ES2556239T3 - Antagonistas del receptor 3 de tipo Toll - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido del receptor 3 de tipo Toll (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, L595 y K619 de SEC ID Nº: 2.

Description

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También se desvelan otros anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos reactivos con TLR3 que comprenden tanto una región variable de la cadena pesada como de la cadena ligera y en los que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDR) 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestran en la Tabla 1a.

Tabla 1a.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

mAb Nº:

Nº ID SEC.:

HCDR1

HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3

16

52 88 54 49 50 51

17

58 64 60 55 56 57

18

70 77 72 67 68 69

19

82 83 84 79 80 89

1

46 47 48 43 44 45

2

52 53 54 49 50 51

3

58 59 60 55 56 57

4

61 62 60 55 56 57

5

61 64 60 55 56 63

6

61 64 60 55 56 65

7

61 64 60 55 56 66

8

70 71 72 67 68 69

9

70 73 72 67 68 69

10

70 75 72 67 68 74

11

70 77 72 67 68 76

12

70 77 72 67 68 78

13

82 83 84 79 80 81

14

82 86 84 79 80 85

15*

82 86 84 79 80 87

15**

111 112 84 109 110 113

15-1

111 114 84 109 110 113

15-2

115 112 84 109 110 113

15-3

116 112 84 109 110 113

15-4

111 117 84 109 110 113

15-5

116 118 84 109 110 113

15-6

116 112 119 109 110 113

15-7

111 112 84 120 110 113

15-8

111 112 84 121 110 113

15-9

116 118 119 109 110 113

15-10

116 112 119 79 80 226

F17

61 192 60 55 56 191

11

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Dependiendo de la delineación de los sitios de unión al antígeno, los residuos del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos de la invención y posteriormente los residuos de la región estructural puede variar ligeramente para cada cadena pesada y ligera.

Tabla 1b.

10

15

20

25

30

35

Residuo Original

Sustitución ejemplar Substituciones mas conservativas

Ala (A)

Val, Leu, Ile Val

Arg (R)

Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N)

Gln Gln

Asp (D)

Glu Glu

Cys (C)

Ser, Ala Ser

Gln (Q)

Asn Asn

Gly (G)

Pro, Ala Ala

His (H)

Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I)

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K)

Arg, 1, 4 Acido-diamino butírico, Gln, Asn Arg

Met (M)

Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F)

Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro (P)

Ala Gly

Ser (S)

Thr, Ala, Cys Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr, Phe Tyr

Tyr (Y)

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V)

Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

40 La Tabla 2a y 2b muestra los residuos del sitio de unión al antígeno de anticuerpos a modo de ejemplo de la invención y divulgación delineada según Kabat, Chothia e IMGT, y sus secuencias compuestas.

En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 según la reivindicación 1 que comprende tanto una región variable de la cadena pesada como una región variable de la

45 cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones de la cadena pesada variable (VH) y la cadena ligera variable (VL) como se muestran en la Tabla 3a. F17, F18 y F19 representan variantes de anticuerpo que comprenden secuencias de aminoácidos consenso para las familias 17, 18 y 19, respectivamente (véase el Ejemplo 1).

50

55

14

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Tabla 2a.

15

25

35

45

55

mAb

Definición CDR HCDR1 HCDR2 HCDR3

ID SEC.

Secuencia ID SEC Secuencia ID SEC Secuencia

14

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

14

Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

14

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

14

Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15

Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

15

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15

Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-1

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-1

Kabat NYWVG RIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-1

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-1

Consenso 111 GYSFTNYWVG 114 RIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-2

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-2

Kabat NYWIG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-2

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-2

Consenso 115 GYSFTNYWIG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-3

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-3

Kabat NYWIS 86 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ELYQGYMDTFDS

15-3

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-3

Consenso 116 GYSFTNYWIS 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-4

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-4

Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-4

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-4

Consenso 111 GYSFTNYWVG 117 FIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-5

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-5

Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-5

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-5

Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-6

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY ARQLYQGYMDTFDS

15-6

Kabat NYWIS FIDPSDSYTNYAPSFQ QLYQGYMDTFDS

15-6

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-6

Consenso 116 GYSFTNYWIS 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 119 ARQLYQGYMDTFDS

15-7

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

15-7

Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-7

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-7

Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-8

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS

17

5

10

15

mAb

Definición CDR HCDR1 HCDR2 HCDR3

ID SEC.

