BR112016021066B1 - Anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptídeo kir3dl2, composição farmaceutica e uso de um anticorpo ou composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptídeo kir3dl2, composição farmaceutica e uso de um anticorpo ou composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

anticorpos humanizados com estabilidade aumentada. a presente invenção proporciona anticorpos que possuem uma estabilidade melhorada. incluem-se os anticorpos que são capazes de se ligar a polipeptídeos kir3dl2. os anticorpos são adequados para o tratamento de doenças caracterizadas por células que expressam kir3dl2, em particular as células t cd4+, incluindo malignidades, tais como micose fungóide e síndrome de sezary e desordens auto-imunes que expressam kir3dl2.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção proporciona anticorpos que possuem uma estabilidade melhorada. Incluem-se os anticorpos que são capazes de se ligar a polipeptídeos KIR3DL2. Os anticorpos são adequados para o tratamento de doenças caracterizadas por células que expressam KIR3DL2, em particular as células T CD4+, incluindo malignidades, tais como micose fungóide e síndrome de Sezary e desordens auto-imunes que expressam KIR3DL2.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente norte-americano de n° 61/953.035, depositado em 14 de março de 2014; cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade; incluindo quaisquer figuras.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0003] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma lista de sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado "KIR-5 PCT_ST25", criado em 11 de março de 2015, que possui 49 KB de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] Receptores do tipo imunoglobulina assassinas (KIR) são uma família de receptores que, juntamente com os receptores de lectina do tipo C (CD94-NKG2), são utilizados por células NK humanas e subconjuntos de linfócitos T para reconhecerem especificamente moléculas de MHC de classe I. Certos inibidores e ativadores KIR tem domínios extracelulares altamente semelhantes e são reconhecidas pelo mesmo anticorpo monoclonal, e.g. KIR2DL1 e KIR2DS1 são ambas reconhecidas por EB6 e 2DL2 e 2DS2 por GL183. Três critérios (número de domínios extracelulares semelhantes a Ig (domínios D0, D1, D2), comprimento da cauda citoplasmática e analogia de sequência) têm sido usados para categorizar as proteínas KIR em 13 grupos, nomeadamente KIR3DL1-2, KIR3DS1, KIR2DL1-5 e KIR2DS1-5. A designação 2D para 2 domínios ou 3D para 3 domínios apresenta o número de domínios de tipo Ig; receptores, quer com domínios citoplasmáticos longos ou curtos, são ainda classificados como L ou S. (Pascal V. et al, 2007, J. Immunol. 179: 16251633) Os receptores inibitórios possuem caudas citoplasmáticas longas (L) (isto é, KIR2DL ou KIR3DL) contendo uma ITIM canônica que se torna uma tirosina fosforilada mediante a conexão KIR do seu ligante HLA de classe I. A ITIM fosforilada recruta o domínio Src de homologia 2 contendo fosfatases de tirosina proteicas, domínio Src de homologia 2 contendo fosfatase 1 e/ou domínio Src de homologia 2 contendo fosfatase 2, que desfosforilam substratos celulares, abortando assim, o sinal de ativação NK, contendo domínio de destino com a expressão do auto-MHC de classe I apropriado. Receptores com caudas citoplasmáticas curtas (S) carecem de ITIMs (isto é, KIR2DS ou KIR3DS). Estes ativadores KIR compreendem um resíduo carregado dentro de seu domínio transmembranar facilitando a interação com a cadeia de sinalização KARAP/DAP12. O envolvimento da família de receptores de KIR2DS foi mostrado como conduzindo a uma cascata de KARAP/DAP12 mediada por eventos que culminam num aumento da atividade citolítica das células NK e na produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como IFN-y (Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179: 1625-1633). As células NK maduras são previstas para adquirir, pelo menos, um receptor inibidor específico para uma molécula de auto-MHC de classe I, que prevalece geralmente funcionalmente sobre moléculas ativadoras potencialmente auto-reativas. Propõe-se que a resposta das células NK represente o resultado de tanto ativação integrada quanto sinalização inibidora por KIR e outros receptores.
[0005] O KIR3DL2 tem sido estudado como alvo para o tratamento de doenças malignas envolvendo células T CD4+ que expressam receptores de KIR3DL2, em particular as células T CD4+, incluindo malignidades, tais como micose fungóide e síndrome de Sézary (ver, por exemplo publicações PCT WO2010/081890 e WO02/50122). Um ligante de KIR3DL2, HLA-B27, está fortemente associado com a espondiloartrites (SpA) um grupo de doenças artríticas inflamatórias debilitantes tipificadas por espondilite anquilosante (EA, do inglês Ankylosing Spondylitis - AS). A ligação de KIR3DL2 por dímeros B27 promove a sobrevivência dos subconjuntos de células NK e Th17 (Bowness, et al (2011) Journal of Immunology 186: 2672-2680; Chan, et al (2005) Arthritis Rheum 52: 3586-3595). Demonstrou-se que que há um aumento de proporções de subconjuntos de células patogênicas Th17 e NK que expressam KIR3DL2 em pacientes com SpA. Estudos sugerem fortemente que as interações KIR3DL2-B27 desempenham um papel central em SpA e que KIR3DL2 é um alvo terapêutico promissor.
[0006] A existência de anticorpos reativos contra vários polipeptídeos KIR3D têm sido relatada. A existência de dois anticorpos anti-KIR3DL2 foram relatados: Q241 e Q66 (Pende, et al (1996) J Exp Med 184: 505-518). No entanto, estes dois anticorpos são do isotipo IgM (pentâmeros) e não são prontamente adaptados para uso farmacêutico. Além disso, se as regiões variáveis forem colocadas no contexto de um anticorpo do tipo IgG bivalente, a sua afinidade seria esperada como sendo baixa. Células referidas como "AZ158" que produzem um anticorpo foram ainda relatadas (Parolini, S., et al (2002) Em Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415-417; publicação PCT WO2010/081890). O anticorpo 5.133 está disponível a partir Miltenty Biotech (Auburn CA). Ambos os anticorpos AZ158 e 5.133 se ligam a KIR3DL2, bem como KIR3DL1 (e ainda o KIR3DS1 altamente homólogo). KIR3DL2 e KIR3DL1 partilham identidade relativamente elevada de aminoácidos e vários ligantes de HLA que se ligam a KIR3DL2 são também reconhecidos por KIR3DL1. Apesar de imunizações terem dado origem a AZ158, Q241 e Q66, há uma necessidade de anticorpos melhorados em aplicações terapêuticas entre outras.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] Num aspecto, proporcionam-se anticorpos anti-KIR3DL2 com estruturas humanas que têm tanto uma ligação de afinidade de antígeno elevada quanto estabilidade em formulações farmacêuticas. Os inventores desenvolveram anticorpos com estruturas diferentes de um único gene e humanas de mosaico e determinaram que certos aminoácidos no resíduo 39 na cadeia pesada e 38 na cadeia leve (Abnum) fornecem forte aumento da estabilidade física.
[0008] Estes exemplos de anticorpos foram desenvolvidos utilizando regiões de combinação com o antígeno de anticorpos 2B12 e 10G5. Os anticorpos 2B12 e 10G5 CDRs são descritos no pedido de patente PCT número PCT/EP2013/069302 depositado em 17 de setembro de 2013. Anti-KIR3DL2 mAbs 2B12 e 10G5 têm a propriedade vantajosa de que não envolvem o KIR3DL1 intimamente relacionado (por homologia), nem causam uma internalização KIR3DL2. A internalização KIR3DL2 dificulta fortemente abordagens baseadas em ADCC. Os anticorpos são capazes de mediar ADCC quando são do isotipo adequado (por exemplo, IgG1), mas também são capazes de inibir as interações do dímero KIR3DL2-KIR3DL2 com HLA B27. Notavelmente, o bloqueio do ligante pode ser conseguido sem se provocar a internalização do receptor. Os anticorpos que bloqueiam um ou mais ligantes naturais de KIR3DL2 são, portanto, bastante adequados para o tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias, tanto como um formato diminuidor de Acm quanto não. Os epitopos em KIR3DL2 ligados pelos anticorpos foram determinados, como ambos os anticorpos 10G5 e 2B12 que perderam a ligação para mutantes KIR3DL2 que tenham substituições em resíduos de I60 e G62. O anticorpo 10G5 ainda perde ligação a mutantes KIR3DL2 que têm substituições de resíduos que incluem P14, S15 e H23 e nos resíduos R13, A25 e P27. Os anticorpos competem uns com os outros para a ligação a polipeptídeos de KIR3DL2 na sua configuração nativa como expresso na superfície de células.
[0009] Numa forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo 2B12 ou 10G5 humanizado. Numa forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo humanizado 10G5 ou 2B12 tendo uma estrutura humana de mosaico de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada. Exemplos com a região determinante de complementaridade (CDR) de resíduos ou sequências e/ou sítios para substituições de aminoácidos na região estrutural (FR) de tais anticorpos humanizados tendo propriedades, tais como, por exemplo, menor imunogenicidade ou outras propriedades funcionais melhoradas, propriedades de ligação ao antígeno melhoradas e / ou propriedades físico-químicas melhoradas, tais como, por exemplo, uma melhor estabilidade, são fornecidos. Numa forma de realização, a sequência de estrutura humana compreende uma retro- mutação.
[0010] As estruturas e regiões variáveis aqui proporcionadas conferem alta estabilidade física e baixa propensão de agregação a 2B12 e 10G5 sob condições encontradas em formulações farmacêuticas. Em particular, proporcionam-se anticorpos que possuem o antígeno combinando regiões de 2B12 ou 10G5, com regiões de estrutura substancialmente humana, em que o anticorpo compreende, na sua cadeia pesada, uma glutamina (Q) na posição 39 e, na sua cadeia leve, uma glutamina na posição 38 (com numeração Abnum). Sem se pretender ou ficar limitado a teorias, acredita-se que quando uma glutamina está presente na cadeia leve no resíduo 38 (com numeração Abnum) ligações de H são construídas entre VH_Q39 e VL_Q38 (ver a figura 1), resultando em uma maior estabilidade física do anticorpo. Estas duas ligações de H podem estabilizar a estrutura quaternária do mAb, impedindo a exposição de porções hidrofóbicas que são responsáveis pela agregação de proteínas.
[0011] Numa forma de realização, o anticorpo VH e VL humano tem estruturas aceitadoras, em que o anticorpo compreende, na sua cadeia pesada, um resíduo glutamina no resíduo 39 e, na sua cadeia leve, uma glutamina no resíduo 38. Um VH e / ou VL de estrutura aceitadora humano pode compreender uma retro-mutação (por exemplo, uma, duas, três ou quatro ou mais substituições de amino ácido para o correspondente resíduo doador numa ou mais das regiões de estrutura) em comparação com uma estrutura aceitadora humana de ocorrência natural. Opcionalmente, o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que os anticorpos 2B12 ou 10G5.
[0012] Numa forma de realização, o anticorpo compreende uma estrutura de cadeia pesada 1 (FW1) e 2 (FW2) derivadas do subgrupo VH7 humano. Opcionalmente, o anticorpo compreende estrutura de cadeia pesada 3 (FW3) derivada do subgrupo VH7 humano. Opcionalmente, o anticorpo compreende estrutura de cadeia pesada 4 (FW4) que é derivada a partir de um subgrupo JH6. Numa forma de realização, o anticorpo compreende estruturas aceitadoras da cadeia leve de subgrupo VK1 e/ou VK4, opcionalmente combinadas com um subgrupo JK4. Opcionalmente, o anticorpo compreende cadeias leves FW1 derivadas do subgrupo VK1 humano e a cadeia leve FW2 e a cadeia leve FW3 derivadas do subgrupo humano VK4. Opcionalmente, o anticorpo compreende cadeias leves FW4 derivadas de um subgrupo JK4.
[0013] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado, que se liga a KIR3DL2, que compreende uma cadeia pesada que compreende a cadeia pesada CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 e uma estrutura da cadeia pesada humana aceitadora do subgrupo VH7 humano, opcionalmente combinado com um subgrupo JH6 e uma cadeia leve compreendendo a cadeia leve CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 e uma estrutura aceitadora de cadeia leve humana de subgrupo VK1 e / ou VK4, opcionalmente combinado com um subgrupo JK4. Numa forma de realização, as estruturas de cadeia pesada compreendem uma ou mais retro- mutações. Numa forma de realização, as estruturas da cadeia leve compreendem uma ou mais retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas de cadeia pesada compreendem (coletivamente) uma, duas ou três retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas da cadeia leve compreendem (coletivamente) uma ou duas retro-mutações.
[0014] Numa forma de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a cadeia pesada CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 e uma estrutura de cadeia pesada humana aceitadora, em que um esqueleto 1 (FW1) e 2 (FW2) são derivados do subgrupo VH7 humano. Opcionalmente, o esqueleto 3 (FW3) é derivado do subgrupo VH7 humano. Opcionalmente, o esqueleto 4 (FW4) é derivado a partir de um subgrupo JH6. Opcionalmente, o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a cadeia leve CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 e uma estrutura aceitadora de cadeia leve humana de subgrupo VK1 e / ou VK4, opcionalmente combinado com um subgrupo JK4. Opcionalmente, a cadeia leve FW1 é derivada da cadeia leve de subgrupo VK1 humano e a cadeia leve FW2 e a cadeia leve FW3 de são derivadas do subgrupo humano VK4. Opcionalmente, a cadeia leve FW4 é derivada de um subgrupo JK4. Numa forma de realização, as estruturas de cadeia pesada compreendem uma ou mais retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas da cadeia leve compreendem uma ou mais retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas de cadeia pesada compreendem (coletivamente) uma, duas ou três retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas da cadeia leve compreendem (coletivamente) uma ou duas retro-mutações.
[0015] Numa forma de realização, o gene de subgrupo VH7 é IGHV7-4 (por exemplo IGHV7-4-1 * 02, um gene que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID No: 53). Numa forma de realização, o gene de subgrupo VK1 é IGKV1-39, por exemplo, um gene que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID No: 44. Numa forma de realização, o gene de subgrupo VK4 é IGKV4-1, por exemplo, um gene que codifica para o aminoácido sequência de ácido mostrada na SEQ ID No: 45.
[0016] Numa forma de realização, é fornecido um anticorpo monoclonal isolado que se liga a KIR3DL2 que compreende uma cadeia pesada que compreende a cadeia pesada CDR1, 2 e 3 do anticorpo 10G5 e uma estrutura aceitadora de cadeia pesada humana de subgrupo derivado de VH1 humano (por exemplo, IGHV1-46) e um cadeia leve compreendendo a cadeia leve CDR1, 2 e 3 do anticorpo 10G5 e uma estrutura aceitadora de cadeia leve humana derivada do subgrupo VK1 (por exemplo IGKV1- NL1). Numa forma de realização, as estruturas de cadeia pesada compreendem uma ou mais retro-mutações. Numa forma de realização, as estruturas da cadeia leve compreendem uma ou mais retro-mutações.
[0017] Numa forma de realização, o anticorpo compreende uma estrutura humana aceitadora de cadeia pesada de subgrupo VH1 e / ou VH7 combinado com um subgrupo JH6 e uma estrutura aceitadora de cadeia leve humana de subgrupo VK1 e / ou VK4 combinado com um subgrupo JK4.
