JP2012525425A - Toll様受容体3アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
a.Kd<10nMでヒトTLR3に結合する;
b.インビトロでのポリ(I:C)NF−κBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50%超低減させる;
c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を60%超阻害する;
d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を50%超阻害する;
e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
g.1μg/mLで、PBMC細胞による、ポリ(I:C)により誘導されたIFN−γ、IL−6又はIL−12の産生を20%超阻害する;
h.インビトロでのNF−kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<10μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する;
i.インビトロでのISREレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<5μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する。
本発明はTLR3の生物活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びかかる抗体の使用法を提供する。かかるTLR3アンタゴニストは、TLR3に結合してTLR3の活性化を阻害する性質を有し得る。かかる抗体によってTLR3活性が阻害され得る機序の例としては、TLR3へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくはインサイチューでの阻害、受容体の2量化の阻害、エンドソーム区画へのTLR3の局在化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はTLR3のmRNAの転写の阻害が挙げられる。他の機序によってTLR3の活性を阻害することが可能な他の抗体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。
Xaa6−I−Xaa7−Xaa8−R−S−Xaa9−W−Y−N−D−Y−A−V−S−V−K−S
(I)
式中、
Xaa6は、Arg又はLysであってよく、
Xaa7は、Tyr、His又はSerであってよく、
Xaa8は、Met、Arg又はTyrであってよく、
Xaa9は、Lys又はArgであってよい。
I−I−Q−Xaa15−R−S−K−W−Y−N−Xaa16−Y−A−Xaa17−S−V−K−S
(III)
式中、
Xaa15は、Lys、Thr又はIleであってよく、
Xaa16は、Asn又はAspであってよく、
Xaa17は、Val又はLeuであってよい。
Xaa24−I−D−P−S−D−S−Y−T−N−Y−Xaa25−P−S−F−Q−G
(V)
式中、
Xaa24は、Phe又はArgであってよく、
Xaa25は、Ala又はSerであってよい。
Xaa1−S−Y−D−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−T−V
(II)
式中、
Xaa1は、Ala、Gln、Gly又はSerであってよく、
Xaa2は、Gly、Glu又はSerであってよく、
Xaa3は、Asp又はAsnであってよく、
Xaa4は、Glu又はSerであってよく、
Xaa5は、Phe、Ala又はLeuであってよい。
Xaa10−S−Y−D−Xaa11−P−Xaa12−Xaa13−Xaa14−V
(IV)
式中、
Xaa10は、Gln又はSerであってよく、
Xaa11は、Thr、Glu又はAspであってよく、
Xaa12は、Val又はAsnであってよく、
Xaa13は、Tyr又はPheであってよく、
Xaa14は、Ser、Asn又はGlnであってよい。
Q−Q−Xaa18−Xaa19−Xaa20−Xaa21−Xaa22−Xaa23−T
(VI)
式中、
Xaa18は、Tyr、Gly又はAlaであってよく、
Xaa19は、Gly、Glu又はAsnであってよく、
Xaa20は、Ser又はThrであってよく、
Xaa21は、Val、Ile又はLeuであってよく、
Xaa22は、Ser又はLeuであってよく、
Xaa23は、Ile、Ser、Pro又はTyrであってよい。
a.Kd<10nMでヒトTLR3に結合する;
b.インビトロでのポリ(I:C)NF−κBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50%超低減させる;
c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL5/IP−10の産生を60%超阻害する;
d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL5/IP−10の産生を50%超阻害する;
e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
g.1μg/mLで、PBMC細胞による、ポリ(I:C)により誘導されたIFN−γ、IL−6又はIL−12の産生を20%超阻害する;
h.インビトロでのNF−κBレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<10μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する;
i.インビトロでのISREレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<5μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する。
本発明のTLR3アンタゴニスト、例えばTLR3抗体アンタゴニストは、免疫系を調節する目的で使用することができる。何らのかの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、本発明のアンタゴニストは、TLR3へのリガンドの結合、TLR3の2量化、TLR3の細胞内移行、又はTLR3の輸送を防止又は低減することによって免疫系を調節し得るものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。こうした動物の例としては、ヒト、齧歯類、犬、猫、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば本発明の抗体は、TLR3活性の中和、炎症、炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるように調製される。
TLR3活性の抑制が所望される病態の治療又は予防に効果的な剤の「治療上の有効量」は、標準的な研究技術により判定され得る。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。
抗huTLR3アンタゴニストmAbの同定及び誘導
MorphoSys Human Combinatorial Antibody Library(HuCAL(登録商標))Goldファージディスプレイライブラリ(Morphosys AG,Martinsried,Germany)をヒト抗体フラグメントの供給源として使用し、C末端にポリヒスチジンタグを有するヒトTLR3(huTLR3)(配列番号4)のアミノ酸1〜703を発現させることによって生成した精製TLR3抗原に対してパニングさせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸1〜703はhuTLR3の予想される細胞外ドメイン(ECD)と一致している。多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるさまざまな方法において、TLR3タンパク質を提示することにより、huTLR3と特異的に結合したFabフラグメント(Fab)を選別した。手法の異なるパニングにより、62種類の候補物質(V領域配列が異なる)をhTLR3のECDに結合する固有の物質として同定した。
インビトロでのTLR3アンタゴニスト活性の判定
上記に述べたCDRを成熟させた15種類の候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選択し、結合範囲及び中和活性を調べた。4種類の親Fab(Fab 16〜19)及びCDR成熟させた15種類のFab(Fab 1〜15)又はこれらの非生殖細胞V領域変異体についての、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。
