ES2899036T3 - Nanocuerpo anti-PD-L1 y su uso - Google Patents

Nanocuerpo anti-PD-L1 y su uso Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH), que comprende una región determinante complementaria (CDR) que consiste en la CDR1 como se establece EN la SEQ ID NO: 5, CDR2 como se establece en la SEQ ID NO: 6 y CDR3 como se establece en la SEQ ID NO: 7, en el que dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están separadas por las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena VHH, y el anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanocuerpo anti-PD-LI y su uso
Campo técnico
La presente divulgación se relaciona con el campo de la tecnología biomédica o biofarmacéutica, y más específicamente con los nanocuerpos contra PD-L1, las secuencias de codificación y los usos de los mismos.
Antecedentes
El ligando 1 de la muerte programada 1 (PD-L1), también conocido como CD274, es un miembro de la familia B7 y es un ligando de PD-1. PD-L1 es una proteína transmembrana de tipo I con un total de 290 aminoácidos, incluyendo una región similar a la IgV, una región similar a la IgC, una región hidrófoba transmembrana y una región intracelular compuesta por 30 aminoácidos.
A diferencia de otras moléculas de la familia B7, PD-L1 tiene un efecto de regulación negativa sobre la respuesta inmunitaria. El estudio descubrió que PD-L1 se expresa principalmente en las células T activadas, las células B, los macrófagos, las células dendríticas y similares. Además de en los linfocitos, PD-L1 también se expresa en las células endoteliales de otros tejidos, como el timo, el corazón y la placenta, así como en el sistema no linfoide, como el melanoma, el cáncer de hígado, el cáncer gástrico, el carcinoma de células renales, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de cabeza y cuello, etc. PD-L1 tiene un amplio efecto en la regulación de las células T y B autorreactivas y en la tolerancia inmunológica, y desempeña un papel en las respuestas de las células T y B periféricas. La alta expresión de PD-L1 en las células tumorales se correlaciona con el mal pronóstico de los pacientes con cáncer.
El factor de muerte programada-1 (PD-1), que se une a PD-L1 y también se conoce como CD279, es un miembro de la familia CD28. Contiene dos residuos de tirosina en la región citoplasmática. Un residuo cerca del N-terminal está localizado en el motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM), y el otro cerca del C-terminal está localizado en el motivo interruptor basado en tirosina inmunorreceptora (ITSM). La PD-1 se expresa principalmente en la superficie de los linfocitos T activados, los linfocitos B y los macrófagos. Normalmente, PD-1 puede inhibir la función de los linfocitos T, promover la función de Treg, inhibiendo así la respuesta autoinmune y previniendo la aparición de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, en el desarrollo de los tumores, la unión de PD-L1 expresada por las células tumorales y PD-1 puede promover el escape inmunológico de los tumores a través del efecto inhibidor de los linfocitos. La unión de PD-L1 a PD-1 puede conducir a una variedad de cambios biológicos, causando la regulación inmunológica, como la inhibición de la proliferación y activación de los linfocitos, la inhibición de la diferenciación de las células T CD4+ en células Th1 y Th17, y la inhibición de la liberación de citoquinas inflamatorias, etc.
El éxito de la aplicación de los anticuerpos monoclonales en la detección del cáncer y en la terapia biológica ha llevado a una revolución en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, el peso molecular del anticuerpo monoclonal convencional (150 kD) es demasiado grande para permitir que el anticuerpo penetre en el tejido, lo que da lugar a una menor concentración efectiva en la región del tumor y a un efecto terapéutico insuficiente. La inmunogenicidad de los anticuerpos tradicionales es elevada, mientras que el anticuerpo modificado apenas puede alcanzar la afinidad intrínseca. Además, una serie de hechos, como el largo ciclo de desarrollo, los altos costes de producción y la falta de estabilidad de los anticuerpos tradicionales totalmente humanizados, limitan su aplicación y popularidad en la práctica clínica.
Los nanocuerpos son las moléculas de anticuerpos más pequeñas hasta ahora, y su peso molecular es 1/10 del de los anticuerpos ordinarios. Además de la reactividad antigénica de los anticuerpos monoclonales, los nanocuerpos también poseen propiedades funcionales únicas, como bajo peso molecular, alta estabilidad, buena solubilidad, fácil expresión, débil inmunogenicidad, fuerte penetración y fuerte focalización, humanización sencilla y bajo coste de preparación, etc. Supera casi perfectamente las deficiencias de los anticuerpos tradicionales, como el largo ciclo de desarrollo, la baja estabilidad, las estrictas condiciones de almacenamiento, etc.
WO 2016/007235 A1 ha divulgado anticuerpos anti-PD-Ll y usos diagnósticos de los mismos, en particular, WO 2016/007235 A1 proporciona anticuerpos contra el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y procedimientos de uso de los mismos.
WO 2016/111645 A1 ha divulgado anticuerpos anti-PD-Ll, en particular, se divulgan anticuerpos anti-PD-Ll. También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos, y procedimientos de uso de dichos anticuerpos para restaurar la función de las células T en las células T que muestran agotamiento de las células T o anergia de las células T, además, se trata de anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, que se unen a PD-L1. También se divulgan polipéptidos de cadena pesada y ligera. Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígenos y los polipéptidos pueden proporcionarse en forma aislada y/o purificada y pueden formularse en composiciones adecuadas para su uso en investigación, terapia y diagnóstico.
Muyldermans, S. (2013) Annu. Rev. Biochem. 82, 775-797 ha dado a conocer los nanocuerpos: anticuerpos de dominio único y ha destacado las ventajas de los nanocuerpos, entre ellas sus beneficiosas propiedades bioquímicas y económicas; la afinidad de tamaño, la especificidad, la estabilidad y los costes de producción.
Sin embargo, todavía no hay nanocuerpos satisfactorios contra PD-L1 en el campo. Por lo tanto, es una necesidad urgente en el arte desarrollar nuevos nanocuerpos específicos que sean efectivos contra PD-L1.
Sumario
El objeto de la presente invención es proporcionar una clase de nanocuerpos específicos que sean eficaces contra PD-L1. La invención se define en las reivindicaciones.
En el primer aspecto de la presente invención, se proporciona una cadena VHH de nanocuerpos anti-PD-Ll, que comprende una región determinante complementaria (CDR) de la cadena VHH que consiste en la CDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO. : 5, CDR2 como se establece en la SEQ ID NO: 6 y CDR3 según la SEQ ID NO: 7.
Dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están separadas por las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena VHH, y el nanocuerpo anti-PD-Ll puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
El segundo aspecto de la presente invención proporciona una cadena VHH de nanocuerpos anti-PD-Ll, dicha cadena VHH comprende una región marco (FR) y la región determinante complementaria (CDR) del primer aspecto, y dicha región marco
(a) que consiste en FR1 como se establece en la SEQ ID NO. :1, FR2 como se establece en la SEQ ID NO. : 2, f R3 como se establece en la SEQ ID NO. : 3, y FR4 como se establece en la SEQ ID NO. : 4; o
(b) que consiste en FR1 como se establece en la SEQ ID NO. :10, FR2 como se establece en la SEQ ID NO: 11, FR3 como se establece en la SEQ ID NO: 12, y FR4 como se establece en la SEQ ID NO. : 13, y el nanocuerpo anti-PD-Ll puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
En otra realización preferida, la cadena VHH de dichos nanocuerpos anti-PD-Ll es la establecida por la SEQ ID NO: 8 o 14.
El tercer aspecto de la presente invención proporciona un nanocuerpo anti-PD-Ll, que es un nanocuerpo anti-PD-Ll contra el epítopo PD-L1, y tiene una cadena VHH como se establece en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. : 8 o SEQ ID NO: 14, y el nanocuerpo anti-PD-Ll puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
El cuarto aspecto de la presente invención proporciona un polinucleótido, y dicho polinucleótido codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el primer aspecto de la presente invención, la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, y los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida, dicho polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. : 9 o 15.
En otra realización preferida, dicho polinucleótido incluye ADN o ARN.
El quinto aspecto de la presente invención proporciona un vector de expresión, dicho vector de expresión comprende el polinucleótido según el cuarto aspecto de la presente invención.
El sexto aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped, y dicha célula huésped comprende el vector de expresión según el quinto aspecto de la presente invención, o el polinucleótido según el cuarto aspecto de la presente invención está integrado dentro del genoma de la célula huésped.
En otra realización preferida, dicha célula huésped incluye procariocitos o eucariocitos.
En otra realización preferida, dicha célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli. y células de levadura.
El séptimo aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para producir nanocuerpos anti-PD-Ll que comprende los pasos de:
(a) cultivar dicha célula huésped según el sexto aspecto de la presente invención en condiciones adecuadas para producir nanocuerpos, obteniendo así un cultivo que contenga dichos nanocuerpos anti-PD-Ll; y
(b) aislar o recuperar dichos nanocuerpos anti-PD-Ll de dicho cultivo.
En otra realización preferida, dicho nanocuerpo anti-PD-Ll tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. : 8 o 14.
El octavo aspecto de la presente invención proporciona un inmunoconjugado, y dicho inmunoconjugado comprende: (a) la cadena VHH de dichos nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, o dichos nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención; y
(b) una parte de conjugación seleccionada del grupo formado por un marcador detectable, un fármaco, una toxina, una citoquina, un radionúclido y una enzima.
En otra realización preferida, dicha parte conjugadora es un fármaco o una toxina.
En otra realización preferida, dicha parte conjugadora es un marcador detectable.
En otra realización preferida, dicho conjugado se selecciona del grupo que consiste en marcadores fluorescentes o luminiscentes, radiomarcadores, agentes de contraste MRI (generación de imágenes por resonancia magnética) o CT (tomografía computarizada), o enzimas, radionúclidos, biotoxinas, citoquinas (por ejemplo, IL-2, etc.), anticuerpos, fragmentos Fc de anticuerpos, fragmentos scFv de anticuerpos, nanopartículas/nanorods de oro, partículas virales, liposomas, partículas nanomagnéticas, enzimas activadoras de profármacos (por ejemplo, DT-diaforasa (DTD) o proteína similar a la bifenil hidrolasa (BPHL), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino) o cualquier forma de nanopartículas, etc., que produzcan productos detectables.
En otra realización preferida, dicho inmunoconjugado contiene cadenas VHH multivalentes (como bivalentes) de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, o los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida, dicho multivalente se refiere a que la secuencia de aminoácidos del inmunoconjugado contiene varias cadenas VHH repetidas de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, o los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención.
El noveno aspecto de la invención proporciona nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención para su uso como (a) un agente para detectar la molécula PD-L1; o (b) un medicamento para tratar cánceres. En otra realización preferida, dicha detección comprende la detección realizada por citometría de flujo o inmunofluorescencia celular.
El décimo aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:
(i) la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el primer aspecto de la presente invención, la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención, o el inmunoconjugado según el octavo aspecto de la presente invención; y
(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra realización preferida, dicha composición farmacéutica está en forma de inyección.
En otra realización preferida, dicha composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de cánceres, y dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de hígado, leucemia, tumor renal, cáncer de pulmón, cáncer de intestino delgado, cáncer de hueso, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer cervical, linfoma, tumor suprarrenal y tumor de vejiga.
El undécimo aspecto de la presente divulgación proporciona uno o más usos de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención:
(i) para detectar la molécula PD-L1 humana;
(ii) para el ensayo de citometría de flujo;
(iii) para la detección por inmunofluorescencia celular;
(iv) para el tratamiento del cáncer;
(v) para diagnosticar el cáncer.
En otra realización preferida, dicho uso es no diagnóstico y no terapéutico.
El duodécimo aspecto de la presente divulgación proporciona una proteína recombinante, y dicha proteína recombinante tiene:
(i) la secuencia de la región variable de la cadena pesada VHH según el segundo aspecto de la presente invención o la secuencia de los nanocuerpos según el tercer aspecto de la presente invención; y
(ii) una secuencia de etiqueta opcional que ayude a la expresión y/o purificación.
En otra realización preferida, dicha secuencia de etiquetas incluye la etiqueta 6His o la etiqueta HA.
En otra realización preferida, dicha proteína recombinante se une específicamente a la proteína PD-L1.
El decimotercer aspecto de la presente invención proporciona un uso de la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención, o el inmunoconjugado según el octavo aspecto de la presente invención para preparar un agente, placa de detección o kit;
en el que dicho agente, placa de detección o kit se utiliza para detectar la proteína PD-L1 en la muestra de ensayo. Además, se divulga un uso de la cadena VHH de los nanocuerpos anti-PD-Ll según el segundo aspecto de la presente invención, los nanocuerpos anti-PD-Ll según el tercer aspecto de la presente invención, o el inmunoconjugado según el octavo aspecto de la presente invención para preparar un medicamento,
en el que dicho medicamento se utiliza para tratar o prevenir los cánceres que expresan PD-L1 (es decir, PD-L1 positivo).
