JP2012532851A - Ｔｌｒ３結合剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＴＬＲ３に特異的に結合し、場合によってさらに、シグナル伝達を調節する、例えば阻害する、抗体（例えばモノクローナル抗体）、抗体断片、およびその誘導体に関する。本発明はまた、かかる抗体を産生する細胞；かかる抗体を作製する方法；抗体の断片、変異体、および誘導体；これらを含む医薬組成物；抗体を使用し、疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患などを診断、処置または予防する方法、に関する。

Description

本発明は、ＴＬＲ３に特異的に結合する、場合によってさらに、シグナル伝達を調節する、例えば阻害する、抗体（例えばモノクローナル抗体）、抗体断片、およびその誘導体に関する。本発明はまた、かかる抗体を産生する細胞、かかる抗体を作製する方法；抗体の断片、変異体、および誘導体；これらを含む医薬組成物；抗体を使用し、疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患などを診断、処置または予防する方法、に関する。
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＴｏｌｌタンパク質は、背腹パターンを調節し、また古い宿主防御機構を示すと考えられている。ヒトにおいては、ＴＬＲは、先天性免疫の重要な成分であると考えられている。ヒトおよびショウジョウバエのＴｏｌｌタンパク質配列は、タンパク質鎖の全長にわたって相同性を示す。ヒトＴｏｌｌ様受容体のファミリーは、１０の高度に保存された受容体タンパク質、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０からなる。ショウジョウバエＴｏｌｌのように、ヒトＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、およびヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体の細胞質ドメインに対して相同な細胞質ドメインからなる細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。ショウジョウバエＴｏｌｌおよびＩＬ−１受容体の双方におけるシグナル伝達経路と同様、ヒトＴｏｌｌ様受容体は、ＮＦ−κＢ経路を通じてシグナル伝達する。
様々な哺乳類のＴＬＲが多数の特性およびシグナル形質導入機序を共有するが、それらの生物学的機能は非常に異なる。これは、部分的には、４つの異なるアダプター分子（ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦおよびＴＲＡＦ）がＴＬＲとの様々な組み合わせにおいて関連し、かつ異なるシグナル伝達経路を媒介するという事実に起因する。さらに、１つのＴＬＲに対する異なるリガンドは、異なるシグナル形質導入経路を優先的に活性化しうる。さらに、ＴＬＲは、様々な造血および非造血細胞内で異なる形で発現される。したがって、ＴＬＲリガンドに対する応答は、ＴＬＲによって活性化されるシグナル経路だけでなく、個別のＴＬＲが発現される細胞の性質に依存する。
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）は、ＴＬＲ３シグナル伝達が炎症および自己免疫条件に関与している場合の治療標的として、多大な注目を受けている。親出願の（特許文献１）は、ｈＴＬＲ３タンパク質の核酸およびアミノ酸配列を提供している。（非特許文献１）は、細胞表面ＴＬＲ３に結合する抗ＴＬＲ３抗体の使用について開示している。抗体Ｃ１１３０は、ＴＬＲ３に対して活性化することが述べられており、また（特許文献２）中に記載されている。ＴＬＲ３を阻害するポリクローナル抗体については、（非特許文献２）中に記載された。（特許文献３）および（非特許文献３）は、細胞区画ＴＬＲ３ではなく細胞表面ＴＬＲ３に結合しそれを阻害することが報告されており、または脊髄系ＤＣ内の抗体クローンＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））に対応する抗体について記載している。（特許文献４）は、細胞表面上でＴＬＲ３を発現することが報告されている上皮細胞内でのサイトカイン産生を阻害することが報告されている抗体Ｃ１０６８について記載している。Ｃ１０６８は、ＴＬＲ３への結合において、抗体ＴＬＲ３．７と競合することが述べられている（（特許文献５）を参照）。ＰＣＴ特許出願の（特許文献５）は、抗ＴＬＲ３抗体を提供する。かかる抗体は、ｄｓＲＮＡを遮断することが述べられており、またｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への結合を阻止することが提起されている。研究利用のための他の抗ＴＬＲ３抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．製のポリクローナル抗ＴＬＲ３抗体、Ａｂｃａｍ製の抗体４０Ｃ１２８５および抗体６１９Ｆ７、７１３Ｅ４、７１６Ｇ１０、ＩＭＧ−５６３１およびＩＭＧ−５３４８（全部がＩｍｇｅｎｅｘ．Ｃｏｒｐ．製）を含む。
国際公開第９８／５０５４７号パンフレット 国際公開第２００７／０５１１６４号パンフレット 国際公開第０３／１０６４９９号パンフレット 国際公開第０６／０６０５１３号パンフレット 国際公開第２０１０／０５１４７０号パンフレット
ＬｅＢｏｕｔｅｉｌｌｅｒら、（２００５年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４６）：３８１３３−３８１４５頁 Ｃａｖａｓｓａｎｉら、（２００８年） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２６０９−２６２１頁 Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００３年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３１５４−３１６２頁
しかし、今日まで数種類の抗ＴＬＲ３抗体が産生されている一方、これらの抗体は、一般にあくまで研究目的であって、治療用途は意図されていない。本明細書中でさらに説明されるように、本開示は、現在使用可能な抗ＴＬＲ３抗体の中で、それらは、実験観察を行うための一部の研究設定において有用でありうる一方、例えばＴＬＲ３を調節するための治療剤としての用途に対して最適ではない。したがって、改善されたＴＬＲ３に特異的な抗体を提供するという需要がある。
一態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に特異的に結合するモノクローナル抗体（限定はされないが、抗体断片および誘導体を含む）を含む新規の組成物、ならびにそれらを使用する方法を提供する。一態様では、抗体は、ＴＬＲ３リガンドのＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。一態様では、抗体は、ヒトＴＬＲ３に、酸性条件下、また特に細胞の酸性化細胞内区画（例えば、エンドサイトーシス経路エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｉｃ）、リソソーム区画）内で遭遇される場合に代表的な条件下で結合する。かかる酸性条件は、一般に、約ｐＨ６．５未満のｐＨ、または約ｐＨ４．５〜６．５の間、または約ｐＨ５．６によって特徴づけられる。
本明細書中の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、細胞の酸性化細胞内区画（例えば、エンドサイトーシス経路エンドソーム、リソソーム区画）内で、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節し、場合によって阻害する。
本明細書中の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、樹状細胞（ＤＣ）（例えば、脊髄ＤＣ、単球由来ＤＣ）内で、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節し、場合によって阻害する。
本明細書中の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、場合により、ヒトＴＬＲ３への結合に対し、酸性条件下で、中性条件下より実質的に低い親和性を有しないものとして特徴づけることが可能であり、例えばこの場合、ＴＬＲ３への結合におけるＫＤは、０．２−、０．３−、−０．４、０．５−、１．０−、もしくは１．５−ｌｏｇ１０を超えない程度に低下する。中性条件は、一般に、６．６〜７．４の間のｐＨ、例えば細胞質内で見出される７．２のややアルカリ性ｐＨによって特徴づけられる。場合により、抗体は、ヒトＴＬＲ３への結合に対し、酸性条件下で、中性条件下とは実質的に異なる（より低いまたは高い）親和性を有することなく、例えばこの場合、ＴＬＲ３への結合におけるＫＤは、中性および酸性条件下（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）で、０．２−、０．３−、０．４−、０．５−、１．０−、もしくは１．５−ｌｏｇ１０を超えない程度に異なる。
本明細書中の実施形態のいずれかの他の態様では、酸性条件下での、抗体のＴＬＲ３に対する二価結合親和性は、場合により、約１００、５０、１０、５、もしくは１ナノモルを超えない（すなわち親和性が向上した）、好ましくはサブナノモルまたは場合によって約３００、２００、１００もしくは１０ピコモルを超えない平均ＫＤによって特徴づけられうる。
本明細書中の実施形態のいずれかの他の態様では、本抗体は、ＴＬＲ３リガンドのＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。ＴＬＲ３リガンドは、一般に、抗ＴＬＲ３抗体以外のリガンドとなり、また、天然または非天然ＴＬＲ３リガンド、場合により、ポリＡＵ（ポリアデニル酸：ポリウリジル酸）またはポリＩＣ（ポリイノシン酸：ポリシチジル酸）などのｄｓＲＮＡに基づくリガンドであってもよい。特に、発明者らは、本発明に従う抗体が、ｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ３リガンドがＴＬＲ３ポリペプチドに既に結合されている場合であっても、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害可能であることを確立している。本発明に従う抗体はまた、予備活性化された（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖｅｄ）条件下、例えばＩＦＮαの存在下であっても、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害可能である。本発明に従う抗体は、確立された自己免疫疾患、例えば、異常細胞内に、ｄｓＲＮＡなどの天然ＴＬＲ３リガンド、および／または、ＩＦＮα、特に高レベルのＩＦＮαの存在を有する患者を処置するのに有効であると考えられる。本抗体はまた、ＴＬＲ３リガンド結合部位がｄｓＲＮＡ分子によって占有され、潜在的にはより広範な全体的結合が可能になる場合であっても、ＴＬＲ３に結合する利点を有することになる。
本開示は、酸性条件下でヒトＴＬＲ３に結合する抗体が、ＴＬＲ３を、単独にまたは主に細胞質区画内で、また主にエンドサイトーシス経路の区画（例えばエンドソーム）内で発現する細胞（脊髄樹状細胞（ＭｄＤＣ）；単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ））内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節する、特に阻害する強力な能力を有することを示す。本抗体は、ｄｓＲＮＡへの結合に関与しないＴＬＲ３中の領域に結合し、かつ本抗体は、酸性条件下でｄｓＲＮＡがＴＬＲ３に結合することを阻止しない。本組成物および方法は、多くの用途にとって有用であり、特に、細胞質（例えばエンドサイトーシス経路区画に局在化された）ＴＬＲ３が標的化される場合に、ＴＬＲ３シグナル伝達を（例えばインビボで）調節することに適している。細胞質ＴＬＲ３シグナル伝達を調節することは、酸性細胞質区画（例えばエンドソーム）内でＴＬＲ３を発現するＤＣまたは他の細胞内でのＴＬＲ３シグナル伝達の調節が有益である場合の疾患を処置または予防するのに有用でありうる。例えば、ＤＣの、アポトーシスまたは壊死細胞に由来する抗原（急性炎症の間での組織壊死過程を含む）を取り込む能力については十分に文書化されていることから（Ａｌｂｅｒｔら（２００４年） Ｎａｔ．Ｒｅ、Ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２２３−２３１頁）、ＤＣ内でのＴＬＲ３シグナル伝達の阻害（例えば、ＤＣによるサイトカイン産生の阻害によって認められる）は、炎症または自己免疫疾患の処置または予防において用いられうる（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、（２００８年））。場合により、本抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、例えば、ＴＬＲ３リガンドによるＴＬＲ３受容体の刺激によって誘発されるサイトカイン産生（例えばＩＰ１０）を阻害する。
エンドソームおよびリソソームは、細胞内部の膜結合区画であり、エンドサイトーシス経路の一部を形成し、また通常はエンドソーム膜のプロトンポンピングＡＴＰアーゼの作用に起因して酸性である。原位置でのリソソーム（ｌｙｏｓｏｍａｌ）ｐＨの最初の測定値は、マクロファージ内で４．７〜４．８のｐＨであることが判明し、受容体依存性エンドサイトーシスに関与する線維芽細胞エンドソームのｐＨは、約５．５であることが判定された。ＴＬＲ３の初期試験によると、それは単球由来ＤＣ内の細胞質内で発現されており、またそれはおそらくはエンドサイトーシス経路の細胞内区画内でそのリガンドに結合することが同定された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００３年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３１５４−３１６２頁）。その後、ＴＬＲ３は、樹状細胞、星状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、上皮細胞、線維芽細胞および肝細胞内の細胞のエンドソーム区画内で発現されることが報告されているが、ＴＬＲ３はまた、細胞表面上、特に上皮細胞上、また炎症の一部の症例ではマクロファージ上で見出されている（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、２００８年、上記）。エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキンによる処理により、ＤＣ内でのＴＬＲ３シグナル伝達が阻害されることから、エンドソーム酸性化は、ＴＬＲ３シグナル伝達における役割を有することが示されている。酸性化エンドソーム区画に対応する酸性条件下（例えば約５．６または約６．５未満のｐＨ）でＴＬＲ３に結合する、本明細書で提供される抗体は、酸性条件下でその親和性を失う抗体に対し、エンドソーム区画内でのＴＬＲ３への効率的な高親和性結合、また場合によってそのさらなる調節を可能にする利点を有し、したがって細胞表面ＴＬＲ３に対してそのさらなる効果を発揮しうる。例示される抗体は、主にサイトソーム（ｃｙｔｏｓｏｍａｌ）区画内でＴＬＲ３を発現することが知られているＤＣ内のＴＬＲ３に対して強力な阻害活性を有する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に特異的に結合し、かつＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する、例えば、ＴＬＲ３のリガンド（例えば、ＴＬＲ３の天然もしくは合成リガンド、核酸に基づくリガンド、ｄｓＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、ポリＩＣ、ポリＡＵ）のＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することのない、ＴＬＲ３リガンドによるＴＬＲ３受容体の刺激によって誘発されるサイトカイン産生を阻害する、モノクローナル抗体を提供する。ＴＬＲ３ポリペプチドがかかる抗体によって結合される場合、ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３ポリペプチドにさらに結合し、残存する非抗体結合ＴＬＲ３および／または他のｄｓＲＮＡ受容体（すなわちＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＴＬＲ７など）への結合に利用可能なｄｓＲＮＡが減少する可能性があり、それにより、毒性の増大、不適切なシグナル伝達カスケード活性化などの望ましくない副作用、およびｄｓＲＮＡが原因となってシグナル伝達が誘発されてもたらされる症状、例えば慢性炎症が、低減される可能性がある。かかる抗体組成物および方法は、多くの用途、特にＴＬＲ３シグナル伝達に関連した疾患を処置または予防するのに有用であり、またその作用機序を考慮すると、本発明の抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドをアネルギー化（ａｎｅｒｇｉｚｉｎｇ）または阻害するのに使用可能である。場合により、本抗体は、ＴＬＲ３の二本鎖ＲＮＡリガンドのＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を検出可能な程度にまで低下させないものとして特徴づけることが可能である。本抗体はまた、酸性条件下で、例えば酸性化エンドソーム区画内で遭遇される場合に代表的な条件下で、ヒトＴＬＲ３に高親和性で結合可能であってもよく、そうでなくてもよい。一実施形態では、ＴＬＲ３によってシグナル伝達を阻害しうる抗体が探求される場合、ＴＬＲ３に特異的に結合し、またＴＬＲ３の二本鎖ＲＮＡリガンドのＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することなくＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体が、さらに、本明細書中に記載の酸性条件下、また特に細胞の酸性化エンドソーム区画内で遭遇される場合に代表的な条件下で、ヒトＴＬＲ３に結合しかつそれを阻害する能力がありうることは有利となる。
本発明の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、場合によって酸性および／または中性条件下で、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、モノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３の任意の１つまたは任意の組み合わせと競合する。一実施形態では、本発明の抗体は、場合によって酸性および／または中性条件下で、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、
（ａ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２および３を有する抗体（３１Ｃ３）、
（ｂ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１０および１１を有する抗体（２９Ｈ３）、
（ｃ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１８および１９を有する抗体（２８Ｆ１１）、
（ｄ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２６および２７を有する抗体（２３Ｃ８）、および
（ｅ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号３４および３５を有する抗体（３４Ａ３）
からなる群から選択される抗体と競合する。
一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３および２９Ｈ３と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３および２３Ｃ８と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３および２８Ｆ１１と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３および３４Ａ３と競合する。一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２９Ｈ３および２３Ｃ８と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２９Ｈ３および２８Ｆ１１と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２９Ｈ３および３４Ａ３と競合する。一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２３Ｃ８および２８Ｆ１１と競合し、一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２３Ｃ８および３４Ａ３と競合する。一実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２８Ｆ１１および３４Ａ３と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号６１、６４および６５から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６２、６６および６７から選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列；および／または
（ｃ）配列番号６３、６８、６９および７０から選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号７１〜７６から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７７〜８１から選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列；および／または
（ｃ）配列番号８２〜８５から選択される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む重鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号４、５および６でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号７、８および９でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
（ｂ）（ｉ）配列番号１２、１３および１４でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１５、１６および１７でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
（ｃ）（ｉ）配列番号２０、２１および２２でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号２３、２４および２５でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
（ｄ）（ｉ）配列番号２８、２９および３０でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号３１、３２および３３でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；ならびに
（ｅ）（ｉ）配列番号３６、３７および３８でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号３９、４０および４１でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
からなる群から選択され、場合により、ここで前記配列のいずれかにおけるアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くが、異なるアミノ酸によって置換されうる。
本発明の一実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３の任意の１つまたは任意の組み合わせに相当するＴＬＲ３エピトープに結合する。別の実施形態では、本抗体は、抗体３１Ｃ３の抗原結合領域を含む。別の実施形態では、本抗体は、抗体２９Ｈ３の抗原結合領域を含む。別の実施形態では、本抗体は、抗体２３Ｃ８の抗原結合領域を含む。別の実施形態では、本抗体は、抗体２８Ｆ１１の抗原結合領域を含む。別の実施形態では、本抗体は、抗体３４Ａ３の抗原結合領域を含む。別の実施形態では、本抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３軽鎖可変領域配列の１つ、２つもしくは全部で３つのＣＤＲを含む軽鎖、および／または、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３重鎖可変領域配列の１つ、２つもしくは全部で３つのＣＤＲを含む重鎖を含む。別の実施形態では、本抗体は、場合によってヒトＦｃ領域に融合された、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３またはその断片もしくは誘導体である。抗体２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１は、２００９年７月３日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ）に、それぞれＣＮＣＭＩ−４１８７およびＣＮＣＭＩ−４１８６の番号の下、寄託されている。抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３の抗原結合領域はまた、配列番号２〜４１で開示されている。
本発明の一態様では、本発明に従う１つの抗体の軽鎖は、Ｖ遺伝子におけるＶＫ１９−１４、ＶＫ ａｑ４、ＶＫ１２−４１およびＶＫ１２−４４、ならびにＪ遺伝子におけるＪＫ２から選択される、ＶＬ遺伝子再構成に由来する核酸配列から得られるかまたはそれによってコードされる。
本発明の一態様では、本発明に従う１つの抗体の重鎖は、Ｖ遺伝子におけるＶＨ３６−６０．ａ１．８５、ＶＨＬ５５８．１および、ＶＨＪ５５８．２、ならびにＪ遺伝子におけるＪＨ４またはＪＨ２から選択される、ＶＬ遺伝子再構成に由来する核酸配列から得られるかまたはそれによってコードされる。
本発明の別の態様では、本抗体は、配列番号４〜９、１２〜１７、２０〜２５、２８〜３３、３６〜４１からなる群から選択される配列の１つ以上のＣＤＲを有し、ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３に特異的に結合する抗体を提供し、ここで本抗体は、次の特性の１つ以上を有する。
ａ．酸性ｐＨ、例えば約６．５未満のｐＨまたは約４．５〜６．５の間または約ｐＨ５．６で、ＴＬＲ３ポリペプチドに対してサブナノモル親和性を有するか；または
ｂ．ＴＬＲ３リガンドの存在下でＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することが可能であるか；または
ｃ．炎症性バックグラウンド下、例えばＩＦＮαなどの炎症性サイトカインの存在下でＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することが可能であるか；または
ｄ．ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２８Ｆ１１、２３Ｃ８または３４Ａ３と競合するか；
ｅ．ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、ｄｓＲＮＡと競合しない
一実施形態では、本抗体は、上掲の特性、すなわち、（ａ）および（ｂ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ａ）および（ｃ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；または（ａ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；または（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；または（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；または（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を有する。一実施形態では、本抗体は、特性（ｄ）および（ｅ）を有する。別の実施形態では、本抗体は、本明細書中に記載の抗ＴＬＲ３抗体の特性のいずれかをさらに有する。
別の実施形態では、本明細書中の実施形態のいずれかの抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドを表面上に発現する細胞によって内在化されうる。
本発明の任意の態様の一実施形態では、配列番号で列挙されるアミノ酸配列は、１つ、２つ、３つもしくはそれより多くのアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、本発明の任意の実施形態において、実施形態は、特定の配列番号のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有しうるアミノ酸配列を包含しうる。
別の実施形態では、本発明は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２８Ｆ１１、２３Ｃ８および３４Ａ３からなる群から選択される抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗ＴＬＲ３抗体を提供する。
一実施形態では、本抗体は、キメラであり、例えば非マウス、場合によってヒト定常領域を有する。一実施形態では、本抗体は、ヒトまたはヒト化である。別の実施形態では、本抗体は、マウス抗体である。別の実施形態では、本抗体は、他のヒトＴＬＲ（例えばＴＬＲ４）に実質的に結合しない。
本発明の実施形態のいずれかの一態様では、本抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、場合によってＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。一実施形態では、本抗体は、Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃγＲによって結合されたアイソタイプである。
本発明の実施形態のいずれかの一態様では、本抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体から選択される抗体断片である。本発明の実施形態のいずれかの一態様では、本抗体は、Ｆｃドメインを含まないか、またはＦｃγＲによって実質的に結合されないアイソタイプである。一実施形態では、本抗体は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ２アイソタイプである。実施例において示されるように、本発明の抗体のＦ（ａｂ’）２断片は、ＤＣ内でのＴＬＲ３シグナル伝達に対するその調節能を保持し、それ故、それにＦｃドメインが不在であるにもかかわらず、ＤＣによって取り込まれた。かつては一般に、抗体は、少なくとも部分的にＦｃ受容体介在性取り込みにより、ＤＣ内のエンドソーム経路に入ることになると考えられてきた（ヒトＤＣは、タイプＩ（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４）およびタイプＩＩ（ＦｃγＲＩＩ、ＣＤ３２）を含む数種のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）を発現する）。ＦｃγＲに結合しないアイソタイプおよびフォーマットが、ＤＣ内のＴＬＲ３を調節可能であるという実験結果により、ＴＬＲ３発現細胞の（例えばＦｃγＲ介在性抗体に依存する細胞の細胞毒性を介する）望ましくない欠損を誘発するリスクを伴うことなく、所望される特性を保持する抗体の開発が可能になる。例えば、ＦｃγＲ結合を低下させるように修飾されたＩｇＧ４アイソタイプまたは他のＩｇＧアイソタイプは、血清半減期などのそれらの有利な薬理学的特性故に使用可能である一方、例えばＤＣ内で細胞死を誘発することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節しうる。本発明の実施形態のいずれかの一態様では、抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、またＩｇＧ４もしくはＩｇＧ２アイソタイプの定常領域を含む。本発明の実施形態のいずれかの一態様では、抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、またＦｃγＲに実質的に結合しない定常領域を含む。
別の実施形態では、本抗体は、検出可能または有毒な部分にコンジュゲートされる（conjugated）かまたは共有結合される。
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＴＬＲ３抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマまたは組換え宿主細胞を提供する。一実施形態では、本細胞は、クローン３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３である。関連する態様では、本発明は、ａ）３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３抗体によって特異的に認識されるＴＬＲ３エピトープを含む抗原で免疫されている非ヒト哺乳類宿主に由来するＢ細胞を含むハイブリドーマを提供し、それはｂ）不死化細胞に融合され、ここでハイブリドーマは、エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する。これらの態様の一実施形態では、モノクローナル抗体は、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３に相当するエピトープに結合する。場合により、本細胞は、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３の抗原結合領域を有する抗体を産生する。
別の態様では、本発明は、抗体を試験する方法であって、
ａ）場合によってＴＬＲ３リガンド（例えばｄｓＲＮＡ）のＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、および／または