熱で不活化したFBSを添加したDMEM及びGlutaMax培地(Invitrogen,Carlsbad,CA)中で293T細胞を増殖させ、pNF−κB又はISREホタルルシフェラーゼレポータープラスミド30ng、pcDNA3.1ベクター13.5ng、phRL−TK 5ng、及びFLTLR3をコードするpCDNA(配列番号2)1.5ngをトランスフェクトした。phRL−TKプラスミドは、HSV−1チミジンキナーゼプロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(Promega,Madion,WI)を有している。TLR3抗体を30〜60分インキュベートした後、ポリ(I:C)(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を加えた。各プレートを37℃で6時間又は24時間インキュベートした後、DualGloルシフェラーゼ試薬を加えて各プレートをFLUOstarプレートリーダーで読み取った。ホタルルシフェラーゼの相対発光量(RLU)をウミシイタケルシフェラーゼのRLUで割ることによって、正規化された値(ルシフェラーゼ比)を求めた。ホタルルシフェラーゼの産生を刺激するNF−κB又はISREシグナル伝達カスケードは、TLR3アゴニストであるポリ(I:C)(1μg/mL)による刺激前に、細胞を抗TLR3抗体(0.4、2.0及び10μg/mL)とインキュベートすることによって特異的に阻害された。NF−κBアッセイの結果を図1に示す。図中、5465をポジティブコントロール(抗ヒトTLR3 mAbを中和する)として、また抗ヒト組織因子mAb(859)をヒトIgG4アイソタイプコントロールとして用いて、ホタル/ウミシイタケ比の阻害率(%)を表す。0.4〜10μg/mLのmAb濃度で50%を上回る阻害率が得られた。c1068及びTLR3.7は、10μg/mLでTLR3の生物活性の約38%及び8%を阻害した。同様の結果がISREレポーター遺伝子アッセイで得られた(データは示されていない)。
BEAS−2B細胞(SV−40で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞)を、I型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトTLR3抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした後、ポリ(I:C)を加えた。処理の24時間後に上澄み液を回収し、IL−6、IL−8、CCL−2/MCP−1、CCL5/RANTES及びCXCL10/IP−10の検出用にカスタムしたマルチプレックスビーズアッセイを用いて、サイトカイン及びケモカインレベルについてアッセイした。結果を、0.4、2.0及び10μg/mLのmAbで処理した後の、サイトカイン/ケモカインの個別の阻害率(%)として図2に示す。5465はポジティブコントロールであり、859はアイソタイプコントロールである。
サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮(NHBE)細胞(Lonza,Walkersville,MD)においてもアッセイした。NHBE細胞を増殖させ、コラーゲンコーティングした培養皿に移して48時間インキュベートした後、培地を除去して0.2mLの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトTLR3 mAbの存在下又は非存在下で60分間インキュベートした後、ポリ(I:C)を加えた。24時間後に上澄み液を回収し、−20℃で保存するか、又は直ちにIL−6のレベルについてアッセイした。結果を、投与量0.001〜50μg/mLでのmAb処理後の、IL−6分泌の阻害率(%)として図3にグラフで示す。5465はポジティブコントロールであり、859はアイソタイプコントロールである。大部分のmAbは1μg/mLでIL−6の産生の少なくとも50%を阻害し、5μg/mLで阻害率75%を達成した。
サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)においてもアッセイした。ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにFicoll−Paque Plus溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してFicollの直ぐ上に白色の層を形成しているPBMCを回収して播種した。この後、PBMCを抗ヒトTLR3 mAbの存在下又は非存在下でインキュベートした後、25μg/mLのポリ(I:C)を加えた。24時間後に上澄み液を回収し、Luminex法によってサイトカインのレベルを調べた。5465をポジティブコントロールとし、hIgG4をアイソタイプコントロールとして用い、mAbの単回用量(0.4μg/mL)によるIFN−γ、IL−12及びIL−6の累積阻害率(%)として、結果を図4にグラフ化して示す。
簡潔に言えば、500ng/mLのポリ(I:C)及び10ng/mLのTNF−αの相乗効果のある組み合わせを添加する前に、ヒト気道平滑筋(HASM)細胞を、抗ヒトTLR3 mAbsの存在又は非存在下でインキュベートした。24時間後に上澄み液を回収し、Luminex技術を用いて、サイトカインレベルを求めた。結果を、3段階の容量(0.4、2及び10μg/mL)でmAbを用いた場合のケモカインCCL5/RANTESのレベルとして図5にグラフで示す。5465はポジティブコントロールであり、hIgG4はアイソタイプコントロールである。
完全長の抗体コンストラクト
4種類の親Fab(候補物質番号16〜19)及び15種類の子孫Fab(候補物質番号1〜15)の重鎖をS229P Fc変異を有するヒトIgG4バックグラウンド上にクローニングした。候補物質9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ又は15EVQを、F235A/L236及びS229P Fc変異を有するヒトIgG4バックグラウンド上にクローニングした。
抗TLR3 mAbの結合の特性評価
ヒトTLR3の細胞外ドメイン(ECD)に対するmAbの結合のEC50値をELISAによって求めた。ヒトTLR3のECDタンパク質をPBSで2μg/mLに希釈し、100μLの一定分量を96穴プレート(Corning Inc.,Acton,MA)の各ウェルに分配した。4℃で一晩インキュベートした後、PBSに0.05%のTween−20(Sigma−Aldrich)を加えた洗浄緩衝液によりプレートを3回洗浄した。ウェルを2%のI−Block(Applied Biosystems,Foster City,CA)及び0.05%のTween−20/PBSからなる200μLのブロッキング溶液によりブロッキングした。室温で2時間ブロッキングした後、プレートを3回洗浄し、続いてブロッキング緩衝液に希釈した抗TLR3 mAb候補物質1〜19を連続的に添加した。
競合的エピトープ結合
抗TLR3抗体競合グループ又は「エピトープビン」を決定するためにエピトープ結合実験を行った。
エピトープマッピング
実施例5で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピングのために選択した。エピトープマッピングを、TLR3セグメント交換実験、変異誘発、H/D交換、及びインシリコタンパク質−タンパク質ドッキングを含む各種のアプローチを用いて行った(The Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,Volume 6,GlenE.Morrised.,1996)。
熱安定性が向上した変異体の作製
結晶構造に基づいた機能改変(Structure−based engineering)を行って高い熱安定性を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物活性を維持しつつ免疫原性を最小に抑えようと試みた。
代替抗TLR3抗体の作製
実施例1で作製したヒト化抗体がマウスTLR3に対して充分な特異性もアンタゴニスト活性も有さなかったことから、本明細書ではmAb 5429と命名するキメラアンタゴニストのラット/マウス抗マウスTLR3抗体を作製して、さまざまなインビボモデルにおいてTLR3シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代替キメラmAb 5429及びその親ラット抗マウスTLR3抗体c1811はインビトロ及びインビボでマウスのTLR3シグナル伝達を阻害し、マウスのいくつかの疾患モデルにおいて発症機構を改善した。