En otra realización preferida, dicho cáncer comprende l cáncer gástrico, linfoma, cáncer de hígado, leucemia, tumor renal, cáncer de pulmón, cáncer del intestino delgado, cáncer de hueso, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata o tumores suprarrenales.
El decimocuarto aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar la proteína PD-L1 en una muestra, y dicho procedimiento comprende las etapas de:
(1) Poner en contacto la muestra con los nanocuerpos según el tercer aspecto de la presente divulgación;
(2) detectar el complejo antígeno - anticuerpo, donde el complejo detectado indica la presencia de la proteína PD-L1.
El decimoquinto aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad, dicho procedimiento comprende administrar los nanocuerpos según el tercer aspecto de la presente invención o el inmunoconjugado según el octavo aspecto de la presente invención a un sujeto necesitado.
En otra realización preferida, dicho sujeto incluye a los mamíferos, como los humanos.
El decimosexto aspecto de la presente divulgación proporciona una región de marco (FR) de una cadena VHH de un nanocuerpo anti- PD-L1, y dicha región de marco (FR) de la cadena VHH está compuesta por FR1 como se establece en la SEQ ID NO. : 1, FR2 como se establece en la SEQ ID NO. : 2, FR3 como se establece en la SEQ ID NO. : 3, y FR4 como se establece en la SEQ ID NO. : 4.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el resultado de SDS-PAGE de la proteína antigénica purificada y del nanocuerpo, en el que A es la molécula de ácido nucleico de referencia, B es la proteína hPD-L1 (ECD) -Fc purificada, y C es la proteína hPD-L1 (ECD) -Fc purificada después de que la proteína de la etiqueta Fc sea eliminada por la enzima TEV, D es la proteína PD-L1 Nb-Fc purificada, y E es la proteína PD-1-Fc biotinilada. Todas las proteínas mencionadas se expresaron en células HEK293F.
La figura 2 muestra el resultado de la detección de la capacidad de la biblioteca construida. La biblioteca construida se recubrió en una placa después de ser diluida en serie. La figura muestra 1/5 de los clones con dilución en gradiente de 104 veces,105 veces y 106 veces, y se contó el número de clones para determinar el tamaño de la biblioteca.
La figura 3 es un resultado de detección de la tasa de inserción de la biblioteca de nanocuerpos construida. Las bandas de ADN en los poros del gel, de izquierda a derecha, corresponden respectivamente a la molécula de ADN marcadora en el primer carril, y a los productos de PCR del fragmento de inserción detectado en los demás carriles. El carril del producto de la PCR es de aproximadamente 500 pb. La tasa de inserción detectada llega al 95,8 %.
La figura 4 muestra el proceso de cribado y enriquecimiento de los nanocuerpos de PD-L1. No hay enriquecimiento después de la primera ronda de criba. Está 4 veces enriquecido después de la segunda ronda de criba y 210 veces enriquecido después de la tercera ronda de criba.
La figura 5 es la ilustración de los nanocuerpos de PD-L1 purificados (correspondientes al nanocuerpo del aminoácido de la SEQ ID NO. : 8) expresado por E. coli. Se trata de un electroforetograma SDS-PAGe del nanocuerpo PD-L1 tras la purificación por cromatografía de afinidad en gel de resina mediante columna de níquel. Los resultados resultaron que la pureza de PD-L1 alcanza más del 90 % después de la purificación.
La figura 6 muestra los efectos de bloqueo de los nanocuerpos de PD-L1 probados por FACS. Se lleva a cabo mediante la co-reacción de células HEK293F que expresan instantáneamente la proteína humana PD-L1 de longitud completa, varios grupos de nanocuerpos y la proteína hPD-1-Fc biotinilada.
La figura 7 ilustra los nanocuerpos de PD-L1 humanizados por expresión eucariótica tras su purificación. Cuatro tipos de nanocuerpos de PD-L1 humanizados son expresados por células HEK293F, donde A es la molécula de proteína como estándar, B es la proteína PD-L1 Nb humanizada codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. : 10. El nanocuerpo expresado tiene una proteína con etiqueta Fc y la pureza de la proteína alcanza más del 90 %.
La figura 8 muestra los efectos de bloqueo de los nanocuerpos de PD-L1 humanizados probados por FACS. Se lleva a cabo mediante la co-reacción de células EBC-1 que expresan naturalmente la proteína PD-L1, nanocuerpos humanizados y proteína hPD-1-Fc biotinilada. Muestra que la tasa de unión de la PD-1-Fcbiotina y las células EBC-1 en el grupo en blanco y el grupo de control negativo es superior al 90 %, mientras que después de añadir los nanocuerpos de PD-L1 y los nanocuerpos humanizados, la tasa de unión de la PD-1-Fc-biotina y las células EBC-1 es sólo inferior al 10 %. Esto demuestra que la interacción entre PD-1 y PD-L1 puede ser bloqueada significativamente por los nanocuerpos añadidos.
La figura 9 muestra los resultados de las pruebas de afinidad de los nanocuerpos de PD-L1. La afinidad de los nanocuerpos de PD-L1 se comprueba con BiaCore T200. Muestra que la afinidad antes de la humanización es de 2,34 * 10'9 M y la afinidad después de la humanización es de 2,26 * 10'9 M. La humanización no afecta a la afinidad de los nanocuerpos.
La figura 10 muestra los resultados de especificidad de los nanocuerpos de PD-L1 probados por ELISA. Se pudo observar que los nanocuerpos de PD-L1 antes y después de la humanización sólo interactúan con el PD-L1 humano y de Cercopithecidae en lugar de Muroidea u otro miembro de la familia PD-L1. Ambas cepas de nanoanticuerpos tienen una buena especificidad.
La figura 11 muestra los efectos de inhibición de los nanocuerpos en la interacción entre PD-1 y PD-L1 por el procedimiento MOA, en el que los nanocuerpos antes de la humanización tienen una actividad más fuerte que la de los anticuerpos en el grupo de control positivo, mientras que los nanocuerpos después de la humanización tienen una actividad comparable a la de los anticuerpos en el grupo de control positivo.
La figura 12 muestra que los nanocuerpos y los nanocuerpos humanizados pueden activar eficazmente las células T y tienen un efecto de activación comparable al de los anticuerpos del grupo de control positivo.
La figura 13 muestra la forma de administración de los nanocuerpos de la invención en el estudio de la actividad de inhibición tumoral.