ｂ）ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合し、および／または
ｃ）酸性条件下、また特に細胞の酸性化細胞内区画内で遭遇される場合に代表的な条件下、例えば約ｐＨ５．６、約ｐＨ４．５〜約６．５の間で、ヒトＴＬＲ３に結合する、（ここで場合により、酸性条件下でのＴＬＲ３に対する親和性は、中性条件下での結合に対し、実質的に異ならない、例えば低下しない）
か否かを判定するための抗体を試験するステップを含む方法を提供する。
場合により、本方法は、サブステップ（ａ）および（ｂ）、サブステップ（ａ）および（ｃ）、サブステップ（ｂ）および（ｃ）またはサブステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に従って抗体を試験するステップを含む。
場合により、本方法は、抗体を、それがＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することが判定される場合、それがＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合することが判定される場合、ならびに／あるいは、酸性条件下および／または中性条件と比べて親和性の低下を伴わない場合にそれがヒトＴＬＲ３に結合することが判定される場合、選択するステップをさらに含む。場合により、本抗体は、それが樹状細胞内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節する、例えば阻害する能力についてさらに試験され、また抗体がＤＣ内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節することが判定される場合、選択される。場合により、そのように選択された抗体は、疾患の処置または予防における使用のために選択される（例えば、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体は、炎症および自己免疫疾患において使用されることになる）。場合により、そのように選択された多量の抗体が産生される（例えば組換え宿主細胞内で）。
別の態様では、本発明は、哺乳類対象、特にヒト対象においてＴＬＲ３に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、（例えば、非ヒト哺乳動物を、ＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で免疫することにより）複数の抗体を産生するステップと；前記複数から、
ａ）ＴＬＲ３シグナル伝達を、場合により、ＴＬＲ３リガンド（例えばｄｓＲＮＡ）のＴＬＲ３ポリペプチドへの結合を遮断することなく阻害し、および／または
ｂ）ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合し、および／または
ｃ）ヒトＴＬＲ３に、酸性条件下、また特に細胞の酸性化細胞内区画内で遭遇される場合に代表的な条件下、例えば約ｐＨ５．６、約ｐＨ４．５〜約６．５の間で結合する（ここで場合により、酸性条件下でのＴＬＲ３に対する親和性は、中性条件下での結合と比べて実質的に異ならない、例えば低下しない）、
抗体を選択するステップと、を含む方法を提供する。
場合により、本方法は、サブステップ（ａ）および（ｂ）、サブステップ（ａ）および（ｃ）、サブステップ（ｂ）および（ｃ）、またはサブステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に従い、抗体を選択するステップを含む。場合により、本方法は、樹状細胞内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節する、例えば阻害する能力を有する抗体を選択する（抗体がＤＣ内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節することが判定される場合に選択される）ステップをさらに含む。
別の態様では、本発明は、抗体を試験する方法であって、ａ）試験抗体を提供するステップと、ｂ）前記試験抗体が、細胞の表面でのＴＬＲ３の発現における低下を誘発するか否かを評価するステップと、ｃ）前記抗体が、細胞の表面でのＴＬＲ３の発現における低下を誘発しない場合、前記試験抗体を、疾患（例えば本明細書で開示される疾患のいずれか）の処置における候補として選択するステップと、を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体を試験する方法であって、ａ）試験抗体を提供するステップと、ｂ）前記試験抗体の結合親和性を、酸性条件下、例えば５．６のｐＨで評価するステップと、ｃ）前記抗体が酸性条件下で結合親和性を有する場合（例えば、サブナノモル親和性、中性条件の場合に対して親和性の実質的低下がないなど）、前記試験抗体を疾患の処置における候補として選択するステップと、を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体を試験する方法であって、ａ）試験抗体を提供するステップと、ｂ）前記試験抗体が、ＴＬＲ３リガンド、例えばｄｓＲＮＡの存在下で、ＴＬＲ３タンパク質に結合できるか否かを評価するステップと、ｃ）前記抗体がＴＬＲ３リガンドの存在下でＴＬＲ３タンパク質に結合できる場合、前記試験抗体を疾患の処置における候補として選択するステップと、を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体を選択する方法であって、ａ）試験抗体を提供するステップと、ｂ）前記試験抗体が、炎症性サイトカイン、すなわちＩＦＮαの存在下で、ＴＬＲ３タンパク質に結合できるか否かを評価するステップと、ｃ）前記試験抗体を疾患の処置における候補として選択するステップと、を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体を試験する方法であって、ａ）試験抗体を提供するステップと、ｂ）前記試験抗体が、例えばＴＬＲ３発現細胞により、内在化されうるか否かを評価するステップと、ｃ）前記抗体が内在化されうる（好ましくは、ここで抗体は、迅速に、例えば２時間以内に内在化される）場合、前記試験抗体を疾患の処置における候補として選択するステップと、を含む方法を提供する。一実施形態では、疾患は、炎症性疾患である。一実施形態では、疾患は、癌である。
一実施形態では、調製される抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、本方法は、前記抗体がヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する能力が評価されるステップをさらに含む。一実施形態では、抗体が他のＴＬＲファミリーメンバに結合する能力が評価される。別の実施形態では、本方法は、選択されるモノクローナル抗体の断片または誘導体を作製するステップをさらに含む。一実施形態では、断片または誘導体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体断片、多重特異性抗体（複数の異なる抗体断片、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を含む）からなる群から選択される。別の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。
別の態様では、本発明は、患者における疾患を処置または予防する方法であって、本発明のＴＬＲ３抗体を患者に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本方法は、患者に適切な追加的な治療剤を投与するステップをさらに含み、例えば特にＴＬＲ３抗体がＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する場合、追加的な作用剤は、免疫調節剤、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗生物質、抗炎症剤などからなる群から選択してもよい。特に、ＴＬＲ３発現細胞（例えば癌細胞）を除去するため、ＴＬＲ３抗体が、ＴＬＲ３発現細胞によって内在化され、および／または毒素もしくは細胞毒性薬に結合される場合、追加的な作用剤は、抗癌剤、細胞毒性剤などからなる群から選択してもよい。一態様では、本発明は、自己免疫、炎症、アレルギー、喘息、感染、骨粗鬆症、肝硬変および敗血、癌または本明細書で検討される他の疾患から選択される疾患を処置または予防するための方法であって、治療有効量の阻害性ＴＬＲ３抗体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。本抗体は、前記疾患を処置または予防するのに十分な時間投与される。
一実施形態では、本発明の抗体は、診断アッセイ、またはより一般的には、インビトロでＴＬＲ３ポリペプチドを検出するための任意のアッセイにおいて使用してもよい。一態様では、本発明は、（例えば生物学的試料中の）ＴＬＲ３ポリペプチドを検出するインビトロでの方法であって、ＴＬＲ３ポリペプチド（例えば、ＴＬＲ３ポリペプチドを発現する細胞、精製ＴＬＲ３ポリペプチド、生物学的試料など）を本発明のモノクローナル抗体と接触状態にするステップと、抗体とＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を検出するステップと、を含む方法を提供する。
本発明のこれらのおよびさらなる有利な態様および特徴は、本明細書中の他の箇所で、さらに説明されうる。
脊髄ＤＣ上でのＴＬＲ３活性化マーカーの阻害を示す。図１Ａ：ＣＤ８６発現のレベル、図１Ｂ：ＩＬ−６分泌、図１Ｃ：ＩＰ−１０分泌。すべての図面は、抗体３１Ｃ３が、対照と比較して、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 ＭｄＤＣ上でのＴＬＲ３活性化マーカーの阻害を示す。図２Ａ：ＣＤ８６発現のレベル、図２Ｂ：ＩＰ−１０分泌。すべての図面は、抗体２９Ｈ３が、対照と比較して、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 抗体３１Ｃ３のＦ（ａｂ）’２断片を精製全３１Ｃ３抗体（「Ｐｕｒ」によって示される）と比較した、脊髄ＤＣ上でのＴＬＲ３活性化マーカーの阻害を示す。図３Ａ：ＣＤ８６発現のレベル、図３Ｂ：ＩＰ−１０分泌。図面は、抗体３１Ｃ３のＦ（ａｂ）’２断片が、精製全３１Ｃ３抗体と同様、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 抗体２９Ｈ３のＦ（ａｂ）’２断片を精製全２９Ｈ３抗体（「Ｐｕｒ」によって示される）と比較した、ＭｄＤＣ上でのＴＬＲ３活性化マーカーの阻害を示す。図４Ａ：ＣＤ８６発現のレベル、図４Ｂ：ＩＰ−１０分泌。図面は、抗体２９Ｈ３のＦ（ａｂ）’２断片が、精製全２９Ｈ３抗体と同様、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 本発明に従う抗体が、ＴＬＲ３チップと比較して、市販の抗体より強い結合性を有する場合の結合親和性の比較を示す。 ＴＬＲ３受容体に対するリガンドであるポリＡＵの存在下または不在下での、ＴＬＲ３チップに対する本発明に従う抗体の結合性を示す。図面は、本発明の抗体の結合が、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３ ｄｓＲＮＡ固定部位への結合を遮断しないことを示す。 ＴＬＲ３チップ上での２９Ｈ３の存在が３１Ｃ３の結合を遮断し、またその逆もいえることを示す。これらの結果は、両抗体が、重複するかまたは高度に類似したエピトープに対して競合することを示す傾向がある。 コンピュータモデリングによって生成される、ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインの分子表面マップを示す。 ルシフェラーゼに基づくレポーター遺伝子活性（２９３Ｔ−ＴＬＲ３−ＩＳＲＥ）におけるＴＬＲ３シグナル伝達の阻害についてのアッセイの結果を示し、この場合、ルシフェラーゼにおける倍数増加がポリＡＵ用量の関数として示される。要するに、抗ＴＬＲ３抗体３１Ｃ３の存在下でのレポーターアッセイにおいて、ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３アゴニストを使用し、ＴＬＲ３シグナル伝達が誘発され、またＴＬＲ３シグナル伝達が評価された。抗体３１Ｃ３は、ＴＬＲ３阻害活性を全く有しない対照抗ＴＬＲ３抗体と比較して、ＴＬＲ３シグナル伝達を用量依存性に強力に阻害した。 図１０Ａは、対照（Ａｂなし：白点）と比較した、本発明に従う市販のＴＬＲ３．７抗体（黒点）、２８Ｆ１１（白三角）、２３Ｃ８（白四角）および３１Ｃ３（黒四角）抗体での、２９３Ｔ−ＴＬＲ３ルシフェラーゼアッセイを用いる、ＴＬＲ３シグナル伝達の用量依存性阻害を示す。図１０Ｂは、３１Ｃ３（黒四角）、２３Ｃ８および３４Ａ３（黒三角）抗体と比較するアッセイにおける同じ結果を示す。 抗体なし（黒点）と比較した、異なる条件下での３１Ｃ３（白四角）または２３Ｃ８（塗りつぶした黒四角）抗ＴＬＲ３抗体の効果を示す。ＩＰ−１０分泌は縦軸のｎｇ／ｍｌで示され、添加されるｄｓＲＮＡの用量は横軸のμｇ／ｍｌで示される。図１１Ａは、標準条件（予備活性化なし）下でのＴＬＲ３シグナル伝達の阻害を示す。図１１Ｂは、ポリＡＵ予備刺激下でのＴＬＲ３シグナル伝達の阻害を示す。図１１Ｃは、ＩＦＮα予備刺激下でのＴＬＲ３シグナル伝達の阻害を示す。 動力学アッセイの結果を示す。図１２Ａは、３１Ｃ３抗体における（ポリＡＵ用量に依存する）ｎｇ／ｍｌでのＩＰ−１０分泌を示し、図１２Ｂは、２３Ｃ８抗体における結果を示す。ＴＬＲ３ ｍＡｂは、ｄｓＲＮＡに対して、１時間３０分前（黒×印）、同時（黒プラス「＋」）、または１時間３０分後（白四角）のいずれかに培地に添加され、ｄｓＲＮＡ単独（黒点）は、陽性対照として提供される。 インビトロでの、ＴＬＲ３発現細胞内での３１Ｃ３ ｍＡｂによるヒトＴＬＲ３の特異的認識を示す。３１Ｃ１ ｍＡｂでの細胞内ＦＡＣＳ染色におけるヒストグラム特性は、ＨＥＫ２９３Ｔ対照細胞およびヒトＴＬＲ３が形質移入された２９３Ｔ細胞について示される。未染色物は、対照アイソタイプＩｇＧ１の場合に得られる蛍光強度範囲を示す。 脊髄ＤＣ上でのＴＬＲ３誘発性活性化マーカーおよびサイトカイン分泌の阻害を示す。図１４Ａ：ＩＰ−１０分泌、図１４Ｂ：ＣＤ８６発現のレベル。すべての図面は、抗体３１Ｃ３（黒点）、２８Ｆ１１（黒三角）および２３Ｃ８（黒四角）（ここでは５０μｇ／ｍｌの用量で示される）が、対照と比較して、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、本発明に従う抗体の結合親和性を示す。図１５Ａは、本発明に従う抗体が、ＴＬＲ３チップに対し、市販の（すなわちＴＬＲ３．７）抗体より強い結合性を有することを示す。図１５Ｂは、ＴＬＲ３チップが３１Ｃ３抗体で予め飽和されている場合での、前記チップに対する本発明に従う抗体の結合性を示す。図１５Ａおよび１５Ｂに示される結合レベルの比較により、チップが３１Ｃ３抗体で予め飽和されている場合、本発明に従う抗体がｈＴＬＲ３に対して低下した結合性を有するのに対し、市販のＴＬＲ３．７抗体が３１Ｃ３抗体の存在下または不在下で同じ結合レベルを保持することが明示される。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＴＬＲ３受容体に対するリガンドであるポリＡＵの存在下または不在下での、ＴＬＲ３チップに対する本発明に従う２８Ｆ１１、３４Ａ３および２３Ｃ８抗体の結合性を示す。図面は、本発明の抗体の結合が、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３ ｄｓＲＮＡ固定部位への結合を遮断しないことを示す。 ３４Ａ３抗体の、ｒｈＴＬＲ３（太線）単独または３１Ｃ３で飽和されたチップ（点線）に対する結合性を示す。図面は、２つの抗体が、ｈＴＬＲ３への結合において、３１Ｃ３と競合することを示す。 本発明に従う抗体のＣＤＲの系統樹を示す。図１８Ａは、軽鎖ＣＤＲにおける系統樹を示し、図１８Ｂは、重鎖ＣＤＲにおける系統樹を示す。図面は、抗体２８Ｆ１１（２８．２）、３１Ｃ３（３１）および２３Ｃ８（２３）の間に高いＣＤＲ相同性があり、かつ、２３Ｈ３（２９）および３４Ａ３（３４）がアミノ酸配列内により多くの差異を有することを示す。 図１９ＡおよびＢは、３４Ａ３抗体による脊髄ＤＣ上のＴＬＲ３活性化マーカーの阻害を示す。図１９Ａ：ＩＰ−１０分泌、図１９Ｂ：ＩＬ−６分泌。すべての図面は、抗体３４Ａ３（黒三角）が、対照（Ａｂなし−白点）および３１Ｃ３（黒四角、陽性対照）と比較して、ＴＬＲ３リガンド誘発性応答を阻害することを示す。 実施例８に記載される内在化アッセイのＦＡＣＳ分析を示す。図２０Ａは、抗体結合ＴＬＲ３タンパク質の不在下での２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞の標準蛍光を示す陰性対照を示す。図２０Ｂは、２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系におけるＴＬＲ３発現のレベルを示す陽性対照である。図２０ＣおよびＤはそれぞれ、２４時間または２時間のインキュベーション後に３１Ｃ３抗体とカップリングされるＴＬＲ３タンパク質の割合を示す。図２０Ｂと同様の蛍光を示す図２０Ｄおよび２０Ｆでは、抗体３１Ｃ３によるＴＬＲ３の結合が、２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系でのＴＬＲ３の発現を下方調節しないことが確認される。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＴＬＲ３受容体に対するリガンドであるポリＡＵの存在下または不在下での、ＴＬＲ３チップに対する本発明に従う２８Ｆ１１、３４Ａ３および２３Ｃ８抗体の結合性を示す。図面は、本発明の抗体の結合が、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３ ｄｓＲＮＡ固定部位への結合を遮断しないことを示す。
はじめに
本発明は、自己免疫、炎症、アレルギー、喘息、肝硬変、骨粗鬆症、感染、癌および敗血などの障害の予防および処置に適した抗体および特にＴＬＲ３調節性抗体を産生し、使用するための新規の方法を提供する。抗体、抗体誘導体、抗体断片、およびそれらを産生する細胞が、それらを産生する方法ならびに抗体および化合物を使用して患者を処置または診断する方法と同様、包含される。
高親和性が抗体において望ましい一方、一般に高ピコモル〜低ナノモルの範囲内での親和性を有することが報告されているすべての抗体が、インビトロで親和性が成熟している。科学文献によると、１００ｐＭにインビボでの親和性の上限があり、かつ、抗原に対する親和性が推定される上限を超えるＢ細胞産生抗体であれば、正常な免疫応答の間に選択的利点を全く有しなくなることが理由で、これが生じうることが提起されている。しかし、ヒトＴＮＦ−αに約５．３ｐＭの結合親和性（Ｋ（Ｄ））で結合する抗ＴＮＦ−α抗体「ＴＳＫ１１４」を含む高親和性抗体の例が存在し、それは最初は臨床的に関連するインフリキシマブ（レミケード）およびアダリムマブ（ヒュミラ）ｍＡｂの場合より約１，０００倍および１００倍高かった（Ｓｏｎｇら、（２００８年） Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４０（１）：３５−４２頁）。高親和性抗体を得ることは、抗原に依存する可能性があるが、これまで利用可能なＴＬＲ３抗体は、せいぜいナノモルでの親和性を示している。しかし、本抗ＴＬＲ３抗体は、極めて高い親和性（１０ピコモル相当であり、また１００ピコモルより高い、２つの抗体がかかる親和性を中性および酸性条件の双方で維持した場合を含む）を示した。
本発明は、少なくとも部分的には、酸性化エンドソーム区画内で遭遇される場合に対応する酸性条件下で、ＴＬＲ３に特異的かつ効率的に結合するモノクローナル抗体の発見に基づく。アッセイされる極めて多数の抗体の中で、酸性条件下で高親和性でのＴＬＲ３への結合を保持する特定の抗体が現れた一方、例えば市販される他の抗体およびＴＬＲ３への結合またはＴＬＲ３の調節において選択される他の抗体は、初期にＴＬＲ３に対してより高い（例えば２−ｌｏｇ１０高めの）親和性を示したにもかかわらず親和性が低下し、および／または、中性条件下であっても低い親和性を有した。用いられる酸性条件は、酸性化エンドソーム区画内で認められる場合と同様のｐＨ５．６であったが、それは炎症症状においてＴＬＲ３シグナル伝達が生じると考えられる条件に対応する。
酸性条件は、一般に、タンパク質の構造に作用するとともに、タンパク質−タンパク質相互作用に作用することが知られている。例えば、他のペプチドに結合されないＭＨＣクラスＩＩペプチドが、エンドソームの酸性条件下で速やかに分解することは知られている。しかし、この場合、ｐＨ５．６の酸性条件下で固定化ＴＬＲ３に対する高い結合親和性が低下した抗体は、酸性条件下（ｐＨ３）で予め精製されていた。理論に拘束されたくないが、これは、結合親和性の低下が生じた原因は、酸性条件での抗体の固有の不安定性（分解）ではなく、むしろ抗体とその標的抗原との間での相互作用における修飾であったことを示唆する。
ＴＬＲ３リガンドのポリ（Ｉ−Ｃ）が、酸性ｐＨ時に限ってＴＬＲ３に結合し、それを活性化することから、ｐＨの変化に起因する抗体−ＴＬＲ３相互作用における修飾は、ｄｓＲＮＡとＴＬＲ３との相互作用に作用すると考えられる。試験によると、ポリ（Ｉ−Ｃ）（および他のｄｓＲＮＡ）が、酸性条件（すなわち、ｐＨが４．５〜６．５の範囲内、または約５．６の酸性条件）下で静電ポテンシャルの変化を受けうる、中性ｐＨでの正の静電ポテンシャルのＴＬＲ３の領域内で、ＴＬＲ３に結合することが報告されている。しかし、本抗体は、抗体の結合親和性が実質的に変化しない状態を維持する程度に酸性化される条件下で、静電ポテンシャルにおいて実質的変化を受けない（または、例えば正の静電ポテンシャルの領域よりも少ない変化を受ける）エピトープに結合すると考えられる。一態様では、これは、抗体が、例えばＴＬＲ３への結合におけるＫＤが０．２−、０．３−、０．４−、０．５−、１．０−、もしくは１．５−ｌｏｇ１０を超えない程度に異なる場合、酸性条件下でヒトＴＬＲ３への結合に対して中性条件下と比べて実質的に異なる（より低いおよび／またはより高い）親和性を有しないことから、抗体のＴＬＲ３に対する親和性の観点から顕現しうる。酸性および中性条件下でのＴＬＲ３への結合におけるＫＤは、抗体３１Ｃ３および２９Ｈ７において、０．５−ｌｏｇ１０に満たない程度に異なった。本発明の抗体が結合する相手のエピトープは、中性ｐＨで負の静電ポテンシャルを有しうると考えられる。ＴＬＲ３タンパク質の表面上での負、正または中性の静電ポテンシャルの領域は、図８またはさらにＣｈｏｅら、（２００５年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１−５８５頁（その開示内容は、参照により本明細書中に援用される）の図５Ｄにおいて示される。ｄｓＲＮＡリガンドのＴＬＲ３への結合に干渉することによってＴＬＲ３を阻害する抗体は、ＴＬＲ３のグリコシル化を含まない表面上のＣ末端近傍の正または中性の静電ポテンシャルの領域に結合し、それにより、静電ポテンシャルのより大幅な変化を受けうるＴＬＲ３の領域内に結合する可能性が高まるが、本抗体は、ｄｓＲＮＡリガンドへの結合に関与しないＴＬＲ３の領域に結合しながらも、ＴＬＲ３タンパク質により、例えばＴＬＲ３が最終的にシグナルを変換するのに必要とされる高次構造をとることを阻害することにより、シグナル伝達を阻害する能力を保持するように見られる。
本発明はまた、少なくとも部分的には、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を特異的かつ効率的に阻害する高親和性モノクローナル抗体の発見に基づく。発明者らは、ヒトＴＬＲ３上に存在するエピトープ、例えばＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、またＴＬＲ３リガンドでの刺激に応答してサイトカイン放出を阻害する場合に特に効率的な、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３によって認識されるエピトープを同定している。
ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する本発明の抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することが有益である場合、自己免疫疾患、炎症性疾患および他の疾患を処置および／または予防するのに特に有用となる。自己免疫および炎症性疾患は、身体内に通常存在する物質および組織に対する身体の過剰反応免疫応答から発症する。自己免疫および炎症性疾患の双方においては、症状は、ヒト適応または先天免疫系の異常な反応を通じて発症する。自己免疫においては、患者の免疫系は、身体自体のタンパク質に対して活性化される。（例えば炎症症状を来しうる感染における）炎症性疾患においては、それは免疫系の過剰反応と、それに続く下流シグナル伝達（ＴＮＦ、ＩＦＮなど）であり、それは問題を引き起こす。自己免疫疾患は、自己抗原を認識し、かつ組織破壊を媒介するＴおよびＢ細胞の増殖に起因する。ウイルス感染は、長い間、自己免疫を引き起こすかまたは明らかに促進すると疑われてきた。Ｌａｎｇら、（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ、Ｖｅｓｔ．１１６：２４５６−２４６３頁、２００６年）においては、ウイルスがさらに別の機序を通じて自己免疫損傷を引き起こしうることが示されている。
最近では、ｄｓＲＮＡがＴＬＲ３に対するリガンドであることは確立されており（Ａｌｅｘｏｕｐｏｕｌｏｕら、（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２−７３８頁）、またより最近では、１つもしくは複数の損傷組織から放出されるＲＮＡの場合、ＴＬＲ３リガンドとしても作用しうることが示されている（Ｋａｒｉｋｏら、（２００４年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）。免疫複合体内部でのＴＬＲのその内因性ＲＮＡリガンドによる不適切な活性化は、ほぼ間違いなく、様々な炎症および自己免疫疾患の病原に寄与する重要な要素である。最近の論文では、ＴＬＲ３リガンドが、敗血、または自己免疫疾患、例えば関節リウマチ（Ｂｏｋａｒｅｗａら、（２００８年） ＥｕｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、全身性エリテマトーデス（Ｒａｈｍａｎら、（２００６年） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．）、および糖尿病（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２００５年）の間に認められる過剰炎症応答を増幅する場合の、炎症性疾患におけるＴＬＲ３の役割が示唆されている（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、２００８年）。ＴＬＲ３が、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）ワクシニアウイルスなどのウイルス感染において有害な役割を果たし（この場合、ＴＬＲ３は、ウイルス複製、有害な肺炎症および白血球の肺への動員に寄与する）、罹患率の増加またはウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）（この場合、ＴＬＲ３は、ウイルスが血液脳関門（ＢＢＢ）を越え、致死性脳炎を引き起こすことを可能にする）をもたらしうることも報告されている。エンドソームの場合（例えば脊髄ＤＣ内）に対応するｐＨ条件下で、ＴＬＲ３を阻害する本発明の抗体は、これらの症状、例えば限定はされないが、ウイルス感染自体およびウイルス感染によって引き起こされるかまたは促進される症状（例えば自己免疫または炎症症状）の処置および予防において有用となる。
Ｚｏｒｄｅ−Ｋｈ、Ｖａｌｅｖｓｋｙら、（２００９年） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４９は、肝細胞増殖がＴＬＲ３の不在下での部分肝切除後に加速される間、ＩＬ−６および可溶性のインターロイキン−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）のレベルが有意に低下したこと、またさらに、部分肝切除後、ＴＬＲ３シグナル伝達が肝細胞内で誘発され、ＮＦ−ｋＢの活性化がもたらされ、また、クッパー細胞内での活性化ＴＬＲ３の存在がＮＦ−ｋＢ活性化を阻害することを報告している。したがって、ＴＬＲ３シグナル伝達は、肝再生の開始を低下させることが見出され、それ故、本発明の抗ＴＬＲ３抗体は、特に、肝臓損傷、例えば肝硬変を含む疾患、あるいは、アルコール依存症、ＢもしくはＣ型肝炎感染または脂肪肝疾患などのかかる肝臓損傷を発症させることで知られる疾患を処置および予防するための、肝再生を誘発する方法において使用できる。
Ｋｉｍら、（２００９年） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．は、ＴＬＲ３が、ＲＡ滑膜内での破骨細胞形成を、ヒト単球を直接刺激することで破骨細胞分化を促進し、また、ＲＡ−ＦＬＳにおいて間接的にＲＡＮＫＬ発現を誘発することにより、直接的かつ間接的に促進することを報告している。ＲＡＮＫＬの発現は、ＲＡ滑膜内での破骨細胞の分化を促進し、また抗ＲＡＮＫＬ抗体（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ，Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）は、骨粗鬆症の処置において有効である。したがって、本発明の抗ＴＬＲ３抗体は、特にＲＡ患者における、炎症性骨破壊、例えば骨粗鬆症を処置および予防するのに使用できる。
Ｗｅｎら、（２００４年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：３１７２−３１８０頁は、自己免疫疾患がウイルス様刺激によって誘発されうることを示唆し、そこではＴＬＲ３がかかる誘発を媒介しうるものとして同定されている。結果によると、インスリン単独または他のＴＬＲリガンド（ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＰＧＮ）ではなく、ポリＩＣとインスリンとの併用により、マウスモデルにおいて膵島の自己免疫糖尿病およびアポトーシスを誘発されうることが示される。さらに、ＴＬＲ３は、他のＴＬＲと比較して、すべての個体において最高の発現レベルを示した。したがって、本発明の抗ＴＬＲ３抗体は、糖尿病および膵島自己免疫を処置および予防するのに使用できる。
酸性条件下でＴＬＲ３に結合する本発明の抗体は、一般に、細胞表面ＴＬＲ３およびエンドソームＴＬＲ３の双方に高親和性で結合することから、抗体は、ＴＬＲ３の標的化（例えば調節）が有用である場合の任意の状況（例えば疾患の処置または予防）下で有用となる。ＴＬＲ３は、マクロファージの表面における炎症のいくつかの症例に見出されており、エンドソーム酸性化（ａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のクロロキン中和時でのＴＬＲ３の遮断は、それに反し、一部で抗炎症活性を示した（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、２００８年、上記）。しかし、本発明の抗体は、疾患の処置または予防において、細胞質（例えばエンドソーム）区画内でのＴＬＲ３によるシグナル伝達を調節すること（例えば阻害すること）が有用であるかまたは求められる場合、他の抗体を超える最高の利点を有することになり、またかかる区画でのＴＬＲ３のシグナル伝達を調節することの相対的重要性は、疾患に依存しうる。かかる疾患の一例が関節リウマチであり、エンドソーム区画で発現されるＴＬＲ３は、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキンによる処理により、ＴＬＲ３シグナル伝達が阻害され、かつ関節リウマチを有する患者に由来する滑液培養物からの炎症性サイトカインの産生が阻害されることから、関節リウマチにおいて重要な役割を果たすと考えられる（Ｓａｃｒｅら、（２００８年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：８００２−８００９頁）。エンドソーム区画で発現されるＴＬＲ３は、ｍＤＣが、文書で十分に立証された、抗原をアポトーシスまたは壊死細胞（急性炎症中の組織壊死の間を含む）から取り込む能力を有することから、ＤＣ（例えば脊髄ＤＣ）が増悪疾患に関与する場合の多数の他の疾患において重要な役割を果たすと考えられる。
本抗体がＴＬＲ３に特異的であることから、それはまた、ＴＬＲ３またはＴＬＲ３発現細胞の精製、インビトロ、生体外、もしくはインビボでのＴＬＲ３受容体の調節（例えば活性化または阻害）、インビボでの破壊を意図したＴＬＲ３発現細胞の標的化、またはインビボ、生体外、もしくはインビトロでのＴＬＲ３の特異的標識／結合を含む他の目的のため、例えば、免疫ブロッティング、ＩＨＣ分析（すなわち凍結生検に対する）、ＦＡＣＳ分析、および免疫沈降などの方法において、使用できる。
定義
「ＴＬＲ３リガンド」は、本明細書で使用される場合、インビトロ、生体外、もしくはインビボでＴＬＲ３に特異的に結合し、その活性を改変しうる任意の化合物を示す。本化合物は、天然リガンド、例えば、一般にｄｓＲＮＡまたはウイルスｄｓＲＮＡ、またはポリＩＣもしくはポリＡＵなどの合成リガンドでありうる。本化合物は、無機もしくは有機化合物または因子を含む任意のタイプの分子、例えば、タンパク質（抗体など）、核酸、炭水化物、脂質、または任意の他の分子実体でありうる。さらに、かかる化合物は、活性化または阻害を含む任意の方法で、また任意の機序により、例えば、受容体に結合し、天然リガンドの場合と同様に活性を誘発または遮断するか、あるいは受容体に結合し、他のリガンドへの接近を遮断することにより、ＴＬＲ３受容体を調節しうる。好ましくは、リガンドは、受容体を活性化することから、それを使用し、ＴＬＲ３発現細胞によるサイトカインの産生を誘発することが可能である。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を示す。重鎖における定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに指定される。これらのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を示す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、それらが生理学的状態における最も一般的な抗体であり、またそれらが研究室セッティング（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｅｔｔｉｎｇ）において最も容易に作製されることから、本発明で使用される抗体の好ましいクラスであり、ＩｇＧが特に好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外ではヒトに適した抗体が特に好ましい。「抗体」はまた、本明細書中に記載の抗体のいずれかの任意の断片または誘導体を含む。
