 2 또는 3개의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 (일괄적으로) 1 또는 2개의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 인간 중쇄 수용체 프레임워크와 항체 2B12의 중쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 중쇄를 포함하되, 여기서 프레임워크 1(FW1) 및 2(FW2)는 인간 VH7 하위군으로부터 유래된다. 임의로, 프레임워크 3(FW3)은 인간 VH7 하위군으로부터 유래된다. 임의로, 프레임워크 4(FW4)는 JH6 하위군으로부터 유래된다. 임의로, 항체는, 임의로 JK4 하위군과 조합하여, VK1 및/또는 VK4 하위군의 인간 경쇄 수용체 프레임워크와 항체 2B12의 경쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 임의로, 경쇄 FW1은 인간 VK1 하위군으로부터 유래되고, 경쇄 FW2 및 경쇄 FW3은 인간 VK4 하위군으로부터 유래된다. 임의로, 경쇄 FW4는 JK4 하위군으로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 (일괄적으로) 1, 2 또는 3개의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 (일괄적으로) 1 또는 2개의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, VH7 하위군 유전자는 IGHV7-4(예컨대 IGHV7-4-1*02, 서열번호 53에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 유전자)이다. 일 실시형태에 있어서, VK1 하위군 유전자는 IGKV1-39, 예컨대, 서열번호 44에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 유전자이다. 일 실시형태에 있어서, VK4 하위군 유전자는 IGKV4-1, 예컨대, 서열번호 45에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 유전자이다.
일 실시형태에 있어서, 인간 VH1 하위군(예컨대 IGHV1-46)으로부터 유래된 인간 중쇄 수용체 프레임워크와 항체 10G5의 중쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 중쇄, 및 VK1 하위군(예컨대 IGKV1-NL1)으로부터 유래된 인간 경쇄 수용체 프레임워크와 항체 10G5의 경쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 경쇄를 포함하는, KIR3DL2에 결합하는 단리된 단클론성 항체가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 JH6 하위군과 조합된 VH1 및/또는 VH7 하위군의 인간 중쇄 수용체 프레임워크와 JK4 하위군과 조합된 VK1 및/또는 VK4 하위군의 인간 경쇄 수용체 프레임워크를 구비한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하고 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; VH 도메인의 39번 위치에 글루타민(Q) 잔기 및 VL 도메인의 38번 위치에 글루타민을 포함하는 단리된 인간화 항체를 제공한다. 39번 위치에서의 글루타민(Q) 잔기는 인간 VH 프레임워크 서열에 자연적으로 존재할 수 있거나, 또는 아미노산 치환 또는 서열의 기타 변형에 의해 도입될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 항체 2B12 또는 10G5의 중쇄 및 경쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하는 인간화 항체가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, KIR3DL1 폴리펩타이드에 실질적으로 결합하지 않고 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 인간 수용체 프레임워크를 포함하는 항체가 제공되되, 항체는 항체 2B12 또는 10G5의 중쇄 및 경쇄 CDR1, 2 및 3을 포함하되, 여기서 인간 프레임워크 영역들 중 하나 이상은 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 치환은 복귀 돌연변이이다. 임의로, 치환은 본 명세서에 개시된 치환이다. 임의로, 항체는 그의 중쇄에서 39번 잔기에 글루타민을 그리고 그의 경쇄에서 38번 잔기에 글루타민을 포함한다.
일 양상에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 각각 서열번호 18(HCDR1), 서열번호 19(HCDR2) 및 서열번호 20(HCDR3)의 서열을 포함하는 중쇄 CDR 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및
(b) 각각 서열번호 21, 22 및 23의 서열을 포함하는 경쇄 CDR 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2, LCDR3). 임의로, 항체는 JH6 하위군과 조합된 VH1 및/또는 VH7 하위군의 인간 중쇄 수용체 프레임워크, 및 JK4 하위군과 조합된 VK1 및/또는 VK4 하위군의 인간 경쇄 수용체 프레임워크를 구비한다. 임의로, 인간 경쇄 및/또는 중쇄수용체 프레임워크는 치환(예컨대 복귀 돌연변이)을 포함한다.
임의로, 2B12 항체의 본 명세서에서의 임의의 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 잔기 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72c, 9 및 108(애브넘 넘버링)(이들의 임의의 조합을 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 치환을 가질 수 있다. 임의로, 2B12 항체의 본 명세서에서의 임의의 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 잔기 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78 및 104(애브넘 넘버링)(이들의 임의의 조합을 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 치환을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 치환(들)은 복귀 돌연변이다.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 2B12-H0, -H1, -H2, -H3 및 -H4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 2B12-L0, -L1, -L2, -L3 및 -L4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 29 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 24 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 2B12 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 영역은 그의 프레임워크 영역들 중 1, 2, 3 또는 4개에 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역은 그의 프레임워크 영역들 중 1, 2, 3 또는 4개에 하나 이상의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일 양상에 있어서, 6.5 내지 8, 임의로 약 7.4의 pH에서, (a) c2B12-H0, -H1, -H2, -H3 및 -H4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 2B12-L0, -L1, -L2, -L3 및 -L4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 IgG 항체 분자; (b) 완충계, 예컨대 인산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨; (c) 등장화제, 임의로 NaCl; 및 (d) 폴리솔베이트 80을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 활성 제형이 제공된다. 일 양상에 있어서, 6.5 내지 8, 임의로 약 7.4의 pH에서, (a) 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 항체; (b) 약 10mM 완충제, 예컨대 인산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨; (c) 등장화제, 임의로 약 9㎎/㎖ NaCl; 및 (d) 폴리솔베이트 80을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 활성 제형이 제공된다.
일 양상에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 각각 서열번호 2(HCDR1), 서열번호 3(HCDR2) 및 서열번호 4(HCDR3)의 서열을 포함하는 중쇄 CDR 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및
(b) 각각 서열번호 5, 6 및 7의 서열을 포함하는 경쇄 CDR 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2, LCDR3). 임의로, 항체는 JH6 하위군과 조합된 VH1 하위군의 중쇄 인간 수용체 프레임워크, 및 JK2 하위군과 조합된 VK1 하위군의 경쇄 인간 수용체 프레임워크를 갖는다. 임의로, 항체는 치환(예컨대 복귀 돌연변이)을 포함하는 인간 수용체 프레임워크를 가진 중쇄를 갖는다.
임의로, 10G5 항체의 본 명세서에서의 임의의 실시형태에 있어서, 중쇄 프레임워크는 잔기 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72a 및 75(애브넘 넘버링)(이들의 임의의 조합을 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 치환을 가질 수 있다. 임의로, 10G5 항체의 본 명세서에서의 임의의 실시형태에 있어서, 경쇄 프레임워크는 잔기 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76 및 100(애브넘 넘버링)(이들의 임의의 조합을 포함함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 치환을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 치환(들)은 복귀 돌연변이이다.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 10G5-H0, -H1, -H2, -H3, -H4, -H5 및 -H6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 및 -L5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 13 내지 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 8 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시형태에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 10G5 단클론성 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 양상에 있어서, 6.5 내지 8, 임의로 약 7.4의 pH에서, (a) 10G5-H0, -H1, -H2, -H3, -H4, -H5 및 -H6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 및 -L5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 IgG 항체 분자; (b) 완충계, 예컨대 인산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨; (c) 등장화제, 임의로 NaCl; 및 (d) 폴리솔베이트 80을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 활성 제형이 제공된다. 일 양상에 있어서, 6.5 내지 8, 임의로 약 7.4의 pH에서, (a) 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 항체; (b) 약 10mM 완충제, 예컨대 인산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨; (c) 등장화제, 임의로 약 9㎎/㎖ NaCl; 및 (d) 폴리솔베이트 80을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 활성 제형이 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 KIR3DL2 폴리펩타이드 대립유전자(allele) *002, *003, *005, *007, 및/또는 *008의 1, 2, 3, 4 또는 5개에 결합한다. 임의로, 항체는 특정 KIR3DL2 대립유전자(예컨대 대립유전자_*001, *002, *003, *005, *007 및/또는 *008)를 그들의 표면에서 발현하도록 만들어진 세포에 결합하기 위하여 5 ㎍/㎖ 이하, 임의로 3 ㎍/㎖ 이하, 2 ㎍/㎖ 이하, 1 ㎍/㎖ 이하 또는 0.5 ㎍/㎖ 이하의 EC50을 지닌다. 일 양상에 있어서, 리간드(HLA) 결합 영역(예컨대 HLA 결합 포켓)에서 또는 KIR3DL2 단백질의 HLA 결합면 상에 적어도 부분적으로 KIR3DL2 폴리펩타이드와 결합하는 항체가 제공된다.
일 양상에 있어서, 잔기 I60 및/또는 G62(서열번호 1 참조)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 및/또는 잔기 I60 및/또는 G62(서열번호 1, 예컨대 I60N, G62S 참조)에 돌연변이를 가진 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가진 항체가 제공된다. 일 양상에 있어서 KIR3DL2 폴리펩타이드의 잔기 R13, A25 및/또는 Q27(서열번호 1 참조)를 포함하는 에피토프에 결합하고/하거나 잔기 R13, A25 및/또는 Q27에 돌연변이를 가진 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가진 항체가 제공된다. 예를 들어, 항체는 돌연변이 R13W, A25T 및/또는 Q27R을 가진 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가질 수 있다. 임의로, 에피토프는 부가적으로 또는 대안적으로 잔기 P14, S15 및/또는 H23(서열번호 1 참조)이 하나 이상을 포함하고/하거나, 항체는 잔기 P14, S15 및/또는 H23(서열번호 1, 예컨대 P14S, S15A, H23S 참조)에 돌연변이를 가진 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 갖는다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 이러한 제제 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 예컨대 세포독성제 또는 검출 가능한 제제에 접합된 이러한 제제를 포함하는 접합체(conjugate)를 제공한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 이러한 제제를 암호화하는 핵산 및 벡터, 그리고 이러한 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또한 핵산이 생산되도록 이러한 숙주 세포를 배양함으로써 제제를 제조하는 재조합 방법이 제공된다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 이러한 제제 및 환자의 암 또는 자가면역 질환과 같은 장애를 치료하도록 사용자에게 지시하는 설명서를 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 임의로, 이러한 물품은 다른 제제를 수용하는 다른 용기를 포함할 수도 있으며, 이때 설명서는 제제와 병용하여 항체로 장애를 치료하도록 사용자에게 지시한다. 본 발명은 또한 환자의 암, 염증성 장애 또는 자가면역 장애와 같은 장애의 치료에서, 임의로 다른 항암제 혹은 항염증제와 함께, 본 발명의 제제를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 부가적인 유리한 양상 및 특징은 본 명세서의 어디에선가 더욱 설명될 수 있다.
도 1은 항체 구조의 모델링을 도시하며, 경쇄에서 38번 잔기에 그리고 중쇄에서 39번 잔기에 글루타민이 존재할 경우, H-결합이 H_Q39와 VL_Q38 사이에 구축될 수 있어, 이러한 항체의 보다 큰 물리적 안정성을 설명할 수 있는 것을 나타낸 도면.
도 2는 라지(Raji)-KIR3DL2 하이(high) 5M IV이 생착되고 항체 2B12-H2L1의 용량 반응과 함께 IP 처치된 CB17-SCID 마우스의 생존 곡선을 도시한 도면(n=8/군). 치료는 1일로부터 시작하였다. 실험의 종료는 58일에서였다.
도입
본 개시내용의 항체는, KIR3DL1+ 세포(또는 KIR3DL2+ KIR3DL1+ 세포, KIR3DS1+ 세포; 또는 KIR3DS1 KIR3DL2+ 세포) 등과 같은 다른 세포를 표적화하는 일 없이, KIR3DL2-발현 세포, 특히 CD4+, KIR3DL2+ T 세포를 직접 그리고 구체적으로 표적화할 수 있고, KIR3DL2+ 세포 내로 내재화되지 않는다. 또한 KIR3DL2의 천연 리간드의 결합(또는 리간드-유도 KIR3DL2 신호전달)을 저해하는 항체가 제공된다. 본 개시 내용은 이러한 특성을 가진 항체를 제공하며, 이러한 항체는 서열번호 1의 성숙 KIR3DL2 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 1 내지 98번 잔기에 의해 규정된 도메인 0을 포함하는 KIR3DL2+의 영역에 결합하기 위하여 서로 경쟁한다.
KIR3DL2(CD158k)는 문헌[Pende et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518](이의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 약 140 kD의 3-Ig 도메인 분자의 다이설파이드-연결된 동종 2량체이다. KIR3DL1(CD158e1)은 문헌[Colonna and Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408]에 기재된 약 70 kD의 단량체 분자이고; HLA 결합 포켓은 문헌[Vivian et al. (2011) Nature 479: 401-405]에 기재되어 있었다. KIR3DL2의 천연 리간드는, 그 중에서도, HLA-A 및 HLA-B 폴리펩타이드, 특히 HLA-A3 및 HLA-A11(문헌[Hansasuta et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34: 1673-1679] 및 HLA-B27을 포함한다. HLA-B27 유전자의 조직화, 서열 및 발현을 위하여 HLA-B27(예컨대, 문헌[Weiss et al. (1985) Immunobiology 170(5):367-380]) 그리고 HLA-B27 다량체 및 HLA-B272 동종 2량체를 위하여 문헌[Allen et al. (1999) J. Immunol. 162: 5045-5048 및 Kollnberger et al (2007) Eur. J. Immunol. 37: 1313-1322]을 참조한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "KIR3D"는 개별적으로 또는 일괄적으로 임의의 KIR3D 수용체(예컨대 KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DS1)를 지칭하고, 용어 "KIR3D"는 용어 "KIR3DL1, KIR3DL2 및/또는 KIR3DS1"에 의해 치환될 수 있다. 마찬가지로, "KIR3DL"은 개별적으로 또는 일괄적으로 임의의 KIR3DL 수용체(예컨대 KIR3DL1, KIR3DL2)를 지칭하며, 용어 "KIR3DL"은 용어 "KIR3DL1 및/또는 KIR3DL2"에 의해 치환될 수 있다. 용어 "KIR3D", "KIR3DL", "KIR3DL1", "KIR3DL2", "KIR3DS1"은 각각 또한 이들이 지칭되는 KIR3D 유전자 또는 암화화된 단백질(들)의 임의의 변이체, 유도체 또는 아이소폼을 포함한다. 수개의 대립유전자 변이체는 KIR3D 폴리펩타이드(예컨대 KIR3DL2)에 대해서 보고되어 있으며, 이들의 각각은 각각의 용어로 포괄된다. 성숙 인간 KIR3DL2(대립유전자 *002)의 아미노산 서열은 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호 AAB52520에 대응하는 서열번호 1로 표시되고, 이때 21개의 아미노산 잔기 리더 서열은 생략되고 IPD KIR 데이터베이스(EMBL-EBI에 의해 간행, 영국에 소재한 European Bioinformatics Institute) 수탁 번호 KIR00066에 대응한다.