通常の方法を用いて生成させた、遺伝子組み換え型マウスTLR3の外部ドメイン(配列番号162のアミノ酸1〜703、GenBank Acc.No.NP_569054)により、CDラットに免疫性を与えた。マウスTLR3に特異的な抗体力価を示す2匹のラット由来のリンパ球を、FO骨髄腫細胞に融合した。マウスTLR3に反応性のあるモノクローナル抗体のパネルを同定し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胎児線維芽細胞アッセイにおいて、インビトロアンタゴニスト活性について試験した。ハイブリドーマ株C1811Aを更なる研究のために選択した。ハイブリドーマによって分泌されるmAb c1811から、機能性可変領域の遺伝子を配列決定した。次いで、クローニングされた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入し、mAb 5429と表示されるキメララット/Balb C muIgG1/κ mAbを常法によって作製するためのコード配列を得た。抗体を実施例3で述べたようにして発現させた。mAb 5429の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号164及び配列番号163にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号166及び配列番号165にそれぞれ示す。mAb c1811の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号168及び配列番号167にそれぞれ示す。
mAb 5429を、TLR3シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビトロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。
マウスTLR3のcDNA(配列番号161、GenBank受諾番号NM_126166)をマウス脾臓cDNA(BD Biosciences,Bedford,MA)からPCRによって増幅し、標準的な方法を用いてpCEP4ベクター(Life Technologies,Carslbad,CA)にクローニングした。200μLのHEK293T細胞を、完全DMEM中、4×104細胞/ウェルの濃度で96穴白色透明底プレートに播種し、30ngのpNF−κBホタルルシフェラーゼ(Stratagene,Carslbad,CA)又は30ngのpISREホタルルシフェラーゼ(BD Biosciences,Bedford,MA)、5ngのphRL−TKコントロールウミシイタケルシフェラーゼ(Promega Corp.,Madison,WI)レポータープラスミド、1.5ngの完全長マウスTLR3をコードするpCEP4、及び13.5ngの空のpcDNA3.1ベクター(Life Technologies,Carslbad,CA)を使用して、翌日Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.,Carslbad,CA)を用いて全DNA量を50ng/ウェルとし、トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの24時間後、細胞を抗マウスTLR3抗体と新鮮な無血清DMEM中で37℃で30分〜1時間インキュベートした後、0.1又は1μg/μLのポリ(I:C)を加えた。24時間後にDual−Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega,Madison,WI)を使用してプレートを回収した。相対的な光量単位を、FLUOstar OPTIMA多重検出リーダーを使用し、OPTIMALソフトウェア(BMG Labtech GmbH,Germany)により測定した。標準化された値(ルシフェラーゼ比)はホタルルシフェラーゼの相対光量単位(RLU)をウミシイタケルシフェラーゼのRLUで割ることによって得た。mAb 5429、並びにその親mAb c1811及びmAb 15(表3a)が、用量依存的にポリ(I:C)誘発NF−κB及びISRE活性化を低下させたことから(図8A及び8B)、TLR3の活性を中和するこれらの抗体の能力が実証された。ISREアッセイにおいて測定されたIC50は、mAb 5249、mAb 15及びmAb c1811についてそれぞれ0.5、22、及び0.7μg/mLであった。
C57BL/6 MEF細胞をArtis Optimusより入手した(Opti−MEF(商標)C57BL/6−0001)。200μLのMEF培地(glutamax、10%熱失活FBS、1×NEAA、及び10μg/mLゲンタマイシンを加えたDMEM)中の細胞を、96穴平底プレート(BD Falcon)に20,000細胞/ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、37℃/5%CO2で行った。播種の24時間後に、mAb 5429又はmAb c1811を各ウェルに加えた。プレートをmAbと1時間インキュベートした後、各ウェルにポリ(I:C)を1μg/mL加えた。24時間のインキュベーションの後、上澄み液を回収した。ビーズキット(Invitrogen Corp.,Carslbad,CA)を用い、サイトカインレベルを定量して、CXCL10/IP−10を製造者のプロトコールに従って検出した。結果をGraph Pad Prismソフトウェアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリ(I:C)誘発CXCL10/IP−10レベルを用量依存的に低下させたことから、これらの抗体が、内因性のTLR3を中和してTLR3シグナル伝達を阻害する能力が実証された(図9)。
各群10匹ずつのC57BL/6及びTLR3ノックアウトマウス(TLR3 KO)(C57BL/6バックグラウンド;雌、8〜12週齢、Ace Animals,Inc.)に1mLの3%チオグリコレート培地(Sigma)を腹腔内投与し、96時間後にマウスを安楽死させ、各マウスから得た腹膜を10mLの滅菌PBSで洗浄した。チオグリコレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをPBS中に再懸濁し、細胞の生存率をTrypan Blue染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、250μLのFACS緩衝液(PBS−Ca2+−Mg2+、1%熱失活FBS、0.09%アジ化ナトリウム)に再懸濁し、濡れた氷上に保持した。CD16/32試薬(eBioscience)を10μg/106細胞に10分間使用してマクロファージ上のFc受容体をブロッキングした。細胞を100μL/ウェル中、106個細胞で分配して、表面染色を行った。Alexa−Fluor 647(Molecular Probe)−接合mAb c1811及びmAb 1679(TLR3特異性を有さないことからアイソタイプコントロールとして用いられるラット抗マウスTLR3抗体)を0.25μg/106個細胞で加え、氷上、暗所で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、250μLのFACS緩衝液に再懸濁した。生存率染色として7−AAD(BD Biosciences,Bedford,MA)を5μL/ウェルで30分を超えないように加えた後、FACS Caliburにより試料を取得して死細胞集団を検出した。Cell Quest Proソフトウェアを使用してFACS Caliburにより、試料を採取した。収集したデータを、FCS Expressを使用してヒストグラムを作成することによって解析した。
TLR3抗体アンタゴニストはTLR3介在型の全身性炎症を防御する
モデル
ポリ(I:C)誘発全身性サイトカイン/ケモカインモデルを、TLR3介在性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、ポリ(I:C)(PIC)を腹腔内投与することで、TLR3によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した。
腹腔内投与されたポリ(I:C)は、TLR3ノックアウト動物においてケモカイン及びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、TLR3によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した(表9A)。TLR3依存性のポリ(I:C)誘導型メディエーターは、ポリ(I:C)ポストチャレンジ1時間では、IL−6、KC、CCL2/MCP−1及びTNF−αであり、ポリ(I:C)ポストチャレンジ4時間では、IL−1α、CCL5/RANTES及びTNF−αであった。mAb c1811及びmAb 5429は、両方ともこれらのTLR3依存性のメディエーターのレベルを著しく低下させ、抗体がインビボでTLR3シグナル伝達を低下させる能力を実証した(表9B)。表9中の値は、6匹の動物/群±SEMのpg/mLでの平均のサイトカイン又はケモカイン濃度として示したものである。これらのデータは、TLR3の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなどの状態における過剰なTLR3介在サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえで有用となり得ることを示唆するものである。