用語「に特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、または単離標的細胞の表面上に存在する天然タンパク質のいずれかを用いて評価される場合、結合パートナー、例えばＴＬＲ３に結合しうることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を判定するための他の方法は、下記にさらに説明され、当該技術分野で周知である。
抗体が特定のモノクローナル抗体（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）「と競合する」といわれる場合、それは、抗体が、組換えＴＬＲ３分子または表面に発現されるＴＬＲ３分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、結合アッセイにおいて、試験抗体が、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３のＴＬＲ３ポリペプチドまたはＴＬＲ３発現細胞への結合を低下させる場合、抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３とそれぞれ「競合する」といわれる。
用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、抗体のエピトープへの結合の力を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、かつ［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄによって与えられる。親和定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を測定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８８年）、Ｃｏｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９２年、１９９３年）、およびＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１頁（１９８３年）（参考文献は、全体として参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。ｍＡｂの親和性を判定するための、当該技術分野で周知の１つの好ましい標準的方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器の使用である。
本発明に関連する範囲内で、「決定基」は、ポリペプチド上での相互作用または結合の部位を示す。
用語「エピトープ」は、抗原決定基として定義され、抗体が結合する対象の抗原上の場所または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、ならびに特異的抗原に結合する抗体またはペプチドによって有効に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内部のアミノ酸残基を含んでもよい。それは、例えば抗体または受容体と結合しうる複合抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造領域である。エピトープは、線状または立体配座的／構造的であってもよい。用語「線状エピトープ」は、アミノ酸の線状配列（一次構造）上に隣接するアミノ酸残基からなるエピトープとして定義される。用語「立体配座的または構造的エピトープ」は、全部が隣接しておらず、それ故、分子のフォールディング（二次、三次および／または四次構造）によって互いに隣接した状態になる、アミノ酸の線状配列の分離した部分を示すアミノ酸残基からなるエピトープとして定義される。立体配座的エピトープは、三次元構造に依存する。したがって、用語「立体配座的」は、「構造的」と交換可能に使用されることが多い。
「免疫原性断片」は、本明細書中で、（ｉ）膜結合受容体およびそれに由来する突然変異体を含む、前記断片に結合する、および／または前記断片を含む任意の形態の分子に結合する抗体の産生、（ｉｉ）任意のＭＨＣ分子および前記断片に由来するペプチドを含む二分子複合体に対して反応するＴ細胞を含むＴ細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）哺乳類免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージまたは細菌などの形質移入媒体の結合、などの免疫応答を引き起こす能力がある任意のポリペプチドまたはペプチド断片を意味する。あるいは、免疫原性断片はまた、上で規定されるような、免疫応答を引き起こす能力がある任意の作成物、例えば共有カップリングによって担体タンパク質にコンジュゲートされたペプチド断片、前記ペプチド断片をそのアミノ酸配列内に含むキメラ組換えポリペプチドコンストラクトを示し、また詳細には、配列が前記断片をコードする部分を含むｃＤＮＡが形質移入された細胞を含む。
「毒性」または「細胞毒性」ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を減速させ、停止させ、または食い止めるか、それらの活性を任意の検出可能な方法で低下させるか、あるいはそれらを直接的もしくは間接的に殺滅することが可能な任意の化合物を包含する。好ましくは、毒性または細胞毒性化合物は、細胞を直接的に殺滅するか、アポトーシスを引き起こすかまたはそれ以外により、作用する。毒性「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、任意のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの誘導体、例えば非天然アミノ酸または修飾された結合を伴うペプチドもしくはポリペプチド誘導体を含みうる。毒性「小分子」は、好ましくは１０ｋＤ未満、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄ、もしくはそれより小さいサイズを有する任意の毒性化合物または因子を含みうる。
「ヒトに適した」抗体は、例えば本明細書中に記載の治療方法を意図した、ヒトにおいて安全に使用可能な任意の抗体、誘導体化抗体、または抗体断片を示す。ヒトに適した抗体は、あらゆるタイプのヒト化、キメラ、または完全ヒト抗体、あるいは、抗体の少なくとも一部が、ヒトに由来するかまたは一般に天然非ヒト抗体が使用される場合に引き起こされる免疫応答を回避するように修飾される場合の任意の抗体を含む。
本発明の目的のため、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合された抗体を示す。かかる抗体は、結合領域の由来となる非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。かかる抗体は、抗原接種に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「改変」されているトランスジェニックマウスまたは他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎら、（１９９４年） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、（１９９４年） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６頁；Ｔａｙｌｏｒら、（１９９４年） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９頁（これらの全教示内容は参照により本明細書中に援用される）を参照）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体形質移入（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法、ならびにファージディスプレイ技術（それら全部は当該技術分野で既知である）により、作製されうる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０年） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３頁を参照）。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって産生されうる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書（それら全体が参照により援用される）を参照）。
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部が改変されるか、置換されるか、または交換されることで、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤など）を与える完全に異なる分子に連結される場合；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、改変されるか、置換されるか、または交換されることで、可変領域が異なるまたは改変された抗原特異性を有する場合の、抗体分子である。
用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端断片、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖のアミノ酸（ａａ）２３０個〜ａａ４５０個の、または抗体重鎖の他のタイプ（例えば、ヒト抗体におけるα、δ、εおよびμ）におけるその対応配列、またはその天然アロタイプを示す。他に規定がなければ、免疫グロブリンについての一般に認められたＫａｂａｔアミノ酸の番号付けが、本開示全体を通じて用いられる（Ｋａｂａｔら、（１９９１年） 「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）。
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、通常的に材料に伴う（その天然状態で見出される）成分を実質的または本質的に含まない材料を示す。純度および等質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製される。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すように本明細書中で交換可能に使用される。同用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｉｍｅｔｉｃ）である場合のアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
用語「組換え体」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されているか、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、または、通常では異常発現される（発現されるかもしくは全く発現されない条件下で）天然遺伝子を発現する。
本発明と関連する範囲内で、共通の決定基に「結合する」抗体という用語は、前記決定基に特異性および／または親和性を伴って結合する抗体を示す。
抗ＴＬＲ３抗体の産生
本発明の抗体は、ＴＬＲ３に特異的に結合する。さらに、本発明の抗体は、酸性化エンドソーム区画内で遭遇される場合に対応する酸性条件下でＴＬＲ３に結合する。さらに、本発明の抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達経路に対する阻害能がある。阻害抗体がＴＬＲ３シグナル伝達経路を特異的に阻害する能力により、それらは極めて多数の用途において、特に、本明細書中に記載のように、ＴＬＲ３シグナル伝達経路の阻害、すなわちさらに、サイトカインおよびケモカイン分泌ならびに細胞活性化を回避することが望ましい場合の疾患を処置または予防するのに有用になる。
一実施形態では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合し、かつヒトＴＬＲ３への結合においてモノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合する抗体を提供する。抗体３１Ｃ３は、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１８６下で２００９年７月３日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ）に３１Ｃ３．１として寄託された細胞によって産生される。抗体２９Ｈ３は、番号ＣＮＣＭＩ−４１８６下で２００９年７月３日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ）に２９Ｈ３．７として寄託された細胞によって産生される。
「ＴＬＲ３」、「ＴＬＲ３ポリペプチド」および「ＴＬＲ３受容体」は、交換可能に使用され、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバであるＴｏｌｌ様受容体３を示すように本明細書で使用される。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１で示される（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ ００３２５６、その開示内容は参照により本明細書中に援用される）。ヒトＴＬＲ３ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ ００３２６５で記載される。ヒトＴＬＲ３配列はまた、ＰＣＴ特許公開番号、国際公開第９８／５０５４７号パンフレット（その開示内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載される。
一態様では、本発明は、モノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合し、モノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と実質的もしくは本質的に同じ、または同じ、ＴＬＲ３分子上のエピトープまたは「エピトープ部位」を認識し、それに結合し、またはそれに対する免疫特異性を有する抗体を提供する。他の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３からなるか、またはその誘導体もしくは断片である。
好ましい抗体が抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と同じエピトープに結合する一方、本抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドの任意の部分を認識し、かつそれに対して産生されうることは理解されるであろう。例えば、ＴＬＲ３の任意の断片、好ましくも限定されないヒトＴＬＲ３、またはＴＬＲ３断片の任意の組み合わせは、抗体を産生するための免疫原として使用でき、また本発明の抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチド内部の任意の位置でエピトープを認識することが、それらが本明細書中に記載のＭｄＤＣもしくはＭｏＤＣなどのＴＬＲ３発現細胞上でそのように作用しうる限り、可能である。一実施形態では、認識されたエピトープは、細胞表面上に存在し、すなわちそれらは、細胞外部に存在する抗体に接近可能である。最も好ましくは、エピトープは、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３によって特異的に認識されるエピトープである。さらに、ＴＬＲ３内部の異なるエピトープを認識する抗体は、併用されることで、例えば、異なる個体中で最大の有効性および大きさを有するＴＬＲ３ポリペプチドに結合しうる。
本発明の抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術によって産生してもよい。典型的には、それらは、非ヒト動物、好ましくはマウスの、ＴＬＲ３ポリペプチド、好ましくはヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原による免疫によって産生してもよい。ＴＬＲ３ポリペプチドは、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドの完全長配列、またはその断片もしくは誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわち、ＴＬＲ３ポリペプチドを発現する細胞の表面上に暴露されるエピトープ、好ましくは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３抗体によって認識されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含んでもよい。かかる断片は、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７の連続アミノ酸、さらにより好ましくはその少なくとも約１０の連続アミノ酸を有する。断片は、典型的には、本質的に受容体の細胞外ドメインに由来する。好ましい実施形態では、免疫原は、脂質膜内、典型的には細胞の表面にある野生型ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、免疫原は、無傷細胞、特に無傷ヒト細胞、場合によって処理または溶解される場合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、組換えＴＬＲ３ポリペプチドである。
非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスにおける抗体の産生を刺激するための当該技術分野で周知の任意の方法で実施してもよい（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８８年）（その全開示内容は、参照により本明細書中に援用される）を参照）。免疫原は、場合によってアジュバント、例えば完全または不完全フロインドアジュバントを有する緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を測定するための方法は、当業者にとって周知であり、本発明に対して決して限定的ではない。これらのパラメータは、異なる免疫原に対して異なる場合があるが、容易に解明される。
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の位置および頻度もまた、当該技術分野で周知である。典型的な免疫プロトコルでは、非ヒト動物は、１日目と約１週間後に再度、抗原が腹腔内に注射される。この後、約２０日目に、場合によって不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントを用いる、抗原のリコール注射（ｒｅｃａｌｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が行われる。リコール注射は、静脈内に行われ、数日間連続して繰り返してもよい。この後、４０日目に、典型的にはアジュバントを用いずに、静脈内または腹腔内のいずれかにブースター注射が行われる。このプロトコルにより、約４０日後、抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の産生がもたらされる。他のプロトコルもまた、免疫において使用される抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞の産生がもたらされる限り、用いてもよい。
ポリクローナル抗体の調製においては、血清が、免疫非ヒト動物および周知の技術によって単離されるその中に存在する抗体から得られる。ＴＬＲ３ポリペプチドと反応する抗体を得るため、血清を、固体支持体に結合された上に示される免疫原のいずれかを用いて親和性精製してもよい。
他の実施形態では、非免疫非ヒト哺乳動物由来のリンパ球が単離され、インビトロで成長され、次いで細胞培養物中の免疫原に暴露される。次いで、リンパ球は採取され、下記の融合ステップが実施される。
好ましいモノクローナル抗体においては、次のステップは、抗体産生ハイブリドーマを形成するための、免疫非ヒト哺乳動物由来の脾細胞の単離およびそれに続くそれら脾細胞と不死化細胞との融合である。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当該技術分野で周知であり、また、単一の細胞懸濁液を生成するため、典型的には、麻酔された非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、脾細胞を脾膜からセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）のナイロンメッシュを通して適切な緩衝液に搾り出すことを含む。細胞は、洗浄され、遠心分離され、任意の赤血球を溶解する緩衝液に再懸濁される。溶液は、再び遠心分離され、ペレット中に残存するリンパ球は、最終的に新しい緩衝液に再懸濁される。
リンパ球は、一旦単離され、単一の細胞懸濁液中に存在する場合、不死細胞系に融合されうる。これは、典型的にはマウス骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマの作製に有用な多数の他の不死細胞系は、当該技術分野で既知である。好ましいマウス骨髄腫系は、限定はされないが、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞に由来するものを含む。融合は、ポリエチレングリコールまたはそれに類するものを使用して行われる。次いで、得られたハイブリドーマは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１種以上の物質を含有する選択培地中で成長される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠損している場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（同物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する）を含むことになる（ＨＡＴ培地）。
ハイブリドーマは、典型的にはマクロファージの栄養補給層上で成長される。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するために使用される、非ヒト哺乳動物の同腹子に由来し、また、典型的には、ハイブリドーマをプレーティングする数日前に不完全フロインドアジュバントまたはそれに類するものでプライミングされる。融合方法は、Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）（その開示内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
細胞は、コロニー形成および抗体産生にとっての十分な時間、選択培地中で成長させておく。これは通常、約７〜約１４日間である。
次いで、ハイブリドーマコロニーは、ＴＬＲ３ポリペプチド遺伝子産物、場合により、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３によって特異的に認識されるエピトープに特異的に結合する抗体の産生についてアッセイされる。アッセイは、典型的には、比色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが成長するウェルに適合しうる場合には任意のアッセイを用いてもよい。他のアッセイは、ラジオイムノアッセイまたは蛍光活性化細胞選択を含む。所望される抗体産生が陽性のウェルについて試験し、１つ以上の異なるコロニーが存在するか否かが判定される。２つ以上のコロニーが存在する場合、細胞は、再クローン化され、成長され、単一の細胞のみが所望される抗体を産生するコロニーを生じさせていることが確認されうる。典型的には、本抗体はまた、下記のように、パラフィン包埋組織切片内でのＴＬＲ３ポリペプチド、例えばＴＬＲ３発現細胞に対する結合能について試験されることになる。
本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されているハイブリドーマは、適切な培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０中でより大量に成長されうる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍として、インビボで成長されうる。
モノクローナル抗体（または腹水）を含有する増殖培地は、所望されるモノクローナル抗体を産生するほどに十分に成長した後、細胞から分離され、その中に存在するモノクローナル抗体は精製される。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー（プロテインＡもしくはプロテインＧ−セファローズ、またはアガロースもしくはセファロースビーズなどの固体支持体に連結された抗マウスＩｇを使用）によって行われる（すべては、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、発刊番号１８−１０３７−４６、Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣ（その開示内容はここで参照により援用される）中に記載されている）。結合抗体は、典型的には、抗体含有画分の即時中和を伴う低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシンもしくは酢酸塩緩衝液）の使用により、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出される。これらの画分は、必要に応じ、プールされ、透析され、濃縮される。
外見上単一のコロニーを有する陽性のウェルは、典型的には、再クローン化および再アッセイがなされることで、１つのモノクローナル抗体のみが検出され、産生されていることが確認される。
抗体はまた、例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１（１９８９年）、５４４頁（その全開示内容は参照により本明細書中に援用される）に開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によって産生されてもよい。
ＴＬＲ３、特に、モノクローナル抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と実質的もしくは本質的に同じエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定については、抗体競合が評価可能な、種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて容易に判定されうる。多くのかかるアッセイは、通常的に実施され、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号明細書、１９９７年８月２６日に交付（具体的には参照により本明細書中に援用される）を参照）。本明細書中に記載の抗体が結合するエピトープを実際に決定することが、本明細書中に記載のモノクローナル抗体と同じもしくは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するために決して必要とされないことが理解されるであろう。
例えば、試験されるべき試験抗体が異なる動物源から得られるか、またはさらに異なるＩｇアイソタイプである場合、対照（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）および試験抗体が混合され（または予備吸着され）、ＴＬＲ３ポリペプチドを含有する試料に適用されるような単純な競合アッセイを用いてもよい。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコルおよびＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用は、かかる競合試験における使用に適する。
特定の実施形態では、対照抗体（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）を、様々な量の試験抗体と、ＴＬＲ３抗原試料に適用する前のある期間、予備混合する（例えば、約１：１０または約１：１００）。他の実施形態では、対照および様々な量の試験抗体は、ＴＬＲ３抗原試料に暴露する間、単純に混合しうる。（例えば、未結合抗体を除去するための分離または洗浄技術を用いることにより）結合抗体を遊離抗体から、また、（例えば、種特異的またはアイソタイプ特異的二次抗体を使用するかまたは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３を検出可能な標識で特異的に標識することにより）３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３を試験抗体から区別できる限り、試験抗体が３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３の抗原への結合を低下させるか否かを判定することができ、それは試験抗体が３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と実質的に同じエピトープを認識することが示される。完全に無関係な抗体の不在下での（標識）対照抗体の結合は、高値の対照としての機能を果たしうる。低値の対照は、標識（３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）抗体を全く同じタイプ（３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）の未標識抗体とともにインキュベートすることによって得られる可能性があり、この場合、競合が生じ、かつ標識抗体の結合が低下することになる。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性における有意な低下は、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識（３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）抗体と「交差反応する」または「競合する」抗体を示唆する。３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３のＴＬＲ３抗原への結合を、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５〜１００％）低下させる任意の試験抗体（３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３：試験抗体が約１：１０〜約１：１００の間での任意の比）は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であると考えられる。好ましくは、かかる試験抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３のＴＬＲ３抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば約９５％）低下させることになる。
競合はまた、例えばフローサイトメトリー試験によって評価しうる。かかる試験では、所与のＴＬＲ３ポリペプチドを担持する細胞は、最初に例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３とともに、次いで蛍光色素またはビオチンで標識された試験抗体とともにインキュベートしうる。飽和量の３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３とのプレインキュベーション時に得られる結合が、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３とのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる（蛍光を介して測定される）結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％もしくはそれ未満（例えば、約３０％、２０％もしくは１０％）である場合、抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合するといわれる。あるいは、飽和量の試験抗体とプレインキュベートされる細胞上の（蛍光色素またはビオチンによる）標識３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３抗体の場合に得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションを伴わない場合に得られる結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％、もしくはそれ未満（例えば、約３０％、２０％もしくは１０％）である場合、抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合するといわれる。
また、試験抗体が、上部にＴＬＲ３抗原が固定化されている表面に飽和濃度で予備吸着され、適用されている単純な競合アッセイを用いてもよい。単純な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）は、ＴＬＲ３飽和濃度で表面と接触状態にされ、対照抗体のＴＬＲ３および表面への結合が測定される。対照抗体のこの結合は、試験抗体の不在下での対照抗体のＴＬＲ３含有表面への結合と比較される。試験アッセイにおいては、試験抗体の存在下での対照抗体によるＴＬＲ３含有表面での結合における有意な低下は、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識することで、試験抗体が対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照（３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３など）抗体のＴＬＲ３抗原への結合が少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％低下した任意の試験抗体は、対照（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であると考えられうる。好ましくは、かかる試験抗体は、対照抗体（例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３）のＴＬＲ３抗原への結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくはそれより大きく）低下させることになる。対照および試験抗体の順序は入れ替え可能であり、すなわち、競合アッセイにおいて、対照抗体が最初に表面に結合でき、その後に試験抗体が表面と接触状態にされることは理解されるであろう。好ましくは、ＴＬＲ３抗原に対してより高い親和性を有する抗体は、最初に表面に結合され、これは、二次抗体において認められる結合性の低下（抗体が交差反応していると仮定）がより顕著になると想定されることが理由である。かかるアッセイのさらなる例が、例えば、Ｓａｕｎａｌ （１９９５年） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３−４１頁（その開示内容は参照により本明細書中に援用される）に提供される。
