BRPI1016191A2 - Antagonista do receptador do tipo-toll 3. - Google Patents

Antagonista do receptador do tipo-toll 3. Download PDF

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BRPI1016191A2
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Fang Teng
Alexey Teplyakov
Jiun Wu Sheng
Yiqing Feng
Katharine Heeringa
Jinquan Luo
Robert Rauchenberger
Mark Rutz
Lani San Mateo
Robert T. Sarisky
Rymond Sweet
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Janssen Biotech, Inc.
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Abstract

antagonistas do receptor do tipo toll 3. a presente invenção refere-se a anticorpos antagonistas do re5 ceptor do tipo toll 3 (tlr3), a polinucleotídeos que codificam os anticorpos antagonistas de tlr3 ou a fragmentos dos mesmos, e a métodos de preparo e ao uso dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGO- NISTAS DO RECEPTOR DO TIPO TOLL 3".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos antagonistas do re- 5 ceptor do tipo Toll 3 (TLR3), polinucleotídeos que codificam os anticorpos antagonistas de TLR3 ou fragmentos dos mesmos, e a métodos de preparo e uso dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os receptores do tipo Toll (TLRs) regulam a ativação da respos- 10 ta imunológica inata e influenciam o desenvolvimento da imunidade adapta- tiva iniciando cascatas de transdução de sinal em resposta a ligantes bacte- rianos, virais, parasíticos e, em alguns casos, ligantes derivados de hospe- deiro (Lancaster et al., J. Physiol. 563:945 a 955, 2005). Os TLRs localiza- dos na membrana plasmática, TR1, TLR2, TLR4 e TLR6, reconhecem os 15 ligantes que incluem componentes proteicos e lipídicos de bactérias e fun- gos. Os TLRs predominantemente intracelulares, TLR3, TLR7 e TLR9, res- pondem ao dsRNA, ssRNA e DNA de CpG não metilado, respectivamente. Acredita-se que a desregulação da sinalização de TLR cause uma pluralida- de de problemas, e estratégias terapêuticas estão sendo desenvolvidas nes- 20 se sentido (Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov. 4:879 a 880, 2005; Reza- ei, Int. Immunopharmacol. 6:863 a 869, 2006; Wickelgren, Science 312:184 a187, 2006). Por exemplo, os antagonistas dos receptores TLR4 e TLRs 7 e 9 estão sendo desenvolvidos clinicamente para uso em sepse severa e lú- pus severo, respectivamente (Kanzler et al., Nat. Med. 13:552 a 559, 2007). 25 A sinalização de TLR3 é ativada por dsRNA, mRNA ou RNA li- berados de células necróticas durante a inflamação ou infecção viral. A ati- vação do TLR3 induz a secreção de interferons e citocinas pró-inflamatórias e aciona a ativação e o recrutamento de células imunes que são protetoras durante certas infecções microbianas. Por exemplo, um alelo de TLR3 domi- 30 nante-negativo foi associado com suscetibilidade crescente à encefalite por Herpes Simplex na infecção primária com HSV-1 na infância (Zheng et al., Science 317:1522 a 1527 2007). Em camundongos, a deficiência de TLR3 está associada à sobrevivência menor frente ao desafio com o vírus Cox- sackie (Richer et al., PLoS One 4:e 4127, 2009). Entretanto, mostrou-se que a sinalização do TLR3 descontrolada ou desregulada contribui para a morbi- dade e a mortalidade em certos modelos de infecção viral, incluindo West 5 Nile, flebovírus, vaccinia, e influenza A (Wang et al., Nat.
Med. 10:1366 a 1373, 2004; Gowen et al., J.
Immunol. 177:6301 a 6307, 2006; Hutchens et al., J.
Immunol. 180:483 a 491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2:E53, 2006). As estruturas cristalinas dos domínios extracelulares de TLR3 10 humanos e murinos foram determinadas (Bell et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (USA), 102:10976 a 10980, 2005; Choe, et al., Science 309:581 a 585, 2005; Liu et al., Science, 320:379 a 381, 2008). A TLR3 adota o formato geral de uma ferradura solenóide decorada por glicanos e tem 23 unidades em tan- dem de motivos de repetições ricas em leucina (LRR). Os sítios de ligação 15 de dsRNA foram mapeados a duas regiões distintas (Liu et al., Science, 320:379 a 381, 2008). Foi proposto que o conjunto de sinalização consiste em 1 dsRNA e dois domínios extracelulares de TLR3 (Leonard et al., Proc.
Natl.
Acad.
Natl.
Acad.
Sci. (USA) 105: 258 a 263, 2008). Foi mostrado que TLR3 aciona mecanismos patogênicos em um 20 espectro de doenças inflamatórias, mediadas pelo sistema imune e autoimu- nes, incluindo, por exemplo, choque séptico (Cavassani et al., J.
Exp.
Med. 205:2609 a 2621, 2008), lesão pulmonar aguda (Murray et al., Am.
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Sci. (USA) 104:7512 a 7515, 2007), doença de 30 fígado autoimune (Lang et al., J.
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Diabetes 57:1236 a 1245, 2008; Lien e Zipris, Curr.
Mol.
Med. 9:52 a 68, 2009). Além disso, mostrou-se que aumentos or-
gão-específicos na expressão de TLR3 estão correlacionados com inúmeras condições patológicas acionadas por respostas inflamatórias locais desregu- ladas, como no tecido hepático na cirrose biliar primária (Takii et al., Lab In- vest. 85:908 a 920, 2005), articulações com artrite reumatóide (Ospelt et al., 5 Arthritis Rheum. 58:3684 a 3692, 2008), e na mucosa nasal de pacientes com rinite alérgica (Fransson et al., Respir.
Res. 6: 100, 2005). Em condições necróticas, a liberação de conteúdo intracelular, incluindo mRNA endógeno aciona a secreção de citocinas, quimiocinas e outros fatores que induzem à inflamação local, facilitam a liberação de resí- 10 duos de célula morta e o reparo de danos.
A necrose frequentemente perpe- tua processos inflamatórios, contribuindo para a inflamação crônica ou exa- gerada (Bergsbaken et al., Nature Reviews 7:99 a 109, 2009). A ativação de TLR3 no sítio da necrose pode contribuir para esses processos inflamatórios anormais e gera um laço de feedback positivo pró-inflamatório adicional a- 15 través dos ligantes de TLR3 liberados.
Portanto, o antagonismo ao TLR3 pode ser benéfico em uma variedade de transtornos que envolvem inflama- ção crônica ou exagerada e/ou necrose.
A modulação negativa da ativação de TLR3 também pode repre- sentar uma nova estratégia de tratamento para indicações oncológicas, in- 20 cluindo carcinomas de célula renal e carcinoma de célula escamosa de ca- beça e pescoço (Morikawa et al., Clin.
Cancer Res. 13:5703 a 5709, 2007; Pries et al., Int.
J.
Mol.
Med. 21:209 a 215, 2008). Além disso, o alelo de TLR3L423F que codifica uma proteína com atividade reduzida foi associado com a proteção contra a degeneração macular avançada "seca" relacionada 25 à idade (Yang et al., N.
Engl.
J.
Med. 359:1456 a 1463, 2008), indicando que os antagonistas do TLR3 podem ser benéficos nessa doença.
Patologias associadas a condições inflamatórias e outras, como aquelas associadas a infecções, têm impactos significativos econômicos e na saúde.
Ainda assim, apesar dos avanços em muitas áreas da medicina, 30 comparativamente, poucas opções de tratamento e terapias estão disponí- veis para muitas dessas condições.
Portanto, há uma necessidade de se suprimir a atividade de
TLR3 para tratar condições associadas a TLR3.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra o efeito de mAbs anti-TLR3 humano (huTLR3) em um teste de gene -repórter de NF- B. 5 As figuras 2A e 2B mostram o efeito (% de inibição) ou mAbs an- ti-huTLR3 em um teste BEAS-2B. As figuras 3A e 3B mostram o efeito de mAbs anti-huTLR3 em um teste NHBE. A figura 4 mostra o efeito de mAbs anti-huTLR3 em um teste de 10 PBMC. As figuras 5A e 5B mostram o efeito de mAbs anti-huTLR3 em um teste de HASM. As figuras 6A, 6B e 6C mostram a ligação de mAbs anti-huTLR3 a mutantes de TLR3. 15 A figura 7A mostra epitopos para mAb 15EVQ (preto) e mAb C1068 (cinza) (imagem superior) e o epitopo para mAb 12QVQ/QSV (preto, imagem inferior) sobreposto na estrutura de ECD de TLR3 humano. A figura 7B mostra o mapa de perturbação de troca H/D localizada de proteína de ECD de TLR3 complexada com mAb 15EVQ. 20 As figuras 8A e 8B mostram o efeito do mAb 5429 de ra- to/camundongo anti-TLR3 de camundongo (substituto) em testes de gene- repórter de A) NF- B e B) ISRE. A figura 9 mostra o efeito dos mAbs substitutos (mAb 5429, mAb c1811) no teste MEF CXCL10/IP-10. 25 A figura 10 mostra a especificidade de ligação do mAb substituto ao TLR3. Painel superior: controle isotípico; painel inferior: mAb c1811. A figura 11 mostra o efeito dos mAbs substitutos em nível penH em um modelo AHR. A figura 12 mostra o efeito dos mAbs substitutos sobre as conta- 30 gens totais de neutrófilos em fluido BAL no modelo AHR. A figura 13 mostra o efeito dos mAbs substitutos sobre os níveis de CXCL10/IP-10 em fluido BAL em modelo AHR.
A figura 14 mostra o efeito do mAb substituto sobre as classifi- cações de histopatologia em um modelo DSS.
A figura 15 mostra o efeito do mAb substituto sobre A) as classi- ficações de histopatologia e B) influxo de neutrófilos em um modelo de trans- 5 ferência de células T.
A figura 16 mostra o efeito do mAb substituto sobre as classifi- cações clínicas em um modelo CIA.
A figura 17 mostra o efeito do mAb substituto sobre as classifi- cações clínicas AUC em um modelo CIA. 10 A figura 18 mostra o efeito do mAb substituto sobre a sobrevida de camundongos C57BL/6 após a administração intranasal de influenza A/PR/8/34. A administração do mAb começou no dia -1. A figura 19 mostra o efeito do mAb substituto sobre as classifi- cações clínicas após a administração de influenza A/PR/8/34. A administra- 15 ção do mAb começou no dia -1. A figura 20 mostra o efeito do mAb substituto sobre o peso cor- poral ao longo de 14 dias após a administração de influenza A/PR/8/34. A administração do mAb começou no dia -1. A figura 21 mostra o efeito dos mAbs substitutos sobre os níveis 20 de glicose sanguínea em animais (A) WT DIO e (B) TLR3KO DIO após o desafio com glicose.
A figura 22 mostra o efeito do mAb substituto sobre os níveis de insulina em animais WT DIO.
A figura 23 mostra o efeito do mAb 15EVQ sobre os níveis de 25 (A) NTHi e (B) CXCL10/IP-10 e CCL5/RANTES induzidos por rinovírus em células NHBE.
A figura 24 mostra o efeito do mAb 15EVQ sobre (A) níveis de sICAM-1 e (B) viabilidade em células HUVEC.
A figura 25 mostra a sobrevida de animais após a administração 30 do mAb substituto 3 dias após a infecção com influenza A.
A figura 26 mostra as classificações clínicas após a administra- ção do mAb substituto 3 dias após a infecção com influenza A.
A figura 27 mostra a alteração do peso corporal de animais após a administração do mAb substituto 3 dias após a infecção com influenza A.
A figura 28 mostra a estrutura molecular do complexo quaterná- rio de ECD de huTLR3 com Fab 12QVQ/QSV, Fab 15EVQ e Fab c1068 em 5 A. em representações de fita e superfície.
O ECD de TLR3 está em cinza claro com a terminação N rotulada como N; todas as moléculas Fab são mostradas em cinza escuro na representação de fitas.
B.
Os epitopos estão coloridos de cinza claro e rotulados no ECD de TLR3 assim como para os Fabs em A.
Nas figuras 28, 29 e 30, os Fab 12QVQ/QSV, Fab c1068 e Fab 10 15EVQ estão abreviados como Fab12, Fab1068 e Fab15, respectivamente, nos rótulos, para clareza.
A figura 29 mostra um mecanismo de neutralização por Fab 15EVQ.
A.
A unidade de sinalização (SU) dsRNA:TLR3 é mostrada com o epitopo de Fab 15EVQ destacado (cinza claro) em um dos dois ECD de 15 TLR3 (cinza claro e escuro, e rotulado como TLR3. O ligante de dsRNA é mostrado como uma dupla hélice em cinza claro.
B.
Uma ilustração da liga- ção de Fab 15EVQ que inibiu estericamente a ligação de dsRNA e inibe, desta forma, a formação da SU.
A ligação de Fab 15EVQ, que tem maior afinidade, evitará a formação da SU ou irá desmontar a SU pré-formada. 20 A figura 30 mostra um mecanismo de Fab 12QVQ/QSV e Fab c1068 e agrupamento de unidades de sinalização (SU) de TLR3. a.
Fab 12QVQ/QSV e Fab c1068 podem se ligar (ou co-ligar) a uma única SU.
B.
Modelo para o agrupamento mais próximo de duas SUs em um dsRNA de cerca de 76 pares de base.
Os três epitopos estão destacados em moléculas 25 diferentes para clareza.
C.
A ligação de Fab 12QVQ/QSV e Fab c1068 evita o agrupamento de SU devido aos encontros estéricos entre os anticorpos e as SUs vizinhas.
As duas setas apontando para a esquerda representam qualitativamente diferentes graus de separação de SUs causados pelos anti- corpos (seta de baixo para Fab 12QVQ/QSV e seta de cima para Fab 30 c1068). A figura 31 mostra a correspondência entre a numeração se- quencial, de Kabat, e de Chothia para anticorpos exemplificadores.
As CDRs e HVs estão destacadas em cinza. A figura 32 mostra o alinhamento de VL do mAb 15EVQ com es- truturas de Vk1 humanas. As alças hipervariáveis de Chothia estão subli- nhadas, os resíduos de paratopo estão com sublinhado duplo e as diferen- 5 ças na estrutura estão destacadas em cinza. Os genes de V 1 são os alelos *01 exceto onde indicado em contrário. A numeração dos resíduos é se- quencial. A figura 33 mostra o alinhamento de VH do mAb 15EVQ com es- truturas de Vh5 humanas. As características da sequência são indicadas tal 10 como na figura 32. A figura 34 mostra o alinhamento de VL do mAb 12QVQ/QSV com as estruturas de Vk3 humanas. As características da sequência são indicadas tal como na figura 32. A figura 35 mostra o alinhamento de VL e VH do mAb 15EVQ ou 15 mAb 12QVQ/QSV com as estruturas de J , J ou Jh humanas. As caracte- rísticas da sequência são indicadas tal como na figura 32.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Um aspecto da invenção é um anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga aos resíduos de aminoácido do recep- 20 tor do tipo Toll 3 (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, L595, e K619 da SEQ ID n° 2. Um outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado ou frag- mento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga aos resíduos de aminoáci- 25 dos do receptor do tipo Toll 3 (TLR3) S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195, e A219 da SEQ ID n° 2. Um outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, 30 ou fragmento do mesmo, sendo do que o anticorpo se liga a TLR3 tendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos Chothia da região variável da cadeia pesada W33, F50, D52, D54, Y56, N58,
P61, E95, Y97, Y100, e D100b e os resíduos Chothia da região variável de cadeia leve Q27, Y32, N92, T93, L94, e S95. Um outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que tem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, 5 ou fragmento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga a TLR3 tendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos Cho- thia da região variável da cadeia pesada N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, F99 e Y100, e os resíduos Chothia da região variável da cadeia leve G29, S30, Y31, Y32, E50, D51, Y91, D92, e D93. 10 Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3, em que o anticorpo tem pelo menos uma dentre as seguintes proprie- dades: a. se liga a TLR3 humano com um Kd de <10 nM; b. reduz a atividade biológica de TLR3 humano em um ensaio in 15 vitro de gene-repórter poli(I:C) NF-kB em >50% a 1 µg/ml; c. inibe >60% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml de poli(I:C) a 10 µg/ml; d. inibe >50% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml de poli(I:C) a 0,4 µg/ml; 20 e. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 5 µg/ml; f. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 1 µg/ml; g. inibe >20% da produção de IFN- , IL-6 ou IL-12 induzidos por 25 poli(I:C) por células PBMC a 1 µg/ml; h. inibe a atividade biológica de TLR3 de macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter NF-kB com IC50 < 10 µg/ml; ou i. inibe a atividade biológica de TLR3 de macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter ISRE com IC50 < 5 µg/ml. 30 Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3 que compete pela ligação de TLR3 com um anticorpo monoclonal, sendo que o anticorpo monoclonal compreende as sequências de aminoáci-
dos de certas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de ca- deia pesada 1, 2 e 3, as sequências de aminoácidos de certas CDRs de ca- deia leve 1, 2 e 3, as sequências de aminoácidos de certas regiões variáveis de cadeia pesada (VH) ou as sequências de aminoácidos de certas regiões 5 variáveis de cadeia leve (VL). Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, e sendo que o anticorpo compreende as sequências de aminoácido de certas regiões determinantes de complementaridade (C- 10 DRs) 1, 2 e 3 de cadeia pesada e as sequências de aminoácidos de certas CDRs 1, 2 e 3 de cadeia leve.
Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3 que compreende a região variável de cadeia pesada e a região variá- vel de cadeia leve, e em que o anticorpo compreende as sequências de a- 15 minoácidos de certas regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as sequên- cias de aminoácidos de certas regiões variáveis de cadeia leve (VL). Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3 que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve e sendo que o anticorpo compreende a sequência de 20 aminoácido de certas cadeias pesadas e a sequência de aminoácido de cer- tas cadeias leves.
Outro aspecto da invenção é uma cadeia pesada de anticorpo isolado que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ.
ID n°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 25 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ou 216. Outro aspecto da invenção é uma cadeia leve de anticorpo iso- lado que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ.
ID n°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 ou 225. 30 Outro aspecto da invenção é uma cadeia pesada de anticorpo isolado que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ.
ID n°: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ou 168.
Outro aspecto da invenção é uma cadeia leve de anticorpo iso- lado que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID n° 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 ou 227. Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que co- 5 difica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende a sequência de a- minoácidos mostrada em SEQ. ID n°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ou 216. Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que co- 10 difica uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de amino- ácidos mostrada em SEQ. ID n°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 ou
225. Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que co- 15 difica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende a sequência de a- minoácidos mostrada em SEQ. ID n°: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ou 168. Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que co- difica uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de amino- 20 ácidos mostrada em SEQ. ID n°: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 ou 227. Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo isolado da invenção e um veículo farmaceuticamen- te aceitável. 25 Outro aspecto da invenção é um vector que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Outro aspecto da invenção é uma célula hospedeira que com- preende o vetor da invenção. Outro aspecto da invenção é um método de fabricação de um 30 anticorpo reativo com TLR3 que compreende cultivar a célula hospedeira da invenção e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira. Outro aspecto da invenção é um método para tratamento ou prevenção de uma condição inflamatória que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessidade do mesmo durante um tempo suficiente para tratar ou evitar a condições inflamatórias. 5 Outro aspecto da invenção é um método para o tratamento ou prevenção de uma condição inflamatória sistêmica, que compreende admi- nistrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado da in- venção a um paciente que tenha necessidade do mesmo durante um tempo suficiente para tratar ou prevenir a condição inflamatória sistêmica. 10 Outro aspecto da invenção é um método para tratar a diabetes tipo II que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz do anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessi- dade do mesmo durante um tempo suficiente para tratar diabetes tipo II. Outro aspecto da invenção é um método para tratar hiperglice- 15 mia que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessida- de do mesmo por um período de tempo suficiente para tratar a hiperglicemia. Outro aspecto da invenção é um método para tratar hiperinsuli- nemia que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamen- 20 te eficaz do anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessi- dade do mesmo por um período de tempo suficiente para tratar a resistência à insulina. Outro aspecto da invenção é um método para tratar ou evitar in- fecções virais que compreende a administração de uma quantidade terapeu- 25 ticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessidade do mesmo durante tempo suficiente para tratar ou evitar infec- ções virais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a paten- 30 tes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão aqui incor- poradas a título de referência como se fossem descritas na íntegra. O termo "antagonista", como usado aqui, significa uma molécula que inibe parcial ou completamente, por qualquer mecanismo, um efeito de outra molécula, como um receptor ou um mediador intracelular.
Conforme usado aqui, um "anticorpo antagonista de TRL3" ou um anticorpo "reativo com TLR3" descreve um anticorpo que é capaz de, 5 direta ou indiretamente, substancialmente agir contra, reduzir ou inibir a ati- vidade biológica de TLR3 ou a ativação do receptor TLR3. Por exemplo, um anticorpo reativo com TLR3 pode se ligar diretamente a TLR3 e neutralizar a atividade de TLR3, isto é, bloquear a sinalização de TLR3 para reduzir a li- beração de citocina e quimiocina ou a ativação de NF- B. 10 O termo "anticorpos", como usado aqui, tem um significado no sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticor- po incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais incluindo anti- corpos monoclonais murinos, humanos, adaptados a seres humanos, huma- nizados e quiméricos, e fragmentos de anticorpos. 15 Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias de peptídeos que exibem especificidade de ligação a um antígeno específico.
Anticorpos intactos são glicoproteínas heterotetraméricas compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
Tipicamente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, 20 embora o número de ligação dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina.
Cada cadeia leve e pesada tem, tam- bém, pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas.
Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (região variável) (VH) seguido de vários domínios constantes (regiões constantes). Cada cadeia 25 leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio cons- tante em sua outra extremidade; sendo que o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o do- mínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.
Cadeias leves de anticorpo de qualquer espécie vertebrada podem 30 ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, capa ( ) e lambda ( ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
As imunoglobulinas podem ser atribuídas a cinco classes princi- pais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de amino- ácidos de domínio constante de cadeia pesada.
IgA e IgG são, ainda, sub- classificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. 5 O termo "fragmentos de anticorpo" significam uma porção de um anticorpo intacto, em geral, a região variável ou de ligação de antígeno do anticorpo intacto.
Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de pelo menos dois anticorpos 10 intactos.
Uma região variável da cadeia leve ou uma região variável da cadeia pesada de uma imunoglobulina consiste em uma região "estrutural" interrompida por três "sítios de ligação ao antígeno". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos, da seguinte forma: (i) o 15 termo Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) tem por base a variabilidade de sequência (Wu and Kabat, J.
Exp.
Med. 132:211 a 250, 1970). Em geral, o sítio de ligação ao antígeno tem seis CDRs; três na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), e três na VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed.
Public Health 20 Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) O termo "re- gião hipervariável", "HVR", ou "HV" refere-se às regiões de um domínio vari- ável do anticorpo que têm estrutura hipervariável, conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia and Lesk, Mol.
Biol. 196:901 a 917, 1987). Em ge- ral, o sítio de ligação ao antígeno tem seis regiões hipervariáveis, três em 25 VH (H1, H2, H3) e três em VL (L1, L2, L3). Chothia e Lesk referem-se às HVs estruturalmente conservadas como "estruturas canônicas". (iii) As "IMGT-CDRs", conforme proposto por Lefranc (Lefranc et al., Dev.
Compa- rat.
Immunol. 27:55 a 77, 2003) são baseadas na comparação de domínios V de imunoglobulinas e receptores de células T.
A base de dados Internatio- 30 nal ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas dessas regiões.
A correspondência entre C- DRs, HVs e delineações IMGT é descrita em Lefranc et al., Dev.
Comparat.
Immunol. 27:55 a 77, 2003. (iv) O sítio de ligação ao antígeno também pode ser delineado com base no uso de resíduo determinante da especificidade (SDRU) (Almagro, Mol.
Recognit. 17:132 a 143, 2004), onde Resíduos de- terminantes de especificidade (SDR), refere-se aos resíduos de aminoácidos 5 de uma imunoglobulina que estão diretamente envolvidos em contato de an- tígeno.
O SDRU é uma medida precisa do número e distribuição de SDR para diferentes tipos de antígenos, conforme definido por análises das estru- turas cristalinas de complexos antígeno-anticorpo. (v) O sítio de ligação ao antígeno também pode ser definido como os resíduos dos paratopos do an- 10 ticorpo identificados a partir da estrutura cristalina do complexo antígeno- anticorpo.
O termo "sequências compósitas", para uso na presente inven- ção, significa um sítio de ligação ao antígeno definido para incluir todos os resíduos de aminoácidos delineados individualmente por Kabat, Chothia ou 15 IMGT, ou qualquer outra delineação adequada do sítio de ligação ao antíge- no.
Os "resíduos de Chothia" para uso na presente invenção são os resíduos VL e VH do anticorpo numerados de acordo com Al-Lazikani (Al- Lazikani et al., J.
Mol.
Biol. 273:927 a 948, 1997). A correspondência entre 20 os dois sistemas de numeração mais usados, Kabat (Kabat et al., Sequen- ces of Immunological Interest, 5a Ed.
Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991) e Chothia (Chothia e Lesk, Mol.
Biol. 196:901 a 917, 1987) em relação à numeração sequencial de polipeptídeos é mostrada na figura 31 para anticorpos exemplificadores da invenção. 25 "Estrutura" ou "sequências estruturais" são as sequências rema- nescentes de uma região variável diferente daquelas definidas para serem o sítio de ligação ao antígeno.
A estrutura é dividida tipicamente em quatro regiões, FR1, FR2, FR3, e FR3, que formam um arcabouço para os três sí- tios de ligação ao antígeno em cada região variável.
Porque o sítio de liga- 30 ção ao antígeno pode ser definido por vários termos, conforme descrito aci- ma, a exata sequência de aminoácidos de uma estrutura depende de como o sítio de ligação ao antígeno foi definido.
"Uma estrutura da região variável da cadeia leve capa 1 (V 1)" ou "V 1" para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos genes de V 1 funcionais humanos ou alelos dos mesmos.
Genes de Vk1 funcionais huma- 5 nos exemplificadores são IGKV1-5*01, IGKV1-6*01, IGKV1-8*01, IGKV1- 9*01, IGKV1-12*01, IGKV1-13*02, IGKV1-16*01, IGKV1-17*01, IGKV1- 27*01, IGKV1-33*01, IGKV1-37*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-8*01, IGKV1D- 12*01, IGKV1D-13*01, IGKV1D-16*01, IGKV1D-17*01, IGKV1D-33*01, IGKV1D-37*01, IGKV1D-39*01, IGKV1D-42*01, ou IGKV1D-43*01. A no- 10 menclatura dos genes de imunoglobulina é bem conhecida. "Uma estrutura da região variável da cadeia leve lambda 3 (V 3)" ou "V 3" para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos ge- nes de V 3 funcionais humanos ou alelos dos mesmos.
Os genes de V 3 15 funcionais humanos exemplificadores são IGLV3-1*01, IGLV3-9*01, IGLV3- 10*01, IGLV3-12*01, IGLV3-16*01, IGLV3-19*01, IGLV3-21*01, IGLV3- 22*01, IGLV3-25*01, IGLV3-27*01, e IGLV3-32*01. "Uma estrutura da região variável da cadeia pesada Vh5" ou "Vh5", para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem 20 uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos genes de Vh5 funcionais humanos ou alelos dos mesmos.
Os genes de Vh5 funcionais humanos exemplificadores são IGHV5-51*01 e IGHV5-1*01. "Uma estrutura da região variável da cadeia pesada Vh6" ou "Vh6", para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem 25 uma sequência de aminoácido codificada por qualquer um dos genes de Vh6 funcionais humanos ou alelos dos mesmos.
Um gene de Vh6 funcional hu- mano exemplificador é IGHV6-1*01. "Uma estrutura da região J da cadeia leve capa (J ) ou "J ", pa- ra uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem uma se- 30 quência de aminoácido codificada por qualquer um dos genes de J funcio- nais humanos ou alelos dos mesmos.
Os genes de V funcionais humanos exemplificadores são IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4, e IGKJ5.
"Uma estrutura da região J da cadeia leve lambda (J ) ou "(J )", para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem uma se- quência de aminoácido codificada por qualquer um dos genes de (J ) fun- cionais humanos ou alelos dos mesmos.
Os genes de J funcionais huma- 5 nos exemplificadores são IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3, IGLJ4, IGLJ5, IGLJ6, e I- GLJ7. "Uma estrutura da região J da cadeia pesada (Jh)" ou "Jh", para uso na presente invenção, refere-se a uma estrutura que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer um dos genes de Jh funcionais hu- 10 manos ou alelos dos mesmos.
Os genes de Jh funcionais humanos exempli- ficadores são IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5, e IGHJ6. "Genes de linhagem germinativa" ou "genes de linhagem germi- nativa de anticorpo", para uso na presente invenção, são sequências de i- munoglobulina codificadas por células não linfóides que não foram submeti- 15 das ao processo de maturação que leva a rearranjo genético e mutação para expressão de uma imunoglobulina particular. "Arcabouço", para uso na presente invenção, refere-se a se- quências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada codi- ficadas por genes de linhagem germinativa humanos.
Desta forma, o arca- 20 bouço abrange tanto a estrutura quanto o sítio de ligação ao antígeno.
O termo "antígeno", como é usado aqui, significa qualquer molé- cula que tem a capacidade de gerar anticorpos direta ou indiretamente.
Está incluída na definição de "antígeno" um ácido nucléico que codifica proteína.
O termo "homólogo" significa sequências de proteínas que têm 25 entre 40% e 100% de identidade de sequência em relação a uma sequência de referência.
O homólogo de TLR3 humano inclui polipeptídeos de outras espécies que têm entre 40% e 100% de identidade de sequência em relação a uma sequência de TLR3 humano conhecida.
O percentual de identidade entre duas cadeias peptídicas pode ser determinado por alinhamento de pa- 30 reamento com o uso das configurações padrão do módulo AlignX do Vetor NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Por "TLR3" entende-se TLR3 humano (huTLR3) e seus homólogos.
As sequências de nucleotídeo e ami-
noácido do huTLR3 de extensão completa são mostradas nas SEQ ID n°s: 1 e 2, respectivamente.
O nucleotídeo e as sequências de aminoácidos do domínio extracelular (ECD) de huTLR3 são mostrados nas SEQ ID n°s: 3 e 4, respectivamente. 5 O termo "substancialmente idêntico", como usado aqui, significa que dois anticorpos ou sequências de aminoácidos de fragmentos de anti- corpos sendo comparados são idênticos ou têm "diferenças insubstanciais". Diferenças insubstanciais são substituições de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos em um anticorpo ou sequência de aminoácidos de fragmento de anticorpo. 10 Sequências de aminoácido substancialmente idênticas às sequências apre- sentadas aqui também são parte desse pedido de patente.