TLR3抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する。
モデル
気道過敏症をポリ(I:C)によって誘発させた。
過去の観察により、ポリ(I:C)の鼻腔内投与はマウスの肺機能にTLR3によって介在される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィー(BUXCO)におけるベースラインのエンハンストポーズ(PenH)測定値が高くなり、霧状化されたメタコリンに対する応答性が高くなることが示されている(国際公開第06/060513(A2)号)。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症性サイトカイン/ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけるポリ(I:C)誘発障害におけるmAb 1811及びmAb 5429の作用を、ポリ(I:C)チャレンジに先立ってそれぞれの抗体を50mg/kgで皮下投与することによって評価した。
TLR3抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患を防御する。
モデル
DSS大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。
大腸、結腸、及び直腸の2つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すなわち、(i)単一の細胞の壊死、(ii)上皮の潰瘍形成、(iii)上皮の脱落、(iv)陰窩腫瘍、(v)細胞増殖、(vi)陰窩細胞増殖、(vii)粘膜固有層における肉芽組織形成、(viii)粘膜下組織における肉芽組織、(ix)粘膜下炎症性細胞の浸潤物、好中球優位性、及び(x)粘膜下浮腫。
0−所見を認めず。
1−軽度、限局性、又は時折認められる。
2−軽度、多病巣である。
3−中度、頻繁だが限定された領域に認められる。
4−重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に認められる。
5−極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。
過去の観察によれば、TLR3ノックアウト動物は、DSSの摂取によって誘発された炎症性腸疾患のモデルにおいて、野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所見を示すことが実証されており(国際公開第06/60513(A2)号)、このことはTLR3シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を有することを示唆するものである。壊死細胞から放出される共生生物のバクテリアRNA又は哺乳類RNAは、内因性リガンドとして作用して、TLR3シグナル伝達を刺激することができ(Karikoら、Immunity 23165〜231175 2005;Karikoら、J.Biol.Chem.279:12542〜12550 2004)、それゆえ、腸中の内因性リガンドによるTLR3刺激は、DSS大腸炎モデルにおける炎症を増進させ、及び持続させ得るということが報告された。
T細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能のあるマウスから得た制御性T細胞を含まないナイーブT細胞(腸粘膜の抗原提示細胞を攻撃する)の集団を移植することによって、SCIDマウスに腸の炎症を誘発した。
コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下(p<0.05)(図15A)によって評価されるように、疾患重篤度は、T細胞移植を受けた動物において抗TLR3抗体による処置に応じて改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発(transmural involvement)を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下が認められた(いずれもp<0.05)(図15B)。抗TNFα抗体を、最適な効果を与えることが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。
TLR3抗体アンタゴニストはコラーゲン誘導性関節炎を防御する。
モデル
コラーゲン誘導性関節炎(CIA)モデルを関節リウマチのモデルとして用いた。
0−正常
1−後肢又は前肢関節が冒される、すなわちわずかなびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
2−後肢又は前肢関節が冒される、すなわち軽度のびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
3−後肢又は前肢関節が冒される、すなわち中度のびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
4−顕著なびまん性紅斑及び腫脹、すなわち4本の指関節が冒される。
5−足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹を呈し、指を曲げられない。
II型コラーゲン誘導関節炎の病変を有するマウスの肢又は足首関節をスコアリングする場合、変化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨/中足骨/指又は足根骨/脛足根骨の多数の可能性のある関節のうち、1〜3個のみの足又は足首の関節が冒されている場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの1、2又は3の最大スコアが任意に与えられる。2個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された/大多数の関節に下記の基準を適用する。
0−正常
1−冒された関節の滑膜及び関節周囲組織に炎症性細胞が最小限に浸潤している。
2−軽度の浸潤を呈している。足の場合には、冒された関節に限定された軽度の浸潤を呈している。
3−中度の浸潤を呈している。足の場合には、冒された関節に限定された中度の浸潤を呈している。
4−大部分の領域が顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤を呈している。
5−重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤を呈している。
0−正常
1−軟骨及び肋軟骨下骨にパンヌスが最小限に浸潤している。
2−冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう浸潤を呈している。
3−冒された関節の中度の高組織破壊をともなう中度の浸潤を呈している。
4−大部分の関節で関節構造の顕著な破壊をともなう顕著な浸潤を呈している。
5−関節構造の全体的又はほぼ全体的な破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒している。
0−正常
1−トルイジンブルー染色が最小限〜軽度に損なわれている。冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認められない。
2−トルイジンブルー染色が軽度に損傷を受けている。冒された関節に限局性の軽度(表在性)の軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊が認められる。
3−トルイジンブルー染色が中度に損傷を受けている。冒された関節に多病巣性の中度(深部又は中間層)の軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊が認められる。
4−トルイジンブルー染色が顕著に損傷を受けている。大部分の関節に多病巣性の顕著な(深部〜深層)軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊が認められる。
5−トルイジンブルー染色が重度に損傷を受けている。すべての関節に多病巣性の重度(深部〜タイドマーク)の軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊が認められる。