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者に既知の方法で行ってもよい。かかるマッピング／特徴づけ方法の一例としては、抗ＴＬＲ３抗体に対するエピトープ領域は、ＴＬＲ３タンパク質中での暴露されるアミン／カルボキシルの化学修飾を用いるエピトープ「フットプリンティング」によって判定されうる。かかるフットプリンティング技術の１つの具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析によって検出される水素−重水素交換）の使用であり、ここでは、受容体およびリガンドタンパク質のアミド陽子での水素／重水素交換、結合、および逆交換が生じ、ここでタンパク質結合に関与する骨格アミド基は、逆交換から保護され、したがって重水素化されたままになる。関連領域は、この場所で、ペプシンタンパク質加水分解、高速マイクロボア高性能液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析によって同定されうる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２６７巻（２）、２５２−２５９頁（１９９９年） Ｅｎｇｅｎ Ｊ．Ｒ．およびＳｍｉｔｈ Ｄ．Ｌ．（２００１年） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３、２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。好適なエピトープ同定技術の別の例が、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、この場合、典型的には、遊離抗原および抗原結合ペプチド、例えば抗体と複合体を形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置が比較される。抗原は、典型的には、１５Ｎで選択的に同位体標識されることで、ＮＭＲスペクトルにおいて、抗原に対応するシグナルのみが見られ、かつ抗原結合ペプチドからのシグナルが全く見られない。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的には、複合体のスペクトルにおける位置を、遊離抗原のスペクトルに対してシフトさせることになり、また結合に関与するアミノ酸は、そのようにして同定されうる。例えば、Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４年；（４４）：１４９−６７頁；Ｈｕａｎｇ ｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２８１巻（１）、６１−６７頁（１９９８年）；ならびにＳａｉｔｏおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６年６月；９（３）：５１６−２４頁を参照のこと。
エピトープマッピング／特徴づけはまた、質量分析法を用いて実施可能である。例えば、Ｄｏｗｎｗａｒｄ、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００年４月；３５（４）：４９３−５０３頁ならびにＫｉｓｅｌａｒおよびＤｏｗｎａｒｄ、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９年５月１日；７１（９）：１７９２−８０１頁を参照のこと。また、プロテアーゼ消化技術は、エピトープマッピングおよび同定と関連して有用でありうる。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばｐＨ７〜８でのｏ／ｎ消化のためにトリプシンをＴＬＲ３に対して約１：５０の比で使用し、続いてペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）で分析することにより、判定されうる。抗ＴＬＲ３結合剤によってトリプシン切断から保護されたペプチドは、後に、トリプシン消化を受けた試料と、抗体とともにインキュベートされ、次いで例えばトリプシンによる消化を受けた試料と、の比較によって同定されうる（それによって結合剤に対するフットプリントが明らかになる）。キモトリプシン、ペプシンなどのような他の酵素は、同様のエピトープ特徴づけ方法において使用しうる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面暴露されていない（それ故、免疫原性／抗原性の観点で最も関連性が少ない）ＴＬＲ３ポリペプチドの領域内に含まれるか否かを分析するための迅速な方法を提供しうる。類似技術の考察については、例えばＭａｎｃａ、Ａｎｎ Ｉｓｔ Ｓｕｐｅｒ Ｓａｎｉｔａ．１９９１年；２７：１５−９頁を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープの解明のために有用な別の技術である。例えば、「アラニン走査」においては、タンパク質セグメント内の各残基がアラニン残基と置換され、結合親和性における結果が測定される。突然変異が結合親和性の有意な低下（ｒｅｓｕｃｔｉｏｎ）をもたらす場合、結合に関与する可能性が最も高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、フォールディングされていないタンパク質に結合しない抗体）を使用し、アラニン置換が、タンパク質のフォールディング全体に影響を与えないことを検証することが可能である。例えば、ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５年；２６７：３８３−３８６頁；およびＷｅｌｌｓ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６年；９３：１−６頁を参照のこと。
また、エピトープ「フットプリンティング」に対して、電子顕微鏡を使用してもよい。例えば、Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ １９９２年；３５５：２７５−２７８頁では、天然ササゲモザイクウイルスのカプシド表面上のＦａｂ断片の物理的フットプリントを測定するため、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成、およびＸ線結晶学の協調的活用が用いられた。
エピトープ評価のための「非標識（ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）」アッセイの他の形態として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｇｅｒｓｔａｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０年；３：２０８−１４頁；Ｎｉｃｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒ．１９９３年；６４６：１５９−１６８頁；Ｌｅｉｐｅｒｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８年；３７：３３０８−３３１１頁；Ｋｒｏｇｅｒら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２年；１７：９３７−９４４頁を参照のこと。
本発明の抗体と同じもしくは実質的に同じエピトープに結合する抗体が、本明細書中に記載の典型的な競合アッセイの１つ以上において同定されうることも着目すべきである。
一旦、ＴＬＲ３に対する結合能があり、および／または他の所望される特性を有する抗体が同定されると、それらはまた、典型的には、例えば本明細書中に記載の標準的方法を用い、それらの他のポリペプチド、例えば関連のないポリペプチドおよび他のＴＬＲファミリーメンバ（例えば、ヒトＴＬＲ１、２、もしくは４〜１０）に対する結合能について評価されることになる。望ましくは、抗体は、あくまでＴＬＲ３、例えばヒトＴＬＲ３に対して実質的な親和性で結合し、関連のないポリペプチドまたは他のＴＬＲファミリーメンバ（例えば、ＴＬＲ２もしくはＴＬＲ４；アミノ酸残基１〜２３でのシグナルペプチドを含むヒト前駆体ＴＬＲ４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿６１２５６４に見出され、その開示内容は参照により本明細書中に援用される）に有意なレベルで結合しない。しかし、ＴＬＲ３に対する親和性が、他のＴＬＲファミリーメンバ（または他の関連のないポリペプチド）の場合より実質的に高い（例えば、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０、０００倍、もしくはそれより高い）限り、抗体は本方法における使用に適することが理解されるであろう。
抗体のＴＬＲ３発現細胞への結合はまた、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはマウスなどの他の哺乳類において評価しうる。したがって、本発明は、抗体、ならびにその断片および誘導体を提供し、ここで前記抗体、断片または誘導体は、ＴＬＲ３に特異的に結合し、さらにそれは、非ヒト霊長類、例えばカニクイザルに由来するＴＬＲ３に結合する。場合により、細胞内取り込みまたは局在化、場合により、エンドサイトーシス経路などの細胞内区画内での局在化が、ＴＬＲ３が発現される細胞および／または細胞内区画へ容易に取り込まれる抗体を選択するため、評価される。細胞内取り込みまたは局在化は、一般に、抗体がその活性を発揮することが求められるかまたは考えられている細胞内、例えばＤＣ内で測定されることになる。細胞内取り込みまたは局在化は、標準的方法により、例えば検出可能な部分（例えば蛍光部分）で標識された抗体を使用する共焦点染色により、評価しうる。
脊椎動物または細胞内での抗体の免疫および産生時、特定の選択ステップを実施し、特許請求される抗体を単離してもよい。これに関連し、特定の実施形態では、本発明はまた、かかる抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を、ＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で免疫するステップと；（ｂ）前記免疫動物から抗体を調製するステップと；（ｃ）ＴＬＲ３に結合する能力がある、ステップ（ｂ）からの抗体を選択するステップと、を含む方法に関する。本抗体は、細胞質区画（例えばエンドソーム区画）内の場合に対応する酸性条件下、例えば約５．５〜６．５の間のｐＨで、ＴＬＲ３への結合について試験しうる。
酸性条件下でのヒトＴＬＲ３に対する抗体の二価結合親和性は、測定可能である。抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５、もしくは１ナノモル以下（すなわち親和性が向上）、好ましくはサブナノモル、または場合により、約３００、２００、１００もしくは１０ピコモル以下の平均ＫＤにより、特徴づけることが可能である。ＫＤは、例えば、組換え的に生成されたヒトＴＬＲ３タンパク質のチップ表面上への固定化、それに続く溶液中で試験されるべき抗体の適用（例えば本実施例中に示される）により、測定可能である。酸性および中性条件下での結合性に類似した結合性を保持する抗体を選択するため、例えば酸性ｐＨでの結合親和性が実質的に低下しない場合、例えばＴＬＲ３への結合におけるＫＤが、非酸性ｐＨで認められる場合より、０．２−、０．３−、０．５−、１．０−、もしくは１．５−ｌｏｇ１０以下だけ低下する場合、中性ｐＨ（例えば７．２）での結合と酸性ｐＨ（例えば４．５〜６−５の範囲内のｐＨ）での結合との間に認められる差異の最小化を試みることができる。一実施形態では、本方法は、ＴＬＲ３への結合において、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３と競合する能力がある、（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）をさらに含む。
実施形態のいずれかの一態様では、本方法によって調製される本抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、本発明の方法に従う抗体を産生するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば齧歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ、またはヒツジである。本発明の抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３を包含する。しかし、他の抗体が、本明細書中に記載の方法を用いて得ることが可能であり、それ故、本発明の抗体は、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３以外の抗体でありうることは理解されるであろう。さらに、本発明の抗体は、場合により、抗体ＴＬＲ３．７のいずれか（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））、国際公開第０６／０６０５１３号パンフレットの抗体Ｃ１０６８、国際公開第２００７／０５１１６４号パンフレットの抗体Ｃ１１３０、国際公開第２０１０／０５１４７０号パンフレットで開示された抗体のいずれか、例えば抗体１〜１９およびＦ１７〜Ｆ１９、抗体４０Ｃ１２８５（Ａｂｃａｍ）、または抗体６１９Ｆ７、７１３Ｅ４、７１６Ｇ１０、ＩＭＧ−５６３１、ＩＭＧ−３１５もしくはＩＭＧ−５３４８（全部がＩｍｇｅｎｅｘ．Ｃｏｒｐ．製）あるいはそれらの誘導体（例えば、全部または一部において抗原結合領域を含む）、以外の抗体であるように特定化しうる。
他の実施形態によると、ＴＬＲ３ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡは、本発明のハイブリドーマから単離され、適切な宿主への形質移入にとって適切な発現ベクター内に挿入される。次いで、宿主は、抗体、またはその変異体、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、または検出可能な部分を含むバージョンの組換え産生のために使用される。
本発明のモノクローナル抗体、例えば、抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３をコードするＤＮＡは、従来の手順を用い（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力があるオリゴヌクレオチドプローブの使用により）、容易に単離され、配列決定されうる。ＤＮＡは、一旦単離されると、発現ベクターに挿入可能であり、次いでそれは、通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入され、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成が得られる。本明細書中の他の箇所で記載のように、抗体の結合特異性を最適化することを目的に、かかるＤＮＡ配列は、例えば、抗体をヒト化する、断片もしくは誘導体を産生する、または例えば抗原結合部位において抗体の配列を修飾するといった多数の目的のいずれかのため、修飾しうる。
抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組換え発現は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、５、２５６頁（１９９３年）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０、１５１頁（１９９２年）を参照。
抗体のＴＬＲ３シグナル伝達に対する調節能の評価
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を調節し、例えば阻害し、結果としてＴＬＲ３発現細胞の活性または挙動を調節することができる。例えば、抗体は、ＴＬＲ３発現細胞の活性化を阻害してもよく、例えばそれらはＴＬＲ３シグナル伝達経路を、場合によってｄｓＲＮＡなどの天然もしくは内因性リガンドのＴＬＲ３への結合を遮断することなく阻害可能であり、場合により、それらは、ＴＬＲ３タンパク質がＴＬＲ３リガンドの存在下でホモ二量体を形成する能力を遮断し、それ故、シグナル伝達カスケードの開始を遮断してもよい。したがって、これらの抗体は、「中和」または「阻害」または「遮断」抗体と称される。かかる抗体は、特に、ＴＬＲ３発現免疫細胞の活性を低下させるため、例えば過剰なＴＬＲ３発現細胞の活性または数を含む症状の処置または予防において、またはＴＬＲ３発現細胞活性の低下が、症状またはその任意の徴候を改善、予防、除去、またはいくらか改善しうる場合、有用である。
様々な範囲の細胞アッセイを用い、抗体のＴＬＲ３シグナル伝達に対する調節能を評価することが可能である。分子、細胞に基づく、および動物に基づくモデルを含む多数のアッセイのいずれかを用い、抗ＴＬＲ３抗体のＴＬＲ３発現細胞活性に対する調節能を評価することが可能である。例えば、細胞に基づくアッセイを、ＴＬＲ３を発現する細胞がｄｓＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、ポリＩＣ、もしくはポリＡＵ、または別のＴＬＲ３リガンドに暴露され、かつ、抗体がリガンドの結合または受容体の刺激を破壊する能力（例えば、本明細書中に記載のＴＬＲ３細胞活性、例えばインターフェロン発現、ＮＦｋＢ活性、ＮＫ細胞活性化などのいずれかを試験することによって判定される）が評価されるように、用いルことが可能である。アッセイにおいて使用されるＴＬＲ３リガンドは、限定はされないが、精製リガンド組成物として、非ＴＬＲ３リガンドとの混合物中、天然組成物中、細胞内もしくは細胞の表面上を含む任意の好適な形態でありえ、あるいは溶液中または固体支持体上で細胞によって分泌されうる（例えばリガンドを産生する細胞がアッセイで使用される）。
ＴＬＲ３発現細胞の活性はまた、リガンドの不在下で、細胞を抗体自体に暴露し、細胞の活性または挙動の任意の態様に対するその効果を評価することによって評価しうる。かかるアッセイにおいては、ＴＬＲ３発現細胞のベースラインレベルの活性（例えば、サイトカイン産生、増殖、下記参照）が、リガンドの不在下で得られ、また抗体または化合物がベースライン活性レベルを変更する能力が検出される。かかる一実施形態では、高スループットスクリーニングアプローチを用い、受容体の活性化に作用可能な化合物が同定される。
ＴＬＲ３活性に反映する任意の好適な生理的変化を用い、試験抗体または抗体誘導体を評価することが可能である。例えば、種々の効果、例えば遺伝子発現における変化（例えばＮＦｋＢ応答性遺伝子）、タンパク質分泌（例えばインターフェロン）、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞内二次メッセンジャー、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰ、またはＮＫ細胞に対する活性化能などの活性を測定することができる。一実施形態では、受容体の活性は、サイトカイン、例えばＴＬＲ３応答性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインの産生を検出することによって評価される。
ＴＬＲ３の調節は、ほとんどの場合、例えば、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＫＫεおよび／またはＴＢＫ１を含む、例えばＭｙＤ８８独立性／ＴＲＩＦ依存性シグナル形質導入経路を含む、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル形質導入経路に基づく、多数の考えられる読み出しシステム（ｒｅａｄｏｕｔ ｓｙｓｔｅｍ）のいずれかを使用して評価されうる（ＡｋｉｒａおよびＴａｋｅｄａ （２００４年） Ｎａｔｕｒｅ ＲｅＶｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４９９−５１１頁）。これらの経路は、ＫＢキナーゼ複合体を含むキナーゼを活性化する。ＴＬＲ３の活性化は、ＴＬＲシグナル伝達の任意の態様を試験することによって評価されうる。例えば、ＴＬＲシグナル伝達の活性化は、タンパク質−タンパク質会合（例えば、ＴＲＩＦとＴＢＫおよび／またはＩＫＫε）、タンパク質の細胞内局在化（ＮＫ−ｋＢの核への移動など）、および遺伝子発現（例えば、ＮＫ−ｋＢ感受性遺伝子の発現）における変化、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１の産生および分泌）を引き起こす。任意のかかる変化は、検出可能であり、それを用いてＴＬＲ３活性化が検出されうる。一実施形態では、ＴＬＲ３の刺激は、培養の１８〜２０時間後に上清を回収し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＭＣＰ−１のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定することによって検出される。別の実施形態では、ＴＬＲ３の刺激は、培養の１８〜２０時間後に上清を回収し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０および／またはＭＣＰ−１のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定することによって検出される。
一実施形態では、ＴＬＲ３を天然に発現する細胞、例えばＤＣ（例えば脊髄ＤＣまたは単球由来ＤＣ）が使用される。別の実施形態では、ＴＬＲ３の刺激およびその結果としてのシグナル形質導入経路の活性化時、検出可能な遺伝子産物の発現を引き起こすレポーターコンストラクトを有する細胞が使用される。アッセイにとって特に有用なレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子コンストラクトは、例えば、ＮＦ−ｋＢまたは特にＴＲＩＦ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＫＫε、ＴＢＫ１によって媒介されるシグナル伝達に感受性を示すプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。かかるプロモーターの例として、限定はされないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＩＰ−１０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＴＮＦ−αに対するものが挙げられる。ＴＬＲ感受性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子は、限定はされないが、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、生物発光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、例えば米国特許第５，４９１，０８４号明細書）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、例えば米国特許第６，４８６，３８２号明細書）など）、表面発現分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、および分泌分子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＴＮＦ−α）を含みうる。例えば、Ｈｃｋｅｒ Ｈら、（１９９９年） ＥＭＢＯＪ．１８：６９７３−８２頁；Ｍｕｒｐｈｙ ＴＬら、（１９９５年） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：５２５８−６７頁（それらの開示内容は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。使用に適したレポータープラスミドは、市販されている（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。一実施形態では、アッセイは、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを発現するように作製された宿主細胞内で、試験組成物が、ＴＬＲ３シグナル伝達に対して応答性を示すプロモーター（例えばＩＳＲＥ、ＩＦＮ刺激応答因子）の制御下で、ルシフェラーゼ発現（または他のレポーター）を誘発するか否かを判定するステップを含む。
酵素活性の読み出しに依存するアッセイにおいては、基質がアッセイの一部として供給され、また検出は、化学発光、蛍光、着色、放射性標識の取り込み、薬剤耐性、光学密度、または酵素活性の他のマーカーの測定を含みうる。分子の表面発現に依存するアッセイにおいては、検出は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析または機能アッセイを用いて行われうる。分泌分子は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはバイオアッセイを用いてアッセイ可能である。これらや他の好適な読み出しシステムの多くは、当該技術分野で周知であり、市販されている。好ましくは、レポーターシステムは、いずれが使用される場合でも定量化可能である。
別の実施形態では、ＴＬＲ３発現細胞に対する抗体の効果は、インビボで非ヒト霊長類において評価される。例えば、本発明の抗ＴＬＲ３抗体を含む医薬組成物は、健常であるかまたはある症状、例えば自己免疫疾患または炎症を発祥している非ヒト霊長類に投与され、また、例えば、霊長動物におけるＴＬＲ３発現細胞の数または活性、サイトカインの存在および／もしくはレベル、または症状の進行に対する投与の効果がアッセイされる。これらのＴＬＲ３に関連するパラメータのいずれかにおいて検出可能な変化を及ぼす任意の抗体または抗体誘導体もしくは断片は、本明細書中に記載の方法における使用のための候補である。
本明細書中に記載のアッセイのいずれかにおいて、細胞内でのＴＬＲ３刺激性活性の任意の検出可能な尺度における、５％、１０％、２０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、最も好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれより大きい増加または減少は、試験抗体が本方法における使用に適することを示す。
阻害性抗ＴＬＲ３抗体を評価する場合、抗体を有利に選択し、炎症または自己免疫に関連した任意のパラメータを変更しうる。例えば、抗体は、細胞内での活性化、特に炎症性サイトカインの産生を低下させるように選択しうる。細胞は、例えば炎症または自己免疫疾患を患う個体から得られる細胞であってもよい。
抗体ＣＤＲ配列
本発明の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、式（Ｉ）〜（ＸＸ）から選択される各式に従うＣＤＲ１、２および／または３配列を有する重鎖および／または軽鎖を含みうる。本明細書中の任意の実施形態では、特定のＨＣＤＲ１〜３またはＬＣＤＲ−１〜３は、式（Ｉ）〜（ＸＸ）の配列を有するものとして特定されうる。好ましい一実施形態では、本抗体は、３つのＬＣＤＲを含む軽鎖および３つのＨＣＤＲを含む重鎖を含む。場合により、軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。
一実施形態では、ＬＣＤＲ１は、式（Ｉ）：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｅ−Ｎ−Ｉ−Ｙ−Ｓ−Ｘａａ１−Ｌ−Ａ（Ｉ）（配列番号６１）、
（式中、Ｘａａ１は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ１は、Ｓｅｒ、ＴｙｒもしくはＡｓｎであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ２は、式（ＩＩ）：
Ｘａａ２−Ａ−Ｋ−Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｅ（ＩＩ）（配列番号６２）
（式中、Ｘａａ２は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ２は、ＡｓｎもしくはＴｙｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ３は、式（ＩＩＩ）：
Ｑ−Ｈ−Ｈ−Ｙ−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｘａａ３−Ｔ（ＩＩＩ）（配列番号６３）
（式中、Ｘａａ３は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ３は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ１は、式（ＩＶ）：
Ｘａａ４−Ａ−Ｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２（ＩＶ）（配列番号６４）
（式中、Ｘａａ４〜Ｘａａ１２は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ４は、Ａｒｇ、ＳｅｒもしくはＬｙｓであってもよく、および／または、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、ＳｅｒもしくはＧｌｎであってもよく、および／または、Ｘａａ６は、ＡｓｎもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ７は、ＩｌｅもしくはＶａｌであってもよく、および／または、Ｘａａ８は、欠失、ＴｙｒもしくはＡｒｇであってもよく、および／または、Ｘａａ９は、ＳｅｒもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１０は、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＶａｌであってもよく、および／または、Ｘａａ１２は、ＡｌａもしくはＰｈｅであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ１は、式（Ｖ）：
Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｌ−Ａ−Ｘａａ１７（Ｖ）（配列番号６５）
（式中、Ｘａａ１３〜Ｘａａ１７は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ１３は、Ｌｅｕ、ＡｓｎもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１４は、ＡｌａもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１５は、ＬｙｓもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１６は、ＡｓｎもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１７は、ＧｌｕもしくはＳｅｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ２は、式（ＶＩ）：
Ｘａａ１８−Ａ−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３（ＶＩ）（配列番号６６）
（式中、Ｘａａ１９〜Ｘａａ２３は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ１８は、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＬｅｕであってもよく、および／または、Ｘａａ１９は、ＳｅｒもしくはＬｙｓであってもよく、および／または、Ｘａａ２０は、ＡｓｎもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ２１は、ＬｅｕもしくはＡｒｇであってもよく、および／または、Ｘａａ２２は、ＡｌａもしくはＨｉｓであってもよく、および／または、Ｘａａ２３は、ＴｈｒもしくはＧｌｕであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ２は、式（ＶＩＩ）：
Ｌ−Ｘａａ２４−Ｓ−Ｎ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７（ＶＩＩ）（配列番号６７）
（式中、Ｘａａ２４〜Ｘａａ２７は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ２４は、ＴｈｒもしくはＡｌａであってもよく、および／または、Ｘａａ２５は、ＬｅｕもしくはＡｒｇであってもよく、および／または、Ｘａａ２６は、ＡｌａもしくはＨｉｓであってもよく、および／または、Ｘａａ２７は、ＳｅｒもしくはＴｈｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ３は、式（ＶＩＩＩ）：
Ｑ−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｇ−Ｘａａ３１−Ｐ−Ｘａａ３２−Ｔ（ＶＩＩＩ）（配列番号６８）
（式中、Ｘａａ２８〜Ｘａａ３２は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ２８は、ＨｉｓもしくはＧｌｎであってもよく、および／または、Ｘａａ２９は、ＨｉｓもしくはＴｒｐであってもよく、および／または、Ｘａａ３０は、ＴｙｒもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ３１は、ＴｈｒもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ３２は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＰｒｏであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ３は、式（ＩＸ）：
Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｈ−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｐ−Ｘａａ３８−Ｔ（ＩＸ）（配列番号６９）