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KIR3DL2(대립유전자 *002)의 cDNA는 젠뱅크 수탁 번호 U30272에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *002 의 전구체 아미노산 서열(리더 서열을 포함함)은 젠뱅크 수탁 번호 AAB52520에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *001의 아미노산 서열은 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00065에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *003의 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AAB36593 및 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00067에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *004의 아미노산 서열은 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00068에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *005의 아미노산 서열은 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00069에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *006(성숙)의 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AAK30053 및 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00070에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *007(성숙)의 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AAK30052 및 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00071에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *008의 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AAK30054 및 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00072에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *009의 아미노산 서열은 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00457에 표시되어 있다. 인간 KIR3DL2 대립유전자 *011의 아미노산 서열은 IPD KIR 데이터베이스 수탁 번호 KIR00544에 표시되어 있다. KIR3DL1(CD158e2) 폴리펩타이드(대립유전자 *00101)를 암호화하는 cDNA는 젠뱅크 수탁 번호 L41269에 표시되어 있고; 암호화된 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AAA69870에 표시되어 있다. 리더 서열이 KIR3DL2 폴리펩타이드 서열을 기술하는 특정 서열 번호로 존재할 경우, 본 명세서에서의 아미노산 위치에 대한 어떠한 언급도 성숙 KIR3DL 폴리펩타이드에 대한 것일 것이다. 상기 수탁 번호를 가진 데이터베이스 기록의 각각은 참고로 본 명세서에 편입된다.
항원-결합 화합물을 이용하는 방법; 예를 들어, 세포 증식 또는 활성을 저해하는, 분자를 세포(예컨대 독성 분자, 검출 가능한 마커 등)에 전달하는, 세포를 표적화, 동정 또는 정제하는, 세포를 결핍, 사멸 또는 제거하는, 세포 증식을 저감시키는 방법이 제공되되, 이 방법은 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 본 개시내용의 항원-결합 화합물에 KIR3DL2 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포 등과 같은 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위하여, "세포 증식"은 세포의 성장 또는 증식의 임의의 양상, 예컨대, 세포 성장, 세포 분할 또는 세포 주기의 임의의 양상을 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 세포는 세포 배양액(시험관내)에 또는 포유동물(생체내), 예컨대, KIR3DL2-발현 병상을 앓고 있는 포유동물에 있을 수 있다. 또한 KIR3DL2 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 증식 또는 활성을 저해하거나 세포의 사멸을 유도하는 방법이 제공되되, 해당 방법은, 세포의 증식 또는 활성을 저해하고/하거나 사멸을 유도하는데 효과적인 양으로, 독성제에 연결된 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합되는 항원-결합 화합물에 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 따라서, 증식성 질환 및 KIR3DL2 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 병원성 확대 또는 활성화를 특징으로 하는 임의의 병태를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 포유동물에 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항원-결합 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 병태의 예는 세자리 증후군, 균상 식육종, CTCL, 말초 T 세포 림프종, 오쏘 내장 결절외(ortho visceral extranodal) PTCL(예컨대, NK/T-림프종 또는 장질환 관련 T 세포 림프종(EATL)), 미분화 대세포 림프종(ALCL), PTCL-NOS(달리 명시되지 않은), 및 자가면역 또는 염증성 병태, 예컨대 관절염, 강직성 척추염, 심혈관 질환을 포함한다.
KIR3DL2-발현 세포를 제거하는 것이 유용할 수 있는 장애(예컨대 암, 염증성 및 자가면역 장애)의 치료에 적합한 기타 화합물 및 항체를 제조하는 방법 및 이용하는 방법이 제공된다. 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 및 이들을 생산하는 세포, 이를 생산하는 방법 및 항체 및 화합물을 이용해서 환자를 치료하는 방법이 망라된다.
본 발명의 항체는 KIR3DL2에 특이적이므로, 이것은 면역블로팅, IHC 분석, 즉, 동결 생검 상, FACS 분석, 및 면역침강법 등과 같은 방법을 비롯하여, KIR3DL2 또는 KIR3DL2-발현 세포를 정제시키거나, KIR3DL2 수용체를 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 조절(예컨대, 활성화 또는 저해)하거나, 생체내 파과를 위하여 KIR3DL2-발현 세포를 표적화하거나, 또는 KIR3DL2를 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 특이적으로 표지/결합하는 것을 포함하는 광범위한 목적을 위하여 이용될 수 있다.
정의
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, "포함하는"이란 어휘와 함께 이용될 경우, 단수 표현은 하나 또는 하나보다 많은 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
"포함하는"이 사용될 경우, 이것은 임의로 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "암" 및 "종양"은 비제어된 그리고 진행성 다중화를 포함하는 세포 또는 조직의 새로운 성장으로서 정의된다. 특정 실시형태에 있어서, 자연적인 과정에서, 암은 치명적이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 암은 침습적, 전이성 및/또는 미분화성(서로에게 그리고 그들의 축방향 프레임워크로의 분화 및 배향의 손실)이다.
"자가면역" 장애는, 자기 것을 자기 것이 아닌 것 또는 다른 것으로부터 구별하는 능력의 파괴로 인해, 면역계가 자기 세포 또는 조직에 대한 반응을 시작하는 임의의 장애, 병태 또는 질환을 포함한다. 자가면역 장애의 예는 류마티스 관절염, 류마티스 혈관염, 전신 홍반성 루프스, 다발성 경화증, 베게너 육아종증, 척추관절염 등을 포함한다. "염증성 장애"는 원치 않는 면역 반응을 특징으로 하는 임의의 장애를 포함한다. 자가면역 및 염증성 장애는 면역계의 임의의 성분을 포함할 수 있고, 신체에서 임의의 세포 또는 조직 유형을 표적화할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "항체"는, 다클론성 및 단클론성 항체를 지칭한다. 중쇄 중의 불변 도메인의 유형에 따라서, 항체는 5가지의 주된 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나에 할당된다. 이들 중 몇 개는 하위부류 또는 동형, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등으로 더욱 분할된다. 예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 4량체를 포함한다. 각 4량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa)와 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다. 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 "알파", "델타", "엡실론", "감마" 및 "뮤"라고 일컬어진다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3차원 형태는 잘 알려져 있다. IgG 및/또는 IgM은 여기에서 이용되는 바람직한 부류의 항체이고, IgG가 특히 바람직한데, 그 이유는 이들이 생리적 상황에서 가장 통상의 항체이기 때문이고 그리고 이들이 실험실 세팅에서 가장 용이하게 제작되기 때문이다. 바람직하게는 항체는 단클론성 항체이다. 특히 바람직한 것은 인간화, 키메라, 인간 또는 기타-인간-적합한 항체이다. "항체"는 본 명세서에 기재된 항체 중 어느 것인가의 임의의 단편 또는 유도체를 포함한다.
용어 "에 특이적으로 결합하는"은 항체가 단리된 표적 세포의 표면 상에 존재하는 단백질의 재조합 형태, 그 안의 에피토프 또는 천연 단백질을 이용해서 평가되는 바와 같이 결합 상대방, 예컨대, KIR3DL2에 대해서 바람직하게는 경쟁적 결합 검정법으로 결합할 수 있는 것을 의미한다. 경쟁적 결합 검정법 및 특이적 결합을 결정하는 기타 방법은 이하에 더욱 기술되고 당업계에 충분히 공지되어 있다.
항체가 특정 단클론성 항체(예컨대 2B12, 10G5)"와 경쟁한다고 일컬어질 경우, 이것은 항체가 재조합 KIR3DL2 분자 또는 표면 발현된 KIR3DL2 분자를 이용해서 결합 검정법에서 단클론성 항체와 경쟁하는 것을 의미한다. 예를 들어, 시험 항체가 결합 검정법에서 2B12 또는 10G5의 KIR3DL2 폴리펩타이드 또는 KIR3DL2-발현 세포의 결합을 저감시킨다면, 항체는 2B12 또는 10G5와 각각 "경쟁한다고" 일컬어진다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "친화도"는, 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab] x [Ag]/[Ab-Ag]로서 정의된 해리상수 Kd에 의해 부여되며, 여기서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 결합되지 않은 항체의 몰 농도이며, [Ag]는 결합되지 않은 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 방법의 예는 문헌[Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌은 참고로 본 명세서에 전체적으로 편입된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 충분히 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 스크리닝(비아코어(BIAcore)(상표명) SPR 분석 장치를 이용한 분석에 의하는 등)의 사용이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "결정자"(determinant)는 폴리펩타이드 상의 상호작용 또는 결합 부위를 지칭한다.
용어 "에피토프"란 항원성 결정자를 지칭하며, 항체가 결합하는 항원 상의 영역 또는 구역이다. 단백질 에피토프는 항체의 "풋프린트" 내에서 특정 항원 결합 항체 또는 펩타이드, 즉, 아미노산 잔기에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기뿐만 아니라 결합에 직접 연루되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이것은, 예컨대, 항체 또는 수용체와 조합될 수 있는 복합 항원 분자 상의 가장 간단한 형태 또는 최소 구조 영역이다. 에피토프는 선형 또는 입체배좌적(conformational)/구조적일 수 있다. 용어 "선형 에피토프"는 아미노산의 선형 서열(1차 구조) 상에서 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 에피토프로서 정의된다. 용어 "입체배좌적 또는 구조적 에피토프"는 결코 연속적이지 않은 아미노산 잔기로 구성된 에피토프로서 정의되고, 따라서 분자의 접힘에 의해 서로 인접하게 되는 아미노산의 선형 서열의 분리된 부분들(2차, 3차 및/또는 4차 구조)를 나타낸다. 입체배좌적 에피토프는 3-차원 구조에 의존한다. 용어 "입체배좌적"은 따라서 흔히 "구조적"과 호환적으로 이용된다.
그와 같이 결합되는 KIR3DL2 폴리펩타이드 및/또는 항체를 지칭할 경우의 용어 "세포내 내재화" 또는 "내재화"는, 세포의 세포외 표면으로부터 세포의 세포내 표면으로 분자의 전좌 과정과 관련된 분자적, 생화학적 및 세포적 이벤트를 지칭한다. 분자의 세포내 내재화를 담당하는 과정은 잘 알려져 있고, 그 중에서도, 세포외 분자(호르몬, 항체 및 작은 유기 분자 등); 막-관련 분자(세포-표면 수용체); 및 세포외 분자에 결합된 막-관련 분자의 복합체(예를 들어, 막관통 수용체에 결합된 리간드 또는 막-관련 분자에 결합된 항체)의 내재화를 포함할 수 있다. 따라서, "세포내 내재화를 유도 및/또는 증가시키는" 것은 세포내 내재화가 개시되고/되거나 세포내 내재화의 속도 및/또는 정도가 증가되는 이벤트를 포함한다.
KIR3DL2-발현 세포에 관하여 용어 "결핍시키는" 것은 샘플에 또는 대상체에 존재하는 KIR3DL2-발현 세포의 수에 부정적으로 영향을 미치도록 사멸시킬 수 있거나 제거할 수 있거나 또는 용해시킬 수 있거나 또는 그러한 사멸, 제거 또는 용해를 유발할 수 있는 공정, 방법 또는 화합물을 의미한다.
용어 "~ 제" 혹은 제제(agent)는 본 명세서에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로 이루어진 추출물을 지칭하는데 이용된다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 지니는 제제를 의미한다.
용어 "독성제" 및 "세포독성제"는 임의의 검출 가능한 방식으로 세포의 증식을 늦추거나 중지시키거나 역전시킬 수 있거나, 이의 활성을 감소시키거나, 또는 이를 직접 또는 간접적으로 사멸시킬 수 있는 임의의 화합물을 포괄한다. 바람직하게는, 세포독성제는 주로 세포의 기능을 직접 간섭함으로써 세포 사멸을 초래하고, 알킬화제, 종양 괴사 인자 저해제, 인터칼레이터, 미세관 저해제, 키나제 저해제, 프로테아좀 저해제 및 토포아이소머라제 저해제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "독성 페이로드"란, 세포가 전달될 때 세포 사멸을 초래하는 충분한 양의 세포독성제를 지칭한다. 독성 페이로드의 전달은 항체 또는 항원 결합 단편 및 세포독성제를 포함하는 충분한 양의 면역접합체의 투여에 의해 달성될 수 있다. 독성 페이로드의 전달은, 또한 세포독성제를 포함하는 충분한 양의 면역접합체의 투여에 의해 달성되며, 여기서 면역접합체는 항체 또는 항원 결합 단편을 인식하여 이에 결합하는 그의 2차적인 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
본 명세서에서의 목적을 위하여, "인간화" 또는 "인간" 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 및 가변 프레임워크 영역이 동물 면역글로불린의 결합 영역, 예컨대, CDR과 융합된 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 결합 영역이 유래되는 비-인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만 비-인간 항체에 대한 면역 반응을 회피하도록 설계된다. 이러한 항체는 유전자이식 마우스 또는 항원 도전에 반응하여 특정 인간 항체를 생산하기 위하여 "공학적으로 조작된" 기타 동물로부터 얻어질 수 있다(예컨대, 문헌[Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579] 참조, 이들의 전체 교시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨). 완전 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 형질감염 방법뿐만 아니라 파지 디스플레이 수법에 의해 작제될 수 있으며, 이들 방법은 모두 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌[McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553] 참조). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다(예컨대, 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호. 이들은 그들의 전문이 참고로 편입됨).