0−正常
1−小さい範囲の吸収が認められ、最小の程度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節に破骨細胞をほとんど認めない。
2−より多くの範囲の吸収が認められ、軽度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
3−皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁(medullary trabecular)及び皮質骨の明らかな吸収が、中度に生じている。一部の髄様骨梁が損傷し、病変が低倍率で明瞭に確認できる。冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
4−残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損が、顕著な程度に生じている。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞が認められる。大部分の関節が冒されている。
5−皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊が認められる。重度。
デキサメタゾン(Dex)及び抗マウスTNF−α抗体をポジティブコントロールとして用い、PBSを溶媒コントロールとして用い、CVAMをネガティブコントロール抗体として用いた。すべての処置は、実験の12日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験22日目までに100%となった。溶媒又はCVAM抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高かった。Dex(d18〜d26についてp<0.05)、5mg/kgの抗TNF−α抗体(d18〜26についてp<0.05)、又は25mg/kgのmAb 5429(d18〜d23及びd25〜d26についてp<0.05)で処置した各群では有意に低い臨床スコアが認められた(図16)。曲線下面積(AUC)として表した臨床的関節炎スコアは、25mg/kgのmAb 5429(低下率43%)、5mg/kgの抗TNF−α抗体(52%)、又はDex(69%)による処置により、溶媒コントロールと比較して有意に低下した。図17は、各群についてAUCの平均及び標準偏差を示す。
TLR3抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染を防御する。
モデル
インフルエンザAウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして使用した。
0−正常。機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候が認められない。
1−毛皮が逆立っている。歩行のわずかな低下が認められるか、又は認められない。
2−歩行時に背中が曲がっている。歩行をいやがる。呼吸困難である。
3−毛皮が逆立っている。呼吸困難である。運動失調。震えが生じている。
4−毛皮が逆立っている。そっと突いても歩行不可能。意識不明。触れると冷たく感じる。
5−死亡。
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。mAb 5429(20mg/kg)を投与したインフルエンザA感染野生型マウス及びmAb 5429を投与しないインフルエンザA感染TLR3ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種したC57BL/6マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大した(それぞれp<0.001及びp<0.01)。このことは、TLR3の阻害又は欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防し得ることを示すものである(図18)。臨床スコアは、20mg/kgのmAb 5429を投与した群、及びTLR3ノックアウト群において有意に低下した(図19)。マウスの体重をインフルエンザウイルス投与後14日間にわたって観察した。インフルエンザAウイルスを投与したC57BL/6マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、20mg/kgのmAb 5429を投与したC57BL/6マウス及びTLR3ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種した野生型C57BL/6マウスに対して有意に大きな体重を示した(図20)。これらの結果は、TLR3抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、TLR3アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。
TLR3抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血症インスリンを低下させる。
モデル
食餌誘発型肥満(DIO)モデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルとして用いた。
高脂肪の食餌を12〜16週間与えた後、野生型DIO動物は高血糖及び高インスリンとなった。mAb 5429による処置により、野生型DIO動物では耐糖能が改善したがTLR3ノックアウトDIO動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの60、90、120及び180分後に、mAb 5429で処置した動物においてコントロール(PBSのみ)と比較して有意に低い血中グルコース濃度が観察された(図21A)。mAb 5429で処置した野生型DIO動物では、mAbを投与しない野生型DIOマウスと比較してAUCの約21%の低下が観察された。mAb 5429で処置した野生型DIO動物では空腹時インスリンレベルも低下した(図22)。TLR3ノックアウトDIO動物では、mAb 5429による処置により空腹時インスリンに改善は認められなかった。インスリン抵抗性指数(Homeostatic model assessment)(HOMA)分析は、mAb 5429で処置した野生型DIO動物においてインスリン感受性の改善を示したが、TLR3ノックアウトDIO動物では改善を示さなかった。HOMA−IR値は、野生型DIO、5mg/kgの野生型DIO(mAb 5429投与)、及び20mg/kgの野生型DIO(mAb 5429投与)動物で、それぞれ14.0±9.8、8.7±4.9、9.0±3.0であった。TLR3ノックアウトDIO動物では何の効果も認められなかった。
TLR3抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応を防御する。
試薬
細菌性増悪したCOPD患者から単離された分類不能型ヘモフィルスインフルエンザ(Nontypeable Haemophilusインフルエンザ)(HNTHi)株35をDr.T.F.Murphy(Buffalo VA Medical Center,Buffalo,NY)より入手した。ヒトライノウイルス16を、アメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)よりTCID(50)=2.8×107/mLのものを入手した。
NHBE細胞(Lonza,Wakersville,MD)をMicrotest 96穴組織培養プレート(BD Biosciences,Bedford,MA)に1×105/ウェルで播いた。寒天プレート上で16〜20時間増殖させたNTHiを増殖培地に約2×108cfu/mlで再懸濁し、100μg/mlのゲンタマイシンで30分間処理してから約2×107/ウェルでNHBEを含む96穴プレートに加えた。3時間後に上澄み液を除去し、抗体(0.08〜50μg/mLの最終濃度)を添加又は非添加の新鮮な増殖培地に交換した。更に24時間インキュベートした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在を、Luminex 100IS多重蛍光分析器及びリーダーシステム(Luminex Corporation,Austin,TX)でサイトカイン25重ABビーズキット、ヒト(IL−1β、IL−1RA、IL−2、IL−2R、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL12p40p70、IL−13、IL−15、IL−17、TNF−α、IFN−α、IFN−γ、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、IP−10、MIG、エオタキシン、RANTES及びMCP−1を含む)によって3重にアッセイした。