（式中、Ｘａａ３３〜Ｘａａ３８は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ３３は、ＧｌｎもしくはＬｅｕであってもよく、および／または、Ｘａａ３４は、ＨｉｓもしくはＧｌｎであってもよく、および／または、Ｘａａ３５は、ＴｒｐもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ３６は、ＡｓｎもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ３７は、ＴｙｒもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ３８は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＰｒｏであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＬＣＤＲ３は、式（Ｘ）：
Ｘａａ３９−Ｑ−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｐ−Ｘａａ４４−Ｔ（Ｘ）（配列番号７０）
（式中、Ｘａａ４０〜Ｘａａ４４は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ３９は、ＧｌｎもしくはＬｅｕであってもよく、および／または、Ｘａａ４０は、ＴｒｐもしくはＨｉｓであってもよく、および／または、Ｘａａ４１は、ＴｈｒもしくはＴｒｐであってもよく、および／または、Ｘａａ４２は、ＧｌｙもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ４３は、ＡｓｎもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ４４は、ＰｒｏもしくはＴｙｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＩ）：
Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｇ−Ｙ−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６−Ｈ（ＸＩ）（配列番号７１）
（式中、Ｘａａ４５〜Ｘａａ４６は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ４５は、ＰｈｅもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ４６は、ＭｅｔもしくはＩｌｅであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＩＩ）：
Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｘａａ４７−Ｙ−Ｘａａ４８−Ｍ−Ｈ（ＸＩＩ）（配列番号７２）
（式中、Ｘａａ４７〜Ｘａａ４８は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ４７は、ＧｌｙもしくはＡｌａであってもよく、および／または、Ｘａａ４８は、ＰｈｅもしくはＴｙｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＩＩＩ）：
Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｘａａ４９−Ｙ−Ｙ−Ｘａａ５０−Ｈ（ＸＩＩＩ）（配列番号７３）
（式中、Ｘａａ４９〜Ｘａａ５０は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ４９は、ＧｌｙもしくはＡｌａであってもよく、および／または、Ｘａａ５０は、ＩｌｅもしくはＭｅｔであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＩＶ）：
Ｇ−Ｙ−Ｘａａ５１−Ｆ−Ｔ−Ｘａａ５２−Ｙ−Ｘａａ５３−Ｘａａ５４−Ｘａａ５５（ＸＩＶ）（配列番号７４）
（式中、Ｘａａ５１〜Ｘａａ５５は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ５１は、ＶａｌもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ５２は、Ｔｈｒ、ＧｌｙもしくはＡｌａであってもよく、および／または、Ｘａａ５３は、Ｓｅｒ、ＴｙｒもしくはＰｈｅであってもよく、および／または、Ｘａａ５４は、ＩｌｅもしくはＭｅｔであってもよく、および／または、Ｘａａ５５は、ＴｙｒもしくはＨｉｓであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＶ）：
Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｘａａ５６−Ｔ−Ｘａａ５７−Ｇ−Ｙ−Ｘａａ５８−Ｘａａ５９−Ｈ（ＸＶ）（配列番号７５）
（式中、Ｘａａ５６〜Ｘａａ５９は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ５６は、ＩｌｅもしくはＰｈｅであってもよく、および／または、Ｘａａ５７は、欠失もしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ５８は、Ｓｅｒ、ＴｙｒもしくはＰｈｅであってもよく、および／または、Ｘａａ５９は、Ｔｒｐ、ＩｌｅもしくはＭｅｔであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、式（ＸＶＩ）：
Ｇ−Ｙ−Ｘａａ６０−Ｘａａ６１−Ｔ−Ｘａａ６２−Ｘａａ６３−Ｙ−Ｓ−Ｘａａ６４−Ｘａａ６５（ＸＶＩ）（配列番号７６）
（式中、Ｘａａ６０〜Ｘａａ６５は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ６０は、ＶａｌもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ６１は、ＰｈｅもしくはＩｌｅであってもよく、および／または、Ｘａａ６２は、ＴｈｒもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ６３は、欠失もしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ６４は、ＩｌｅもしくはＴｒｐであってもよく、および／または、Ｘａａ６５は、ＴｙｒもしくはＨｉｓであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、式（ＸＶＩＩ）：
Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−Ｘａａ６６−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｓ−Ｘａａ６７−Ｎ−Ｘａａ６８−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｄ（ＸＶＩＩ）（配列番号７７）
（式中、Ｘａａ６６〜Ｘａａ６８は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ６６は、ＡｓｎもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ６７は、欠失もしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ６８は、ＡｒｇもしくはＧｌｎであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、式（ＸＶＩＩＩ）：
Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−Ｘａａ６６−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｓ−Ｙ−Ｎ−Ｑ−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｄ（ＸＶＩＩＩ）（配列番号７８）
（式中、Ｘａａ６６は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ６６は、ＡｓｎもしくはＴｙｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、式（ＸＩＸ）：
Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｓ−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ６８−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｄ（ＸＩＸ）（配列番号７９）
（式中、Ｘａａ６８は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ６８は、ＡｒｇもしくはＧｌｎであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、式（ＸＸ）：
Ｙ−Ｉ−Ｘａａ６９−Ｘａａ７０−Ｙ−Ｘａａ７１−Ｇ−Ｘａａ７２−Ｔ−Ｘａａ７３−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ７４−Ｘａａ７５−Ｘａａ７６−Ｘａａ７７−Ｘａａ７８（ＸＸ）（配列番号８０）
（式中、Ｘａａ６９〜Ｘａａ７８は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ６９は、ＡｓｐもしくはＨｉｓであってもよく、および／または、Ｘａａ７０は、欠失もしくはＰｒｏであってもよく、および／または、Ｘａａ７１は、ＳｅｒもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ７２は、ＩｌｅもしくはＡｓｐであってもよく、および／または、Ｘａａ７３は、ＳｅｒもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ７４は、ＧｌｎもしくはＰｒｏであってもよく、および／または、Ｘａａ７５は、ＬｙｓもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ７６は、ＰｈｅもしくはＬｅｕであってもよく、および／または、Ｘａａ７７は、ＬｙｓもしくはＡｒｇであってもよく、および／または、Ｘａａ７８は、ＧｌｙもしくはＳｅｒであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、式（ＸＸＩ）：
Ｘａａ７９−Ｉ−Ｘａａ８０−Ｘａａ８１−Ｙ−Ｘａａ８２−Ｇ−Ｘａａ８３−Ｔ−Ｘａａ８４−Ｘａａ８５−Ｎ−Ｘａａ８６−Ｘａａ８７−Ｘａａ８８−Ｘａａ８９−Ｘａａ９０（ＸＸＩ）（配列番号８１）
（式中、Ｘａａ７９〜Ｘａａ９０は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ７９は、ＡｒｇもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ８０は、Ａｓｎ、ＡｓｐもしくはＨｉｓであってもよく、および／または、Ｘａａ８１は、欠失もしくはＰｒｏであってもよく、および／または、Ｘａａ８２は、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ８３は、Ｉｌｅ、ＡｓｐもしくはＡｌａであってもよく、および／または、Ｘａａ８４は、ＳｅｒもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ８５は、欠失もしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ８６は、Ｐｒｏ、ＡｒｇもしくはＧｌｎであってもよく、および／または、Ｘａａ８７は、Ｓｅｒ、ＬｙｓもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ８８は、ＰｈｅもしくはＬｅｕであってもよく、および／または、Ｘａａ８９は、ＬｙｓもしくはＡｒｇであってもよく、および／または、Ｘａａ９０は、ＡｓｐもしくはＧｌｙであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ３は、式（ＸＸＩＩ）：
Ｘａａ９１−Ｘａａ９２−Ｇ−Ｘａａ９３−Ｘａａ９４−Ｙ−Ｘａａ９５−Ｆ−Ｄ−Ｙ（ＸＸＩＩ）（配列番号８２）
（式中、Ｘａａ９１〜Ｘａａ９５は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ９１は、ＡｓｐもしくはＳｅｒであってもよく、および／または、Ｘａａ９２は、ＡｓｐもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ９３は、ＧｌｙもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ９４は、ＡｓｎもしくはＴｈｒであってもよく、および／または、Ｘａａ９５は、Ｐｒｏもしくは欠失であってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ３は、式（ＸＸＩＩＩ）：
Ｘａａ９６−Ｘａａ９７−Ｘａａ９８−Ｘａａ９９−Ｘａａ１００−Ｙ−Ｘａａ１０１−Ｘａａ１０２−Ｄ−Ｙ（ＸＸＩＩＩ）（配列番号８３）
（式中、Ｘａａ９６〜Ｘａａ１０２は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ９６は、ＳもしくはＤであってもよく、および／または、Ｘａａ９７は、Ｇ、ＴＤであってもよく、および／または、Ｘａａ９８は、Ｇ、Ｋもしくは欠失であってもよく、および／または、Ｘａａ９９は、Ｇ、Ｌ、Ｎもしくは欠失であってもよく、および／または、Ｘａａ１００は、Ｙ、Ｔ、Ｇ、Ｎであってもよく、および／または、Ｘａａ１０１は、Ｐ、Ｇもしくは欠失であってもよく、および／または、Ｘａａ１０２は、Ｍ、ＦもしくはＬであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ３は、式（ＸＸＩＶ）：
Ｘａａ１０３−Ｘａａ１０４−Ｘａａ１０５−Ｘａａ１０６−Ｘａａ１０７−Ｘａａ１０８−Ｘａａ１０９−Ｆ−Ｄ−Ｙ（ＸＸＩＶ）（配列番号８４）
（式中、Ｘａａ１０３〜Ｘａａ１０９は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ１０３は、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕであってもよく、および／または、Ｘａａ１０４は、ＡｓｐもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ１０５は、ＧｌｙもしくはＡｓｎであってもよく、および／または、Ｘａａ１０６は、Ａｓｎ、ＴｙｒもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ１０７は、Ａｓｎ、ＴｈｒもしくはＴｙｒであってもよく、および／または、Ｘａａ１０８は、ＴｙｒもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ１０９は、Ｔｙｒ、Ｐｒｏもしくは欠失であってもよい。）
に属する。
一実施形態では、ＨＣＤＲ３は、式（ＸＸＶ）：
Ｘａａ１１０−Ｇ−Ｘａａ１１１−Ｘａａ１１２−Ｙ−Ｘａａ１１３−Ｘａａ１１４−Ｘａａ１１５−Ｄ−Ｙ（ＸＸＶ）（配列番号８５）
（式中、Ｘａａ１１０〜Ｘａａ１１５は、保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であってもよく、好ましくは、Ｘａａ１１０は、ＧｌｕもしくはＡｓｐであってもよく、および／または、Ｘａａ１１１は、Ａｓｎもしくは欠失であってもよく、および／または、Ｘａａ１１２は、Ｔｙｒもしくは欠失であってもよく、および／または、Ｘａａ１１３は、ＴｙｒもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ１１４は、ＴｙｒもしくはＧｌｙであってもよく、および／または、Ｘａａ１１５は、ＭｅｔもしくはＰｈｅであってもよい。）
に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、
ａ 配列番号６１、６４および６５から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列；および／または
ｂ 配列番号６２、６６および６７から選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列；および／または
ｃ 配列番号６３、６８、６９および７０から選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む軽鎖を含みうる。
一実施形態では、本発明の抗体は、
ａ 配列番号７１〜７６から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列；および／または
ｂ 配列番号７７〜８１から選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列；および／または
ｃ 配列番号８２〜８５から選択される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む重鎖を含みうる。
抗体２９Ｈ３
細胞産生抗体２９Ｈ３は、登録番号Ｉ−４１８７下でＣＮＣＭに寄託されており、抗体２９Ｈ３はまた、配列決定されている。重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１として挙げられる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列が、それぞれ配列番号５３および５４として挙げられる。一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体２９Ｈ３と本質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し、場合により、本抗体は、抗体２９Ｈ３の抗原結合領域を含む。本明細書中の実施形態のいずれかにおいては、抗体２９Ｈ３は、それをコードするそのアミノ酸配列および／または核酸配列によって特徴づけられうる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、２９Ｈ３のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、２９Ｈ３の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体は、２９Ｈ３の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、２９Ｈ３の可変の軽鎖可変領域または２９Ｈ３の軽鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体が提供される。場合により、任意の１つ以上の前記軽鎖または重鎖ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含みうる。場合により、抗体２９Ｈ３の抗原結合領域の一部もしくは全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、２９Ｈ３である。
別の態様では、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドを提供し、ここで抗体は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および／または配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）を含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖（それぞれ少なくとも３つのＣＤＲを有する）を含む抗体を提供し、ここで少なくとも３つのＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つは、重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号１２〜１４および１５〜１７の配列を有し、またここで抗体は酸性条件下でＴＬＲ３に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、
ａ 配列番号１０の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｂ 配列番号１１の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｃ 配列番号１０の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号１１の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｄ 配列番号１２、１３および１４で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｅ 配列番号１５、１６および１７でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｆ 配列番号１２、１３および１４で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換可能である）；および配列番号１５、１６および１７で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｇ 配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｈ 配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）
を含むヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、特定のＣＤＲまたはＣＤＲセット（対応する配列番号で列挙される）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴づけられうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合において、上記の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体３１Ｃ３
細胞産生抗体３１Ｃ３は、登録番号Ｉ−４１８６下でＣＮＣＭに寄託されており、抗体３１Ｃ３はまた、配列決定されている。重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３として挙げられる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列が、それぞれ配列番号５１および５２で挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体３１Ｃ３と本質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し、場合により、本抗体は、抗体３１Ｃ３の抗原結合領域を含む。本明細書中の実施形態のいずれかにおいては、抗体３１Ｃ３は、それをコードするそのアミノ酸配列および／または核酸配列によって特徴づけられうる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、３１Ｃ３のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、３１Ｃ３の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体は、３１Ｃ３の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、３１Ｃ３の可変の軽鎖可変領域または３１Ｃ３の軽鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体が提供される。場合により、任意の１つ以上の前記軽鎖または重鎖ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含みうる。場合により、抗体３１Ｃ３の抗原結合領域の一部もしくは全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、３１Ｃ３である。
別の態様では、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドを提供し、ここで抗体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）を含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖（それぞれ少なくとも３つのＣＤＲを有する）を含む抗体を提供し、ここで少なくとも３つのＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つは、重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号４〜６および７〜９の配列を有し、またここで抗体は酸性条件下でＴＬＲ３に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、
ａ 配列番号２の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｂ 配列番号３の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｃ 配列番号２の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号３の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｄ 配列番号４および５で示される重鎖ＣＤＲ１および２（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）、場合により、ここで重鎖は、配列番号４、５および６で示されるＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｅ 配列番号７、８および９で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｆ 配列番号４、５および６で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号７、８および９で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｇ 配列番号２のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｈ 配列番号３のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）
を含むヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、特定のＣＤＲまたはＣＤＲセット（対応する配列番号で列挙される）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴づけられうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合において、上記の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体２３Ｃ８
抗体２３Ｃ８は、配列決定されている。重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２６として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２７として挙げられる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列が、それぞれ配列番号５７および５８で挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体２３Ｃ８と本質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し、場合により、本抗体は、抗体２３Ｃ８の抗原結合領域を含む。本明細書中の実施形態のいずれかにおいては、抗体２３Ｃ８は、それをコードするそのアミノ酸配列および／または核酸配列によって特徴づけられうる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、２３Ｃ８のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、２３Ｃ８の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体は、２３Ｃ８の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、２３Ｃ８の可変の軽鎖可変領域または２３Ｃ８の軽鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体が提供される。場合により、任意の１つ以上の前記軽鎖または重鎖ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含みうる。場合により、抗体２３Ｃ８の抗原結合領域の一部もしくは全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、２３Ｃ８である。
別の態様では、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドを提供し、ここで抗体は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）を含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖（それぞれ少なくとも３つのＣＤＲを有する）を含む抗体を提供し、ここで少なくとも３つのＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つは、重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号２８〜３０および３１〜３３の配列を有し、またここで抗体は酸性条件下でＴＬＲ３に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、
ａ 配列番号２６の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｂ 配列番号２７の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｃ 配列番号２６の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号２７の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｄ 配列番号２８および２９で示される重鎖ＣＤＲ１および２（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；場合により、ここで重鎖は、配列番号２８、２９および３０で示されるＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｅ 配列番号３１、３２および３３で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｆ 配列番号２８、２９および３０で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号３１、３２および３３で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｇ 配列番号２６のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｈ 配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）
を含むヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、特定のＣＤＲまたはＣＤＲセット（対応する配列番号で列挙される）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴づけられうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合において、上記の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体２８Ｆ１１
抗体２８Ｆ１１は、配列決定されている。重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１８として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１９として挙げられる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、それぞれ配列番号５５および５６で挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体２８Ｆ１１と本質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し、場合により、本抗体は、抗体２８Ｆ１１の抗原結合領域を含む。本明細書中の実施形態のいずれかにおいては、抗体２８Ｆ１１は、それをコードするそのアミノ酸配列および／または核酸配列によって特徴づけられうる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、２８Ｆ１１のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、２８Ｆ１１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体は、２８Ｆ１１の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、２８Ｆ１１の可変の軽鎖可変領域または２８Ｆ１１の軽鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体が提供される。場合により、任意の１つ以上の前記軽鎖または重鎖ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含みうる。場合により、抗体２８Ｆ１１の抗原結合領域の一部もしくは全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、２８Ｆ１１である。
別の態様では、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドを提供し、ここで抗体は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）を含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖（それぞれ少なくとも３つのＣＤＲを有する）を含む抗体を提供し、ここで少なくとも３つのＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つは、重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号２０〜２２および２３〜２５の配列を有し、またここで抗体は酸性条件下でＴＬＲ３に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、