Secuencia ID SEC Secuencia ID SEC Secuencia

15-8

Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS

15-8

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD

15-8

Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS

15-9

IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 119 ARQLYQGYMDTFDS

15-9

Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFQG QLYQGYMDTFDS

15-9

Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMPTFD

15-9

Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQG 119 ARQLYQCYMDTFDS

En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 según la reivindicación 1 que comprende tanto una región variable de la cadena pesada como una región variable de la 20 cadena ligera que tiene secuencias de aminoácidos al menos el 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de la región variable mostradas en la Tabla 3a.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado según la reivindicación 1 que tiene ciertas secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera como se muestra en la Tabla 3b.

25 En el presente documento también se desvelan polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención o su complemento. Ciertos polinucleótidos a modo de ejemplo se desvelan en el presente documento, sin embargo, también están dentro del alcance de la invención otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o preferencias de codón en un sistema de expresión dado, codifican los

30 antagonistas de anticuerpo de la invención.

Tabla 2b.

35

40

45

50

55

60

65

mAb

Definición CDR LCDR1 LCDR2 LCDR3

Nº ID SEC:

Secuencia Nº ID SEC: Secuencia Nº ID SEC: Secuencia

14

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 85 QQAETVSPT

14

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQAEIVSPT

14

Chothia SQSIGLY AAS AETVSP

14

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 85 QQAETVSPT

15

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-1

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-1

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-1

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-1

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-2

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-2

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-2

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-2

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-3

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-3

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mAb

Definición CDR LCDR1 LCDR2 LCDR3

Nº ID SEC:

Secuencia Nº ID SEC: Secuencia Nº ID SEC: Secuencia

15-3

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-3

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-4

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-4

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-4

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-4

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-5

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-5

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-5

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-5

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-6

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-6

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-6

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-6

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-7

IMGT QSISSY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-7

Kabat RASQSISSYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-7

Chothia SQSISSY AAS GNTLSY

15-7

Consenso 120 RASQSISSYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-8

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-8

Kabat RASQSIGLYLN AASSLQS QQGNTLSYT

15-8

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-8

Consenso 121 RASQSIGLYLN 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

15-9

IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT

15-9

Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT

15-9

Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY

15-9

Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT

19

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5

15

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45

55

65

volumen de 150 µl/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000. Los anticuerpos se marcaron con éster de NHS MSD Sulfo-Tag ™ según instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).

Se evaluaron los siguientes anticuerpos anti-TLR3: mAb 1-19 obtenidos de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana MorphoSys (mostrada en la Tabla 3a); c1068 (descrita en el documento WO06/060513A2), c1811 (mAb de rata anti-TLR3 de ratón producido por un hibridoma generado de ratas inmunizadas con proteína TLR3 de ratón), TLR3.7 (eBiosciences, San Diego, CA, cat nº 14-9039) y IMG-315A (generado contra los aminoácidos de TLR3 humano los aminoácidos 55-70 (VLNLTHNQLRRLPAAN) de Imgenex, San Diego, CA). Para los mAb 9, 10, 12, 14 y 15 se usaron las variantes 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ en este estudio.

Basándose en los ensayos de competición, se asignaron anticuerpos anti-TLR3 a cinco cajas distintas. Caja A: mAb 1, 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; caja B: mAb 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 11, 12QVQ/QSV, 17, 18; caja C: anticuerpo Imgenex IMG-315A; caja D: anticuerpos TLR3.7, c1068; y caja E: anticuerpo c1811.

Ejemplo 6

Mapeo de epítopes

Se seleccionaron anticuerpos representativos de distintas cajas de epítopes como se describe en el Ejemplo 5 para el mapeo de epítopes adicional. El mapeo de epítopes se realizó usando diversos enfoques, que incluyen experimentos de intercambio de segmentos de TLR3, mutagénesis, intercambio de H/D y enlace proteína-proteína por ordenador (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volumen 6, Glen E. Morris ed., 1996).