"키메라 항체"는, (a) 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되어 항원 결합 부위(가변 영역)가 키메라 항체, 예컨대, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 새로운 특성을 부여하는 상이한 또는 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종, 또는 전체적으로 상이한 분자의 불변 영역에 연결되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 가진 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다.
용어 "Fc 도메인," "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은, 예컨대, 항체 중쇄의 C-말단 단편, 예컨대, 약 아미노산(aa) 230개 내지 약 aa 450개의 인간 g(감마) 중쇄 또는 다른 유형의 항체 중쇄(예컨대, 인간 항체에 대해서 α, δ, ε 및 μ)에서의 그의 상대 서열 또는 그의 천연 유래 동종이인자형(allotype)을 지칭한다.
용어 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 당업계에서 충분히 이해되는 용어이며, Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매게 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 비특이적 세포독성 세포는 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구를 포함한다.
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 자연 상태에서 발견된 것처럼 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 순도 및 동질성은 전형적으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피 등과 같은 분석 화학적 수법을 이용해서 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.
용어 "폴리펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 본 명세서에서 호환가능하게 이용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 유래 아미노산의 인공적 화학 모방체인 아미노산 중합체에뿐만 아니라 천연 유래 아미노산 중합체 및 비-천연 유래 아미노산 중합체에 적용된다.
예컨대, 세포, 혹은 핵산, 단백질 또는 벡터를 지칭하는데 이용될 경우 용어 "재조합체"는, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 혹은 단백질의 변형에 의해 변형된 것이나 또는 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래되는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는, 세포의 천연(비재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 달리 비정상적으로 발현되거나, 발현 하에 있거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
용어 "변형"은, 아미노산의 서열을 지칭할 때(예컨대, "아미노산 변형"), 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. "변형" 또는 "아미노산 변형"이란 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 여기에서의 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 단백질 서열 내의 주어진 위치에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 의미한다. 예를 들어, 치환 P14S는 14번 위치에서의 프롤린이 세린으로 대체된 모 폴리펩타이드의 변이체를 지칭한다. 폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 폴리펩타이드, 전형적으로 천연 또는 "모"(parent) 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드 변이체는 천연 아미노산 서열 내의 소정의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 소유할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 에피토프와 "결합하는" 용어 항체는 특이성 및/또는 친화도를 가진 상기 결정자와 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "동일성" 또는 "동일한"은, 2개 이상의 폴리펩타이드의 서열 간의 관계에서 사용될 경우, 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트링들 사이의 정합 개수에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩타이드들 간의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 검토된 갭 정렬(만약 존재한다면)을 가진 둘 이상의 서열 중 더 작은 것들 간의 동일한 정합 퍼센트이다. 관련된 폴리펩타이드의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 산출될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기재된 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열들 간에 최대 정합을 부여하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램에 기술된다. 두 서열 간에 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))를 비롯한 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 기타 공급처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기 참조)로부터 공개적으로 입수 가능하다. 잘 알려진 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성을 결정하는데 이용될 수 있다.
항체 및 에피토프
본 발명은, 부분적으로 변형된 인간 수용체 프레임워크 서열의 발견에 기초하고 있으며, 이것에 항체 CDR이 편입되므로 얻어지는 항-KIR3DL2 가변 영역은 인간 KIR3DL2의 D0 도메인에 결합하는 능력을 보유한다.
이러한 인간화 가변 영역 및 이를 포함하는 항체는 잔기 I60 및/또는 G62를 포함하는 KIR3DL2(서열번호 1)의 세그먼트에 결합할 수 있다. 임의로, 항체는 잔기 I60 및/또는 G62 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합하지만 잔기 R13, A25, 및/또는 Q27에는 결합하지 않는다. 임의로, 항체는 잔기 P14, S15 및/또는 H23 중 하나 이상뿐만 아니라 잔기 I60 및/또는 G62 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다.
달리 특정되지 않는 한, 면역글로불린에 대한 애브넘 아미노산 넘버링 명명법이 이 개시내용을 통해서 이용된다(문헌[Abhinandan and Martin, (2008) Molecular Immunology 45: 3832-3839] 참조, 이 개시내용은 참고로 편입됨). 애브넘 시스템을 이용하는 서열 넘버링은 또한 http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum에서 자동적으로 생성될 수 있다. 그러나, 당업자라면 대안적인 넘버링 시스템을 사용하여 애브넘 넘버링에 대응하는 위치를 확인할 수 있음이 이해될 것이다. 각각의 중쇄 및 경쇄에서의 38번 및 39번 잔기에 대해서, 애브넘 위치는 카밧 넘버링 시스템(Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)에서와 동일한 위치에 대응한다.
항체가 VL 도메인 서열 내에서 38번 잔기에 글루타민을 포함할 경우, 바람직한 인간 VH 수용체 프레임워크는 VH 도메인 서열 내에서 39번 잔기에 글루타민을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 JH6과 함께 인간 하위군 VH1로부터의 중쇄 프레임워크를 포함하고, 임의로 항체는 IGHJ6*01과 함께 IGHV1 -46*03을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 인간 하위군 VK1로부터의 경쇄 프레임워크, 임의로 IGKV1-NL1*01을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 JH6과 함께 인간 하위군 VH1 및/ VH7로부터의 중쇄 프레임워크를 포함하고, 임의로 항체는, IGHJ6*01과 함께, IGHV7-4-1*02 및 IGHV1-c*01을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는, JH4, 임의로 IGKJ4*01과 함께 인간 하위군 VK1 및 VK4로부터의 경쇄 프레임워크, 임의로 IGKV4-1*01 및 IGKV1-39*01을 포함한다.
인간화 항체는 해당 인간화 항체의 친화도, 안정성 또는 기타 특성을 증대시키기 위하여 인간 프레임워크 서열에 하나 이상의 복귀 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
다른 양상에 있어서, 2B12 또는 10G5의 인간화 버전인 특정 인간화 항체가 제공된다. 이러한 항체는 전형적으로 인간 프레임워크 서열 내의 2B12 또는 10G5 CDR로부터 주된 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
항체 10 G5
항체 10G5의 인간화 VH 및 VL 아미노산 서열의 예는 각각 서열번호 13 내지 17 및 8 내지 12에 표시되어 있다. 일 양상에 있어서, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 인간화 항체가 제공되되, 여기서 항체는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 SYTMH, 또는 그의 적어도 3 또는 4개의 아미노산의 서열을 포함하는 HCDR1 영역; 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 YINPSSGYTENNRKF, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산을 포함하는 HCDR2 영역; 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 LGKGLLPPFDY, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산을 포함하는 HCDR3 영역; 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 RASENIYSNLA, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산을 포함하는 LCDR1 영역; 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 AATNLAD, 또는 그의 적어도 3, 4 또는 5개의 연속 아미노산을 포함하는 LCDR2 영역; 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 QHFWGTPYT, 또는 그의 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 연속 아미노산을 포함하는 LCDR3 영역을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 하기를 포함하는, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 인간화 10G5 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
(d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2;
(f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및
(g) 인간 프레임워크 서열.
일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 JH6과 함께 인간 하위군 VH1로부터 중쇄 프레임워크를 포함하고, 임의로 항체는 IGHJ6*01과 함께 IGHV1-46*03을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 인간 하위군 VK1로부터의 경쇄 프레임워크, 임의로 IGKV1-NL1*01을 포함한다.
임의로 인간 프레임워크는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 복귀 돌연변이를 포함한다. 실시예 1은 10G5 가변 영역에 대한 프레임워크 및 복귀 돌연변이의 동정을 나타낸다. 키메라 10G5와 비교해서, 시험된 이들 돌연변이체는 검정법에서 이용된 두 mAb 농도에서 견줄만한 결합 프로파일을 나타내었다. 이와 같이 해서 본 발명의 실시형태는 애브넘 넘버링을 이용해서 이하의 잔기 중 임의의 하나 이상(또는 이들의 임의의 조합)에서 복귀 돌연변이를 가진 복귀-돌연변이된 10G5 중쇄 변이체를 포함한다:
10G5 VH: 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72a, 75.
따라서 본 발명의 추가의 실시형태는 이하의 잔기 중 임의의 하나 이상(또는 이들의 임의의 조합)에서 복귀 돌연변이를 가진 복귀-돌연변이된 10G5 경쇄 변이체를 포함한다:
10G5 VL: 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76, 100.
인간화 항체는, 인간화 항체의 친화도, 안정성 또는 기타 특성을 증대시키기 위하여 인간 프레임워크 서열에 하나 이상의 추가의 돌연변이(예컨대 복귀 돌연변이)를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 하기를 포함하는, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 인간화 10G5 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
(d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2;
(f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및
(g) 인간 프레임워크 서열, 여기서 글루타민(Q) 잔기는 VH 도메인의 39번 위치에 그리고 VL 도메인의 38번 위치에 존재한다. 임의로, 인간 프레임워크 서열은 하나 이상의 복귀 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
39번 위치에서의 글루타민(Q) 잔기는 인간 VH 프레임워크 서열에 천연적으로 존재할 수 있거나, 또는 서열의 아미노산 치환 또는 기타 변형에 의해 도입될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 서열번호 13 내지 17의 10G5의 VH 도메인에 대해서 적어도 약 80% 서열 동일성(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 그 이상의 동일성)을 가진 VH 도메인을 포함하는 인간화 항체를 제공한다. 다른 특정 양상에 있어서, 본 발명은 (a) 인간 VH 도메인 내로 도입된 비-인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 13 내지 17의 인간화 10G5 VH에 대해서 적어도 약 80%(예컨대 적어도 90%, 95%, 97%, 98%) 동일함), 및 (b) (a) 비-인간 VL 도메인 내로 도입된 비-인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 8 내지 12의 인간화 10G5 VL에 대해서 적어도 약 80%(적어도 90%, 95%, 97%, 98%) 동일함)을 포함하는, KIR3DL2에 결합하는 인간화 항체를 제공한다.
항체 2B12
항체 2B12의 인간화 VH 및 VL 아미노산 서열의 예가 각각 서열번호 24 내지 28 및 29 내지 33에 표시되어 있다. 일 양상에 있어서, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 인간화 항체가 제공되되, 여기서 항체는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 TAGMQ, 또는 그의 적어도 3 또는 4개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 HCDR1 영역; 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 WINSHSGVPKYAEDFK, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 HCDR2 영역; 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 GGDEGVMDY, 또는 그의 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 연속 아미노산을 포함하는 HCDR3 영역; 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 KASQDVSTAVA, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 LCDR1 영역; 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 WTSTRHT, 또는 그의 적어도 3, 4 또는 5 연속 아미노산의 서열을 포함하는 LCDR2 영역; 및/또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 QQHYSTPWT, 또는 그의 적어도 4, 5, 6, 7 또는 8개의 연속 아미노산을 포함하는 LCDR3 영역을 포함한다.
본 명세서에서의 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 CDR 1, 2 및 3 중 어느 하나는 그의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열, 및/또는 대응하는 서열번호에 나열된 특정 CDR 또는 CDR들의 세트와 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 할 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 하기를 포함하는, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드와 결합하는 단리된 인간화 2B12 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
(d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(e) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2;
(f) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및
(g) 인간 프레임워크 서열.
일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 JH6과 함께 인간 하위군 VH1 및/또는 VH7로부터의 중쇄 프레임워크를 포함하고, 임의로 항체는 IGHJ6*01과 함께 IGHV7-4-1*02 및/또는 IGHV1-c*01을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 JH4과 함께 인간 하위군 VK1 및/또는 VK4로부터의 경쇄 프레임워크, 임의로 IGKV4-1*01 및/또는 IGKV1-39*01, 임의로 IGKJ4*01을 포함한다.
임의로 인간 프레임워크는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 복귀 돌연변이를 포함한다. 실시예 1은 2B12 가변 영역에서 프레임워크 및 복귀 돌연변이의 확인을 나타낸다. 키메라 2B12와 비교해서, 이들 시험된 돌연변이체는 검정법에서 이용된 두 mAb 농도에서 견줄만한 결합 프로파일을 나타내었다. 이와 같이 해서 본 발명의 실시형태는, 애브넘 넘버링을 이용해서 이하의 잔기 중 임의의 하나 이상(또는 이들의 임의의 조합)에서 복귀 돌연변이를 가진 복귀-돌연변이된 2B12 중쇄 변이체를 포함한다:
2B12 VH: 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72c, 91, 108.
이와 같이 해서 본 발명의 추가의 실시형태는 이하의 잔기 중 임의의 하나 이상(또는 이들의 임의의 조합)에서 복귀-돌연변이된 2B12 경쇄 변이체를 포함한다:
2B12 VL: 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78, 104.
인간화 항체는, 예컨대, 인간화 항체의 친화도, 안정성 또는 기타 특성을 증대시키기 위하여 인간 프레임워크 서열에 하나 이상의 추가의 돌연변이(예컨대, 복귀 돌연변이)를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 하기를 포함하는, 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 인간화 2B12 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
(d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(e) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2;
(f) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및
(g) 인간 프레임워크 서열, 여기서 글루타민(Q) 잔기는 VH 도메인의 39번 위치에 그리고 VL 도메인의 38번 위치에 존재한다. 임의로, 인간 프레임워크 서열은 하나 이상의 복귀 돌연변이를 더 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 서열번호 29 내지 33의 2B12 또는 인간화 2B12의 VH 도메인에 적어도 약 80%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그 이상의 동일성)을 가진 VH 도메인을 포함하는 인간화 항체를 제공한다. 다른 특정 양상에 있어서, 본 발명은, 하기를 포함하는, KIR3DL2에 결합하는 인간화 항체를 제공한다: (a) 인간 VH 도메인 내에 혼입된 비-인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인(여기서, VH 도메인은 서열번호 29 내지 33의 인간화 2B12 VH에 대해서 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 90%, 95%, 97%, 98%) 동일함) 및 (b) (a) 인간 VL 도메인 내에 혼입된 비-인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 24 내지 28의 인간화 2B12 VL과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 90%, 95%, 97%, 98%) 동일함).