ａ 配列番号１８の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｂ 配列番号１９の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｃ 配列番号１８の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号１９の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｄ 配列番号２０および２１で示される重鎖ＣＤＲ１および２（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；場合により、ここで重鎖は、配列番号２０、２１および２２で示されるＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｅ 配列番号２３、２４および２５で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｆ 配列番号２０、２１および２２で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号２３、２４および２５で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｇ 配列番号１８のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｈ 配列番号１９のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）
を含むヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、特定のＣＤＲまたはＣＤＲセット（対応する配列番号で列挙される）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴づけられうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合において、上記の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体３４Ａ３
抗体３４Ａ３は、配列決定されている。重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３５として挙げられる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、それぞれ配列番号５９および６０で挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体３４Ａ３と本質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し、場合により、本抗体は、抗体３４Ａ３の抗原結合領域を含む。本明細書中の実施形態のいずれかにおいては、抗体３４Ａ３は、それをコードするそのアミノ酸配列および／または核酸配列によって特徴づけられうる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、３４Ａ３のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、３４Ａ３の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体は、３４Ａ３の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、３４Ａ３の可変の軽鎖可変領域または３４Ａ３の軽鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体が提供される。場合により、任意の１つ以上の前記軽鎖または重鎖ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含みうる。場合により、抗体３４Ａ３の抗原結合領域の一部もしくは全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、場合によってヒト定常領域、場合によってヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプに融合される場合の抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、３４Ａ３である。
別の態様では、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドを提供し、ここで抗体は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）を含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖（それぞれ少なくとも３つのＣＤＲを有する）を含む抗体を提供し、ここで少なくとも３つのＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つは、重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号３６〜３８および２９〜４１の配列を有し、またここで抗体は酸性条件下でＴＬＲ３に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、
ａ 配列番号３４の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｂ 配列番号３５の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｃ 配列番号３４の重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号３５の軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｄ 配列番号３６、３７および３８で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｅ 配列番号３９、４０および４１で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ以上は異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｆ 配列番号３６、３７および３８で示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；および配列番号３９、４０および４１で示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｇ 配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）；または
ｈ 配列番号３５のアミノ酸配列を有する可変領域に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ここでこれらのアミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい）
を含むヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、特定のＣＤＲまたはＣＤＲセット（対応する配列番号で列挙される）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴づけられうる。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合において、上記の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
本発明の抗体、例えば、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３のいずれかにおいては、特定の可変領域およびＣＤＲ配列は、保存的配列修飾を含みうる。保存的配列修飾は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変しないアミノ酸修飾を示す。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準的技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発により、本発明の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、あるアミノ酸残基が、類似した物理化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合である。特定の可変領域およびＣＤＲ配列は、１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれより多いアミノ酸挿入、欠失または置換を含みうる。置換がなされる場合、好ましい置換は、保存的修飾となる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と置換可能であり、また改変抗体は、保持された機能（すなわち本明細書中に示される特性）について、本明細書中に記載のアッセイを用いて試験可能である。
用語「同一性」または「同一である」は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間でのマッチの数によって判定された、ポリペプチド間の配列の関連性の程度を示す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を伴う２つ以上の配列の小さい方の間での同一のマッチのパーセントの尺度である。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算されうる。かかる方法は、限定はされないが、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １」、Ｇｒｉｆｆｉｎ Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年；およびＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８、１０７３頁（１９８８年）において記載のものを含む。
同一性を判定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大マッチを与えるように設計される。同一性を判定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記述されている。２つの配列間の同一性を判定するための好ましいコンピュータプログラムの方法は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２、３８７頁（１９８４年）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−４１０頁（１９９０年））。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（「ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）から公的に利用可能である。また、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し、同一性を判定してもよい。
ＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアの定義）、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義システムによる、本発明に従う抗体のＣＤＲの配列は、下の表Ａ中にまとめられている。本明細書中に記載のアミノ酸配列は、Ａｂｍ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの番号付けシステムに従って番号付けされる。任意の好適な番号付けシステムが、任意の他の表示の不在下で、指定されたＣＤＲ領域に対して使用可能である一方、本明細書中で使用される番号付けはＡｂｍである。かかる番号付けは、次の表示、すなわち、ＣＤＲ−Ｌ１：開始：約２４の残基、前の残基：通常はＣｙｓ、後の残基：通常はＴｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎだけでなく、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）、長さ：１０〜１７の残基；ＣＤＲ−Ｌ２：開始：Ｌ１の末端の後に通常は１６の残基、前の残基：一般にＩｌｅ−Ｔｙｒ（それだけでなく、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅ）、長さ：通常は７つの残基；ＣＤＲ−Ｌ３、開始：Ｌ２の末端の後に通常は３３の残基、前の残基：通常はＣｙｓ、後の残基：通常はＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ：７〜１１の残基；ＣＤＲ−Ｈ１、開始：約２６の残基（Ｃｙｓの後に通常は４つ）（Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ定義、Ｋａｂａｔ定義では５つ後の残基から開始する）、前の残基：通常はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ、後の残基：通常はＴｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ−、Ｖａｌだけでなく、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａ）、長さ：１０〜１２の残基（ＡｂＭ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義では最後４つの残基が除外される）；ＣＤＲ−Ｈ２、開始：ＣＤＲ−Ｈ１のＫａｂａｔ／ＡｂＭ定義の末端の後に通常は１５の残基、前の残基：典型的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（しかし、多数の変化、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ後の残基）、長さ：Ｋａｂａｔ定義では１６〜１９の残基；ＡｂＭ（およびＣｈｏｔｈｉａ）定義では、７つ前の残基で終了する；ＣＤＲ−Ｈ３、開始：ＣＤＲ−Ｈ２の末端の後に通常は３３の残基（Ｃｙｓの後に通常は２つ）、前の残基：通常はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）、後の残基：通常はＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ：３〜２５残基、を用いて確立されている。
本発明に従う抗体の可変鎖の配列は下の表Ｂ中に列挙され、シグナルペプチド配列はイタリック体で表され、またＣＤＲは太字で提供される。用語ｘ／ｘは、２つの表示されるアミノ酸のいずれかが特定のアミノ酸残基に存在しうることを示し、例えば用語Ｆ／Ｓは、所与の位置でのアミノ酸がフェニルアラニンまたはセリンのいずれかでありうることを意味する。本明細書中の任意の実施形態では、ＶＬまたは、ＶＨ配列は、シグナルペプチドまたはその任意の部分を有するかまたは有しないことに対し、特定化または番号付けされうる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトまたはマウスＩｇＧ１アイソタイプである。別の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプである。一実施形態では、本発明の抗体は、その結合および／または機能特性を保持する抗体断片である。
Figure 2012532851
Figure 2012532851
下の表Ｃにまとめられるように、本発明に従う抗ＴＬＲ３抗体の軽鎖および重鎖の配列決定により、かかる抗体の産生に関与する遺伝子再配列の同定が得られた（示される遺伝子配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｓｈｏｗＧｅｒｍｌｉｎｅ．ｃｇｉで検索可能である）。図１８Ａおよび１８Ｂは、軽鎖および重鎖の（ＰｈｙｌｉｐのＤｒａｗｔｒｅｅによって生成される）系統樹を示し、それは抗体２８Ｆ１１、３１Ｃ３および２３Ｃ８の間で相同性の程度が高いことを示す。
Figure 2012532851
下の表Ｄは、アミノ酸での、各抗体における異なるＣＤＲ間での配列同一性の百分率を提供する。
Figure 2012532851
Figure 2012532851
Figure 2012532851
表Ｅは、ＬＡＬＩＧＮソフトウェアを使用し、各抗体についての異なるＶＬおよび、ＶＨ（イタリック）ヌクレオチド配列間で計算されている同一性の百分率を提供する。
Figure 2012532851
表Ｆは、ＬＡＬＩＧＮソフトウェアを使用し、異なるＶＬおよび、ＶＨ（イタリック）アミノ酸配列間で計算されている同一性の百分率を提供する。
Figure 2012532851
本モノクローナル抗体の断片および誘導体
（他に指定されないかまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、本願中で使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」によって包含される）本発明の抗体の断片および誘導体、好ましくは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３様抗体は、当該技術分野で既知の技術によって産生されうる。「断片」は、無傷抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；限定はされないが、（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）１つの軽鎖可変ドメインのみを有する一本鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを有するその断片（関連する重鎖部分を有しない）、および（３）１つの重鎖可変領域のみを有する一本鎖ポリペプチド、または重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを有するその断片（関連する軽鎖部分を有しない）を含む、隣接アミノ酸残基の１つの連続配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書中で「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本抗体の断片は、標準的方法を用いて得ることができる。例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術に従い、単離抗体のプロテアーゼ消化によって産生されうる。免疫反応性断片を既知の方法を用いて修飾することで、例えば、インビボでクリアランスを遅延速させ、断片がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾可能であるというより望ましい薬物動態学的特性を得ることが可能であることは理解されるであろう。ＰＥＧをＦａｂ’断片にカップリングし、部位特異的にコンジュゲートするための方法は、例えば、Ｌｅｏｎｇら、１６（３）：１０６−１１９頁（２００１年）およびＤｅｌｇａｄｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（２）：１７５−１８２頁（１９９６年）（それらの開示内容は参照により本明細書中に援用される）において記載されている。
あるいは、本発明の抗体、好ましくは、３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、本発明の断片をコードするように修飾されうる。次いで、修飾ＤＮＡは、発現ベクターに挿入され、適切な細胞を形質転換または形質移入するように使用され、次いで所望される断片を発現する。
特定の実施形態では、本発明の抗体、好ましくは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターへの挿入前に、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインにおけるコード配列をそれに相同な非ヒト配列の代わりに置換するか（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ、６８５１頁（１９８４年））、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドにおけるコード配列の全部もしくは一部を共有結合させることにより、修飾されうる。そのようにして、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は、元の抗体の結合特異性を有するように調製される。典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換される。
したがって、別の実施形態によると、本発明の抗体、好ましくは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３様抗体は、ヒト化される。本発明に従う抗体の「ヒト化」形態は、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、それはマウス免疫グロブリンに由来する最小配列を有する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される一方、元の抗体の所望される特異性、親和性、および能力を維持する、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されうる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または輸入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良し、最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、また典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことになり、ここでＣＤＲ領域の全部もしくは実質的に全部は、元の抗体のそれらに対応し、かつＦＲ領域の全部もしくは実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン共通配列のそれらに相当する。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３頁（１９８８年）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２，５９３頁（１９９２年）；、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４頁；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書（これらの全開示内容は、参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。本発明の抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。
ヒト化抗体の作製に使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の双方）の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法によると、本発明の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、マウスの場合に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１、２２９６頁（１９９３年）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．１９６、９０１頁）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に対して使用可能である（Ｃａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ８９、４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５１頁（１９９３年））。
抗体がＴＬＲ３受容体に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性の保持によってヒト化されることはさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法に従い、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより、ヒト化抗体が調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者には周知である。選択される候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原に対する結合能に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、所望される抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増大が得られるように、ＦＲ残基が、共通および輸入配列から選択され、組み合わされうる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに対し、直接かつ最も実質的に関与する。
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫用に使用されるマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置換されている、本発明に従うマウス宿主である。したがって、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅについては、米国特許第６，１６２，９６３号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
ヒト抗体はまた、様々な他の技術により、例えば免疫を目的として、ヒト抗体レパートリーを発現するように改変されている他のトランスジェニック動物を使用することにより（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３年）２５５）、またはファージディスプレイ法を用いた抗体レパートリーの選択により、産生されうる。かかる技術は、当業者に既知であり、本願中に開示されるモノクローナル抗体から開始して実施されうる。
本発明の抗体、好ましくは３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３様抗体はまた、重鎖／軽鎖の一部が元の抗体中の対応する配列に同一または相同である一方、鎖の残りが、別種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に同一または相同である場合の「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体の断片に、それらが所望される生物学的活性および結合特異性を示す限り、誘導体化されうる（Ｃａｂｉｌｌｙら、上記；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、６８５１頁（１９８４年））。
本抗体がＴＬＲ３に対する結合能を有し、また場合により、さらにＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する一方、それらはまた、ＴＬＲ３ポリペプチドを発現する細胞、例えばメラノーマなどの特定の腫瘍細胞または乳房、肺、食道、胃、喉頭、腎臓、もしくは頚部のそれら、または炎症に関与する、潜在的にウイルス感染された細胞の殺滅を標的とする場合に有用な毒素へのコンジュゲーション（conjugation）などの他の目的のために使用されうる。かかる実施形態では、典型的には、得られた試料（例えば腫瘍を対象とした生検）を最初に、細胞（例えば、腫瘍細胞、感染細胞、炎症に関与する細胞など）がＴＬＲ３を発現するか否かを、例えば本明細書中に記載の検出方法を用いて評価することになる。ＴＬＲ３が確かに腫瘍細胞の表面上で検出される場合、細胞毒性抗体が投与されうる。次いで、細胞毒性抗体が細胞によって内在化され、毒素が細胞内部で放出され、それによってその細胞は選択的に殺滅される。したがって、かかる抗体は、限定はされないが、胆道癌；脳癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；白血病；リンパ腫；肝癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；ならびに他の癌および肉腫を含む、癌および腫瘍の処置（ｔｒｅａｔｍｉｎｇ）方法で使用されることになる。癌は、原発性または転移性でありうる。
抗体の抗腫瘍効力を増強するための１つの有効なアプローチは、細胞毒性薬または毒素を標的細胞による内在化能があるｍＡｂに結合させることを含む。これらの作用剤は、それぞれ抗体−薬剤コンジュゲート（conjugate）（ＡＤＣ）および免疫毒素と称される。患者への投与時、ＡＤＣおよび免疫毒素は、その抗体部分を介して標的細胞に結合し、内在化されるようになり、薬剤または毒素がその効果を発揮することが可能になる。例えば、米国特許公開第２００５／０１８０９７２Ａ１号明細書、米国特許公開第２００５／０１２３５３６Ａ１号明細書を参照のこと。また、例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ、１０：７０６３−７０７０頁、１９９９年１０月１５日、Ｌａｗら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ、１０：７８４２−７８５１頁、２００４年１２月１日、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、１０２（４）：１４５８−１４６５頁、２００３年８月１５日、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ、１１：８４３−８５２頁、２００５年１月１５日、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２１（７）：７７８−７８４頁、２００３年７月（これらのすべては、ここでそれら全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
細胞毒性抗体は、記載の技術を用いて調製されうる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１４巻、第３号、２００８年５月／６月、またはＲａｖｉら、「Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、９８−１０７頁、２００８年１月、第４１巻、第１号）。
好ましい毒性または細胞毒性ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を減速させ、停止させ、または食い止めるか、それらの活性を任意の検出可能な方法で低下させるか、あるいはそれらを直接的もしくは間接的に殺滅することが可能な任意の化合物を含む。好ましくは、毒性または細胞毒性化合物は、細胞を直接的に殺滅するか、ＡＤＣＣを引き起こすかまたはそれ以外により、作用する。毒性ペプチドは、本明細書で使用される場合、任意のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの誘導体、例えば非天然アミノ酸または修飾された結合を伴うペプチドもしくはポリペプチド誘導体を含んでもよい。毒性小分子は、好ましくは１０ｋＤ未満、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄ、もしくはそれより小さいサイズを有する任意の毒性化合物または因子を含んでもよい。
検出可能な部分へのコンジュゲーションは、特に本発明の抗体が診断目的で使用される場合、有用である。かかる目的は、限定はされないが、生物学的試料、例えば、血液試料または組織生検をＴＬＲ３発現細胞の存在についてアッセイすること、および個体におけるＴＬＲ３発現細胞の存在、レベルまたは活性を検出することを含む。かかるアッセイおよび検出方法は、例えば、患者の細胞内でＴＬＲ３の発現を検出することと、患者の細胞がＴＬＲ３を発現するように判定される場合、それに続き、本発明のＴＬＲ３調節抗体を投与することを含む、本発明の診断／治療方法において使用することができる。
特定の実施形態では、本抗体は、ＴＬＲ３発現細胞を生物学的試料から精製するように使用される。生物学的試料は、例えば診断または生体外治療目的で患者から、あるいは研究目的でかかる細胞源を得るための個体または非ヒト霊長類から、得ることができる。
かかる一実施形態では、本発明の標識抗体は、ＦＡＣＳソーティングにおいて使用し、ＴＬＲ３発現細胞を生物学的試料から精製または単離することが可能である。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の抗体の固体支持体へのコンジュゲーションは、生物学的試料、例えば血液試料に由来する、細胞表面上にＴＬＲ３受容体を担持する細胞、または個体からの組織生検に由来する細胞、の親和性精製におけるツールとして有用でありうる。この精製方法は、得られた精製細胞集団の場合の、本発明の別の代替的な実施形態である。
ＴＬＲ３発現細胞を単離または精製するために用いられる方法とは無関係に、そのように実施する能力は、極めて多くの目的のため、例えば、ＴＬＲ３関連疾患を、例えば本明細書中に記載の抗ＴＬＲ３抗体の投与前に、ＴＬＲ３発現細胞の数または活性を評価することによって診断するため、有用である。さらに、精製ＴＬＲ３発現細胞は、例えば、細胞とその様々な特性および挙動をよりよく特徴づけるとともに、その挙動、活性、生存、または増殖を調節するために使用可能な化合物または方法を同定するため、研究との関連で有用である。
治療、診断および予後における組成物および使用
本明細書中で示されるように、本発明の抗体は、ポリペプチドを含むＴＬＲ３発現細胞の活性、ひいては、ポリペプチドを発現する細胞、例えばＴＬＲ３発現免疫細胞、ＤＣ、脊髄ＤＣなどの活性または挙動を調節する場合、特に有効である。特定の実施形態では、本抗体は、例えば、ＴＬＲ３シグナル伝達を、場合によって抗原またはリガンド（ｄｓＲＮＡなど）と受容体との相互作用を遮断することなく遮断し、それによって細胞の増殖または活性化を阻害することにより、ＴＬＲ３を阻害する。組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。かかる組成物は、本発明の「抗体組成物」とも称される。一実施形態では、本発明の抗体組成物は、上記の抗体の実施形態中で開示される抗体を含む。抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１もしくは３４Ａ３は、本発明の抗体組成物中に存在しうる抗体の範囲内に含まれる。