Intercambio de segmentos de TLR3. Se usaron proteínas quiméricas de ser humano-ratón TLR3 para localizar dominios de unión al anticuerpo macroscópicos en TLR3. El dominio extracelular de la proteína TLR3 humano se dividió en tres segmentos (aa 1-209, aa 210-436, aa 437-708 según la numeración de aminoácidos basada en la secuencia de aminoácidos de TLR3 humano, GenBank Acc. No. NP_003256). Se generó la proteína quimérica MT5420 reemplazando los aminoácidos de TLR3 humano 210-436 y 437-708 por aminoácidos de ratón correspondientes (TLR3 de ratón, GenBank Acc. No. NP_569054, aminoácidos 211-437 y 438-709). Se generó la quimera MT6251 reemplazando los aminoácidos humanos en las posiciones 437-708 por los aminoácidos de TLR3 de ratón (TLR3 de ratón, GenBank Acc. No. NP_569054, aminoácidos 438-709). Todas las construcciones se generaron en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carslbad, CA) usando procedimientos de clonación estándar. Las proteínas se expresaron transitoriamente en células HEK293 como proteínas de fusión del extremo C V5-His6, y se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.

mAb c1068. Se unió el mAb c1068 a ECD de TLR3 humano con alta afinidad, pero no se unió bien a TLR3 murino. c1068 perdió su capacidad para unirse a tanto MT5420 como MT6251, demostrando entonces que el sitio de unión se localizó dentro de los aminoácidos 437-708 de la proteína TLR3 humano WT.

mAb 12QVQ/QSV. Se unió el mAb 12QVQ/QSV a ambas quimeras, que indica entonces que el sitio de unión para el mAb 12QVQ/QSV se localizó dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína TLR3 humano que tiene una secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2.

Enlace proteína-proteína por ordenador. La estructura cristalina del mAb 15EVQ (véase más adelante) y la estructura de TLR3 humano publicada (Bell et al., J. Endotoxin Res. 12:375-378, 2006) fueron de energía minimizada en CHARMm (Brooks et al., J. Computat. Chem. 4:187-217, 1983) para su uso como los modelos de partida para el enlace. El enlace de proteínas se llevó a cabo con ZDOCKpro 1.0 (Accelrys, San Diego, CA), que es equivalente a ZDOCK 2.1 (Chen y Weng, Proteins 51: 397-408, 2003) con una rejilla angular de 6 grados. Se bloquearon residuos de Asn del sitio de glucosilación ligados en N conocidos en TLR3 humano (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 y 636) (Sun et al., J. Biol. Chem. 281:11144-11151, 2006) de la participación en la superficie de separación del anticuerpo-antígeno por un término de energía en el algoritmo ZDOCK. Se produjeron 2000 poses iniciales y se agruparon y los poses de enlace se refinaron y se volvieron a puntuar en RDOCK (Li et al., Proteins 53:693-707, 2003). Se inspeccionaron visualmente los 200 poses con las mayores puntuaciones de ZDOCK iniciales y las 200 posiciones principales de RDOCK.

La cristalización de Fab 15EVQ se llevó a cabo por el método de difusión de vapor a 20 ºC (Benvenuti y Mangani, Nature Protocols 2:1633-51, 2007). Se estableció el cribado inicial usando un robot Hydra en placas de 96 pocillos. Los experimentos estuvieron compuestos de gotitas de 0,5 µl de disolución de proteína mezclada con 0,5 µl de disolución de depósito. Las gotitas se equilibraron contra 90 µl de disolución de depósito. La disolución de Fab en tampón Tris 20 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 50 mM, se concentró a 14,3 mg/ml usando celdas Amicon Ultra-5 kDa. El cribado se realizó con los tamices de cristalización Wizard I & II (Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA) e internos. Se cristalizó Fab 12QVQ/QSV de una manera similar.