La figura 14 muestra que el volumen del tumor se inhibe mejor que en el grupo de control en los ratones inoculados con Nb-Fc humanizado, y no se observa un aumento significativo (del tamaño del tumor), lo que sugiere que el Nb-Fc humanizado tiene un efecto inhibidor del tumor significativo.
La figura 15 muestra que el Nb-Fc humanizado de la invención tiene una mejor solubilidad que la del anticuerpo de control.
La figura 16 muestra que no hay cambios significativos en la pureza del Nb-Fc humanizado.
La Figura 17 muestra que no hay un cambio significativo de unión entre el Nb-Fc humanizado y las células CHO-PDL1.
Descripción detallada
Tras extensos e intensos estudios, los inventores han obtenido con éxito una clase de nanocuerpos anti-PD-Ll tras numerosos cribados. Los resultados experimentales muestran que los nanocuerpos anti-PD-Ll de la invención pueden bloquear eficazmente la interacción entre PD-L1 y PD-1. Sorprendentemente, los nanocuerpos humanizados anti-PD-Ll de la invención pueden bloquear aún más eficazmente la unión entre PD-L1 y PD-1. El análisis de BiaCore T200 muestra que los nanocuerpos humanizados anti-PD-Ll tienen una alta afinidad, una estabilidad superior y un efecto inhibidor tumoral significativo. A partir de este descubrimiento, se completa la invención.
En particular, se utilizó la proteína PD-L1 humana como antígeno para inmunizar a un camello, obteniendo así una biblioteca genética de nanocuerpos de alta calidad. Las moléculas de la proteína PD-L1 se conjugaron en una placa ESLIA y mostraron una estructura espacial correcta de la proteína PD-L1. Los antígenos en dicha configuración se utilizaron para cribar la biblioteca de genes de los nanocuerpos mediante la tecnología de exposición de fagos (exposición de fagos de una biblioteca de genes de anticuerpos de cadena pesada de camello) obteniendo así genes de nanocuerpos con especificidad PD-L1. A continuación, los genes se transfirieron a E . col i , obteniendo así los tintes que pueden expresarse eficazmente en E. coli con alta especificidad.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "nanocuerpos de la invención", "nanocuerpos anti-PD-LI de la invención" y "nanocuerpos de PD-L1 de la presente invención" son intercambiables y se refieren a nanocuerpos que reconocen y se unen específicamente a PD-L1 (incluido PD-L1 humano). El nanocuerpo más preferible es el que comprende una cadena VHH de secuencia de aminoácidos como la establecida por la SEQ ID NO. :8 o 14.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" es una proteína glicosaminoglicana heterotetramérica de aproximadamente 150.000 Dalton con las mismas características estructurales, formada por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a la cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, y el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de las diferentes isoformas de inmunoglobulina es diferente. Cada cadena pesada y ligera también tiene enlaces disulfuro intracadena que están regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene una región variable (VH) en un extremo seguida de una pluralidad de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene una región variable (VL) en un extremo y una región constante en el otro; la región constante de la cadena ligera es opuesta a la primera región constante de la cadena pesada, y la región variable de la cadena ligera es opuesta a la región variable de la cadena pesada. Unos residuos de aminoácidos especiales forman una interfaz entre las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas.
Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "anticuerpo de dominio único (VHH)" y "nanocuerpos" tienen el mismo significado refiriéndose a una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo, y construyen un anticuerpo de dominio único (VHH) que consiste en una sola región variable de cadena pesada. Es el fragmento de unión a antígeno más pequeño con función completa. Generalmente, los anticuerpos con una deficiencia natural de la cadena ligera y de la región constante de la cadena pesada 1 (CHI) se obtienen primero, las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo se clonan entonces para construir un anticuerpo de dominio único (VHH) que consiste en una sola región variable de la cadena pesada.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variable" se refiere a que ciertas porciones de la región variable en los nanocuerpos varían en secuencias, lo que forma la unión y la especificidad de varios anticuerpos específicos a su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida de manera uniforme en la región variable de los nanocuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables en las regiones variables de la cadena ligera y pesada. La parte más conservada de la región variable se denomina región marco (FR). Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales contienen cada una cuatro regiones FR, que están sustancialmente en una configuración p-plegada, unidas por tres CDR que forman un bucle de enlace, y en algunos casos pueden formar una estructura parcialmente p-plegada. Las CDRs de cada cadena están estrechamente adyacentes a las otras por las regiones FR y forman un sitio de unión al antígeno del nanocuerpo con las CDRs de la otra cadena (véase Kabat et al., NIH Publ. N° 91-3242, Volumen I, páginas 647-669. (1991)). Las regiones constantes no están directamente implicadas en la unión del nanocuerpo al antígeno, pero presentan diferentes efectos o funciones, por ejemplo, participan en la citotoxicidad dependiente de los anticuerpos.
Como es sabido por los expertos en la técnica, los inmunoconjugados y los productos de expresión de la fusión incluyen: conjugados formados por la unión de fármacos, toxinas, citoquinas, radionúclidos, enzimas y otras moléculas de diagnóstico o terapéuticas a los nanocuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención. La divulgación también incluye un marcador de la superficie celular o un antígeno que se une a dicho nanocuerpo de proteína anti-PD-Ll o al fragmento del mismo.
Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "región variable de la cadena pesada" y "Vh " pueden utilizarse indistintamente.
Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "región variable" y "región determinante complementaria (CDR)" pueden utilizarse indistintamente.
La región variable de la cadena pesada de dicho nanocuerpo comprende 3 regiones determinantes complementarias: CDR1, CDR2 y CDR3.
En otra realización preferida, la cadena pesada de dicho nanocuerpo comprende la mencionada región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada.
Según la presente invención, los términos "nanocuerpo de la invención", "proteína de la invención" y "polipéptido de la invención" se utilizan indistintamente y todos ellos se refieren a un polipéptido, como una proteína o polipéptido que tiene una región variable de cadena pesada, que se une específicamente a la proteína PD-L1. Pueden contener o no una metionina de partida.
La invención también proporciona otras proteínas o productos de expresión de fusión que tienen los nanocuerpos de la invención. Específicamente, la presente invención incluye cualquier proteína o conjugado proteico y producto de expresión de la fusión (es decir, inmunoconjugado y producto de expresión de la fusión) que tenga una cadena pesada que contenga una región variable, siempre que la región variable sea idéntica o al menos un 90 % idéntica, preferentemente al menos un 95 % idéntica a la cadena pesada del nanocuerpo de la presente invención.