[0018] Num outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo humanizado isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano e compreende uma região CDR-L1, CDR-L2 e uma região CDR-L3, uma região CDR-H1, CDR-H2 e uma região CDR-H3; uma glutamina (Q) como resíduo na posição 39 do domínio VH e uma glutamina na posição 38 do domínio VL. O resíduo de glutamina (Q) na posição 39 pode existir naturalmente no âmbito da sequência de VH humano, ou pode ser introduzido por substituição de aminoácidos ou outra modificação da sequência.
[0019] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia pesada e leve CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 ou 10G5. Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo que compreende uma estrutura de receptor humano que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 sem substancialmente se ligar a um polipeptídeo KIR3DL1, em que o anticorpo compreende a cadeia pesada e leve CDR1, 2 e 3 do anticorpo 2B12 ou 10G5, em que um ou mais das regiões de estrutura humana compreendem uma substituição de aminoácidos. Opcionalmente, a substituição é uma retro-mutação. Opcionalmente, a substituição é uma substituição aqui divulgada. Opcionalmente, o anticorpo compreende, na sua cadeia pesada, uma glutamina no resíduo 39 e, na sua cadeia leve, uma glutamina no resíduo 38.
[0020] Num aspecto, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência de SEQ ID No: 18 (HCDR1), SEQ ID No: 19 (HCDR2) e SEQ ID No: 20 (HCDR3) respectivamente e b) uma cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência de SEQ ID No: 21, 22 e 23, respectivamente. Opcionalmente, o anticorpo tem uma estrutura aceitadora de cadeia pesada humana de subgrupo VH1 e / ou VH7 combinado com um subgrupo JH6 e uma estrutura aceitadora de cadeia leve humana de subgrupo VK1 e / ou VK4 combinado com um subgrupo JK4. Opcionalmente, as cadeias leve e pesada humanas e / ou estruturas aceitadoras compreendem uma substituição (por exemplo, uma retro-mutação).
[0021] Opcionalmente, em quaisquer formas de realização aqui reveladas, um anticorpo 2B12 tem uma estrutura de cadeia pesada que pode ter uma ou mais substituições na posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: os resíduos 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72c, 9 e 108 (com numeração Abnum), incluindo todas as suas combinações. Opcionalmente, em quaisquer formas de realização aqui reveladas, um anticorpo 2B12 tem uma estrutura de cadeia leve que possui uma ou mais substituições na posição (ões) selecionada (s) a partir do grupo consistindo de: resíduos 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78 e 104 (com numeração Abnum), incluindo todas as suas combinações. Numa forma de realização, uma substituição(ões) é uma retro- mutação(ões).
[0022] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 2B12- H0, -H1, -H2, -H3 e -H4; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 2B12-L0, - L1, -L2, -L3 e -L4.
[0023] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 29 a 33, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 24 a 28.
[0024] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 29, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 24.
[0025] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 31, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 25.
[0026] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 31, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 26.
[0027] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 32, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 26.
[0028] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 monoclonal compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 33, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 26.
[0029] Numa forma de realização, uma região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais retro-mutações em uma, duas, três ou quatro das suas regiões estruturais. Numa forma de realização, uma região variável de cadeia leve compreende uma ou mais retro-mutações em uma, duas, três ou quatro das suas regiões estruturais.
[0030] Num aspecto, é proporcionada uma formulação farmaceuticamente aceitável e ativa, compreendendo (a) cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de uma molécula de anticorpo IgG que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 2B12- H0, -H1, -H2, -H3 e -H4; e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 2B12-L0, -L1, -L2, -L3 e - L4; (b) um sistema tampão, por exemplo fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio; (c) um agente isotônico, opcionalmente NaCl; e (d) polissorbato 80, a um pH dentre 6,5 e 8, opcionalmente cerca de 7,4. Num aspecto, é proporcionada uma formulação farmaceuticamente aceitável e ativa, compreendendo (a) cerca de 0,05 mg / mL a cerca de 10 mg / ml de anticorpo; (b) um tampão de cerca de 10 mM, por exemplo fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio; (c) um agente isotônico, opcionalmente, cerca de 9 mg / ml de NaCl; e (d) polissorbato 80, a um pH dentre 6,5 e 8, opcionalmente cerca de 7,4.
[0031] Num aspecto, proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: a) uma cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência de SEQ ID No: 2 (HCDR1), SEQ ID No: 3 (HCDR2) e SEQ ID No: 4 (HCDR3), respectivamente, e b) uma cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência de SEQ ID No: 5, 6 e 7, respectivamente. Opcionalmente, o anticorpo tem uma estrutura aceitadora humana de cadeia pesada de subgrupo VH1 combinado com um subgrupo JH6 e uma estrutura de receptor humano de cadeia leve de subgrupo VK1 combinado com um subgrupo JK2. Opcionalmente, o anticorpo tem uma cadeia pesada possuindo uma estrutura de receptor humano que compreende uma substituição (por exemplo, uma retro-mutação).
[0032] Opcionalmente, em quaisquer formas de realização aqui reveladas, um anticorpo 10G5 tem uma estrutura de cadeia pesada que pode ter uma ou mais substituição(ões) na posição(s) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: resíduos de 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72a e 75 (com numeração Abnum), incluindo todas as suas combinações. Opcionalmente, em quaisquer formas de realização aqui reveladas, um anticorpo 10G5 tem uma estrutura de cadeia leve que possui uma ou mais substituições na posição (ões) selecionada (s) a partir do grupo consistindo de: resíduos 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76 e 100 (com numeração Abnum), incluindo todas as suas combinações. Numa forma de realização, uma substituição (ões) é uma retro-mutações.
[0033] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 10G5- H0, -H1, -H2, -H3, -H4, H5 e -H6; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 10G5-L0, - L1, -L2, -L3, -L4 e -L5.
[0034] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 13 a 17, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 8 a 12.
[0035] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 13, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 8.
[0036] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 14, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 9.
[0037] Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 15, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 9.
[0038] Num aspecto, é proporcionada uma formulação farmaceuticamente aceitável e ativa, compreendendo (a) cerca de 0,05 mg / mL a cerca de 10 mg / mL de uma molécula de anticorpo IgG que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 10G5-H0 , -H1, -H2, -H3, -H4, H5 e -H6 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 e - L5; (b) um sistema tampão, por exemplo fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio; (c) um agente isotônico, opcionalmente NaCl; e (d) polissorbato 80, a um pH dentre 6,5 e 8, opcionalmente cerca de 7,4. Num aspecto, é proporcionada uma formulação farmaceuticamente aceitável e ativa, compreendendo (a) cerca de 0,05 mg / mL a cerca de 10 mg / ml de anticorpo; (b) cerca de 10 mM de tampão, e.g. fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio; (c) um agente isotônico, opcionalmente, cerca de 9 mg / ml de NaCl; e (d) polissorbato 80, a um pH dentre 6,5 e 8, opcionalmente cerca de 7,4.
[0039] Numa forma de realização, os anticorpos ligam-se a 1, 2, 3, 4 ou 5 dos polipeptídeos KIR3DL2 alelos *002, *003, *005, *007 e/ou *008. Opcionalmente, os anticorpos possuem um EC50 de, no máximo, 5 μg/ml, opcionalmente não mais do que 3 μg/ml, não mais de 2 μg/ml, não mais do que 1 μg/ml ou não mais do que 0,5 μg/ml para a ligação para células feitas para expressar na sua superfície um alelo específico (por exemplo, KIR3DL2 alelos_ *001, *002, *003, *005, *007 e/ou *008). Num aspecto, proporcionam-se anticorpos que se ligam ao polipeptídeo KIR3DL2 na região de ligação do ligante (HLA) (por exemplo, bolsa de ligação de HLA) ou, pelo menos, em parte, sobre a face de ligação a HLA da proteína KIR3DL2.
[0040] Num aspecto, proporcionam-se anticorpos que se ligam a um epitopo compreendendo os resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID No: 1) e/ou os anticorpos com ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 possuindo uma mutação nos resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID No: 1, por exemplo, I60N, G62S). Num aspecto, proporcionam-se anticorpos que se ligam a um epitopo compreendendo os resíduos R13, A25 e/ou Q27 do polipeptídeo KIR3DL2 e/ou ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 possuindo uma mutação nos resíduos R13, A25 e/ou Q27 (com referência à SEQ ID No: 1). Por exemplo, um anticorpo pode ter ligação reduzida a um polipeptídeo possuindo as mutações KIR3DL2 R13W, A25T e/ou Q27R. Opcionalmente, o epitopo compreende, adicionalmente ou em alternativa, um ou mais de resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID No: 1) e/ou os anticorpos com ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação em resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID No: 1, por exemplo, P14S, S15A, H23S).
[0041] Em outros aspectos, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem tais agentes e um transportador e para conjugados compreendendo tais conjugados a, por exemplo agentes um agente citotóxico ou agente detectável. Em outros aspectos, a invenção proporciona ácidos nucleicos e vetores que codificam para tais agentes e células hospedeiras que contenham tais ácidos e/ou vetores nucleicos.
[0042] Também são fornecidos métodos recombinante para a produção de agentes através da cultura de tais células hospedeiras de modo a que os ácidos nucleicos sejam produzidos. Em outros aspectos, a invenção proporciona artigos de fabricação compreendendo um recipiente compreendendo estes agentes e instruções que dirigem um utilizador para tratar uma desordem, tal como câncer ou doença auto- imune num paciente. Opcionalmente, o artigo pode compreender um outro recipiente contendo um outro agente, em que instruções que direcionam o utilizador para tratar o distúrbio com o anticorpo em combinação com o agente são também providas. A invenção também proporciona métodos de utilização dos agentes da invenção no tratamento de doenças como o câncer, uma doença inflamatória auto-imune ou um distúrbio num paciente, opcionalmente em conjunto com um outro agente anti-câncer ou agente anti-inflamatório.
[0043] Estes e outros aspectos vantajosos e características da invenção podem ser adicionalmente descritos aqui, em outros pontos do relatório descritivo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0044] A figura 1 mostra a modelagem da estrutura do anticorpo, que mostra que, quando uma glutamina está presente na cadeia leve no resíduo 38 e da cadeia pesada no resíduo 39, ligações de H podem ser construídas entre VH_Q39 e VL_Q38, o que pode explicar a maior estabilidade física de tais anticorpos.
[0045] A figura 2 mostra as curvas de sobrevivência de camundongos (mice) SCID CB17-enxertados com Raji-KIR3DL2 alta 5M IV e tratados IP com uma resposta de dose de anticorpos 2B12-H2L1 (n = 8/grupo). Os tratamentos são iniciados a partir do dia 1. O término do experimento se deu em 58 dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0046] Introdução
[0047] Os anticorpos da presente descrição são capazes de atingir diretamente e especificamente células que expressam KIR3DL2, nomeadamente CD4+, células KIR3DL2+ T, sem visar outras células, tais como células KIR3DL1+ (ou células KIR3DL2 + KIR3DL1 +, células KIR3DS1 + ou células KIR3DS1 KIR3DL2+) e que não fazem internalização em células KIR3DL2+. São também proporcionados anticorpos que inibem a ligação de ligantes naturais de KIR3DL2 (ou sinalização KIR3DL2 induzida pelo ligante). A invenção proporciona anticorpos que possuem tais propriedades e que competem uns com os outros para a ligação a uma região de KIR3DL2 + que inclui domínios 0 definidos por resíduos de aminoácido 1 a 98 dos polipeptídeos KIR3DL2 maduro de SEQ ID No: 1.
[0048] O KIR3DL2 (CD158k) é um homodímero ligado por dissulfeto, com três moléculas de domínio Ig de cerca de 140 kD, descrito por Pende et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. A KIR3DL1 (CD158e1) é uma molécula monomérica de aproximadamente 70 kD, descrita por Colonna e Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408; em que o bolso de ligação a HLA foi descrito por Vivian et al. (2011) Nature 479: 401-405. Os ligantes naturais de KIR3DL2 incluem, entre outros, polipeptídeos de HLA-A e HLA-B, nomeadamente HLA-A3 e HLA-A11 (ver Hansasuta et al (2004) Eur J. Immunol. 34: 1673-1679 e HLA- B27. O HLA-B27 (ver, por exemplo, Weiss et al (1985) Immunobiology 170 (5): 367380 para organização, sequência e expressão do gene HLA-B27 e para multimeros de HLA-B27 e homodímeros HLA-B272 ver Allen et al (1999) J. Immunol 162: 50455048 e Kollnberger et al (2007) Eur J. Immunol 37: 1313-1322). Tal como aqui utilizado, o termo "KIR3D" refere-se a qualquer receptor KIR3D (por exemplo, KIR3DL1 , KIR3DL2, KIR3DS1) individualmente ou coletivamente e o termo "KIR3D" pode ser substituído pelo termo "KIR3DL1, KIR3DL2 e / ou KIR3DS1". Da mesma forma, o termo "KIR3DL" refere-se a qualquer receptor KIR3DL (por exemplo, KIR3DL1, KIR3DL2) individualmente ou coletivamente e o termo "KIR3DL" pode ser substituído pelo termo "KIR3DL1 e/ou KIR3DL2". Os termos "KIR3D", "KIR3DL", "KIR3DL1", "KIR3DL2", "KIR3DS1" incluem, cada um, além disso, qualquer variante, derivado, ou isoforma do gene KIR3D ou proteína (s) codificada a que se referem. Diversas variantes alélicas têm sido relatadas para os polipeptídeos KIR3D (por exemplo KIR3DL2), cada uma destas estando englobada pelos termos respectivos. A sequência de aminoácidos do KIR3DL2 humano maduro (alelo * 002) é mostrada na SEQ ID No: 1, que corresponde ao Genbank com no. de acesso AAB52520 em que a sequência líder de 21 resíduos de aminoácidos foi omitida e a correspondente base de dados de IPD KIR (publicado pela EMBL-EBI, European Bioinformatics Institute, Reino Unido) com No. de acesso KIR00066. LMGGQDKPFL SARPSTWPR GGHVALQCHY RRGFNNFMLY KEDRSHVPIF HGRIFQESFI MGPVTPAHAG TYRCRGSRPH SLTGWSAPSN PLVIMVTGNH RKPSLLAHPG PLLKSGETVI LQCWSDVMFE HFFLHREGIS EDPSRLVGQI HDGVSKANFS IGPLMPVLAG TYRCYGSVPH SPYQLSAPSD PLDIVITGLY EKPSLSAQPG PTVQAGENVT LSCSSWSSYD IYHLSREGEA HERRLRAVPK VNRTFQADFP LGPATHGGTY RCFGSFRALP CVWSNSSDPL LVSVTGNPSS SWPSPTEPSS KSGICRHLHV LIGTSWIFL FILLLFFLLY RWCSNKKNAA VMDQEPAGDR TVNRQDSDEQ DPQEVTYAQL DHCVFIQRKI SRPSQRPKTP LTDTSVYTEL PNAEPRSKW SCPRAPQSGL EGVF SEQ ID NO: 1
[0049] O DNAc de KIR3DL2 (alelo * 002) é mostrado no acesso Genbank de No. U30272. A sequência de aminoácidos percursora (incluindo a sequência líder) de um alelo humano KIR3DL2 *002 é mostrada no acesso Genbank de No. AAB52520. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *001 é mostrada na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00065. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *003 é mostrada no acesso Genbank de No. AAB36593 e no banco de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00067. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *004 é mostrada na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00068. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *005 é mostrada na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00069. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *006 (maduro) é mostrada no Genbank com no. de acesso AAK30053 e na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00070. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *007 (maduro) é mostrada no Genbank com no. de acesso AAK30052 e na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00071. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *008 é mostrada no Genbank com no. de acesso AAK30054 e na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00072. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *009 é mostrada na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00457. A sequência de aminoácidos de um alelo humano KIR3DL2 *011 é mostrada na base de dados IPD KIR com No. de acesso KIR00544. O DNAc que codifica um polipeptídeo KIR3DL1 (CD158e2) (alelo *00101) é mostrado no Genbank com no. de acesso L41269; a sequência de aminoácidos codificada é mostrada no Genbank com no. de acesso AAA69870.