Em algumas mo- dalidades, a identidade de sequência pode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais alta.
O percentual de identi- dade pode ser determinado conforme descrito acima.
Cadeias peptídicas 15 exemplificadoras que estão sendo comparadas são regiões variáveis de ca- deia pesada ou leve.
O termo "em combinação com" conforme usado aqui significa que os agentes descritos podem ser administrados a um animal juntos em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencialmente 20 como agentes únicos em qualquer ordem.
O termo "condição inflamatória", para uso na presente invenção, significa uma resposta localizada à lesão celular que é mediada, em parte, pela atividade de citocinas, quimiocinas, ou células inflamatórias (por exem- plo, neutrófilos, monócitos, linfócitos, macrófagos) que é caracterizada na 25 maoria dos casos por dor, vermelhidão, inchaço, e perda de função tecidual.
O termo "condição inflamatória pulmonar" para uso na presente invenção, significa uma condição inflamatória afetando ou associada aos pulmões.
O termo "anticorpo monoclonal" (mAb), conforme usado aqui, significa um anticorpo (ou fragmento de anticorpo) obtido a partir de uma 30 população de anticorpos substancialmente homogêneos.
Os anticorpos mo- noclonais são altamente específicos, sendo tipicamente direcionados contra um único determinante antigênico.
O modificador "monoclonal" indica o cará-
ter substancialmente homogêneo do anticorpo e não exige produção do anti- corpo por qualquer método particular. Por exemplo, mAbs murinos podem ser feitos pelo método de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495 a 497,
1975. mAbs quiméricos que contêm uma região variável de cadeia leve e de 5 cadeia pesada derivada de um anticorpo doador (tipicamente murino) em associação com as regiões constantes de cadeias leve e pesada derivadas de um anticorpo aceitante (tipicamente outra espécie de mamífero, como o ser humano) podem ser preparados pelo método apresentado na patente US n° 4.816.567. mAbs adaptados para seres humanos que têm CDRs deriva- 10 das de imunoglobulina de um doador não humano (tipicamente murino) e as partes da molécula derivadas de imunoglobulina remanescentes que são derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas podem ser preparadas por técnicas conhecidas dos versados na técnica como aquela descrita na patente U.S. n° 5.225.539. Sequências estruturais humanas úteis para a a- 15 daptação a seres humanos podem ser selecionadas a partir de bases de dados relevantes por versados na técnica. Opcionalmente, mAbs adaptados para seres humanos podem ser ainda mais modificados pela incorporação de resíduos de apoio estruturais alterados para preservar a afinidade de li- gação por técnicas como aquelas apresentadas em Queen et al., Proc. Natl. 20 Acad. Sci. (USA), 86:10029 a 10032, 1989 e Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421, 1991. mAbs completamente humanos que não possuem sequências não humanas podem ser preparados a partir de camundongos transgênicos de imunoglobulina humana por técnicas referidas, por exemplo, em Lonberg 25 et al., Nature 368:856 a 859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845 a 851, 1996; e Mendez et al., Nature Genetics 15:146 a 156, 1997. mAbs humanos também podem ser preparados e otimizados a partir de bi- bliotecas de apresentação em fago por técnicas referidas, por exemplo, em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57 a 86, 2000; e Krebs et al., J. Immunol. 30 Meth. 254:67 a 84 2001. Os fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmen- tos Fab, F(ab’)2, Fd, e dAb podem ser produzidos por clivagem dos anticor- pos ou por manipulação recombinante. Por exemplo, os fragmentos Fab e
F(ab’)2 podem ser gerados por tratamento dos anticorpos com uma enzima como pepsina.
O termo "epitopo", conforme é usado aqui significa uma porção de um antígeno à qual um anticorpo se liga especificamente.
Os epitopos 5 normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa (como polar, não polar ou hidrofóbica) de porções como aminoácidos ou ca- deias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tri- dimensionais específicas, assim como características de carga específicas.
Um epitopo pode ser linear em natureza ou pode ser um epitopo descontí- 10 nuo, por exemplo, um epitopo conformacional, que é formado por uma rela- ção espacial entre aminoácidos não contíguos de um antígeno em vez de uma série linear de aminoácidos.
Um epitopo conformacional inclui epitopos resultantes do dobramento de um antígeno, onde os aminoácidos de por- ções que diferem da sequência linear do antígeno estão em grande proximi- 15 dade em espaço 3-dimensional.
O termo "paratopo", para uso na presente invenção, refere-se a uma porção de um anticorpo ao qual um antígeno se liga especificamente.
Um paratopo pode ser linear em natureza ou pode ser descontínuo, formado por uma relação espacial entre aminoácidos não contíguos de um anticorpo 20 e não para uma série linear de aminoácidos.
Um "paratopo de cadeia leve" e um "paratopo de cadeia pesada" ou "resíduos de aminoácido de paratopo de cadeia leve" e "resíduos de aminoácido de paratopo de cadeia pesada" refe- rem-se a resíduos de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo em con- tato com um antígeno, respectivamente. 25 O termo "ligação específica" conforme usado aqui, refere-se ao anticorpo que se liga a um antígeno pré-determinado com maior afinidade do que a outros antígenos ou proteínas.
Tipicamente, o anticorpo se liga com uma constante de dissociação (KD) de 10-7 M ou menos, e se liga ao antíge- no pré-determinado com uma KD que é de pelo menos duas vezes menor do 30 que sua KD para ligar a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, ca- seína, ou qualquer outro polipeptídeo específico) além do antígeno pré- determinado.
As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e
"um anticorpo específico para um antígeno" são usadas de maneira inter- cambiável aqui com o termo "um anticorpo que se ligar especificamente a um antígeno" ou "um anticorpo específico ao/de antígeno" por exemplo, um anticorpo específico de TLR3. A constante de dissociação pode ser medida 5 com o uso de procedimentos padrão, conforme descrito abaixo.
O termo "atividade biológica de TLR3" ou "ativação de TLR3", conforme usado aqui, se refere a qualquer atividade que ocorre como um resultado de ligação de ligante ao TLR3. Os ligantes de TLR3 incluem dsR- NA, poli(I:C), e mRNA endógeno, por exemplo, mRNA endógeno liberado de 10 células necróticas.
Uma ativação de TLR3 exemplificadora resulta na ativa- ção de NF- B em resposta ao ligante de TLR3. A ativação de NF- B pode ser testada com o uso de um teste de gene-repórter mediante indução do receptor com poli(I:C) (Alexopoulou et al., Nature 413:732 a 738, 2001; Häcker et al., EMBO J. 18:6973 a 6982, 1999). Outra ativação de TLR3 e- 15 xemplificadora resulta na ativação de fatores de resposta de interferon (IRF- 3, IRF-7) em resposta ao ligante de TLR3. A ativação de IRF mediada por TLR3 pode ser submetida a teste com o uso do gene-repórter acionado por um elemento de resposta estimulado por interferon (ISRE). Outra ativação de TLR3 exemplificadora resulta na secreção de citocinas e quimiocinas pró- 20 inflamatórias, por exemplo, TNF- , IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-10 e RAN- TES.
A liberação de citocinas e quimiocinas de células, tecidos ou em circu- lação pode ser medida com o uso de imunotestes bem conhecidos, como um imunoteste ELISA.
Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras conven- 25 cionais são usados aqui conforme o que segue: Aminoácido Código de três letras Código de uma letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Aspartato Asp D Cisteina Cis C Gltamato Glu E Glutamina Gln Q
Aminoácido Código de três letras Código de uma letra Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Composições de substâncias A presente invenção fornece anticorpos antagonistas capazes de inibir a atividade biológica de TLR3 e usos de tais anticorpos.
Tais anta- gonistas do TLR3 podem ter as propriedades de ligação de TLR3 e de inibi- 5 ção de ativação de TLR3. Mecanismos exemplificadores pelos quais a ativa- ção TLR3 pode ser inibida por tais anticorpos incluem a inibição in vitro, in vivo ou in situ do ligante ligando ao TLR3, a inibição de dimerização do re- ceptor, a inibição da localização de TLR3 ao compartimento endossomal, a inibição da atividade quinase das vias de sinalização à jusante, ou a inibição 10 de transcrição de mRNA de TLR3. Outros anticorpos antagonistas capazes de inibir a ativação de TLR3 por outros mecanismos também estão no esco- po dos vários aspectos e modalidades da invenção.
Esses antagonistas são úteis como reagentes de pesquisa, reagentes diagnósticos e agentes tera- pêuticos. 15 Uma diversidade de anticorpo, em um sistema natural, é criada pelo uso de múltiplos genes de linhagem germinativa que codificam regiões variáveis e uma variedade de eventos somáticos.
Os eventos somáticos in- cluem a recombinação de segmentos gênicos variáveis com segmentos gê- nicos de diversidade (D) e de junção (J) para fazer uma região VH completa 20 e a recombinação de segmentos gênicos variáveis e de junção para fazer uma região VL completa.
O processo de recombinação em si pode ser im- preciso, resultando na perda ou adição de aminoácidos nas junções V(D)J.
Estes mecanismos de diversidade ocorrem no desenvolvimento da célula B antes da exposição a antígenos.
Após a estimulação antigênica, os genes de 5 anticorpo expressos em células B são submetidos a mutação somática.
Com base no número estimado de segmentos gênicos de linhagem germinativa, na recombinação aleatória destes segmentos, e no pareamento VH-VL alea- tório, até 1,6×107 anticorpos diferentes poderiam ser produzidos (Fundamen- tal Immunology, 3a ed. (1993), ed.
Paul, Raven Press, New York, E.U.A., 10 N.Y.). Quando outros processos que contribuem para a diversidade do anti- corpo (como mutação somática) são levados em consideração, acredita-se que mais de 1010 anticorpos diferentes poderiam ser gerados (Immunoglobu- lin Genes, 2a ed. (1995), eds.
Jonio et al., Academic Press, San Diego, Ca- lif.). Por causa dos muitos processos envolvidos na geração de diversidade 15 do anticorpo, é altamente improvável que anticorpos monoclonais derivados independentemente com a mesma especificidade antigênica tenham se- quências de aminoácido idênticas.
A invenção fornece novos sítios de ligação ao antígeno e cadei- as de imunoglobulina derivadas de bibliotecas de genes de imunoglobulina 20 humana.
A estrutura para carregar um sítio de ligação ao antígeno é, em geral, uma cadeia pesada ou leve de anticorpo ou porção da mesma, onde o sítio de ligação ao antígeno é localizado para um sítio de ligação ao antígeno de ocorrência natural conforme determinado conforme descrito acima.
A invenção fornece um anticorpo ou fragmento isolado do mes- 25 mo reativo com TLR3 que compreende as regiões variáveis da cadeia pesa- da e da cadeia leve e em que o anticorpo compreende as sequências de aminoácido das regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e as sequências de amino- ácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de 30 cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) conforme mostrado na tabela 1a.
Tabela 1a. mAb no: SEQ.
ID N°: HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 16 52 88 54 49 50 51 17 58 64 60 55 56 57 18 70 77 72 67 68 69 19 82 83 84 79 80 89 1 46 47 48 43 44 45 2 52 53 54 49 50 51 3 58 59 60 55 56 57 4 61 62 60 55 56 57 5 61 64 60 55 56 63 6 61 64 60 55 56 65 7 61 64 60 55 56 66 8 70 71 72 67 68 69 9 70 73 72 67 68 69 10 70 75 72 67 68 74 11 70 77 72 67 68 76 12 70 77 72 67 68 78 13 82 83 84 79 80 81 14 82 86 84 79 80 85 15* 82 86 84 79 80 87 15** 111 112 84 109 110 113 15-1 111 114 84 109 110 113 15-2 115 112 84 109 110 113 15-3 116 112 84 109 110 113 15-4 111 117 84 109 110 113 15-5 116 118 84 109 110 113 15-6 116 112 119 109 110 113 15-7 111 112 84 120 110 113 15-8 111 112 84 121 110 113 15-9 116 118 119 109 110 113 15-10 116 112 119 79 80 226 F17 61 192 60 55 56 191 mAb no: SEQ.
ID N°: HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 F18 70 194 72 67 68 193 F19 82 196 84 79 80 195
15* CDRs definidas por IMGT 15** CDRs definidas como consenso Em certas modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou um fragmento reativo com TLR3 que compreende a região variável de 5 cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, e sendo que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de HCDR2 mostrada na SEQ.
ID n° 192, sendo que a HCDR2 da SEQ.
ID n° 192 é definida conforme mos- trado na fórmula (I): Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (I) 10 sendo que Xaa6 pode ser Arg ou Lys; Xaa7 pode ser Tyr, His ou Ser; Xaa8 pode ser Met, Arg ou Tyr; e Xaa9 pode ser Lys ou Arg. 15 Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve e sendo que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de HCDR2 mostrada na SEQ.
ID n° 194, sendo que a HCDR2 da SEQ.
ID n° 194 é definida conforme o 20 mostrado na fórmula (III): I-I-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S, (III) sendo que Xaa15 pode ser Lys, Thr ou Ile; Xaa16 pode ser Asn ou Asp; e 25 Xaa17 pode ser Val ou Leu.
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve e sendo que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de HCDR2 mostrada na SEQ.
ID n° 196, sendo que a HCDR2 da SEQ.
ID n° 196 é definida conforme o mostrado na fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V) 5 sendo que Xaa24 pode ser Phe ou Arg; e Xaa25 pode ser Ala ou Ser.
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de 10 cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, e sendo que o anticor- po compreende uma sequência de aminoácidos de LCDR3 mostrada na SEQ.
ID n° 191, sendo que a LCDR3 da SEQ.
ID n° 191 é definida conforme mostrado na fórmula (II): Xaa1-S-Y-D—Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V, (II) 15 sendo que Xaa1 pode ser Ala, Gln, Gly ou Ser; Xaa2 pode ser Gly, Glu ou Ser; Xaa3 pode ser Asp ou Asn; Xaa4 pode ser Glu ou Ser; e 20 Xaa5 pode ser Phe, Ala ou Leu.
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, e sendo que o anticor- po compreende uma sequência de aminoácidos de LCDR3 mostrada na 25 SEQ.
ID n° 193, sendo que a LCDR3 da SEQ.
ID n° 193 é definida conforme mostrado na fórmula (IV): Xaa10-S-Y-D—Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V, (IV) sendo que Xaa10 pode ser Gln ou Ser; 30 Xaa11 pode ser Thr, Glu ou Asp; Xaa12 pode ser Val ou Asn; Xaa13 pode ser Tir ou Phe; e
Xaa14 pode ser Ser, Asn ou Gln.
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, e sendo que o anticor- 5 po compreende uma sequência de aminoácidos de LCDR3 mostrada na SEQ.
ID n° 195, sendo que a LCDR3 da SEQ.
ID n° 195 é definida conforme mostrado na fórmula (VI): Q-Q-Xaa18—Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T, (VI) sendo que 10 Xaa18 pode ser Tyr, Gli ou Ala; Xaa19 pode ser Gly, Glu ou Asn; Xaa20 pode ser Ser ou Thr; Xaa21 pode ser Val, Ile ou Leu; Xaa22 pode ser Ser ou Leu; e 15 Xaa23 pode ser Ile, Ser, Pro ou Tyr.
A invenção também fornece um anticorpo ou fragmento isolado reativo com TLR3 que tem as sequências de aminoácido das regiões deter- minantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e as sequências de aminoácido das regiões determinan- 20 tes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), conforme mostrado na tabela 1a.
Anticorpos cujas sequências de aminoácidos de sítio de ligação ao antígeno diferem insubstancialmente daquelas mostradas na tabela 1a (SEQ.
ID n°s: 49 a 121 e 191 a 196) são incorporados no escopo da inven- 25 ção.
Tipicamente, isso envolve uma ou mais substituições de aminoácido com um aminoácido tendo características de carga, hidrofóbicas ou estero- químicas similares.
Substituições adicionais nas regiões estruturais, em con- traste com sítios de ligação ao antígeno também podem ser feitas, contanto que elas não afetem adversamente as propriedades do anticorpo.
Substitui- 30 ções podem ser feitas para melhorar as propriedades do anticorpo, por e- xemplo, estabilidade ou afinidade.
Uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições podem ser feitas ao sítio de ligação ao antígeno. 1%, 2%, 3%,
4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou 30% dos resíduos estruturais podem ser substituídos, desde que o anticorpo resultante retenha as propriedades de- sejadas.
Modificações conservadoras produzirão moléculas que têm ca- 5 racterísticas químicas e funcionais similares àquelas da molécula da qual tais modificações são feitas.
Modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas das moléculas podem ser alcançadas ao selecionar substituições na sequência de aminoácidos que difere significativamente em seu efeito na manutenção (1) da estrutura da cadeia principal molecular na 10 área da substituição, por exemplo, como uma conformação de lâmina ou helicoidal, (2) da mudança ou capacidade hidrofóbica da molécula no sítio alvo, ou (3) do tamanho da molécula.
Por exemplo, uma "substituição de a- minoácido conservadora" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo de modo que haja pouco ou 15 nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição.
Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo também pode ser substituído por alanina, conforme foi previamente descrito para mutage- nese de varredura de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol.
Scand.
Suppl. 643:55 a 67, 1998; Sasaki et al., Adv.
Biophys. 35:1 a 24, 1998). As substitu- 20 ições de aminoácido desejadas (ou conservadora ou não conservadora) po- dem ser determinadas por aqueles versados na técnica no momento que tais substituições forem desejadas.
Por exemplo, as substituições de aminoácido podem ser usadas para identificar resíduos importantes da sequência de molécula, ou para aumentar ou diminuir a afinidade das moléculas descritas 25 aqui.
Substituições de aminoácido exemplificadoras são mostradas na tabela 1b.
Em certas modalidades, as substituições de aminoácido conser- vadoras também abrangem resíduos de aminoácidos que não têm ocorrên- cia natural, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptí- 30 deos, em vez de por síntese em sistemas biológicos.
As substituições de aminoácido podem ser feitas, por exemplo, por mutagenese de PCR (paten- te US n° 4.683.195). Bibliotecas de variantes podem ser geradas com o uso de métodos bem conhecidos, por exemplo, usando códons aleatórios (NNK) ou não aleatórios, por exemplo, códons DVK, que codificam 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW) e seleção de bibliotecas para variantes com as proprie- dades desejadas, conforme mostrado no Exemplo 1. A tabela 1c mostra 5 substituições feitas a três antagonistas de anticorpo de TLR3 parentais den- tro das regiões LCDR3 e HCDR2 para melhoras as propriedades do anticor- po.
Dependendo da delineação dos sítios de ligação ao antígeno, os resíduos do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos da invenção e, sub- 10 sequentemente, os resíduos da estrutura podem variar levemente para cada cadeia leve e pesada.
Tabela 1b.
Resíduo ori- Substituições exemplificadoras Substituições mais ginal conservativas Ala (A) Val, Leu, Ile Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln Gln Asp (D) Glu Glu Cis (C) Ser, Ala Ser Gln (Q) Asn Asn Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, NORLEUCINA Leu Leu (L) NORLEUCINA, Ile, Val, Met, Ala, Phe He Lys (K) Arg, 1, 4 Ácido Diamino-butírico, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Gly Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala, NORLEUCINA Leu
As tabelas 2a e 2b mostram os resíduos de sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos exemplificadores da invenção delineados de acordo com Kabat, Chothia e IMGT, e suas sequências compósitas.
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de 5 cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, e sendo que o anticor- po compreende as sequências de aminoácidos das regiões variável de ca- deia pesada (VH) e variável de cadeia leve (VL) e também fornece cada re- gião variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve isoladas, conforme mostrado na tabela 3a.
F17, F18 e F19 representam as variantes 10 de anticorpo que compreendem sequências de aminoácidos de consenso para as famílias 17, 18 e 19, respectivamente (consultar o exemplo 1).
Tabela 1c. Família 17 LCDR3 SEQ. ID mAb n°: 17 A S Y D G D E F T V 3 4 5 Q E S A 6 G S N S L 7 S S S L Consenso A,Q,G,S S Y D G,E,S D,N E,S F,A,L T V 191 30/133 Família 17 HCDR2 SEQ. ID mAb n°: 17 R I Y M R S K W Y N D Y A V S V K S 3 H R 4 K S Y R 5 6 7 Consenso R,K I Y,H, M,R, R S K,R W Y N D Y A V S V K S 192
S Y
Família 18A LCDR3 SEQ.
ID mAb n°: 18 Q S Y D S Q F S F G V 8 9 Família 18B mAb 10 Q S Y D T P V Y S V 11 S E N F N 12 S D N F Q
31/133 Consenso Q,S S Y D T,E,D P V,N Y,F S,N,Q V 193 * consenso com base nos mAbs 10, 11, 12 Família 18A, HCDR2 SEQ.
ID 18B n°: mAb 18 I I Q K R S K W Y N N Y A V S V K S 8 T D 9 I D L 10 11 12 Consenso I I Q K,T,I R S K W Y N N,D Y A V,L S V K S 194
Família 19 LCDR2 SEQ.
ID mAb n°: 19 Q Q Y G S V S I T 13 G E S I L S 14 A E T P 15 G N T L Y 15-1 G N T L Y 15-2 G N T L Y 15-3 G N T L Y 15-4 G N T L Y
32/133 15-5 G N T L Y 15-6 G N T L Y 15-7 G N T L Y 15-8 G N T L Y 15-9 G N T L Y 15-10 G N T L Y Consenso Q Q Y,G,A G,E,N S,T V,I,L S,L l,S,P,Y T 195
Família 19 HCDR2 SEQ.
ID mAb n°: 19 F I D P S D S Y T N Y A P S F Q G 13 14 15 15,1 R 15,2 15,3
33/133 15,4 S 15,5 R S 15,6 15,7 15-8 15-9 R S 15-10 Consenso F,R I D P S D S Y T N Y A,S P S F Q G 196
Embora as modalidades ilustradas nos exemplos compreendam pares de regiões variáveis, um de uma cadeia pesada e um de uma cadeia leve, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que modalidades alterna- tivas podem compreender regiões variáveis únicas de cadeia pesada ou le- 5 ve.
A região variável única pode ser usada para selecionar uma segunda região variável capaz de formar um fragmento de ligação ao antígeno espe- cífico de dois domínios capaz, por exemplo, de se ligar a TLR3. A triagem pode ser realizada por métodos de triagem por apresentação em fago (pha- ge display) com o uso, por exemplo, de abordagem de combinação dupla 10 hierárquica apresentada em PCT Publ. n°. WO92/01047. Nessa abordagem, uma colônia individual que contém um clone de cadeia H ou de cadeia L é usada para infectar uma biblioteca de clones completa que codifica a outra cadeia (L ou H), e o domínio de ligação ao antígeno específico de duas ca- deias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de apresentação 15 em fago, conforme descrito.
Tabela 2a. mAb definição da HCDR1 HCDR2 HCDR3 CDR SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência 14 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 14 Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 14 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 14 Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15 Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 15 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
35/133 15 Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-1 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-1 Kabat NYWVG RIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 15-1 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-1 Consenso 111 GYSFTNYWVG 114 RIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-2 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-2 Kabat NYWIG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 15-2 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-2 Consenso 115 GYSFTNYWIG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-3 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-3 Kabat NYWIS 86 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ELYQGYMDTFDS mAb definição da HCDR1 HCDR2 HCDR3 CDR SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência 15-3 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-3 Consenso 116 GYSFTNYWIS 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-4 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-4 Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS 15-4 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-4 Consenso 111 GYSFTNYWVG 117 FIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-5 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-5 Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS
36/133 15-5 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-5 Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-6 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY ARQLYQGYMDTFDS 15-6 Kabat NYWIS FIDPSDSYTNYAPSFQ QLYQGYMDTFDS 15-6 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-6 Consenso 116 GYSFTNYWIS 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 119 ARQLYQGYMDTFDS 15-7 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS 15-7 Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 15-7 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-7 Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-8 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS mAb definição da HCDR1 HCDR2 HCDR3 CDR SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência SEQ ID Sequência 15-8 Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS 15-8 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-8 Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS 15-9 IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 119 ARQLYQGYMDTFDS 15-9 Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFQG QLYQGYMDTFDS 15-9 Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD 15-9 Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQG 119 ARQLYQGYMDTFDS
37/133
Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo isola- do ou fragmento reativo com TLR3 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve tendo sequências de aminoácido pelo menos 95% idênticas às sequências de aminoácidos da 5 região variável mostradas na tabela 3a.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado que tem certas sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve, conforme mostrado na tabela 3b.
Outro aspecto da invenção é polinucleotídeos isolados que codi- 10 ficam quaisquer anticorpos da invenção ou seus complementos.
Certos poli- nucleotídeos exemplificadores são apresentados aqui, entretanto, outros polinucleotídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferên- cias de códon em um dado sistema de expressão, codificam os anticorpos antagonistas da invenção também estão no escopo da invenção.
Tabela 2b. mAb definição LCDR1 LCDR2 LCDR3 CDR SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência 14 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 85 QQAETVSPT 14 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQAETVSPT 14 Chothia SQSIGLY AAS AETVSP 14 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 85 QQAETVSPT 15 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
39/133 15 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-1 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-1 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-1 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-1 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-2 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-2 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-2 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-2 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-3 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-3 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT mAb definição LCDR1 LCDR2 LCDR3 CDR SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência 15-3 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-3 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-4 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-4 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-4 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-4 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-5 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-5 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
40/133 15-5 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-5 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-6 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-6 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-6 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-6 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-7 IMGT QSISSY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-7 Kabat RASQSISSYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-7 Chothia SQSISSY AAS GNTLSY 15-7 Consenso 120 RASQSISSYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-8 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT mAb definição LCDR1 LCDR2 LCDR3 CDR SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência SEQ.
ID n°: Sequência 15-8 Kabat RASQSIGLYLN AASSLQS QQGNTLSYT 15-8 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-8 Consenso 121 RASQSIGLYLN 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-9 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-9 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-9 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-9 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
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Tabela 3a. mAb no: SEQ. ID n°: mAb no: SEQ. ID n°:
HV LV HV LV 16 6 5 15-1 124 41 17 8 7 15-2 125 41 18 10 9 15-3 126 41 19 12 11 15-4 127 41 1 14 13 15-5 128 41 2 16 15 15-6 129 41 3 18 17 15-7 42 122 42/133 4 20 19 15-8 42 123 5 22 21 15-9 159 41 6 24 23 15-10 129 225 7 26 25 F17 198 197 8 28 27 F18 200 199 9 30 29 F19 202 201 10 32 31 c1811 164 163 11 34 33 9QVQ/QSV 212 209 12 36 35 10QVQ/QSV 213 210 13 38 37 12QVQ/QSV 214 211 14 40 39 14EVQ 215 39 15 42 41 15EVQ 216 41
Anticorpos antagonistas exemplificadores podem ser anticorpos dos isótipos IgG, IgD, IgG, IgA ou IgM.
Adicionalmente, tais anticorpos anta- gonistas podem ser modificados pós-translacionalmente por processos como glicosilação, isomerização, deglicosilação ou modificação covalente de ocor- 5 rência não natural, como a adição de porções de polietileno glicol ("PEG") (peguilação) e lipidação.
Tais modificações podem ocorrer in vivo ou in vitro.
Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser conjugados a polietileno glicol (peguilado) para otimizar seus perfis farmacocinéticos.
A conjugação pode ser realizada por técnicas conhecidas àqueles versados na técnica. 10 Mostrou-se que a conjugação de anticorpos terapêuticos com PEG intesifica a farmacodinâmica, mas não interfere na função (Deckert et al., Int.
J.
Can- cer 87:382 a 390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409 a 418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106 a 119, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761 a 770, 2003). 15 Tabela 3b. mAb no: região variável de cadeia pesada Cadeia leve SEQ.
ID n°: SEQ.
ID n°: 14 102 155 15 102 156 15-1 130 156 15-2 131 156 15-3 132 156 15-4 133 156 15-5 134 156 15-6 135 156 15-7 102 157 15-8 102 158 15-9 160 156 15-10 135 227 F17 204 203 F18 206 205 F19 208 207 14EVQ 220 155 15EVQ 220 156 5429 166 165 c1811 168 167 Propriedades farmacocinéticas dos anticorpos da invenção tam-
bém poderiam ser melhoradas através de modificações Fc por técnicas co- nhecidas para aqueles versados na técnica.
Por exemplo, as cadeias pesa- das do isótipo IgG4 contêm um motivo Cis-Pro-Ser-Cis (CPSC) na região de articulação capaz de formar ou inter- ou intraligações dissulfeto de cadeia 5 pesada, isto é, os dois resíduos Cis no motivo CPSC podem ter ligação dis- sulfeto com os resíduos Cis correspondentes na outra cadeia pesada (inter) ou os dois resíduos Cis em um dado motivo CPSC podem ter ligação dissul- feto um com o outro (intra). Acredita-se que enzimas isomerase in vivo são capazes de converter interligações de cadeia pesada de moléculas de IgG4 10 em intraligações de cadeia pesada e vice-versa (Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9 a 19, 2002). Em conformidade, já que os pares de cadeia pesada: leve (H:L) naquelas moléculas de IgG4 com intraligações de cadeia pesada na região de articulação não são covalentemente associados uns aos outros, eles podem dissociar em monômeros H:L que, então, reassoci- 15 am com monômeros H:L derivados de outras moléculas IgG4 formando mo- léculas IgG4 biespecíficas, heterodiméricas.
Em um anticorpo IgG biespecí- fico, dois Fabs da molécula de anticorpo diferem nos epitopos que eles li- gam.
A substituição do resíduo de Ser no motivo CPSC da região de dobra- diça da IgG4 por Pro resulta em um "comportamento semelhante à IgG1", 20 isto é, as moléculas formam ligações de dissulfeto estáveis entre cadeias pesadas e, portanto, não são suscetíveis a troca H:L com outras moléculas de IgG4. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção compreenderão um domínio Fc de IgG4 com uma mutação de S para P no motivo CPSC.
A localização do motivo CPSC é tipicamente encontrada no resíduo 228 de 25 uma cadeia pesada madura, mas pode mudar, dependendo dos comprimen- tos de CDR.
Além disso, os sítios que afetam a ligação a receptores Fc dife- rentes de um receptor selvagem de FcRn nos anticorpos da invenção podem ser removidos.
Por exemplo, as regiões de ligação ao receptor Fc envolvidas 30 na atividade de ADCC podem ser removidas nos anticorpos da invenção.
Por exemplo, uma mutação de Leu234/Leu235 na região de dobradiça de IgG1 para L234A/L235A ou Phe235/Leu236 na região de dobradiça de IgG4 para P235A/L236A reduz a ligação a FcR e reduz a capacidade da imuno- globulina mediar citotoxicidade dependente do complemento e ADCC.
Em uma modalidade, os anticorpos da invenção compreenderão um domínio Fc de IgG4 com mutações P235A/L236A.