En general, las propiedades de unión al antígeno de un nanocuerpo pueden describirse mediante tres regiones específicas situadas en la región variable de la cadena pesada, denominadas regiones variables (CDR), y el segmento se divide en cuatro regiones marco (FR). Las secuencias de aminoácidos de cuatro FR son relativamente conservadoras y no participan directamente en las reacciones de unión. Estas CDRs forman una estructura de bucle en la que las láminas p formadas por laas FR entre ellos están espacialmente cerca aproximadamente de otros, y las CDR en la cadena pesada y las CDR en la cadena ligera correspondiente constituyen el sitio de unión al antígeno del nanocuerpo. Las secuencias de aminoácidos del mismo tipo de nanocuerpos pueden compararse para determinar qué aminoácidos constituyen las regiones FR o CDR.
Las regiones variables de las cadenas pesadas de los nanocuerpos de la invención adquieren un interés particular porque al menos una parte de ellas está implicada en la unión de antígenos. Por lo tanto, la presente divulgación incluye aquellas moléculas que tienen una región variable de cadena pesada de nanocuerpo con una CDR, siempre que sus CDR sean idénticas en un 90 % o más (preferentemente en un 95 % o más, y lo más preferible en un 98 % o más) a las CDR identificadas en el presente documento.
La presente invención incluye no sólo nanocuerpos intactos sino también fragmentos de nanocuerpos inmunológicamente activos o proteínas de fusión formadas a partir de nanocuerpos con otras secuencias. Por lo tanto, la presente invención también incluye fragmentos, derivados y análogos de los nanocuerpos.
Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" se refieren a un polipéptido que conserva sustancialmente la misma función o actividad biológica de un nanocuerpo de la invención. Los fragmentos polipeptídicos, derivados o análogos de la invención pueden ser (i) polipéptidos que tengan uno o más residuos de aminoácidos conservadores o no conservadores (preferentemente residuos de aminoácidos no conservadores) sustituidos. Dichos residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no estar codificados por el código genético; o (ii) un polipéptido que tiene un grupo sustituyente en uno o más residuos de aminoácidos; o (iii) un polipéptido formado por la fusión de un polipéptido maduro y otro compuesto (como un compuesto que aumenta la vida media del polipéptido, por ejemplo, polietilenglicol); o (iv) un polipéptido formado por la fusión de una secuencia de aminoácidos adicional a la secuencia del polipéptido (por ejemplo, una secuencia líder o secretora o una secuencia utilizada para purificar este polipéptido o una secuencia proproteica, o una proteína de fusión formada con una etiqueta 6 His). De acuerdo con las enseñanzas del presente documento, estos fragmentos, derivados y análogos están dentro del ámbito de una persona con conocimientos normales en la materia.
El nanocuerpo de la presente invención se refiere a un polipéptido que incluye las regiones CDR anteriores y que tiene actividad de unión a la proteína PD-L1. El término también abarca formas variantes de polipéptidos que comprenden las regiones CDR mencionadas y que tienen la misma función que los nanocuerpos de la invención. Estas variaciones incluyen, pero no se limitan a, deleciones, inserciones y/o sustituciones de uno o varios (generalmente 1-50, preferentemente 1-30, más preferentemente 1-20, óptimamente 1-10) aminoácidos, y adición de uno o varios (generalmente menos de 20, preferentemente menos de 10, y más preferentemente menos de 5) aminoácidos en el C-terminal y/o N-terminal. Por ejemplo, en la técnica, la sustitución de aminoácidos con propiedades análogas o similares no suele alterar la función de la proteína. Por otro lado, la adición de uno o varios aminoácidos en el C-terminal y/o N-terminal no suele cambiar la función de la proteína. El término también incluye fragmentos activos y derivados activos de los nanocuerpos de la invención.
Las formas variantes del polipéptido incluyen: secuencias homólogas, variantes conservadoras, variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos, proteínas codificadas por ADN capaz de hibridar con el ADN que codifica el nanocuerpo de la presente invención en condiciones de alta o baja exigencia, y polipéptidos o proteínas obtenidos utilizando antisuero contra los nanocuerpos de la invención.
La invención también proporciona otros polipéptidos, como una proteína de fusión que comprende nanocuerpos o fragmentos de los mismos. Además de los polipéptidos de longitud casi completa, la presente invención también incluye fragmentos de los nanocuerpos de la invención. Típicamente, el fragmento tiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos del nanocuerpo de la invención, preferentemente al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos, más preferentemente al menos aproximadamente 80 aminoácidos contiguos, y más preferentemente al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos.
En la presente invención, "una variante conservadora de un nanocuerpo de la presente invención" se refiere a los polipéptidos en los que hay hasta 10, preferentemente hasta 8, más preferentemente hasta 5, y más preferentemente hasta 3 aminoácidos sustituidos por aminoácidos que tienen propiedades análogas o similares, en comparación con la secuencia de aminoácidos del nanocuerpo de la presente invención. Estos polipéptidos variantes conservadores se producen preferentemente según las sustituciones de aminoácidos de la Tabla 1.
Tabla 1
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continuación
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La presente invención también proporciona una molécula polinucleotídica que codifica el nanocuerpo anterior o un fragmento o proteína de fusión del mismo. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en forma de ADN o ARN. Las formas de ADN incluyen el ADNc, el ADN genómico o el ADN sintético. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. El ADN puede ser una cadena codificante o una cadena no codificante.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos maduros de la invención incluyen: secuencias codificantes que sólo codifican el polipéptido maduro; secuencias codificantes para el polipéptido maduro y varias secuencias codificantes adicionales; secuencias codificantes (y secuencias codificantes adicionales opcionales) y secuencias no codificantes para el polipéptido maduro.
El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" puede incluir un polinucleótido que codifica el polipéptido, y también puede incluir un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales.
La invención también se refiere a polinucleótidos que hibridan con las secuencias descritas anteriormente y que tienen al menos un 50 %, preferentemente al menos un 70 %, y más preferentemente al menos un 80 % de identidad entre las dos secuencias. La presente invención se refiere específicamente a polinucleótidos que pueden hibridarse con los polinucleótidos de la presente invención en condiciones estrictas. En la presente invención, "condiciones estrictas" se refiere a: (1) hibridación y elución a menor fuerza iónica y mayor temperatura, como 0,2 x SSC, 0,1 % SDS, 60° C; o (2) desnaturalizantes adicionales durante la hibridación, como 50 % (v/v) de formamida, 0,1 % de suero bovino fetal / 0,1 % de Ficoll, 42° C, etc.; o (3) la hibridación se produce sólo cuando la identidad entre las dos secuencias es al menos superior al 90 %, preferentemente superior al 95 %. Además, los polipéptidos codificados por polinucleótidos hibridables tienen las mismas funciones y actividades biológicas que los polipéptidos maduros.