Se recogieron datos de difracción de rayos X y se procesaron usando el generador de rayos X de microfoco Rigaku MicroMax ™-007HF equipado con una óptica confocal Osmic ™ VariMax ™, detector Saturn 944 CCD y un sistema de

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una cadena lateral ligeramente mayor tal como Ile. (2) E99 de VH CDR3 estaba enterrado en la interfase VH/VL sin una red de enlaces de H. El grupo carboxilato negativamente cargado de E99 estuvo en un entorno generalmente hidrófobo con contactos principalmente de van der Waals (vdw) con residuos vecinos. El enterramiento de un grupo cargado es normalmente energéticamente desfavorable y así tiene efecto desestabilizante. (3) F50 de VH es un 5 residuo de la interfase VH/VL. Su cadena lateral aromática es voluminosa y así puede tener impacto negativo tras el emparejamiento. Se calcularon las redes de empaquetamiento de enlaces de H y de vdw para el Fv y se inspeccionaron visualmente en Pymol (www://pymol.org). Las cavidades enterradas en los dominios VH y VL se calcularon por Caver (Petrek et al., BMC Bioinformatics, 7:316, 2006). Todas las figuras de gráficas moleculares se prepararon en Pymol. Se hicieron mutaciones a los vectores de expresión que codifican los fragmentos Fab o 10 anticuerpos humanos completos IgG4 generados como se ha descrito en el Ejemplo 3 usando técnicas de clonación estándar usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change II XL (Stratagene, San Diego, CA), kit de mutagénesis dirigida al sitio Change-IT Multiple Mutation (USB Corporation, Cleveland, OH) o el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change II (Stratagene, San Diego, CA). Las reacciones se realizaron según cada recomendación del fabricante. Los clones obtenidos se secuenciaron para verificación, y las variantes manipuladas 15 resultantes se llamaron mAb 15-1 -15-10 según su cadena pesada o ligera modificada. Cada cadena de variante (H

o L) se expresó con la cadena L o H del mAb 15EVQ no mutante para producir anticuerpos, excepto que la cadena pesada para el mAb 15-10 era del mAb 15-6. Un listado de las SEC ID Nº: para las CDR, regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas y cadenas pesadas y ligeras de longitud completa para el mAb 15EVQ y sus variantes manipuladas por ingeniería se muestra en la Tabla 6. La Tabla 7 muestra los cebadores para la generación de cada 20 variante.

Tabla 6.

25

30

35

40

45

Nº SEC ID:

Nº Candidato:

HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 LV HV IgG4 pesada Cadena ligera

15

111 112 84 109 110 113 41 216 220 156

15-1

111 114 84 109 110 113 41 124 130 156

15-2

115 112 84 109 110 113 41 125 131 156

15-3

116 112 84 109 110 113 41 126 132 156

15-4

111 117 84 109 110 113 41 127 133 156

15-5

116 118 84 109 110 113 41 128 134 156

15-6

116 112 119 109 110 113 41 129 135 156

15-7

111 112 84 120 110 113 122 42 102 157

15-8

111 112 84 121 110 113 123 42 102 158

15-9

116 118 119 109 110 113 41 159 160 156

15-10

116 112 119 109 110 226 225 129 135 227

Se evaluó la unión de los mAb 15-1 -15-9 a TLR3 por inmunoensayo de ELISA. Se unió ECD de TLR3 humano (100 µl de 2 µg/ml de ECD de TLR3) a una placa Maxisorb negra (eBioscience) durante la noche a 4 ºC. Las placas se lavaron y se bloquearon, y se tomaron anticuerpos diluidos en alícuotas a 50 µl por pocillo por duplicado sobre los

50 pocillos. La placa se incubó a TA durante 2 horas agitando suavemente. La unión se detectó usando el sustrato POD de luminiscencia (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, Cat. Nº 11 582 950 001) y cabra anti-Fc humano:HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat. Nº. 109-035-098) y la placa se leyó en un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

55 Se realizaron experimentos de DSC en un sistema de DSC capilar MicroCal's Auto VP (MicroCal, LLC, Northampton, MA) en el que se midieron continuamente las diferencias de temperatura entre las celdas de referencia y de muestra, y se calibraron a unidades de potencia. Las muestras se calentaron de 10 ºC a 95 ºC a una tasa de calentamiento de 60 ºC/hora. El tiempo de barrido previo fue 15 minutos y el periodo de filtrado fue 10 segundos. La concentración usada en los experimentos de DSC fue aproximadamente 0,5 mg/ml. El análisis de los termogramas resultantes se

60 realizó usando el software MicroCal Origin 7 (MicroCal, LLC).