39번 위치에서 글루타민(Q) 잔기는 인간 VH 프레임워크 서열에 자연적으로 존재할 수 있거나, 또는 서열의 아미노산 치환 또는 변형에 의해 도입될 수 있다.
10G5 또는 2B12 항체는 인간 IgG 불변 도메인(예컨대 IgG1, IgG4)을 더 포함할 수 있다. 임의로 불변 도메인은 Fc 수용체 결합을 증가시키기 위한 변형을 포함하는 IgG1 도메인이다. 임의로 불변 도메인은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위한 변형을 포함하는 IgG 도메인(예컨대 IgG1, IgG4)이다.
인간화 항체의 재조합 생산을 위하여, 인간화 VH 및 VL 영역, 또는 그의 변이체 버전은, 표준 재조합 방법에 따라 인간 항체로부터 전장 또는 절단된 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다(예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 참조). 결과는 선택된 VH 및 VL 영역과 불변 영역을 포함하는 관심대상 인간화 항체 분자를 발현하고 분비하는 형질주입된 세포주이다. 인간 항체의 불변 영역을 암호화하는 cDNA 서열은 공지되어 있다.
필요한 경우, 인간화 항체의 종류는 또한 공지된 방법에 의해 "변환"될 수 있다. 종류 변환(class switching) 수법은 하나의 IgG 아류를 다른 것으로 전환, 예컨대, IgG1에서 IgG2로 전환시키는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 효과기 기능은 각종 치료 용도에 대해서 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 항체로 동형 변환됨으로써 변화될 수 있다.
각종 형태의 인간화 항체(예컨대 10G5 및 2B12)가 상정된다. 예를 들어, 인간화 항체는, 항체 단편, 예컨대, Fab 또는 본 명세서에 기재된 기타 종류의 단편일 수 있다. 대안적으로, 인간화 항체는 전장 또는 무손상 항체, 예컨대, 전장 또는 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체일 수 있다. 불변 영역은 공지된 방법에 따라서 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, IgG4 불변 영역에서, 잔기 S241은 힌지에서 완전한 다이설파이드 가교 형성을 허용하도록 프롤린(P) 잔기로 돌연변이될 수 있다(예컨대, 문헌[Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8] 참조).
일 실시형태에 있어서, KIR3DL2 봉쇄(예컨대 KIR3DL2의 그의 HLA 리간드에 의한 결합의 저해)가 KIR3DL2 발현 세포의 (예컨대 CDC 또는 ADCC를 통한) 결실 없이 요망되는 경우, 인간화 항체는 전장 IgG4 항체 또는 그의 단편이다. 일 실시형태에 있어서, KIR3DL2 발현 세포의 (예컨대 CDC 또는 ADCC를 통한) 결실 없이 요망되는 경우, 인간화 항체는 Fc 수용체(예컨대 CD16)에 결합하는 Fc 영역을 포함하는 전장 IgG1 항체 또는 그의 단편이다. 항체는, 예컨대 Fc 수용체 결합을 증가시키기 위한 변형을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인을 더 포함할 수 있다.
ADCC 및 CDC를 유도하기 위한 항-KIR3DL2 항체(특히 비내재화 항체)의 능력에 비추어, 항체는 또한 항체-의존적 세포독성, 비만세포 탈과립, 및 식세포 작용 등과 같은 효과기 기능뿐만 아니라, 림프구 증식의 조절 및 항체 분비 등과 같은 면역조절 신호에 영향을 미칠 수 있는 Fc 수용체에 결합하는 그의 능력을 증가시키는 변형이 실시될 수 있다. 전형적인 변형은 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대 치환, 결실, 삽입), 및/또는 변형된 유형의 글리코실화, 예컨대, 하이포푸코실화를 포함하는 변형된 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 이러한 변형은 Fc 수용체: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD 16)과의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A) 및 FcγRIII(CD 16)은 활성화(즉, 면역계 증대) 수용체인 한편 FcγRIIB(CD32B)는 저해(즉, 면역계 약화) 수용체이다. 변형은, 예를 들어, 효과기(예컨대 NK) 세포 상에서 Fc 도메인의 FcγRIIIa에의 결합을 증가시킬 수 있다. 변형의 예는 PCT/EP2013/069302(출원일: 2013년 9월 17일)(이의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 제공된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체는 Fc 영역의 CH3 도메인에 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 변형을 소유하는) 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인에 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 변형을 소유하는) 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 이것은 아미노산 231 내지 341로부터 연장되는 것으로 정의된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 변형을 소유하는) 적어도 2개의 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이러한 변형은 CH3 영역에 있고 적어도 하나의 이러한 변형은 CH2 영역에 있다. 힌지 영역 내의 아미노산 변형도 포괄된다. 일 실시형태에 있어서, Fc 영역의 CH1 도메인에서의 아미노산 변형이 포괄되며, 이는 아미노산 216 내지 230의 연장으로서 정의된다. Fc 변형의 임의의 조합, 예를 들어, 미국 특허 제7,632,497호; 제7,521,542호; 제7,425,619호; 제7,416,727호; 제7,371,826호; 제7,355,008호; 제7,335,742호; 제7,332,581호; 제7,183,387호; 제7,122,637호; 제6,821,505호 및 제6,737,056호; PCT 공보 번호 WO2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 및 WO 04/063351; 그리고 문헌[Lazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 및 Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604]에 개시된 상이한 변형의 임의의 조합이 실시될 수 있다.
항-KIR3DL2 항체는 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해서 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 변형을 소유하는) 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하므로, 그 분자는 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해서 증대된 효과기 기능을 지니며, 임의로 변이체 Fc 영역은 221, 239, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399, 402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 및/또는 439번 위치 중 임의의 하나 이상에서 치환을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 항-KIR3DL2 항체는 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있고, 여기서 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해서 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 변형을 소유하는) 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하므로, 그 분자는 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해서 증대된 효과기 기능을 지니며, 임의로 변이체 Fc 영역은 239, 298, 330, 332, 333 및/또는 334번 위치 중 임의의 하나 이상에 치환(예컨대 S239D, S298A, A330L, I332E, E333A 및/또는 K334A 치환)을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 변이체 또는 야생형 Fc 영역을 가진 항체는 항체의 Fc 수용체 결합 능력을 증가시키는 변화된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변화된 글리코실화 기구를 지니는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변화된 글리코실화 기구를 지니는 세포는 당업계에 기술된 바 있으며, 이는 제조합 항체를 발현함으로써 변화된 글리코실화를 지니는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1]뿐만 아니라, 유럽 특허 번호 EP 1,176,195; PCT 공보 WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/54342(각각은 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨) 참조. 일 양상에 있어서, 항체는 그의 불변 영역에서 하이포푸코실화된다. 이러한 항체는 아미노산 변화를 포함할 수 있거나 또는 아미노산 변화를 포함하지 않지만 이러한 하이포푸코실화를 수득하기 위한 조건 하에서 생산되거나 처리될 수 있다. 일 양상에 있어서, 항체 조성물은 본 명세서에 기재된 키메라, 인간 또는 인간화 항체를 포함하되, 여기서 조성물 중의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 75, 85, 90, 95% 또는 실질적으로 전체 항체종이 푸코스를 결여하는 코어 탄수화물 구조(예컨대, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)를 포함하는 불변 영역을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 푸코스를 가진 코어 탄수화물 구조를 포함하는 항체가 없는 항체 조성물이 제공된다. 코어 탄수화물은 바람직하게는 Asn297에서의 당쇄(sugar chain)일 수 있다.
항- KIR3DL2 항체 생산
항체는 당업계에 공지된 각종 수법에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 이것은 KIR3DL2 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로 이용해서 비-인간 동물, 바람직하게는 마우스의 면역화에 의해 생산된다. 항체는 또한 면역글로불린의 조합적 라이브러리의 선택에 의해 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항-KIR3DL2 항체를 암호화하는 단리된 핵산뿐만 아니라, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 일 양상에 있어서, 본 발명에 따른 제제를 암호화하는 핵산 단편이 제공된다. 일 양상에 있어서, 본 발명에 따른 제제를 암호화하는 핵산 단편은 DNA 및 RNA 단편으로부터 선택된다. 또한 예컨대 핵산이 발현되고 인간화 항체가 생산되도록 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 적절한 숙주 세포를 배양하는 등과 같은 재조합 수법을 이용해서 이러한 항-KIR3DL2 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 배양하기 전에, 숙주 세포에는, 예를 들어, 각종 중쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 그리고 각종 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 공동-형질주입될 수 있다. 부가적으로, 항체는 공지된 수법을 이용해서 숙주 세포 배양액으로부터 회수 및/또는 정제될 수 있다. 유용한 벡터, 숙주 세포, 및 수법은 이하에 더욱 설명된다.
일반적으로, 항체의 재조합 생산을 위하여, 이것을 암호화하는 핵산이 단리되고 전형적으로 하나 이상의 발현 대조 요소에 작동 가능하게 연결된, 추가의 클로닝(DNA의 증폭)을 위하여 또는 발현을 위하여 복제 가능한 벡터 내로 삽입된다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 용이하게 단리되고, 통상의 절차를 사용해서(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용해서) 서열 분석된다. 많은 벡터가 공지되어 있고 입수 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다: 신호 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사-종결 서열.
KIR3DL2에 결합하는 하나 이상의 항체, 특히 단클론성 항체 10G5 또는 2B12와 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프의 동정은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 각종 면역학적 스크리닝 검정법들 중 어느 하나를 이용해서 용이하게 결정될 수 있다. 많은 이러한 검정법은 통상적으로 실행되고 당업계에 충분히 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 번호 5,660,827 참조). 본 명세서에 기재된 항체가 결합하는 에피토프를 실제로 결정하는 것은, 어떠한 방식으로도 본 명세서에 기재된 단클론성 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 동정하도록 요구되지 않는 것이 이해될 것이다. 광범위한 검정법 중 어느 것이라도 인간 KIR3DL2에 대한 항체의 결합을 평가하는데 이용될 수 있다. 그 중에서도, ELISA, 방사능면역검정법, 웨스턴 블로팅, 비아코어 및 기타 경쟁 검정법에 기반한 프로토콜이 사용하기에 적합하고 당업계에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 조사될 시험 항체가 상이한 공급원 동물로부터 얻어지는 경우 또는 심지어 상이한 Ig 동형인 경우, 간단한 경쟁 검정법이 이용될 수 있으며, 이때 대조군(항체, 예컨대, 10G5 또는 2B12)과 시험 항체를 혼합(또는 사전 흡착)시키고 KIR3DL2 폴리펩타이드를 함유하는 샘플에 적용한다. 웨스턴 블로팅 및 비아코어(BIACORE) 분석의 사용에 기반한 프로토콜이 이러한 경쟁 연구에서 이용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에 있어서, KIR3DL2 항원 샘플에 적용하기 전 소정 시간 기간 동안 대조군 항체(10G5 또는 2B12)를 다양한 양의 시험 항체(예컨대, 약 1:10 또는 약 1:100)와 사전 혼합한다. 다른 실시형태에 있어서, 대조군과 다양한 양의 시험 항체는 단순히 KIR3DL2 항원 샘플에 노출 동안 혼합될 수도 있다. (예컨대, 미결합 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 수법을 사용해서) 자유 항체로부터 결합된 것을 그리고 (예컨대, 종-특이적 또는 동형-특이적 2차 항체를 사용함으로써, 또는 10G5 또는 2B12를 검출 가능한 표지로 구체적으로 표지화함으로써) 시험 항체로부터 10G5 또는 2B12를 구별할 수 있는 한, 시험 항체가 항원에 대한 10G5 또는 2B12의 결합을 저감시키는지의 여부를 판정할 수 있으며, 이것은 시험 항체가 10G5 또는 2B12와 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는 것을 나타낸다. 완전히 무관한 항체의 부재 시 (표지된) 대조군 항체의 결합은 대조군 높은 값으로서 역할할 수 있다. 대조군 낮은 값은 정확히 동형(10G5 또는 2B12)의 표지되지 않은 항체로 표지된 (10G5 또는 2B12) 항체를 배양함으로써 얻어질 수 있고, 여기서 경쟁이 일어나서 표지된 항체의 결합을 저감시킬 것이다. 시험 검정법에서, 시험 항체의 존재 시 표지된 항체 반응성의 유의한 저감은, 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하고 표지된 (10G5 또는 2B12) 항체와 "교차-반응" 또는 경쟁하는 시험 항체를 나타낸다. KIR3DL2 항원에 대한 10G5 또는 2B12의 결합을 약 1:10 내지 약 1:100 사이의 10G5 또는 2B12:시험 항체의 임의의 비에서 적어도 약 50%, 예컨대, 적어도 약 60% 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 90%(예컨대, 약 65 내지 100%)만큼 저감시키는 임의의 시험 항체는, 10G5 또는 2B12와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체인 것으로 고려된다. 바람직하게는, 이러한 시험 항체는 KIR3DL2 항원에 대한 10F6의 결합을 적어도 약 90%(예컨대, 약 95%)만큼 저감시킬 것이다.