NHBE細胞をMicrotest 96穴組織培養プレート(BD Biosciences,Bedford,MA)に1×105細胞/ウェルで播いた。翌日、抗体(0.08〜50μg/mLの最終濃度)をNHBE又はBEAS−2B細胞に加えて1時間インキュベートした後、10μL/ウェルのライノウイルスを加えた。更に24時間インキュベーションした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在について上記に述べたようにluminexアッセイによってアッセイを行った。
mAb 15EVQが、NTHiにより誘導されたIP−10/CXCL10及びRANTES/CCL5の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体であるヒトIgG4(Sigma,Louis,MO)はNTHiによる刺激に対して阻害作用を示さなかった(図23A)。mAb 15EVQは、ライノウイルスにより誘導されたCXCL10/IP−10及びCCL5/RANTESの産生も阻害した(図23B)。
TLR3抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する。
方法
2人のドナーから得た正常なヒト星状細胞(Lonza,Walkersville,MD)を24穴プレートに75,000細胞/ウェルで播き、一晩接着させた。翌日、星状細胞を200ng/mLのポリ(I:C)及び/又は10μg/mLのmAb 18で24時間処理した。サイトカインをLuminexによって測定した。
表10に示すように、ポリ(I:C)により誘導されたIL−6、IL−8、IL−12、IFN−α、IFN−γ、CXCL9/MIG、CCL3/MIP−1a、CCL4、CCL5/RANTES及びCXCL10/IP−10の産生はmAb 18によって阻害された。
TLR3抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する。
方法
HUVEC細胞(Lonza,Walkersville,MD)をロンザ社の推奨する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地(Lonza,Walkersville,MD)に再懸濁し、96穴プレートに3×105細胞/mLで播き、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。ポリ(I:C)(GE Healthcare、Piscataway,NJ)を濃度を増加させながら(1.5〜100μg/mL)加え、更に24時間37℃でインキュベートした。サイトカイン阻害アッセイを行うため、mAb 15EVQを細胞に異なる濃度(0〜50μg/mL)で加えて30分間インキュベートし、その後、20μg/mLのポリ(I:C)を24時間加えた。細胞上澄み液を回収し、ヒトサイトカイン30重キット及びLuminex MAP技術(Invitrogen Corp.,Carslbad,CA)を用いてサイトカインレベルを測定した。sICAM−1の発現を測定するため、HUVEC細胞を20μg/mLのポリ(I:C)及び異なる濃度のmAb 15EVQ(0.8〜50μg/mL)で処理した。細胞上澄み液をELISA(R&D Systems)によりsICAM−1の発現について分析した。細胞の生存率をCellTiterGloキット(Promega,Madison,WI)により測定した。
HUVEC細胞は、ポリ(I:C)に応答して次のサイトカインを産生した:IL−1RA、IL−2、IL−2R、IL−6、IL−7、CXCL8/IL−8、IL−12(p40/p70)、IL−15、IL−17、TNF−α、IFN−α、IFN−γ、GM−CSF、CCL3/MIP−1α、CCL4/MIP−1β、CXCL10/IP−10、CCL5/RANTES、CCL2/MCP−1、VEGF、G−CSF、FGF−basic、及びHGF(表11)。mAb 15EVQは、ポリ(I:C)により誘導される全サイトカインのレベルを用量依存的に低下させた(表12)。ポリ(I:C)により誘導されるTNF−α、CCL2/MCP−1、CCL5/RANTES、及びCXCL10/IP−10の産生を低下させるmAb 15EVQの能力は、TLR3により介在される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながり得る白血球及びT細胞の浸潤に対する防御を与え得ることを示唆するものである。更に、mAb 15EVQによるVEGFの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含む、VEGFによって介在される病態におけるTLR3の遮断の潜在的な効果を示唆するものである。
TLR3抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスTLR3との交差反応性
実施例2で述べたようにISREレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又はマウスTLR3に対する活性を評価した。カニクイザル(配列番号217)及びマウスTLR3 cDNA(配列番号161)を全血から増幅し、pCEP4ベクター(Clontech)の中にクローニングし、及び上述のように発現させた。mAb 15EVQは、ヒトTLR3 NF−κB及びISREアッセイにおけるそれぞれ0.44及び0.65μg/mLのIC50と比較して、cyno NF−κB及びISREアッセイにおいてそれぞれ4.18μg/mL及び1.74μg/mLのIC50を有していた。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何の作用も示さなかった。
TLR3抗体アンタゴニストの治療用投与は、急性の致命的なウイルス感染症を防御する。
実施例14は、インフルエンザA感染症に対するTLR3抗体アンタゴニストによる予防的な治療(−1、4、8、及び12日目に投与)について述べている。この実施例は、TLR3抗体アンタゴニストの治療用投与(インフルエンザA感染後臨床症状の発症3日後)が生存率の向上において効果的であるということを実証している。
動物へのmAb 5249の投与をインフルエンザAの感染後3日後に行ったこと、及び投与した動物が8週齢であったことを除いて、インフルエンザAウイルスチャレンジモデルを、実施例14に述べたように急性の致命的なウイルス感染症のモデルとして使用した。抗マウスIgG1アイソタイプコントロールmAbはBioLegendからのものであった。インフルエンザAの感染後3、7及び11日に動物に投与した。
X線結晶法によるTLR3抗体アンタゴニストのエピトープ及びパラトープ。
ヒトTLR3細胞外ドメインを、mAb 15EVQ、mAb 12QVQ/QSV及びmAb c1068のFabsと複合体の状態で結晶化させた。
タンパク質の発現及び精製。
TLR3 ECD(配列番号2のアミノ酸1〜703)の3つのFabの発現及び精製は上述の通りであった。
1TLR3 ECD:1.1Fabのモル比に対応させて、4mgのヒトTLR3 ECDを2.4mgのそれぞれのFabと混合し、4℃で3.5時間インキュベートした。複合体をアニオン交換クロマトグラフ法により20mMのTris(pH 8.5)、10%のグリセロール(緩衝液A)で平衡化したMonoQ5/50GLカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)で精製し、20mMのTris(pH 8.5)、10%のグリセロール、1MのNaCl(緩衝液B)により溶離した。1.74mL中のほぼ2.48mgの複合体を緩衝液Aにより10mLまで希釈し、カラム上に1mL/minで充填し、B濃度の0〜40%の直線的な勾配により40カラム容積にわたって溶離した。5回の連続的な精製操作を行った。ピーク1由来の区分をプールし、Amicon−15mLのUltra−30000 MWCO及びMicrocon 30000 MWCOにより20mMのTris(pH 8.5)/27mMのNaCl/10%グリセロール中に、14.49mg/mLまで濃縮した(吸光係数:A280(1mg/mL)=1.31)。