本発明は、ＴＬＲ３発現細胞活性をそれを必要とする患者において調節する方法であって、前記患者に本発明に従う組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。一実施形態では、ＴＬＲ３発現細胞活性は阻害され、ここで患者は疾患または障害を有し、ここでかかる阻害は、治療効果を促進し、増強し、および／または誘発しうる（あるいは、例えば治験によって測定されうる、少なくとも実質的割合の疾患または障害を有する患者におけるかかる効果および患者と実質的に類似した特性を促進し、増強し、および／または誘発する）。
他の実施形態では、本方法は、患者が患うかまたは影響を受けやすい疾患の処置または予防において有用な、適切な追加的な治療剤を前記患者に投与する追加的なステップを含んでもよく、かかる作用剤の例として、免疫調節剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド、免疫系抑制剤、コルチコステロイド、抗生物質、抗ウイルスまたは補助化合物が挙げられる。かかる追加的な作用剤は、前記抗体と併せた単一剤形として、または別々の剤形として、患者に投与されうる。抗体の用量（または抗体および追加的な治療剤の総用量）は、患者における治療的応答を検出可能に誘発し、促進し、および／または増強するのに十分なものである。抗体、断片、または誘導体および追加的な治療剤は、別々に投与される場合、望ましくは、患者に対する検出可能な組み合わされた治療効果をもたらす（例えば、タイミング、投与の回数などに関する）条件下で投与される。
これらの組成物中で使用可能な薬学的に許容できる担体は、限定はされないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、リン酸塩などの緩衝液物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含む。本発明の抗体は、患者におけるＴＬＲ３発現細胞の活性を調節する、例えば阻害する方法において使用してもよい。この方法は、前記組成物を前記患者と接触させるステップを含む。かかる方法は、予防および治療目的の双方において有用となる。
患者への投与での使用においては、本組成物は、患者への投与を意図して調合されることになる。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、鼻内に、口腔的に、経膣的に、または移植された容器を介して投与されうる。本明細書で使用されるものとして、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
本発明の組成物の無菌の注射可能な形態は、水性または油性懸濁液でありうる。これらの懸濁液は、好適な分散剤または浸潤剤および懸濁化剤を使用する当該技術分野で既知の技術に従って調合されうる。無菌の注射可能な調製物はまた、非経口的に許容できる非毒性の希釈剤または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば１，３−ブタンジオールでの溶液として）であってもよい。使用可能な許容できる媒体および溶媒の中に、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、無菌固定油は、従来から溶媒または懸濁培地として使用される。この目的のため、合成モノもしくはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を使用してもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、薬学的に許容できる天然油、例えばオリーブ油またはヒマシ油（特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで）の場合と同様、注射物質の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容できる剤形の調合において一般に使用される、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を含有しうる。他の一般に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティエンハンサー（薬学的に許容できる固体、液体、または他の剤形の作製において一般に使用される）も、製剤を目的として使用されうる。
本発明の組成物は、限定はされないが、カプセル、タブレット、水性懸濁液または溶液を含む、任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してもよい。経口使用におけるタブレットの場合、一般に使用される担体は、ラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む。典型的には、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもまた添加される。カプセル形態での経口投与においては、有用な希釈剤として、例えばラクトースが挙げられる。経口使用として水性懸濁液が必要な場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と結合される。必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤または着色剤もまた添加してもよい。
あるいは、本発明の組成物は、直腸投与において坐剤の形態で投与してもよい。これらは、同作用剤を、室温で固体であるが、直腸温度で液体であり、それ故、直腸内で溶解し、薬剤を放出することになる、好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製されうる。かかる材料は、ココアバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールを含む。
本発明の組成物はまた、処置の標的が、特に、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含む、局所適用によって容易に接近可能である領域または器官を含む場合、局所的に投与してもよい。好適な局所製剤は、これらの領域または器官の各々に対して容易に調製される。局所適用においては、組成物は、１つ以上の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏中で調合されうる。本発明の化合物の局所投与のための担体は、限定はされないが、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水を含む。あるいは、本組成物は、１つ以上の薬学的に許容できる担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローションまたはクリーム中で調合されうる。好適な担体は、限定はされないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含む。
下部腸管に対する局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）または好適な浣腸製剤中で行ってもよい。パッチもまた、使用してもよい。
本発明の組成物はまた、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与してもよい。かかる組成物は、医薬製剤に関する当該技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の好適な保護剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収プロモーター、フルオロカーボン、および／あるいは他の従来の可溶化剤または分散剤を使用する、生理食塩水中の溶液として調製されうる。
いくつかのモノクローナル抗体、例えばＲｉｔｕｘａｎ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）またはＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ）は、臨床症状において有効であることが示されており、また同様の投与レジメン（すなわち、製剤および／または用量および／または投与プロトコル）を、本発明の抗体の場合に使用してもよい。本発明の医薬組成物中の抗体の投与におけるスケジュールおよび用量は、これらの生成物における既知の方法に従い、例えば製造業者の使用説明書を使用し、決定してもよい。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）もしくは５００ｍｇ（５０ｍＬ）のいずれかの使い捨てバイアル内に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給してもよい。生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および注射用滅菌水の中で、ＩＶ投与のために調合される。ｐＨは、６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体における例示的な適切な用量範囲は、約１ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の間であってもよい。しかし、これらのスケジュールが例示的であり、かつ最適なスケジュールおよびレジメンが、治験において判定されなければならない、医薬組成物中の特定の抗体の親和性および耐性を考慮することで適合可能であることは理解されるであろう。
別の実施形態によると、本発明の抗体組成物は、通常、抗体が投与されている場合の特定の治療目的のために使用される作用剤を含む、別の治療剤をさらに含んでもよい。追加的な治療剤は通常、処置中の特定の疾患または症状に対する単剤療法において、同作用剤に対して典型的に使用される量で、組成物中に存在することになる。かかる治療剤は、限定はされないが、抗炎症剤、ステロイド、免疫系抑制剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ならびに他の抗体およびその断片を含む。
別の実施形態では、異なる交差反応性を有する本発明の２つ以上の抗体、例えばＴＬＲ３ポリペプチドの範囲内の異なるエピトープに特異的に結合する抗体は、単一組成物中で組み合わされることで、できるだけ多くの異なるＴＬＲ３遺伝子産物が標的化され、例えば個体内または異なる患者内でのポリペプチドにおける多様性が明らかになり、またできるだけ有効に標的化される。さらに、本発明の抗体組成物は、単一のＴＬＲ３エピトープを認識する複数の抗体を含んでもよい。かかる組み合わせであれば、治療的セッティング上の有用性の拡大がさらに提供されることになる。
本発明はまた、ＴＬＲ３発現細胞活性を、それを必要とする患者において調節する方法であって、本発明に従う組成物を前記患者に投与するステップを含む方法を提供する。本方法は、より詳細には、ＴＬＲ３細胞活性の低下が有益であり、あるいは過剰なＴＬＲ３細胞活性によって引き起こされるかまたは特徴づけられる疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、ウイルス感染）を有する患者におけるＴＬＲ３細胞活性を低下させることを目的とする。
本方法を使用可能な疾患および症状は、例えば、ＴＬＲ３シグナル伝達または前記ＴＬＲ３シグナル伝達時のサイトカイン産生により、部分的または全体的に媒介されるかまたは悪化される疾患を含む、ＴＬＲ３の調節が有益でありうる場合のすべての疾患を含む。特に、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体が使用される場合、かかる障害は、ＴＬＲ３シグナル伝達または前記ＴＬＲ３シグナル伝達時のサイトカイン産生により、部分的または全体的に媒介されるかまたは悪化される任意の障害、例えば特に炎症性疾患および自己免疫疾患などの免疫障害を含む。より詳細には、本発明の方法は、種々の免疫障害および他の疾患、例えば、限定はされないが、自己免疫、炎症、アレルギー、喘息、感染（例えば、慢性感染、ウイルス感染）および敗血の処置のために用いられる。ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体で処置可能な疾患の例として、限定はされないが、関節炎、全身性エリテマトーデス、敗血、喘息、骨粗鬆症、中枢神経系抗原に対する自己免疫、自己免疫性糖尿病、炎症性腸疾患、自己免疫性心筋炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｃａｒｄｉｔｉｓ）、自己免疫性肝炎が挙げられる。
本発明に従う、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体を使用して処置可能な他の免疫障害は、特に自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、限定はされないが、クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アゾソン病、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、再生不良性貧血、自己免疫肝炎、糖尿病、グッドパスツール病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、エリテマトーデス、脱髄性症状、多発性硬化症、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オルド（Ｏｒｄ’ｓ）甲状腺炎、天疱瘡、肝硬変、乾癬、関節リウマチ、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、虫垂炎、動脈炎、関節炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、肝炎、汗腺膿瘍、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、へんとう炎、ブドウ膜炎、膣炎、脈管炎、および外陰炎を含む。
本抗体は、キット中に含まれうる。キットは、場合により、任意の数の抗体および／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、もしくは任意の他の数の治療抗体および／または化合物をさらに有しうる。キットの内容物についての本説明が決して限定されるものではなく、例えば、本キットは、他のタイプの治療化合物を有しうることは理解されるであろう。好ましくは、本キットはまた、例えば本明細書中に記載の方法を詳述する、本抗体を使用するための使用説明書を含む。
本発明のさらなる態様および利点は、以下の実験セクションにおいて開示されることになり、それは、例示的なものであり、本願の範囲を限定しないものとして見なされるべきである。
材料および方法
インターフェロン−α（ＩｎｔｒｏｎＡ（商標））は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐ．から購入した。腫瘍細胞系：Ａ３７５悪性メラノーマ腫瘍細胞系（ＣＲＬ−１６１９）は、ＡＴＣＣから購入する。抗体（抗原、サプライヤ、参照）：抗ＴＬＲ３抗体ｐＡｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ．ＡＦ１４８７。機器：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
レンチウイルスｓｈＲＮＡでの阻害
対照ヒトＴＬＲ３を標的化する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするレンチウイルスコンストラクトを、Ｖｅｃｔａｌｙｓ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって作成し、産生した。腫瘍細胞に、レンチウイルス調製物を感染させ、さらにピューロマイシンを用いてそれを選択し、安定なｓｈＴＬＲ３ Ａ３７５腫瘍細胞を得た。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
（ａ）一般的なＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００による方法。ＳＰＲ測定を、２５℃、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行った。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０、０５％Ｐ２０を、ランニング緩衝液の代わりに使用し、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用してセンサーグラムを分析した。組換えヒトＴＬＲ３を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
（ｂ）タンパク質固定化。組換えＴＬＲ３タンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｅｒｉｅｓ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（チップ）のデキストラン層内のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（０、２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、０、０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化させた。タンパク質を、カップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（すなわち、結合実験において約２０００ＲＵおよび親和性実験において６００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、ｐＨ８の１００ｍＭエタノールアミン（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
（ｃ）抗体結合分析を、ＨＢＳ−ＥＰ＋（中性ｐＨ）を用いて実行した。１０μｇ／ｍｌの濃度での抗体を、固定化タンパク質上で１０μｌ／分の一定流速で２分間注入し、１０ｍＭ ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ再生緩衝液の１０秒間注入による再生前の３分間、解離させておいた。ブランク補正（ｂｌａｎｋ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を、可溶性抗体を参照デキストラン流動細胞上に同時注入することにより、オンラインで行った。
（ｄ）酸性緩衝液（ｐＨ５．６）中での競合アッセイ。流速を１０μｌ／分に設定し、ｒｈＴＬＲ３表面を飽和させるため、５０μｇ／ｍｌの濃度での一次抗体（または１００μｇ／ｍｌでのポリＡＵ）を、２分間、３回連続で注入した。次いで、二次抗体を、５０μｇ／ｍｌで再び２分間注入し、１０ｍＭ ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ再生緩衝液の１５秒間注入による再生前の３分間、解離させておいた。ブランク補正を、再びオンラインで行い、飽和抗体（または核酸（ｎｅｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））を用いる曲線から、緩衝液の注入を差し引き、第１の複合体の解離に起因するシグナルを除去した。得られたシグナルを、二次抗体のｒｈＴＬＲ３表面上への直接的注入によって得られるものと比較した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
プロモーターとしてＩＳＲＥ（ＩＦＮ刺激応答配列）ならびにレポーター遺伝子およびタンパク質としてルシフェラーゼを用いるレポーター遺伝子アッセイをセットアップした。２９３Ｔ細胞系（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１５７３）に、ｐＩＳＲＥ−ｌｕｃプラスミド（＃２１９０８９−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を安定的に形質移入し、それをＩＦＮ−α刺激に対して最適な応答を誘発するものとしてさらに選択し、対照２９３Ｔ−ＩＳＲＥと称した。この細胞系に、異なるプラスミドｐＵＮＯ−ｈＴＬＲ３プラスミド（＃ｐｕｎｏ−ｈｔｌｒ３−ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）をさらに安定的に形質移入し、それを２９３Ｔ−ＴＬＲ３−ＩＳＲＥと称した。０日目、細胞を、９６ウェル培養プレート（１００μｌ／ウェル）内の完全培地中に、４×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。細胞を、まず３７℃で２０時間インキュベートし、次いで５０μＬの培地を廃棄し、細胞を、様々な濃度の抗ＴＬＲ３抗体とともに最終的に１００μＬ／ウェルの漸増量のポリＡＵで活性化する。新しい培地とともにインキュベートした細胞は、バックグラウンドのルシフェラーゼ活性として使用することになる。細胞を、３７℃で６時間インキュベートする。１００μＬの新たに解凍したＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレートを、暗所、室温で１０分間インキュベートし、各ウェル内で放射された光を、ガンマカウンタ（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）装置上でＣｏｕｎｔ Ｐｅｒ Ｓｅｃｏｎｄ（ＣＰＳ）として定量する。
実施例１−ＴＬＲ３特異的モノクローナル抗体の産生
免疫＃１
一次スクリーニング。
抗ＴＬＲ３抗体を得るため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒトＨｉｓ標識ＴＬＲ３細胞外ドメイン組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１４８７−ＴＲ−０５０）で免疫した。マウスは、５０μｇのＴＬＲ３タンパク質および完全フロイントアジュバントのエマルジョンでの１回の一次免疫（ｐｒｉｍｏ−ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）を腹腔内に、５０μｇのＴＬＲ３タンパク質および不完全フロイントアジュバントのエマルジョンでの二次免疫を腹腔内に、また１０μｇのＴＬＲ３タンパク質での３回の追加免疫を静脈内に受けた。免疫脾細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合し、放射線を照射した脾細胞の存在下で培養した。４０の培養プレートを得て、ＴＬＲ３への結合の検出のために開発したＥＬＩＳＡを使用し、ＴＬＲ３への結合について、一次スクリーニングで評価した。要するに、Ｈｉｓ標識組換えＴＬＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１４８７−ＴＲ−０５０）を、Ｎｉ−ＮＴＡ ９６ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上でコーティングした。ハイブリドーマ培養プレートからの上清（ＳＮ）を、ＴＬＲ３−プレート内でインキュベートし、ＴＬＲ３に結合するＩｇの存在が、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）ＩｇＧ−ＨＲＰの場合に明らかになった。陽性の上清を選択し、ＴＬＲ４への結合の欠如について試験した。要するに、Ｈｉｓ標識ｒｅｃ ＴＬＲ４タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３１４６−ＴＲ−０５０）を、Ｎｉ−ＮＴＡ ９６−ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上でコーティングした。ハイブリドーマ培養プレートからのＳＮを、ＴＬＲ４プレート内でインキュベートし、ＴＬＲ４に結合するＩｇの存在が、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）ＩｇＧ−ＨＲＰの場合に明らかになった。ＴＬＲ３特異的抗体由来の抗Ｈｉｓ特異的抗体を使用する場合、ＴＬＲ４を、一次スクリーニングにおいて選択したウェルの中で区別するため、二次スクリーニングとして選択した。第二に、ＴＬＲ３とＴＬＲファミリーの他のメンバとの間の相同性を仮定すると、初期評価は、少なくとも１つの市販のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、そのパッケージ上で、ＴＬＲ３タンパク質に特異的なものであることを表示するにもかかわらず、ＴＬＲ４を安定的に形質移入したパラフィン包埋２９３Ｔ細胞を認識することを示した。
二次スクリーニング；目的のハイブリドーマの選択。
１６８の上清を、保持し、ｒｅｃ ＴＬＲ３チップを使用するＢｉａｃｏｒｅアッセイの後、ヒトＴＬＲ３発現２９３Ｔ細胞への結合に基づく様々なアッセイフォーマットにおけるさらなるスクリーニングにおいて試験した。ｐＩＳＲＥ−ｌｕｃプラスミド（＃２１９０８９−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を安定的に形質移入した２９３Ｔ細胞系（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１５７３）を、ＩＦＮ−α刺激に対して最適な応答を誘発するものとしてさらに選択し、対照２９３Ｔ細胞と称した。この細胞系に、ｐＵＮＯ−ｈＴＬＲ３プラスミド（＃ｐｕｎｏ−ｈｔｌｒ３−ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）またはｐＵＮＯ−ｈＴＬＲ４プラスミド（＃ｐｕｎｏ−ｔｌｒ４−ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）をさらに安定的に形質移入し、それらをそれぞれ２９３Ｔ−ＴＬＲ３および２９３Ｔ−ＴＬＲ４と称した。上清を、ＦＡＣＳに基づくスクリーニングで、２９３Ｔ対照細胞に結合することなく、２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に結合することについて、またそれと同時に、ＩＨＣスクリーニングで、２９３Ｔ−ＴＬＲ４細胞に結合することなく、凍結細胞ペレットとして２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に結合することについて、スクリーニングした。凍結細胞ペレットとして２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に結合することについて、ＩＨＣスクリーニングで選択したウェルについても、パラフィン包埋細胞ペレットとして２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に結合することについて、ＩＨＣスクリーニングでさらに試験した。要するに、ＦＡＣＳスクリーニングにおいては、上清中での反応抗体の存在が、ビオチンで標識したヤギ抗マウスポリクローナル（ｐｏｌｙｃｏｌｏｎａｌ）抗体（ｐＡｂ）、ＰＥで標識したストレプトアビジンによって明らかになった。ＩＨＣスクリーニングにおいては、上清中での反応抗体（Ａｂ）の存在が、ビオチンで標識したロバ抗マウスｐＡｂ（＃７１５−０６５−１５０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）で標識したストレプトアビジン（＃Ｅ２８８６，Ｓｉｇｍａ）によって明らかになり、またＤＡＢ（＃ＳＫ−４１０５，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって明らかになった。
潜在的に興味深いハイブリドーマのクローニング。
一次スクリーニングから選択した４２の潜在的に興味深いハイブリドーマを、９６ウェルプレート内で限界希釈技術によってクローン化し、３０４のサブクローンを、以下の一連のスクリーニングで試験した。３０４のサブクローンを、ＴＬＲ３への結合の検出用に開発した同じＥＬＩＳＡを用いるＴＬＲ３への結合についてのスクリーニングで、最初に評価し、陽性上清を選択し、ＥＬＩＳＡアッセイでＴＬＲ４への結合の欠如について試験し、ＴＬＲ３に対して選択的である２２８のクローンを得た。ＴＬＲ４ ＥＬＩＳＡで得られるＤＯに対するＴＬＲ３ ＥＬＩＳＡで得られるＤＯについて１０を超える比が得られたすべての上清を、ＴＬＲ３に対して特異的なものとして選択した。それらの中には、プレート３１のウェルＣ３（３１Ｃ３）、プレート２９のウェルＨ３（２９Ｈ３）、プレート２３のウェルＥ７（２３Ｅ７）、プレート２３のウェルＣ８（２３Ｃ８）およびプレート２８のウェルＦ１１（２８Ｆ１１）からの上清が含まれた。３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、および２８Ｆ１１は、ＩｇＧ１アイソタイプであった。
３０４のクローンの中で、凍結ＩＨＣにおいて陽性である、試験されたプレクローン（ｐｒｅｃｌｏｎｅ）から生じるものとして選択した６３のクローンについても、２９３Ｔ−ＴＬＲ４細胞に結合することなく、凍結細胞ペレットとして２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に結合することについて、凍結ＩＨＣスクリーニングで試験し、凍結ＩＨＣにおいて３１の陽性クローンを得た。
ＦＡＣＳ染色における７１のクローン陽性および凍結ＩＨＣにおける３１のクローン陽性の中で、４１のクローンを、３０４の初期クローンからの凍結保存について選択した。
免疫＃２
一次スクリーニング。
異なる抗体を産生するため、さらなる一連の免疫を行った。一連の一次免疫の場合と同様の実験セットアップを使用し、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、免疫脾細胞を、融合し、放射線を照射した脾細胞の存在下で培養した。培養プレートを得て、ＴＬＲ３への結合の検出のために開発したＥＬＩＳＡを使用し、一次スクリーニングでＴＬＲ３への結合について評価した。２８４０から２６３のクローンを、二次スクリーニング用に選択した。
二次スクリーニング；興味深いハイブリドーマの選択。
２６３の上清を、保持し、２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞に対する阻害試験におけるさらなるスクリーニングで試験した。９５％を超える阻害効果を有するクローンを選択した。それらの中には、プレート３４のウェルＡ３（３４Ａ３）からの上清が含まれた。
実施例２−ＴＬＲ３調節
脊髄ＤＣ（ＭｄＤＣ）を、ＰＢＭＣを正常な健常ヒトドナーから単離することにより、ＰＢＭＣから得た。単球を、一般的な使用説明書に従い、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）での陽性選択を用い、ＰＢＭＣから精製した。単球を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｃｏｍａｘ，ＳＰ）およびヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（それぞれ２００ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌ）における５〜６日のインキュベーションにより、ＤＣ（ＭｄＤＣ）にさらに誘導した。
次いで、得られたＭｄＤＣを、平底９６ウェルプレート内、１０６個の細胞／ｍｌで２通りに播種した。細胞を、指定濃度での抗ＴＬＲ３抗体とともに、２００μｌの最終容量で２０時間活性化した。漸増量のポリＡＵ（３０、１００、３００および９００μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、投与効果の出力を得た。
上清を、刺激の２０時間後に回収し、−２０℃で凍結し、さらにＩＬ−６およびＩＰ−１０について酵素結合免疫吸着アッセイを用いてアッセイした。次いで、細胞を採取し、活性化マーカーＣＤ８６（ａ．ｈｕＣＤ８６マウスの場合、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｒｅｆ ５５５６５７）に対して染色するとともに、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出した。
図１および２は、ＣＤ８６細胞活性化およびＩＬ−６、ＩＰ−１０分泌の観点での、抗体３１Ｃ３および２９Ｈ３（双方ともＩｇＧ１アイソタイプ）の阻害特性について図示する。抗ＴＬＲ３抗体３１Ｃ３．１および２９Ｈ３．７は、ＴＬＲ３介在性脊髄ＤＣの活性化にインビトロで拮抗し、さらに、これらの抗体は、ＴＬＲ３介在性ＣＤ８３／ＣＤ８６発現を有効に下方制御し、かつＴＬＲ３介在性サイトカイン／ケモカイン分泌（特にＩＰ−１０およびＩＬ−６）を排除した。
Ｆ（ａｂ）’２断片を、パパイン切断およびＭｏｎｏＱ ５／５０ＧＬ上でのイオン交換クロマトグラフィーによる精製により、抗体３１Ｃ３．１および２９Ｈ３．７から産生し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＣＤ８６細胞活性化およびサイトカイン分泌の観点で阻害について試験した。抗体３１Ｃ３．１および２９Ｈ３．７の双方のＦ（ａｂ）’２断片は、完全長抗体と同様の範囲まで、ＴＬＲ３介在性ＣＤ８３／ＣＤ８６発現を有効に下方制御し、かつＴＬＲ３介在性サイトカイン／ケモカイン分泌を排除した。図３は、抗体３１Ｃ３のＦ（ａｂ）’２断片および全３１Ｃ３ ＩｇＧが、同様の範囲まで、ＴＬＲ３介在性ＣＤ８６発現およびＩＰ−１０分泌を排除する場合での、抗体３１Ｃ３における結果を示し、図４は、抗体２９Ｈ３のＦ（ａｂ）’２断片について同じことを示す。
同様の実験において、２８Ｆ１１および２３Ｃ８抗体のＴＬＲ３シグナル伝達に対する阻害能について評価し、抗体３１Ｃ３の場合と比較した。抗体を、漸増用量のポリＡＵの存在下、５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。結果を、図１４Ａおよび１４Ｂに示し、本発明に従う抗体の阻害特性について明示する。
抗体３４Ａ３はまた、同様の設定で試験している。この回では、細胞（ＭｄＤＣ）を固定用量のポリＡＵ（３００μｇ／ｍｌ）で刺激し、漸増用量の抗体を培地に添加する。図１９Ａおよび１９Ｂは、ＩＬ−６およびＩＰ−１０分泌の観点で３１Ｃ３と比較した、抗体３４Ａ３における結果を図示する。
実施例３−二価親和性
抗体２９Ｈ３．７、２３Ｅ７．３、３１Ｃ３．１ならびに市販の抗体ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および４０Ｃ１２８５（Ａｂｃａｍ）の結合特性を、ＳＰＲ、アイテムｃ）に記載の方法を用いて比較した。図５は、ＴＬＲ３に対する結合親和性が、市販の抗体の場合よりも、２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１の場合に有意に改善されることを示す。