[0050] Onde uma sequência de comando estiver presente em um determinado SEQ ID No descrevendo uma sequência de polipeptídeo KIR3DL2, qualquer referência aos amino ácidos e posições de resíduos será para o polipeptídeo maduro KIR3DL. Cada um dos registos de dados que têm os números de acesso acima são aqui incorporados por referência.
[0051] São proporcionados métodos de utilização dos compostos de ligação a antígeno; por exemplo, um método para inibir a proliferação ou a atividade das células, para a entrega de uma molécula dentro de uma célula (por exemplo, uma molécula tóxica, um marcador detectável, etc), para segmentação, para identificação ou purificação de uma célula, para esgotar, matar ou eliminar uma célula, para reduzir a proliferação de células, o método compreendendo a exposição de uma célula, tal como uma célula T, que expressa um polipeptídeo KIR3DL2, a um composto de ligação ao antígeno da presente invenção que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2. Será entendido que, para os fins da presente invenção, o termo "proliferação celular" pode referir-se a qualquer aspecto do crescimento ou proliferação de células, por exemplo, o crescimento celular, divisão celular, ou de qualquer aspecto do ciclo celular. A célula pode estar em cultura celular (in vitro) ou em um mamífero (in vivo), por exemplo, um mamífero que sofre de uma patologia que expressa KIR3DL2. É também proporcionado um método para induzir a morte de uma célula ou inibir a proliferação ou a atividade de uma célula que expressa um polipeptídeo KIR3DL2, compreendendo expor a célula a um composto de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 ligado a um agente tóxico, numa quantidade eficaz para induzir a morte e / ou inibir a proliferação ou a atividade da célula. Assim, é fornecido um método para tratar um mamífero que sofre de uma doença proliferativa e qualquer condição caracterizada por uma expansão patogênica ou ativação de células que expressam de um polipeptídeo KIR3DL2, o método compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de ligação ao antígeno aqui divulgado ao mamífero. Exemplos de tais condições incluem a síndrome de Sezary, micose fungóide, CTCL, um linfoma de células T periféricas, um PTCLs orto visceral extranodal (por exemplo, um linfoma NK-T ou um linfoma de células T com enteropatia associada (EATL)), um linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), um PTCL-NOS (não especificado) e doenças auto-imunes ou inflamatórias, por exemplo, artrite, espondilite anquilosante e doença cardiovascular.
[0052] São proporcionados métodos para a produção e utilização de anticorpos e outros compostos adequados para o tratamento de distúrbios (por exemplo, cânceres, doenças auto-imunes e inflamatórias) onde a eliminação de células que expressam KIR3DL2 é útil. Os anticorpos, derivados de anticorpos, fragmentos de anticorpos e células para produzi-los são englobados, assim como o são os métodos para produzir os mesmos e métodos de tratamento de doentes utilizando os anticorpos e compostos.
[0053] Uma vez que os anticorpos da presente invenção são específicos para KIR3DL2, eles podem ser usados para uma variedade de fins, incluindo purificação KIR3DL2 ou de células que expressam KIR3DL2, modulação (por exemplo, ativação ou inibição) de receptores que expressam KIR3DL2 in vitro, ex vivo ou in vivo, alvos celulares que expressam KIR3DL2para destruição in vivo, ou especificamente rotulagem/ligação KIR3DL2 in vivo, ex vivo ou in vitro, incluindo por métodos tais como immunoblotting, análise IHC, ou seja, em biópsias congeladas, análise de FACS e imunoprecipitação.
Definições
[0054] Tal como utilizado no presente relatório descritivo, os termos "um" ou "uma" podem significar um ou mais. Tal como utilizado no presente relatório descritivo, quando usado em conjunção com a palavra "compreendendo", os termos "um" ou "uma" podem significar um ou mais do que um. Tal como aqui utilizado o termo "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0055] Quando o termo "compreendendo" é utilizado, este pode ser opcionalmente substituído por "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em".
[0056] Os termos "câncer" e "tumorais", como aqui utilizados, são definidos como um novo crescimento de células ou de tecidos que compreende a multiplicação descontrolada e progressiva. Numa forma de realização específica, espera-se que o curso natural do câncer seja fatal. Em formas de realização específicas, um câncer é invasivo, metastático e / ou anaplásico (perda de diferenciação e de orientação para o outro e de sua estrutura axial).
[0057] Os distúrbios "auto-imunes" incluem qualquer distúrbio, condição ou doença na qual o sistema imunológico monta uma reação contra células independentes ou tecidos, devido a uma quebra na capacidade de distinguir de auto identificação ou de outro modo. Exemplos de doenças auto-imunes incluem artrite reumatóide, artrite vascularitis, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, granulomatose de Wegener, espondilartrite e outros. Uma "desordem inflamatória" inclui qualquer desordem caracterizada por uma resposta imunitária indesejada. Doenças autoimunes e inflamatórias podem envolver qualquer componente do sistema imunológico e podem atingir qualquer tipo de célula ou tecido no corpo.
[0058] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a anticorpos policlonais e monoclonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são atribuídos a uma de cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Vários destes estão ainda divididos em subclasses ou isotipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e semelhantes. Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplificativa (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, possuindo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, que é o principal responsável por reconhecimento de antígeno. A cadeia leve variável (VL) e a cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas, respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados "alfa", "delta", "epsilon", "gama" e "mu", respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e / ou IgM são as classes preferidas de anticorpos aqui empregadas, com IgG sendo particularmente preferidos, porque são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e por serem mais facilmente feitos num ambiente de laboratório. De preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Particularmente preferidos são os anticorpos de outra forma-humanos-adequados humanizados, quiméricos ou humanos. "Anticorpos" também incluem qualquer fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos aqui descritos.
[0059] O termo "liga-se especificamente a" significa que um anticorpo se pode ligar de um modo preferido, num ensaio de ligação competitiva para o parceiro de ligação, e.g. KIR3DL2, tal como avaliado usando tanto às formas recombinantes das proteínas, epítopos das mesmas ou proteínas nativas presentes na superfície das células alvo isoladas. Ensaios de ligação competitiva e outros métodos para se determinar a ligação específica são ainda descritos abaixo e são bem conhecidos na arte.
[0060] Quando um anticorpo é dito como "competindo com" um anticorpo monoclonal específico (por exemplo, 2B12, 10G5), isso significa que o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal num ensaio de ligação utilizando tanto moléculas recombinantes KIR3DL2 ou moléculas de KIR3DL2 expressas na superfície. Por exemplo, se um anticorpo de teste reduz a ligação de 2B12 ou 10G5 a um polipeptídeo KIR3DL2 ou célula KIR3DL2 que expressa num ensaio de ligação, é dito que o anticorpo "compete" respectivamente com 2B12 ou 10G5.
[0061] O termo "afinidade", como aqui utilizado, significa a força da ligação de um anticorpo para um epítopo. A afinidade de um anticorpo é dada pela constante de dissociação KD, definida como [AB] x [Ag] / [Ab-Ag] em que [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo-antígeno, [AB] é a concentração molar do anticorpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do antígeno não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1 / Kd. Exemplos de métodos para se determinar a afinidade de mAb podem ser encontrados em Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1988), Coligan et al, eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983), cujas referências são aqui inteiramente incorporadas por referência. Um método padrão bem conhecidos na arte para se determinar a afinidade de mAbs é a utilização da ressonância de plasmon de superfície (SPR) com varredura (tal como por análise com um dispositivo de análise BIAcore™ SPR).
[0062] Tal como aqui utilizado, um "determinante" designa um local de interação ou ligação em um polipeptídeo.
[0063] O termo "epitopo" refere-se a um determinante antigênico e é a área ou região de um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epitopo da proteína pode compreender resíduos de aminoácidos estão diretamente envolvidos, bem como resíduos de aminoácidos de ligação que são efetivamente bloqueados pelo anticorpo específico de antígeno de ligação, ou peptídeo, isto é, os resíduos de aminoácidos dentro da "pegada" do anticorpo. É a forma mais simples ou menor área estrutural de uma molécula de antígeno complexo, que pode se combinar com, por exemplo, um anticorpo ou um receptor. Os epitopos podem ser lineares ou conformacionais / estruturais. O termo "epitopo linear" é definido como um epitopo composto por resíduos de aminoácidos que são contíguos na sequência linear de aminoácidos (estrutura primária). O termo "epitopo conformacional ou estrutural" é definido como um epitopo composto por resíduos de aminoácidos que não são todos contíguos e, assim, representam partes separadas da sequência linear de aminoácidos que são postos em proximidade um do outro através da dobragem da molécula (estruturas secundária, terciárias e/ou quaternárias). Um epitopo conformacional é dependente da estrutura tridimensional. O termo "conformacional" é, portanto, muitas vezes usado como sinônimo de "estrutural".
[0064] O termo "internalização intracelular", ou "internalização", quando se refere a um polipeptídeo KIR3DL2 e/ou um anticorpo que se liga, tais como, refere-se aos eventos moleculares, bioquímicos e celulares associados com o processo de translocação de uma molécula da superfície extracelular de uma célula de a superfície de uma célula intracelular. Os processos responsáveis pela internalização intracelular de moléculas são bem conhecidos e podem envolver, inter alia, a internalização das moléculas extracelulares (por exemplo, hormônios, anticorpos e moléculas orgânicas pequenas); moléculas associadas à membrana (por exemplo, receptores de superfície celular) e complexos de moléculas associadas à membrana ligados a moléculas extracelulares (por exemplo, um ligante ligado a um receptor transmembranar ou um anticorpo ligado a uma molécula associada à membrana). Assim, "induzir e / ou aumentar a internalização intracelular" compreende os eventos em que a internalização intracelular é iniciada e/ou a taxa e/ou extensão da internalização intracelular é aumentada.
[0065] O termo "esgotando", no que diz respeito a células que expressam KIR3DL2, indica um processo, método, ou um composto que pode matar, eliminar, lisar ou induzir tais supressões, a eliminação ou a lise, de modo a afetar negativamente o número de células que expressam KIR3DL2 presentes numa amostra ou num indivíduo.
[0066] O termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato feito de materiais biológicos. O termo "agente terapêutico" refere-se a um agente que tem atividade biológica.
[0067] Os termos "agente tóxico" e "agente citotóxico" abrangem qualquer composto que pode abrandar, parar ou inverter a proliferação das células, diminuir a sua atividade de alguma forma detectável, direta ou indiretamente ou matá-las. De preferência, os agentes citotóxicos causam a morte celular primariamente por interferirem diretamente com o funcionamento da célula e incluem, mas não estão limitados a, agentes de alquilação, inibidores do fator de necrose tumoral, intercaladores, inibidores de microtúbulos, inibidores da quinase, inibidores de proteassomas e inibidores de topoisomerase. O termo "carga útil tóxica", tal como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade suficiente do agente citotóxico que, quando entregues a uma célula, resulta em morte celular. A entrega de uma carga tóxica pode ser conseguida por administração de uma quantidade suficiente de imunoconjugado compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno ou anticorpo e um agente citotóxico. A entrega de uma carga tóxica pode também ser conseguida por administração de uma quantidade suficiente de um imunoconjugado compreendendo um agente citotóxico, em que o imunoconjugado compreende um anticorpo ou fragmento derivado de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhece e se liga a um fragmento de ligação ao antígeno ou anticorpo.
[0068] Para os fins da presente invenção, um anticorpo "humanizado" ou "humano" refere-se a um anticorpo em que a região de estrutura constante e variável derivada de uma ou mais imunoglobulinas humanas é fundida com a região de ligação, por exemplo a CDR, de uma imunoglobulina animal. Tais anticorpos são concebidos para manter a especificidade de ligação do anticorpo não humano a partir do qual as regiões são derivadas de ligação, mas, para evitar uma reação imune contra o anticorpo não-humano. Tais anticorpos podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos ou outros animais que tenham sido "modificados" para produzir anticorpos humanos específicos em resposta ao desafio antigênico (ver, por exemplo, Green et al (1994) Nature Genet 07:13;. Lonberg et al (1994) Nature 368: 856; Taylor et al (1994) Int Immunol 6: 579, cujos ensinamentos i são aqui incorporados na sua totalidade por referência). Um anticorpo completamente humano pode também ser construído por métodos genéticos ou cromossômicos de transfecção, bem como com a tecnologia de apresentação de fagos, os quais são conhecidos na arte (ver, por exemplo, McCafferty et al (1990) Nature 348: 552-553). Os anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (ver, por exemplo, os documentos de patente norte-americanos N°s. 5567610 e 5229275, que são incorporados na sua totalidade por referência).
[0069] Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma sua porção, é alterada, substituída ou trocada de modo a que o local de ligação ao antígeno (região variável) é ligada a uma região constante de uma diferente ou alterada classe, a função efetora e / ou espécies, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo químico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, droga, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção do mesmo, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável com uma especificidade antigeno diferente ou alterada.
[0070] Os termos "domínio de Fc", "porção de Fc" e "região Fc" referem-se a um fragmento C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, desde cerca de aminoácido (aa) 230 até cerca do aa 450 de Y humano (gama) da cadeia pesada ou a sua sequência homóloga em outros tipos de cadeias pesadas de anticorpo (por exemplo, α, δ, ε e μ para anticorpos humanos), ou um alotipo que ocorre naturalmente da mesma.
[0071] O termo "citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células" ou "ADCC" é um termo bem compreendido na arte e refere-se a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) reconhecem um anticorpo ligado uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. Células citotóxicas não específicas que mediam ADCC incluem células assassinas naturais (NK), monócitos, macrófagos, neutrófilos e eosinófilos.
[0072] Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" referem-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado no seu estado nativo. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que é a espécie predominante presente numa preparação é substancialmente purificada.
[0073] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados intercambiavelmente aqui para se referir um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um produto químico artificial mimético de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de ocorrência natural de aminoácidos e de polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural.
[0074] O termo "recombinante" quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou proteína ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que de outra forma são anormalmente expressos, sob expressa ou não expressa de todo.