40

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5

15

25

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55

65

La estabilidad térmica (Tm) de las variantes generadas se midió por DSC (Tabla 8). La unión de las variantes de anticuerpo a TLR3 fue comparable a la del anticuerpo parental.

Tabla 8. Resumen de las temperaturas de fusión (TM) de las variantes y fundamento para hacerlas.

Nº Candidato:

Mutaciones Racional TM (°C) ∆TM (°C)

15EVQ

WT 64.7 0

15-1

HV F50R Interfaz VH / VL 69.3 4.6

15-2

HV V34I embalaje núcleo VH 66.9 2.2

15-3

HV V34I/G35S H-unión, embalaje núcleo VH 71.2 6.5

15-4

HV A61S/Q67H VH / VL embalaje, VH carga superficial 65.4 0.7

15-5

HV F50R/V34I/G35S/A61S/Q67H Interfaz VH / VL, H-unión, núcleo VH 76.2 11.5

15-6

HV V34I/G34S/E99Q Unión H-, embalaje núcleo VH, la eliminación de 75 10.3

15-7

LV G30S/L31S L-CDR1 superficie residuos polares 63.1 -1.6

15-8

LV A34N Interfaz VUVH 64 -0.7

15-9

HV F50R/V34I/G35S/A61S/Q67H/E99Q Interfaz VH / VL, H-unión, núcleo VH 76 11.3

15-10

LV S95P Estabilización de estructura canónica 76.6 11.9

Ejemplo 8

Generación de un anticuerpo anti-TLR3 sustituto

Se generó un anticuerpo de rata/ratón anti-TLR3 de ratón antagonista quimérico, llamado en el presente documento mAb 5429, para evaluar los efectos para inhibir la señalización de TLR3 en diversos modelos in vivo, ya que los anticuerpos humanizados generados en el Ejemplo 1 no tuvieron suficiente especificidad o actividad de antagonista para TLR3 de ratón. El mAb 5429 quimérico sustituto, además de su anticuerpo de rata anti-TLR3 de ratón parental, c1811, inhibió la señalización de TLR3 de ratón in vitro, e in vivo, y mejoró los mecanismos patógenos en varios modelos de enfermedad en el ratón.

Los datos tratados más adelante sugieren una función para TLR3 en la inducción y perpetuación de inflamación perjudicial, y contribuyen al fundamento para el uso terapéutico de antagonistas de TLR3 y antagonistas del anticuerpo para TLR3, por ejemplo, afecciones inflamatorias agudas y crónicas que incluyen hipercitoquinemia, asma e inflamación de las vías respiratorias, enfermedades inflamatorias del intestino y artritis reumatoide, infecciones virales y diabetes de tipo II.

Generación del mAb 5429 sustituto

Se inmunizaron ratas CD con el ectodominio de TLR3 murino recombinante (aminoácidos 1-703 de SEC ID Nº: 162, GenBank Acc. No. NP_569054) generado usando métodos rutinarios. Los linfocitos de dos ratas que demuestran títulos de anticuerpos específicos para TLR3 murino se fusionaron con células de mieloma FO. Se identificó un panel de anticuerpos monoclonales reactivo con TLR3 murino y se probó para la actividad de antagonista in vitro en los ensayos de indicador de luciferasa murina y de fibroblastos embrionarios murinos. Se seleccionó la línea de hibridoma C1811A para trabajo adicional. Se secuenciaron genes de la región variable funcional del mAb c1811 secretado por el hibridoma. Entonces se insertaron respectivamente genes clonados de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera en vectores de expresión plasmídicos que proporcionaron secuencias codificantes para generar un mAb quimérico de rata/muIgG1/κ de Balb C designado mAb 5429 usando métodos rutinarios. Los anticuerpos se expresaron como se describe en el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del mAb 5429 se muestran en SEC ID Nº: 164 y SEC ID Nº: 163, respectivamente, y las secuencias de longitud completa de la cadena pesada y ligera se muestran en SEC ID Nº: 166 y SEC ID Nº: 165, respectivamente. Las secuencias de longitud completa de la cadena pesada y ligera del

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Tabla 9B.