경쟁은 또한, 예를 들어, 유세포분석 시험에 의해 평가될 수 있다. 이러한 시험에서, 주어진 KIR3DL2 폴리펩타이드를 보유하는 세포가 먼저 예를 들어 10G5 또는 2B12와 배양될 수 있고, 이어서 시험 항체가 형광색소 또는 바이오틴으로 표지된다. 항체는 포화량의 10G5 또는 2B12에 의한 사전 배양 시 얻어진 결합이 10G5 또는 2B12에 의한 사전 배양하지 않은 항체에 의해서 얻어진 결합(형광 수단에 의해 측정됨)의 약 80%, 바람직하게는, 약 50%, 약 40% 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)이면 10F6과 경쟁한다고 일컬어진다. 대안적으로, 항체는 포화량의 시험 항체로 사전 배양된 세포 상에서 10G5 또는 2B12 항체에 의해 얻어진(형광색소 또는 바이오틴에 의해) 결합이 시험 항체의 사전 배양 없이 얻어진 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 또는 그 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)이면 10G5 또는 2B12와 경쟁한다고 일컬어진다.
시험 항체가 사전 흡착되어 KIR3DL2 항원이 고정화되는 표면에 포화 농도로 도포되는 단순 경쟁 검정법이 또한 이용될 수 있다. 단순 경쟁 검정법의 표면은 바람직하게는 비아코어(BIACORE) 칩(또는 표면 플라스몬 공명 분석에 적합한 다른 매체)이다. 대조군 항체(예컨대, 10G5 또는 2B12)는 이어서 KIR3DL2-포화 농도 및 KIR3DL2에서 표면과 접촉하게 되고, 대조군 항체의 표면 결합이 측정된다. 대조군 항체의 이러한 결합은 시험 항체의 부재 시 KIR3DL2-함유 표면에 대한 대조군 항체의 결합과 비교된다. 시험 검정법에서, 시험 항체의 존재 시 대조군 항체에 의한 KIR3DL2-함유 표면의 결합의 유의한 저감은, 시험 항체가 대조군 항체와 "교차-반응"하도록 시험 항체가 대조군 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는 것을 나타낸다. KIR3DL2 항원에 대한 대조군(예컨대, 10G5 또는 2B12) 항체의 결합을 적어도 약 30% 이상, 바람직하게는 약 40%만큼 저감시키는 임의의 시험 항체는, 대조군(예컨대, 10G5 또는 2B12)과 실질적으로 동일한 에포토프 또는 결정자에 결합하는 항체인 것으로 고려될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 시험 항체는 KIR3DL2 항원에 대한 대조군 항체(예컨대, 10G5 또는 2B12)의 결합을 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 또는 그 이상)만큼 저감시킬 것이다. 대조군 및 시험 항체의 수순이 역전될 수 있는 것: 즉, 대조군 항체가 먼저 표면에 결합될 수 있고 시험 항체가 경쟁 검정법에서 그후 표면과 접촉하게 되는 것이 이해될 것이다. 바람직하게는, KIR3DL2 항원에 대해서 더 높은 친화도를 가진 항체가 먼저 표면에 결합되는데, 그 이유는 제2 항체(항체가 교차-반응하는 것으로 가정)에 대해서 보여지는 결합의 저감이 커다란 정도가 될 것으로 예상되기 때문이다. 이러한 검정법의 추가의 예는, 예컨대, 문헌[Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41](이의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 제공된다.
바람직하게는, KIR3DL2 에피토프를 인식하는 단클론성 항체는 심지어 모든 관련 세포, 예컨대, 악성 CD4+ T 세포, SS 또는 MF 환자로부터의 세포의 실질적인 퍼센트로 존재하는 에피토프와 반응할 것이지만, 다른 세포, 즉, KIR3DL2를 발현하지 않는 세포와는 유의하게 반응하지 않을 것이다. 일 양상에 있어서, 항-KIR3DL2 항체는 KIR3DL2와 결합하지만 KIR3DL1 및/또는 KIR3DS1와는 결합하지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 KIR3DL2-양성 세포의 발현을 특징으로 하는 질환을 가진 개체 또는 개체, 즉, 항-KIR3DL2 항체를 이용하는 본 명세서에 기재된 방법들 중 하나를 이용한 치료를 위한 후보인 개체로부터의 KIR3DL2-발현 세포에 결합될 것이다. 따라서, 일단 세포 상에서 KIR3DL2를 특이적으로 인식하는 항체가 얻어지면, 이것은 SS 또는 MF 등과 같은 장애를 가진 환자로부터 채취한 KIR3DL2-양성 세포(예컨대 악성 CD4+ T 세포)에 결합하는 그의 능력에 대해서 시험될 수 있다. 특히, 본 항체 중 하나로 환자를 치료하기 전에, 환자에서 그 치료가 유익할 것 같은 우도를 최대화하기 위하여, 예컨대 혈액 샘플에서 환자로부터 채취한 악성 세포를 결합하는 항체의 능력을 시험하는 것이 유익할 것이다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 KIR3DL2-발현 세포, 예컨대 악성 CD4+ T 세포, 전염증성 CD4+ 세포에 결합하는 그의 능력을 시험하기 위하여 면역 검정법에서 검증된다. 예를 들어, 말초 혈액 림프구(PBL)는 복수의 환자로부터 채취되고, CD4+ T 세포는, 예컨대, 관련된 항체를 이용한 유세포측정에 의해 PBL로부터 풍부해지고(악성 CD4+ 세포에 대해서는, 예컨대, 문헌[Bagot et al. (2001) Blood 97:1388-1391](이의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨) 참조), 또는 CD4+CD28-세포 분획은 MACS 칼럼(밀테니 바이오텍사) 상에서의 자성 분리에 의해 단리된다. 세포에 결합하는 주어진 항체의 능력은 이어서 당업자에게 충분히 공지된 표준 방법을 이용해서 평가된다. 유의한 퍼센트의 개체 또는 환자(예컨대, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상)로부터 KIR3DL2, 예컨대 T 세포를 발현하는 것으로 알려진 세포의 실질적인 부분(예컨대, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상)에 결합하는 것으로 판명된 항체는, 여기에서 사용하기 위하여, 환자에서 악성 T 세포의 존재 또는 수준을 결정하기 위한 진단 목적으로 또는 본 명세서에 기재된 치료 방법에서 사용하기 위하여, 예컨대, 악성 T 세포수 또는 활성을 증감시키기 위한 용도에서 양쪽 모두에 대해서 적합하다. 세포에 대한 항체의 결합을 평가하기 위하여, 항체는 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 직접 표지된 경우, 2차적인 표지된 항체가 전형적으로 부가된다. 이어서 세포에 대한 항체의 결합은, 예컨대, 세포형광측정 분석(예컨대 FACScan)을 이용해서 검출될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
항체가 에피토프 영역 내에서 결합하는지의 여부의 판정은 당업자에게 알려진 방식에서 수행될 수 있다. 이러한 매핑/특성 규명 방법의 일례로서, 항-KIR3DL2 항체에 대한 에피토프 영역은 KIR3DL2 단백질에서 노출된 아민/카복실의 화학적 변형을 이용한 에포토프 "풋-프린딩"에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A] 참조. 적절한 에피토프 동정 수법의 다른 예는 핵자기공명 에피토프 매핑(NMR)이다. 예컨대, 문헌[Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al. Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); 및 Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24] 참조. 에피토프 매핑/특성 규명은 또한 질량 분광분석법을 이용해서 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌[Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 및 Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-801] 참조. 부위-지향된 돌연변이유발은 결합 에피토프의 해명을 위하여 유용한 다른 수법이다. 예를 들어, "알라닌-스캐닝"에서, 단백질 세그먼트 내의 각 잔기는 알라닌 잔기와 교체되고, 결합 친화도에 대한 결과가 측정된다. 예컨대, 문헌[Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; 및 Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6] 참조. 에피토프 평가를 위한 "비표지"(label-free) 검정법의 다른 형태는 표면 플라스몬 공명(SPR, 비아코어) 및 반사율계 간섭 분광법(reflectometric interference spectroscopy: RifS)을 포함한다. 예컨대, 문헌[Faegerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroeger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944] 참조.
또한 본 명세서에 기재된 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 PCT 출원 번호 PCT/EP2013/069302(출원일: 2013년 9월 17일)에 기재된 KIR3DL2 돌연변이체 폴리펩타이드에 결합하기 위한 검정법 또는 예시적인 경쟁 검정법 중 하나 이상에서 검정될 수 있는 것에 유의해야 한다. KIR3DL2 돌연변이체로 형질주입된 세포에 항-KIR3DL2 항체를 결합하는 것이 측정되고 야생형 KIR3DL2 폴리펩타이드(서열번호 1)에 결합하는 항-KIR3DL2 항체의 능력과 비교된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 돌연변이 KIR3DL2 폴리펩타이드와 항-KIR3DL2 항체 간의 결합의 저감은 결합 친화도의 저감(예컨대, 공지된 방법인 이러한 특정 돌연변이체를 발현하는 세포의 FACS 시험에 의해 또는 돌연변이체 폴리펩타이드에 결합하는 비아코어(Biacore) 시험에 의해 측정됨) 및/또는 항-KIR3DL2 항체의 총 결합능의 저감(예컨대, 항-KIR3DL2 항체 농도 대 폴리펩타이드 농도의 플롯에서 Bmax의 감소에 의해 입증됨)이 있는 것을 의미한다. 결합의 유의한 저감은, 항-KIR3DL2 항체가 KIR3DL2에 결합되는 경우 돌연변이된 잔기가 항-KIR3DL2 항체에 대한 결합에 직접 연루되거나 또는 결합 단백질에 밀접한 근위에 있는 것을 나타낸다. 항체 에피토프는 따라서 바람직하게는 이러한 잔기를 포함할 것이고 이러한 잔기에 인접한 추가의 잔기를 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 명세서에서의 항-KIR3DL2 항체는 약 104 내지 약 1011M-1(예컨대, 약 108 내지 약 1010M-1) 범위의 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 친화도를 지닌다. 예를 들어, 항체는, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR) 스크리닝(비아코어(BIAcore)(상표명) SPR 분석 장치에 의한 분석 등)에 의해 결정된, KIR3DL2에 관하여 1 x 10-9M 미만의 평균 해리 상수(Kd)를 지닐 수 있다. 더욱 특별한 예시적인 양상에 있어서, 항체는 KIR3DL2에 대해서 약 1 x 10-8M 내지 약 1 x 10-10M, 또는 약 1 x 10-9M 내지 약 1 x 10-11M의 Kd를 지닐 수 있다.
항체는 예를 들어 약 100, 60, 10, 5 또는 1 나노몰 이하(즉, 이들보다 양호한 친화도)의 평균 Kd를 특징으로 할 수 있다. Kd는 칩 표면 상에 재조합적으로 생산된 인간 KIR3DL2 단백질을 고정화하고 나서 용액 중 시험될 항체의 인가에 의해 결정될 수 있다.
일단 항원-결합 화합물이 얻어지면, 일반적으로 KIR3DL2-발현 표적 세포 내로의 내재화(항체는 바람직하게는 내재화되지 않을 것임) 및/또는 KIR3DL2-발현 표적 세포 내로의 KIR3DL2 내재화를 일으키고/키거나 KIR3DL2-발현 표적 세포를 향하여 ADCC 또는 CDC를 유도하고/하거나 이 세포의 전염증성 활성 및/또는 증식을 저해하고/하거나 이 세포의 제거를 유발하는 능력에 대해서 평가될 것이다. ADCC, CDC를 내재화 또는 유도하거나, 일반적으로 KIR3DL2-발현 표적 세포의 활성의 제거 또는 저해를 초래하는 항원-결합 화합물의 능력을 평가하는 것은, 예컨대, 본 명세서에서 예들이 제공되는 바와 같이, 상기 방법의 임의의 적절한 단계에서 수행될 수 있다. 이 평가는 치료적 용도를 위하여 정해진 항체(또는 다른 화합물)의 동정, 생산 및/또는 개발에 연루된 각종 단계 중 하나 이상에서 유용할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "내재화"되지 않거나 "내재화"하지 않는 항-KIR3DL2 항체는 포유동물 세포(즉 세포 표면 KIR3DL2) 상의 KIR3DL2에 결합 시 세포에 의해 실질적으로 흡장(즉, 유입)되지 않는 것이다. 비-내재화 항체는 물론 항체 단편, 인간 또는 인간화 항체 및 항체 접합체를 포함할 것이다.
항-KIR3DL2 항체가 포유동물 세포 상의 KIR3DL2에 결합할 때 내재화하는 지의 여부 또는 KIR3DL2 폴리펩타이드가 (예컨대, 항체에 의해 결합될 때) 세포내 내재화를 받는지의 여부는 PCT 출원 번호 PCT/EP2013/069302(출원일: 2013년 9월 17일)(이의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨) 에 기재된 실험예에 기재된 것들을 포함하는 각종 검정법에 의해 결정될 수 있다.
ADCC의 시험은 전형적으로 결합된 항-KIR3DL2 항체를 가진 KIR3DL2-발현 표적 세포(예컨대 Cou-L 세포, 세자리 증후군 세포 또는 그 표면 KIR3DL2를 발현하도록 만들어진 임의의 세포)가 상보체의 연루 없이도 효과기 세포 보유 Fc 수용체에 의해 인지되는 세포-매개 세포독성의 평가를 포함한다. KIR3DL2 항원을 발현하지 않는 세포는 임의로 대조군으로서 이용될 수 있다. NK 세포 세포독성의 활성화는 사이토카인 생산(예컨대 IFN-γ 생산) 또는 세포독성 마커(예컨대 CD107 가동화)의 증가를 측정함으로써 평가된다. 바람직하게는 항체는, 대조군 항체(예컨대, KIR3DL2에 결합하지 않는 항체, 쥣과 불변 영역을 가진 KIR3DL2 항체)에 비해서, 표적 세포의 존재 시 적어도 20%, 50%, 80%, 100%, 200% 또는 500%의 사이토카인 생산, 세포독성 마커의 발현 또는 표적 세포 용해의 증가를 유도할 것이다. 다른 예에서, 표적 세포의 용해는 예컨대 크롬 방출 검정법에서 검출되고, 바람직하게는 항체는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%의 표적 세포의 용해를 유도할 것이다. 항원-결합 화합물이 (a) 두 ADCC를 유도하고 (b) KIR3DL2-발현 세포 내로 내재화시키고/시키거나 KIR3DL2 내재화를 유도하는 그의 두 능력에 대해서 시험되는 경우, 검정법은 임의의 수순으로 수행될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 항체는 KIR3DL2(예컨대 B27 2량체(B272) 4량체)의 HLA 리간드를 KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 것을 간섭하는 그의 능력에 대해서 시험된다. 예컨대, PCT 출원 번호 PCT/EP2013/069302에 기재된 검정법 참조.