[0075] O termo "alteração", quando se refere a uma sequência de aminoácidos (por exemplo, "alteração de aminoácidos"), entende-se uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção de uma sequência de polipeptídeo. Por "alteração" ou "modificação aminoácido” entende-se uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção de uma sequência de polipeptídeo. Por "substituição de aminoácidos” ou “substituição" entende-se, aqui, a substituição de um aminoácido numa determinada posição numa sequência da proteína com outro aminoácido. Por exemplo, os P14S de substituição referem-se a uma variante de um polipeptídeo progenitor, em que a prolina na posição 14 é substituída por serina. Uma "variante" de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma polipeptídeo de referência, tipicamente um polipeptídeo "pai" ou nativo. A variante de polipeptídeo pode possuir uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções em certas posições no interior da sequência de aminoácidos nativa.
[0076] Tal como aqui utilizado, o termo anticorpo que "se liga" um polipeptídeo ou epitopo designa um anticorpo que se liga referida determinante com especificidade e/ou afinidade.
[0077] O termo "identidade" ou "idêntica", quando utilizado em uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, refere-se ao grau de relação de sequências entre os polipeptídeos, como determinado pelo número de correspondências entre as cadeias de dois ou mais resíduos de aminoácidos . O termo "identidade" mede a percentagem de coincidências idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de hiato (se houver) abordados por um determinado modelo matemático ou programa de computador (i.e., "algoritmos"). A identidade dos polipeptídeos relacionados podem ser prontamente calculada por processos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
[0078] Os métodos preferidos para se determinar a identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para se determinar a identidade encontram-se descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al, Nucl Acid Res 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, Wis), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX está disponível ao público a partir do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al BCN / NLM / NIH Bethesda, Md 20894; Altschul et al., Supra). O algoritmo de Smith Waterman, bem conhecido, pode também ser utilizado para determinar a identidade.
Anticorpos e epítopos
[0079] A presente invenção é baseada, em parte, na determinação de sequências de esqueleto aceitador humano modificado em que os CDR de anticorpos podem ser incorporados de tal modo que a região variável anti-KIR3DL2 resultante retém a capacidade de ligar o domínio D0 de KIR3DL2 humano.
[0080] Tais regiões variáveis humanizadas e anticorpos que os contêm podem se ligar a um segmento de KIR3DL2 (SEQ ID No: 1) compreendendo os resíduos I60 e / ou G62. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epitopo compreendendo um ou mais dos resíduos de I60 e / ou G62, mas não resíduos R13, A25 e / ou Q27. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epitopo compreendendo um ou mais dos resíduos de I60 e / ou G62, bem como um ou mais dos resíduos de P14, S15 e / ou H23.
[0081] A menos que especificado de outro modo, a nomenclatura de aminoácidos com a numeração Abnum para imunoglobulinas é utilizado ao longo deste relatório descritivo (ver Abhinandan e Martin, (2008) Molecular Immunology 45: 3832-3839, cuja divulgação é aqui incorporada por referência). A numeração da sequência usando o sistema Abnum pode também ser gerada automaticamente em http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum. No entanto, será entendido que um técnico no assunto pode utilizar um sistema de numeração alternativo e identificar as posições correspondentes à numeração Abnum. Para os resíduos 38 e 39 nas respectivas cadeias pesadas e leves, a posição Abnum corresponde às mesmas posições no sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5a ed., United States Public Health Service, Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD).
[0082] Quando o anticorpo compreende uma glutamina no resíduo 38 na sequência do domínio VL, estruturas aceitadoras de VH humano preferidas compreendem uma glutamina no resíduo 39 na sequência de domínio VH.
[0083] Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia pesada do subgrupo humano VH1 em conjunto com JH6, opcionalmente os anticorpos compreendem IGHV1 -46*03 em conjunto com IGHJ6*01. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia leve do subgrupo humano VK1, opcionalmente IGKV1-NL1*01.
[0084] Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia pesada do subgrupo humano VH1 e / VH7, em conjunto com JH6, opcionalmente os anticorpos compreende IGHV7-4-*02 e IGHV1-01-c*01, juntamente com IGHJ6*01. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia leve do subgrupo humano VK1 e VK4, opcionalmente IGKV4-1*01 e IGKV1-39*01, em conjunto com JH4, opcionalmente IGKJ4*01.
[0085] O anticorpo humanizado pode compreender ainda uma ou mais retro- mutações nas sequências estruturais humanas para, por exemplo, aumentar a afinidade, estabilidade ou outras propriedades do anticorpo humanizado.
[0086] Em um outro aspecto, proporcionam-se anticorpos humanizados específicos que são versões humanizadas de 2B12 ou 10G5. Tais anticorpos são tipicamente caracterizados por compreender resíduos de aminoácido chave de 2B12 ou 10G5 CDR nas sequências estruturais humanas.
Anticorpo 10G5
[0087] Exemplos de sequências de aminoácidos VH e VL humanizadas do anticorpo 10G5 são mostradas nas SEQ ID Nos: 13 a 17 e 8 a 12, respectivamente. Num aspecto, é proporcionado um anticorpo humanizado isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos SYTMH como estabelecida na SEQ ID No: 2, ou uma sequência de pelo menos três ou quatro aminoácidos da mesma; uma região HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos YINPSSGYTENNRKF como estabelecida na SEQ ID No: 3, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos; uma região HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos LGKGLLPPFDY como estabelecida na SEQ ID No: 4, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos; uma região LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos RASENIYSNLA como estabelecida na SEQ ID No: 5, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos; uma região LCDR2 compreendendo uma sequência de AATNLAD de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No: 6, ou uma sequência de, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos seus aminoácidos contíguos; uma região LCDR3 compreendendo uma sequência de QHFWGTPYT de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No: 7, ou uma sequência de, pelo menos, 5, 6, 7, 8 ou dos seus aminoácidos contíguos.
[0088] Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo 10G5 humanizado isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano, compreendendo: a) uma região CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 2; b) uma região CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 3; c) uma região CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 4; d) uma região CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 5; e) uma região CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 6; f) uma região CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 7; e g) sequências estruturais humanas.
[0089] Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia pesada do subgrupo humano VH1 em conjunto com JH6, opcionalmente o anticorpo compreende IGHV1-46*03, em conjunto com IGHJ6*01. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia leve do subgrupo humano VK1, opcionalmente IGKV1-NL1*01.
[0090] Opcionalmente, a estrutura humana compreende uma ou mais mutações, por exemplo, retro-mutações. O exemplo 1 mostra a identificação de estruturas e retro- mutações para regiões variáveis 10G5. Em comparação com 10G5 quimérico, estes mutantes testados mostraram um perfil de ligação comparável ao das duas concentrações de mAb utilizadas no ensaio. Formas de realização da invenção incluem, assim, as variantes de cadeia pesada de 10G5 retro-mutada com retro- mutações em qualquer um ou mais (ou qualquer combinação de) dos seguintes resíduos, utilizando a numeração de Abnum:
[0091] 10G5 VH: 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72a, 75.
[0092] Outras formas de realização da invenção incluem, assim, as variantes de cadeia retro-mutada 10G5 leve possuindo retro-mutações em qualquer um ou mais (ou qualquer combinação) dos seguintes resíduos:
[0093] 10G5 VL: 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76, 100.
[0094] O anticorpo humanizado pode compreender ainda uma ou mais mutações adicionais (por exemplo retro-mutações) nas sequências estruturais humanas para, por exemplo, aumentar a afinidade, estabilidade ou outras propriedades do anticorpo humanizado.
[0095] Num aspecto, é proporcionado um anticorpo 10G5 humanizado isolado que se liga ao polipeptídeo KIR3DL2 humano, compreendendo: a) uma região CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 2; b) uma região CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 3; c) uma região CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 4; d) uma região CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 5; e) uma região CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 6; f) uma região CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 7; e g) sequências de estrutura humana, em que um resíduo de glutamina (Q) está presente na posição 39 do domínio VH e na posição 38 do domínio VL. Opcionalmente, as sequências estruturais humanas ainda compreendem uma ou mais retro-mutações.
[0096] O resíduo de glutamina (Q) na posição 39 pode existir naturalmente no âmbito da sequência de VH humano, ou pode ser introduzido por substituição de aminoácidos ou outra modificação da sequência.
[0097] Num outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos humanizados que compreendem um domínio VH possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou mais de identidade) com o VH domínio de 10G5 de SEQ ID Nos: 13 a 17. Num outro aspecto particular, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que se liga a KIR3DL2, compreendendo (a) um domínio VH que compreende os resíduos de CDR não humano incorporados num domínio VH humano, em que o domínio VH é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos, 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico a um 10G5 VH humanizado de SEQ ID Nos: 13 a 17 e (b) (a) um domínio VL que compreende os resíduos de CDR não humano incorporados num domínio humano VL, em que o domínio VL é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao 10G5 VL humanizado de SEQ ID Nos: 8 a 12.
Anticorpo 2B12
[0098] Exemplos de sequências de aminoácidos de VH e VL humanizados de anticorpos 2B12 são mostradas na SEQ ID Nos: 24 a 28 e 29 a 33, respectivamente. Num aspecto, é proporcionado um anticorpo humanizado isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de TAGMQ de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No: 18, ou uma sequência de pelo menos três ou quatro dos seus aminoácidos contíguos; uma região HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WINSHSGVPKYAEDFK como estabelecida na SEQ ID No: 19, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos; uma região HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos GGDEGVMDY como estabelecida na SEQ ID No: 20, ou uma sequência de, pelo menos, 5, 6, 7, 8 ou dos seus aminoácidos contíguos; uma região LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos KASQDVSTAVA como estabelecida na SEQ ID No: 21, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos; uma região LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WTSTRHT como estabelecida na SEQ ID No: 22, ou uma sequência de, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos seus aminoácidos contíguos; e / ou uma região LCDR3 compreendendo uma sequência de QQHYSTPWT de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID No: 23, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8 ou dos seus aminoácidos contíguos.
[0099] Em qualquer das formas de realização aqui apresentadas, qualquer um dos CDR 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves podem ser caracterizados por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos seus aminoácidos contíguos e / ou como tendo uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listado na SEQ ID No. correspondente.
[00100] Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo humanizado 2B12 isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano, compreendendo: a) uma região CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 18; b) uma região CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 19; c) uma região CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 20; d) uma região CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 21; e) uma região CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 22; f) uma região CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 23; e g) sequências estruturais humanas.
[00101] Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia pesada do subgrupo humano VH1 e / ou em conjunto com JH6 VH7, opcionalmente o anticorpo compreende IGHV7-4-1*02 e / ou IGHV1-c*01, em conjunto com IGHJ6*01. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia leve do subgrupo humano VK1 e / ou VK4, opcionalmente IGKV4-1*01 e/ou IGKV1-39 * 01, em conjunto com JH4, opcionalmente IGKJ4*01.
[00102] Opcionalmente, uma estrutura humana compreende uma ou mais mutações, por exemplo retro-mutações. O exemplo 1 mostra a identificação de estruturas e retro-mutações nas regiões variáveis 2B12. Em comparação com o 2B12 quimérico, estes mutantes testados mostraram um perfil de ligação comparável ao das duas concentrações de mAb utilizadas no ensaio. Formas de realização da invenção incluem, assim, os variantes 2B12 da cadeia pesada retro-mutada com retro- mutações em qualquer uma ou mais (ou qualquer combinação de) dos seguintes resíduos, utilizando a numeração de Abnum: 2B12 VH: 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72c, 91, 108.
[00103] Outras formas de realização da invenção incluem, assim, os variantes 2B12 de cadeia leve retro-mutada com retro-mutações em qualquer uma ou mais (ou qualquer combinação) dos seguintes resíduos: 2B12 VL: 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78, 104.
[00104] O anticorpo humanizado pode compreender ainda uma ou mais mutações adicionais (por exemplo retro-mutações) nas sequências estruturais humanas para, por exemplo, aumentar a afinidade, estabilidade ou outras propriedades do anticorpo humanizado.
[00105] Num aspecto, é proporcionado um anticorpo humanizado 2B12 isolado que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 humano, compreendendo: a) uma região CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 18; b) uma região CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 19; c) uma região CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 20; d) uma região CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 21; e) uma região CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 22; f) uma região CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 23; e g) sequências de estrutura humana, em que um resíduo de glutamina (Q) está presente na posição 39 do domínio VH e na posição 38 do domínio VL. Opcionalmente, as sequências estruturais humanas ainda compreendem uma ou mais retro-mutações.
[00106] Num outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos humanizados que compreendem um domínio VH possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou mais de identidade) com o VH domínio de 2B12 2B12 humanizado ou da SEQ ID N ° s: 29 a 33. Num outro aspecto particular, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que se liga a KIR3DL2, compreendendo (a) um domínio VH que compreende os resíduos de CDR não humano incorporados num domínio VH humano, em que o domínio VH é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos, 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao VH humanizado 2B12 de SEQ ID Nos: 29 a 33 e (b) (a) um domínio VL que compreende os resíduos de CDR não humano incorporados num domínio VL humano, em que o domínio VL é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao 2B12 humanizado VL de SEQ ID Nos: 24 a 28.
[00107] O resíduo de glutamina (Q) na posição 39 pode existir naturalmente no âmbito da sequência de VH humano, ou pode ser introduzido por substituição de aminoácidos ou outra modificação da sequência.
[00108] O anticorpo 10G5 ou 2B12 pode ainda compreender um domínio constante de IgG humana (por exemplo, IgG1, IgG4). Opcionalmente, o domínio constante é um domínio de IgG1 que compreende uma modificação para aumentar a ligação ao receptor Fc. Opcionalmente, o domínio constante é um domínio de IgG (por exemplo, IgG1, IgG4) que compreende uma modificação para diminuir a ligação ao receptor Fc.
[00109] Para a produção recombinante de anticorpos humanizados, as regiões VH e VL humanizadas, ou versões de uma sua variante, podem ser clonadas em vetores de expressão que codificam todo o comprimento ou as regiões constantes truncadas a partir de um anticorpo humano de acordo com métodos recombinantes convencionais (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989). O resultado é uma linha celular transfectada que expressa e segrega a molécula de anticorpo humanizado de interesse, que compreende as regiões VH e VL selecionadas e as regiões constantes. As sequências de DNAc que codificam as regiões constantes de anticorpos humanos são conhecidas.
[00110] Se desejado, a classe de um anticorpo humanizado também pode ser "comutada" por métodos conhecidos. As técnicas de mudança de classe podem ser usadas para converter uma subclasse de IgG para outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da invenção pode ser alterada por mudança de isotipo para, por exemplo, anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 para várias utilizações terapêuticas.
[00111] Várias formas de anticorpos humanizados (por exemplo, 10G5 e 2B12) são contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um tipo de Fab ou outro fragmento aqui descrito. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um de comprimento completo ou anticorpo intacto, tal como um de comprimento completo ou de anticorpo IgG1 ou IgG4 intacto. A região constante pode ainda ser modificada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, em uma região constante de IgG4, o resíduo S241 pode ser mutado para um resíduo de prolina (P), para permitir a formação de pontes dissulfeto completa na sua dobra (ver, por exemplo, Angal et al, Mol Immunol 1993; 30: 105-8 ).