La secuencia de nucleótidos de longitud completa del nanocuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo puede obtenerse generalmente mediante un procedimiento de amplificación por PCR, un procedimiento de recombinación o un procedimiento de síntesis artificial. Un procedimiento posible es sintetizar secuencias relacionadas utilizando procedimientos sintéticos, especialmente cuando la longitud del fragmento es corta. En general, una secuencia larga de fragmentos puede obtenerse sintetizando primero una pluralidad de fragmentos pequeños y conectándolos después. Además, la secuencia codificadora de la cadena pesada y la etiqueta de expresión (por ejemplo, 6His) pueden fusionarse para formar una proteína de fusión.
Una vez obtenidas las secuencias en cuestión, éstas pueden obtenerse a gran escala mediante procedimientos recombinantes. Por lo general, las secuencias pueden obtenerse clonándolas en un vector, transfiriéndolas a las células y aislando después las secuencias de las células huésped proliferadas por procedimientos convencionales. Las biomoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) a las que se refiere la presente invención incluyen biomoléculas que existen en forma aislada.
En la actualidad, las secuencias de ADN que codifican la proteína de la presente invención (o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma) pueden obtenerse completamente por síntesis química. La secuencia de ADN puede entonces introducirse en diversas moléculas de a Dn existentes (o, por ejemplo, vectores) y en células conocidas en la técnica. Además, también se pueden introducir mutaciones en las secuencias proteicas de la invención mediante síntesis química.
La invención también se refiere a vectores que comprenden las secuencias de ADN adecuadas mencionadas anteriormente y promotores o secuencias de control adecuadas. Estos vectores pueden utilizarse para transformar una célula huésped adecuada de modo que pueda expresar la proteína.
La célula huésped puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana; o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura; o una célula eucariota superior, como una célula de mamífero. Algunos ejemplos representativos son: Escherichia coli, Streptomyces, células bacterianas como Salmonella typhimurium, células fúngicas como la levadura, células de insecto de Drosophila S2 o Sf9, células animales de CHO, COS7, 293 y similares.
La transformación de la célula huésped con el ADN recombinante puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando el huésped es un organismo procariota como E. coli, se pueden cosechar células competentes capaces de absorber ADN después de la fase de crecimiento exponencial y tratarlas con el procedimiento del CaCh. Los procedimientos utilizados son bien conocidos en la técnica. Otro procedimiento es utilizar MgCh. Si es necesario, la conversión también puede realizarse por electroporación. Cuando el huésped es eucariota, se pueden utilizar los siguientes procedimientos de transfección de ADN: coprecipitación de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales como la microinyección, la electroporación, el empaquetamiento en liposomas y otros similares.
Los transformantes obtenidos pueden cultivarse de manera convencional para expresar el polipéptido codificado por el gen de la presente invención. Dependiendo de las células huésped utilizadas, el medio utilizado en el cultivo puede seleccionarse entre varios medios convencionales. El cultivo se realiza en condiciones adecuadas para el crecimiento de las células huésped. Después de que las células huésped crezcan hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se induce mediante un procedimiento adecuado (como el cambio de temperatura o la inducción química) y las células se incuban durante un período de tiempo adicional.
El polipéptido recombinante en el procedimiento anterior puede ser expresado intracelularmente, o en la membrana celular, o secretado extracelularmente. Si es necesario, la proteína recombinante puede aislarse y purificarse mediante diversos procedimientos de separación utilizando sus características físicas, químicas y de otro tipo. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a: el tratamiento de renaturalización convencional, el tratamiento con un agente de precipitación de proteínas (procedimiento por saturación salina), la centrifugación, la disrupción osmótica, el supertratamiento, la ultracentrifugación, la cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), el análisis de la capa de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), y otras técnicas de cromatografía líquida y sus combinaciones.
Los nanocuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación o conjugados con un marcador detectable (con fines de diagnóstico), un agente terapéutico, una fracción de modificación de la PK (proteína quinasa) o una combinación de los mismos.
Los marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, pero no se limitan a: marcadores fluorescentes o luminiscentes, marcadores radiactivos, agentes de contraste de IRM (generación de imágenes por resonancia magnética) o TC (tomografía computarizada), o enzimas capaces de producir productos detectables.
Los agentes terapéuticos que pueden unirse o conjugarse a los nanocuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: 1. Radionúclidos 2. Venenos biológicos 3. Citoquinas como la IL-2, etc. 4. Nanopartículas/nanorods de oro; 5. Partículas de virus; 6. Liposoma; 7. Nanopartículas magnéticas; 8. Enzimas activadoras de fármacos (por ejemplo, DT-diaforasa (DTD) o proteína similar a la bifenil hidrolasa (BPHL)). 10. Agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino) o cualquier forma de nanopartículas, etc.
Composición farmacéutica
La invención también proporciona una composición. Dicha composición es una composición farmacéutica que comprende el nanocuerpo mencionado o el fragmento activo o la proteína de fusión del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. En general, estos materiales pueden formularse en medios portadores acuosos no tóxicos, inertes y farmacéuticamente aceptables en los que el pH es generalmente de aproximadamente 5-8, preferentemente de aproximadamente 6-8, aunque el pH puede variar según la naturaleza del material de formulación y la condición a tratar. Las composiciones farmacéuticas formuladas pueden administrarse por vías convencionales, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la administración intratumoral, intraperitoneal, intravenosa o tópica.
La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse directamente para unir moléculas de proteína PD-L1 y, por lo tanto, puede utilizarse para tratar tumores. Además, también se pueden utilizar otros agentes terapéuticos al mismo tiempo.
La composición farmacéutica de la presente invención contiene una cantidad segura y eficaz (por ejemplo, 0,001-99 wt %, preferentemente 0,01-90 wt %, y más preferentemente 0,1-80 wt %) de los nanocuerpos de la presente invención antes mencionados (o sus conjugados) y portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichos portadores incluyen, pero no se limitan a: solución salina, tampón, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación del fármaco debe ser adecuada para el modo de administración. La composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse en forma de inyección, por ejemplo, mediante un procedimiento convencional utilizando solución salina fisiológica o una solución acuosa que contenga glucosa y otro adyuvante. Las composiciones farmacéuticas, como las inyecciones y las soluciones, se elaboran preferentemente en condiciones asépticas. La cantidad de ingrediente activo administrada es una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal a aproximadamente 50 miligramos/kilogramo de peso corporal por día. Además, los polipéptidos de la invención también pueden utilizarse con otros agentes terapéuticos.