Corningプレート3550(Corning Inc.,Acton,MA)を用いて等容量のタンパク質及びリザーバ溶液を、シッティングドロップ法で分注するOryx4自動タンパク質結晶化ロボット(Douglas Instruments)を用いて、自動化結晶化スクリーニングを行った。初期のスクリーニングは、Hampton Crystal Screen HT(HR2−130,Hampton Research,Aliso Viejo,CA)により実施した。いくつかの条件から、小さい結晶を使用してシードを生成し、次いでこれをMicroseed−Matrix Screening(MMS)で使用した。小さい結晶を与える初期のスクリーニング条件に基づき、何回かの精密化を行った。MMSに使用するリザーバ条件は、精密化後に小さい結晶を与えた条件に基づくものであった:18〜28%のポリエチレングリコール(PEG)3350、1MのLiCl、pH4.5及び2.0〜2.9Mの(NH4)2SO4、5%のPEG400、pH4.5、及び探索したpH及び異なる添加物。成分を1タンパク質溶液:0.25シード原料:0.75リザーバ溶液の容量比で分注することにより、Oryx4自動タンパク質結晶化ロボット(Douglas Instruments)を用いて、MMS結晶化スクリーニングを行った。〜10Åの分解能で回折する結晶は、0.1Mの酢酸Na(pH 4.5)、2.9Mの(NH4)2SO4、5%メチル−ペンタン−ジオール(MPD)及び0.1Mの酢酸Na(pH 4.5)、26%のPEG3350、1MのLiClから成長させたものであった。
X線データを収集するために、結晶(サイズ約1.0×0.5×0.1mm3)を、合成母液(0.1Mの酢酸Na(pH 4.5)、28% PEG 3350、1MのLiCl、16%グリセロール)中に数秒浸漬し、窒素流中100Kで瞬間凍結した。X線回折データを収集し、Osmic(商標)VariMax(商標)共焦光学系、Saturn 944 CCD検出器、及びX−stream(商標)2000低温冷却システムを備えたRigaku MicroMax(商標)−007HF微小焦点X線発生装置(Rigaku,Woodlands,TX)を使用して処理した。回折強度を、1/2度の像当たり1minの露出時間、5Åの最大分解能で250°(結晶回転)にわたって検出した。X線データを、プログラムD*TREK(Pflugrath,Acta Crystallographica Section D,55:1718〜1725,1999)により処理した。この結晶は、単位セルパラメーター:a=214.90Å、b=142.08Å、c=125.04Å、及びβ=103.17の単斜晶系空間群C2に属する。この非対称ユニットには1分子の複合体を含む。X線データ統計値を表13に示す。
TLR3 ECD−Fab 15EVQ−Fab 12QVQ/QSV−Fab c1068の結晶構造を、Phaser(Read,Acta Crystallogr.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57:1373〜1382,2001)を用い分子置換により決定した。探索モデルはTLR3 ECD(すべてのグルカンを取り除いた、タンパク質データバンク(PDB)構造番号1ziw,Choeら、Science 309:581〜585,2005)であり、3つのFabの高分解能結晶構造を決定した(これらのFab構造に対する結晶データ及び精密化統計値の要約としては表13を参照のこと)。Fab 12QVQ/QSVのエルボー角度は、遊離形態におけるものから著しくはずれていることが判明した。エルボー角度を約5°間隔で調整することにより、一連のFab 12QVQ/QSVモデルを生成し、その1つが電子密度とよく一致することが判明した。構造精密化をPHENIX(Adamsら、J.Synchrotron Radiat.11:53〜55,2004)により行った。TLR3 ECDに対して構造を、Fab及び13個の剛体セグメント(精密化で使用される定義:30〜60、61〜108、109〜156、157〜206、207〜257、258〜307、308〜363、364〜415、416〜464、465〜514、515〜570、571〜618、619〜687)に対する剛体ドメイン(各V又はCドメイン)として、それぞれのFab剛体に対する1つのB因子及びTLR3 ECD全体に対する単一のB因子によって精密化した。
TLR3 ECD−3つのFab四次複合体の分子構造
複合体の全体的な分子構造を図28に示す。非対称単位中に1つのTLR3 ECD及びそれぞれのFabの1分子が存在する。TLR3 ECDに対する構造モデルは、huTLR3(配列番号2)の30〜687個のすべての残基を含む。3つのFabに対しては、それぞれの非結合形からのすべての残基を、溶媒イオン及び水分子を除いて含めた。TLR3 ECD分子は、全体のトポロジー(1ziwに対して0.79Åのrms、613Cα’、及び2a0zに対して1.37Å、595Cα’)において以前に報告された構造と極めて類似している。このFab構造は、方法に記載のFab 12QVQ/QSVのLCDR3、並びにTLR3 ECD/Fab界面におけるエルボー領域及び一部の側鎖を除いて、それぞれの非結合形とすべて同一である。
a Rmerge=Σ|I−<I>|/ΣI、式中、Iは測定された反射の強度であり、<I>はこの反射のすべての測定値の平均強度である。
b Rcryst=Σ||Fobs|−|Fcalc||/Σ|Fobs|、式中、Fobs及びFcalcは測定及び計算された構造因子であり、Rfreeは精密化の前に反射のランダムに選択された5%の組に対して計算されたものである。
c ラマチャンドランプロットをMolProbity(Davis,I.W.ら、Nucleic Acids Res,32:W615−9,2004)により計算した。
TLR3 ECDと3つのFabとの間の結合に関与する残基を、図28Bに示す。Fab 12QVQ/QSVはTLR3 ECDのN末端近くで結合した。立体配置エピトープは、TLR3 LRR 3〜7からの残基(配列番号2のアミノ酸100〜221)から構成されるものであった。Fab 12QVQ/QSVの結合は、抗原及び抗体上でそれぞれほぼ928Å2及び896Å2を埋め込んだ。Fab 12QVQ/QSVに対しては、結晶構造は、次のTLR3(配列番号2)エピトープ残基:S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195、及びA219を同定した。Fab 12QVQ/QSVに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基:軽鎖(配列番号211):G28、S29、Y30、Y31、E49、D50、Y90、D91及びD92、重鎖(配列番号214):N32、Q54、R56、S57、K58、Y60、Y104、P105、F106及びY107を同定した。
mAb 15EVQ:mAb 15EVQエピトープは、TLR3残基N517、H539及びN541を含み、これらはC末端二本鎖RNA結合部位と折りたたみする。(Bellら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:8792〜7,2006).いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、このように、mAb 15EVQは、リガンドに対して結合するTLR3に対して競合し、及びシグナル伝達単位の形成に必要とされる、リガンドにより誘起される受容体二量体化を防止すると考えられる。(Liuら、Science 320:379〜81,2008)。図29は、mAb 15EVQに対するこの直接の競合機構を図示する。抗体濃度に依存して、この機構は、ポリ(I:C)の全阻害又は二本鎖RNAにより誘起されるTLR3活性化を生じる。
Claims (25)
- toll様受容体3(TLR3)の、配列番号2のアミノ酸残基;K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595、及びK619に結合する、単離された抗体又はそのフラグメント。
- toll様受容体3(TLR3)の、配列番号2のアミノ酸残基;S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195、及びA219に結合する、単離された抗体又はそのフラグメント。
- 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又はそのフラグメントであって、抗体が重鎖可変領域のChothia残基;W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、Y100及びD100b並びに軽鎖可変領域のChothia残基;Q27、Y32、N92、T93、L94及びS95により、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする、単離された抗体又はそのフラグメント。
- 次のa〜iの特性のうち少なくとも1つを有する、請求項3に記載の単離された抗体;
a.Kd <10nMでヒトTLR3に結合する;
b.インビトロでのポリ(I:C)NF−κBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50%超低減させる;
c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を60%超阻害する;