[00112] Numa forma de realização, em que é desejado o bloqueio de KIR3DL2 (por exemplo, a inibição da ligação de KIR3DL2 pelos seus ligantes HLA) sem a depleção (por exemplo, através de CDC ou ADCC) da célula que expressa o KIR3DL2, o anticorpo humanizado é um anticorpo IgG4 de comprimento total ou um seu fragmento. Numa forma de realização, em que é desejada a depleção (por exemplo, através de CDC ou ADCC), da célula que expressa o KIR3DL2, o anticorpo humanizado é um anticorpo IgG1 de comprimento completo ou um seu fragmento que compreende uma região Fc que se liga a receptores de Fc (por exemplo, CD16). O anticorpo pode ainda compreender um domínio constante de IgG1 humano, compreendendo uma modificação, por exemplo para aumentar a ligação ao receptor Fc.
[00113] Tendo em vista a capacidade dos anticorpos anti-KIR3DL2 (particularmente os anticorpos de não internalização) para induzir ADCC e CDC, os anticorpos podem também ser feitos com modificações que aumentam a sua capacidade para ligar receptores Fc, que podem afetar as funções efetoras, tais como por anticorpos dependentes de citotoxicidade, desgranulação dos mastócitos e fagocitose, bem como imunomoduladores, tais como sinais de regulação da proliferação dos linfócitos e secreção de anticorpos. As modificações típicas incluem regiões constantes modificadas de IgG1 humano, compreendendo uma modificação de ácido, de pelo menos um aminoácido (por exemplo de substituição, deleções, inserções) e/ou tipos de glicosilação, por exemplo, hipofucosilação alterada. Tais modificações podem afetar a interação com os receptores de Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FCYRIIA (CD32A) e FcyRIII (CD16) são ativados (isto é, há um reforço no sistema imunológico), enquanto os receptores FCYRIIB (CD32B) são receptores de inibição (isto é, com o amortecimento do sistema imunológico). A modificação pode, por exemplo, aumentar a ligação do domínio Fe de células efetoras em FcYRIIIa (e.g. NK). Exemplos de modificações são fornecidos no documento de patente PCT/EP2013/069302, depositado em 17 de setembro de 2013, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.
[00114] Em algumas formas de realização, os anticorpos compreendendo uma região Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácidos) no domínio CH3 da região Fc. Em outras formas de realização, os anticorpos compreendendo uma região Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácidos) no domínio CH2 da região Fe, que é definida como estendendo-se desde os aminoácidos 231 a 341. Em algumas formas de realização, os anticorpos compreendem, pelo menos, duas modificações de aminoácidos (por exemplo, possuindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácidos), em que, pelo menos, uma tal modificação se dá na região CH3 e, pelo menos, uma tal alteração se dá na região CH2. Também são englobados grupos amino ácido com modificação na região de dobra. Numa forma de realização, são englobadas modificações de amino ácido no domínio CH1 da região Fe, que é definida como estendendo-se desde os aminoácidos 216 a 230. Qualquer combinação de modificações de Fc pode ser feita, por exemplo, qualquer combinação de diferentes modificações descritas nos documentos de patente norte-americanos N°s US7.632.497; US7.521.542; US7.425.619; US7.416.727; US7.371.826; US7.355.008; US7.335.742; US7.332.581; US7.183.387; US7.122.637; US6.821.505 e US6.737.056; em documentos de patente PCT Nos WO2011/109400; WO2008/105886; WO2008/002933; WO2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 e WO 04/063351; e em Lazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 103 (11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soe. Trans. 30 (4): 487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277 (30): 26.733-26.740 e Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604).
[00115] Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem compreender uma região Fc variante, em que a região Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais aminoácidos com modificações) em relação a uma região Fc de tipo selvagem, de tal modo que a molécula tem uma função efetora aumentada em relação a uma molécula compreendendo uma região Fc de tipo selvagem, opcionalmente, em que a região Fc variante compreende uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 221, 239, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399, 402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 e / ou 439. Em uma forma de realização, anticorpos anti- KIR3DL2 podem compreender uma região Fc variante, em que a região Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácidos) em relação a uma região Fc de tipo selvagem, de tal modo que a molécula tem uma função efetora aumentada em relação a uma molécula compreendendo uma região Fc de tipo selvagem, opcionalmente, em que a região Fc variante compreende uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 239, 298, 330, 332, 333 e / ou 334 (por exemplo, substituições S239D, S298A, A330L, I332E, E333A e / ou K334A).
[00116] Numa forma de realização, os anticorpos possuindo variantes de tipo selvagem ou regiões Fc podem ter padrões de glicosilação alterados que aumentam a capacidade de ligação dos anticorpos ao receptor Fc. Tais modificações de carbohidratos podem ser conseguidas por, por exemplo, expressar o anticorpo numa célula hospedeira com engrenagem de glicosilação alterada. As células com engrenagem de glicosilação alterada têm sido descritas na arte e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, assim como, o documento de patente europeu No EP 1176195 e publicações de patente PCT WO 06/133148; WO 03/035835; e WO 99/54342, cada um das quais sendo aqui incorporado por referência na sua totalidade. Num aspecto, os anticorpos são hipofucosilados na sua região constante. Tais anticorpos podem incluir uma alteração de aminoácidos ou podem não compreender uma alteração de aminoácidos, mas serem produzidos ou tratados sob condições de forma a produzir tais hipofucosilação. Num aspecto, uma composição de anticorpo compreende um anticorpo quimérico, humano ou humanizado aqui descrito, em que pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 75, 85, 90, 95% ou substancialmente todas as espécies de anticorpo na composição têm uma região constante que compreende uma estrutura de carbohidrato do núcleo (por exemplo, estruturas de complexos, híbridos e de manose elevada), que carece de fucose. Numa forma de realização, é fornecida uma composição de anticorpo que é livre de anticorpos que compreendem uma estrutura central de carbohidrato tendo a fucose. O carbohidrato do núcleo será, de preferência, uma cadeia de açúcar em Asn297.
Produção de Anticorpos Anti-KIR3DL2
[00117] Os anticorpos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na arte. Normalmente, eles são produzidos por imunização de um animal não-humano, de preferência um rato (mouse), com um imunogênio compreendendo um polipeptídeo KIR3DL2, de preferência um polipeptídeo KIR3DL2 humano. Os anticorpos também podem ser produzidos por seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas.
[00118] A invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos anti-KIR3DL2 aqui descritos, assim como vetores e células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos. Num aspecto, um fragmento de ácido nucleico que codifica o agente de acordo com a invenção é fornecido. Num aspecto, um fragmento de ácido nucleico que codifica o agente de acordo com a invenção, o qual é selecionado a partir de um DNA e um fragmento de RNA. Também são fornecidos métodos de produção de tais anticorpos anti-KIR3DL2 usando técnicas recombinantes, tais como, por exemplo, uma cultura de células hospedeiras adequadas compreendendo tais ácidos nucleicos ou vetores de modo a que o ácido nucleico seja expresso e o anticorpo humanizado produzido. Antes de cultura, a célula hospedeira pode ser, por exemplo, co-transfectada com um vetor compreendendo os ácidos nucleicos que codificam um domínio variável pesado e com um vetor compreendendo o ácido nucleico que codifica um domínio leve variável. Além disso, o anticorpo pode ser recuperado e / ou purificado a partir da cultura da célula hospedeira utilizando técnicas conhecidas. Os vetores úteis, as células hospedeiras e técnicas são descritas mais abaixo.
[00119] Geralmente, para a produção recombinante do anticorpo, um ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido num vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão, tipicamente operativamente ligado a um ou mais elementos de controle de expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores são conhecidos e disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição.
[00120] A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam a KIR3DL2, em particular substancialmente ou essencialmente o mesmo epitopo que 10G5 anticorpo monoclonal ou 2B12, pode ser prontamente determinada utilizando-se qualquer um de uma variedade de ensaios de rastreamento imunológico em que a concorrência de anticorpo pode ser avaliada. Muitos destes ensaios são rotineiramente praticados e são bem conhecidos na arte (ver, e. g., o documento de patente norte-americano No. US5.660.827). Será entendido que, na verdade, a determinação do epitopo ao qual um anticorpo aqui descrito se liga não é de modo algum necessária para se identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal aqui descrito. Qualquer um de uma ampla variedade de ensaios pode ser utilizado para se avaliar a ligação de um anticorpo a KIR3DL2 humano. Protocolos baseados em testes ELISA, radioimunoensaios, Western blotting, BIACORE e outros ensaios de competição, inter alia, são adequados para utilização e são bem conhecidos na arte.
[00121] Por exemplo, quando os anticorpos teste a serem examinados são obtidos a partir de diferentes animais de origem, ou são até mesmo de um isotipo de Ig diferente, um ensaio de competição simples podem ser empregado, no qual os anticorpos de controle (um anticorpo tal como 10G5 ou 2B12) e teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo polipeptídeos KIR3DL2. Protocolos baseados em transferência de western e a utilização da análise de BIACORE são adequados para uso em tais estudos de competição.
[00122] Em certas formas de realização, é feita uma pré-mistura os anticorpos de controle (10G5 ou 2B12), com quantidades variáveis dos anticorpos de teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1: 100) durante um período de tempo antes de se aplicar a amostra de antígeno KIR3DL2. Em outras formas de realização, o controle e quantidades variadas de anticorpos teste podem simplesmente ser misturados durante a exposição ao antígeno de amostra KIR3DL2. Enquanto se pode distinguir a ligação a partir de anticorpos livres (por exemplo, usando técnicas de separação ou de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados) e 10G5 ou 2B12 a partir dos anticorpos de teste (por exemplo, usando técnicas específicas para cada espécie ou anticorpos secundários específicos do isotipo ou por rotulagem específica de 10G5 ou 2B12 com um marcador detectável) pode-se determinar se os anticorpos de teste reduzem a ligação de 10G5 ou 2B12 aos antígenos, o que indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epitopo que 10G5 ou 2B12. A ligação dos anticorpos de controle (marcado) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante pode servir como o valor de controle alto. O valor de controle baixo pode ser obtido por incubação do anticorpo marcado (10G5 ou 2B12) com os anticorpos não marcados do exato mesmo tipo (10G5 ou 2B12), onde a competição iria ocorrer e se reduz a ligação dos anticorpos marcados. Num ensaio de teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo teste que reconhece substancialmente o mesmo epitopo e que "reage de modo cruzado" ou compete com o anticorpo marcado (10G5 ou 2B12). Qualquer anticorpo teste que reduz a ligação de 10G5 ou 2B12 a antígenos KIR3DL2 por, pelo menos, cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% ou 90% (por exemplo, cerca de 65 a 100%), em qualquer proporção de 10G5 ou 2B12: anticorpo de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1: 100 é considerado como sendo um anticorpo que se liga a substancialmente o mesmo epitopo ou determinante como 10G5 ou 2B12. De preferência, tal anticorpo de teste reduz a ligação do antígeno ao 10F6 KIR3DL2 por, pelo menos, cerca de 90% (por exemplo, cerca de 95%).
[00123] A competição também pode ser avaliada, por exemplo, com um teste de citometria de fluxo. Num tal teste, células portadoras de um dado polipeptídeo KIR3DL2 podem ser incubadas primeiro com 10G5 ou 2B12, por exemplo, e, em seguida, com o anticorpo de teste marcado com um fluorocromo ou biotina. O anticorpo é designado como competindo com 10F6 se a ligação obtida após pré- incubação com uma quantidade saturante de 10G5 ou 2B12 é de cerca de 80%, de preferência cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%, 20% ou 10%) da ligação (tal como medida por meio de fluorescência) obtida pelo anticorpo sem pré-incubação com 10G5 ou 2B12. Em alternativa, um anticorpo é designado como competindo com 10G5 ou 2B12 se a ligação obtida com um anticorpo marcado 10G5 ou 2B12 (por um fluorocromo ou biotina) em células pré-incubadas com uma quantidade saturante de anticorpo de teste é de cerca de 80%, de preferência cerca de 50%, cerca de 40%, ou menos (por exemplo, cerca de 30%, 20% ou 10%) da ligação obtida sem pré-incubação com o anticorpo de teste.
[00124] Um ensaio de competição simples no qual um anticorpo de teste é pré- adsorvido e aplicado a concentração de saturação a uma superfície sobre a qual um antígeno de KIR3DL2 é imobilizado pode também ser empregada. A superfície no ensaio de competição simples é preferivelmente um chip BIACORE (ou outros meios adequados para a análise de ressonância de plasma de superfície). O anticorpo de controle (por exemplo, 10G5 ou 2B12) é então posto em contato com a superfície, a uma concentração saturante de KIR3DL2 e a ligação do anticorpo de controle de superfície de KIR3DL2 é medida. Esta ligação do anticorpo de controle é comparada com a ligação do anticorpo de controle à superfície da contendo KIR3DL2 na ausência de anticorpo de teste. Num ensaio de teste, uma diminuição significativa na ligação da superfície contendo KIR3DL2 pelo anticorpo de controle, na presença de um anticorpo de teste, indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo de controle de tal modo que o anticorpo de teste "tem uma reação cruzada” com o anticorpo de controle. Qualquer anticorpo teste que reduz a ligação de controle (tais como 10G5 ou 2B12) do anticorpo a um antígeno KIR3DL2 por, pelo menos, cerca de 30% ou mais, de preferência cerca de 40%, pode ser considerado como sendo um anticorpo que se liga a substancialmente o mesmo epitopo ou determinante como controle (por exemplo, 10G5 ou 2B12). De um modo preferido, um tal anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle (por exemplo, 10G5 ou 2B12) ao antígeno KIR3DL2 por, pelo menos, cerca de 50% (e. g., pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, ou mais). Será entendido que a ordem dos anticorpos de teste e de controle pode ser invertida, isto é, o anticorpo de controle pode ser primeiro ligado à superfície e o anticorpo de teste ser posto em contato com a superfície depois de um ensaio de competição. De um modo preferido, o anticorpo que possui uma afinidade mais elevada para o antígeno KIR3DL2 é ligado à superfície em primeiro lugar, uma vez que será de se esperar que a redução na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos são de reação cruzada) será de maior magnitude. Outros exemplos de tais ensaios são fornecidos por, por exemplo, Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, cuja descrição é aqui incorporada por referência.
[00125] De um modo preferido, os anticorpos monoclonais que reconhecem um epitopo de KIR3DL2 vão reagir com um epitopo que está presente em uma percentagem substancial de, ou mesmo todas as células relevantes, por exemplo, células T CD4 + malignas, células SS ou MF de um paciente, mas não vão reagir significativamente com outras células, isto é, células que não expressam KIR3DL2. Num aspecto, os anticorpos anti-KIR3DL2 se ligam a KIR3DL2, mas não se ligam a KIR3DL1 e / ou KIR3DS1.
[00126] Em algumas formas de realização, os anticorpos ligam-se a células que expressam KIR3DL2 a partir de um indivíduo ou indivíduos com uma doença caracterizada pela expressão de células de KIR3DL2-positiva, isto é, um indivíduo que é um candidato para tratamento com um dos métodos aqui descritos utilizando um anti anticorpo -KIR3DL2. Sendo assim, uma vez que um anticorpo que reconhece especificamente KIR3DL2 em células é obtido, ele pode ser testado quanto à sua capacidade para se ligar a células de KIR3DL2-positivas (por exemplo, células T CD4 + malignas), retiradas de um doente com uma doença tal como SS ou MF. Em particular, antes do tratamento de um paciente com um dos anticorpos da presente invenção, será benéfico se testar a capacidade do anticorpo para se ligar células malignas retiradas do paciente, por exemplo, numa amostra de sangue, para maximizar a probabilidade de que a terapia será benéfica no paciente.