약제학적 제형
일 양상에 있어서, 약제로서 이용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다. 일 양상에 있어서, 악성 신생물, 염증성 장애 또는 자가면역 질환의 치료에서 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.
일 양상에 있어서, 인간 환자에서 KIR3DL2-발현 세포를 제거 또는 결핍시키기 위한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 담체와 함께 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 1 ㎎/㎖ 내지 500 ㎎/㎖의 농도에서 존재하는 이러한 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공하는 것이며, 여기서 상기 제형의 pH는 2.0 내지 10.0이다. 제형은 완충계, 보존제(들), 긴장성 제제(들), 킬레이트제(들), 안정제 및 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 약제학적 제형은 수성 제형, 즉, 물을 포함하는 제형이다. 이러한 제형은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가의 실시형태에 있어서, 약제학적 제형은 수성 제형이다. 용어 "수성 제형"은 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 제형으로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수성 용액"은 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 실시형태에 있어서, 약제학적 제형은 냉동-건조된 제형이며, 여기에 의사나 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
다른 실시형태에 있어서, 약제학적 제형은 어떠한 사전 용해 없이 사용 준비된 건조된 제형(예컨대, 냉동 건조 또는 분무 건조)이다.
추가의 양상에 있어서, 약제학적 제형은 이러한 항체 및 완충제의 수용액을 포함하며, 여기서 항체는 1 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 존재하고, 상기 제형의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 약 6, 약 8 미만(그리고 더욱 일반적으로 약 7.7, 7.6 또는 7.5 미만)(예컨대, 6 내지 7.4, 예컨대, 6 내지 7.4, 예컨대, 6 내지 7, 6.2 내지 7, 6.4 내지 7.4, 6.5 내지 7.5, 6.7 내지 7.7의 범위에서, 또는 약 7, 약 7.4 등에서)의 제형의 pH가 이용된다.
추가의 실시형태에 있어서, 완충제는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트르산염, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨, 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 바이신(bicine) 트라이신, 말산, 숙신산염, 말레산, 푸말산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 구체적인 완충제의 각각은 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다.
추가의 실시형태에 있어서, 제형은 약제학적으로 허용 가능한 보존제를 더 포함한다. 보존제는, 예컨대, 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 뷰틸 p-하이드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질알코올, 클로로뷰탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드유레아, 클로로헥시딘, 나트륨 데하이드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-하이드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로로페네신(3p-클로로페녹시프로판-1,2-다이올) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제는, 예컨대, 0.1 ㎎/㎖ 내지 20 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖, 또는 10 ㎎/㎖ 내지 20 ㎎/㎖의 농도에서 존재할 수 있다. 이들 특정 보존제의 각각은 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다. 약제학적 조성물 중의 보존제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 참고된다.
추가의 실시형태에 있어서, 제형은 등장화제를 더 포함한다. 등장화제는, 예컨대, 염(예컨대 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예컨대 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예컨대 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판다이올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판다이올, 1,3-뷰탄다이올) 폴리에틸렌글리콜(예컨대 PEG400), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 임의의 당, 예컨대, 단당류, 이당류 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸, 예를 들어, 프럭토스, 글루코스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카복시메틸셀룰로스-Na가 사용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 --OH기를 가진 C4-C8 탄화수소로서 정의되고, 예를 들어, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 위에서 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합해서 이용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제제에 가용성이고 본 발명의 방법을 이용해서 달성되는 가용화 효과에 악영향을 주지 않는 한 사용량에 고정된 제한은 없다. 당 또는 당 알코올 농도는, 예컨대, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖일 수 있다. 등장화제는, 예컨대, 1 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 내지 7 ㎎/㎖, 8 ㎎/㎖ 내지 24 ㎎/㎖, 또는 25 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖의 농도로 존재할 수 있다. 이들 구체적인 등장화제의 각각은 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다. 약제학적 조성물 중에 등장화제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 참조된다.
추가의 실시형태에 있어서, 제형은 킬레이트제를 더 포함한다. 킬레이트제는, 예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 및 아스파르트산, 그리고 이들의 혼합물의 염으로부터 선택될 수 있다. 킬레이트제는, 예를 들어, 0.1 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 내지 2 ㎎/㎖, 또는 2 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖의 농도로 존재할 수 있다. 이들 구체적인 킬레이트제의 각각이 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다. 약제학적 조성물 중의 킬레이트제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 참조된다.
제형은 안정제를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 약제학적 조성물 중의 안정제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 참조된다. 더욱 특히, 본 발명의 조성물은 안정화된 액체 약제학적 조성물일 수 있고, 그의 치료적 활성 성분들은 액체 약제학적 제형의 보관 동안 가능하게는 응집물 형성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. "응집물 형성"이란 올리고머의 형성을 초래하는 폴리펩타이드 분자들 간의 물리적 상호작용이 의도되며, 이는 여전히 가용성일 수 있고 또는 용액으로부터 석출되는 대형의 가시적 응집물일 수 있다. "보관 동안"이란 일단 제조되었지만 대상체에게 즉시 투여되지 않은 액체 약제학적 조성물 또는 제형이 의도된다. 오히려, 후속의 제조에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 액체 형태 또는 기타 형태로 나중에 재구성하기 위하여 액체 형태로, 동결된 상태로 또는 건조된 형태로 보관을 위하여 포장된다. "건조된 형태"란 액체 약제학적 조성물 또는 제형이 냉동 건조(즉, 동결건조), 분무 건조, 또는 공기 건조에 의해 건조된 것이 의도된다. 액체 약제학적 조성물의 보관 동안 폴리펩타이드에 의한 응집물 형성은 그 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 악영향을 미칠 수 있어, 약제학적 조성물의 치료 효능의 손실을 초래할 수도 있다. 또한, 응집물 형성은 폴리펩타이드-함유 약제학적 조성물이 주입 시스템을 이용해서 투여되는 경우 튜브, 막 또는 펌프의 막힘 등과 같은 기타 문제를 초래할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 조성물의 보관 동안 폴리펩타이드에 의한 응집물 형성을 저감시키기에 충분한 아미노산 염기의 양을 포함할 수 있거나 더 포함하지 않을 수 있다. "아미노산 염기"란 아미노산 또는 아미노산의 조합이 의도되며, 여기서 임의의 주어진 아미노산은 그의 유리 염기 형태로 또는 그의 염 형태로 존재한다. 아미노산들의 조합이 이용되는 경우, 아미노산의 전부가 그들의 유리 염기 형태로 존재할 수 있거나, 전부가 그들의 염 형태로 존재할 수 있거나. 일부가 그들의 유리 염기 형태로 존재할 수 있는 한편 나머지는 그들의 염 형태로 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물을 제조하는데 이용되는 아미노산은 하전된 곁사슬, 예컨대, 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 및 글루탐산을 보유하는 것들이다. 특정 아미노산(예컨대 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 임의의 입체이성질체(즉, L, D, 또는 이들의 혼합물) 또는 이들 입체이성질체의 조합은, 특정 아미노산이 그의 유리 염기 형태로 또는 그의 염 형태로 존재하는 한 본 발명의 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, L-입체이성질체가 이용된다. 본 발명의 조성물은 또한 이들 아미노산의 유사체로 제형화될 수도 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에 있어서, 메티오닌(또는 기타 황산 아미노산 또는 아미노산 유사체)이 치료제로서 작용하는 폴리펩타이드가 이러한 산화를 받기 쉬운 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩타이드인 경우 메티오닌 잔기가 메티오닌 설폭사이드로 산화되는 것을 저해하기 위하여 첨가될 수 있다. "저해한다"란, 시간 경과에 따라서 메티오닌 산화된 종들의 의도된 최소 축적이다. 메티오닌 산화의 저해 결과, 그의 적절한 분자 형태로 폴리펩타이드의 유지 시간이 더 커진다. 메티오닌의 임의의 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이의 조합물이 사용될 수 있다. 첨가될 양은 메티오닌 설폭사이드의 양이 조절제로 허용 가능하도록 메티오닌 잔기의 산화를 저해하기에 충분한 양이어야 한다. 전형적으로, 이것은 조성물이 약 10% 이하 내지 약 30%의 메티오닌 설폭사이드를 함유하는 것을 의미한다. 일반적으로, 이것은 메티오닌 잔기에 첨가된 메티오닌의 비가 약 1:1 내지 약 1000:1, 예컨대, 10:1 내지 약 100:1의 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 제형은 고분자량 중합체 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 더 포함한다. 본 발명의 추가의 실시형태에 있어서, 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카복시-/하이드록시셀룰로스 또는 이들의 유도체(예컨대 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 사이클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올로서의 황-함유 물질, 및 상이한 염(예컨대 염화나트륨)으로부터 선택된다. 이들 특정 안정제의 각각은 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다.
약제학적 조성물은 또한 그 내부에서 치료적 활성 폴리펩타이드의 안정성을 더욱 증대시키는 추가의 안정화제를 포함한다. 본 발명에 대한 특정 관심대상인 안정화제는 메티오닌 산화에 대해서 폴리펩타이드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 그리고 동결-해동 또는 기계적 전단과 연관된 응집에 대해서 폴리펩타이드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 추가의 실시형태에 있어서, 제형은 계면활성제를 더 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어, 세정제, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세라이드, 아세틸화 모노글리세라이드, 솔비탄 지방산 에스터, 폴리옥시프로필렌-폴리에틸렌 블록 중합체(예컨대, 폴록사머, 예를 들어, 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F68, 폴록사머 188 및 407, 트리톤(Triton) X-100), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예컨대, 알킬화 및 알콕실화 유도체(트윈(Tween)류, 예컨대 트윈-20, 트윈-40, 트윈-80 및 Brij-35), 모노글리세라이드 또는 그의 에톡실화 유도체, 다이글리세라이드 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알코올, 글리세롤, 렉틴 및 인지질(예컨대, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 다이포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 인지질의 유도체(예컨대, 다이팔미토일 포스파티드산) 및 라이소인지질(예컨대, 팔미토일 라이소포스파티딜-L-세린 및 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스터) 및 라이소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬 에스터), 알콕시(알킬 에터)-유도체, 예컨대, 라이소포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 및 콜린의 라우로일 및 미리스틸 유도체, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨인 극성 헤드기의 변형, 그리고 양하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 라이소포스파티딜세린 및 라이소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로인지질(예컨대, 세팔린), 글리세로당지질(예컨대, 갈락토피라노사이드), 스핑고당지질(예컨대, 세라마이드, 강글리오사이드), 도데실포스포콜린, 달걀 라이소렉틴, 후시드산 유도체-(예컨대 나트륨 타우로-다이하이드로푸시데이트 등), 장쇄 지방산 및 그의 염 C6-C12(예컨대, 올레산 및 카프릴산), 아실카르틴 및 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화 유도체, 또는 라이신 또는 아르기닌의 곁사슬 아실화 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 천연 또는 산성 아미노산의 임의의 조합물을 포함하는 다이펩타이드의 Nα-아실화 유도체, 중성 아미노산과 2종의 하전된 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 트라이펩타이드의 Nα-아실화 유도체, DSS(도큐세이트 나트륨, CAS 등록 번호[577-11-7]), 도큐세이트 칼슘, CAS 등록 번호[128-49-4]), 도큐세이트 칼륨, CAS 등록 번호[7491-09-0]), SDS(도데실황산나트륨 또는 라우릴황산나트륨), 카프릴산나트륨, 콜산 또는 그의 유도체, 담즙산 및 그의 염 및 글리신 또는 타우린 접합체, 우르소데옥시콜산, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 타우로콜산나트륨, 글리콜산나트륨, N-헥사데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-설포네이트) 1가의 계면활성제, 양쪽성이온성 계면활성제(예컨대 N-알킬-N,N-다이메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필다이메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 양이온성 계면활성제(제4급 암모늄 염기)(예컨대 세틸-트라이메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제(예컨대, 도데실 β-D-글루코피라노사이드), 에틸렌다이아민에 프로필렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드의 순차적 첨가로부터 유도되는 4작용성 블록 공중합체인 폴록사머(예컨대, 테트로닉(Tetronic))으로부터 선택될 수 있거나, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체 또는 그의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 계의 각각은 본 발명의 대안적인 실시형태를 구성한다.
추가의 실시형태에 있어서, 제형은 EDTA(에틸렌다이아민 테트라아세트산) 및 벤즈아미딘HCl 등과 같은 프로테아제 저해제를 더 포함하지만, 기타 상업적으로 입수 가능한 프로테아제 저해제가 또한 이용될 수 있다. 프로테아제 저해제의 사용은 특히 자체촉매작용을 저해하기 위하여 프로테아제의 지모겐을 포함하는 약제학적 조성물에서 특히 유용하다. 기타 성분이 본 발명의 펩타이드 약제학적 제형에 존재할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 추가의 성분은 습윤제, 유화제, 산화방지제, 증량제(bulking agent), 긴장성 변형제(tonicity modifier), 킬레이트제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 양쪽성 이온(예컨대, 아미노산, 예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘)을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 성분은, 물론, 본 발명의 약제학적 제형의 전체적인 안정성에 악영향을 주지 않아야 한다. 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약제학적 조성물은, 수개의 부위에서, 예를 들어, 국소 부위, 예를 들어, 피부 및 점막 부위에서, 흡수를 우회시키는 부위에서, 예를 들어, 동맥내, 정맥내, 심장내 투여 그리고 흡수에 연루된 부위에서, 예를 들어, 피부내, 피부 하, 근육내 또는 복부내 투여로, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여는, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 수개의 투여 경로 중 어느 하나를 통해서, 예를 들어, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 혀, 설하, 협측, 구강내, 경구, 위장내, 비강, 폐, 예를 들어, 예를 들어, 세기관지 및 허파꽈리 또는 이들의 조합, 상피, 피부, 경피, 질, 직장, 안구를 통해서, 예를 들어, 결막, 요도 및 비경구를 통해서 행할 수 있다.