A localização desses resíduos identi- 5 ficados acima é típica em uma cadeia pesada madura, mas pode mudar, dependendo dos comprimentos de CDR.
Anticorpos exemplificadores que têm mutações P235A/L236A são anticorpos que têm as sequências de ami- noácido da cadeia pesada mostradas nas SEQ.
ID n°s: 218, 219 ou 220. Os fragmentos de anticorpos ou as moléculas de anticorpos, to- 10 talmente humanos, adaptados para seres humanos, humanizados e matura- dos por afinidade se situam dentro do escopo da invenção já que são proteí- nas de fusão e proteínas quiméricas.
A afinidade do anticorpo a um antígeno pode ser aprimorada através de modelo racional ou maturação por afinidade aleatória com o uso de métodos bem conhecidos como mutagênese direcio- 15 nada ou aleatória, ou empregando as bibliotecas de apresentação em fago (phage display). Por exemplo, substituições podem ser feitas aos resíduos da Zona Vernier que se localizam principalmente na região estrutural ou aos "resíduos determinantes de afinidade", ADRs, para modular a afinidade de um anticorpo (Pat.
US n° 6.639.055; publicação PCT n° WO10/045340). 20 Os fragmentos de anticorpos ou as moléculas de anticorpos to- talmente humanos, adaptados para seres humanos, maturados por afinida- de, modificados para otimizar a estabilidade, seletividade, reatividade cruza- da, afinidade, imunogenecidade ou outra propriedade biofísica ou biológica desejável se situam dentro do escopo da invenção.
A estabilidade de um 25 anticorpo é influenciada por inúmeros fatores, incluindo (1) acondicionamen- to de núcleo de domínios individuais que afetam sua estabilidade intrínseca, (2) interações de interface proteína/proteína que têm impacto no pareamento de HC e LC, (3) disposição de resíduos polares e carregados (4) rede de ligação H para resíduos polares e carregados; e (5) distribuição de resíduo 30 polar e carga de superfície dentre outras forças intra e inter-moleculares (Worn et al., J.
Mol.
Biol., 305:989 a 1010, 2001). Resíduos com o potencial para desestabilizar estruturas podem podem ser identificados com base na estrutura cristalina do anticorpo ou através de modelagem molecular em de- terminados casos, e o efeito dos resíduos sobre a estabilidade do anticorpo pode ser testado através da geração e da avaliação de variantes que abri- gam mutações nos resíduos identificados.
Uma das maneiras de aumentar a 5 estabilidade do anticorpo é elevar o ponto médio de transição térmica (Tm) conforme medido através de calorimetria de varredura diferencial (CVD). De modo geral, a Tm da proteína está correlacionada a sua estabilidade e in- versamente correlacionada com a sua suscetibilidade ao desenovelamento e desnaturação em solução e os processos de degradação que dependem da 10 tendência da proteína de desenovelar (Remmele et al., Biopharm., 13:36 a 46, 2000). Inúmeros estudos encontraram correlações entre a classificação da estabilidade física de formulações medidas como a estabilidade térmica através de DSC e a estabilidade física medida através de outros métodos (Gupta et al., AAPS PharmSci. 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm.
Sci. 15 93:3076 a 3089, 2004; Maa et al., Int.
J.
Pharm., 140:155 a 168, 1996; Bedu- Addo et al., Pharm.
Res., 21:1353 a 1361, 2004; Remmele et al., Pharm.
Res., 15:200 a 208, 1997). Os estudos de formulação sugerem que uma Tm de Fab implica na estabilidade física de longo prazo de um mAb correspon- dente.
As diferenças nos aminoácidos na estrutura ou dentro dos sítios de 20 ligação ao antígeno poderiam ter efeitos significativos sobre a estabilidade térmica do domínio Fab (Yasui, et al., FEBS Lett. 353: 143 a 146, 1994). Os anticorpos antagonistas da invenção podem unir TLR3 com um Kd menor que ou igual a cerca de 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 ou 10-12 M.
A afinidade de uma dada molécula por TLR3, como um anticorpo, pode ser 25 determinada de maneira experimental com o uso de quaisquer métodos a- dequados.
Tais métodos podem usar instrumentação Biacore ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técni- ca.
Os anticorpos antagonistas que unem um dado homólogo de 30 TLR3 com uma afinidade desejada podem ser selecionados a partir de bibli- otecas de variantes ou fragmentos através de técnicas incluindo maturação por afinidade de anticorpo.
Os anticorpos antagonistas podem ser identifica-
dos com base na sua inibição da atividade biológica de TLR3 com o uso quaisquer métodos adequados.
Tais métodos podem usar testes de gene repórter ou testes que medem a produção de citocinas com o uso de méto- dos bem conhecidos e conforme descritos no pedido. 5 Outra modalidade da invenção é um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção.
Tais vetores podem ser vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores para expressão de baculovírus, vetores à base de transpóson ou quaisquer outros vetores adequados para a introdu- ção dos polinucleotídeos da invenção em um dado organismo ou anteceden- 10 te genético por quaisquer meios.
Outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos polinucleotídeos da invenção como um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma região variá- vel de cadeia pesada de imunoglobulina que tem a sequência de aminoáci- 15 dos mostrada em SEQ ID N° 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ou 216 ou uma região variável de cadeia leve de imuno- globulina que tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID n° 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 20 199, 201, 163, 209, 210, 211, ou 225. Outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compre- ende uma cadeia pesada de imunoglobulina que tem a sequência de amino- ácidos mostradas em SEQ ID n° 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 25 204, 206, 208, 220, 166 ou 168, ou uma cadeia leve de imunoglobulina que tem a sequência de aminoácidos mostradas em SEQ ID n° 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167, ou 227. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacterianas, células de planta ou células de ar- chea.
As células eucarióticas exemplificadoras podem ser de origem mamí- 30 fera, de inseto, de aves ou de outra origem animal.
As células eucarióticas de mamífero incluem linhagens de células imortalizadas como linhagens de células de hibridoma ou mieloma como linhagens de células de murino
SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA CRL- 1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wilt- shire, Reino Unido, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem de células de mieloma de seres humanos 5 exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens de células úteis incluem aquelas derivadas de células do ovário do hamster chinês (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD,), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ou DG44. Outra modalidade da invenção é um método de fabricação de 10 um anticorpo reativo com TLR3 que compreende o cultivo de uma célula hospedeira da invenção e a recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira.
Os métodos de fabricação de anticorpos e de purificação dos mesmos são bem conhecidos na técnica.
Outra modalidade da invenção é uma linhagem celular de hibri- 15 doma que produz um anticorpo da invenção.
Outra modalidade é um anticorpo isolado ou fragmento do mes- mo, sendo que o anticorpo se liga aos resíduos de aminoácido do receptor do tipo Toll 3 (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, 20 L595, e K619 da SEQ ID n° 2. Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado ou frag- mento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga aos resíduos de aminoáci- dos do receptor do tipo Toll 3 (TLR3) S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195, e A219 da 25 SEQ ID n° 2. Diversas metodologias bem conhecidas podem ser empregadas a fim de determinar o epitopo de ligação dos anticorpos da invenção.
Por exemplo, quando as estruturas de ambos os componentes individuais são conhecidas, o acoplamento proteína-proteína in silico pode ser executado a 30 fim de identificar sítios compatíveis de interação.
A troca de hidrogênio- deutério (H/D) pode ser executada com o complexo de anticorpo e antígeno a fim de mapear as regiões no antígeno que podem ser ligadas através do anticorpo.
A mutagênese do ponto ou segmento do antígeno pode ser usada para localizar os aminoácidos importantes para a ligação de anticorpo.
Para grandes proteínas como TLR3, o mapeamento da mutagênese de ponto é simplificado quando o sítio de ligação é primeiramente localizado em uma 5 região na proteínas, como através de acoplamento, mutagênese do segmen- to o troca de H/D.
Quando as estruturas de ambos os componentes individu- ais são conhecidas, o acoplamento proteína-proteína em ambiente virtual pode ser executado a fim de identificar sítios de interação compatíveis.
A estrutura co-cristalina do complexo anticorpo-antígeno pode ser usada para 10 identificar resíduos que contribuem para o epitopo e o paratopo.
Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado ou frag- mento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga a TLR3 que tem uma se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos de Cho- thia da região variável da cadeia pesada W33, F50, D52, D54, Y56, N58, 15 P61, E95, Y97, Y100, e D100b, e com os resíduos de Chothia da região va- riável da cadeia leve Q27, Y32, N92, T93, L94, e S95. Os resíduos de Cho- thia do paratopo de cadeia pesada e do paratopo de cadeia leve correspon- dem aos resíduos de cadeia pesada W33, F50, D52, D55, Y57, N59, P62, E99, Y101, Y104, e D106 da SEQ ID n° 216 e aos resíduos de cadeia leve 20 Q27, Y32, N92, T93, L94, e S95 da SEQ ID n° 41. Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado ou frag- mento do mesmo, sendo que o anticorpo se liga a TLR3 tendo sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos de Chothia da regi- ão variável da cadeia pesada N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, 25 F99, e Y100, e com os resíduos de Chothia da região variável da cadeia leve G29, S30, Y31, Y32, E50, D51, Y91, D92, e D93. Os resíduos de Chothia do paratopo da cadeia pesada e do paratopo da cadeia leve correspondem aos resíduos de cadeia pesada N32, Q54, R56, S57, K58, Y60, Y104, P105, F106, e Y107 da SEQ ID n° 214 e aos resíduos da cadeia leve G28, S29, 30 Y30, Y31, E49, D50, Y90, D91, e D92 de SEQ ID n° 211. Anticorpos isolados com determinados resíduos de paratopo que se ligam a TLR3 podem ser produzidos, por exemplo, por enxertar os resí-
duos de paratopo em um arcabouço adequado, montar os arcabouços en- genheirados em anticorpos completos, expressar os anticorpos resultantes, e testar os anticorpos quanto a ligação a TLR3 ou quanto a um efeito sobre a atividade biológica de TLR3. Os arcabouços exemplificadores são sequên- 5 cias de aminoácido de regiões variáveis de anticorpo humano codificadas por genes de linhagem germinativa humanos.
Os arcabouços podem ser selecionados com base, por exemplo, na homologia de sequência como um todo, no % de identidade entre os resíduos de paratopo, ou na identidade de classe da estrutura canônica entre o arcabouço e um anticorpo exemplifica- 10 dor, como mAb 15EVQ ou mAb 12QVQ/QSV.
Genes de linhagem germinati- va de anticorpos humanos são apresentados, por exemplo, em Tomlinson et al., J.
Mol.
Biol 227:776 a 798, e na base de dados internacional ImMunoGe- neTics (IMGT) (http_://_www_imgt_org). Regiões estruturais consenso hu- manas também podem ser usadas, por exemplo, conforme descrito na pa- 15 tente U.S. n° 6.300.064. A seleção de um arcabouço adequado pode ser feita, por exemplo, de acordo com métodos descritos na publicação PCT n° WO10/045340. Genes de linhagem germinativa humanos exemplificadores que podem ser usados como arcabouços sobre os quais os resíduos de paratopo 20 são enxertados são os genes codificados pelas estruturas de V 1, V 3, Vh5, Vh6, J , J , e Jh.
As regiões J de linhagem germinativa são usadas na sua totalidade ou em parte para selecionar sequências FR4. Por exemplo, os resíduos de paratopo da cadeia leve do mAb 15EVQ podem ser enxertados a uma estrutura de V 1 codificada por IGKV1-39*01 que é unida diretamente 25 à sequência da região J codificada por IG J1. Sequências de outros genes de V 1 também podem ser usadas, e as sequências de FR4 de outros ge- nes de J podem ser substituídas ao invés de IG J1. Os resíduos de para- topo da cadeia pesada do mAb 15EVQ podem ser enxertados a uma estru- tura de Vh5 codificada por IGHV5-51*01, seguido de cerca de 11 a 13 resí- 30 duos, por exemplo, 12 resíduos, constituindo a HCDR3 e a sequência de FR4 codificada por IGHJ1. Os 11 a 13 resíduos ocupam entre o final da re- gião FR3 ("CAR") e o início da região FR4 (WGQ para a maioria das regiões
JH) e incluem 4 resíduos de paratopo definidos da Vh do mAb 15EVQ.
Se- quências de outros genes de Vh5 também podem ser usadas e sequências de FR4 de outros genes de Jh podem ser substituídas no lugar de IGJH1. Em outro exemplo, os resíduos de paratopo da cadeia leve do mAb 5 12QVQ/QSV podem ser enxertados a uma estrutura de V 3 codificada por IGLV3-1*01 que é unida diretamente à sequência da região J codificada por IGJL2. Sequências de outros genes de V 3 e J também podem ser usadas.
O comprimento de LCDR3 é mantido em cerca de 9 a 11 resíduos, por e- xemplo, 10 resíduos.
Estes cerca de 9 a 11 resíduos ocupam entre o final da 10 região FR3 ("YYC" para a maioria dos arcabouços lambda V) e o início da região FR4 ("FGG" para a maioria das regiões JL) e incluem 3 resíduos de paratopo definidos do mAb 12QVQ/QSV.
Os resíduos de paratopo da cadeia pesada do mAb 12QVQ/QSV podem ser enxertados a uma estrutura de Vh6 codificada por IGHV6-1*01, seguido de cerca de 9 a 11 resíduos, por exem- 15 plo, 10 resíduos, constituindo a HCDR3 e a sequência de FR4 codificada por IGJH1. Os cerca de 9 a 11 resíduos ocupam entre o final da região FR3 ("CAR") e o início da região FR4 (WGQ para a maioria das regiões JH) e incluem 4 resíduos de paratopo definidos da Vh do mAb 12QVQ/QSV.
As sequências de FR4 de outros genes de Jh podem ser substituídas no lugar 20 de IGHJ1. A ligação a TLR3 e a atividade biológica do anticorpo resultante podem ser avaliadas com o uso de métodos-padrão.
Os alinhamentos das regiões variáveis da cadeia leve e regiões variáveis da cadeia pesada dos mAb 15EVQ e do mAb 12QVQ/QSV com os genes exemplificadores de V 1, Vh5, V 3, Vh6, J , J ou Jh são mostrados nas figuras 32 a 35. Os anticor- 25 pos engenheirados com paratopo enxertado podem ser ainda modificados por substituições dos resíduos da Zona Vernier ou dos resíduos determinan- tes de afinidade para melhorar as propriedades do anticorpo, por exemplo, afinidade, conforme descrito acima.
Contanto que o anticorpo com paratopo enxertado retenha a ligação a TLR3, a sequência de aminoácido da estrutu- 30 ra no anticorpo com paratopo enxertado pode ser 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica às sequências estruturais dos mAb 15EVQ ou 12QVQ/QSV.
Sequências dos sítios de ligação ao antígeno podem ser enxer- tadas am adição aos resíduos de paratopo com o uso de métodos-padrão.
Por exemplo, uma HCDR3 ou LCDR3 completa pode ser enxertada.
Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado ou fragmento 5 do mesmo reativo com TLR3 que compete para a ligação de TLR3 a um an- ticorpo monoclonal, sendo que o anticorpo monoclonal compreende as se- quências de aminoácidos de determinadas regiões determinantes de com- plementaridade de cadeia pesada (CDRs) 1, 2 e 3, as sequências de amino- ácidos de determinadas CDRs de cadeia leve 1, 2 e 3, as sequências de 10 aminoácidos de determinadas regiões variáveis de cadeia pesada (VH) ou a sequência de aminoácidos de determinadas regiões variáveis de cadeia leve (VL). Os anticorpos monoclonais exemplificadores da invenção são um anti- corpo isolado que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 216 e uma se- 15 quência de aminoácidos de região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID n° 41, e um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pe- sada que tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 214 e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID n° 211. 20 A competição entre a ligação a TLR3 pode ser testada in vitro com o uso de métodos bem conhecidos.
Por exemplo, a ligação de anticorpo marcado com éster NHS MSD Sulfo-Tag™ a TLR3 na presença de um anti- corpo não marcado pode ser avaliada através de ELISA.
Anticorpos exempli- ficadores da invenção são mAb 12, mAb 15 e mAb c1811 (vide tabela 3a). 25 Os anticorpos anti-TLR3 previamente descritos c1068 e seus derivados (descritos na publicação de patente PCT No.
WO06/060513A2), TLR3.7 (e- Biosciences, cat. n° 14-9039) e IMG-315A da Imgenex (Imgenex IMG-315A; gerado contra os aminoácidos 55-70 do TLR3 humano, VLNLTHNQLRRL- PAAN) não competem com a ligação ao TLR3 com os mAbs 12, 15 ou 30 c1811 conforme mostrado no exemplo 5. Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado reativo com TLR3, em que o anticorpo tem pelo menos uma dentre as seguintes proprie-
dades: a. liga TLR3 humano com um Kd de <10 nM; b. reduz a atividade biológica de TLR3 humano em um ensaio in vitro de gene-repórter poli(I:C) NF-kB em >50% a 1 µg/ml; 5 c. inibe >60% da produção de IL-6 ou CXCL5/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml de poli(I:C) a 10 µg/ml; d. inibe >50% da produção de IL-6 ou CXCL5/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml poli(I:C) a 0,4 µg/ml; e. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas 10 com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 5 µg/ml; f. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 1 µg/ml; g. inibe >20% da produção de IFN- , IL-6 ou IL-12 induzida por poli(I:C) por células PBMC a 1 µg/ml. 15 h. inibe a atividade biológica de TLR3 em macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter NF-kB com IC50 <10 µg/ml; ou i. inibe a atividade biológica de TLR3 de macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter ISRE com IC50 <5 µg/ml.
Métodos de tratamento 20 Os antagonistas do TLR3 da invenção, por exemplo, os anticor- pos antagonistas do TLR3, podem ser usados para modular o sistema imu- nológico.
Embora não seja desejável se comprometer com qualquer teoria particular, os antagonistas da invenção podem modular o sistema imunológi- co evitando ou reduzindo a ligação do ligante ao TLR3, a dimerização de 25 TLR3, a internalização de TLR3 ou o tráfego de TLR3. Os métodos da in- venção podem ser usados para tratar um paciente animal pertencente a qualquer classificação.
Exemplos de tais animais incluem mamíferos como seres humanos, roedores, cães, gatos e animais da fazenda.
Por exemplo, os anticorpos da invenção são úteis na antagonização da atividade do TLR3, 30 no tratamento de inflamação, doenças inflamatórias e metabólicas e também são úteis na preparação de um medicamento para tal tratamento sendo que o medicamento é preparado para administração em dosagens aqui defini-
das.
Em geral, as condições inflamatórias, as condições associadas a infecções ou transtornos inflamatórios mediados pelo sistema imune que podem ser evitadas ou tratadas através da administração dos anticorpos 5 antagonistas do TLR3 da invenção incluem aquelas mediadas por citocinas ou quimiocinas e aquelas condições que resultam completa ou parcialmente da ativação de TLR3 ou da sinalização através da trajetória de TLR3. Exem- plos de tais condições inflamatórias incluem condições associadas a sepse, processo inflamatório intestinal, transtornos autoimunes, transtornos inflama- 10 tórios e condições associadas à infecção.
Acredita-se também que cânceres, condições cardiovasculares e metabólicas, condições neurológicas e fibróti- cas podem ser evitados ou tratados através da administração dos anticorpos antagonistas do TLR3 da invenção.
A inflamação pode afetar um tecido ou ser sistêmica.
Tecidos afetados exemplificadores são o trato respiratório, 15 pulmões, o trato gastrointestinal, intestino delgado, intestino grosso, cólon, reto, o sistema cardiovascular, tecido cardíaco, vasos sanguíneos, articula- ções, tecido sinuvial e ósseo, cartilagem, epitélio, endotélio, tecido hepático ou adiposo.
Condições inflamatórias sistêmicas exemplificadoras são tem- pestade de citocina ou hipercitoquinemia, síndrome de resposta inflamatória 20 sistêmica (SIRS), doença de enxerto-contra-hospedeiro (GVHD), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), síndrome do desconforto respira- tório agudo grave (SARS), síndrome antifosfolipídeo catastrófica, infecções virais severas, influenza, pneumonia, choque ou sepse.
A inflamação é uma resposta protetora de um organismo para se 25 defender contra um agente invasivo.
A inflamação é um evento em cascata que envolve muitos mediadores celulares e humorais.
Por um lado, a su- pressão de respostas inflamatórias pode deixar um hospedeiro imunocom- prometido; no entanto, se não for controlada, a inflamação pode levar a complicações sérias incluindo doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, 30 asma, psoríase, artrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, processo in- flamatório intestinal e similares), choque séptico e falha múltipla dos orgãos.
Significantemente, estes diversos estados doentios compartilham mediado-
res inflamatórios comuns, como citocina, quimiocinas, células inflamatórias e outros mediadores secretados por estas células.
A ativação do TLR3 por seus ligantes poli(I:C), dsRNA ou mRNA endógeno leva à ativação de trajetórias de sinalização que resultam na sín- 5 tese e secreção de citocinas pró-inflamatória, ativação e recrutamento de células inflamatórias, como macrófagos, granulócitos, neutrófilos e eosinófi- los, morte celular e destruição de tecido.
O TLR3 induz a secreção de IL-6, IL-8, IL-12, TNF- , MIP-1, CXCL5/IP-10 e RANTES, e outras citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas implicadas na ativação e recrutamento de células 10 imunes, contribuindo assim para a destruição do tecido em doenças autoi- mune e outras doenças inflamatórias.
O mRNA endógeno do ligante de TLR3 é liberado de células necróticas durante a inflamação, e pode resultar em um loop de feedback positivo para ativar TLR3 e perpetuar a inflamação e dano adicional ao tecido.
Os antagonistas de TLR3, como os anticorpos 15 antagonistas do TLR3, podem normalizar a secreção de citocina, reduzir o recrutamento de células inflamatórias e reduzir o dano ao tecido e a morte celular.
Portanto, os antagonistas de TLR3 apresentam potencial terapêutico para tratar inflamação e um espectro de condições inflamatórias.
Um exemplo de uma condição inflamatória é a condição associ- 20 ada à sepse que pode incluir síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), choque séptico ou síndrome de disfunção múltipla de orgãos (MODS). O dsRNA liberado através de infecções virais, bacterianas, fúngi- cas ou parasíticas e através de células necróticas pode contribuir para o iní- cio de sepse.
Embora se acredite, sem se ater a uma teoria particular, que o 25 tratamento com antagonistas de TLR3 possa fornecer um benefício terapêu- tico ao estender o tempo de sobrevivência em pacientes que sofrem de con- dições inflamatórias associadas à sepse, ou possa evitar que um evento lo- cal inflamatório (por exemplo, nos pulmões) se espalhe e se torne uma con- dição sistêmica, através da potencialização da atividade antimicrobiana ina- 30 ta, através da demonstração da atividade sinergistica quando combinada com agentes antimicrobianos, através da minimização do estado de inflama- ção local que contribui para a patologia, ou qualquer combinação dos mes-
mos.
Esta intervenção pode ser suficiente para permitir o tratamento adicio- nal (por exemplo, tratamento de infecção subjacente ou redução dos níveis de citocina) necessário para garantir a sobrevida do paciente.
A sepse pode ser modelada em animais, como camundongos, pela administração de D- 5 galactosamina e poli(I:C). Em tais modelos, a D-galactosamina é uma hepa- totoxina que funciona como um sintetizador de sepse e a poli(I:C) é uma mo- lécula que induz a sepse que imita o dsRNA e ativa TLR3. O tratamento com antagonistas de TLR3 pode aumentar as taxas de sobrevivência do animal em um modelo murino de sepse e, deste modo, os antagonistas de TLR3 10 podem ser úteis no tratamento de sepse.
A inflamação gastrointestinal é uma inflamação de uma camada mucosal do trato gastrointestinal, e abrange condições inflamatórias agudas e crônicas.
A inflamação aguda é geralmente caracterizada por um curto período de início e pela infiltração ou influxo de neutrófilos.
A inflamação 15 crônica é geralmente caracterizada por um período relativamente mais longo de início e pela infiltração ou influxo de células mononucleares.
A camada mucosal pode ser a mucosa dos intestinos (incluindo o intestino delgado e o intestino grosso), reto, revestimento do estômago (gástrico) ou da cavidade bucal.
Condições inflamatórias gastrointestinais crônicas exemplificadoras 20 são as doenças inflamatórias intestinais (IBD), colite induzida por insultos ambientais (por exemplo, inflamação gastrointestinal (por exemplo, colite) causada por ou associada a (por exemplo, como um efeito colateral) um re- gime terapêutico, como administração de quimioterapia, radioterapia e simi- lares), colite por infecção, colite isquêmica, colite colágena ou linfocítica, en- 25 terocolite necrosante, colite em condições como doenças grânulomatosa crônica ou doença celíaca, alergias alimentares, gastrite, enterocolite ou gastrite infecciosa (por exemplo, gastrite ativa crônica infectada por Helico- bacter pylori) e outras formas de inflamação gastrointestinal causadas por um agente infeccioso. 30 A doença inflamatória intestinal (IBD) inclui um grupo de trans- tornos inflamatórios crônicos de etiologia geralmente desconhecida, por e- xemplo, colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD). Evidências clínicas e experimentais sugerem que a patogênese da IBD é multifatorial que envolve genes de suscetibilidade e fatores ambientais.
Na doença inflamatória do intestino, o dano ao tecido resulta de uma imunoresposta inapropriada ou exagerada aos antígenos da microflora do sistema digestivo.
Existem diver- 5 sos modelos de animais para a doença inflamatória intestinal.
Alguns dos modelos mais usados são o modelo de colite induzida por etanol/ácido 2,4,6- trinitrobenossulfônico (TNBS) ou o modelo oxazalona, que induz ulceração e inflamação crônica no cólon (Neurath et al., Intern.
Rev.
Immunol 19:51 a 62, 2000). Outro modelo utiliza sulfato de dextrano sódico (DSS), que induz uma 10 colite aguda manifestada por diarreia de sangue, perda de peso, encolhi- mento do cólon e ulceração mucosal com infiltração neutrófila.
A colite indu- zida por DSS é caracterizada histologicamente pela infiltração de células inflamatórias na lâmina própria, com hiperplasia linfóide, dano focal da cripta e ulceração epitelial (Hendrickson et al., Clinical Microbiology Reviews 15:79 15 a 94, 2002). Outro modelo envolve a transferência adotiva de células T naive (virgens) de CD4 de alto CD45RB para camundongos RAG ou SCID.
Neste modelo, células T virgens do doador atacam o intestino recipiente causando inflamação crônica do sistema digestivo e sintomas similares a doenças in- flamatórias intestinais humanas (Read and Powrie, Curr.
Protoc.
Immunol. 20 capítulo 15 unidade 15,13, 2001). A administração de antagonistas da pre- sente invenção em qualquer um desses modelos pode ser usada para avali- ar a eficácia potencial daqueles antagonistas para melhorar os sintomas e alterar o curso de doenças associadas à inflamação no intestino, como do- ença inflamatória intestinal.
Estão disponíveis diversas opções de tratamento 25 para IBD, por exemplo, terapias do anticorpo anti-TNF- foram usadas ao longo de uma década para tratar doença de Crohn (Van Assche et al., Eur.
J.
Pharmacol.
Epub Outubro de 2009). Entretanto, uma porcentagem signifi- cativa de pacientes é refratária aos tratamentos atuais (Hanauer et al., Lan- cet 359:1541 a 1549, 2002; Hanauer et al., Gastroenterology 130:323 a 333, 30 2006) e, deste modo, são necessárias novas terapias que tenham como ob- jetivo populações de pacientes refratários.
Outro exemplo de uma condição inflamatória é uma condição in-
flamatória pulmonar.
Condições inflamatórias pulmonares exemplificadoras incluem condições pulmonares induzidas por infecção inclusive aquelas as- sociadas a infecções virais, bacterianas, fúngicas, por parasitas ou por prião; condições pulmonares induzidas por alérgeno; condições pulmonares indu- 5 zidas por poluentes como asbestose, silicose, ou beriliose; condições pul- monares induzidas por aspiração gástrica, desregulação imune, condições inflamatórias com predisposição genética como fibrose cística, e condições pulmonares induzidas por trauma físico, como lesão pelo ventilador.
Estas condições inflamatórias incluem também asma, enfisema, bronquite, doença 10 pulmonar obstrutiva crônica (COPD), sarcoidose, histiocitose, linfangiomio- matose, lesões pulmonares agudas, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar crônica, displasia broncopulmonar, pneumonia ad- quirida na comunidade, pneumonia nosocomial, pneumonia associado ao ventilador, sepse, pneumonia viral, infecção por influenza, infecções por pa- 15 rainfluenza, infecções por rotavírus, infecção por metapneumovírus humano, infecção pelo vírus sincicial respiratório e Aspergillus ou outras infecções fúngicas.
Doenças inflamatórias associadas à infecção exemplificadoras po- dem incluir pneumonia viral ou bacteriana, incluindo pneumonia grave, fibro- se cística, bronquite, exarcebações da via aérea e síndrome do desconforto 20 respiratório agudo (ARDS). Tais condições associadas à infecção podem envolver múltiplas infecções como uma infecção viral primária e uma infec- ção bacteriana secundária.
A asma é uma doença inflamatória dos pulmões que é caracteri- zada pela hiper-responsividade da via aérea ("AHR"), broncoconstrição, res- 25 piração ofegante, inflamação eosinofílica ou neutrofílica, hipersecreção de muco, fibrose subepitelial e níveis de IgE elevados.
Pacientes com asma sofrem "exacerbações", uma piora de sintomas, mais comumente devido a infecções microbianas do trato respiratório (por exemplo, rinovírus, vírus da influenza, Haemophilus influenza, etc.). Ataques asmáticos podem ser dispa- 30 rados por fatores ambientais (por exemplo, áscaris, insetos, animais (por exemplo, gato, cães, coelhos, camundongos, ratos, hamsters, porcos da ín- dio e pássaros), fungos, poluentes do ar (por exemplo, fumaça do tabaco),
gases irritantes, fumaças, vapores, aerossóis, produtos químicos, pólen, e- xercício ou ar frio.
Além de asma, várias doenças inflamatórias crônicas que afetam os pulmões são caracterizadas pela infiltração neutrófila nas vias aé- reas, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), pneumonia 5 bacteriana e fibrose cística (Linden et al., Eur.
Respir.
J. 15:973 a 977, 2000; Rahman et al., Clin.
Immunol. 115:268 a 276, 2005), e doenças como COPD, rinite alérgica e fibrose cística são caracterizadas por hiper- responsividade da via aérea (Fahy e O’Byrne, Am.
J.
Respir.
Crit.
Care Med. 163:822 e 823, 2001). Modelos animais comumente usados de asma e in- 10 flamação da via aérea incluem o modelo de desafio de ovalbumina e mode- los de sensibilização de metacolina (Hessel et al., Eur.