[00127] Numa forma de realização, os anticorpos são validados num imunoensaio para testar a sua capacidade para se ligar a células que expressam KIR3DL2, e.g. as células T CD4 +, células malignas CD4 + pró-inflamatórias. Por exemplo, linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram obtidos de uma pluralidade de pacientes e as células T CD4 + foram enriquecidas a partir dos PBL, por exemplo, por citometria de fluxo utilizando anticorpos relevantes (por células CD4 + malignas ver, por exemplo, Bagot et al. (2001) Blood 97: 1388-1391, cuja divulgação é aqui incorporada por referência), ou células T CD4 + CD28 são isoladas por separação magnética sobre uma coluna de MACS (Miltenyi Biotec). A capacidade de um determinado anticorpo para se ligar às células é, em seguida, avaliada utilizando métodos padrão bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Os anticorpos que são encontrados como se ligando a uma parte substancial (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais) de células que se sabe expressarem KIR3DL2, e.g. células T, a partir de uma percentagem significativa de indivíduos ou doentes (por exemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou mais) são adequadas para utilização na presente invenção, tanto para fins de diagnóstico para determinar a presença ou o nível de células T malignas num paciente quanto para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos, por exemplo, para utilização para aumentar ou diminuir o número de células T malignas ou sua atividade. Para se avaliar a ligação dos anticorpos às células, os anticorpos podem ser direta ou indiretamente marcados. Quando indiretamente marcados, é tipicamente adicionado um anticorpo secundário, rotulado. A ligação dos anticorpos às células pode então ser detectada utilizando, por exemplo, análises citofluorométricas (por exemplo FACScan). Tais métodos são bem conhecidos dos técnicos no assunto.
[00128] A determinação de se um anticorpo se liga dentro de uma região de epítopo pode ser efetuada de maneiras conhecidas para a pessoa versada no assunto. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento / caracterização, uma região de epitopo para um anticorpo anti-KIR3DL2 pode ser determinada por epitopo “pé-de-impressão" utilizando modificação química das aminas / carboxilas expostas na proteína KIR3DL2. Ver, e. g., Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Outro exemplo de uma técnica de identificação do epítopo adequada é o mapeamento de epitopo por ressonância magnética nuclear (RMN). Ver, e. g., Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al. Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24. O mapeamento / caracterização de epitopo também pode ser realizado utilizando-se métodos de espectrometria de massas. Ver, por exemplo, Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 and Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-801. Mutagênese sítio dirigida é uma outra técnica útil para a elucidação de um epitopo de ligação. Por exemplo, em modo "varrimento de alanina", cada resíduo no interior de um segmento de proteína é re-colocado por um resíduo de alanina e as consequências para afinidade de ligação são medidas. Ver, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383-386; e Wells, Proc Natl Acad Sci EUA 1996; 93: 1-6. Outras formas de ensaio "free-label" para avaliação de epitopo incluem ressonância de superfície de plasma (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência reflectométrica (RIFS). Ver, por exemplo, Fagerstam et al, Journal of Molecular Recognition 1990; 3:. 208-14; Nice, et al., J. Chromatogr. 1993; 646: 159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308-3311; Kroger et al, Biosensors and Bioelectronics., 2002; 17: 937-944.
[00129] Deve também ser notado que uma ligação ao mesmo ou a substancialmente o mesmo epitopo que um anticorpo aqui descrito pode ser identificada em um ou mais dos ensaios de competição ou ensaios de exemplo para a ligação a polipeptídeos mutantes KIR3DL2 descritos no pedido de patente PCT de No. PCT / EP2013 / 069.302 depositado em 17 de Setembro de 2013. A ligação do anticorpo anti-KIR3DL2 de células transfectadas com os mutantes KIR3DL2 é medida e comparada com a capacidade do anticorpo anti-KIR3DL2 de se ligar ao polipeptídeo KIR3DL2 de tipo selvagem (SEQ ID No: 1). Uma redução na ligação entre um anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 mutante, tal como aqui utilizado, significa que há uma redução na afinidade de ligação (por exemplo, tal como medida por métodos conhecidos, tais testes FACS das células que expressam um mutante particular, ou através de testes de Biacore de ligação a polipeptídeos mutantes) e / ou uma redução da capacidade total de ligação do anticorpo anti-KIR3DL2 (por exemplo, tal como evidenciado por uma diminuição no Bmax num lote de concentração de anticorpos anti-KIR3DL2 versus concentração de polipeptídeo). Uma redução significativa na ligação indica que o resíduo mutado está diretamente envolvido na ligação ao anticorpo anti-KIR3DL2 ou está em estreita proximidade com a proteína de ligação quando o anticorpo anti-KIR3DL2 é emparelhado a KIR3DL2. Um epitopo de anticorpo, assim, inclui, de preferência, tais resíduo e pode incluir resíduos adicionais adjacentes a tal resíduo.
[00130] Tipicamente, um anticorpo anti-KIR3DL2 aqui tem uma afinidade para um polipeptídeo KIR3DL2 na faixa de cerca de 104a cerca de 1011 M-1 (por exemplo, cerca de 108 a cerca de 1010 M-1). Por exemplo, um anticorpo pode ter uma constante de dissociação média (Kd) de menos de 1 x 10-9 M com relação a KIR3DL2, como determinado por, por exemplo, por ressonância plasmónica de superfície (SPR) rastreamento (tal como por análise com um dispositivo analítico BIAcore™ SPR). Num aspecto exemplificativo mais particular, um anticorpo pode ter um Kd de cerca de 1 x 10-8 M a cerca de 1 x 10-10 M, ou cerca de 1 x 10-9 M a cerca de 1 x 10-11 M, para KIR3DL2.
[00131] Os anticorpos podem ser caracterizados, por exemplo, por um Kd médio de não mais do que cerca de (isto é, melhor do que a afinidade) 100, 60, 10, 5, ou 1 nanomolar. A constante Kd pode ser determinada, por exemplo, por imobilização de proteínas produzidas de forma recombinante de KIR3DL2 humanos na superfície de um chip, seguida pela aplicação do anticorpo a ser testado em solução.
[00132] Uma vez que um composto de ligação ao antígeno é obtido este geralmente será avaliado em termos de internalização (um anticorpo, de preferência, não vai internalizar) em células alvo que expressam KIR3DL2 e / ou da capacidade para causar internalização KIR3DL2 em células alvo que expressam KIR3DL2, para induzir ADCC ou CDC no sentido de inibir a atividade pró-inflamatória e / ou a proliferação e / ou fazer com que haja a eliminação de células alvo que expressam KIR3DL2. A avaliação da capacidade do composto de ligação ao antígeno para internalizar ou para induzir ADCC, CDC ou geralmente levar à eliminação ou inibição da atividade de células alvo que expressam KIR3DL2, pode ser realizada em qualquer fase adequada do método, por exemplo como nos exemplos são aqui proporcionados. Esta avaliação pode ser útil em uma ou mais das várias etapas envolvidas na identificação, produção e / ou no desenvolvimento de um anticorpo (ou outro composto) destinado a utilização terapêutica.
[00133] Tal como aqui utilizado, um anticorpo anti-KIR3DL2 que não é "internalizado" ou que não "internalize" é uma entidade que não foi obtida substancialmente pela (isto é, entre) célula após a ligação a KIR3DL2 em uma célula de mamífero (em termos de superfície celular ou seja KIR3DL2). O anticorpo de não internalização pode, usualmente, incluir fragmentos de anticorpos, anticorpos humanos ou humanizados e conjugado de anticorpo.
[00134] Se um anticorpo anti-KIR3DL2 é internalizado ao se ligar a KIR3DL2 em uma célula de mamífero, ou se um polipeptídeo KIR3DL2 sofre internalização intracelular (por exemplo, ao ser ligado por um anticorpo) este fato pode ser determinado por vários ensaios, incluindo os descritos nos exemplos experimentais descritos no documento de patente PCT No. PCT / EP2013 / 069302, depositado em 17 de setembro de 2013, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.
[00135] Ensaios ADCC tipicamente envolvem se avaliar a citotoxicidade mediada por células em que uma célula alvo que expressa KIR3DL2 (por exemplo, uma célula Cou-L, células síndrome de Sezary ou qualquer célula feita para expressar, na sua superfície KIR3DL2) com anticorpo anti-KIR3DL2 ligado é reconhecida por uma célula efetora portadora de receptores Fc, sem o envolvimento do complemento. Uma célula que não expresse um antígeno KIR3DL2 pode, opcionalmente, ser utilizada como um controle. A ativação da citotoxicidade das células NK é avaliada por medição do aumento da produção de citoquinas (por exemplo, produção de IFN-Y) ou marcadores de citotoxicidade (por exemplo, mobilização CD107). De preferência, o anticorpo irá induzir um aumento da produção de citocinas, expressão de marcadores de citotoxicidade, ou a lise de células alvo de pelo menos 20%, 50%, 80%, 100%, 200% ou 500%, na presença de células alvo, em comparação com um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não se liga a KIR3DL2, um anticorpo KIR3DL2 tendo regiões constantes de murino). Em outro exemplo, a lise de células alvo é detectada, e.g. num ensaio de liberação de cromo, em que de preferência o anticorpo irá induzir a lise de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de células alvo. Quando um composto de ligação ao antígeno é testado tanto para a sua capacidade para (a) induzir ambas ADCC quanto (b) internalização em células que expressam KIR3DL2 e / ou induzir a internalização KIR3DL2, em que os ensaios podem ser realizados em qualquer ordem.
[00136] Em outras formas de realização, os anticorpos são testados quanto à sua capacidade para interferir com a ligação de um ligante HLA de KIR3DL2 (por exemplo dímero B27 tetrâmero (B272)) a um polipeptídeo KIR3DL2. Ver, por exemplo, ensaios descritos no pedido de patente PCT No. PCT / EP2013 / 069302.
Formulações farmacêuticas
[00137] Num aspecto, é fornecido um agente de acordo com a invenção para utilização como um produto farmacêutico.
[00138] Num aspecto, é fornecido um agente de acordo com a invenção para utilização como um produto farmacêutico no tratamento de neoplasmas malignos, uma doença inflamatória, ou uma doença auto-imune.
[00139] Num aspecto, é fornecido um agente de acordo com a invenção para utilização como um produto farmacêutico para a eliminação ou depleção de células que expressam KIR3DL2 num paciente humano.
[00140] Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende anticorpos como aqui descritos em conjunto com um ou mais veículos.
[00141] Sendo assim, um objeto da invenção é proporcionar uma formulação farmacêutica compreendendo um tal anticorpo o qual está presente numa concentração de 1 mg / ml a 500 mg / ml e em que a referida formulação tem um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema tampão, conservante (s), agente (s) de tonicidade, agente (s) quelante (s), estabilizantes e tensoativos. Numa forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação compreendendo água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Numa outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo, pelo menos, 50% p / p de água.
[00142] Numa outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca por congelação, uma forma em que o médico ou o paciente adiciona solventes e / ou diluentes antes da utilização.
[00143] Numa outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, liofilizada ou seca por pulverização) pronta para utilização sem qualquer dissolução prévia.
[00144] Num aspecto adicional, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa de um tal anticorpo e um tampão, em que o anticorpo está presente numa concentração acima de 1 mg / mL ou e em que a referida formulação tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0 .
[00145] Numa forma de realização, um pH da formulação de pelo menos cerca de 6 e inferior a cerca de 8 (e, mais geralmente, inferior a cerca de 7,7, 7,6, ou 7,5) é utilizado (por exemplo, num intervalo de 6 a 7,4, tal como de 6 a 7, de 6,2 a 7, de 6,4 a 7,4, de 6,5 a 7,5, de 6,7 a 7,7 ou cerca de 7, cerca de 7,4, etc).
[00146] Numa outra forma de realização, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogenofosfato de sódio, fosfato de hidrogênio dissódico, fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio, tris (hidroximetil) -aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos. Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00147] Numa outra forma de realização, a formulação compreende ainda um conservante farmaceuticamente aceitável. O conservante pode ser selecionado a partir de, por exemplo, do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p- hidroxibenzoato, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imidureia, clorohexidina, dehidroacetato de sódio, clorocresol, p- hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano- 1,2-diol) ou misturas dos mesmos. O conservante pode, por exemplo, estar presente numa concentração de 0,1 mg / ml a 20 mg / ml, de 0,1 mg / ml a 5 mg / ml, a partir de 5 mg / ml a 10 mg / ml, ou desde 10 mg / ml a 20 mg / ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecid para o técnico no assunto. Por conveniência, se faz referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00148] Numa outra forma de realização, a formulação compreende ainda um agente isotônico. O agente isotônico pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste de um sal (por exemplo cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,3- propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol, 1,2-propanodiol (propilenoglicol) (por exemplo, PEG400), ou misturas dos mesmos. Qualquer açúcar, tais como mono-, diou polissacáridos, ou glucanos, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel em água, amido de hidroxietilo e carboximetilcelulose-Na pode ser usado. Numa forma de realização, o aditivo de açúcar é a sacarose. O álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 com pelo menos um grupo OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Numa forma de realização, o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Não existe um limite fixo para a quantidade utilizada, desde que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitos estabilizantes conseguidos utilizando os métodos da invenção. A concentração de açúcar ou álcool de açúcar pode, por exemplo, situar-se entre cerca de 1 mg / ml e cerca de 150 mg / ml. O agente isotônico pode estar presente numa concentração de, por exemplo, 1 mg / ml a 50 mg / ml, entre 1 mg / ml a 7 mg / mL, a partir de 8 mg / ml a 24 mg / ml, ou desde 25 mg / ml a 50 mg / ml. Cada um destes agentes isotônicos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido para o técnico no assunto. Por conveniência, se faz referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00149] Numa outra forma de realização, a formulação também compreende um agente quelante. O agente quelante pode, por exemplo, ser selecionado dentre sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e suas misturas. O agente quelante pode, por exemplo, estar presente numa concentração de 0,1 mg / ml a 5 mg / ml, de 0,1 mg / ml a 2 mg / mL, ou de 2 mg / ml a 5 mg / ml. Cada um destes agentes quelantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. A utilização de um agente quelante em composições farmacêuticas é bem conhecida para o técnico no assunto. Por conveniência, se faz referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00150] A formulação pode ou não compreender um estabilizador. O uso de um estabilizador nas composições farmacêuticas é bem conhecido para o técnico no assunto. Por conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995. Mais particularmente, as composições da invenção podem ser composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe a formação de agregados durante o armazenamento em forma de formulações farmacêuticas líquidas. Por "formação de agregado" deve ser entendida uma interação física entre as moléculas de polipeptídeo que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou agregados grandes visíveis que precipitam a partir da solução. Por "durante o armazenamento" entende-se uma composição farmacêutica líquida ou formulação que, uma vez preparada, não é administrada imediatamente a um sujeito. Em vez disso, após a preparação, esta é embalada para armazenamento, quer numa forma líquida, num estado congelado, ou numa forma seca para posterior reconstituição em um estado líquido ou outra forma adequada para administração a um sujeito. Por "forma seca" entende-se a composição farmacêutica líquida ou formulação que é seca, quer por secagem por congelação (isto é, a liofilização), secagem por pulverização ou secagem ao ar. A formação de agregados por um polipeptídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida que pode afetar de forma adversa a atividade biológica do referido polipeptídeo, resultando em perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregados pode causar outros problemas tais como o bloqueio de tubos, membranas, ou bombas quando a composição farmacêutica contendo o polipeptídeo é administrada utilizando um sistema de infusão.