5

15

25

35

C57BL/6

PIC

+ PIC + PIC +

PIC

C57BL/6

mAb 5429 (mg/kg)

50 20 10 - - -

mAb c1811 (mg/kg)

- - - 20 10 2

1 h PIC reto

TNF-α

29.33 ± 3.78*** 31.05 ± 1.59*** 59.55 ± 12.71*** 32.54 ± 3.89*** 42.22 ± 7.04*** 42.61 ± 10.58***

KC

466.3 ± 92.35*** 440.3 ± 10.01*** 744.6 ± 103.1** 637.3 ± 151.0*** 944.2 ± 130.9** 919.3 ± 231.2**

IL-6

480.2 ± 62.88*** 375.9 ± 46.14*** 705.2 ± 149.8*** 739.2 ± 113.3*** 1047 ± 222*** 1229 ± 378.4***

MCP-1

168.5 ± 15.04** 321.6 ± 206.7 219.2 ± 70.58* 184.0 ± 14.92** 278.3 ± 53.57 414.9 ± 97.17

4 h PIC reto

IL-1α

343.0 ± 33.01*** 452.6 ± 94.86** 481.1 ± 121.0* 354.8 ± 45.43*** 351.7 ± 68.85*** 352.4 ± 39.60***

RANTES

1381 ± 169.7*** 2439 ± 308.7** 1601 ± 398.9*** 1303 ± 168.0*** 1365 ± 474.1*** 2209 ± 402.5**

TNF-α

100.1 ± 8.5*** 205.1 ± 41.85*** 226.1 ± 64.72*** 138.9 ± 26.0*** 121.6 ± 38.85*** 223.8 ± 47.74***

***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05: Un sentido ANOVA estadísticas se compararon con los C57BL / 6 + PICgrupo

Ejemplo 10

Los antagonistas del anticuerpo para TLR3 reducen la hipersensibilidad de las vías respiratorias

45 Modelo

Se indujo hipersensibilidad de las vías respiratorias por poli(I:C).

Se anestesiaron ratones C57BL/6 hembra (12 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (referencia C57BL/6;

12 semanas de edad, Ace Animals, Inc.) con isoflurano y se administraron intranasalmente varias dosis (10-100 µg)

de poli(I:C) en 50 µl de PBS estéril. Los ratones recibieron tres administraciones de poli(I:C) (o PBS) con un periodo

de descanso de 24 horas entre cada administración. 24 horas tras la última administración de poli(I:C) (o PBS), se

midieron la función pulmonar y la hipersensibilidad de las vías respiratorias a metacolina usando pletismografía de

cuerpo entero (sistema de BUXCO). Los ratones se colocaron en la cámara pletismográfica de cuerpo entero y se 55 dejó que se aclimataran durante al menos 5 minutos. Tras las lecturas del nivel inicial, los ratones se expusieron a

dosis crecientes de metacolina nebulizada (Sigma, St. Louis, MO). La metacolina nebulizada se administró durante 2

minutos, seguido de un periodo de recogida de datos de 5 minutos, seguido de un periodo de descanso de 10

minutos antes de las posteriores exposiciones a metacolina de dosis crecientes. Se midió la elevada resistencia al

flujo de aire como pausa potenciada (Penh) y se representa como el valor de Penh promedio durante el periodo de

registro de 5 minutos (sistema de BUXCO). Tras las mediciones de la función pulmonar, los ratones se sacrificaron y

los pulmones se canularon. Se realizaron lavados broncoalveolares (BAL) inyectando 1 ml de PBS en los pulmones

y recuperando el efluente. Se extrajeron los tejidos de pulmón y se congelaron. Los líquidos BAL se centrifugaron

(1200 rpm, 10 min) y se recogieron los sobrenadantes sin células y se guardaron a -80 ºC hasta el análisis. Se

resuspendieron sedimentos de células en 200 µl de PBS para cifras totales y diferenciales de células. Se realizó 65 ensayo de múltiplex siguiendo el protocolo del fabricante y el kit de inmunoensayo de múltiplex (Millipore, Billercia,

MA).

45

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Se dividieron ratones B10RIII macho (6-8 semanas de edad, Jackson Labs) en grupos de 15 por grupo (grupos de artritis) o 4 por grupo (ratones de control). Los grupos de artritis se anestesiaron con isoflurano y se les administraron inyecciones de colágeno de tipo II (Elastin Products) y adyuvante completo de Freund complementado con M.