J.
Pharmacol. 293:401 a 412, 1995). A inibição da produção de citocina e quimiociona a partir de células epiteliais e bronquiais humanas cultivadas, fibroblastos bronquiais ou as células do músculo liso da via aérea também podem ser 15 usadas como modelos in vitro.
A administração de antagonistas da presente invenção em qualquer um desses modelos pode ser usada para avaliar o uso destes antagonistas para melhorar os sintomas e alterar o curso da as- ma, da inflamação da via aérea, COPD e similares.
Outras condições inflamatórias e neuropatias que podem ser evi- 20 tadas ou tratadas pelos métodos da invenção são aquelas causadas por do- enças autoimunes.
Estas condições e neuropatias incluem esclerose múlti- pla, lúpus sistêmico erimatoso, e transtornos neurodegenerativos e do sis- tema nervoso central (CNS) incluindo doença de Alzheimer, doença de Par- kinson, doença de Huntington, transtorno bipolar e esclerose lateral amiotró- 25 fica (ALS), doenças hepáticas incluindo cirrose biliar primária, colangite es- clerosante primária, esteatohepatite/doença hepática gordurosa não alcoóli- ca, fibrosis, vírus da hepatite C (HCV) e vírus da hepatite B (HBV), diabetes e transtornos cardiovasculares resitentes à insulina incluindo ateroesclerose, hemorragia cerebral, derrame e infarto do miocárdio, artrite, artrite reumatói- 30 de, artrite psoriática e artrite reumatóide juvenil (JRA), osteoporose, osteoar- trite, pancreatite, fibrose, encefalite, psoríase, artrite de células gigantes, es- pondolite anquilosante, hepatite autoimune, vírus da imunodeficiência huma-
na (HIV), condições inflamatórias da pele, transplante, câncer, alergias, do- enças endócrinas, reparo de ferimentos, outros transtornos autoimunes, hi- per-responsividade da via aérea e infecções ou transtornos mediados por células, vírus e príon. 5 A artrite, incluindo a osteoartrite, a artrite reumatóide, as articu- lações artríticas como um resultado de lesões, e similares, são condições inflamatórias comuns que se beneficiam do uso terapêutico de proteínas an- ti-inflamatórias, como os antagonistas da presente invenção.
Por exemplo, a artrite reumatóide (RA) é uma doença sistêmica que afeta todo o corpo e é 10 uma das formas mais comuns de artrite.
Já que a artrite reumatóide resulta em dano ao tecido, os ligantes de TLR3 poderiam estar presentes no sítio da inflamação.
A ativação da sinalização do TLR3 pode perpetuar a inflamação e danificar ainda o tecido na articulação inflamada.
Diversos modelos ani- mais de artrite reumatóide são conhecidos na técnica.
Por exemplo, no mo- 15 delo de artrite induzida por colágeno(CIA), os camundongos desenvolvem artrite inflamatória crônica que é muito similar à artrite reumatóide humana.
A administração dos antagonistas de TLR3 da presente invenção ao modelo de camundongo de CIA pode ser usada para avaliar o uso destes antagonis- tas para melhorar os sintomas e alterar o curso das doenças. 20 A diabetes mellitus, diabetes, refere-se a um processo de doen- ça derivado de múltiplos fatores causativos e caracterizado por hiperglicemia (LeRoith et al., (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Fila- délfia, PA, EUA. 1996), e todas as referências citadas no mesmo.
A hipergli- cemia descontrolada está associada à mortalidade prematura e aumentada 25 devido a um risco aumentado para doenças microvasculares e macrovascu- lares, incluindo nefropatia, neuropatia, retinopatia, hipertensão, doença ce- rebrovascular e doença cardíaca coronariana.
Portanto, o controle da home- ostase de glicose é uma abordagem criticamente importante para o trata- mento de diabetes. 30 Defeitos subjacentes levam a uma classificação de diabetes em dois grupos principais: diabetes do tipo I (diabete mellitus dependente de insulina, IDDM), que deriva quando os pacientes não têm células beta produ-
toras de insulina em suas glândulas pancreáticas, e diabetes do tipo 2 (dia- bete mellitus não dependente de insulina, NIDDM), que ocorre em pacientes com secreção debilitada de insulina de células beta e/ou com resistência à ação da insulina. 5 A diabetes tipo 2 é caracterizada por resistência à insulina a- companhada por deficiência de insulina relativa, não absoluta.
Em indivíduos resistentes à insulina, o corpo secreta quantidades anormalmente elevadas de insulina para compensar este defeito.
Quando quantidades inadequadas de insulina estão presentes para compensar a resistência à insulina e con- 10 trolar adequadamente a glicose, um estado de tolerância deficiente à glicose se desenvolve.
Em um número significativo de indivíduos, a secreção de insulina declina adicionalmente e o nível de glicose do plasma se eleva, re- sultando no estado clínico de diabetes.
A inflamação associada à adipose está fortemente implicada no desenvolvimento de resistência à insulina, dia- 15 betes tipo 2, dislipidemia e doença cardiovascular.
O tecido adiposo obeso recruta e retém macrófagos e pode produzir citocinas pró-inflamatórias em excesso incluindo TNF- e IL-6, ácidos graxos livres e adipocinas, que po- dem interferir na sinalização da insulina e induzir resistência à insulina.
A ativação de TLR3 em macrófagos pode contribuir para a situação pró- 20 inflamatória do adiposo.
São conhecidos diversos modelos animais de resis- tência à insulina.
Por exemplo, em um modelo de obesidade induzida por dieta (DIO), os animais desenvolvem hiperglicemia e resistência à insulina acompanhada por ganho de peso.
A administração de antagonistas de TLR3 da presente invenção ao modelo DIO pode ser usada para avaliar o uso dos 25 antagonistas para melhorar as complicações associadas à diabete tipo 2 e alterar o curso da doença.
Cânceres exemplificadores podem incluir ao menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou pacientes, incluindo, mas não se limitando a, leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica agura 30 (ALL), ALL das células B ou células T, leucemia mielóide aguda(AML), leu- cemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica aguda (CLL), leucemia de célula pilosa, síndromes mielodiplástica (MDS), um linfoma, doença de
Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, mie- loma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreá- tico, carcinoma de célula renal, câncer de mama, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndromeparaneoplástica/hipercalcemia por malignida- 5 de, tumores sólidos, adenocarcinomas, carcinoma de célula escamosa, sar- comas, melanoma maligno, melanoma particularmente metatástico, heman- gioma, doença metatástica, câncer relacionado à reabsorção óssea e câncer relacionado à dor nos ossos.
Doenças cardiovasculares exemplificadoras podem incluir doen- 10 ça cardiovascular em uma célula, tecido, órgão, animal ou pacientes, inclu- indo, mas não se limitando a, da parada cardíaca, infarto do miocárdio, insu- ficiência cardíaca congestiva, derrame, derrame isquêmico, hemorragia, ar- terioesclerose, ateroesclerose, reestenose, doença ateroesclerose de diabé- ticos, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, 15 choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, cor pulmo- nale, hipertensão pulmonar primária, arritmia cardíaca, batimentos ectópicos atriais, flutter atrial, fibrilação atrial (sustentada ou paroxística), síndrome pós-perfusão, resposta inflamatória do desvio cardiopulmonar, taquicardia atrial multifocal ou caótica, taquicardia de QRS estreita regular, arritmias es- 20 pecíficas, fibrilação ventricular, arritmia do feixe de His, bloqueio atrioventri- cular, bloquio da ramificação de feixe, transtornos isquêmicos do miocárdio, doença da artéria coronária, angina peitoral, infarto do miocárdio, cardiomio- patia, cardiomiopatia digestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doença do pericárdio, tumores cardíacos, 25 aneurismas periféricos e aórticos, dissecção aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, transtornos vasculares pe- riféricos, transtornos arteriais oclusivos, doença ateroesclerótica periférica, tromboangeíte obliterante, transtornos arteriais periféricos funcionais, doen- ça e fenômeno de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, 30 trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, linfoderma, lipede- ma, angina instável, lesões de reperfusão, síndrome pós bombeamento e lesões de isquemia-reperfusão.
Doenças neurológicas exemplificadoras podem incluir doenças neurológicas em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, mas não se limitando a, doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, enxaqueca, dores de cabeça, complexo AIDS demência, doenças desmieli- 5 nizantes, como esclerose múltipla e mielite transversa aguda; transtornos cereberales e extrapiramidais como lesões do sistema cortiespinhal; trans- tornos dos núcleos da base ou transtornos cerebelares; transtornos do mo- vimento hipercinético como coreia de Huntington e coreia senil; transtornos do movimentos induzidos por medicamentos, como aqueles induzidos por 10 medicamentos com receptores de dopamina CNS de bloqueio; transtornos do movimento hipocinético, como doença de Parkinson; paralisia supranu- clear progressiva; lesões estruturais do cerebelo; degenerações espinocere- belar, como ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degeneração de múltiplos sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, 15 Shi-Drager e Machado-Joseph); transtornos sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia e transtorno multisistêmico mito- condrial); transtornos de núcleo de desmielinação, como esclerose múltipla, mielite transversa aguda; e transtornos da unidade motora como atrofias musculares neurogênicas (degeneração da célula do corno anterior, como 20 esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia mus- cular espinhaljuvenil); doença de Alzheimer; síndrome de Down na meia ida- de; doença do corpo de Lewy difuso; demência senil do tipo do corpo de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoffe; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt-Jakob; panencefalite de esclerosamento subagudo, doença de 25 Hallerrorden-Spatz e demência pugilística.
Condições fibróticas exemplificadoras podem incluir fibrose do fígado (incluindo, mas não se limitando a, cirrose induzida pelo álcool, cirro- se induzida por vírus, hepatite induzida autoimune); fibrose dos pulmões (in- cluindo, mas não se limitando a, escleroderma, fibrosa pulmonar idiopática); 30 fibrose dos rins (incluindo, mas não se limitando a, escleroderma, nefrite di- abética, nefrite glomerular, nefrite lúpica); fibrose dérmica (incluindo, mas não se limitando a, escleroderma, cicatrização hipertrófica e quelóide, quei-
maduras); mielofibrose; neurofibromatose; fibroma; fibrose intestinal; e ade- sões fibróticas que resultam de procedimentos cirúrgicos.
Em tal método, a fibrose pode ser uma fibrose de orgão específico ou fibrose sistêmica.
A fi- brose de orgão específico pode estar associada a pelo menos um de fibrose 5 dos pulmões, fibrose do fígado, fibrose dos rins, fibrose do coração, fibrose vascular, fibrose da pele, fibrose do olho, fibrose da medula óssea ou outra fibrose.
A fibrose dos pulmões pode estar associada a pelo menos um den- tre fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar induzida por medicamento, asma, sarcoidose ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
A fibrose do fíga- 10 do pode estar associada a ao menos um dentre cirrose, esquistossomose ou colangite.
A cirrose pode ser selecionada a partir de cirrose alcoólica, cirrose pós-hepatite C, cirrose biliar primária.
A colangite é colangite de esclerosa- mento.
A fibrose dos rins pode estar associada a nefropatia diabética ou glomeruloscelerose lúpica.
A fibrose do coração pode estar associada ao 15 infarto do miocárdio.
A fibrose vascular pode estar associada à reestenose arterial pós angioplastia ou ateroesclerose.
A fibrose da pele pode estar as- sociada à cicatrização da queimadura, à cicatrização hipertrófica, qulóide ou à dermatologia de fibrosamento nefrogênico.
A fibrose do olho pode estar associada à fibrose retro-orbital, pós cirurgia de catarata ou vitreoretinopatia 20 proliferativa.
A fibrose da medula óssea pode estar associada à mielofibrose idiopática ou mielofibrose induzida por medicamentos.
A outra fibrose pode ser selecionada a partir de doença de Peyronie, contratura de Dupuytren ou dermatomiosite.
A fibrose sistêmica pode ser esclerose sistêmica ou doença de enxerto-contra-hospedeiro. 25 Administração/Composições Farmacêuticas A "quantidade terapeuticamente eficaz" do agente eficaz no tra- tamento ou da prevenção das condições onde a supressão da atividade de TLR3 é desejável por ser determinada através de técnicas de pesquisa pa- drão.
Por exemplo, a dosagem do agente que será eficaz no tratamento ou 30 prevenção de condições inflamatórias como asma, doença de Crohn, colite ulcerativa ou artrite reumatóide pode ser determinada através de administra- ção do agente em modelos relevantes de animais, como os modelos aqui descritos.
Além disso, testes in vitro podem, opcionalmente, ser emprega- dos para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem.
A seleção de uma dosagem eficaz particular pode ser determinada (por exemplo, através 5 de testes clínicos) por versados na técnica com base na consideração de vários fatores.
Tais fatores incluem a doença a ser tratada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do paciente, o estado imune do pa- ciente e outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica.
A dosa- gem que precisa ser empregada na formulação também irá depender da via 10 de administração e da severidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente.
As dosagens eficazes podem ser extrapoladas destas curvas de resposta à dosagem derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.
Nos métodos da invenção, o antagonista do TLR3 pode ser ad- 15 ministrado unicamente ou em combinação com pelo menos uma outra molé- cula.
Tais moléculas adicionais podem ser outras moléculas de antagonistas do TLR3 ou moléculas com um benefício terapêutico não mediado pela sina- lização do receptor de TLR3. Antibióticos, antivirais, paliativos e outros com- postos que reduzem os níveis de citocina ou a atividade são exemplos de 20 tais moléculas adicionais.
O modo de administração para uso terapêutico do agente da in- venção pode ser qualquer rota adequada que distribui o agente ao hospedei- ro.
As composições farmacêuticas destes agentes são particularmente úteis para administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intramuscular, 25 intraperitoneal, intravenosa, subcutânea ou intranasal.
O agente da invenção pode ser preparado como uma composi- ção farmacêutica que contém uma quantidade eficaz do agente como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável.
O termo "veí- culo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o 30 composto ativo é administrado.
Tais veículos farmacêuticos podem ser líqui- dos, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mi-
neral, óleo de gergelim e similares.
Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, li- vres de matéria particulada.
As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtra- 5 ção). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceutica- mente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisioló- gicas como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, de estabilização, espessantes, lubrificantes e corantes, etc.
A concentração do agente da in- venção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de 10 menos que cerca de 0,5%, usualmente em ou pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.
Deste modo, uma composição farmacêutica da invenção para in- 15 jeção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 ml de água tampo- nada estéril, e entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, por exemplo, cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou, com mais preferência, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um anticorpo antagonista de TLR3 da invenção.
De maneira simi- lar, uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa po- 20 deria ser preparada para conter cerca de 250 ml de solução de Ringer esté- ril, e cerca de 1 mg a cerca de 30 mg e, de preferência, 5 mg a cerca de 25 mg de um antagonista da invenção.
Os métodos atuais para preparar as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical 25 Science", 15a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.
Os anticorpos antagonistas da invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso.
Esta técnica mostrou-se eficaz com imunoglobulinas convencionais e em preparações de proteínas e as técnicas de reconstituição e de liofilização 30 conhecidas na técnica podem ser empregadas.
A presente invenção será agora descrita com relação aos se- guintes exemplos específicos não limitadores.
Exemplo 1 Identificação e Derivação de mAbs antagonistas de TLR3 Anti-humano A biblioteca de apresentação em fagos, MorphoSys Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®) Gold (Morphosys AG, Martinsried, 5 Alemanha) foi usada como uma fonte de fragmentos de anticorpo humano e foi submetida a ciclos de seleção (panning) utilizando-se o um antígeno de TLR3 purificado gerado da expressão de aminoácido 1-703 de TLR3 huma- no (huTLR3) (SEQ.
ID n°: 4) com uma etiqueta de poli-histidina C-terminal e purificados através de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.
Os 10 aminoácidos 1 a 703 correspondem ao domínio extracelular previsto (ECD) de huTLR3. Os fragmentos Fab (Fabs) que se ligaram especificamente a huTRL3 ECD foram selecionados pela apresentação da proteína de TLR3 em uma variedade de formas para que um conjunto diverso de fragmentos de anticorpo pudesse ser identificado, sequenciado e confirmado como úni- 15 co.
A partir de diferentes estratégias de planejamento, 62 candidatos (se- quências de região V diferentes) foram identificados como aglutinantes de ECD de TLR3 humano único.
Os 62 candidatos identificados como aglutinantes de ECD de TLR3 humano foram submetidos à triagem para atividade neutralizante na 20 faixa de testes à base de células relevantes para a identificação de atividade anti-inflamatória.
Usando-se os dados da atividade preliminar (vide exemplo 2 abaixo), quatro candidatos (Fabs 16 a 19) que definem as famílias 16 a 19 foram selecionados dentre os 62 como "pais" para maturação de CDR de CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) e de CDR3 de cadeia leve (LCDR3). Um 25 dos candidatos parentais (candidato 19) exibiu um sítio de glicosilação ligado por N em HCDR2; uma mutação de Ser para Ala (S para A) foi feita neste candidato para apagar o sítio.
Após a maturação de CDR dos quatro candi- datos parentais, um total de 15 candidatos de progênie (candidatos 1 a15) foram identificados para caracterização adicional conforme descrito no e- 30 xemplo 2 abaixo.
Uma listagem de regiões variáveis de cadeia pesada e leve presentes em cada um dos 19 candidatos é mostrada na tabela 3 acima.
Os candidatos são mencionados, na presente invenção, como mAbs 1 a 19 ou
Fabs 1 a 19, dependendo de se os mesmos são Fabs ou clonados como cadeias de anticorpo de tamanho total (exemplo 3). Devido à representação esquemática do vetor de expressão, as terminações amino amadurecias das regiões variáveis para todos os candidatos foram QVE para cadeia pesada e 5 DI para a cadeia leve.
As sequências preferenciais nestas terminações são aquelas nos genes de linhagem germinativa respectivas com identidade ele- vada para as sequências do candidato.
Para as famílias 17 e 18, as sequên- cias de linhagem germinativa são QVQ para VH e SY para VL.
Para a família 19, as sequências são EVQ para VH e DI para VL.
A sequência SY é exclu- 10 siva para o subgrupo lambda 3 e há relatórios de heterogeneidade ou com S ou com Y como o resíduo de terminal amino.
Deste modo, a terminação consensual de QSV do subgrupo lambda prominente 1 foi considerada uma substituição mais adequada para DIE para VL das famílias 17 e 18. Estas alterações foram introduzidas nos candidatos 9, 10 e 12 a partir da família 18 15 e nos candidatos 14 e 15, da família 19. Neste processo, ambas as regiões, VH e VL, destes anticorpos foram otimizadas por códon.
As sequências de aminoácidos das variantes da linhagem germinativa de N-terminal da região variável de cadeia leve dos candidatos 9, 10 e 11 são mostradas em SEQ ID nOS: 209-211, e as sequências de aminoácidos dos variantes da linhagem 20 germinativa de N-terminal da região variável de cadeia pesada para candida- tos 9, 10, 12, 14 e 15 são mostradas em SEQ ID nOS: 212-216, respectiva- mente.
As variantes de N-terminal dos candidatos são mencionados na pre- sente invenção como candidato/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ ou 15EVQ.
As variantes da linhagem germinativa de 25 N-terminal foi expressa como mAbs e não demonstraram nenhum efeito na ligação em TLR3 ou em sua capacidade para inibir atividade biológica de TLR3 quando comparadas a suas contrapartes parentais (dados não mos- trados). Exemplo 2 30 Determinação de Atividade de Antagonistas de TLR3 in vitro Os 15 candidatos amadurecidos por CDR descritos acima foram selecionados como terapêuticos humanos potenciais e uma faixa de ativida-
des de ligação e neutralizante foi determinada.
Os testes de atividade e os resultados para os quatro Fabs parentais, Fabs 16 a 19 e 15 Fabs amadure- cidos por CDR, Fabs 1 a 15 ou seus variantes de região V de linham não germinativa são descritos a seguir. 5 Inibição da Cascata de Sinalização de NF- B e ISRE Células 293T foram cultivadas em DMEM e meio GlutaMax (Invi- trogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementadas com FBS desativado a quente e transfectadas com 30 ng de pNF- B ou plasmídeos repórteres de luciferese de vagalume de ISRE, 13,5 ng de vetor de pcDNA3,1, 5 ng de phRL-TK, e 10 1,5 ng de pCDNA que codifica TLR3 de FL (SEQ.
ID n°: 2). O plasmídeo phRL-TK contém o gene luciferase de Renilla acionado pelo promotor quina- se timidina HSV-1 (Promega, Madion, WI). Os anticorpos TLR3 foram incu- bados durante 30 a 60 minutos antes da adição de poli(I:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). As placas foram incubadas durante 6 ou 24 horas a 15 37°C antes da adição do reagente luciferase Dual-Glo, e as placas foram lidas sobre um leitor de placa FLUOstar.
Os valores normalizados (razões de luciferase) foram obtidos através da divisão dos RLUs de vagalumes pelos RLUs de Renilla.
Mediante estímulo com o poli(I:C) do agonista de TLR3 (1 µg/ml), a produção de luciferase de vagalume estimulada pela cascata de 20 sinalização de ISRE ou NF- B foi inibida de modo específico através da in- cubação das células com anticorpos anti-TLR3 (0,4, 2,0 e 10 µg/ml) antes do estímulo.
Os resultados para os testes de NF- B são mostrados na figura 1 e são expressos como % de inibição da proporção de Firefly/Renilla com 5465 como o controle positivo (Mab anti-TLR3 humano neutralizante) e um mAb 25 antifator tecidual humano (859) como o controle isotípico de IgG4 humana. >Obteve-se 50% de inibição com concentrações de mAb de 0,4 a 10 µg/ml. c1068 e TLR3.7 inibiram cerca de 38% e 8% da atividade biológica de TLR3 a 10 µg/ml.
Resultados similares foram obtidos com o teste de gene-repórter ISRE (dados não mostrados). 30 Liberação de citocina em células BEAS-2B As células BEAS-2B (linhagem de células epiteliais brônquicas normais de ser humano transformadas por SV-40) foram semeadas em pra-
tos revestidos de colágeno tipo I e incubadas com ou sem anticorpos de TLR3 anti-humano antes da adição de poli (I:C). Vinte e quatro horas após os tratamentos, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de citocina e quimiocina foram analisados com o uso de um teste de microesfera de mul- 5 tiplexação de praxe para a detecção de IL-6, IL-8, CCL-2/MCP-1, C- CL5/RANTES, e CXCL10/IP-10. Os resultados são mostrados na figura 2 como % de inibição da citocina/quimiocina individual seguindo o tratamento de mAb com 0,4, 2,0 e 10 µg/ml. 5465 é um controle positivo; 859 é um con- trole isotípico. 10 Liberação de citocina em células NHBE A liberação de citocina também foi testada em células epiteliais brônquicas normais de ser humano (NHBE) (Lonza, Walkersville, MD, EUA). As células NHBE foram expandidas e transferidas para pratos revestidos de colágeno e incubadas por 48 horas após o que o meio foi removido e restau- 15 rado com 0,2 ml de um meio fesco.
As células foram então incubadas com ou sem mAbs de TLR3 anti-humano 60 minutos antes da adição de poli (I:C). Os sobrenadantes foram coletados após 24 horas e armazenados a - 20°C ou analisados imediatamente para os níveis IL-6. Os resultados estão representados por meio de gráfico na figura 3 como o % de inibição da se- 20 creção de IL-6 seguindo o tratamento com mAb com o uso de doses entre 0,001 e 50 µg/ml. 5465 é um controle positivo, 859 é um controle isotípico.
A maioria dos mAbs inibiu pelo menos 50% da produção de IL-6 a <1 µg/ml, e alcançou 75% de inibição a <5 µg/ml.
Liberação de citocina em células PBMC 25 A liberação de citocina também foi testada em células mononu- cleares de sangue periférico de ser humano (PBMC). O sangue integral foi coletado a partir de doadores humanos em tubos de coleta de heparina aos quais uma solução de Ficoll-Paque Plus foi lentamente em disposta cama- das por baixo.
Os tubos foram centrifugados e as PBMCs, que formaram 30 uma camada branca logo acima da Ficoll, foram recuperadas e plaqueadas.
As PBMCs foram então incubadas com ou sem mAbs anti-TLR3 humano antes da adição de 25 µg/ml de poli(I:C). Após 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de citocina foram determinados com o uso da tecnologia Luminex.
Os resultados estão dispostos em gráfico na figura 4 como uma inibição de porcentagem cumulativa de IFN- , IL-12 e IL-6 com o uso de uma dose única de mAb (0,4 µg/ml) com 5465 sendo um controle 5 positivo; hIgG4 sendo um controle isotípico.
Liberação de citocina em células de HASM Brevemente, as células do músculo liso das vias aéreas do ser humano (HASM) foram incubadas com ou sem mAbs de TLR3 anti-humano antes da adição de uma combinação sinérgica de 500 ng/ml de poli(I:C) e 10 10 ng/ml de TNF- . Após 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de citocina foram determinados com o uso da tecnologia Luminex.
Os resultados estão dispostos em gráfico na figura 5 como os níveis da quimo- cina CCL5/RANTES com o uso de três doses de mAb (0,4, 2 e 10 µg/ml). 5465 é um controle positivo; hIgG4 é um controle isotípico. 15 Os resultados dos testes in vitro em células de ser humano con- firmam a capacidade dos anticorpos da invenção de reduzirem a liberação de citocina e quimocinas como um resultado da ligação a huTLR3. Exemplo 3 Construtos de Anticorpo de Comprimento Total 20 As cadeias pesadas dos quatro Fabs parentais (candidatos n° 16 a 19) e dos 15 Fabs de progênie (candidatos n° 1 a 15) foram clonadas em antecedente de IgG4 de ser humano com uma mutação da Fc de S229P.
Os candidatos 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ ou 15EVQ fo- ram clonados em um antecedente de IgG4 de ser humano com mutações da 25 Fc de F235A/L236A e S229P.
As sequências de aminoácidos maduras da cadeia pesada com comprimento total são mostradas nas SEQ ID nOs: 90 a 102 e 218 a 220 da seguinte forma:
Candidato n° SEQ ID n° 16 90 17 91 18 92 19 93 1 94 2 95 3 96 4 97 5, 6, 7 98 8 99 9 100 10, 11, 12 101 13, 14, 15 102 9EVQ 218 10EVQ, 12EVQ 219 14EVQ, 15EVQ 220 Para a expressão, essas sequências de cadeia pesada podem incluir uma sequência líder N-terminal como MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID N° 103). As sequências de nucleotídeo exemplificadoras que codifi- 5 cam a cadeia pesada dos candidatos 14EVQ e 15EVQ com uma sequência líder e a forma madura (sem uma sequência líder) são mostradas na SEQ ID nOs: 104 e 105, respectivamente.
Da mesma maneira, para a expressão, as sequências de cadeia leve dos anticorpos da invenção podem incluir uma sequência líder N-terminal como MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID N° 10 106). As sequências de nucleotídeo exemplificadoras que codificam a cadeia leve de um candidato otimizado de códon 15 com uma sequência líder e a forma madura (sem uma sequência líder) são mostradas na SEQ ID nOs: 107 e 108, respectivamente.
Exemplo 4 15 Caracterização da ligação de mAb de Anti-TLR3 Os valores de EC50 para a ligação dos mAbs ao domínio extra- celular de TLR3 de ser humano (ECD) foram determinados pelo teste ELISA.
A proteína de ECD de TLR3 humano foi diluída para 2 µg/ml em PBS e alí- quotas de 100 µl foram dispensadas a cada poço de uma placa de 96 poços (Corning Inc., Acton, MA, EUA). Após incubação de um dia para outro a 4°C, a placa foi lavada 3 vezes em tampão de lavagem que consiste em 0,05% 5 de Tween-20 (Sigma-Aldrich) em PBS.
Os poços foram bloqueados com 200 µl de solução de bloqueio consistindo em 2% de I-Block (Applied Biosys- tems, Foster City, CA) e Tween-20 a 0,05% em PBS.
Após bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, a placa foi lavada 3 vezes, e isto foi segui- do da adição de diluições seriadas 10 Tabela 4 Candidato n° EC50 (ng/ml) 1 17,18 2 53,12 3 23,42 4 12,77 5 19,94 6 19 7 16,13 8 18,58 9 22,61 10 15,84 11 26,33 12 25,59 13 23,51 14 33,59 15 32,64 16 43,66 17 13,8 18 9,68 19 66,54
Dos candidatos a mAb anti-TLR3 1 a 19 em tampão de bloqueio.
Os mAbs do anti-TLR3 foram incubados durante 2 horas à temperatura am- biente e foram lavados 3 vezes.
A isso se seguiu a adição de um IgG anti- humano de carneiro conjugado à peroxidase (GE Healthcare, Piscataway,
NJ, EUA) diluído com uma razão de 1:4000 em um tampão bloqueador, in- cubado por 1 hora à temperatura ambiente seguido de 3 lavagens em tam- pão de lavagem.
A ligação foi detectada por uma incubação de 10 a 15 mi- nutos em TMB-S (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA, EU- 5 A). A reação foi interrompida com 25 µl de H2SO4 2 N e a absorbância foi lida a 450 nm com a subtração a 650 nm com o uso de um espectrofotôme- tro SPECTRA Max (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, EUA). Os valo- res de EC50 foram determinados mediante a regressão não linear com o uso de um software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, 10 EUA). Os valores de EC50 foram determinados para a ligação a hu- TLR3 (tabela 4) mediante a incubação com 100 µl de diluições em série de 4 vezes de mAbs a partir de 2,5 µg/ml a 0,6 pg/ml.
Um mAb antifator tecidual humano 859 e hu IgG4 foram incluídos como controles negativos. 15 Afinidade de ligação a ECD de huTLR3 também foi determinada pela análise Biacore.
Os dados (não mostrados) indicaram que os mAbs de 1 a 19 tinham um Kd em relação a ECD de huTLR3 menor que 10-8 M.
Exemplo 5 Ligação Competitiva de Epitopo 20 Experimentos relacionados à ligação de epitopo foram realiza- dos para determinar os grupos de competição de anticorpo anti-TLR3 ou "caixas de epitopo". Para o teste ELISA competitivo, 5 µl (20 µg/ml) da proteína de ECD de TLR3 humano gerada conforme descrito no exemplo 1 foi usado 25 como revestimento em uma placa HighBind da MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) por poço durante 2 horas à temperatura ambiente. 150 µl de tampão A bloqueador da MSD (Meso Scale Discovery) a 5% foram adicionados em cada poço e incubados por 2 horas à temperatura ambiente.
As placas foram lavadas três vezes com 0,1 M do tampão HEPES, pH 7,4, 30 seguido da adição da mistura de mAb do anti-TLR3 marcado com diferentes competidores.