본 발명의 조성물은 수개의 투약 형태(dosage form)(즉, 제형) 중 어느 하나로, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀전, 마이크로에멀전, 다수 에멀전, 발포물, 살브(salve), 페이스트, 플라스터, 연고, 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐, 예를 들어, 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌제, 점안액, 안연고, 안린스, 질 페서리, 질 링, 질 연고, 주사액, 인 시츄 변형 용액(in situ transforming solution), 예를 들어, 인 시츄 겔링, 인 시츄 세팅, 인 시츄 침강물, 인 시츄 결정화, 주입 용액, 및 임플란트로서 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 양상들 중 어느 하나에 따른 제형의 안정성은, 그 중에서도, 고분자량 불순물(예컨대, 제형 내 항체 분자의 응집(다량체)을 제시하는 불순물)의 결여를 기반으로 특성규명될 할 수 있다. 일 양상에 있어서, 본 발명에 따른 제형은 적어도 1일, 예컨대, 적어도 약 1주일, 예컨대, 적어도 약 2주일, 적어도 1개월, 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 3개월의 약 5℃의 보관 동안 약 10% 미만(예컨대, 약 5% 이하)의 고분자량(HMW) 불순물 함량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 1년 초과, 임의로 2년 보관, 임의로 3년 보관 동안 안정적이다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 4주 초과 사용 동안 그리고 3년 이상 보관 동안 안정적이다. 본 발명의 추가의 실시형태에 있어서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 4주 초과 사용 동안 그리고 2년 초과 보관 동안 안정적이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 2주 초과 사용 동안 그리고 2년 초과 보관 동안 안정적이다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 긴장성 변형제로서 염화나트륨을 포함하는 제형을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 인산나트륨 또는 시트르산나트륨(염기) 완충제가 제형에 혼입된 제형을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 폴리솔베이트 80이 계면활성제로서 제형에 혼입된 제형을 제공한다.
본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따른 제형은 임의의 적절한 농도의 항체를 지닐 수 있다. 전형적으로, 농도는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖(예컨대, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖)이다. 하나의 예시적인 양상에 있어서, 제형은 비교적 농축된 항체 제형으로서 제공되며, 이것은 예컨대 약 10 ㎎/㎖의 농도를 가진 (전형적으로 정맥내 투여 또는 직접 비경구 주입에 의해) 투여 전에 희석되어야 하는 제형일 수 있다. 다른 예시적인 양상에 있어서, 제형은 비교적 묽은 제형, 예컨대 주입/주사-준비된 제형으로서 제공되며, 여기서 제형 중 항체의 농도는 약 0.05 ㎎/㎖ 또는 약 0.1 ㎎/㎖이다.
일 양상에 있어서, 제형은 약 1 ㎎/㎖의 항체 농도이다.
예시적인 양상에 있어서, 본 발명은, (a) 제형 중 항체의 농도가 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖가 되도록 하는 본 개시내용의 IgG 항체 분자의 양; (b) 인산나트륨 (예컨대, 제2인산나트륨/제1인산칼륨), 시트르산나트륨(예컨대 시트르산나트륨/시트르산) 또는 붕산나트륨(붕산나트륨/붕산); (c) 염화나트륨; 및 (e) 폴리솔베이트 80을 포함하는 성분들의 혼합물로부터 제조된 약제학적으로 허용 가능한 활성 제형을 제공하되, 여기서 제형은 약 6.7 내지 7.7, 또는 약 7.4의 pH를 지닌다.
추가의 양상 및 이점이 이하의 실험 부문에 개시될 것이지만, 이들은 예시적인 것으로 본 출원의 범위를 제한하지 않는 것으로 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1 - CDR 이식에 의한 인간화 항-K IR3DL2 항체의 생성
항-KIR3DL2 항체는 인간화를 위한 후보로서 PCT 출원 번호 PCT/EP2013/069302(출원일: 2013년 9월 17일)에서 얻었다.
인간화는 먼저 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 이식에 이어서 복귀 돌연변이의 도입에 의해 수행되었다. 모델링 및 설계를 위하여 사용된 마우스 모체(parental) 유전자 및 인간 유전자가 이하의 표 1에 열거되어 있다. 항체는 CHO 세포를 이용해서 생산되었다.
Figure pct00002
항체 10 G5
10G5 경쇄의 인간화 단백질 서열은 이하에 정렬되어 있다. 10G5-LC는 서열번호 34에 표시되어 있다. IGKV1-NL1은 서열번호 35에 표시되어 있다. Hum2C4는 서열번호 36에 표시되어 있다. 3RKD는 서열번호 37에 표시되어 있다. CDR은 10G5-LC에 밑줄 그어 있고, 복귀 돌연변이는 -L1 내지 -L5 변이체에 밑줄 그어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
인간화 항체 2C4(항-ErbB2; pdb 1S78 및 1L7I) 및 마우스 항체 8C11(항-E형 간염 바이러스 캡시드 단백질; pdb 3RKD)이 구조 예상 평가를 위한 주형으로서 이용되었다. 모체 JK 세그먼트는 모체 프레임워크 2(FW2)(이웃한 측접 잔기를 포함함)의 버니어 영역(Vernier zone) 잔기뿐만 아니라 변형되지 않은 채로 유지되었다. 따라서, L2 경쇄는 추가의 복귀 돌연변이를 위한 기본적인 출발 주형으로서 이용되었다.
4개의 경쇄 L2, L3, L4 및 L5가 최종적으로 항체 생성을 위하여 채택되었다.
10G5 중쇄의 인간화 단백질 서열은 이하에 정렬되어 있다. 10G5-HC는 서열번호 38에 표시되어 있다. IGHV1-46은 서열번호 39에 표시되어 있다. 1i9r은 서열번호 40에 표시되어 있다. 1it9는 서열번호 41에 표시되어 있다. 1E60은 서열번호 42에 표시되어 있다. CDR은 10G5-HC 서열에 밑줄 그어 있고, 복귀 돌연변이는 -H1 내지 -H6 변이체에 밑줄 그어 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
인간화 항-Fas 항체 HFE7A(pdb 1IT9), 인간화 항-CD40-L 항체 5C8(pdb 1I9R) 및 마우스 항-HIV-1 캡시드 단백질 p24 항체 13B5(pdb 1E6O)가 구조 예상 평가를 위한 주형으로서 이용되었다. 3D 구조 조사에 기초하여, 5개의 FW3 버니어 영역 잔기 중 3개가 변형되지 않은 채 유지되었다. FW2의 버니어 영역 잔기는 어느 것도 변형되지 않았다. 따라서, H3 중쇄가 추가의 복귀 돌연변이용의 기본적인 출발 주형으로서 이용되었다. 4개의 중쇄 H3, H4, H5 및 H6가 항체 생성을 위하여 채택되었다.
항체 2B12
2개의 인간 VK 유전자가 모자이크 접근법에 의한 CDR 이식을 위하여 이용되었다. FW1은 IGKV1-39로부터 유래되었고, FW2 및 FW3은 IGKV4-1로부터 유래되었다.
인간화 경쇄 단백질 서열은 이하에 정렬되어 있다. 2B12-LC는 서열번호 43에 표시되어 있다. IGKV1-39는 서열번호 44에 표시되어 있다. IGKV4-1은 서열번호 45에 표시되어 있다. 1NCA는 서열번호 46에 표시되어 있다. 1ZA6은 서열번호 47에 표시되어 있다. 1PG7은 서열번호 48에 표시되어 있다. 1b2w는 서열번호 49에 표시되어 있다. 1fvd는 서열번호 50에 표시되어 있다. 2fgw는 서열번호 51에 표시되어 있다. DR은 2B12-LC 서열에 밑줄 그어 있고, 복귀 돌연변이는 -L0 내지 -L4 변이체에 밑줄 그어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
인간화 항-TAG-72 항체 CC49(pdb 1ZA6), 인간화 항-조직 인자 항체 D3H44(pdb 1PG7), 인간화 항-p185HER2 항체 4D5(pdb 1FVD), 인간화 항-감마 인터페론 항체(pdb 1B2W), 인간화 항-CD18 항체(pdb 2FGW) 및 인플루엔자 바이러스 아형 N9 항체 NC41(pdb 1NCA)로부터의 마우스 항-뉴라미니다제가 구조 예상 평가를 위한 주형으로서 이용되었다. FW3의 버니어 영역 잔기는 변형되지 않은 채 유지되었다. 따라서, L1 경쇄는 추가의 복귀 돌연변이를 위한 기본적인 출발 주형으로서 이용되었다. 4가지 경쇄 L1, L2, L3 및 L4가 최종적으로 항체 생성을 위하여 채택되었다.
2가지 인간 VH 유전자가 모자이크 접근법에 의해 CDR 이식을 위하여 이용되었다. FW1 및 FW3은 IGHV7-4-1*02로부터 유래되었고, FW2는 IGHV1-c*01로부터 유래되었다.
인간화 중쇄 단백질 서열은 이하에 정렬되어 있다. 2B12-HC는 서열번호 52에 표시되어 있다. IGHV7은 서열번호 53에 표시되어 있다. IGHV1-c는 서열번호 54에 표시되어 있다. 1BJ1-H는 서열번호 55에 표시되어 있다. 9046-H는 서열번호 56에 표시되어 있다. CDR은 2B12-HC 서열에 밑줄 그어 있고 복귀 돌연변이는 -H1 내지 -H4 변이체에 밑줄 그어 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
인간화 항-VEGF 중화 항체(pdb 1BJ1), 및 시타투주맙 보가톡스 항체(9046-H)가 각각 구조 예상 평가 및 1차 서열 비교를 위한 주형으로서 사용되었다. 1BJ1 3D 구조 조사에 기초하여, FW2 VH/VL 계면 잔기 Lys39가 최종 Cys의 상류 직전에 위치된 FW3 Phe과 함께 변형되지 않은 채 유지되었다. 따라서, H1 중쇄가 추가의 복귀 돌연변이 및 H3 및 H4 변이체의 생성을 위한 기본적인 출발 주형으로서 이용되었다. 대안적으로, IGHV7-4-1의 3개의 FW를 유지하는 변이체가 또한 포함되었다(H2).
4개의 2B12 중쇄 H1, H2, H3 및 H4가 최종적으로 항체 생성을 위하여 채택되었다.
생산된 2B12 및 10G5 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 이하에 표시되어 있다(L은 경쇄를 나타내고, H는 중쇄를 나타낸다).
Figure pct00011
Figure pct00012
모체 키메라 버전과 비교해서 상이한 복귀 돌연변이(인간 프레임워크 잔기 대신에 쥣과 기원의 아미노산)를 함유한 항체 2B12 및 10G5의 각각의 16개의 인간화 변이체가 작제되었다. 모든 항체 변이체는 이하에서 표 2 및 표 3에 표시된 조합으로 인간 IgG1 항체로서 CHO 세포에서 성공적으로 생산되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
항체 변이체는 정제되고 KIR3DL2 양성 세포주를 이용해서 유세포 적정에 의해 분석되었다. 요약하면, 라지-KIR3DL2 세포주는 트리판 블루로 계수되었다. 세포는 1백만개/㎖에서 조정되었다. 100㎕의 이전의 현탁액을 96W-U 바닥 마이크로플레이트(100　000개 세포/웰)로 옮겼다. 세포를 100㎕/웰의 염색 완충제(SB)으로 1회 세척하고, 400g에서 2분 동안 스핀다운하였다. 1/3에서의 희석 범위가 각 정제된 항체에 대해서 100㎍/㎖ 내지 2.10-3㎍/㎖로 수행되었다. 50㎕의 각 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 SB(100㎕)로 3회 세척하고 400g에서 2분 동안 스핀다운하였다. 1/200로 희석된 염소 항-인간-PE(Fc spe)를 플레이트에 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 2회 세척하고 FACS CANTO 세포계수기 상에서 즉시 분석하였다. 모든 상청액은 그 검정법에서 양성이었고, 이것은 모든 인간화 변이체가 표적 항원에 대한 결합을 유지하는 것을 나타낸다.
2B12 및 10G5 항체에 대해서, 모든 변이체는 모체 키메라 버전과 동등하게 잘 표적 세포에 결합하고 그 검정법에서 서로로부터 그리고 키메라 항체로부터 구분되지 않는 것을 나타낸다.
비교로서, 인간화된 다른 항-KIR3DL2 항체에 대해서, 친화도의 전체적인 손실이 관찰되었다. 이 클론의 몇몇 변이체, 예를 들어, H4L1, H4L2 및 H4L3에 대해서, 쥣과 잔기의 인간 프레임워크 서열로의 재도입(복귀 돌연변이)은 완전한 결합 활성을 복구시키지는 못했지만 세포 표면 항원에 대한 겉보기 결합을 다소 개선시켰다.
실시예 2 - 감소된 응집 경향을 가진 인간화 항- KIR3DL2 항체의 동정
인간 IgG1 포맷에서 생산된 2B12 및 10G5의 인간화 변이체의 응집 경향은 그들의 제형의 pH에 관하여 연구되었다. 각 mAb에 대해서, 응집 경향 검정법은 약 1㎎의 정제된 물질을 요구하였다.
이하의 단클론성 항체(mAb)가 연구되었다: 2B12-H1L1; 2B12-H1L2; 2B12-H2L1; 2B12-H2L2; 10G5-H3L2; 및 10G5-H4L2.
이들 mAb의 응집 경향은 그들의 제형 pH의 기능으로서 평가되었다. pH 5.5 내지 8 범위의 총 5종의 약제학적으로 허용 가능한 완충제 용액이 선택되었다; 따라서, 각 mAb는 표 4 내지 8에 나타낸 바와 같이 1㎎/㎖의 최종 농도에서 5종의 제형으로 제조되었다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
각 정제된 mAb의 초기 용액은 PBS 1X 제형 중에 공급되었고, 다른 제형은 투석에 의한 완충제 교환을 통해서 얻어졌다.