d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を50%超阻害する;
e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
g.1μg/mLで、PBMCによる、ポリ(I:C)により誘導されたIFN−γ、IL−6又はIL−12の産生を20%超阻害する;
h.インビトロでのNF−kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50 <10μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する;
i.インビトロでのISREレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50 <5μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する。 - 前記抗体が、アミノ酸12個分の長さの重鎖相補性決定領域(CDR)3(HCDR3)を含む、請求項3に記載の単離された抗体。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号82、86及び84で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域(CDR)1、2及び3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)、並びにそれぞれ配列番号79、80及び87で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1、2及び3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)を含む、請求項3に記載の単離された抗体。
- 軽鎖可変領域カッパー1(Vκ1)フレームワーク(Vκ1)のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の軽鎖フレームワーク及び重鎖可変領域Vh5フレームワーク(Vh5)のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の重鎖フレームワークを含む、請求項3に記載の単離された抗体。
- 前記Vk1フレームワークが、配列番号221で示されるアミノ酸配列を有するIGKV1−39*01によりコードされ、前記Vh5フレームワークが、配列番号222で示されるアミノ酸配列を有するIGHV5−51*01によりコードされる、請求項7に記載の単離された抗体。
- 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又はそのフラグメントであって、抗体が重鎖可変領域のChothia残基;N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99及びY100、並びに軽鎖可変領域のChothia残基;G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92及びD93により、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする、単離された抗体又はそのフラグメント。
- 次のa〜gの特性のうち少なくとも1つを有する、請求項9に記載の単離された抗体;
a.Kd <10nMでヒトTLR3に結合する;
b.インビトロでのポリ(I:C)NF−κBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50%超低減させる;
c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を60%超阻害する;
d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリ(I:C)で刺激されたBEAS−2B細胞からのIL−6又はCXCL10/IP−10の産生を50%超阻害する;
e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリ(I:C)で刺激されたNHBE細胞からのIL−6の産生を50%超阻害する;
g.1μg/mLで、PBMCによる、ポリ(I:C)により誘導されたIFN−γ、IL−6又はIL−12の産生を20%超阻害する。 - 前記抗体が、アミノ酸10個分の長さのHCDR3及びアミノ酸10個分の長さのLCDR3を含む、請求項9に記載の単離された抗体。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号70、77及び72で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域(CDR)1、2及び3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)、並びにそれぞれ配列番号67、68及び78で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1、2及び3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)を含む、請求項9に記載の単離された抗体。
- 軽鎖可変領域カッパー3(Vλ3)フレームワーク(Vλ3)のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の軽鎖フレームワーク及び重鎖可変領域Vh6フレームワーク(Vh6)のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の重鎖フレームワークを含む、請求項9に記載の単離された抗体。
- 前記Vλ3フレームワークが、配列番号223で示されるアミノ酸配列を有するIGLV3−1*01によりコードされ、及びVh6フレームワークが、配列番号224で示されるアミノ酸配列を有するIGHV6−1*01によりコードされる、請求項13に記載の単離された抗体。
- 前記抗体が、次のa〜eのいずれかである、請求項1又は9に記載の単離された抗体又はフラグメント;
a.完全なヒト型抗体;
b.ヒト適合性の抗体;
c.ポリエチレングリコール化抗体;
d.IgG4のイソタイプの抗体;
e.FcドメインがS229P、P235A又はL236A突然変異を含む抗体。 - 請求項1又は9に記載の単離された抗体又はフラグメント及び製薬上許容され得る担体を含む、製薬学的組成物。
- 請求項1又は9に記載の単離された抗体の治療上の有効量を、それらを必要とする患者に、炎症状態を処置又は予防する上で充分な時間にわたって投与することを含む、炎症状態の処置方法。
- 前記炎症状態が、炎症性肺疾患、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、全身性の炎症状態、又は関節リウマチである、請求項17に記載の方法。
- 前記炎症性肺疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道過敏症であるか、又は分類不能型のインフルエンザ菌により誘起される、請求項18に記載の方法。
- 前記全身性の炎症状態が、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群(SIRS)、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、重症急性呼吸器症候群(SARS)、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフルエンザ、肺炎、ショック、又は敗血症である、請求項18に記載の方法。
- 前記炎症状態が消化管潰瘍をともなう、請求項17に記載の方法。
- 前記消化管潰瘍が、炎症性大腸炎、虚血性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎又はリンパ球性大腸炎又は壊死性腸炎をともなう、請求項21に記載の方法。
- 治療上の有効量の請求項1又は9に記載の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、II型糖尿病を処置する上で充分な時間にわたって投与することを含む、II型糖尿病、高血糖症又は高インスリン症の処置方法。
- 治療上の有効量の請求項1又は9に記載の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ウイルス感染症を処置又は予防する上で充分な時間にわたって投与することを含む、ウイルス感染症の処置又は予防方法。
- 前記ウイルス感染症がA型インフルエンザウイルス感染症である、請求項24に記載の方法。
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