Os anticorpos marcados (10 nM) foram incubados com con- centrações crescentes (1 nM a 2 µM) de anticorpos anti-TLR3 não marca-
dos, e então, foram adicionados aos poços designados em um volume de 25 µl de mistura.
Após incubação por 2 horas com agitação suave à temperatu- ra ambiente, as placas foram lavadas 3 vezes com 0,1 M do tampão HEPES (pH 7,4). O tampão de leitura T da MSD foi diluído com água destilada (4 5 vezes) e dispensado com um volume de 150 µl/poço e analisado com um gerador de imagens SECTOR 6000. Os anticorpos foram marcados com éster de NHS Sulfo-Tag® da MSD de acordo com as instruções do fabricante (Meso Scale Discovery). Os anticorpos anti-TLR3 a seguir foram avaliados: mAbs 1 a 19 10 obtidos a partir da biblioteca combinatória de anticorpos humanos Mor- phoSys (mostrados na tabela 3a); c1068 (descrito no documento WO06/060513A2), c1811 (mAb de rato anti-TLR3 de camundongo produzido por um hibridoma gerado a partir de ratos imunizados com a proteína de TLR3 de camundongo), TLR3,7 (eBiosciences, San Diego, CA, EUA, n° de 15 catálogo 14-9039) e IMG-315A (gerado contra os aminoácidos 55 a 70 de TLR3 humano (VLNLTHNQLRRLPAAN) junto à Imgenex, San Diego, CA, EUA). Para os mAbs 9, 10, 12, 14 e 15, as variantes 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ ou 15EVQ foram usadas nesse estudo.
Com base nos testes de competição, anticorpos anti-TLR3 foram 20 atribuídos a cinco caixas distintos distintas.
Caixa A: mAbs 1, 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; Caixa mAbs 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 11, 12QVQ/QSV, 17, 18; Caixa C: anticorpo da Imgenex IMG-315A; Caixa D: anticorpos TLR3,7, c1068; e Caixa E: anticorpo c1811. Exemplo 6 25 Mapeamento de Epitopo Anticorpos representativos de caixas diferentes de epitopos con- forme descrito no exemplo 5 foram selecionados para um mapeamento adi- cional de epitopos.
O mapeamento dos epitopos foi realizado com o uso de várias abordagens, incluindo experimentos de troca de segmento de TLR3, 30 mutagênese, permuta de H/D e acoplamento proteína-proteína in silico (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 6, Glen E.
Morris ed., 1996).
Troca de segmento de TLR3. Proteínas quiméricas de TLR3 humano-camundongo foram usadas para localizar domínios de ligação de anticorpo brutos em TLR3. O domínio extracelular da proteína de TLR3 hu- mano foi dividido em três segmentos (aa 1 a 209, aa 210 a 436, aa 437 a 5 708 de acordo com a numeração de aminoácido com base na sequência de aminoácidos de TLR3 humano, GenBank Acc. n° NP_003256). A proteína quimérica MT5420 foi gerada mediante a substituição dos aminoácidos de TLR3 humano 210 a 436 e 437 a 708 pelos aminoácidos de camindongo correspondentes (TLR3 de camundongo, GenBank Acc. n° NP_569054, a- 10 minoácidos 211 a 437 e 438 a 709). A quimera de MT6251 foi gerada medi- ante a substituição de aminoácidos de ser humano nas posições 437 a 708 por aminoácidos de TLR3 de camundongo (TLR3 de camundongo, GenBank Acc. n° NP_569054, aminoácidos 438 a 709). Todos os construtos foram gerados no vetor pCEP4 (da Life Technologies, Carslbad, CA, EUA) com o 15 uso de procedimentos de clonagem padrão.
As proteínas foram expressas de maneira transiente na células HEK293 como proteínas de fusão C- terminais V5-His6, e foram purificadas conforme descrito no exemplo 1. c1068 de mAb.
O ECD de TLR3 humano foi ligado a c1068 de mAb com um grau muito alto de afinidade, mas não se ligou de maneira sa- 20 tisfatória ao TLR3 de murino.
O c1068 perdeu sua capacidade de se ligar tanto a MT5420 quanto a MT6251, demonstrando que o sítio de ligação es- tava situado nos aminoácidos 437 a 708 da proteína de TLR3 de WT huma- na. 12QVQ/QSV de mAb. 12QVQ/QSVde mAb são ligados a ambas 25 as quimeras, indicando que o sítio de ligação para 12QVQ/QSV de mAb es- tava localizado nos aminoácidos de 1 a 209 da proteína de TLR3 humano que tem uma sequência mostrada na SEQ ID n°2. Acoplamento de proteína-proteína in silico.
A estrutura de cristal de mAb 15EVQ (consulte abaixo) e a estrutura de TLR3 humano publicada 30 (Bell et al., J.
Endotoxin Res. 12:375 a 378, 2006) foram minimizadas em energia em CHARMm (Brooks et al., J.
Computat.
Chem. 4:187 a 217, 1983) para uso como os modelos de partida para acoplamento.
O acoplamento de proteína foi executado com ZDOCKpro 1,0 (Accelrys, San Diego, CA), que é equivalente ao ZDOCK 2,1 (Chen and Weng, Proteins 51: 397 a 408, 2003) com uma grade angular de 6 graus.
Os resíduos de Asn de sítio de glicosila- ção n-ligados conhecidos em TLR3 humano (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 5 291, 398, 413, 507 e 636) (Sun et al., J.
Biol.
Chem. 281:11144 a 11151, 2006) foram bloqueados de participarcom relação à participação na interface complexa anticorpo-antígeno por um termo de energia no algorítimo de ZDOCK.
As 2000 posições iniciais foram produzidas e agrupadas, e as posi- ções de acoplamento foram refinadas e repontuadas em RDOCK (Li et al., 10 Proteins 53:693 a 707, 2003). As 200 posições com as pontuações de ZDOCK iniciais mais altas e as 200 posições de RDOCK superiores foram visualmente inspecionadas.
A cristalização de Fab 15EVQ foi executada por meio do método de difusão de vapor a 20°C (Benvenuti e Mangani, Nature Protocols 2:1633 15 a 1651, 2007). A triagem inicial foi configurada com o uso de um robô Hydra em placas de 96 poços.
Os experimentos foram compostos por gotículas de 0,5 µl de uma solução de proteína misturada com 0,5 µl de uma solução do reservatório.
As gotículas foram equilibradas contra 90 µl da solução do re- servatório.
A solução do Fab em 20 mM de tampão tris, pH 7,4, contendo 50 20 mM de NaCl foi concentrada para 14,3 mg/ml com o uso de células do filtro Amicon Ultra-5 kDa.
A triagem foi realizada com as telas de cristalização Wizard I & II (Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA, EUA) e internas.
Fab 12QVQ/QSV foi cristalizado de uma forma similar.
Os dados de difração de raios X foram coletados e processados 25 com o uso do gerador de raios X por microfoco Rigaku MicroMax® 007HF equipado com elementos ópticos confocais Osmic™ VariMax®, detector Sa- turn 944 CCD, e um sistema de crioresfriamento X-stream® 2000 (Rigaku, Woodlands, TX, EUA). As intensidades de difração foram detectadas acima de uma rotação de cristal de 270° com o tempo de exposição de 120 segun- 30 dos por imagem de meio grau.
Os dados de raios X foram processados com o programa D*TREK (Rigaku). A estrutura foi determinada pelo método de substituição molecular com o uso do programa Phaser ou CNX (Accelrys,
San Diego, CA, EUA). As posições atômicas e os fatores de temperatura foram refinados com REFMAC com o uso de todos os dados na faixa de re- solução de 15 a 2,2 Å para Fab 15EVQ e 50 a 1,9 Å para Fab 12QVQ/QSV.
As moléculas de água foram adicionadas nos picos de densidade de elétron 5 (Fo-Fc) com o uso do nível de corte de 3 . Todos os cálculos cristalográficos foram realizados com o conjunto CCP4 de programas (Collaborative Compu- tational Project, número 4. 1994. The CCP4 suite: programs for protein crys- tallography.
Acta Crystallogr.
D50:760 a 763). Ajustes de modelo foram exe- cutados com o uso do programa COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr. 10 D60:2126 a 2132, 2004). A estrutura de cristal resoluta de mAb 15EVQ mostrou que o sí- tio de combinação de anticorpo foi caracterizado por inúmeros resíduos car- regados negativamente na cadeia pesada (D52, D55, E99, D106 e D109). Dessa forma, o reconhecimento entre o mAb 15EVQ e o TLR3 envolveu 15 provavelmente resíduos carregados positivamente As simulações de aco- plamento proteína-proteína realizadas sugeriram que dois emplastros gran- des em TLR3 envolvendo múltiplos resíduos de carga positiva apresentaram uma complementaridade satisfatória ao anticorpo.
Os resíduos em TLR3 na interface dos complexos simulados pelo anticorpo TLR3 - anti-TLR3 foram 20 R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 e K493. Estudos de mutagênese.
As mutações pontuais de combinação e únicas foram introduzidas em resíduos de superfície de ECD de TLR3 nas regiões identificadas acima para conter os epitopos de mAb 12 e mAb 15EVQ e as proteínas mutantes foram testadas quanto à ligação de anticor- 25 po.
A sequência de nucleotídeo que codifica os aminoácidos de TLR3 humano 1 a 703 (o ECD), (SEQ ID n° 4; número de acesso ao Gen- BankNP_003256) foi clonada com o uso de protocolos padrão.
Todos os mutantes foram gerados pela mutagênese sítio-dirigida com o uso do kit 30 Quickchange II XL da Strategene (Stratagene, San Diego, CA, EUA) de a- cordo com o protocolo do fabricante, com o uso dos oligonucleotídeos mos- trados na tabela 5a.
As mutações foram verificadas pelo sequenciamento de
DNA.
As proteínas foram expressas com um promotor CMV como fusões de His-tag C-terminais em células HEK293, e foram purificadas conforme des- crito no exemplo 1. Ensaios de ligação.
A atividade de ligação de 12QVQ/QSV de 5 mAb e mAb 15EVQ ao TLR3 humano e as variantes geradas foram avalia- das por meio do teste ELISA.
Para acelerar o processo, os mutantes no sítio de ligação de mAb 15EVQ previstos foram co-expressos em células HEK mediante a co-transfecção do mutante do ECD de TLR3 contendo um His tag C-terminal com 12QVQ/QSV de mAb, seguido da purificação por croma- 10 tografia de afinidade de metal.
A amostra recuperada foi um complexo do mutante de TLR3 com o mAb 12. Essa abordagem foi possível porque os sítios de ligação de 12QVQ/QSV de mAb e mAb 15EVQ são distantes um do outro; e dessa forma, é improvável que mutações pontuais em um sítio afe- tem o epitopo no outro sítio.
Esses complexos foram usados nos testes de 15 ligação ELISA. 5 µl por poço de 20 µg/ml de ECD do TLR3 de ocorrência natural ou proteínas mutantes em PBS foram revestidos em uma placa Hi- ghBind da MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 60 min e bloqueadas
Tabela 5a.
As sequências dos oligonucleotídeos senso são mostradas.
Os oligonucletídeos antissenso com sequências com- plementares foram usados na reação de mutagênese.
Variante Oligo Seq ID N°: R64E 5’ CCTTACCCATAATGAACTCGAGAGATTACCAGCCGCCAAC 3’ 136 K182E 5’CAAGAGCTTCTATTATCAAACAATGAGATTCAAGCGCTAAAAAGTGAAG 3’ 137 K416E 5’ CCTTACACATACTCAACCTAACCGAGAATAAAATCTCAAAAATAG 3’ 138 K467E/Y468A 5’ GAAATCTATCTTTCCTACAACGAGGCCCTGCAGCTGACTAGGAACTC 3’ 139 R488/R489/K493E 5’ GCCTTCAACGACTGATGCTCGAGGAGGTGGCCCTTGAGAATGTGGATAGCTCTCCTTC 3’ 140 T472S/R473T/N474S 5’ GTACCTGCAGCTGTCTACGAGCTCCTTTGCCTTGGTCCC 3’ 141
80/133 N196A 5’ GAAGAACTGGATATCTTTGCCGCTTCATCTTTAAAAAAATTAGAGTTG 3’ 169 Q167A 5’ GTCATCTACAAAATTAGGAACTGCGGTTCAGCTGGAAAATCTCC 3’ 170 K163E 5’ CTCATAATGGCTTGTCATCTACAGAATTAGGAACTCAGGTTCAGC 3’ 171 K147E 5’ GAAAATTAAAAATAATCCCTTTGTCAAGCAGGAGAATTTAATCACATTAGATCTGTC 3’ 172 K145E 5’ GAAAATTAAAAATAATCCCTTTGTCGAGCAGAAGAATTTAATCACATTAG 3’ 173 V144A 5’ CAGAAAATTAAAAATAATCCCTTTGCAAAGCAGAAGAATTTAATCACATTAG 3’ 174 N140A 5’ CCAACTCAATCCAGAAAATTAAAGCTAATCCCTTTGTCAAGCAGAAG 3’ 175 D116R 5’ CAATGAGCTATCTCAACTTTCTCGTAAAACCTTTGCCTTCTGCAC 3’ 176 D536K 5’ GTCTTGAGAAACTAGAAATTCTCAAGTTGCAGCATAACAACTTAGCAC 3’ 177 D536A 5’ CTTGAGAAACTAGAAATTCTCGCATTGCAGCATAACAACTTAGCAC 3’ 178 K619E 5’ CTAAAGTCATTGAACCTTCAGGAGAATCTCATAACATCCGTTG 3’ 179
Variante Oligo Seq ID N°: K619A 5’ CTCTAAAGTCATTGAACCTTCAGGCGAATCTCATAACATCCGTTGAG 3’ 180 E570R 5’ CCACATCCTTAACTTGAGGTCCAACGGCTTTGACGAG 3’ 181 N541A 5’ GAAATTCTCGATTTGCAGCATAACGCCTTAGCACGGCTCTGGAAAC 3’ 182 Q538A 5’ GAGAAACTAGAAATTCTCGATTTGGCGCATAACAACTTAGCACGGC 3’ 183 H539E 5’ CTAGAAATTCTCGATTTGCAGGAAAACAACTTAGCACGGCTCTG 3’ 184 H539A 5’ CTAGAAATTCTCGATTTGCAGGCTAACAACTTAGCACGGCTCTG 3’ 185 N517A 5’ CATTCTGGATCTAAGCAACAACGCCATAGCCAACATAAATGATGAC 3’ 186 Y465A 5’ GAAAATATTTTCGAAATCTATCTTTCCGCCAACAAGTACCTGCAGCTGAC 3’ 187
81/133 R488E 5’ GCCTTCAACGACTGATGCTCGAAAGGGTGGCCCTTAAAAATG 3’ 188 R489E 5’ CTTCAACGACTGATGCTCCGAGAGGTGGCCCTTAAAAATGTGG 3’ 189 K467E 5’ CGAAATCTATCTTTCCTACAACGAGTACCTGCAGCTGACTAG 3’ 190
De um dia para o outro em tampão bloqueador A MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) a 4°C.
No dia seguinte, as placas foram lavadas e o mAb 15EVQ marcado por Sulfo-tag da MSD foi adiciona- do em concentrações de 500 pM a 1 pM durante 1,5 horas.
Após as lava- 5 gens, o anticorpo marcado foi detectado com o uso do tampão de leitura T da MSD e as placas foram lidas com o uso de um formado de imagem SEC- TOR 6000. Para avaliar a atividade de ligação de 12QVQ/QSV de mAb ao TLR3 humano e as variantes, uma co-expressão foi executada com mAb 15EVQ e os testes ELISA de ligação foram realizados conforme descrito pa- 10 ra mAb 15EVQ, exceto pelo fato de que o anticorpo detector foi mAb 12QVQ/QSV marcado. 12QVQ/QSV de mAb: O sítio de ligação para 12QVQ/QSV de mAb estava localizado nos aminoácidos 1 a 209 da proteína de TLR3 huma- no conforme determinado nos estudos de troca de segmento.
Os mutantes 15 de TLR3 a seguir foram avaliados: D116R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E, e Q167A.
O TLR3 de ocorrência natural e o mutante de V144A apresentaram ligação comparável a 12QVQ/QSV de mAb (figura 6A). O anticorpo não se ligou ao mutante de D116R do TLR3 e teve uma afinida- de de ligação significativamente reduzida ao mutante de K145E.
Dessa for- 20 ma, os resíduos de D116 e K145 que são colocados juntos sobre a superfí- cie de TLR3 foram identificados como sítios de epitopo chave para 12QVQ/QSV de mAb (figura 7A). Os dois resíduos críticos do epitopo de ligação do mAb 12QVQ/QSV estavam localizados próximos da face do sítio de ligação de 25 dsRNA no segmento N-terminal do ectodomínio de TLR3 (Pirher, et al., Na- ture Struct. & Mol.
Biol., 15:761 a 763, 2008). O epitopo completo conterá outros resíduos nas regiões vizinhas, os quais não foram revelados pelas análises mutacionais realizadas.
Sem se ater a qualquer teoria em particular, acredita-se que a ligação de 12QVQ/QSV de mAb em seu epitopo de TLR3 30 pode interferir direta ou indiretamente com a ligação de dsRNA no electodo- míno de TLR3, perturbando, assim, a dimerização do receptor e a ativação de trajetórias de sinalização a jusante.
mAb 15EVQ: Os mutantes de TLR3 a seguir foram avaliados: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, Q538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, um mutante duplo K467E/Y468A, um mutante triplo T472S/R473T/N474S, e um mutante 5 triplo R488E/R489E/K493E.
O TLR3 de ocorrência natural, os mutantes R64E, K182E, K416E e o mutante triplo T472S/R473T/N474S apresentaram uma ligação comparável a mAb 15EVQ (figura 6B e tabela 5b). O anticorpo não se ligou aos mutantes de TLR3 K467E, R489E, K467E/Y468A e R488E/R489E/K493E (figura 6B e 6C). As variantes remanescentes apre- 10 sentaram uma ligação intermediária com R488E tendo o maior efeito.
Todos esses mutantes se ligam a 12QVQ/QSV de mAb.
Esses resultados mostra- ram que os resíduos K467 e R489 foram determinantes críticos do epitopo mAb 15EVQ.
O resíduo R488 também contribuiu com o epitopo.
Esses resí- duos foram colocados de maneira junta sobre a mesma superfície de TLR3 15 (figura 7A). Os resultados também mostraram que os resíduos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570, e K619, todos sobre a mesma super- fície, como K467, R488 e R489, contribuíram com o epitopo.
Essa conclusão foi suportada adicionalmente pelos estudos de troca de H/D com mAb 15EVQ.
A figura 7A mostra sítios de epitopo de ligação para 12QVQ/QSV de 20 mAbs e mAb de 15EVQ (negro) e C1068 (cinza) sobrepostos sobre a estru- tura do TLR3 humano.
O epitopo para mAb 15EVQ abrange os resíduos Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, Q538, H539, N541, E570, e K619. Estudos de troca de H/D.
Para a troca de H/D, os procedimentos 25 usados para analisar a perturbação de anticorpo foram similares ao que foi descrito anteriormente (Hamuro et al., J.
Biomol.
Techniques 14:171 a 182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45:8488 a 8498, 2006) com algumas modifi- cações.
O ECD do TLR3 recombinante(expresso a partir das células Sf9 com His-tag C-terminal e purificadas) foi incubado em uma solução de água 30 deuterada por períodos predeterminados resultando na incorporação de deu- tério em átomos de hidrogênio permutáveis.
O ECD de TLR3 deuterado foi capturado em uma coluna contendo mAb 15EVQ imobilizado e, então, foi lavado com tampão aquoso.
A proteína do ECD do TLR3 permutada de volta foi eluída a partir da coluna e a localização dos fragmentos contendo deuté- rio foi determinada pela digestão de protease e análise de espectometria de massa.
Como um controle de referência, a amostra de ECD de TLR3 foi pro- 5 cessada de maneira similar exceto pelo fato de que foi exposta à água deu- terada apenas após a captura na coluna de anticorpo, e então, foi lavada e eluída da mesma maneira da amostra experimental.
As regiões ligadas ao anticorpo foram indicadas para serem aqueles sítios relativamente protegi- dos da permuta e, dessa forma, contêm uma fração mais alta de deutério do 10 que a amostra de ECD de TLR3 de referência.
Aproximadamente 80% da proteína poderia ser mapeada com relação aos peptídeos específicos.
Os mapas de perturbação da permuta H/D do ECD de TLR3 pelo mAb 15EVQ são mostrados na figura 7B.
Apenas os segmento de TLR3 em redor da por- ção afetada pelo mAb 15EVQ é mostrado por razão de clareza.
O restante 15 da proteína que se estende às terminações amino e carboxila do ECD de TLR3 não foi afetado de maneira apreciável.
Os estudos de permuta H/D identificaram segmentos de peptí- deo 465YNKYLQL471, 514SNNNIANINDDML526 e 529LEKL532 da SEQ ID n° 2 como as regiões em que a permuta em TLR3 foi particularmente alterada 20 mediante a ligação ao mAb 15EVQ.
Por sua natureza, a permuta H/D é um método de mapeamento linear e normalmente não pode definir quais resí- duos no segmento de peptídeo são mais afetados pela ligação ao anticorpo.
Entretanto, a sobreposição extensiva entre os resultados mutacionais e de troca H/D fornece uma segurança adicional de que a superfície mostrada na 25 figura 7A é o sítio de ligação para o mAb 15EVQ.
Esse sítio de ligação esta- va na mesma região de sequências de aminoácidos linear conforme anteri- ormente descrito para c1068 de mAb (publicação PCT n° WO06/060513A2) mas verificou-se estar localizado sobre uma superfície completamente não sobreposta (figura 7A) de acordo com a falta de competição cruzada entre 30 esses anticorpos.
O epitopo de ligação do mAb 15EVQ estava espacialmente pró- ximo ao sítio de ligação de dsRNA no segmento C-terminal em TLR3 (Bell et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (USA) 103: 8792 a 8797, 2006; Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem, 282: 7668 a 7678, 2007; Liu et al., Science, 320: 379 a 381, 2008). Sem se ater a qualquer teoria em particular, acredita-se que a ligação do mAb 15EVQ ao epitopo sobre TLR3 causa encontros estéricos com uma 5 molécula de dsRNA ligante e/ou o parceiro de dímero, impedindo a ligação do ligante e a dimerização do receptor induzida pelo ligante.
Tabela 5b.
Variante mAb15 Variante mAb12 wt TLR3 ECD +++ wt TLR3 ECD +++ R64E +++ D116R - K182E +++ N140A ++ K416E +++ V144A +++ Y465A ++ K145E + K467E - K147E ++ R488E + K163E ++ R489E - Q167A ++ N517A ++ N196A ++ D536K ++ D536A ++ Q538A ++ H539E ++ H539A ++ N541A ++ E570R ++ K619E ++ K619A ++ K467E/Y468A - R488/R489/K493E - T472S/R473T/N474S +++
Exemplo 7 Geração de variantes com estabilidade térmica otimizada 10 O engenheiramento com base em estrutura foi conduzido para gerar variantes de anticorpo com estabilidade térmica aumentada, com es- forços simultâneos de manter a atividade biológica e minimizar a imunogeni-
cidade.
O mAb 15EVQ foi selecionado para o engenheiramento.
Para minimizar a imunogenicidade, apenas as mutações de linha germinativa pre- vistas para serem benéficas com base em considerações estruturais foram 5 perseguidas.
As sequências VL e VH do 15EVQ de mAb (SEQ ID n° 41 e SEQ ID n° 216, respectivamente) foram alinhadas com os genes de linha germinativa humana com o uso das pesquisas BLAST.
As sequências de linha germinativa mais próximas identificadas foram as de n° AAC09093 e X59318 do GenBank Acc. para VH e VL, respectivamente.
As diferenças a 10 seguir foram identificada entre a linha germinativa VH, VL e aquelas das se- quências VH e VL do mAb 15EVQ: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S, e Q67H; (VL) G30S, L31S, e A34N.
As diferenças de sequência identificadas foram mapeadas sobre a estrutura de cristal do mAb 15EVQ, e os resíduos previs- tos para alterar as interações de interface e pacote foram selecionados para 15 o engenheiramento.
Com base na estrutura de cristal do anticorpo (vide e- xemplo 6), foram identificados resíduos de desestabilização de estrutura em potencial. (1) Uma pequena cavidade encerrada foi identificada no núcleo de VH próximo a V34. Essa cavidade era grande o suficiente para acomodar uma cadeia lateral levemente maior como Ile. (2) E99 do CDR3 de VH foi 20 inserido na interface VH/VL sem uma rede de ligação H.
O grupo carboxilato carregado negativamente de E99 estava em um ambiente genericamente hidrofóbico na maioria das vezes com contatos van der Waals (vdw) aos re- síduos adjacentes.
O enterramento de um grupo de carga é normalmente desfavorável energeticamente e, dessa forma, tem um efeito desestabilizan- 25 te. (3) F50 de VH é um resíduo da interface VH/VL.
Sua cadeia lateral aro- mática é volumosa e, por isso, pode ter um impacto negativo sobre o parea- mento.
As redes de ligação H e pacote vdw para Fv foram calculadas e visu- almente inspecionadas em Pymol (www://_pymol_org). As cavidades enter- radas nos domínios VH e VL foram calculadas por Caver (Petrek et al., BMC 30 Bioinformatics, 7:316, 2006). Todos as figuras dos gráficos moleculares fo- ram preparadas em Pymol.
As mutações foram feitas para os vetores de ex- pressão que codificam os fragmentos Fab ou os anticorpos humanos totais
IgG4 gerados conforme descrito no exemplo 3 com o uso de técnicas de clonagem padrão fazendo uso do kit de mutagênese sítio-dirigida Quick Change II XL (Stratagene, San Diego, CA.
EUA), Kit de mutagênese sítio- dirigida Change-IT Multiple Mutation (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) 5 ou Kit de mutagênese sítio-dirigida Quick Change II (Stratagene, San Diego, CA, EUA). As reações foram realizadas de acordo com cada uma das reco- mendações do fabricante.
Os clones obtidos foram sequenciados para verifi- cação, e as variantes engenheiradas resultantes foram chamadas mAbs 15- 1 - 15-10 de acordo com sua cadeia pesada ou leve modificada.
Cada ca- 10 deia variante (H ou L) foi expressa com a cadeia L ou H selvagem do mAb 15EVQ para produzir anticorpos, com a exceção de que a cadeia pesada para o mAb 15-10 foi do mAb 15-6. Uma lista das SEQ ID n°s para as CDRs, regiões variáveis das cadeias pesada e leve e cadeias pesadas e leves de extensão completa para o mAb 15EVQ e suas variantes engenheiradas é 15 mostrada na tabela 6. A tabela 7 mostra iniciadores para a geração de cada variante.
Tabela 6 SEQ.
ID n°: Candidato n°: HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 LV HV Pesada lgG4 Cadeia leve 15 111 112 84 109 110 113 41 216 220 156 15-1 111 114 84 109 110 113 41 124 130 156 15-2 115 112 84 109 110 113 41 125 131 156 15-3 116 112 84 109 110 113 41 126 132 156 15-4 111 117 84 109 110 113 41 127 133 156 15-5 116 118 84 109 110 113 41 128 134 156 15-6 116 112 119 109 110 113 41 129 135 156
88/133 15-7 111 112 84 120 110 113 122 42 102 157 15-8 111 112 84 121 110 113 123 42 102 158 15-9 116 118 119 109 110 113 41 159 160 156 15-10 116 112 119 109 110 226 225 129 135 227
A ligação dos mAbs 15-1 - 15-9 ao TLR3 foi avaliada pelo imu- noteste ELISA.
O ECD do TLR3 de ser humano (100 µl de 2 µg/ml de ECD do TLR3) foi ligada a uma placa Maxisorb negra (eBioscience) de um dia para o outro a 4°C.
As placas foram lavadas e bloqueadas, e os anticorpos 5 diluídos foram divididos em pequenas quantidades de 50 µl por poço em du- plicata sobre os poços.
A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas com agitação suave.
A ligação foi detectada com o uso do substrato luminescence POD (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha, n° cat 11 582 950 001) e cabra anti-humano Fc:HRP (Jackson ImmunoResearch, 10 West Grove, PA, EUA, n° cat. 109-035-098) e a placa foi lida em um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Os experimentos de DSC foram realizados em um sistema de DSC Auto VP-capillary da MicroCal (MicroCal, LLC, Northampton, MA, EUA) em que as diferenças de temperatura entre as células de amostra e referên- 15 cia foram medidas continuamente, e calibradas para as unidades de força.
As amostras foram aquecidas de 10°C a 95°C com uma taxa de aquecimen- to de 60°C/hora.
O tempo de pré-varredura foi de 15 minutos e o período de filtragem foi de 10 segundos.
A concentração usada nos experimentos de DSC foi de cerca de 0,5 mg/ml.
A análise dos termogramas resultantes foi 20 realizada com o uso do software MicroCal Origin 7 (MicroCal, LLC).
Tabela 7 Candida- Mutantes Iniciadores SEQ.
ID to n°: n°: 15-1 HC: F50R GCCTGGAGTGGATGGGCCGGATCGACCCCAGCG 142 CGCTGGGGTCGATCCGGCCCATCCACTCCAGGC 143 15-2 HC: V34I AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 144 GCATCTGGCGCACCCAGCCGATCCAGTAGTTGGTGAAG 145 15-3 HC: V34I/G35S AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 146 GCATCTGGCGCACCCAGCTGATCCAGTAGTTGGTGAAG 147 15-4 HC: A61S/Q67H AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 144 CGCTGATGGTCACGTGGCCCTGGAAGCTAGGGCTGTAGTTGGTGTAG 148
90/133 15-5 HC: CTTCACCAACTACTGGATCAGCTGGGTGCGCCAGATGC 149 F50R/V34I/G35S/A61S/Q67H CGCTGATGGTCACGTGGCCCTGGAAGCTAGGGCTGTAGTTGGTGTAG 148 15-6 HC: V34I/G35S/E99Q CGCCATGTACTACTGCGCCCGCCAGCTGTACCAGGGCTAC 150 GTAGCCCTGGTACAGCTGGCGGGCGCAGTAGTACATGGCG 151 15-7 LC: G30S/L31S GCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGC 152 GCTGGTACCAGGCCAGGTAGCTGCTGATGCTCTGGCTGGC 153 15-8 LC: A34N AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 144 CGGGCTTCTGCTGGTACCAGTTCAGGTAGCTGCTGATGCTCTG 154 15-9 HC: CGCCATGTACTACTGCGCCCGCCAGCTGTACCAGGGCTAC 150 F50R/V34I/G35S/A61S/ GTAGCCCTGGTACAGCTGGCGGGCGCAGTAGTACATGGCG 151 Q67H/E99Q 15-10 LC: S95P CAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCCAG 228 CTGGCCGAAGGTGTAGGGCAGGGTGTTGCCCTG 229
A estabilidade térmica (Tm) das variantes geradas foi medida por DSC (tabela 8). A ligação das variantes de anti- corpo para o TLR3 foi comparável àquela do anticorpo parental.