[00151] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ou não ainda compreender uma quantidade de uma base de aminoácidos suficiente para diminuir a formação de agregados pelo polipeptídeo durante o armazenamento da composição. Por "base de aminoácido" entende-se um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que qualquer dado aminoácido está presente, tanto na sua forma de base livre quanto na sua forma de sal. Se for utilizada uma combinação de aminoácidos, todos os aminoácidos podem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes nas suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes nas suas formas de base livre enquanto que outros estão presentes em suas formas de sal. Numa forma de realização, os aminoácidos para utilização na preparação das composições da invenção são aqueles que compreendem uma cadeia lateral carregada, tal como arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, G, D, ou uma mistura destes) de um aminoácido particular (por exemplo, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros, pode estar presente nas composições farmacêuticas da invenção, desde que o aminoácido particular esteja presente, tanto na sua forma de base livre quanto sua forma de sal. Numa forma de realização é utilizado o L-estereoisômero. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos destes aminoácidos.
[00152] Numa outra forma de realização da invenção metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou aminoácidos análogos) pode ser adicionada para inibir a oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo que atua como o agente terapêutico é um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metionina susceptível a tal oxidação. Por "inibir" deve ser entendida uma acumulação mínima de espécies oxidadas de metionina ao longo do tempo. A inibição da oxidação da metionina resulta numa maior retenção do polipeptídeo na sua forma molecular adequada. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D) ou combinações dos mesmos pode ser utilizada. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina tal que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para as agências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição não contenha mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isto pode ser conseguido por adição de metionina de modo que a proporção de metionina adicionada a resíduos de metionina varia de cerca de 1: 1 a cerca de 1000: 1, tal como de 10: 1 a cerca de 100: 1.
[00153] Numa outra forma de realização, a formulação compreende adicionalmente um estabilizante selecionado dentre o grupo de polímeros de peso molecular elevado ou compostos de baixo peso molecular. Numa outra forma de realização da invenção o estabilizador é selecionado a partir de polietilenoglicol (por exemplo PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi / hidroxicelulose ou derivados dos mesmos (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol e sais diferentes (por exemplo, cloreto de sódio) contendo enxofre. Cada um destes estabilizadores específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00154] As composições farmacêuticas podem também compreender agentes estabilizantes adicionais, que aumentam ainda mais a estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo. Agentes estabilizadores de particular interesse para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação da metionina e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra a agregação associada com congelamento- descongelamento ou cisalhamento mecânico.
[00155] Numa outra forma de realização, a formulação compreende ainda um tensoativo. O tensoativo pode, por exemplo, ser selecionado dentre um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácidos graxos de sorbitano, polímeros em bloco de polioxipropileno- polioxietileno (por exemplo. Poloxâmeros tais como Pluronic F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X -100), ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polioxietileno, derivados de polioxietileno e polietileno tais como derivados alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou derivados etoxilados destes, diglicerídeos ou seus derivados polioxietileno, álcoois, glicerol, lectinas e fosfolípidos (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, glicerol difosfatidil e esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por exemplo. dipalmitoil ácido fosfatídico) e lisofosfolípidos (por ex. palmitoil lisofosfatidil-L ésteres -serina e 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina ou treonina) e alquil, alcoxil (éster alquílico), alcoxi (éter de alquila) - derivados de lisofosfatidil e fosfatidilcolinas, por exemplo, lauroíla e miristoila derivados de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e modificações do grupo principal polar, ou seja colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol e os compostos positivamente carregados DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina e (por exemplo, glicerofosfolípido cefalinas), gliceroglicolípidos (por ex. galactopiransoídeo), esfingoglicolípidos (eg. ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de ovo de galinha, derivados de ácido fusídico (por exemplo, sódio tauro-dihidrofusidato etc), ácidos graxos de cadeia longa e seus sais de derivados C6-C12 (por ex. ácido oleico e ácido caprílico), acilcarnitinas e seus derivados, derivados N -acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados de cadeia lateral de lisina ou de arginina acilada, derivados de dipeptídeos que compreendem qualquer combinação Na--acilado de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado de um tripeptídeo que compreende qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, derivados de DSS Na--acilado (docusato de sódio, registo CAS No [57711-7] ), docusato de cálcio, registro CAS No [128-49-4]), docusato pde otássio, registro CAS No. [7491-09-0]), SDS (sulfato de sódio dodecil ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido eólico ou derivados dos mesmos, ácidos biliares e seus sais e conjugados de glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-hexadecil-N, N- dimetil-3-amônio-1-propanosulfonato, (alquil- aril-sulfonatos), tensoativos aniônicos monovalentes (por exemplo, tensoativos zwitteriônicos N-alquil-N, N-dimetilamônio-1- propanossulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamônio-1-propanossulfonato, agentes tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo brometo de cetil- trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio), agentes tensoativos não iônicos (por exemplo, Dodecil β-D-glucopiranosideo), poloxaminas (por exemplo os denominados Tetronic 's), que são copolímeros de bloco tetrafuncional derivados da adição sequencial de óxido de propileno e óxido de etileno a etilenodiamina, ou o tensoativo pode ser selecionado a partir do grupo de derivados de imidazolina, ou misturas dos mesmos. Cada um destes tensoativos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00156] Numa outra forma de realização, a formulação compreende ainda inibidores de protease tais como EDTA (etilenodiamina tetra-acética) e benzamidinaHCl, mas podem também ser utilizados outros inibidores de protease disponíveis comercialmente. O uso de um inibidor de protease em particular é útil em composições farmacêuticas compreendendo zimogênios de proteases para inibir a auto-catálise. É possível que outros ingredientes estejam presentes na formulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem incluir agentes molhantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de volume, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina do soro humano, gelatina ou proteas) e um íon dipolar (por exemplo, um aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais, é claro, não deverão afetar de forma adversa a estabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.
[00157] As composições farmacêuticas contendo um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade de tal tratamento, em vários locais, por exemplo, em locais tópicos, por exemplo para atuação na pele e nas mucosas, em locais onde há absorção por bypass, por exemplo, administração numa artéria, numa veia, no coração e em locais que envolvem uma absorção, por exemplo, a administração na pele, debaixo da pele, num músculo ou no abdômen.
[00158] A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser através de qualquer uma de várias vias de administração conhecidas, por exemplo, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou de uma combinação dos mesmos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplo através da conjuntiva, uretal e parentérica a pacientes em necessidade de um tal tratamento.
[00159] As composições da presente invenção podem ser administradas em qualquer das várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, pomadas, pastas, emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, lavagens, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina duras e cápsulas moles de gelatina, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, sprays, pós, aerossóis, inalantes, gotas para os olhos, pomadas oftálmicas, lavagens oftálmicas, pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução para injeção, soluções transformadas in situ, por exemplo, com gelificação in situ, ambientação in situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão e implantes. A estabilidade de uma formulação de acordo com qualquer um dos aspectos aqui descritos pode, nomeadamente, ser caracterizada com base na falta de impurezas de elevado peso molecular (por exemplo, impurezas que sugerem que haverá agregação (multímeros) de moléculas de anticorpo na formulação). Num aspecto, uma formulação de acordo com a invenção pode ser caracterizada como tendo um teor de impurezas de peso molecular elevado (HMW) inferior a cerca de 10% (tal como cerca de 5% ou inferior) durante pelo menos um dia, tal como pelo menos cerca de uma semana, tal como pelo menos cerca de 2 semanas, pelo menos cerca de um mês, no mínimo, cerca de 2 meses, ou mesmo pelo menos cerca de 3 meses de armazenamento a cerca de 5°C.
[00160] Em uma forma de realização da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável durante mais de 1 ano, sendo desejável 2 anos de armazenamento, opcionalmente, 3 anos de armazenamento. Numa outra forma de realização da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável durante mais de 4 semanas de uso e durante mais de 3 anos de armazenamento. Numa outra forma de realização da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável durante mais de 4 semanas de uso e durante mais de dois anos de armazenamento. Numa ainda outra forma de realização da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável durante mais de 2 semanas de uso e durante mais de dois anos de armazenamento.
[00161] Num aspecto, a invenção proporciona uma formulação que compreende cloreto de sódio como um modificador de tonicidade.
[00162] Numa forma de realização, a invenção proporciona uma formulação na qual um tampão de fosfato de sódio ou de citrato de sódio (base) é incorporado na formulação.
[00163] Numa forma de realização, a invenção proporciona uma formulação na qual um polissorbato 80 é incorporado na formulação como agente tensoativo.
[00164] Uma formulação de acordo com qualquer dos aspectos da invenção pode ter qualquer concentração adequada do anticorpo. Tipicamente, a concentração é de cerca de 0,05 mg / mL a cerca de 10 mg / ml (por exemplo, cerca de 1 mg / mL a cerca de 5 mg / mL). Num aspecto exemplar, a formulação é fornecida como uma formulação relativamente concentrada de anticorpo, que pode ser, por exemplo, uma formulação que é para ser diluída antes da administração (normalmente por administração intravenosa ou injeção parentérica direta) com uma concentração de cerca de 10 mg / mL. Em um outro aspecto exemplar, a formulação é fornecida como uma formulação relativamente diluída, tais como uma formulação que é de forma pronta para infusão / injeção, em que a concentração do anticorpo na formulação é de cerca de 0,05 mg / ml ou cerca de 0,1 mg / mL.
[00165] Em um aspecto, a formulação tem uma concentração de anticorpo de cerca de 1 mg / mL.
[00166] Num aspecto exemplar, a presente invenção fornece uma formulação farmaceuticamente aceitável e ativa, preparada a partir de uma mistura de ingredientes que compreendem (a) uma quantidade de uma molécula de anticorpo IgG da presente invenção de tal modo que a concentração de anticorpo na formulação se encontra entre cerca de 0,5 mg / mL e cerca de 10 mg / mL; (b) fosfato de sódio (por exemplo, fosfato de sódio dibásico / fosfato de potássio monobásico), citrato de sódio (por exemplo, citrato de sódio / ácido cítrico) ou borato de sódio (borato de sódio / ácido bórico); (c) cloreto de sódio; e (e) de polissorbato 80, em que a formulação tem um pH dentre cerca de 6,7 e 7,7, ou cerca de 7,4.
[00167] Outros aspectos e vantagens serão revelados na parte experimental apresentada a seguir, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitativa do âmbito do presente pedido.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Geração de anticorpos humanizados anti-KIR3DL2 por enxerto de CDR
[00168] Os anticorpos anti-KIR3DL2 foram obtidos como revelado no pedido de patente PCT No. PCT/EP2013/069302, depositado em 17 de setembro de 2013, como candidatos a humanização.
[00169] A humanização foi efetuada primeiro por enxerto na região determinante complementar (CDR) de cadeias pesadas e leves, seguido por introdução de retro- mutações. Os genes parentais de rato e os genes humanos utilizados para a modelagem e desenho são listados na tabela 1 abaixo. Os anticorpos foram produzidos utilizando-se células CHO. Tabela 1: Genes germinais dos anticorpos parentais e humanizados *Nome e nomenclatura IMGT #Esta Sequência se refere ao gene da linha germinativa VHVGAM3.8.a6.115 com registro AJ851868.
[00170] Ela está ligada a Mus musculus IGHV12-1-1 no banco de dados IMGT mas as duas sequências não são rigorosamente idênticas
Anticorpo 10G5
[00171] As sequências de proteínas de cadeias leves humanizadas 10G5 se encontram alinhadas abaixo. 10G5-LC é apresentada na SEQ ID No: 34. IGKV1-NL1 é mostrada na SEQ ID No: 35. Hum2C4 é mostrada na SEQ ID No: 36. 3RKD é mostrada na SEQ ID No: 37. As CDRs estão sublinhadas em 10G5 -LC e retro- mutações estão sublinhadas nas variantes L1 a L5.
[00172] O anticorpo humanizado 2C4 (anti-ErbB2; pbd 1S78 e 1L7I) e o anticorpo de rato 8C11 (anti-hepatite E da proteína da capsídeo do vírus; 3RKD pdb) foram usados como um modelo para avaliação prospectiva estrutural. O segmento JK parental não modificado foi mantido, bem como os resíduos da zona de Vernier de estrutura parental 2 (FW2) (incluindo os resíduos flanqueadores adjacentes). Portanto, a cadeia leve L2 foi usada como um modelo de partida básico para retro-mutações adicionais.
[00173] As quatro cadeias leves L2, L3, L4 e L5 foram, por fim, escolhidas para a produção de anticorpo.
[00174] As sequências proteicas humanizadas 10G5 de cadeia pesada estão alinhadas abaixo. 10G5-HC é mostrada na SEQ ID No: 38. IGHV1-46 é mostrada na SEQ ID No: 39. 1i9r é mostrada na SEQ ID No: 40. 1it9 é mostrada na SEQ ID No: 41. 1E60 é mostrada na SEQ ID No: 42. CDRs estão sublinhadas na sequência 10G5- HC e retro-mutações são sublinhadas em variantes de -H1 a -H6.
[00175] O anticorpo humanizado HFE7A anti-Fas (1IT9 pdb), o anticorpo humanizado 5C8 anti-CD40-L (1I9R pdb) e o anticorpo murino anti-HIV-1 de proteína de capsídeo p24 13B5 (1E6O pdb) foram utilizados como modelos para avaliação prospectiva estrutural. Com base no exame de estrutura 3D, três dos cinco resíduos FW3 de zona Vernier foram mantidos não modificados. Os resíduos da zona Vernier FW2 não foram modificados. Portanto, a cadeia pesada H3 foi utilizada como um modelo de partida básico para retro-mutações adicionais. As quatro cadeias pesadas H3, H4, H5 e H6 foram escolhidas para a produção do anticorpo.
Anticorpo 2B12
[00176] Dois genes VK humanos foram utilizados para enxerto de CDR por uma abordagem de mosaico. A região FW1 veio de IGKV1-39, e as FW2 e FW3 vieram de IGKV4-1.
[00177] As sequências de proteína da cadeia leve humanizadas são alinhadas abaixo. 2B12-LC é apresentada na SEQ ID No: 43. IGKV1-39 é mostrada na SEQ ID No: 44. IGKV4-1 é mostrada na SEQ ID No: 45. 1NCA é mostrada na SEQ ID No: 46. 1ZA6 é mostrada na SEQ ID No: 47. 1PG7 é mostrada na SEQ ID No: 48. 1b2w é mostrada na SEQ ID No: 49. 1fvd é mostrada na SEQ ID No: 50. 2fgw é mostrada na SEQ ID No: 51. As DRs estão sublinhadas na sequência 2B12-LC e as retro-mutações estão sublinhadas nas variantes de L0 a L4.