Cuando se utiliza una composición farmacéutica, se administra al mamífero una cantidad segura y eficaz del inmunoconjugado, en la que la cantidad segura y eficaz suele ser de al menos aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal, y en la mayoría de los casos, no más de aproximadamente 50 mg/kilogramo de peso corporal, preferentemente la dosis es de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo de peso corporal. Por supuesto, hay que tener en cuenta factores como la vía de administración y el estado de salud del paciente para definir las dosis específicas, todo ello dentro de las competencias de los médicos expertos.
Nanocuerpos con marcadores
En una realización preferida de la invención, los nanocuerpos llevan marcadores detectables. Más preferentemente, el marcador se selecciona del grupo que consiste en isótopos, marcadores de oro coloidal, marcadores de color y marcadores fluorescentes.
Los marcadores de oro coloidal pueden realizarse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En una realización preferida de la invención, los nanocuerpos anti-PD-Ll se marcan con oro coloidal para obtener nanocuerpos marcados con oro coloidal.
Los nanocuerpos anti-PD-Ll de la presente invención tienen muy buena especificidad y alta potencia.
Método de detección
La invención también se refiere a un procedimiento de detección de la proteína PD-L1. Los pasos del procedimiento son básicamente los siguientes: obtener una muestra de células y/o tejido; disolver la muestra en un medio; y detectar el nivel de la proteína PD-L1 en la muestra disuelta.
Según el procedimiento de detección de la presente invención, la muestra utilizada no está particularmente limitada, y un ejemplo representativo es una muestra que contiene células que está presente en una solución de preservación celular.
Kits
La presente divulgación también proporciona un kit que contiene un nanocuerpo (o un fragmento del mismo) o una placa de detección. En una realización preferida de la presente divulgación, el kit incluye además un contenedor, una instrucción, un tampón y similares.
La presente divulgación también proporciona un kit de detección para detectar el nivel de PD-L1, y dicho kit comprende nanocuerpos que reconocen la proteína PD-L1, un medio de lisis para disolver una muestra, un reactivo general y un tampón necesario para la detección, como varios tampón, marcadores de detección, sustratos de detección, etc. El kit de prueba puede ser un dispositivo de diagnóstico in vitro.
Aplicación
Como se ha descrito anteriormente, los nanocuerpos de la presente invención tienen un amplio valor de aplicación biológica y de aplicación clínica. Dichas aplicaciones abarcan diversos campos como el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el PD-L1, la investigación médica básica y la investigación biológica. Una de las aplicaciones preferidas es el diagnóstico clínico y el tratamiento dirigido de PD-L1.
Las principales ventajas de la presente invención son:
(a) los nanocuerpos de la invención son proteínas anti-PD-Ll con alta especificidad para humanos y una estructura espacial correcta;
(b) los nanocuerpos de la invención tienen una fuerte afinidad; y
(c) los nanocuerpos de la invención son fáciles de producir.
La presente invención se describe además en combinación con realizaciones específicas. Debe entenderse que estos ejemplos son sólo para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la misma. Los procedimientos experimentales que no especifican las condiciones concretas en los siguientes ejemplos se realizan generalmente según las condiciones convencionales, como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o según las condiciones recomendadas por el fabricante. Salvo que se indique lo contrario, los porcentajes y las partes son porcentajes en peso y partes en peso.
Ejemplo 1: Expresión y purificación de la proteína PD-L1 humana
(1) La secuencia de nucleótidos de PD-L1 humana se integró en pCDNA3. 1(-) (disponible comercialmente en Invitrogen) y la secuencia del dominio extracelular se subclonó en el vector pFUSE-IgG1 (disponible comercialmente en Invitrogen), en el que se introdujo un sitio de escisión TEV en el C-terminal de hPD-L1 (ECD) para facilitar la preparación de un hPD-L1 (ECD) con etiqueta Fc.
(2) Se utilizó un kit Omega plasmid maxi para extraer el plásmido pFMSE-IgG1-hPD-L1(ECD) construido.
(3) Las células HEK293F se cultivaron hasta una DO de 2,0*10® células/ML.
(4) El plásmido y el agente de transfección PEI se mezclaron bien (1:3) y se colocaron durante 20 minutos, y luego se añadió el producto en el cultivo de células HEK293F para su posterior incubación en un agitador bajo 6 % de CO2 a 37 °C durante 5-6 días.
(5) Se recogió el sobrenadante de las células y se sometió a la unión con perlas de proteína A a temperatura ambiente durante 1 hora.
(6) Después de lavar las perlas con PBS (pH 7,0), 0,1 M de Glicina (pH3. 0) para eluir las proteínas.
(7) Las proteínas eluidas se ultrafiltraron en PBS y se tomaron muestras para un ensayo de SDS-PAGE tras la medición del rendimiento (los resultados del ensayo se muestran en la Figura 1B). El resto de las proteínas se almacenaron en una nevera a -80 °C.
(8) La proteína hPD-L1(ECD)-Fc expresada se escindió utilizando 0,1 mg de enzima TEV por 1mg de proteína hPD-L1(ECD)-Fc a 4 ° C durante 16 horas. La solución de proteína se cargó en una columna de Ni y en una columna de Proteína A posteriormente y el flujo se recogió y se muestreó para una prueba de SDS-PAGE (los resultados de la prueba se muestran en la Figura 1C).
Ejemplo 2: La construcción de la biblioteca de nanocuerpos de PD-L1
(1) Se mezcló 1 mg de antígeno hPD-L1 (ECD)-Fc con adyuvante de Freund en volúmenes iguales para inmunizar a un camello bactriano de Xinjiang una vez a la semana durante un total de 7 veces para estimular a las células B para que expresen nanocuerpos específicos del antígeno;
(2) Tras completar las 7 inmunizaciones, se tomaron muestras de 100 ML de linfocitos de sangre periférica de camello y se extrajo el ARN total.