각 mAb 제형의 응집 경향은 그들의 응집 온도(Tagg)의 측정과 비교에 의해 실험적으로 평가되었다. Tagg는 열 전이 안정성 검정법(Thermal Shift Stability Assay methodology: TSSA)을 이용해서 측정되었다. TSSA는 "ProteoStat(등록상표) 열 전이 안정성 검정법" 키트(뉴욕주의 파밍데일에 소재한 엔조 라이프 사이언시스사(Enzo Life Sciences Inc.)에서 입수 가능함)를 이용해서 수용액 중에서 펩타이드 및 단백질의 응집 온도를 측정한다. 분석될 샘플을 0℃에서 100℃까지 가열하고, 온도가 증가함에 따라서 형광이 판독된다. 샘플 형광의 높은 증가는 응집 온도에 도달할 것일 경우 검출될 것이다. 이 형광 측정은 480㎚ 여기식 분자 회전자 프로브를 이용한다. 이것은 정상 농도에서 존재하는 폴리솔베이트 80 등과 같은 계면활성제에 대한 내성 및 넓은 pH 범위(4 내지 10)에 필적한다.
결과
결과는 이하의 표 9에 표시되어 있다. 초기 순도 %는 각 mAb에 대해서 0.1㎎/㎖ pH = 7.4 제형에서 PBS 1X + 폴리솔베이트 80에 대해서 SE-HPLC에 의해 측정된다. 소거됨으로 표기된 시행은 그들의 값이 연구 프로토콜에 따르면 중앙값으로부터 너무 멀리 떨어져 있었기 때문이다. pH 5.5에서의 2B12-H2L1의 발육부전 시행 1은 중지되었는데, 이것은 그 결과가 TAgg 값이 매우 높은 것으로 보였기 때문에 비정상인 것으로 여겨진다. 결과는 사실상 정상이었지만 세 번째 유효한 시행을 수행하기에 충분한 mAb 산물은 남아있지 않았다.
Figure pct00020
모든 항체는 장기 보관 동안 mAb의 화학적 분해 위험을 피하는 제형과 일치하는 pH값에서 안정성을 입증하였다. 항체는 혈액 pH와 동등한 pH = 7.4에서 안정성을 보였고, mAb의 화학적 분해 위험이 더 낮다. 모든 시험된 변이체에 대해서, 겔 IEF에 의해 측정된 실험적 pI값은 염기성 pH 범위(pH 9 이상)에서 발견된다. 따라서, 2B12 및 10G5 항체는 모든 시험된 pH 조건에서 순 양하전을 보유한다. 실험적 pI 값 훨씬 아래인 선택된 pH 조건(pH 7.0 또는 7.4)은 또한 두 변이체에 대해서 높은 수중 용해도를 보증할 것이다.
응집 경향의 관점에서, 2B12의 H1L1 또는 H1L2와 H2L1 또는 H2L2 변이체 사이에 놀랍게도 큰 갭이 있다. H2L1 또는 H2L2는 H1L1 또는 H1L2보다 훨씬 높은 응집 온도를 지니고, 따라서 훨씬 더 양호한 물리적 안정성을 지녀야 한다. 이것은 위치 39번 위치(애브넘 넘버링)에서 H2 중쇄 상의 글루타민(Q)의 존재에 의해 설명될 수 있었다. 실제로, 2개의 H-결합이 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) 소프트웨어를 이용한 mAb의 모델링에 의해 도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같이 VH_Q39와 VL_Q38 사이에 구축된다. 이들 2개의 H-결합은 아마도 mAb의 4차 구조를 안정화시켜, 단백질 응집을 담당할 수 있는 소정의 소수성 영역의 노출을 방지한다.
2B12 변이체와 마찬가지로, VH_Q39와 VL_Q38 사이에 구축된 2개의 H-결합을 또한 가진 mAb 10G5의 H3L2 및 H4L2 변이체에 대해서, 높은 응집 온도가 관찰되었다. 이들은 또한 양호한 물리적 안정성을 입증하였다.
실시예 3 - IV 모델에서 라지- KIR3DL2 하이가 생착된 CB17 - SCID 마우스에서의 2B12- H2L1 용량 반응의 효율
이 연구의 목적은 항체 2B12-H2L1이 용량-의존적 방식으로 라지-KIR3DL2 인간 B 종양 세포가 정맥내(IV)로 생착된 CB17-SCID 마우스의 수명을 증가시킬 수 있었는지의 여부를 평가하기 위한 것이었다.
세포들이 그들의 표면 상에서 KIR3DL2를 발현하고 2B12-H2L1 항체에 결합된 것을 확인한 후에, 48 SCID 마우스에게 5M의 라지-KIR3DL2 하이 세포(계대 번호 5 및 97%의 생존도)를 IV 생착시켰다. IP 치료는 생착 후 1일에 시작하였고 항체는 0.01, 0.1, 1 ㎍/마우스 및 10 ㎍/마우스의 용량에서 1회 투여되었다.
6개군이 수행되었다(n=8):
Figure pct00021
10㎍/마우스에서 동형 대조군(IC)이 주입된 대조군
Figure pct00022
0.01㎍/마우스에서 2B12-H2L1이 주입된 치료군
Figure pct00023
0.1㎍/마우스에서 2B12-H2L1이 주입된 치료군
Figure pct00024
1㎍/마우스에서 2B12-H2L1이 주입된 치료군
Figure pct00025
10㎍/마우스에서 2B12-H2L1이 주입된 치료군
라지-KIR3DL2 하이 세포의 IV 생착 후, 동형 대조군으로 처치된 마우스의 군은 20일의 중앙 생존으로 신속하게 사망하였다(표 10).
Figure pct00026
모든 용량에서 2B12로 처치된 군의 생존 곡선 및 생존 중앙값은 대조군에 비해서 유의한 증가를 보였다(도 2). 그러나, 증가된 수명(ILS) 퍼센트는 마우스가 1 및 10㎍의 mAb로 처치된 경우 훨씬 더 높았고, 0.01 및 0.1㎍의 mAb에 의해서는 그렇지 않았다(표 10). 2B12는 낮은 농도에서도 ADCC를 유도할 수 있었다.
결과는 도 2에 도시되어 있다. 라지-KIR3DL2 하이 5M IV로 생착되고 2B12의 용량 반응으로 IP 처치된 CB17-SCID 마우스의 생존 곡선(n=8/군). 치료는 1일째로부터 시작하였다. 실험의 종료는 58일에서였다.
이 연구는 2B12에 의한 치료가 저용량에서도 IV 모델의 CB17-SCID 마우스의 생존을 유의하게 연장시킨 것을 나타내었다.
모든 제목 및 하위-제목은 오직 편의상 본 명세서에서 사용되는 것이고 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 기재된 요소의 이의 모든 가능한 변형에서의 임의의 조합은 본 명세서에서 달리 표시하지 않는 한 또는 문맥상 명백하게 부인되지 않는 한 본 발명에 의해 포괄된다. 본 명세서에서의 값의 범위의 언급은 본 명세서에서 달리 표시하지 않는 한 단지 범위 내에 있는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 제공하도록 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서 내에 편입된다. 달리 기술되지 않는 한, 본 명세서에서 제공되는 모든 정확한 값은 상응하는 근사값을 나타낸다(예컨대, 특정 인자 또는 측정과 관련하여 제공되는 모든 정확한 예시적인 값은 또한 적합한 경우에는 "약"으로 수식되는, 상응하는 근사 측정값을 제공하는 것으로 고려될 수 있다).
본 명세서에서 달리 표시하지 않는 한 또는 문맥 상 명백하게 부인되지 않는 한 본 명세서에 기재된 모든 방법은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 임의의 그리고 모든 예시, 또는 예시적 어휘(예컨대, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더욱 잘 설명하기 위해 의도된 것이며, 달리 표시하지 않는 한, 본 발명의 범주에 대한 제한을 제기하는 것은 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 임의의 요소가 그만큼 명백하게 언급되지 않는 한 본 발명의 실시에 필수적이라는 것을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서의 특허 문헌의 언급 및 편입은 오직 편의상 행해지는 것이지, 이러한 특허 문헌의 타당성, 특허가능성 및/또는 이행가능성의 임의의 견해를 반영하는 것은 아니다. 요소 또는 요소들을 참조로 하는 용어를 사용하는 본 발명의 임의의 양상 또는 실시형태의 본 명세서의 설명은 문맥상 달리 기술되거나 명백하게 부인되지 않는 한 특정 요소 또는 요소들로 "이루어지는", "본질적으로 이루어지는" 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양상 또는 실시형태에 대한 지지를 제공하는 것으로 의도된다(예컨대, 특정 요소를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물이 문맥상 달리 언급되거나 명백하게 부인되지 않는 한, 또한 해당 요소로 이루어지는 조성물을 기재하는 것으로 이해되어야만 할 것이다).
본 발명은 본 명세서에 제시된 양상 또는 청구항에 언급된 주제의 모든 변형 및 등가물을 적용 가능한 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 공개문헌 및 특허 출원은 마치 각각의 개별적 공개문헌 또는 특허 출원이 참조에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 인용된 것처럼 나타나있는 경우, 본 명세서에 그 전문이 참고로 편입된다.
이상의 본 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 좀더 상세히 설명되고 있지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시의 견지에서 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
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Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 32 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 33 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 88 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ser Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Arg Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Lys Gly Leu Leu Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 98 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus <400> 42 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Pro Val Val Arg Leu Gly Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 88 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 <210> 45 <211> 86 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 35 40 45 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 47 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 118 <212> PRT <213> mus musculus <400> 52 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Thr Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 98 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 54 <211> 95 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Ala Glu Val Arg Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Ser Phe Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Gln Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Lys Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Arg Asp Met Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Thr Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 <210> 55 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 116 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Chimeric human/mouse <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115

Claims (27)

  1. KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 단클론성 항체로서,
    상기 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열을 포함하되, 상기 중쇄 프레임워크는 잔기 39번 잔기에 글루타민을 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크는 38번 잔기(애브넘 넘버링(Abnum numbering))에 글루타민을 포함하는, 단클론성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 기준 항체가 인간 IgG 동형의 불변 영역을 포함하는, 단클론성 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 KIR3DL2와 상기 KIR3DL2의 HLA 천연 리간드 간의 결합을 검출 가능하게 저감(또는 제거)하는, 단클론성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, (a) KIR3DL2 폴리펩타이드 대립유전자(allele)_*001, (b) KIR3DL2 폴리펩타이드 대립유전자_*002, 및 (c) KIR3DL2 폴리펩타이드 대립유전자_*007에 결합하되, 각 경우에 상기 KIR3DL2 폴리펩타이드는 세포의 표면 상에서 발현되는, 단클론성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, 서열번호 1의 야생형 KIR3DL2 폴리펩타이드와 상기 항체 간의 결합에 비해서, 아미노산 돌연변이 I60N 및 G62S를 가진 돌연변이 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가진, 단클론성 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, 서열번호 1의 야생형 KIR3DL2 폴리펩타이드와 상기 항체 간의 결합에 비해서, 아미노산 돌연변이 R13W, A25T 및 Q27R을 가진 돌연변이 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가진, 단클론성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, 서열번호 1의 야생형 KIR3DL2 폴리펩타이드와 상기 항체 간의 결합에 비해서, 아미노산 돌연변이 P14S, S15A 및 H23S를 가진 돌연변이 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 저감된 결합을 가진, 단클론성 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 KIR3DL2-발현 세포에 결합된 경우 내재화되지 않는, 단클론성 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 KIR3DL2와 HLA-B27 간의 결합을 검출 가능하게 저감시키는, 단클론성 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 KIR3DL1 폴리펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는, 단클론성 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, KIR3DL2 폴리펩타이드에 대한 결합에 대해서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 경쟁하는, 단클론성 항체:
    (a) 서열번호 31 및 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체(2B12), 및
    (b) 서열번호 14 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체(10G5).
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 (i) 각각 서열번호 2(HCDR1), 서열번호 3(HCDR2) 및 서열번호 4(HCDR3)의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 포함하는 중쇄, 및 (ii) 각각 서열번호 5, 6 또는 7의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단클론성 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 (i) 각각 서열번호 18(HCDR1), 서열번호 19(HCDR2) 및 서열번호 20(HCDR3)의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3(HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 포함하는 중쇄, 및 (ii) 각각 서열번호 21, 22 또는 23의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단클론성 항체.
  14. 하기를 포함하는, KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 항체:
    (a) 10G5-H0, -H1, -H2, -H3, -H4, -H5 및 -H6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 및 -L5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  15. 하기를 포함하는, KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 항체:
    (a) 2B12-H0, -H1, -H2, -H3 및 -H4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 2B12-L0, -L1, -L2, -L3 및 -L4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  16. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 항체:
    (a) 서열번호 31 및 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체, 및
    (b) 서열번호 31 및 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체.
  17. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, KIR3DL2 폴리펩타이드에 결합하는 항체:
    (a) 서열번호 14 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체, 및
    (b) 서열번호 15 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 각각 포함하는 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-8M 미만에서 인간 KIR3DL2 폴리펩타이드에 대해서 2가의 결합 친화도를 갖는, 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 감마 1 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역(VH)과 인간 카파 불변 영역에 융합된 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 전장 항체인, 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 FcgIIIA (CD16) 수용체에 대한 결합을 증가시키는 아미노산 치환(들)을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 6.5 내지 8의 pH에서, (a) 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체; (b) 완충계; 및 (c) 등장화제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 pH는 약 7.4인, 약제학적 조성물.
  24. 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서의 상기 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질환은 말초 T 세포 림프종인, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 암은 균상 식육종 및 세자리 증후군(Sezary Syndrome)으로부터 선택되는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 질환은 염증성 또는 자가면역 장애인, 질환의 치료 또는 예방 방법.
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