[00178] O anticorpo humanizado CC49 anti-TAG 72 (1ZA6 pdb), o anticorpo de fator anti-tecido humanizado D3H44 (1PG7 pdb), o anticorpo humanizado anti- p185HER2 4D5 (1FVD pdb), um anticorpo anti- interferon-gama humanizado (1B2W pdb), um anticorpo humanizado anti-CD18 (pdb 2FGW) e o anticorpo de rato antineuraminidase do vírus influenza subtipo N9 NC41 (1NCA pdb) foram utilizados como moldes para avaliação prospectiva estrutural. Os resíduos de zona Vernier FW3 foram mantidos não modificados. Portanto, a cadeia leve L1 foi utilizada como um modelo de partida básico para as retro-mutações adicionais. As quatro cadeias leves L1, L2, L3 e L4 foram, por fim, escolhidas para a produção de anticorpo.
[00179] Dois genes de VH humanos foram utilizados para o enxerto de CDR por uma abordagem de mosaico. As regiões FW1 e FW3 vieram de IGHV7-4-1*02 e a região FW2 veio de IGHV1-C*01.
[00180] As sequências de proteína da cadeia pesada humanizada estão alinhadas abaixo. 2B12-HC é mostrada na SEQ ID No: 52. IGHV7 é mostrada na SEQ ID No: 53. IGHV1-C é apresentada na SEQ ID No: 54. 1BJ1-H é mostrada na SEQ ID No: 55. 9046-H é mostrada na SEQ ID No: 56. CDRs estão sublinhadas na sequência 2B12-HC e retro-mutações estão sublinhadas nas variantes -H1 a -H4.
[00181] Um anticorpo humanizado anti-VEGF neutralizante (1BJ1 pdb) e o anticorpo citatuzumab bogatox (9046-H) foram, respectivamente, utilizados como modelo para avaliação prospectiva estrutural e comparação da sequência primária. Com base no exame de estrutura 3D de 1BJ1, a região FW2 VH / VL com resíduo Lys39 de interface foi mantida não modificada, bem como a Phe de FW3, que está localizada imediatamente a antes da última Cys.
[00182] Portanto, a cadeia pesada H1 foi utilizada como um modelo de partida básico para retro-mutações adicionais e para a geração de variantes H3 e H4. Alternativamente, uma variante que mantém as três regiões FWs de IGHV7-4-1 também foi incluída (H2).
[00183] As quatro cadeias pesada de 2B12 H1, H2, H3 e H4 foram, por fim, escolhidas para a produção do anticorpo.
[00184] As sequências de aminoácidos para as regiões de cadeia leve e pesada variáveis de 2B12 e 10G5 produzidas são mostradas abaixo (L indica cadeia leve, H indica cadeia pesada).
[00185] Foram construídas dezesseis variantes humanizadas de cada um dos anticorpos 2B12 e 10G5 que continham as diferentes retro-mutações (o aminoácido de origem murina, em substituição de resíduos de estrutura humana) em comparação com a versão quimérica parental. Todas as variantes de anticorpos foram produzidas com sucesso em células CHO como anticorpos IgG1 humanos, nas combinações mostradas abaixo nas tabelas 2 e 3. Tabela 2: co-transfecção combinatória para variantes de anticorpo H-K323-10G5 Tabela 3: co-transfecção combinatória para variantes de anticorpo H-K323-2B12
[00186] Variantes de anticorpos foram purificadas e analisadas por citometria de fluxo com titulação utilizando linhas celulares positivas para KIR3DL2. Resumidamente, linha de células RAJI-KIR3DL2 foi contada em azul de tripano. As células foram ajustadas a 1 milhão por ml. 100 μl da suspensão anterior foram transferidos para microplacas de fundo 96W-U (100 000 células por poço). As células foram lavadas 1x com 100 μl / poço de Tampão de Coloração (SB) e centrifugadas durante 2 minutos a 400 g. Faixas de diluição a 1/3 foram realizadas a partir de 100 μg / ml a 2 10-3 μg / ml para cada anticorpo purificado. 50 μl de cada diluição foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas durante 1H a 4°C. As células foram lavadas 3X em SB (100 μl) e centrifugadas durante 2 minutos a 400 g. PE cabra anti-humana (Fc SPE) diluída a 1/200 foi adicionada à placa e as células foram incubadas durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas 2X e imediatamente analisadas num citômetro de tipo FACS CANTO. Todos os sobrenadantes foram positivos neste ensaio, indicando que todas as variantes humanizadas retiveram a ligação ao antígeno alvo.
[00187] Para os anticorpos 2B12 e 10G5, verificou-se que todas as variantes se ligam igualmente bem às células-alvo como as versões quiméricas parentais e não são distinguíveis umas das outras a partir dos anticorpos quiméricos neste ensaio.
[00188] A título de comparação, foi observada uma perda global de afinidade para um outro anticorpo anti-KIR3DL2 que foi humanizado. Para algumas variantes deste clone, H4L1, H4L2 e H4L3 por exemplo, a re-introdução de resíduos de murino nas sequências estruturais humanas (retro-mutação) melhorou ligeiramente a aparente ligação aos antígenos da superfície celular, mas não restaurou uma atividade de ligação total.
Exemplo 2 - Identificação de anticorpos anti-KIR3DL2 humanizados com diminuição da propensão para a agregação
[00189] A propensão para a agregação das variantes humanizadas de 2B12 e 10G5 produzidas no formato IgG1 humano foi estudada no que diz respeito ao pH da sua formulação. Para cada mAb, os ensaios de agregação de propensão necessitaram de cerca de 1 mg de material purificado.
[00190] A seguir, anticorpos monoclonais (mAbs) foram estudados: 2B12-H1L1; 2B12-H1L2; 2B12-H2L1; 2B12-H2L2; 10G5-H3L2; e 10G5-H4L2.
[00191] A propensão para a agregação destes mAb foi avaliada como uma função de seu pH de formulação. Foram selecionadas soluções tampão de cinco formulações farmaceuticamente aceitáveis que variam de pH 5,5 a 8; portanto, cada mAb foi preparado em cinco formulações, a uma concentração final de 1 mg / ml, tal como mostrado nas tabelas de 4 a 8. Tabela 4: Formulação com pH = 5,5 Tabela 5: Formulação com pH = 6,5 Tabela 6: Formulação com pH = 7 Tabela 7: Formulação com pH = 7,4 (PBS 1X + Polissorbato 80 0,1 mg / ml) Tabela 8: Formulação com pH = 8
[00192] As soluções iniciais de cada mAb purificado foram fornecidas na formulação PBS 1X e as outras formulações foram obtidas através de troca de tampão de diálise.
[00193] A propensão para a agregação de cada formulação de mAb foi avaliada experimentalmente por medição e comparação da sua temperatura de agregação (Tagg). A Tagg foi medida usando um ensaio com metodologia Thermal Shift Stability Assay (TSSA). A TSSA mede a temperatura de agregação de peptídeos e proteínas em soluções aquosas, utilizando o kit "ProteoStat® da Thermal Shift Stability Assay" (disponível a partir da Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY). A amostra a ser analisada é aquecida de 0 a 100°C e a fluorescência é lida quando a temperatura aumenta. Um grande aumento da fluorescência da amostra será detectado quando a temperatura de agregação for alcançada. Esta medição de fluorescência utiliza uma sonda rotor molecular excitável a 480nm. É compatível com uma larga faixa de pH (4 a 10) e tolerante aos tensoativos, tais como polissorbato 80, presentes em concentrações normais.
Resultados
[00194] Os resultados são apresentados na tabela 9, abaixo. A % de pureza inicial é medida por SE-HPLC para uma formulação PBS 1X + Polissorbato 80 a 0,1 mg/mL pH = 7,4 para cada mAb. As varreduras indicadas foram canceladas, porque o seu valor era muito distante da média, de acordo com o protocolo do estudo. A varredura cancelada 1 de 2B12-H2L1 em pH 5,5 foi interrompida, acreditando-se que o resultado foi destoante em termos do valor de Tagg, que parecia muito alto. O resultado foi, de fato, normal, mas não restou quantidade suficiente do produto mAb para se realizar uma terceira varredura válida. Tabela 9:
[00195] Todos os anticorpos demonstraram estabilidade a valores de pH compatíveis com formulações que evitam os riscos da degradação química dos mAbs durante o armazenamento a longo prazo. Os anticorpos mostraram estabilidade a pH = 7,4, que é igual ao pH do sangue, e os riscos de degradação química do mAb durante um armazenamento a longo prazo foram menores. Para todas as variantes testadas, os valores de pi experimentais medidos por gel de IEF são encontrados na faixa de pH básico (pH acima de 9). Consequentemente, os anticorpos 2B12 e 10G5 transportam uma carga total positiva em todas as condições de pH testadas. As condições de pH selecionadas (pH 7,0 ou 7,4), que são muito inferiores aos valores de pi experimentais, também irão garantir uma elevada solubilidade em água para ambas as variantes.
[00196] Em termos de propensão para agregação, há um diferença surpreendentemente grande entre as variantes H1L1 ou H1L2 e H2L1 ou H2L2 de 2B12. H2L1 ou H2L2 apresentam uma temperatura de agregação muito maior do que H1L1 ou H1L2 e, portanto, deve ter uma estabilidade física muito melhor. Isto pode ser explicado pela presença de uma glutamina (Q) na cadeia pesada H2 na posição 39 (com numeração Abnum). Com efeito, duas ligações de H são construídas entre VH_Q39 e VL_Q38 como mostrado nas figuras 1A e 1B pela modelação do mAb com o software de descoberta Studio. Estas duas ligações de H- provavelmente estabilizam a estrutura quaternária do mAb, impedindo a exposição de certas áreas hidrofóbicas que podem ser responsáveis pela agregação de proteínas.
[00197] Da mesma forma para variantes 2B12, para as variantes H3L2 e H4L2 de mAb 10G5 que também têm duas ligações de H entre VH_Q39 e VL_Q38, foram observadas altas temperaturas de agregação. Elas também demonstraram boa estabilidade física.
Exemplo 3 - Eficácia da resposta 2B12-H2L1 à dose em camundongos SCID CB17-enxertados com alta Raji-KIR3DL2 em modelo IV
[00198] O objetivo deste estudo foi avaliar se o anticorpo 2B12-H2L1 poderia aumentar o tempo de vida de camundongos CB17- SCID intravenosamente (IV) enxertados com células tumorais B humanas Raji-KIR3DL2, de uma forma dependente da dose.
[00199] Depois de se ter verificado que as células expressam KIR3DL2 em sua superfície e que se ligam ao anticorpo 2B12-H2L1, 48 SCID foram enxertados IV com 5M de células altas Raji-KIR3DL2 (passagem n°5 e 97% de viabilidade). O tratamento IP começou um dia após o enxerto e os anticorpos foram administrados uma vez na dose de 0,01,0,1, 1 μg e 10 μg/rato.
[00200] 6 grupos foram criados (n = 8): - o grupo de controle injetado com o controle de isotipo (IC) a 10 μg/rato - um grupo tratado injetado com 2B12-H2L1 em 0,01 μg/rato - um grupo tratado injetado com 2B12-H2L1 em 0,1 μg/rato - um grupo tratado injetado com 2B12-H2L1 a 1 μg/rato - im grupo tratado injetado com 2B12-H2L1 em 10 μg/rato
[00201] Após o enxerto IV de células altas Raji-KIR3DL2, os grupos de camundongos tratados com controle de isotipo morreram rapidamente com uma sobrevivência média de 20 dias (Tabela 10). Tabela 10
[00202] As curvas de sobrevida e medianas de sobrevivência dos grupos tratados com 2B12 em todas as doses mostraram um aumento significativo em comparação com grupos de controle (figura 2). No entanto, a percentagem de aumento da esperança de vida (ILS) foi muito mais elevada quando os camundongos foram tratados com 1 e 10 μg de mAb e nenhuma com 0,01 e 0,1 μg de mAb (tabela 10). 2B12 foi capaz de induzir ADCC, mesmo em baixas concentrações.
[00203] Os resultados são mostrados na figura 2. Curvas de sobrevivência de camundongos CB17-SCID enxertados com alta Raji-KIR3DL2 5M IV e tratados IP com uma resposta de dose de 2B12 (n = 8/grupo). Os tratamentos foram iniciados a partir do dia 1. O término do experimento se deu em 58 dias.
[00204] Este estudo mostrou que o tratamento com 2B12 prolongou significativamente a sobrevivência de camundongos CB17-SCID em modelo IV, mesmo em doses baixas.
[00205] Todas as posições e sub-marcações são aqui utilizadas apenas para conveniência e não devem ser interpretadas como limitando a invenção de qualquer maneira. Qualquer combinação dos elementos anteriormente descritos em todas as variações possíveis dos mesmos está englobada pela presente invenção, a menos que indicado de outro modo ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. A citação de faixas de valores aqui apresentada destina-se meramente a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro do intervalo, a menos que aqui indicado de outra forma, e cada valor separado é incorporado no presente relatório descritivo como se fosse aqui individualmente citado. Salvo indicação em contrário, todos os valores exatos aqui proporcionados são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplificativos exatos fornecidos no que diz respeito a um fator ou medição particular pode ser considerado como também proporcionando uma medida aproximada correspondente, modificada por "cerca de", quando adequado).
[00206] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de outro modo ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.
[00207] O uso de qualquer e todos os exemplos, ou de linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui fornecido destina-se apenas a esclarecer melhor a invenção e não constitui uma limitação do âmbito da invenção a menos que indicado de outra forma. Nenhuma linguagem no presente relatório descritivo deve ser entendida como indicando qualquer elemento essencial para a prática da invenção, a menos que isto seja explicitamente indicado.
[00208] A citação e incorporação de documentos de patentes neste relatório descritivo é feita apenas por conveniência e não reflete qualquer ponto de vista da validade, patenteabilidade e/ou aplicabilidade de tais documentos de patentes, a descrição de qualquer aspecto ou forma de realização da invenção utilizando termos como referência a um elemento ou elementos destina-se a proporcionar suporte para um aspecto similar ou uma forma de realização da invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "compreende substancialmente” esse elemento ou elementos em particular, a menos que indicado de outro modo ou claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição constituída por aquele elemento, a menos que indicado de outro modo ou claramente contradito pelo contexto).
[00209] Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto citado nos aspectos ou reivindicações aqui apresentadas até ao limite máximo permitido pela lei aplicável.
[00210] Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência na sua totalidade como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
[00211] Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente para um técnico mediano no assunto à luz dos ensinamentos deste invento que certas alterações e modificações poderão ser feitas sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.

Claims (8)

1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2, caracterizado pelo fato de compreender a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID No: 31, e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido das SEQ ID Nos: 25 e 26.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) fundida com uma faixa de região humana gamma 1 constante e uma região variável de cadeia leve (VL) fundida a uma região humana constante kappa.
3. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada humana compreendendo substituição(ões) de aminoácidos que aumenta(m) a ligação a um receptor humano FCYIIIA (CD16), em que as substituições de aminoácidos são uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 239, 298, 330, 332, 333 e/ou 334.
4. Composição farmaceutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 0,05 mg/mL a 10 mg/mL de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; (b) sistema tampão; e (c) um agente isotônico, a um pH dentre 6,5 e 8.
6. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicação 4 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de linfoma cutâneo de células T.
7. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicação 4 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de linfoma de células T periféricas.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado a partir de micose fungóide e síndrome de Sezary.
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B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
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