Tabela 8 Sumário das temperaturas de fusão (TM) das variantes e raciocínio para a realização das mesmas.
Candidato n°: Mutações Raciocínio TM (°C) TM (°C) 15EVQ WT 64,7 0 15-1 HV F50R interface VH/VL 69,3 4,6 15-2 HV V34I pacote de núcleo VH 66,9 2,2 15-3 HV V34I/G35S ligação H, pacote de núcleo VH 71,2 6,5 15-4 HV A61S/Q67H pacote de VH/VL, carga de superfície de VH 65,4 0,7 15-5 HV F50R/V34I/G35S/ A61S/Q67H interface VH/VL, ligação ao H, núcleo de VH 76,2 11,5
91/133 15-6 HV V34I/G34S/E99Q ligação ao H, pacote do núcleo de VH, re- 75 10,3 moção de 15-7 LV G30S/L31S resíduos polares de superfície L-CDR1 63,1 -1,6 15-8 LV A34N interface VL/VH 64 -0,7 15-9 HV F50RA/34I/G35S/ interface VH/VL, ligação ao H, núcleo VH 76 11,3 A61S/Q67H/E99Q 15-10 LV S95P Estabilização da estrutura canônica 76,6 11,9
Exemplo 8 Geração de um anticorpo anti-TLR3 substituto Um anticorpo quimérico antagonista de TLR3 de rato antica- mundongo ou camundongo anticamundongo, chamado na presente inven- 5 ção de mAb 5429 foi gerado para avaliar os efeitos de inibição da sinaliza- ção do TLR3 em vários modelos in vivo, visto que os anticorpos humaniza- dos gerados no exemplo 1 não tiveram uma especificidade suficiente ou ati- vidade antagonista com relação ao TLR3 camundongo.
O mAb 5429 quimé- rico substituto bem como seu anticorpo parental de rato anti-TLR3 de ca- 10 mundongo c1811 inibiram a sinalização de TLR3 camundongo in vitro e in vivo, e melhoraram os mecanismos patogênicos em vários modelos de do- ença no camundongo.
Os dados discutidos abaixo sugerem um papel para o TLR3 na indução e perpetuação de inflamação prejudicial, e contribuem para justificar 15 o uso terapêutico dos antagonistas de TLR3 e dos anticorpos antagonistas do TLR3, por exemplo, condições inflamatórias agudas e crônicas incluindo hipercitocinemia, asma e inflamação da via aérea, doenças inflamatórias do intestino e artrite reumatóide, infecções virais, e diabetes tipo II.
Geração do mAb 5429 substituto 20 Os ratos de CD foram imunizados com o ectodomínio de TLR3 murinorecombinante (aminoácidos 1-703 da sequência ID N°: 162, n° de a- cesso do GenBank NP_569054) gerados usando métodos de rotina.
Linfóci- tos de dois ratos demonstrando titulações de anticorpo específicas para TLR3 murino foram fundidos a células de mieloma FO.
Um painel de anti- 25 corpos monoclonais reativos com TLR3 murino foi identificado e testado quanto a atividade antagonista in vitro nos testes com repórter de luciferase murino e fibroblastos embrionários murinos.
A linhagem de hibridoma C1811A foi selecionada para um trabalho adicional.
Os genes funcionais de região variável foram sequenciados a partir do mAb c1811 secretado pelo 30 hibridoma.
Os genes da região variável da cadeia leve e da cadeia pesada clonados foram então inseridos, respectivamente, em vetores de expressão de plasmídeo que forneceram sequências codificantes para a geração de um anticorpo mAb quimérico Rato/Balb C muIgG1/ chamado de mAb 5429 com o uso de métodos de rotina.
Os anticorpos foram expressos conforme descri- to no exemplo 3. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do mAb 5429 são mostradas na SEQ ID n°:164 e SEQ 5 ID n°: 163, respectivamente, e as sequências de comprimento total de ca- deia leve e pesada são mostradas na SEQ ID n°:166 e SEQ ID n°: 165, res- pectivamente.
As sequências de comprimento total de cadeia leve e pesada do mAb c1811 são mostradas na SEQ ID n°: 168 e SEQ ID n°: 167, respec- tivamente. 10 Caracterização do mAb 5429 O mAb 5429 foi caracterizado em um painel de testes in vitro quanto à sua capacidade de neutralização sobre a sinalização de TLR3. Os testes e os resultados da atividade são descritos a seguir.
Ensaio de gene-repórter luciferase murino 15 O cDNA do TLR3 murino (SEQ ID n°: 161, GenBank Acc. n°: NM_126166) foi amplificado por PCR a partir do cDNA do baço do murino (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA), e clonado no vetor pCEP4 (Life Tech- nologies, Carslbad, CA, EUA) com o uso de métodos-padrão. 200 µl de célu- las HEK293T foram plaqueados em placas brancas de 96 poços com fundo 20 claro, a uma concentração de 4 x 104 células/poço em DMEM completo, e usadas no dia seguinte para transfecções usando Lipofectamina 2000 (Invi- trogen Corp., Carslbad, CA, EUA) com o uso de 30 ng de luciferase de vaga- lume pNF- B (Stratagene, San Diego, CA, EUA) ou 30 ng de luciferase de vagalume pISRE (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA), 5 ng de luciferase 25 Renilla de controle phRL-TK (Promega Corp., Madison, WI, EUA) plasmí- deos-repórter, 1,5 ng de pCEP4 que codifica TLR3 murino de extensão completa, e 13,5 ng do vetor pcDNA3,1 vazio (Life Technologies, Carslbad, CA, EUA) para levar a quantidade de DNA total para 50 ng/poço. 24 horas após a transfecção, as células foram incubadas de 30 minutos a 1 hora a 30 37°C com os anticorpos TLR3 anti-murino em DMEM fresco isento de soro antes da adição de 0,1 ou 1 µg/µl de poli(I:C). As placas foram coletadas após 24 horas com o uso do sistema de teste Dual-Glo Luciferase (Promega,
Madison, WI, EUA). As unidades de luz relativas foram medidas com o uso de um leitor de multi-detecção FLUOstar OPTIMA com o software OPTIMA (BMG Labtech GmbH, Alemanha). Os valores normalizados (razões de luci- ferase) foram obtidos mediante a divisão das unidades de relativas de luz de 5 vagalume (RLUs) pelas RLUs de Renilla.
O mAb 5429, bem como seu mAb c1811 e mAb 15 parentais (tabela 3a) reduziram a ativação de ISRE e de NF-kB induzida por poli(I:C) de uma maneira dose-dependente (figura 8A e 8B), demonstrando suas capacidades de antagonizarem a atividade de TLR3. As IC50s medidas no teste de ISRE foram 0,5, 22, e 0,7 µg/ml para 10 mAb 5249, mAB 15 e mAb c1811, respectivamente.
Ensaio de Fibroblasto Embrionário Murino (MEF) As células do MEFC57BL/6 foram obtidas a partir do Artis Opti- mus (Opti-MEF™ C57BL/6 - 0001). As células foram plaqueadas em placas de fundo plano de 96 poços (BD Falcon) com 20.000 células/poço em 200 µl 15 do meio MEF (DMEM com glutamax, 10% de FBS inativado a quente, 1x de NEAA, e 10 µg/ml de gentamicina). Todas as incubações foram realizadas a 37°C/5% de CO2. 24 horas após o plaqueamento, o mAb 5429 ou o mAb c1811 foram adicionados aos poços.
As placas foram incubadas com os mAbs por 1 hora, após o que o poli(I:C) foi adicionado a 1 µg/ml em cada 20 poço.
Os sobrenadantes foram coletados após uma incubação de 24 horas.
Os níveis de citocina foram determinados com o uso de um bead kit (Invitro- gen Corp., Carslbad, CA, EUA) para detectar CXCL10/IP-10 seguindo o pro- tocolo do fabricante.
Os resultados foram dispostos em gráfico com o uso do software GraphPad Prism.
Ambos os anticorpos reduziram os níveis de CX- 25 CL10/IP-10 induzidos por poli(I:C) de maneira dose-dependente, demons- trando as capacidades desses anticorpos de antagonizarem o TLR3 endó- geno e inibirem a sinalização de TLR3 (figura 9). Citometria de fluxo- Manchamento de Superfície C57BL/6 e TLR3 knockout (TLR3KO) (antecedente C57BL/6; 30 fêmea, 8 a 12 semanas de idade, Ace Animals, Inc.), 10 por grupo, recebe- ram uma dose intraperitoneal com 1 ml de 3% do meio de tioglicolato (Sig- ma) e 96 horas depois, os camundongos foram eutanizados e o peritônio de cada camundongo foi lavado com 10 ml de PBS estéril.
Os macrófagos peri- toneais obtidos por tioglicolato foram ressuspensos em PBS e a viabilidade da célula foi avaliada com o uso do manchamento de azul de tripano.
As cé- lulas foram peletadas por centrifugação e foram ressuspensas em 250 µl de 5 tampão de FACS (PBS -Ca2+-Mg2+, 1% de FBS desativado a quente, 0,09% de azida de sódio) e foram mantidas em gelo molhado.
O reagente CD16/32 (eBioscience) foi usado a 10 µg/106 células por 10 minutos para bloquear os receptores Fc nos macrófagos.
As células foram distribuídas a 106 células em 100 µl/poço para o manchamento da superfície.
Os mAb c1811 e mAb 10 1679 (anticorpo TLR3 rato anticamundongo que não teve especificidade a TLR3 e, dessa forma, usado como um controle isotípico) conjugados com Alexa-Fluor 647 (Molecular Probes) foram adicionados a 0,25 µg/106 células e foram incubados em gelo, no escuro por 30 minutos.
As células foram la- vadas e ressuspensas em 250 µl de tampão FACS.
A mancha de viabilida- 15 de, 7-AAD (BD Biosciences, Bedford, MA), foi adicionada a 5 µl/poço por não mais que 30 minutos antes da captura de amostras em FACS Calibur para detectar uma população celular morta.
As amostras foram coletadas pelo sistema FACS Calibur com o uso do software Cell Quest Pro.
O FCS Express foi usado para analisar os dados coletados mediante a formação de 20 histogramas.
A ligação do mAb c1811 aos macrófagos peritoneais obtidos por tioglicolato murino de C57BL/6 e TLR3KO camundongos foram avaliados por citometria de fluxo para determinar a especificidade de ligação.
O mAb 5429 não foi usado nesse teste visto que foi esperado que a região Fc de camun- 25 dongo desse anticorpo quimérico contribuísse para a ligação não específica.
O mAb c1811 não exibiu ligação aos macrófagos de TLR3KO, e aumentou a ligação às superfícies de célula de macrófagos peritoneais de C57BL/6, su- gerindo uma especificidade do mAb em relação a TLR3 (figura 10). Presu- me-se que o mAb 5429, que tem as mesmas regiões de ligação do mAb 30 c1811, tenham a mesma especificidade de ligação do mAb c1811. Exemplo 9 Anticorpos antagonistas de TLR3 protegem contra a inflamação sistêmica mediada por TLR3 Modelo O modelo sistêmico de citocina/quimiocina induzido por poli(I:C) foi usado como um modelo da inflamação sistêmica mediada por TLR3. 5 Nesse modelo, o poli(I:C) (PIC) distribuído intraperitonealmente induziu uma resposta a citocina e quimiocina sistêmica que foi parcialmente mediada por TLR3. Aos camundongos C57BL/6 fêmea (8 a 10 semanas de idade) ou camundongos TLR3KO fêmea (antecedente C57BL/6; 8 a 10 semanas de 10 idade, Ace Animals, Inc.) foram administrados subcutaneamente mAb 5429 a 10, 20 ou 50 mg/kg em 0,5 ml de PBS, mAb c1811 a 2, 10 ou 20 mg/kg em 0,5 ml de PBS ou 0,5 ml de PBS sozinho (controle de veículo). 24 horas a- pós a administração do anticorpo, os camundongos receberam intraperito- nealmente 50 µg de poli(I:C) (Amersham, n° de catálogo 26-4732 lote n° 15 IH0156) em 0,1 ml de PBS.
O sangue retro-orbital foi coletado 1 e 4 horas após o desafio de poli(I:C). O soro foi preparado a partir do sangue integral e foi analisado quanto às concentrações de citocina e quimiocina com o Lumi- nex.
Resultados 20 O poli(I:C) distribuído intraperitonealmente induziu uma resposta a citocina e quimiocina sistêmica que foi parcialmente mediada por TLR3, conforme evidenciado pela produção significativamente reduzida de um pai- nel de quimiocinas e citocinas nos animais TLR3KO (tabela 9A). Os media- dores induzidos por poli(I:C) TLR3-dependente foram IL-6, KC, CCL2/MCP-1 25 e TNF- 1 hora após o desafio com poli(I:C), e IL-1 , CCL5/RANTES e TNF- 4 horas após o desafio com poli(I:C). Tanto mAb c1811 quanto o mAb 5429 reduziram significativamente os níveis destes mediadores dependentes de TLR3, demonstrando a capacidade dos anticorpos em reduzir a sinaliza- ção de TLR3 in vivo (tabela 9B). Os valores na tabela 9 são mostrados como 30 concentrações médias de citocina ou quimiocina em pg/ml de seis ani- mais/grupo ±SEM.
Esses dados sugerem que o antagonismo ao TLR3 pode ser benéfico para a redução dos níveis excessivos de citocina e quimiocina mediadas por TLR3 em condições como a tempestade de citocina ou cho- que letal.
Tabela 9A.
C57BL/6 TLR3KO PIC - + - + mAb 5429 (mg/kg) - - - - mAb c1811 (mg/kg) - - - - desafio de PIC de 1 hora TNF 6,005 ± 0,32 319,4 ± 34,1* 9,13 ± 4,41 43,80 ± 10,13** KC 129,3 ± 9,83 2357 ± 491,5* 152,0 ± 21,34 432,3 ± 90,66** IL-6 40,91 ± 5,66 5317 ± 856,7* 120,1 ± 99,99 1214 ± 294,9** MCP-1 84,67 ± 18,45 694,6 ± 127,8* 67,85 ± 34,16 249,9 ± 55,60**
98/133 desafio de PIC de 4 horas IL-1 28,21 ± 17,78 796,7 ± 45,0* 13,94 ± 13,84 408,5 ± 29,91** RANTES 20,87 ± 1,738 4511 ± 783,4* 36,01 ± 4,484 706,3 ± 84,36** TNF 0,10 ± 0 561,7 ± 81,84* 3,215 ± 3,115 305,8 ± 53,63**
*p<0,001: ANOVA unidirecional para C57BL/6 PBS **p<0,001 ANOVA unidirecional para C57BL/6 PIC
Tabela 9B.
C57BL/6 PIC + + + + + + mAb 5429 50 20 10 - (mg/kg) mAb - - - 20 10 2 c1811 (mg/kg) desafio de PIC de 1 hora
99/133 TNF- 29,33 ± 3,78*** 31,05 ± 1,59*** 59,55 ± 12,71*** 32,54 ± 3,89*** 42,22 ± 7,04*** 42,61 ± 10,58*** KC 466,3 ± 92,35*** 440,3 ± 10,01*** 744,6 ± 103,1** 637,3 ± 151,0*** 944,2 ± 130,9** 919,3 ± 231,2** IL-6 480,2 ± 62,88*** 375,9 ± 46,14*** 705,2 ± 149,8*** 739,2 ± 113,3*** 1047 ± 222*** 1229 ± 378,4*** MCP-1 168,5 ± 15,04** 321,6 ± 206,7 219,2 ± 70,58* 184,0 ± 14,92** 278,3 ± 53,57 414,9 ± 97,17 desafio de PIC de 4 horas IL-1 343,0 ± 33,01*** 452,6 ± 94,86** 481,1 ± 121,0* 354,8 ± 45,43*** 351,7 ± 68,85*** 352,4 ± 39,60*** RANTES 1381 ± 169,7*** 2439 ± 308,7** 1601 ± 398,9*** 1303 ± 168,0*** 1365 ± 474,1*** 2209 ± 402,5** TNF- 100,1 ± 8,5*** 205,1 ± 41,85*** 226,1 ± 64,72*** 138,9 ± 26,0*** 121,6 ± 38,85*** 223,8 ± 47,74***
***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05: As estatísticas com ANOVA unidirecional foram comparadas com o grupo C57BL/6 + PIC
Exemplo 10 Anticorpos antagonistas de TLR3 reduzem a hiper-reatividade da via aérea Modelo A hiper-reatividade da via aérea foi induzida por poli(I:C). 5 Os camundongos C57BL/6 fêmea (12 semanas de idade) ou camundongos TLR3KO fêmea (antecedente C57BL/6; 12 semanas de idade, Ace Animals, Inc.) foram anestesiados com isoflurano, e várias doses (10 a 100 µg) de poli(I:C) em 50 µl de PBS estéril foram administradas intranasal- mente.
Os camundongos receberam três administrações de poli(I:C)(ou 10 PBS) com um período de descanso de 24 horas entre cada administração. 24 horas após a última administração de poli(I:C)(ou PBS), a função pulmo- nar e a hiper-reatividade da via aérea à metacolina foram medidas com o uso da pletismografia total (BUXCO system). Os camundongos foram colo- cados na câmara de pletismografia total e foram deixados para se aclimati- 15 zarem por pelo menos 5 minutos.
Seguindo as leituras da linha de base, os camundongos foram expostos a doses aumentadas de metacolina nebuliza- da (Sigma, St.
Louis, MO, EUA). A metacolina nebulizada foi administrada por 2 minutos, seguida de um período de coleta de dados de 5 minutos, se- guida de um período de descanso de 10 minutos antes dos desafios de me- 20 tacolina com dose aumentada subsequente.
A resistência de fluxo de ar au- mentada foi medida como a Pausa Maior (Penh) e é representada como o valor médio de Penh sobre o período de registro de 5 minutos (BUXCO sys- tem). Após as medições de função pulmonar, os camundongos foram euta- nizados e os pulmões foram canulados.
As lavagens broncoalveolares (BAL) 25 foram realizadas mediante a injeção de 1 ml de PBS nos pulmões e recupe- ração do efluente.
Os tecidos dos pulmões foram removidos e congelados.
Os fluidos da BAL foram centrifugados (1200 rpm, 10 min.) e os sobrenadan- tes isentos de célula foram coletados e armazenados a -80°C até a análise.
Os péletes de célula foram ressuspensos em 200 µl de PBS para contagens 30 de célula total e diferencial.
O teste multiplex foi realizado seguindo o proto- colo do fabricante e o kit de imunoteste multiplex (Millipore, Billercia, MA, EUA).
Resultados As observações anteriores demonstraram que a administração intranasal de poli(I:C) induziu um problema mediado por TLR3 com relação à função pulmonar nos camundongos com uma medição de pausa maior au- 5 mentada (PenH) da pletismografia total (Buxco) na linha de base e uma ca- pacidade de resposta aumentada à metacolina aerossolizada (um indicador da hiper-reatividade da via respiratória) (publicação PCT n° WO06/060513A2). Esse problema na função pulmonar era associado ao recrutamento do neutrófilo nos pulmões, e aos níveis aumentados de citoci- 10 nas/quimiocinas pró-inflamatórias nos pulmões.
Nesse estudo, o efeito dos mAb 1811 e mAb 5429 foi avaliado no problema induzido por poli(I:C) na função pulmonar mediante a administração subcutânea de cada anticorpo a 50 mg/kg antes do desafio de poli(I:C). O problema mediado por TLR3 da função pulmonar foi significa- 15 tivamente reduzido mediante o tratamento de animais com anticorpos anta- gonistas do TLR3 antes do desafio de poli(I:C). Os aumentos mediados por TLR3 na PenH da linha de base e a sensibilidade da via aérea à metacolina foram evitados nos animais tratados com o anticorpo anti-TLR3 (figura 11). Adicionalmente, o recrutamento mediado por TLR3 dos neutrófilos nos pul- 20 mões dos camundongos e a geração de quimiocinas nas via aéreas foram reduzidos nos animais tratados com o anticorpo anti-TLR3. Os números de neutrófilos (figura 12) e os níveis de CXCL10/IP-10 (figura 13) foram medi- dos a partir do fluido de lavagem broncoalveolar coletado (BALF). Os estu- dos foram repetidos pelo menos três vezes com resultados similares.
Os 25 dados mostrados nas figuras 11, 12 e 13 são provenientes de um estudo representativo.
Cada símbolo representa um ponto de dados de um camun- dongo, e as barras horizontais mostram médias de grupo.
O estudo demons- trou que os anticorpos antagonistas de TLR3 administrados sistemicamente alcançaram os pulmões, reduziram o problema mediado por TLR3 da função 30 pulmonar, a infiltração de neutrófilos na via aérea, a geração de quimiocina e a inflamação do trato respiratório no modelo usado.
Dessa forma, os anta- gonistas de TLR3 podem ser benéficos no tratamento ou prevenção de do-
enças respiratórias caracterizadas pela hiper-reatividade da via aérea, como a asma, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), e fibro- se cística.
Exemplo 11 5 Anticorpos antagonistas de TLR3 protegem contra o processo inflamatório intestinal Modelo O modelo de colite de DSS foi usado como um modelo do pro- cesso inflamatório intestinal. 10 Camundongos C57BL/6 fêmea (<8 semanas de idade) ou ca- mundongos TLR3KO fêmea (antecedente C57BL/6; <8 semanas de idade pesando entre 16,5 g e 18 g, Ace Animals, Inc.) foram alimentados com ali- mentos irradiados com raios gama começando no dia 1. DSS (sulfato de dextrano) (MP Biomedicals, Aurora, OH, n° de catálogo: 160110; 35-50 kDa; 15 18 a 20% de enxofre, lote n° 8247 J) foi diluído em água potável acidificada autoclavada a uma concentração final de 5%. A água de DSS foi administra- da por 5 dias, período após o qual ela foi substituída por água normal.
Os camundongos beberem a água à vontade ao longo do estudo.
Todas as gar- rafas de água foram pesadas todos os dias para fins de registro do consumo 20 de água.
Nos dias 0, 2, e 4, os camundongos foram submetidos à dosagem intraperitoneal com 5 mg/kg (0,1 mg em 0,1 ml de PBS) de mAb 5429, anti- corpo de camundongo anti-TNF- , ou PBS como um controle.
Os camun- dongos foram monitorados diariamente ao longo do estudo e foram pesados nos dias 0 a 4 e no dia 7. Os camundongos foram eutanizados nos dias 2 e 25 7 do estudo.
As cavidades abdominais foram abertas e os cólons ascenden- tes foram cortados onde eles se unem ao ceco.
Os colóns foram coletados e fixados em 10% de formalina tamponada neutra.
Os cólons foram embebi- dos em parafina, divididos e manchados com H&E (Qualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA, EUA). As avaliações histopatológicas colônicas foram 30 feitas de forma não identificada por um patologista veterinário conforme des- crito abaixo (PathoMetrix, San Jose, CA, EUA). Avaliação histopatológica
Dois segmentos do intestino grosso, do cólon e do reto foram avaliados e pontuados quanto às alterações a seguir: (i) necrose de uma única célula; (ii) ulceração epitelial; (iii) descamação epitelial; (iv) abscesso criptal; (v) proliferação celular; (vi) proliferação celular criptal; (vii) formação 5 de tecido de granulação na lâmina própria; (viii) tecido de granulação na submucosa; (ix) infiltrado celular inflamatório submucosal, predominante de neutrófilo; e (x) edema submucosal.
Uma única pontuação geral de gravidade foi fornecida com base nos padrões a seguir: 10 0 - não existente 1 - moderada, encontrada focal ou ocasionalmente 2 - moderada, multifocal 3 - moderada, encontrada frequentemente, porém em áreas limi- tadas 15 4 - grave, encontrada frequentemente em muitas áreas ou ex- tensões do tecido apresentado 5 - muito grave, se estende a grandes porções do tecido apre- sentado Resultados 20 As observações anteriores demonstraram que os animais TLR3KO apresentaram uma histopatologia significativamente reduzida em comparação com os camundongos de ocorrência natural em um modelo de processo inflamatório intestinal induzido pela ingestão de DSS (publicação PCT n° WO06/60513A2), sugerindo dessa forma que a sinalização de TLR3 25 desempenha uma papel na patogênese nesse modelo.
Foi relatado que o RNA de bactéria comensal ou RNA de mamífero liberado a partir de células necróticas pode agir como ligantes endógenos para estimular a sinalização de TLR3 (Kariko et al., Immunity 23165 a 231175, 2005; Kariko et al., J.
Biol.
Chem. 279:12542 a 12550 2004), e portanto, a estimulação de TLR3 pelos 30 ligantes endógenos no sistema digestivo pode acentuar e perpetuar a infla- mação no modelo de colite de DSS.
A gravidade da doença foi melhorada nos animais expostos a
DSS mediante o tratamento com anticorpos anti-TLR3, conforme avaliado pelas pontuações de histopatologia do composto (figura 14). A figura 14 mostra desvios padrão médios e 95% de intervalos de confiança para as pontuações de gravidade de doença como barras horizontais.
Uma redução 5 significativa das pontuações fori observada nos animais expostos a DSS de ocorrência natural tratados com anticorpos anti-TLR3 (p < 0,05) quando comparados a animais de ocorrência natural que não foram tratados.
Os a- nimais TLR3KO expostos a DSS foram protegidos contra as alterações indu- zidas por DSS.
Os animais expostos a DSS que recebem o mAb anti-TNF- 10 de camundongo não demonstraram aprimoramento na histopatologia no modelo de DSS.
Portanto, o modelo de DSS pode ser útil na avaliação de terapias que podem alvejar a população de pacientes humanos que não é responsiva a terapias anti-TNF- , e a neutralização de anticorpos anti-TLR3 pode ter o potencial de fornecer benefício aos pacientes com doença infla- 15 matória intestinal que não respondem às terapias anti-TNF- . Modelo O modelo de transferência da célula T foi usado como um mode- lo de processo inflamatório intestinal.
Nesse modelo, a inflamação do siste- ma digestivo foi induzida nos camundongos SCID pela transferência de uma 20 população de células T naive sem a célula T reguladora dos camundongos imunocompetentes, que ataca as células que apresentam antígeno na mu- cosa intestinal. high As células T naïve (células T CD4+CD45RB ) foram injetadas intraperitonealmente no recebedores SCID para induzir a colite crônica.
Os 25 camundongos foram administrados com PBS (500 µl/camundongo intraperi- tonealmente; controle de veículo), mAb 5429 (0,1 mg/camundongo intraperi- tonealmente), ou anticorpo anti-TNF- (0,05 mg/camundongo intraperitone- almente; controle positivo) começando 48 horas após a transferência das células T e, então, duas vezes por semana ao longo das 8 semanas do es- 30 tudo.
Nas 8 semanas após a transferência da célula T (ou quando os ca- mundongos perderam >15% de seu peso corporal original), os animais fo- ram eutanizados e os cólons foram removidos.
Os cólons foram conserta-
dos, embebidos em parafina e manchados com H&E.
A histopatologia (infil- tração de célula, abscessos de cripta, erosão epitelial, perda de célula calici- forme, e espessamento da parede dos intestinos) foi avaliada quantitativa- mente de forma não identificada. 5 Resultados A gravidade de doença foi melhorada em animais que recebe- ram a transferência de célula T mediante o tratamento com anticorpos anti- TLR3, conforme avaliado pela redução significativa na soma das pontuações de histopatologia quando comparados aos animais controle (p<0,05)(figura 10 15A). Para a soma das pontuações, os abscessos de cripta, ulceração, influ- xo de neutrófilo, perda de célula caliciforme, criptas abdominais, inflamação da lâmina própria e envolvimento transmural foram avaliados.
Uma redução significativa foi observada com os abscessos de cripta, influxo de ulceração e neutrófilo (para todos p< 0,05) (figura 15B). O anticorpo anti-TNF- foi u- 15 sado como um controle positivo em doses que conhecidamente fornecem um benefício ótimo.
Estudos usando dois modelos bem conhecidos de doenças in- flamatórias do intestino, DSS e o modelo de transferência de célula T de- monstraram que os anticorpos antagonistas do TLR3 distribuídos sistemati- 20 camente alcançaram a mucosa intestinal e reduziram a inflamação do trato gastrointestinal induzida através de dois mecanismos patogênicos diferen- tes.
Dessa forma, os antagonistas de TLR3 podem ser benéficos para o tra- tamento de doenças inflamatórias do intestino, incluindo casos refratários anti-TNF- , e outras patologias mediadas pelo sistema imune no trato gas- 25 trointestinal.
Exemplo 12 Anticorpos antagonistas de TLR3 protegem contra a artrite induzida por co- lágeno Modelo 30 O modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) foi usado como um modelo de artrite reumatóide.
Camundongos B10RIII macho (6 a 8 semanas de idade, Jackson
Labs) foram divididos em grupos de 15 por grupo (grupos artrite) ou 4 por grupo (camundongos controle). Os grupos artrite foram anestesiados com isoflurano e foram submetidos a injeções de colágeno Tipo II (Elastin Pro- ducts) e o adjuvante completo de Freund foi suplementado com M. tubercu- 5 losis (Difco) nos dias 0 e 15. No dia 12, os camundongos com artrite por co- lágeno tipo II em desenvolvimento foram selecionados aleatoriamente pelo peso corporal formando grupos de tratamento e foram administrados subcu- taneamente (SC) nos dias 12, 17, e 22 (d12, d17, 2d2) com mAb 5429 (25 mg/kg), o anticorpo controle negativo CVAM (um mAb recombinante sem 10 especificidade conhecida no camundongo) (5 mg/kg) ou anticorpo anti-TNF- (5 mg/kg, controle positivo). Além disso, os grupos controle de camundon- gos foram tratados com veículo (PBS) ou dexametasona (0,5 mg/kg, Dex, composto referência) subcutaneamente (SC) diariamente (QD) nos dias 12 a
25. Os animais foram observados diariamente do dia 12 ao 26. As patas an- 15 terior e posterior foram avaliadas por meio de um sistema de pontuação clí- nica (mostrado abaixo). Os animais foram eutanizados no dia 26 do estudo e a histopatologia foi avaliada de uma maneira às cegas (sistema de pontua- ção descrito a seguir). A eficácia da avaliação teve como base os pesos cor- porais do animal, e as pontuações clínicas da artrite. Todos os animais so- 20 breviveram ao término do estudo. Critérios de pontuação clínica para as patas anteriores e posteriores 0 - normal 1 - articulação da pata anterior e posterior afetada ou eritema e inchaço difusos mínimos 25 2 - articulações da pata anterior e posterior afetadas ou eritema e inchaço difusos moderados 3 - articulações da pata anterior e posterior afetadas ou eritema e inchaço difusos moderados 4 - eritema e inchaço difusos significativos, ou = articulações do 30 dígito 4 afetadas) 5 - pata inteira com eritema grave e difuso e inchaço grave, in- capaz de flexionar os digitos)
Métodos de pontuação histopatológica para articulações de camundongo com artrite por colágeno tipo II Com a pontuação das patas ou tornozelos dos camundongos com lesões de artrite por colágeno tipo II, a gravidade das alterações bem 5 como o número de articulações individuais afetadas foram considerados.