ＴＬＲ３への結合について、中性（ｐＨ７．２）および酸性（ｐＨ５．６）条件で判定し、Ｋ（Ｄ）値を計算した。結果（２つもしくは３つの実験の平均）を表１に示す。中性ｐＨで、２３Ｅ７、２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１のすべてが、組換えヒトＴＬＲ３に対し、１００ピコモルより改善された（約５０ピコモル）、強力かつ類似した二価親和性（ＫＤ）を示した。比較において、抗体ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、有意により低い結合親和性を示した。しかし、酸性ｐＨで、２３Ｅ７は、結合親和性が著しく低下し、そのＫＤは約４ナノモルであった。３１Ｃ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１および３４Ａ３の親和性を、別々のアッセイにおいて同じ条件下で測定し、結果を表１および図１５に示す。これらの結果は、本発明に従う抗体が特に酸性ｐＨで高親和性を有することを示す。
Figure 2012532851
実施例４−エピトープマッピング
酸性ｐＨでのエピトープマッピング。
競合アッセイを、ＳＰＲ、アイテムｄ）に記載の方法に従い、ｐＨ５．６で実施した。図６は、抗体２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１が、ポリＡＵと競合することなくＴＬＲ３に結合できたことを図示し、同様に、図１６Ａおよび１６Ｂは、抗体２８Ｆ１１、３４Ａ３および２３Ｃ８が、ポリＡＵと競合することなくＴＬＲ３に結合できたことを図示する。したがって、２９Ｈ３．７、３１Ｃ３．１、２８Ｆ１１、３４Ａ３および２３Ｃ８は、ＴＬＲ３上のｄｓＲＮＡのエピトープに対して競合することなく、ｄｓＲＮＡシグナル伝達を阻害することができる。図７は、抗体２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１の間での競合を図示する。１つの抗体によるＴＬＲ３への結合がその他のＴＬＲ３への結合を低下させることから（その他の１つの抗体によって約９０％が阻害）、これら２つの抗体がＴＬＲ３上の類似のエピトープに対して競合すると結論づけることができる。同様に、図１５Ａおよび１５Ｂは、抗体３１Ｃ３と抗体ＴＬＲ３０７、２３Ｃ３、２８Ｆ１１および２９Ｈ３との間の競合を図示する。図１５Ａは、任意の競合抗体の不在下での結合を図示する一方、図１５Ｂは、３１Ｃ３でのｈＴＬＲ３チップの飽和後の結合レベルを図示する。結合レベルの低下は、３１Ｃ３抗体によって引き起こされる障害を示し、試験抗体間での結合における競合を明示する。３１Ｃ３競合による影響を受けていないＴＬＲ３．７結合レベルは、抗体が異なるエピトープに対して競合することを明示する一方、他の抗体のすべてにおける結合レベルの低下は、それら全部が類似のエピトープに対して３１Ｃ３と競合することを明示する。
中性ｐＨでのエピトープマッピング。
競合アッセイを、ＳＰＲに記載の方法に従い、ｐＨ７．２で実施した。１つの抗体による結合がその他のＴＬＲ３への結合を低下させたことから、抗体２９Ｈ３．７および３１Ｃ３．１は、ＴＬＲ３への結合に対して互いに競合する。また、エピトープマッピングを市販の抗体ＴＬＲ３．７および抗体２３Ｅ７．３の場合に検討した。これらの抗体のいずれも、ＴＬＲ３への結合において、抗体２９Ｈ３．７および３１Ｃ３のいずれとも競合しなかった。しかし、抗体ＴＬＲ３．７は、ＴＬＲ３への結合において、抗体２３Ｅ７．３と確かに競合し、それは、それらが重なり（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）結合部位を有することを示す。
３４Ａ３抗体結合親和性を、ｒｈＴＬＲ３チップ上に単独、またはｒｈＴＬＲ３チップが３４Ａ３の添加前に３１Ｃ３抗体で飽和される条件下のいずれかで測定した。結果は、図１７に示され、２つの抗体がｈＴＬＲ３への結合において競合することから、それらの重なり結合部位を考慮すると、共通のエピトープ決定基を共有するという証拠を提供する。
図８は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｕ．Ｋ．）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）プロジェクトからのＲｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓデータベースから得られるデータファイル１ＺＩＷとして公的に利用可能なデータに基づき、ＳｗｉｓｓＰｄｂ 、Ｖｉｅｗｅｒ ４．０を用いるコンピュータモデリング（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ （２００７年） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４−２７２３頁）によって生成された、ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインの分子表面マップを示す。この図面では、Ｃ末端は左側に、またＮ末端は右側に存在し、それは、実質的にグリコシル化を含んでいないＴＬＲ３の表面と、他の表面が炭水化物によって幅広くマスクされていることを示す（例えば、Ｃｈｏｅら、（２００５年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１−５８５頁を参照）。図８中の右側の表面マップは、分子表面にマッピングされた、中性ｐＨでのヒトＴＬＲ３ポリペプチドの静電ポテンシャルを示す。正の静電ポテンシャルの主な領域は、矢印で示し、それはＣ末端側のグリコシル化を含まない表面上に正および中性のポテンシャルの一般的領域を形成する。グリコシル化を含まない表面は、リガンドアクセサリ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）分子またはＴＬＲ３単量体または他のオリゴマーアセンブリとの相互作用において接近可能であると考えられ、Ｃ末端側の正の静電ポテンシャルの領域（最暗色の影、矢印によって示される主な正の領域）は、ｄｓＲＮＡ結合領域に対応すると考えられる。これらの領域は、Ｃｈｏｅら、（２００５年）の図５中にも示される。左側のマップは、ｄｓＲＮＡ結合に関与することが突然変異試験によって判定されたアミノ酸残基を示し、ここで残基ｄｓＲＮＡ結合は、残基Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｎ４６６、Ｒ４８９、Ｎ５１７もしくはＮ５４０の突然変異によって阻害され（＞８０％）、またここでｄｓＲＮＡ結合は、残基Ｋ１１７、Ｋ１３７およびＫ１３９の突然変異によって阻害された（＞８０％）。Ｃｈｏｅら、（２００５年）において提起されたモデルでは、ＴＬＲ３が二量体化界面がグリコシル化を含まない表面上のＣ末端領域の近位にある場合のホモ二量体を形成し、かつ、ｄｓＲＮＡがＴＬＲ３のグリコシル化を含まない表面のみに結合し、その場合、２つのＴＬＲ３単量体は、２つのＴＬＲ３単量体および１つのｄｓＲＮＡ鎖の複合体中で、ｄｓＲＮＡをサンドイッチ化しうる。より長いｄｓＲＮＡ鎖に結合するＴＬＲ３の複数の二量体によって形成されるＴＬＲ３のオリゴマー複合体を含むモデルも提起されている（例えば、Ｂｅｌｌら、（２００６年） ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０３（２３）：８７９２−８７９７頁）。Ｒａｎｊｉｔｈ−Ｋｕｍａｒら、（２００７年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（１０）：７６６８−７６７７頁は、ＴＬＲ３がリガンドの不在下でオリゴマー化段階で存在しうることと、ｄｓＲＮＡの結合が、二量体における再配列（単量体の互いに向けての側面のスライドをもたらし、ｄｓＲＮＡに適合するように調節される）を引き起こしうること、またこの場合、得られる高次構造変化は、ＴＩＲドメインの相互作用を刺激し、シグナル伝達を誘発しうることが提起されている。したがって、１つの説明として、抗ＴＬＲ３抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１および３４Ａ３が、例えばグリコシル化を含まない表面上の、またおそらくは中性ｐＨで負電荷を有するエピトープ（したがって、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への結合の領域内ではない）中のＴＬＲ３に結合することが考えうる。したがって、抗体は、場合により、ｄｓＲＮＡとＴＬＲ３との相互作用を阻止しないことになるが、例えば、ｄｓＲＮＡに結合しているＴＬＲ３の二量体またはオリゴマーが、再配置するか、またはＴＩＲドメインの相互作用をもたらすために必要とされる立体配置をとることを阻止することにより、あるいはＴＬＲ３二量体および／または結果として生じるＴＬＲ３−ｄｓＲＮＡ三重複合体の適切な形成に干渉することにより、シグナル伝達を阻害しうる。
実施例５−レポーターアッセイ
抗体を、ルシフェラーゼに基づくレポーター遺伝子活性（２９３Ｔ−ＴＬＲ３−ＩＳＲＥ）における、ＴＬＲ３シグナル伝達の阻害について試験した。ポリ（Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲ３−アゴニストを使用するＴＬＲ３受容体の関与が、プロモーターＩＳＲＥを含むＩＦＮ型経路（ｔｈｅ ｔｙｐｅ−ＩＦＮ ｐａｔｈｗａｙ）を活性化することが報告されている（Ｗｉｅｔｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８（５１）、５０９２３頁、２００３年）。要するに、レポーターアッセイにおいて、ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３アゴニストを使用し、抗ＴＬＲ３抗体３１Ｃ３の存在下でＴＬＲ３シグナル伝達が誘発され、ＴＬＲ３シグナル伝達を評価した。図９中に示される結果は、抗ＴＬ３抗体３１Ｃ３が、ＴＬＲ３シグナル伝達に対する効果を全く有しないことが予め判定された対照抗ＴＬＲ３抗体に対し、ＴＬＲ３シグナル伝達を用量依存性に強力に阻害したことを示す。
さらなる実験セットにおいては、２９３−ｈｕＴＬＲ３細胞を、異なる濃度の抗ＴＬＲ３ ｍＡｂとともに２４時間インキュベートした後（図１０Ａを参照；ｍＡｂ濃度は、対数目盛りでμｇ／ｍｌで軸表示される）、ＴＬＲ３アゴニストの培地にポリＡＵを３００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。ルシフェラーゼ発現を、２４時間後をベースに測定した。結果を図１０Ａに示し、ＩＣ５０を表２中に示し、それは本発明に従う抗体が優れた阻害特性を有することを示す。
Figure 2012532851
別の実験セットにおいては、同じ阻害試験を、１００μｇ／ｍｌのポリＡＵならびに試験抗体３１Ｃ３、２３Ｅ８および３４Ａ３を用いて実施した。ＩＣ５０値を計算し、抗体の全部が、５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有した。さらに、３４Ａ３は、低濃度で増強された阻害効果を示した（図１０Ｂ）。図１０Ａおよび１０Ｂは、漸増用量の本発明に従う抗体の阻害特性を示し、ＴＬＲ３シグナル伝達の阻害は、用量依存性である。このアッセイでは、本発明に従う抗体の優れた阻害特性が確認される。
さらなる試験においては、本発明に従う抗体の阻害特性を、炎症状態下、ここではＩＦＮαの存在下で評価した。要するに、３つの異なる条件について試験した。条件１（図１１Ａ）では、ＩＰ−１０分泌を、前処理を全く伴わない場合に評価し、条件２（図１１Ｂ）では、ＩＰ−１０分泌を、２４時間のＩＦＮα（１０００ＵＩ／ｍｌ）での前処理後に評価し、条件３（図１１Ｃ）では、ＩＰ−１０分泌を、２４時間のポリＡＵ（３００μｇ／ｍｌ）での前処理後に評価し、次いで、ある用量範囲のｄｓＲＮＡ（図１１Ａおよび１１ＢにおけるポリＩＣ、図１１ＣにおけるポリＡＵ）および抗ＴＬＲ３抗体（３１Ｃ３または２３Ｃ８のいずれか）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＩＰ−１０分泌を、ＥＬＩＳＡを用い、２４時間後、（μｇ／ｍｌで）定量した。
図１１に示される結果は、本発明に従う抗体が、刺激分子（ｄｓＲＮＡまたは炎症性サイトカインのいずれか）の存在下であっても、ＴＬＲ３の優れた阻害剤のままであることを明示する。かかる状態は、予め確定された炎症性疾患に類似した症状を呈する。
実施例６−ＦＡＣＳ染色
要するに、２９３Ｔまたは２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系を回収し、培地を洗浄し、細胞を固定し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＩｎｔｒａＰｒｅｐ（商標）透過性試薬を使用し、製造業者の使用説明書に従って透過処理した。次いで、透過性細胞を、２５μｇ／ｍＬの３１Ｃ３抗体とともに室温で２０分間インキュベートし、ＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス抗体によってさらに明らかにした。グラフを図１３に示す。図１３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系に対する陰性対照を示す。図１３Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＬＲ３細胞上で得られる染色を示す。３１Ｃ３抗ＴＬＲ３抗体の代わりに対照アイソタイプ抗体とともにインキュベートした細胞は未染色であった。
透過性細胞内の抗体３１Ｃ３を使用して得られた染色は、本抗体が、細胞内の細胞内ヒトＴＬＲ３を特異的に認識し、かつそれに結合することを示す。
実施例７−動力学的試験
別の一連のアッセイを実施し、本発明に従う抗体の阻害の動力学を判定した。要するに、ＭｄＤＣを、抗ＴＬＲ３抗体（３１Ｃ３もしくは２３Ｃ８、５０μｇ／ｍｌの濃度で）およびある用量範囲のポリＡＵとともに、様々な時間設定でインキュベートした。次いで、培地を２４時間インキュベートし、ＩＰ−１０分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。図１２Ａは、３１Ｃ３抗体におけるｎｇ／ｍｌ（ポリＡＵ用量に依存する）でのＩＰ−１０分泌を示し、図１２Ｂは、２３Ｃ８抗体における結果を示す。
予備刺激：抗ＴＬＲ３抗体を、ｄｓＲＮＡの添加前に１時間３０分間インキュベートした。
同時刺激：抗ＴＬＲ３抗体およびｄｓＲＮＡを同時に添加した。
刺激後：ｄｓＲＮＡを、抗ＴＬＲ３抗体の添加前に１時間３０分間インキュベートした。
これらの結果は、本発明に従う抗体が、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３タンパク質への結合状態と無関係に、ＴＬＲ３阻害にとって効率的であることを明示する。本抗体は、ｄｓＲＮＡの結合部位と競合することがないばかりか、ｄｓＲＮＡがＴＬＲ３タンパク質に既に結合されている場合であっても、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することができる。
実施例８−ＴＬＲ３内在化アッセイ
要するに、抗体なしまたは５０μｇ／ｍＬの抗ＴＬＲ３抗体３１Ｃ３のいずれかを、生存２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系とともに、３７℃で２時間または２４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、固定し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＩｎｔｒａＰｒｅｐ透過性試薬を使用して透過処理した。ＴＬＲ３に結合された抗ＴＬＲ３ ３１Ｃ３抗体の存在を、ＡＰＣで標識したヤギ抗マウス抗体を用いて明らかにする。あるいは、透過性細胞を、対照アイソタイプ、または、ＴＬＲ３への結合において３１Ｃ３抗体と競合しない、ＦＡＣＳにおいて有効なＴＬＲ３に特異的なｍＡｂ（双方ともビオチンで標識）のいずれかとともにインキュベートし、蛍光ストレプトアビジン誘導体との細胞のインキュベーションを通じてさらに明らかにした。グラフを図１２に示す。図１２Ａは陰性対照を示し、それは、ＴＬＲ３タンパク質に結合する抗体の不在下での２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞の蛍光強度を示す。図１２ＣおよびＤは、２４時間または２時間のインキュベーション後の、内在化された３１Ｃ３抗体のＴＬＲ３タンパク質への結合によって誘発される蛍光をそれぞれ示す。図１２Ｂは、３１Ｃ３抗体との予備インキュベーションを伴わない場合での、２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系におけるＴＬＲ３発現の安定状態レベルを示す。図１２Ｂの場合より類似した蛍光を示す図１２Ｄおよび１２Ｆでは、抗体３１Ｃ３によるＴＬＲ３への結合が、２９３Ｔ−ＩＳＲＥ／ＴＬＲ３細胞系におけるＴＬＲ３の発現を下方調節しないことが確認される。
それらの結果は、本発明に従う抗体が迅速かつ効率的に内在化されるとともに、さらに一切のｈＴＬＲ３の下方調節を伴わないことを示す。これらの結果は、本発明に従う抗体の結合の効率を明示する。さらに、この迅速な内在化は、抗体が治療にとっての有望な候補であるという証拠を提供する。かかる抗体はまた、毒性剤とのカップリングにとっての有望な候補であり、それにより、ＴＬＲ３発現細胞の特異的標的化を可能にする。
すべての見出しおよび小見出しは、あくまで便宜的に本明細書で使用され、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。上記要素のそのすべての考えられる変形における任意の組み合わせは、本明細書中で他に指定されないかまたは他に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中で他に指定されない限り、あくまで同範囲内に含まれる独立した各値を個別に参照する略記方法として役立つことを意図しており、独立した各値は、あたかもそれが本明細書中で個別に記述されるように、本明細書中に援用される。特に指定のない限り、本明細書中に提供されるすべての正確な値は、対応する近似値を代表する（例えば、特定の要素または測定値に関連して提供されるすべての正確な典型的値は、必要に応じて「約」によって修飾された、対応する近似測定値もまた提供するものと考えられうる）。
本明細書中に記載のすべての方法は、本明細書中で他に指定されないかまたは他に文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施してもよい。
本明細書中に提供される任意およびすべての例または典型的な言葉（例えば「など」）の使用は、あくまで本発明をよりよく明示することを意図したものであり、他に指定されない限り、本発明の範囲に対して限界を設けるものではない。本明細書中の言葉の中で、任意の要素が本発明の実行に対して必須であることを示すものとして、そのように明示されない限り、解釈されるべきものはない。
本明細書中の特許文書の引用および援用は、あくまで便宜上行われ、かかる特許文書の有効性、特許性および／または権利行使可能性に関する任意の見解を反映するものではない。１つ以上の要素に対する参照などの用語を用いる、本発明の任意の態様または実施形態での本明細書中の説明は、他に指定されないかまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ以上の要素に対して「からなる」、「本質的に〜からなる」または「実質的に含む」といった本発明の類似の態様または実施形態へのサポートを提供することを意図している（例えば、特定の要素を含むものとしての本明細書中に記載の組成物であれば、他に指定されないかまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物もまた説明するものとして理解されるべきである）。
本発明は、適用可能な法律によって認可される最大の範囲までの、本明細書中に示される態様または特許請求の範囲の中に記載される、対象物のすべての修飾物および均等物を含む。
本願中に引用されるすべての特許および特許出願は、各個別の公報または特許出願が、あたかも参照により援用されることが具体的かつ個別に示されるように、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
上記の発明は、理解を明確にすることを目的として、図面および例として、多少詳しく述べられているが、当業者にとっては、本発明の教示内容を踏まえて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく特定の変化および修飾がそれに対してなされうることが容易に理解されるであろう。

Claims (50)

  1. ＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３リガンドと前記ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を遮断することなく、前記ＴＬＲ３ポリペプチドによってシグナル伝達を阻害する、モノクローナル抗体。
  2. ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、場合によって酸性および／または中性条件下で、
    （ａ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号３４および３５を有する抗体（３４Ａ３）、
    （ｂ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１０および１１を有する抗体（２９Ｈ３）、
    （ｃ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１８および１９を有する抗体（２８Ｆ１１）、
    （ｄ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２６および２７を有する抗体（２３Ｃ８）、および
    （ｅ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２および３を有する抗体（３１Ｃ３）
    からなる群から選択される抗体と競合する、請求項１に記載の抗体。
  3. （ａ）配列番号６１、６４および６５から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号６２、６６および６７から選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列；および
    （ｃ）配列番号６３、６８、６９および７０から選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
    を含む軽鎖を含む、請求項１〜２に記載の抗体。
  4. （ａ）配列番号７１〜７６から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号７７〜８１から選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列；および
    （ｃ）配列番号８２〜８５から選択される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列
    を含む重鎖を含む、請求項１〜３に記載の抗体
  5. ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、その二価結合親和性においてサブナノモルＫＤで、酸性条件下で、前記ＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  6. ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３リガンドと前記ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節する、請求項５に記載の抗体。
  7. ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する、請求項５〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 樹状細胞内でのＴＬＲ３シグナル伝達を調節する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 二価結合親和性においてサブナノモルＫＤで、酸性条件下で、前記ＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜４および６〜８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記酸性条件は、４．５〜６．５の間のｐＨを含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 二価結合親和性においてサブナノモルＫＤで、中性条件下で、ＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記中性条件は、６．６〜７．４のｐＨを含む、請求項１１に記載の抗体。
  13. ＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、場合によって酸性および／または中性条件下で、
    （ａ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号３４および３５を有する抗体（３４Ａ３）、
    （ｂ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１０および１１を有する抗体（２９Ｈ３）、
    （ｃ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号１８および１９を有する抗体（２８Ｆ１１）、
    （ｄ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２６および２７を有する抗体（２３Ｃ８）、および
    （ｅ）ＶＨおよびＶＬ領域としてそれぞれ配列番号２および３を有する抗体（３１Ｃ３）
    からなる群から選択される抗体と競合する、抗体。
  14. （ａ）（ｉ）配列番号４、５および６でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号７、８および９でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
    （ｂ）（ｉ）配列番号１２、１３および１４でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１５、１６および１７でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
    （ｃ）（ｉ）配列番号２０、２１および２２でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号２３、２４および２５でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
    （ｄ）（ｉ）配列番号２８、２９および３０でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号３１、３２および３３でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；ならびに
    （ｅ）（ｉ）配列番号３６、３７および３８でそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号３９、４０および４１でそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列と、を有する抗体；
    からなる群から選択され、ここで前記配列のいずれかにおける前記アミノ酸の１つ、２つ、３つもしくはそれより多くが、異なるアミノ酸によって置換されうる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
  15. マウス抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. キメラ、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
  17. ＩｇＧアイソタイプである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 前記抗体の前記アイソタイプは、ＩｇＧ４である、請求項１７に記載の抗体。
  19. ＦｃγＲに実質的に結合しないＦｃ領域を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体から選択される抗体断片である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. 毒性部分にコンジュゲートされるかまたは共有結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. ＴＬＲ３発現細胞、場合によって癌細胞による内在化能がある、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 検出可能な部分にコンジュゲートされるかまたは共有結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体をキメラ化またはヒト化することによって得られる抗体。
  25. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含み、場合により、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を特異的に認識する標識二次抗体をさらに含む、キット。
  26. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマまたは組換え宿主細胞。
  27. 請求項１３または１４に記載の抗体を産生する、請求項２６に記載の細胞。
  28. 抗体３１Ｃ３または抗体２９Ｈ３を産生する、請求項２６に記載の細胞。
  29. 哺乳類対象におけるＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、ａ）非ヒト哺乳動物を、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で免疫するステップと、ｂ）前記免疫動物から、酸性および中性条件下で前記ＴＬＲ３ポリペプチドに高親和性に結合し、かつＴＬＲ３シグナル伝達を調節する抗体を選択するステップと、を含む、方法。
  30. 選択された前記抗体は、中性条件の場合と比較して、酸性条件下で、ＴＬＲ３ポリペプチドに対する結合親和性の実質的低下を全く有しない、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗体は、ＴＬＲ３リガンドとＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害するように選択される、請求項２９に記載の方法。
  32. 哺乳類対象におけるＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、ａ）非ヒト哺乳動物を、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で免疫するステップと、ｂ）前記免疫動物から、ＴＬＲ３リガンドとＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を遮断することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体を選択するステップと、を含む、方法。
  33. ステップ（ｂ）において調製された前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する前記抗体の能力が評価されるステップをさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ヒトＴＬＲ３ポリペプチドへの結合において、抗体２９Ｈ３および／または３１Ｃ３と競合する前記抗体の能力が評価されるステップをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記選択されたモノクローナル抗体の断片または誘導体を作製するステップをさらに含む、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記断片または誘導体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体断片、複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体あるいは請求項２４または２９〜３７に従って得ることができる抗体、ならびに薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
  39. 自己免疫、炎症、アレルギー、喘息、感染、肝硬変および敗血からなる群から選択される疾患を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜２４または３８のいずれか一項に記載の治療有効量の抗体または医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  40. 前記疾患は、感染である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記疾患は、感染に関連した炎症である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記疾患は、肺炎症である、請求項３９または４１に記載の方法。
  43. 前記疾患は、関節リウマチである、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記疾患は、敗血である、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記疾患は、肝硬変である、請求項３９に記載の方法。
  46. 前記疾患は、糖尿病である、請求項３９に記載の方法。
  47. 前記疾患は、骨粗鬆症である、請求項３９に記載の方法。
  48. 前記疾患は、関節リウマチを有する患者における骨粗鬆症である、請求項３９に記載の方法。
  49. 前記患者に、免疫調節剤、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗生物質、抗ウイルス剤および抗炎症剤からなる群から選択される適切な追加的な治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 癌を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の治療有効量の抗体または医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
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