5 tuberculosis (Difco) en los días 0 y 15. En el día 12, los ratones con artritis por colágeno de tipo II en desarrollo se aleatorizaron por peso corporal en grupos de tratamiento y se dosificaron subcutáneamente (SC) en los días 12, 17 y 22 (d12, d17, 2d2) con el mAb 5429 (25 mg/kg), el anticuerpo de control negativo CVAM (un mAb recombinante de especificidad no conocida en el ratón) (5 mg/kg) o anticuerpo anti-TNF-α (5 mg/kg, control positivo). Además, se trataron grupos de control de ratones con vehículo (PBS) o dexametasona (0,5 mg/kg, Dex, compuesto de referencia) subcutáneamente (SC) diariamente (QD) en los días 12-25. Los animales se observaron diariamente de los días 12 a 26. Se evaluaron las patas delanteras y traseras por un sistema de puntuación clínica (mostrado a continuación). Los animales se sacrificaron en el día del estudio 26 y se evaluó la histopatología de un modo cegado (sistema de puntuación descrito a continuación). La evaluación de eficacia se basó en los pesos corporales del animal y las puntuaciones de artritis clínica. Todos los animales sobrevivieron al término del estudio.

15 Criterios de puntuación clínica para las patas delanteras y traseras

0 -normal 1 -articulación de las patas traseras o delanteras afectada o eritema difuso mínimo e hinchazón 2 -articulaciones de las patas traseras o delanteras afectadas o eritema difuso leve e hinchazón 3 -articulaciones de las patas traseras o delanteras afectadas o eritema difuso moderado e hinchazón 4 -eritema difuso marcado e hinchazón, o = 4 articulaciones de los dedos afectadas) 5 -eritema difuso grave e hinchazón grave de la pata entera, incapaz de flexionar los dedos)

25 Métodos de puntuación histopatológica para las articulaciones de ratón con artritis por colágeno de tipo II

Cuando se puntuaron las patas o tobillos de ratones con lesiones de artritis por colágeno de tipo II, se consideraron la gravedad de los cambios, además del número de articulaciones individuales. Cuando solo se afectaron 1-3 articulaciones de las patas o tobillos fuera de una posibilidad de numerosas articulaciones metacarpianas/metatarsales/digitales o tarsales/tibiotarsales, se dio una asignación arbitraria de una puntuación máxima de 1, 2 o 3 para los siguientes parámetros dependiendo de la gravedad de los cambios. Si estuvieron implicadas más de 2 articulaciones, los siguientes criterios se aplicaron a las articulaciones más gravemente afectadas / mayoría de las articulaciones.

35 Se analizaron los datos clínicos para las puntuaciones de patas usando el ABC para los días 1-15, y se calcularon los % de inhibición de los controles.

Inflamación

0 -normal 1 -infiltración mínima de células inflamatorias en sinovio y tejido periarticular de articulaciones afectadas 2 -infiltración leve, si es en las patas, limitada a las articulaciones afectadas 3 -infiltración moderada con edema moderado, si es en las patas, limitada a las articulaciones afectadas 4 -marcada infiltración que afecta la mayoría de las áreas con marcado edema

45 5 -infiltración difusa grave con edema grave

Paño

0 -normal 1 -infiltración mínima de paño en cartílago y hueso subcondral 2 -infiltración leve con destrucción de la zona marginal de tejido duro en las articulaciones afectadas 3 -infiltración moderada con destrucción de tejido duro moderada en articulaciones afectadas 4 -marcada infiltración con marcada destrucción de la arquitectura de las articulaciones, la mayoría de las articulaciones

55 5 -infiltración grave asociada a destrucción total o casi total de la arquitectura de las articulaciones, afecta todas las articulaciones

Daño al cartílago

0 -normal 1 -pérdida de mínima a leve de tinción con azul de toluidina sin pérdida de condrocitos obvia o rotura de colágeno en las articulaciones afectadas 2 -pérdida leve de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos (superficial) leve focal y/o rotura de colágeno en articulaciones afectadas

65 3 -pérdida moderada de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos (zona profunda a media) moderada multifocal y/o rotura de colágeno en articulaciones afectadas

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Claims (1)

1. imagen1

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