Quando apenas de 1 a 3 articulações das patas ou tornozelos fora de uma possibilidade de inúmeras articulações metacarpais/metatarsais/de dígito ou tarsais/tibiotarsais foram afetadas, uma avaliação arbitária de uma pontua- ção máxima de 1, 2 ou 3 com relação aos parâmetros abaixo foi dada de- 10 pendendo da gravidade das alterações.
Se mais de 2 articulações estavam envolvidas, os critérios abaixo foram aplicados às mais gravemente afeta- das/maioria das articulações.
Os dados clínicos para as pontuações de pata foram analisados com o uso de AUC nos dias 1 a 15, e o % de inibição dos controles foi calcu- 15 lado.
Inflamação 0 - normal 1 - infiltração mínima de células inflamatórias no sinóvio e no te- cido em particular de articulações afetadas 20 2 - infiltração moderada, se for nas patas, restrita às articulações afetadas 3 - infiltração moderada com edema moderado, se for nas patas, restrito a articulações afetadas 4 - infiltração significativa que afeta a maioria das áreas com e- 25 dema significativo 5 - infiltração difusa grave com edema grave Pano 0 - normal 1 - infiltração mínima do pano na cartilagem e no osso subcon- 30 dral 2 - infiltração moderada com destruição de zona marginal de te- cidos duros em articulações afetadas
3 - infiltração moderada com destruição moderada de tecidos du- ros em articulações afetadas 4 - infiltração significativa com destruição significativa da arquite- tura da articulação, na maioria das articulações 5 5 - infiltração grave associada à destruição total ou quase total da arquitetura da articulação, afeta todas as articulações Dano na cartilagem 0 - normal 1 - perda mínima a moderada do manchamento azul de toluidina 10 sem perda de condrócito óbvia ou rompimento do colágeno nas articulações afetadas 2 - perda moderada do manchamento azul de toluidina com per- da de condrócito moderada focal (superficial) e/ou rompimento de colágeno nas articulações afetadas 15 3 - perda moderada do manchamento azul de toluidina com per- da de condrócito moderada multifocal (profundidade até a zona média) e/ou rompimento de colágeno nas articulações afetadas 4 - perda significativa do manchamento azul de toluidina com perda de condrócito significativa multifocal (profundidade até zona profunda) 20 e/ou rompimento de colágeno na maioria das articulações 5 - perda difusa grave do manchamento azul de toluidina com perda de condrócito multifocal grave (profundidade até a marca visual) e/ou rompimento de colágeno em todas as articulações Reabsorção óssea 25 0 - normal 1 - mínima com pequenas áreas de reabsorção, não aparentes prontamente em baixa ampliação, osteoclastos raros nas articulações afeta- das 2 - moderada com áreas mais numerosas de, não aparente 30 prontamente em baixa ampliação, osteoclastos mais numerosos nas articu- lações afetadas 3 - moderada com reabsorção óbvia de osso cortical e trabecular modular sem defeitos de espessura total no córtex, perda de algumas trabé- culas medulares, lesão aparente em baixa ampliação, osteoclastos mais numerosos em articulações afetadas 4 - significativa com defeitos de espessura total no osso cortical, 5 frequentemente com distorção do perfil da superfície cortical remanescente, perda significativa de osso medular, inúmeros osteoclastos, afeta a maioria das articulações 5 - grave com defeitos de espessura total no osso cortical e des- truição da arquitetura da articulação de todas as articulações 10 Resultados Dexametasona (Dex) e anticorpo anti-TNF- de camundongo fo- ram usados como um controle positivo, PBS foi usado como controle de veí- culo, e CVAM foi usado como um anticorpo de controle negativo.
Todos os tratamentos foram iniciados no dia 12 do estudo, durante o desenvolvimento 15 da doença da articulação.
A incidência da doença nos animais controle com a doença tratada com veículo foi de 100% no estudo do dia 22. Os grupos controle negativo tratados com o veículo ou anticorpo CVAM tiveram as pon- tuações clínicas mais altas.
Pontuações clínicas significativamente reduzidas foram observadas nos grupos tratados com Dex (p<0,05 no d18-d26), 5 20 mg/kg de anticorpo anti-TNF- (p<0,05 no d18-26), ou 25 mg/kg de mAb 5429 (p<0,05 no d18-d23 e d25-d26) (figura 16). As pontuações clínicas da artrite expressas como área sob a curva (AUC) foram significativamente re- duzidas mediante o tratamento com 25 mg/kg de mAb 5429 (43% de redu- ção), 5 mg/kg do anticorpo anti-TNF- (52%), ou Dex (69%) em comparação 25 com o controle de veículo.
A figura 17 mostra desvios médios e padrão da AUC para cada grupo.
Os efeitos histopatológicos dos tratamentos também foram ava- liados.
A reabsorção óssea da pata foi significativamente diminuída por meio do tratamento com 25 mg/kg de mAb 5429 (47% de diminuição) em compa- 30 ração com os controles de veículo.
Os camundongos de controle positivo tratados com 5 mg/kg do anticorpo anti-TNF- tiveram pontuações de infla- mação da pata (33%), dano de cartilagem (38%), e somadas da pata (37%)
significativamente reduzidas.
O tratamento com Dex reduziu significativa- mente todos os parâmetros de histopatologia da pata (73% de redução das pontuações somadas). Esses dados demonstram que os anticorpos antagonistas de 5 TLR3 otimizam os sintomas clínicos e patológicos da doença no modelo CIA, e sugerem o uso de antagonistas de TLR3 para o tratamento da artrite reu- matóide.
Exemplo 14 Anticorpos antagonistas de TLR3 protegem contra as infecções virais agu- 10 das letais Modelo Um modelo de desafio do vírus influenza A foi usado como um modelo de infecção viral aguda letal.
Nos dias 1, 4, 8, e 12, os camundongos C57BL/6 fêmea (12 se- 15 manas de idade) ou camundongos TLR3KO fêmea (antecedente C57BL/6; 12 semanas de idade, ACE Animals, inc., 15 camundongos por grupo) foram submetidos à dosagem subcutânea de 20 mg/kg de mAb 5429, ou apenas PBS.
No dia 0, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e foram submetidos à administração intranasal do vírus Influenza A/PR/8/34 (ATCC, 20 Rockland, MD, EUA, lote n° 218171), em 25 µl de PBS (equivalente a 105,55 de CEID50). Os animais foram observados duas vezes por dia quanto à alte- rações no peso corporal e sobrevivência ao longo do período de 14 dias.
Um sistema clínico de pontuação foi usado para avaliar o nível de progressão da doença e os aperfeiçoamentos sutis em resposta ao tratamento com o vírus 25 Influenza A.
Pontuações clínicas 0 - normal, alerta e reativo, sem sinais visíveis de enfermidade 1 - pelo eriçado, com ou sem ambulação levemente reduzida 2 - pelo eriçado, postura arqueada ao caminhar, ambulação relu- 30 tante, respiração dificultada 3 - pelo eriçado, respiração dificultada, ataxia, tremor 4 - pelo eriçado, incapacidade de ambular com cutucadas sua-
ves, falta de consciência, sensação de frio ao toque 5 - encontrado morto Resultados Pontuações clínicas diárias de sobrevivência e alterações no pe- 5 so corporal foram avaliadas no estudo.
Tanto os camundongos WT infecta- dos com influenza A aos quais se administrou mAb 5429 (20 mg/kg) quanto os camundongos TLR3KO infectados com influenza A que não receberam o mAb 5429 demonstraram um aumento estatisticamente significativo de so- brevivência (p<0,001 e p<0,01, respectivamente) em comparação com os 10 camundongos C57BL/6 inoculados com o vírus Influenza, indicando que o antagonismo ou deficiência de TLR3 pode evitar a mortalidade induzida pela influenza (figura 18). As pontuações clínicas foram reduzidas significativa- mente no grupo que recebeu 20 mg/kg de mAb 5429, bem como no grupo TLR3KO (figura 19). O peso corporal dos camundongos foi observado ao 15 longo de um período de 14 dias após a administração do vírus influenza.
O peso corporal diminuiu de forma constante nos camundongos C57BL/6 sub- metidos à dosagem com o vírus Influenza A.
Entretanto, tanto os camundon- gos C57BL/6 submetidos à dosagem com 20 mg/kg de mAb 5429 quanto os camundongos TLR3KO demonstraram um peso corporal significativamente 20 maior em relação aos camundongos WT C57BL/6 inoculados com o vírus influenza (figura 20). Esses resultados demonstraram que os anticorpos an- tagonistas de TLR3 reduziram os sintomas clínicos e a mortalidade em um modelo de infecção viral agudo letal por influenza, e sugeriram que os anta- gonistas de TLR3 podem proporcionar uma proteção aos seres humanos em 25 estados infecciosos agudos.
Exemplo 15 Anticorpos antagonistas de TLR3 otimizam a hiperglicemia e reduzem a in- sulina plasmática Modelo 30 O modelo de obesidade induzida por dieta (DIO) foi usado como um modelo de resistência à hiperglicemia e insulina, e obesidade.
Os animais C57BL/6 WT (com cerca de 3 semanas de idade,
Jackson Labs) e os animais TLR3KO (antecedenteC57BL/6; cerca de 3 se- manas de idade, Ace Animals, Inc.) foram mantidos em uma dieta com alto teor de gordura durante 12 a 16 semanas.
Ambos, os camundongos TLR3KO e WT C57BL/6 foram alimentados com uma dieta com alto teor de 5 gordura ou ração normal (Purina TestDiet cat. n° 58126) que consiste em 60,9% kcal de gordura e 20,8% kcal de carboidratos.
Os camundongos fo- ram mantidos em um ciclo claro-escuro de luz 12:12 horas, com água e ali- mento à vontade.
O peso de cada camundongo em cada grupo foi medido semanalmente.
O mAb 5429 foi administrado intraperitonealmente duas ve- 10 zes por semana na primeira semana seguido de dosagem uma vez por se- mana por um total de 7 semanas.
Amostras do soro sanguíneo retro-orbital em jejum foram usadas nas medições de insulina nos pontos de tempo indi- cados.
Os testes de tolerância à glicose foram realizados mediante a admi- nistração intraperitoneal de glicose a 1,0 mg/g de peso corporal após o jejum 15 de um dia para o outro na semana 7. Além disso, a insulina de jejum e os níveis de glicose foram medidos.
HOMA-IR foi determinado a partir da equação com base nos ní- veis de glicose de jejum e nos níveis de insulina (12) com o uso da seguinte equação: HOMA-IR = ((glicose de jejum (mmol/l) x insulina de jejum (mU/l))/ 20 22,5 (Wallace et al., Diabetes Care 27:1487 a 1495, 2004). A glicose san- guínea de jejum (BG) foi determinada com o uso do teste de oxidase de gli- cose.
Os níveis de insulina de jejum foram determinados com o uso do kit ELISA insulina rato/camundongo (Crystal Chem, cat. n° 90060). Resultados 25 Após as semanas 12 a 16 em uma dieta com altos níveis de gordura, os animais WT DIO estavam hiperglicêmicos e hiperinsulinêmicos.
A tolerância à glicose foi aprimorada nos animais WT DIO mas não nos ani- mais TLR3KO DIO no tratamento com o mAb 5429. Níveis de glicose san- guínea significativamente reduzidos foram observados nos animais tratados 30 com mAb 5429 após o desafio de glicose em 60, 90, 120, e 180 min em comparação com o controle (apenas PBS) (figura 21A). Cerca de 21% de redução na AUC foi observada nos animais WT DIO tratados com mAb 5429 em comparação com os camundongos WT DIO que não receberam o mAb.
Os níveis de insulina de jejum também foram reduzidos nos animais WT DIO tratados com mAb 5429 (figura 22). Os animais TLR3KO DIO não apresenta- ram melhorias com relação à insulina de jejum no tratamento com mAb 5 5429. A análise de avaliação do modelo homeostático (HOMA) indicou uma sensibilidade aprimorada à insulina nos animais WT DIO tratados com mAb 5429, mas não nos animais TLR3KO DIO.
Os valores de HOMA-IR foram 14,0 ± 9,8, 8,7 ± 4,9, 9,0 ± 3,0 para WT DIO, 5 mg/kg de mAb 5429 para WT DIO, e 20 mg/kg de mAb 5429 para os animais WT DIO, respectivamente. 10 Nenhum efeito foi observado nos animais TLR3KO DIO.
O estudo demonstrou que os anticorpos antagonistas de TLR3 aprimoraram a resistência à insulina e reduziram a glicose de jejum no mo- delo DIO sem perda de peso, sugerindo que os antagonistas do TLR3 po- dem ser benéficos para o tratamento de hiperglicemia, resistência à insulina, 15 e diabetes tipo II.
Exemplo 16 Anticorpos antagonistas de TLR3 protegem contra respostas inflamatórias induzidas por vírus e bactérias Reagentes 20 Cepas de Haemophilus influenzae (NTHi) não tipáveis 35 isola- das de um paciente com COPD com exacerbações bacterianas foram obti- das junto ao Dr.
T.
Murphy (Buffalo VA Medical Center, Buffalo, NY, EUA). 16 rinovírus humanos foram obtidos junto à American Type Culture Collecti- on (ATCC) com TCID(50)=2,8 x 107/ml. 25 Testes de estimulação de NTHi Células NHBE (Lonza, Wakersville, MD, EUA) foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 poços Microtest (BD Biosciences, Bed- ford, MA, EUA) a 1 x 105/poço.
O NTHi cultivado em placas de ágar por 16 a 20 horas foi ressuspenso em um meio de crescimento a cerca de 2 x 108 30 cfu/ml, tratado com 100 µg/ml de gentamicina por 30 minutos e adicionado a cerca de 2 x 107/poço às placas de 96 poços contendo NHBEs.
Após 3 ho- ras, os sobrenadantes foram removidos e substituídos com um meio de crescimento novo com ou sem anticorpos (0,08 a 50 µ de concentração fi- nal). Após 24 horas adicionais de incubação, a presença de citocinas e qui- miocinas nos sobrenadantes celulares foi testada em triplicata com um kit Cytokine 25-plex AB bead humano (incluindo IL-1 , IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, 5 IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF- , IFN- , IFN- , GM-CSF, MIP-1 , MIP-1 , IP-10, MIG, Eotaxin, RANTES e MCP-1) (Life Technologies, Carslbad, CA, EUA) no analisador de fluorescência mul- tiplex Luminex 100IS e do sistema leitor (Luminex Corporation, Austin, TX, EUA). 10 Testes de estímulo de rinovírus As células NHBE foram semeadas nas placas de cultura de teci- do de 96 poços Microtest (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) a 1 x 105 cé- lulas/poço.
No dia seguinte, os anticorpos (0,08 a 50 µg/ml de concentração final) foram adicionados às células NHBE ou BEAS-2B e incubados por 1 15 hora, seguido da adição de 10 µl/poço de rinovírus.
Após incubação adicio- nal de 24 horas, a presença de citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes celulares foi testada pelos testes luminex conforme descrito acima.
Resultados O mAb 15EVQ inibiu, de maneira dose-dependente, a produção 20 de IP-10/CXCL10 e RANTES/CCL5 induzidos por NTHi, enquanto que o an- ticorpo de controle, IgG4 humano (Sigma, St.
Louis, MO, EUA), não mostrou nenhum efeito inibitório sobre o estímulo de NTHi (figura 23A). O mAb 15EVQ também inibiu a produção de CXCL10/IP-10 e CCL5/RANTES indu- zida por rinovírus (figura 23B). 25 Exemplo 17 Anticorpos antagonistas de TLR3 suprimem respostas inflamatórias em as- trócitos Métodos Astrócitos humanos normais de 2 doadores (Lonza, Walkersville, 30 MD, EUA) foram plaqueados em uma placa de 24 poços a 75.000 célu- las/poço e permitiu-se que se fixassem de um dia para o outro.
No dia se- guinte, os astrócitos foram tratados com 200 ng/ml de poli(I:C) e/ou 10 µg/ml de mAb 18 durante 24 horas.
As citocinas foram medidas por Luminex.
Resultados A produção induzida por poli(I:C) de IL-6, IL-8, IL-12, IFN- , IFN- , CXCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CCL4, CCL5/RANTES e CXCL10/IP-10 foi 5 inibida por mAb 18, conforme mostrado na tabela 10.
Tabela 10 Doador 1 IL-6 IL-8 IL-12 IFN- IFN- Não tratado 876,0 ± 36,8 539,7 ± 32, 6 16,6 ± 0,5 28,8 ± 1,5 12,3 ± 0,3 mAb 18 1011,9 ± 57,4 1401,9 ± 49,7 17,1 ± 0,5 31,6 ± 0,7 10,4 ± 0,2 Poli (l:C) ol* ol 30,3 ± 1,5 47,1 ± 3,1 35,9 ± 1,0 Poli (l:C) + mAb 18 2225,0 ± 108,1 6104,4 ± 259,9 16,8 ± 0,9 30,5 ± 1,6 11,7 ± 0,6 Doador 2 Não tratado 729,1 ± 7,1 248,2 ± 4,7 14 ± 0,5 19,5 ± 1,8 10,5 ± 0,5 mAb 18 779,0 ± 9,8 1132,6 ± 30,6 14,3 ± 0,6 20,8 ± 1,9 10,5 ± 0,1 Poli (l:C) ol ol 25,5 ± 0,4 36,3 ± 1,9 30,8 ± 0,9 Poli (l:C) + mAb 18 3393,3 ± 107,5 8660,4 ± 354,3 16,2 ± 0,3 24,7 ± 1,2 12,6 ± 0,3
116/133 Doador 1 CXCL9/MIG CCL3/MIP-1a CCL4 CL5/RANTES CXCL10/IP-10 Não tratado 12,6 ± 0,7 21 ± 0,9 14,8 ± 0,7 bl** bl mAb 18 14,8 ± 1,7 19,5 ± 1,5 14,8 ± 1,1 bl bl Poli (l:C) 78,3 ± 4,8 1569,3 ± 36,9 159,7 ± 12,7 788,2 ± 94,9 461,4 ± 10,3 Poli (l:C) + mAb 18 18,5 ± 1,6 31,2 ± 1,9 13,2 ± 0,9 bl 6,9 ± 0,5 Doador 2 Não tratado 9,9 ± 1,6 12,3 ± 1,7 11,3 ± 0,3 bl bl mAb 18 8,9 ± 0,7 13,2 ± 1,5 11,1 ± 0,7 bl bl Poli (l:C) 62 ± 3,8 1552,9 ± 41,1 140,7 ± 4,8 546,8 ± 21,7 533,2 ± 15 Poli (l:C) + mAb 18 18,3 ± 2,7 66,6 ± 3,8 12,1 ± 0,8 bl 29,1 ± 6,2 *ol: nível acima da detecção **bl: nível abaixo da detecção
Exemplo 18 Anticorpos antagonistas de TLR3 suprimem respostas inflamatórias em célu- las endoteliais Métodos 5 Células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD, EUA) foram cultiva- das em meio de crescimento contendo soro recomendado por Lonza.
As células foras ressuspensas em um meio livre de soro (Lonza, Walkersville, MD, EUA), plaqueadas em placas de 96 poços a 3x105 células/ml e incuba- das a 37°C, CO2 a 5% durante 24 horas.
Poli(I:C) (GE Healthcare, Piscata- 10 way, NJ, EUA) foi adicionado em concentrações crescentes (1,5 a 100 µg/ml) e incubado por mais 24 horas a 37°C.
Para os testes de inibição de citocina, o mAb 15EVQ foi adicionado às células em várias concentrações (0 a 50 µg/ml) e incubados durante 30 min, e após isto 20 µg/ml de poli(I:C) foram adicionados durante 24 horas.
Os sobrenadantes celulares foram co- 15 letados e os níveis de citocina foram medidos com o uso do kit de citocina humana 30-plex e tecnologia MAP de Luminex (Invitrogen Corp., Carslbad, CA, EUA). Para medir a expressão de sICAM-1, células HUVEC foram trata- das com 20 µg/ml de poli(I:C) e várias concentrações de mAb 15EVQ (0,8 a 50 µg/ml). Os sobrenadantes celulares foram analisados por ELISA (siste- 20 mas R&D) para determinar a expressão de sICAM-1. A viabilidade celular foi medida com o uso do kit CellTiterGlo (Promega, Madison, WI, EUA). Resultados As células HUVEC produziram as seguintes citocinas em res- posta ao poli(I:C): IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CXCL8/IL-8, IL-12 25 (p40⁄p70), IL-15, IL-17, TNF- , IFN- , IFN- , GM-CSF, CCL3/MIP-1 , C- CL4/MIP-1 , CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, VEGF, G-CSF, FGF-básico e HGF (tabela 11). O mAb 15EVQ dependente de dose reduziu os níveis de todas as citocinas induzidas por poli(I:C) (tabela 12). A capaci- dade do mAb 15EVQ de reduzir a produção induzida por poli(I:C) de TNF- , 30 CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, e CXCL10/IP-10 sugeriu que a inibição de atividades mediadas por TLR3 pode proteger contra a infiltração de leucóci- tos e de células T que pode levar à ateroesclerose.
Também, a inibição de
VEGF por mAb 15EVQ sugeriu um benefício potencial de bloqueio de TLR3 em patologias mediadas por VEGF incluindo angiogênese em uma varieda- de de cânceres e doenças oculares como degeneração macular relacionada à idade. 5 TNF- e IFN- atuam no recrutamento de leucócitos e aumen- tam a expressão de moléculas de adesão no endotélio ativado (Doukas et al., Am.
J.
Pathol. 145:137 a 147, 1994; Pober et al., Am.
J.
Pathol. 133:426 a 433, 1988). CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES e CXCL10/IP-10 impactaram no recrutamento de células T e de monócitos e contribuem para o desenvolvi- 10 mento de ateroesclerose (Lundgerg et al., Clin.
Immunol. 2009). A geração de VEGF por células endoteliais está ligada ao crescimento de tecido anor- mal ou de tumores em uma variedade de cânceres durante a angiogênese (Livengood et al., Cell.
Immunol. 249:55 a 62, 2007). Tabela 11 Poli (l:C) µg/ml IL-6 CXCL8/IL-8 CCL2/MCP-1 10 848,8 + 50,9 12876,0 + 2314,0 11813,4 + 1420,9 5 751,3 + 2,1 11363,7 + 108,2 11365,7 + 113,1 2,5 607,1 + 91,6 10961,5 + 2200,7 11607,3 + 2155,7 1,25 419,2 + 178,4 9631,5 + 3675,8 11690,9 + 3189,9 0,63 263,8 + 81,4 6231,9 + 1568,0 9075,6 + 1152,2 0,31 183,5 + 168,3 5257,9 + 1855,0 8106,8 + 1193,1 0,16 111,9 + 72,5 4057,6 + 1127,4 6619,8 + 1728,2 Sem poli (I:C) 0,00 1286,6 + 300,8 1360,1 + 245,4
Poli (l:C) µg/ml IL-2R IL-15 IL-17 100 784,4 + 45,4 61,3 + 12,5 43,8 + 5,3 50 718,6 + 56,8 61,3 + 12,5 47,6 + 0 25 735,7 + 23,4 56,7 + 18,9 58,3 + 4,9 12,5 650,5 + 29,8 38,8 + 6,5 39,8 + 10,9 6,25 643,4 + 39,9 34,2 + 0 32,1 + 0 3,13 681,8 + 24,3 38,8 + 6,5 43,8 + 5,3 1,56 578,6 + 10,5 29,4 + 6,7 36,1 + 5,6 Sem poli (I:C) 0,0 0,0 0,0
Poli (l:C) µg/ml IFN CXCL10/IP-10 CCL4/MIP-1P 100 50,7 + 0 3803,1 + 185,5 234,5 + 19,7 50 44,9 + 1,7 2235,9 + 184,6 291,6 + 41,8 25 46,1 + 0 2403,0 + 271,9 278,7 + 4,7 12,5 41,2 + 3,5 2185,4 + 64,9 243,8 + 63,4 6,25 36,1 + 0 2100,0 + 288,1 201,9 + 46,2 3,13 40,0 + 1,8 3553,2 + 197,1 191,5 + 20,8 1,56 42,5 + 1,7 2064,3 + 242,1 165,3 + 16,3 Sem poli (I:C) 0,0 0,0 0,0
Poli (l:C) µg/ml RANTES TNF VEGF 100 6266,9 + 1708,7 12,8 + 3,2 581,1 + 181,4 50 2919,7 + 119,4 11,5 + 3,2 637,9 + 47,7 25 2805,1 + 176,7 9,8 + 2,8 700,3 + 62,5 12,5 2598,6 + 68,6 7,3 + 0,9 513,2 + 73,5 6,25 2449,2 + 830,6 6,9 + 1,4 440,4 + 29,5 3,13 3117,1 + 795,7 7,3 + 0,9 393,9 + 40,2 1,56 2481,0 + 719,3 6,0 + 1,8 358,4 + 74,8 Sem poli (I:C) 4,9 + 4,5 1,9 + 0,4 32,1 + 8,8 concentrações mostradas como pg/ml
A molécula de adesão intercelular 1 solúvel (sICAM-1) é gerada por clivagem proteolítica e é um marcador da ativação de células endoteliais.
A ICAM-1 desempenha um papel chave na ativação e migração de leucóci- tos e é regulada de maneira ascendente nas células endoteliais e células 5 epiteliais durante a inflamação onde ela atua como mediadora na adesão aos leucócitos via moléculas integrinas LFA-1 e Mac-1. O poli(I:C) ativou as células endoteliais para regular de maneira ascendente a expressão de sI- CAM-1 e a regulação ascendente foi reduzida pelo tratamento com mAb 15EVQ (figura 24A).
Tabela 12 mAb 15 50,00 10,00 2,00 0,40 0,08 0,016 0,003 0 (µg/ml) PIC + + + + + + + - IL-6 177,8 ± 5,6 * 214,6 + 3,6* 359,2 + 57,6 * 727,2 + 50,5 * 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0 CXCL8/IL-8 1040,7 ± 1765,9 + 97,1 6460,3 + 57349,5+ 72422,8+ 47047,5+ 76066,5+ 96478,0+ 185,9 3684,4 6293,4 88279,2 52393,1 11354,1 122298,4 CCL2/MCP-1 1187,7 ± 1955,4 + 9054,4 + 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0 165,4 * 72,7* 4110,9* IL-2R 25,0 ± 35,3 * 0,0 + 0,0* 312,3 + 521,5 + 5,5 664,7 + 9,8 661,2 + 14,8 698,4 + 57,6 654,2 + 14,8 137,6*
120/133 IL-15 0,0 ± 0,0* 0,0 + 0,0* 0,0 + 0,0* 4,1 + 0,0* 38,8 + 6,5 43,4 + 0,0 38,8 + 6,5 43,4 + 0,0 IL-17 1,3 ± 1,8* 11,8 + 16,8 11,8 + 16,8 27,9 + 6,0 47,4 + 10,4 54,3 + 20,2 40,0 + 0,0 51,2 + 5,1 IFN 0,9 ± 1,3* 0,9 + 1,3* 19,0 + 7,7* 36,1 + 0,0 44,9 + 1,7 41,2 + 3,5 47,3 + 1,7 40,0 + 1,8 CXCL10/IP- 0,0 ± 0,0* 58,1 + 2,6* 633,0 + 1441,4 + 97,1 3023,8 + 2107,5 + 2346,4 + 2157,4 + 10 471,6* 166,1 372,6 226,1 282,7 CCL4/MIP-1 0,0 ± 0,0* 0,0 + 0,0* 2,9 + 4,1* 62,1 + 7,2* 176,6 + 21,3 * 227,5 + 19,9 248,3 + 19,4 281,7 + 37,5
RANTES 3,0 ± 0,0* 15,4 + 4,5* 201,1 + 952,4 + 41,1* 2454,4 + 2698,1 + 2624,4 + 3459,7 + 169,1* 98,5* 88,6* 129,8 * 181,8 TNF 1,9 ± 0,4* 1,6 + 0,0* 2,2 + 0,0* 3,4 + 0,0 6,3 + 0,5 8,5 + 0,0 7,6 + 1,4 6,9 + 2,3 VEGF 87,2 ± 8,7* 28,6 + 8,7* 88,3 + 52,1* 156,1 + 6,4* 479,6 + 14,1 544,6 + 8,3 533,5 + 70,2 607,3 + 29,9 * Indica valores de p significativos (menores que 0,05) comparando as concentrações de mAb15 com poli(I:C) apenas Os valores são da média (pg/mL) ± SEM
Isso sugeriu que os anticorpos antagonistas do TLR3 podem ini- bir o tráfego de leucócitos e, dessa forma, dano aos tecidos causado pelo influxo de células inflamatórias.
Para os ensaios de viabilidade, as células HUVECs foram culti- 5 vadas, plaqueadas e estimuladas com poli(I:C) conforme descrito acima.
O mAb 15EVQ dependente de dose restaurou a redução induzida por poli(I:C) na viabilidade celular de HUVEC (figura 24B). A modulação descendente da ativação celular endotelial pode suprimir a infiltração excessiva de células imunes e reduzir o dano ao tecido 10 causado pelas citocinas que são aumentadas durante as condições inflama- tórias.
A inflamação e a superexpressão de citocinas e a adesão de molécu- las nas células endoteliais são contribuidoras-chave para o desenvolvimento de ateroesclerose e hipertensão.
Esses dados fornecem justificativa para a exploração do benefício potencial de antagonistas de TLR3 para o uso em 15 doenças dos vasos sanguíneos incluindo vasculite e outras que retratam disfunção endotelial.
Outra doença que é afetada pela inflamação e super- expressão de citocinas é o sarcoma de Kaposi (KS) que é comum em indiví- duos infectados com HIV e imunossuprimidos e é causado por herpes vírus de sarcoma de Kaposi (KSHV). A produção de VEGF e de citocina contribui 20 com a sobrevivência de células KS (Livengood et al., Cell Immunol. 249:55 a 62, 2007). Os antagonistas de TLR3 poderiam ser benéficos na redução de riscos angiogênicos associados ao KS e outros tumores e na prevenção da perda de viabilidade celular e na proteção da integridade da barreira endote- lial a fim de evitar o vazamento vascular, uma condição potencialmente séria 25 associada a falência de órgãos e a condições inflamatórias que ameaçam a vida como sepse.
O antagonismo ao TLR3 também pode ser benéfico nas infecções virais que envolvem patologia celular epitelial como as febres he- morrágicas virais causadas por membros das famílias flaviviridae (por exem- plo, Dengue, febre amarela), filoviridae (Ebola, Marburg), bunyaviridae (por 30 exemplo, Hantavírus, Nairovírus, Phlebovírus) e arenaviridae (por exemplo, febres hemorrágicas de Lujo, Lassa, Argentina, Boliviana, Venezuelana (Si- hibamiya et al., Blood 113:714 a 722, 2009).
Exemplo 20 Reatividade cruzada de anticorpos antagonistas de TLR3 com TLR3 cinomó- logos e murinos A atividade contra o TLR3 de macacos cinomólogos e murinos 5 foi testada com o uso do teste de gene repórter ISRE conforme descrito no exemplo 2. Os cDNAs de TLR3 de macacos cynomolgus (SEQ.
ID n°: 217) e murinos (SEQ.
ID n°: 161) foram amplificados a partir de sangue total e clo- nados no vetor pCEP4 (Clontech) e expressos conforme descrito acima.
O mAb 15EVQ teve IC50s de 4,18 µg/ml e 1,74 µg/ml nos testes de NF- B de 10 cino e ISRE, respectivamente, em comparação às IC50s de 0,44 e 0,65 µg/ml nos ensaios de NF-kB e ISRE de TLR3 humano, respectivamente.
Os anticorpos de controle de isotipo não tiveram efeito nesses ensaios.
Exemplo 21 Administração terapêutica de anticorpos antagonistas de TLR3 protege de 15 infecções virais letais agudas O Exemplo 14 descreve o tratamento profilático (administrado nos dias -1, 4, 8, e 12) com anticorpos antagonistas de TLR3 contra infecção por influenza A.
Este exemplo demonstra que a administração terapêutica de anticorpos antagonistas de TLR3 (dia 3 após a infecção com influenza A a- 20 pós o início dos sintomas clínicos) é eficaz em aumentar a sobrevida.
Modelo Um modelo de desafio com vírus da influenza A foi usado como um modelo de infecção viral letal aguda conforme descrito no Exemplo 14, exceto que a administração dos animais com mAb 5249 foi feita 3 dias após 25 a infecção com influenza A, e os animais administrados tinham 8 semanas de idade.
O mAb de controle isotípico anti-IgG1 de camundongo foi obtido junto à BioLegend.
Os animais foram administrados nos dias 3, 7 e 11 após as infecções com influenza A.
Pontuações clínicas diárias de sobrevivência e alterações no pe- 30 so corporal foram avaliadas no estudo.
Tanto os camundongos C57Bl/6 ad- ministrados com mAb 5249 e os camundongos TLR3KO demonstraram um aumento estatisticamente significativo na sobrevida (p < 0,028 e p < 0,001,
respectivamente) em relação aos camundongos C57BL/6 inoculados com o mAb de controle isotípico anti-IgG1 de camundongo e vírus Influenza (figura 25). As pontuações clínicas reduziram (figura 26) e os pesos corporais au- mentaram (figura 27) nos camundongos C57BL/6 administrados com mAb 5 5249 e nos animais TLR3KO em comparação aos camundongos C57BL/6 administrados com mAb de controle isotípico anti-IgG1 de camundongo e Influenza A.
Esses resultados demonstraram que os anticorpos antagonistas de TLR3 reduziram os sintomas clínicos e a mortalidade em um modelo de infecção viral letal aguda por influenza, e sugeriram que os antagonistas de 10 TLR3 podem proporcionar uma proteção aos seres humanos em estados infecciosos agudos.
Exemplo 22 Epitopos e paratopos de anticorpos antagonistas de TLR3 por cristalografia de raios X 15 O domínio extracelular de TLR3 humano foi cristalizado em complexo com Fabs de mAb 15EVQ, mAb 12QVQ/QSV e mAb c1068. Métodos Expressão e purificação de proteínas A expressão e purificação do ECD de TLR3 (aminoácidos 1 a 20 703 de SEQ ID n° 2)-três Fabs foram feitas conforme descrito acima.
Preparação do complexo quaternário ECD de TLR3 -três Fab 4 mg de ECD de TLR3 humano foi misturado com 2,4 mg de ca- da Fab e incubados a 4 °C durante 3,5 horas, o que corresponde a uma ra- zão molar de 1 ECD de TLR3:1,1 Fab.
O complexo foi purificado por croma- 25 tografia de troca aniônica em uma coluna MonoQ 5/50 GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), equilibrada com Tris 20 mM pH 8,5, 10% de glicerol (tam- pão A) e eluída com Tris 20 mM pH 8,5, 10% de glicerol, 1 M de NaCl (tam- pão B). Aproximadamente 2,48 mg do complexo em 1,74 mL foram diluídos para 10 mL com tampão A, aplicados sobre a coluna a 1 mL/min e eluídos 30 com um gradiente linear de 0 a 40% B durante 40 volumes de coluna.
Cinco rodadas de purificação consecutivas foram feitas.
As frações do pico 1 foram agrupadas, concentradas com Amicon-15 mL Ultra-30000 MWCO e Micro-
con 30000 MWCO até 14,49 mg/mL em Tris 20 mM pH 8,5, NaCl 27 mM, 10 % de glicerol (coeficiente de extinção: A280 (1 mg/mL) = 1,31). Cristalização Uma triagem por cristalização automatizada foi feita com o uso 5 do robô para cristalização automática de proteína Oryx4 (Douglas Instru- ments) dispensando volumes iguais de proteína e solução de reservatório em um formato de gota em repouso usando uma placa Corning 3550 (Cor- ning Inc., Acton, MA). A triagem inicial foi feita com Hampton Crystal Screen HT (HR2-130, Hampton Research, Aliso Viejo, CA). Pequenos cristais de 10 várias condições foram usados para gerar sementes, que foram então usa- das no teste Microseed-Matrix Screening (MMS). Vários ciclos de refino com base nas condições da triagem inicial foram feitos, os quais geraram peque- nos cristais.
As condições do reservatório usadas para MMS se basearam naquelas que geraram pequenos cristais após o refino: 18 a 28% de polieti- 15 leno glicol (PEG) 3350, 1M LiCl, pH 4,5 e 2,0 a 2,9 M (NH4)2SO4, 5% de PEG400, pH 4,5, e pH explorado e diferentes aditivos.
A triagem de cristali- zação por MMS foi feita usando o robô para cristalização automática de pro- teína Oryx4 (Douglas Instruments) pela dispensação dos componentes na seguinte razão de volume: 1 solução de proteína: 0,25 solução estoque de 20 semente: 0,75 solução de reservatório.
Os cristais com difração a uma reso- lução de ~10-Å cresceram a partir de acetato de sódio 0,1 M, pH 4,5, (NH4)2SO4 2,9 M, 5% de metil-pentano-diol (MPD) e 0,1 M de acetato de só- dio pH 4,5, 26% de PEG3350, LiCl a 1 M.
Em um esforço para melhorar a resolução dos cristais, MMS 25 com as condições acima foi combinado com triagem aditiva usando compo- nentes selecionados do Hampton Additive Screen HR2-428 (Hampton Rese- arch, Aliso Viejo, CA) na seguinte razão de volume: 1 solução de proteína: 0,125 solução estoque de semente: 0,2 solução aditiva: 0,675 solução de reservatório.
Cristais com qualidade de raio X do ECD de TLR3 complexado 30 com os Fabs, que difratam a uma resolução de ~5-Å, foram obtidos após aplicação de uma combinação de MMS e triagem aditiva a partir de uma so- lução contendo acetato de sódio a 0,1 M, pH 4,5, 28% de PEG 3350, LiCl a
1 M e Gly-Gly-Gly a 30 mM.
Coleta de dados de raios X do complexo quaternário de ECD de TLR3 Para a coleta de dados de raios X, um cristal (tamanho ~1,0 x 0,5 x 0,1 mm3) foi imerso por alguns segundos em um líquido mãe sintético 5 (acetato de sódio 0,1 M, pH 4,5, 28% de PEG 3350, LiCl 1 M, 16% de glice- rol), e congelado rapidamente no fluxo de nitrogênio a 100 K.
Os dados de difração de raios X foram coletados e processados com o uso do gerador de raios X por microfoco Rigaku MicroMax™ 007HF equipado com elementos ópticos confocais Osmic™ VariMax™, detector Saturn 944 CCD, e um sis- 10 tema de crioresfriamento X-stream™ 2000 (Rigaku, Woodlands, TX, EUA). As intensidades de difração foram detectadas em uma rotação de cristal de 250° com o tempo de exposição de 1 min por imagem de meio grau até a resolução máxima de 5 Å.
Os dados de raios X foram processados com o programa D*TREK (Pflugrath, Acta Crystallographica, seção D, 55:1718 a 15 1725, 1999). O cristal pertence ao grupo de espaço monoclínico C2 com pa- râmetros de célula unitária: a = 214,90 Å, b = 142,08 Å, c = 125,04 Å, e = 103,17°. A unidade assimétrica contém 1 molécula do complexo.
As estatís- ticas dos dados de raios X são dadas na tabela 13. Tabela 13 coleta de dados grupo de espaço C2 eixos de célula unitária (Å) 214,90, 142,08, 125,04 ângulos de célula unitária (°) 90, 103,17, 90 resolução (Å) 30-5,0 (5,18-5,00) n° de reflexões únicas 15,877 (1589) completeza (%) 99,8 (99,6) redundância 5,2 (4,9) Rintegraçãoa 0,121 (0,312) <I/ > 7,1 (2,9) refino da estrutura resolução (Å) 29,4-5,0 b Rcrist/Rlivre (%) 26,8/30,0 N° de reflexões Conjunto de trabalho 15,792 coleta de dados Conjunto de teste (5% dos dados) 788 Rmsd a partir dos valores ideais comprimento da ligação (Å) 0,007 anjos da ligação (°) 0,744 número de átomos da proteína 15,442 c Gráfico de Ramachandran regiões favorecidas (%) 93,1 permitidas (%) 98,8 não permitidas (%) 1,2 Determinação de estrutura A estrutura cristalina do ECD de TLR3 - Fab 15EVQ - Fab 12QVQ/QSV - Fab c1068 foi determinada por reposição molecular usando Phaser (Read, Acta Crystallogr.
Crystallogr.
D.
Biol.
Crystallogr. 57:1373 a 5 1382, 2001). Os modelos de pesquisa foram ECD de TLR3 (estrutura ID Pro- tein DataBank (PDB) 1ziw com todos os glicanos removidos, Choe et al., Science 309:581 a 585, 2005) e as estruturas cristalinas de alta resolução dos três Fabs determinados (vide Tabela 13 para um resumo dos dados cris- talinos e estatísticas de refino para estas estruturas de Fab). Mostrou-se que 10 o ângulo de cotovelo do Fab 12QVQ/QSV desvia significativamente daquele sob a forma livre.
Uma série de modelos Fab 12QVQ/QSV foi gerada pelo ajuste do ângulo de cotovelo a intervalos de ~5°, um dos quais foi observado concordando bem com a densidade de elétrons.
O refino da estrutura foi e- xecutado com PHENIX (Adams et al., J.
Synchrotron Radiat. 11:53 a 55, 15 2004). A estrutura foi refinada como domínios de estrutura rígida (cada do- mínio V ou C) para os Fabs e 13 segmentos rígidos (definições usadas no refino: 30-60,61-108,109-156,157-206,207-257,258-307,308-363,364- 415,416-464,465-514,515-570,571-618,619-687) para o ECD de TLR3 com um fator B para cada estrutura rígida de Fab e um único B para todo o ECD 20 de TLR3. O refino por Translation/ Libration/ Screw (TLS) foi introduzido para cada uma das estruturas rígidas de Fab e o ECD de TLR3 foi dividido em 2 segmentos de TLS no resíduo 330 da SEQ ID n° 2. A densidade dos glicanos foi visível para 10 dos 15 sítios de N-glicosilação.
Modelos de car- boidrato da estrutura cristalina do domínio extracelular de TLR3 humano (Choe et al., Science 309:581 a 585, 2005, PDB structure ID: 1ziw) foram então adicionados.
A densidade para um pequeno segmento faltando no 5 ECD de TLR3 (resíduos 337 a 342 de SEQ ID n° 2) foi visível após refino da estrutura rígida, e ele foi preenchido com o segmento correspondente da estrutura extracelular de TLR3 2a0z Bell et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (USA) 102:10976 a 10980, 2005, ID da estrutura PDB: 2a0z). A terminação C do ECD de TLR3 continha densidade adicional que se assemelha àquela do 10 2a0z.
Este segmento (647 a 703 de SEQ ID n° 2) foi, então, substituído pe- los (resíduos 647 a 687) de 2a0w.
Desta forma, o modelo de ECD de TLR3 foi um híbrido entre as estruturas de TLR3 1ziw e 2a0z e foi refinado como 13 segmentos de estrutura rígida (intervalo de aminoácidos: 30-60,61- 108,109-156,157-206,207-257,258-307,308-363,364-415,416-464,465- 15 514,515-570,571-618,619-687). A LCDR3 do Fab 12QVQ/QSV adotou aparentemente uma con- formação diferente da sua forma livre.
Anelamento simulado com múltiplos inícios foi executado com parâmetros padrão em PHENIX.
Os modelos deste LCDR3 foram inspecionados visualmente no mapa de densidade eletrônica 20 e a conformação com a "melhor-igualdade" foi enxertada no modelo original.
O processo de refino foi monitorado por Rlivre contra 5% das reflexões des- prezadas antes do início dos cálculos Na rodada final, um fator B para cada resíduo foi incluído.
A inspeção do modelo e a reconstrução manual das re- giões de cotovelo dos Fabs e cadeias laterais nas interfaces proteína- 25 proteína foram feitas usando COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr.
D.
Biol.
Crystallogr. 60:2126 a 2132, 2004). Os Rcrist e Rlivrefinais foram de 26,8% e 30,0%, respectivamente, para todas as 15,792 reflexões independentes a 5,0 Å.
As estatísticas de refino são dadas nas tabelas 13 e 14. Resultados 30 Estrutura molecular do complexo quaternário ECD de TLR3-três Fab A estrutura molecular global do complexo é mostrada na figura
28. Na unidade assimétrica há um ECD de TLR3 e uma molécula de cada Fab.
O modelo estrutural para ECD de TLR3 inclui todos os resíduos de 30 a 687 de huTLR3 (SEQ ID n° 2). Para os três Fabs, todos os resíduos de suas respectivas formas não ligadas foram incluídos exceto íons de solvente e 5 moléculas de água.
A molécula de ECD de TLR3 é muito similar às estrutu- ras relatadas anteriormente com relação à topologia geral (rmsd de 0,79 Å para 1ziw, 613 C ’s, e 1,37 Å para 2a0z, 595 C ’s). As estruturas de Fab são todas idênticas a suas respectivas formas não ligadas com a exceção da LCDR3 do Fab 12QVQ/QSV, conforme descrito nos Métodos, assim como 10 as regiões de cotovelo e algumas cadeias laterais nas interfaces ECD de TLR3/Fab.
Tabela 14 coleta de dados Fab 12QVQ/QSV Fab 15EVQ Fab c1068 grupo de espaço P21 P21 P21 dimensões da célula a, b, c (Å) 75,83, 80,35, 83,06 54,68, 74,74, 64,99 82,48, 136,94, 83,25 , , (°) 90, 115,24, 90 90, 103,69, 90 90, 114,95, 90 Resolução (Å) 70-2,5 (2,59-2,50) 49-2,2 (2,28-2,20) 50-1,9 (2,0-1,9) Reflexões únicas 27,785 (1653) 24,439 (1859) 117,490 (5916) Completeza (%) 88,5 (53) 94,2 (72,8) 89,3 (45,2) Redundância 4 (1,8) 5,2 (4,3) 3,2 (2) Rintegraçãoa 0,164 (0,297) 0,088 (0,445) 0,065 (0,264)
129/133 <I > (média não calculada) 2,9 (1,2) 3,8 (1,4) 5,7 (1,6)
refino da estrutura Fab 12QVQ/QSV Fab 15EVQ Fab c1068 resolução (Å) 15-2,5 (2,56-2,50) 15-2,2 (2,26-2,20) 75,38-1,90 (1,94-1,90) Rcrist/Rlivre (°)b 19,7/25,4 (30,8/40,8) 19,3/26,9 (24,6/31,1) 20,4/27,7 (39,8/51,1) N° de reflexões Conjunto de trabalho 26,723 23,308 111,413 Conjunto de teste 882 1,008 5,917 número de átomos proteínas 7,046 3,705 13,421 solvente (água, etc.) 486 333 1,779 comprimentos de ligação (Å) 0,012 0,013 0,023 refino da estrutura Fab 12QVQ/QSV Fab 15EVQ Fab c1068 RMSD ângulos de ligação 16 1,5 2 (°) Gráfico de Ramachandranc regiões favorecidas (%) 923 96,8 97,2 permitidas (%) 98,9 99,3 99,7 não permitidas (%) 1,1 0,7 0,3 Os valores para o envoltório com resolução mais elevada estão entre parênteses a Rmerge = | <I>|/ , onde I é a intensidade da reflexão medida e <I> é a intensidade média de todas as medições desta reflexão. b Rcryst = ||Fobs|-|Fcalc||/ | Fobs|, onde Fobs e Fcalc são fatores de estrutura observados e calculadoos e Rlivre é calculado para
130/133 5 um conjunto de 5% de reflexões escolhidas aleatoriamente antes do refino. c O gráfico de Ramachandran foi calculado com MolProbity (Davis, I.W., et al., Nucleic Acids Res, 32: W615-9, 2004).
Os epitopos e os paratopos Os resíduos envolvidos na ligação entre o ECD de TLR3 e os três Fabs são mostrados na figura 28B.
O Fab 12QVQ/QSV se ligou próximo à terminação N do ECD de TLR3. O epitopo conformacional foi composto de 5 resíduos de LRRs de TLR3 3 a 7 (aminoácidos 100 a 221 da SEQ ID n° 2). A ligação do Fab 12QVQ/QSV enterrou aproximadamente 928 Å2 e 896 Å2 so- bre o antígeno e o anticorpo, respectivamente.
Para o Fab 12QVQ/QSV, a estrutura cristalina identificou os seguintes resíduos de epitopo de TLR3 (SEQ ID n° 2): S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, 10 T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195, e A219. Para o Fab 12QVQ/QSV, a estrutura cristalina identificou os seguintes resíduos de para- topo: cadeia leve (SEQ ID n° 211): G28, S29, Y30, Y31, E49, D50, Y90, D91, e D92. Cadeia pesada (SEQ ID n° 214): N32, Q54, R56, S57, K58, Y60, Y104, P105, F106, e Y107. 15 Fab 15EVQ e Fab c1068 se ligaram a epitopos não sobrepostos ocupando as LRRs 15 a 23 (aminoácidos 406 a 635 da SEQ ID n° 2) próxi- mo da terminação C (figura 28). O Fab 15EVQ enterrou 1080 Å2 e 1064 Å2 sobre o antígeno e o anticorpo, respectivamente, enquanto que o Fab c1068 enterrou 963 Å2 e 914 Å2 sobre o antígeno e o anticorpo, respectivamente.
O 20 epitopo para o Fab 15EVQ cobre os resíduos K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, L595 e K619 de TLR3 mostrados na SEQ ID n° 2. Para o Fab 15EVQ, a estrutura cristalina identificou os seguintes resíduos de paratopo: cadeia leve (SEQ ID n° 41): Q27, Y32, N92, T93, L94, e S95. Ca- 25 deia pesada (SEQ ID n° 216): W33, F50, D52, D55, Y57, N59, P62, E99, Y101, Y104, e D106. Para o Fab c1068, a estrutura cristalina identificou os seguintes resíduos de epitopo sobre TLR3 (SEQ ID n° 2): E446, T448, Q450, R453, R473, N474, A477, L478, P480, S498, P499, Q503, P504, R507, D523, 30 D524, E527, E530, e K559. Para o Fab c1068, a estrutura cristalina identifi- cou os seguintes resíduos de paratopo cadeia leve: H30, N31, Y32, N50, E66, S67, G68 (glyc). Cadeia pesada: T30, T31, Y32, W33, H35, E50, N52,
N54, N55, R57, N59, V99, M102, I103, e T104. Mecanismos de neutralização e implicação para função de TLR3 mAb 15EVQ: O epitopo do mAb 15EVQ contém os resíduos de TLR3 N517, H539 e N541, que se sobrepõem ao sítio de ligação de dsRNA 5 C-terminal (Bell et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 103:8792 a 8797, 2006). Desta forma, por não desejar se ater a uma teoria particular, acredita-se que o mAb 15EVQ compete pela ligação de TLR3 com seu ligante e evita a di- merização do receptor induzida pelo ligante, que é necessária para a forma- ção da unidade de sinalização (Liu et al., Science 320:379 a 381, 2008). A 10 figura 29 ilustra este mecanismo de competição direta para o mAb 15EVQ.
Dependendo da concentração de anticorpo, este mecanismo levaria a uma inibição total de poli(I:C) ou ativação de TLR3 induzida por dsRNA. mAb 12QVQ/QSV e mAb c1068: Conforme mostrado na figura 30, estes dois anticorpos não se encontram diretamente com o ligante de 15 dsRNA.
Desta forma, é improvável que eles neutralizem a função de TLR3 por um mecanismo similar ao do mAb 15EVQ.
Os fragmentos Fab também são orientados para longe do ligante (figura 30). Estruturalmente, tanto o mAb 12QVQ/QSV quanto o Fab c1068 podem se ligar a uma unidade de sinalização (SU) sem atrapalhar sua função.
Estericamente, é improvável 20 que os dois fragmentos Fab de uma molécula mAb sejam capazes de se ligar simultaneamente às duas moléculas de TLR3 em uma SU, e assim evi- tar a dimerização de TLR3 mediada por dsRNA.
Por não desejar se ater a uma teoria particular, acredita-se que a ligação do mAb 12QVQ/QSV ou mAb c1068 a TLR3 evita o agrupamento da unidade de sinalização devido a 25 encontros estéricos entre os anticorpos e as unidades de sinalização vizi- nhas.
A ligação de TLR3 ao dsRNA não se limita à unidade de sinalização definida pelo complexo dsRNA:TLR3 (Liu, et al., Science, 320: 379 a 381, 2008). É possível que o agrupamento de múltiplas SUs possa levar a uma intensificação da sinalização ou que a sinalização de TLR3 eficaz exija este 30 agrupamento.
O posicionamento do mAb 12QVQ/QSV e do mAb c1068 po- de bloquear o agrupamento e resultar na neutralização da atividade de TLR3. Os efeitos máximos de neutralização dos anticorpos seriam, portanto,
dependentes do grau de separação das SUs causada pela ligação do anti- corpo.
Conforme ilustrado na figura 30, o mAb 12QVQ/QSV causaria uma maior separação do que o mAb c1068, e isto poderia se traduzir em uma maior potência do mAb 12QVQ/QSV.
Isto está em consonância com as ob- 5 servações de que o mAb c1068 e o mAb 15EVQ podem levar a ~50% e 100% de neutralização de TLR3 em concentrações de saturação, respecti- vamente, e o mAb 12QVQ/QSV tem atividade intermediária.
Desta forma, os estudos de neutralização de TLR3 e estruturais combinados sugerem um modelo de sinalização de TLR3 no qual as unidades de sinalização dsR- 10 NA:TLR3 se agrupam para obter uma sinalização eficaz.
O mAb 12QVQ/QSV e o mAb c1068 também definem uma classe de anticorpos que pode modular parcialmente a sinalização de TLR3 sem interferir com a liga- ção do ligante ou dimerização do receptor.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, no qual o anticor- po se liga aos resíduos de aminoácido do receptor do tipo Toll 3 (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, 5 A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, L595, e K619 da SEQ ID n° 2.
2. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, no qual o anticor- po se liga aos resíduos de aminoácido do receptor do tipo Toll 3 (TLR3) S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, T166, Q167, 10 V168, S188, E189, D192, A195, e A219 da SEQ ID n° 2.
3. Anticorpo isolado que compreende uma região variável de ca- deia pesada e uma região variável de cadeia leve, ou fragmento do mesmo, no qual o anticorpo se liga a TLR3 tendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos Chothia da região variável da ca- 15 deia pesada W33, F50, D52, D54, Y56, N58, P61, E95, Y97, Y100, e D100b e os resíduos Chothia da região variável de cadeia leve Q27, Y32, N92, T93, L94, e S95.
4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 3, no qual o anticorpo tem pelo menos uma das seguintes propriedades: 20 a. se liga a TLR3 humano com um Kd de <10 nM; b. reduz a atividade biológica de TLR3 humano em um ensaio in vitro de gene-repórter poli(I:C) NF- B >50% a 1 µg/ml; c. inibe >60% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com<100 ng/ml de poli(I:C) a 10 µg/ml; 25 d. inibe >50% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml de poli(I:C) a 0,4 µg/ml; e. inibe >50% de produção de IL-6 de células NHBE estimuladas com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 5 µg/ml; f. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas 30 com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 1 µg/ml; g. inibe >20% da produção IFN- , IL-6 ou IL-12 induzidos por po- li(I:C) por PBMC a 1 µg/ml;
h. inibe a atividade biológica de TLR3 em macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter NF-kB com IC50 <10 µg/ml; ou i. inibe a atividade biológica de TLR3 em macacos cynomolgus em um ensaio in vitro do gene-repórter ISRE com IC50 <5 g/ml. 5 5. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 3, no qual o anticorpo compreende uma região determinante de complementaridade (C- DR) 3 de cadeia pesada (HCDR3) com 12 aminoácidos de comprimento.
6. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 3, no qual o anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (C- 10 DR) 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID n° 82, 86 e 84, respectivamente, e as regiões deter- minantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3) tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênti- 15 cas às sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID n° 79, 80 e 87, respectivamente.
7. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 3, que com- preende uma estrutura de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácido de uma estrutura capa 1 (V 1) da região variável da 20 cadeia leve (V 1) e uma estrutura de cadeia pesada que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido de uma estrutura Vh5 da região variável de cadeia pesada (Vh5).
8. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, no qual a estrutura Vk1 é codificada por IGKV1-39*01 tendo uma sequência de amino- 25 ácido mostrada em SEQ ID n° 221, e a estrutura Vh5 é codificada por I- GHV5-51*01 tendo uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID n°
222.
9. Anticorpo isolado que compreende uma região variável da ca- deia pesada e uma região variável da cadeia leve, ou fragmento do mesmo, 30 no qual o anticorpo se liga a TLR3 tendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n° 2 com os resíduos Chothia da região variável da ca- deia pesada N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, F99 e Y100, e os resíduos Chothia da região variável da cadeia leve G29, S30, Y31, Y32, E50, D51, Y91, D92, e D93.
10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, no qual o anticorpo tem pelo menos uma das seguintes propriedades: 5 a. se liga a TLR3 humano com um Kd de <10 nM; b. reduz a atividade biológica de TLR3 humano em um ensaio in vitro de gene-repórter de poli(I:C) NF- B >50% a 1 µg/ml; c. inibe >60% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com<100 ng/ml de poli(I:C) a 10 µg/ml; 10 d. inibe >50% da produção de IL-6 ou CXCL10/IP-10 de células BEAS-2B estimuladas com <100 ng/ml de poli(I:C) a 0,4 µg/ml; e. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 5 µg/ml; f. inibe >50% da produção de IL-6 de células NHBE estimuladas 15 com 62,5 ng/ml de poli(I:C) a 1 µg/ml; g. inibe >20% da produção de IFN- , IL-6 ou IL-12 induzida por poli(I:C) por PBMC a 1 µg/ml;
11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, no qual o anticorpo compreende uma HCDR3 com 10 aminoácidos de comprimento 20 e uma LCDR3 com 10 aminoácidos de comprimento.
12. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, no qual o anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) tendo sequên- cias de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoáci- 25 dos mostradas nas SEQ ID n° 70, 77 e 72, respectivamente, e as regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 de cadeia leve (LC- DR1, LCDR2, LCDR3) tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID n° 67, 68 e 78, respectivamente. 30
13. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, que compreende uma estrutura de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido de uma estrutura capa 3 (V 3) da região variável da cadeia leve (V 3) e uma estrutura de cadeia pesada que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido de uma estrutura Vh6 da região variável da cadeia pesada (Vh6).
14. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 13, no qual 5 a estrutura V 3 é codificada por IGLV3-1*01 tendo uma sequência de ami- noácido mostrada em SEQ ID n° 223, e a estrutura Vh6 é codificada por I- GHV6-1*01 tendo uma sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID n°
224.
15. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, de acordo com a 10 reivindicação 1 ou 9, no qual o anticorpo a. é totalmente humano; b. é adaptado a ser humano; c. é conjugado a polietileno glicol; d. é de um isotipo IgG4; ou 15 e. o domínio Fc compreende mutações S229P, P235A ou L236A.
16. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo iso- lado, ou fragmento, como definido na reivindicação 1 ou 9, e um veículo far- maceuticamente aceitável. 20
17. Método para tratar uma condição inflamatória que compre- ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo iso- lado, como definido na reivindicação 1 ou 9, a um paciente que precisa do mesmo durante um tempo suficiente para tratar ou prevenir a condição in- flamatória. 25
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, no qual a condi- ção inflamatória é uma condição inflamatória pulmonar, doença inflamatória intestinal, doença autoimune, condição inflamatória sistêmica, ou artrite reu- matoide.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual a condi- 30 ção inflamatória pulmonar é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), hiper-responsividade da via aérea, ou é induzido por influenza Ha- emophilus não tipável.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual a condi- ção inflamatória sistêmica é tempestade de citocina ou hipercitocinemia, sín- drome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), doença de enxerto-contra- hospedeiro (GVHD), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), 5 síndrome do desconforto respiratório grave (SARS), síndrome antifosfolipí- deo catastrófica, infecções virais graves, gripe, pneumonia, choque, ou sep- se.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17, no qual a condi- ção inflamatória é associado à ulceração gastrointestinal. 10
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, no qual a ulcera- ção gastrointestinal é associada à colite infecciosa, colite isquêmica, colite colagenosa ou linfocítica ou enterocolite necrosante.
23. Método para tratar diabetes tipo II, hiperglicemia ou hiperin- sulinemia que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente 15 eficaz do anticorpo isolado, como definido na reivindicação 1 ou 9, a um pa- ciente que necessita do mesmo durante tempo suficiente para tratar diabetes tipo II, hiperglicemia ou hiperinsulinemia.
24. Método para tratar ou prevenir infecções virais que compre- ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo iso- 20 lado, como definido na reivindicação 1 ou 9, a um paciente que necessita do mesmo, durante tempo suficiente para tratar ou prevenir infecções virais.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, no qual a infec- ção viral é infecção causada por vírus influenza A.
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