(3) Se sintetizó el ADNc y se amplificó el VHH mediante PCR anidada;
(4) Se digirieron 20 p g del vector de visualización de fagos pMECS (adquirido en Biovector) y 10 p g de VHH con las endonucleasas de restricción PstI y Notl y se ligaron los dos fragmentos;
(5) El producto ligado se transfectó electrónicamente en células TG1 competentes, y se construyó la biblioteca de nanocuerpos de PD-L1 y se determinó su capacidad. La capacidad era de 1,3*109 CFM (los resultados se muestran en la figura 2).
Al mismo tiempo, se eligieron 24 clones al azar para la detección de colonias por PCR. Los resultados mostraron que la tasa de inserción de la biblioteca construida era del 100 %. La figura 3 muestra los resultados de la PCR de la colonia.
Ejemplo 3: Cribado y verificación de nanocuerpos de PD-L1
Cribado de nanocuerpos
(1) Se acoplaron 10 |jg de antígenos hPD-L1 (ECD) disueltos en 100 mM de NaHCO3 (pH 8,2) a la placa ELISA de NUNC y se dejaron toda la noche a 4 °C;
(2) Al día siguiente se añadieron 100 j l de BSA al 0,1 % y se bloquearon a temperatura ambiente durante 2 h. (3) Después de 2 h, se añadieron 100 j l de fagos (2*1011 CFM de la biblioteca de genes de visualización de fagos con nanocuerpos de camello inmunizado) y reaccionaron a temperatura ambiente durante 1 h;
(4) Se utilizó PBS al 0,05 % Tween-20 para el lavado durante 5 veces para eliminar los fagos no específicos; (5) Los fagos unidos específicamente a PD-L1 se disociaron mediante trietanolamina 100 mM, y se infectaron células E. coli TG1 en fase logarítmica y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Los fagos se generaron y purificaron para la siguiente ronda de cribado. El proceso de selección se repitió durante 3 rondas. Los resultados del enriquecimiento se muestran en la figura 4.
Cribado de clones específicos positivos individuales mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) basado en fagos:
(1) De las placas de cultivo celular que contenían los bacteriófagos obtenidos mediante las 2-3 rondas de cribado anteriores, se recogieron 96 colonias individuales y se inocularon en medio TB que contenía 100 jg/M L de ampicilina (2,3 litros de KH2PO4 en 1 litro de medio TB. 12. 52 g de K2HPO4, 12 g de peptona, 24 g de extracto de levadura, 4 ML de glicerol). Después de que las células crecieran hasta la fase logarítmica, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se cultivó durante la noche a 28 °C.
(2) Los nanocuerpos crudos se obtuvieron por el procedimiento osmótico, y los nanocuerpos se transfirieron a una placa de ELISA recubierta de antígeno y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora.
(3) Los nanocuerpos no unidos se lavaron con PBST y nanocuerpos anti-HA de ratón (adquiridos en Beijing Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.). El producto se puso a temperatura ambiente durante 1 hora.
(4) Los nanocuerpos no unidos se lavaron con PBST, y se añadieron nanocuerpos marcados con fosfatasa alcalina de cabra antiratón. El producto se puso a temperatura ambiente durante 1 hora.
(5) Los nanocuerpos no unidos se lavaron con PBST y se añadió una solución de tinción con fosfatasa alcalina. La absorbencia se leyó a 405 nm en un instrumento ELISA.
(6) Cuando el valor de DO del pozo de la muestra era más de 3 veces el valor de DO del pozo de control (Ratio /->3), se confirma como un pozo de clonación positivo.
(7) Las bacterias de los pozos de clones positivos se agitaron en un líquido LB que contenía 100 jg/M L para la extracción de plásmidos y la secuenciación.
Ejemplo 4: Expresión de nanocuerpos en el huésped E.coli y purificación:
(1) Los plásmidos obtenidos a partir de los clones previamente secuenciados se electrotransformaron en E. coli WK6 y luego se recubrieron en LA+Glucosa (una placa de cultivo que contiene ampicilina y glucosa) para incubarlos durante toda la noche a 37 °C.
(2) Se recogió una sola colonia, se inoculó en 5 ML de medio de cultivo LB que contiene ampicilina y se cultivó en un agitador durante toda la noche a 37 °C;
(3) Se inoculó 1 ML de cepas cultivadas durante la noche en 330 ML de medio TB y se cultivó en un agitador a 37 °C hasta alcanzar un valor de DO de 0,6-1. Se añadió IPTG y el producto se cultivó en un agitador a 28 °C durante la noche.
(4) El producto se sometió a centrifugación y se recogieron las cepas.
(5) Utilizando el procedimiento de ósmosis para obtener el extracto crudo de nanocuerpo.
(6) Se prepararon nanocuerpos con una pureza superior al 90 % mediante cromatografía de afinidad con columna de iones de Ni. Los resultados de la purificación se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 5: Los efectos de bloqueo de los nanocuerpos probados por citometría de flujo
(1) Se prepararon proteínas hPD-1-Fc-Biotina (El procedimiento de preparación de hPD-1-Fc fue idéntico al del Ejemplo 1. Los resultados de la prueba SDS-PAGE se muestran en la Figura IE). La biotinilación de las proteínas se realizó según las instrucciones del reactivo de biotina.2*
(2) Se tomaron 1*106 células HEK293F que expresaban transitoriamente la proteína humana PD-L1 de longitud completa de cada muestra y se resuspendieron en tampón BSA-PBS al 0,5 %, y se añadieron 10 jg de los nanocuerpos PD-L1 purificados mencionados anteriormente. hIgG1 se estableció como control negativo y PBS fue para el grupo en blanco. Se añadieron 5 |jg de hPD-1-Fc-biotinas en todas las muestras para cada una y se sometieron a incubación a 4 °C durante 20 min.
(3) Las células se lavaron dos veces con PBS y se añadió SA-PE (adquirido en eBioscience). El producto se incubó a 4 °C durante 20 minutos. Se utilizó una citometría de flujo (BD FACS Calibur) para determinar las células después de haberlas lavado dos veces con PBS. Los resultados de la determinación se muestran en la figura 6.
Humanización de los nanocuerpos de PD-L1
(1) En primer lugar, la secuencia del nanocuerpo PD-L1 de la SEQ ID NO. : 8 se utilizó como plantilla para buscar estructuras homólogas en la base de datos estructurales. Se encontraron un total de 1306 estructuras, de las que se tomaron 34 (valor E = 0,0, e identidad de secuencia > 70 %); (2) Estas 34 estructuras se sometieron a comparación estructural. Basándose en la resolución de la estructura cristalina y en el árbol evolutivo construido, se seleccionaron finalmente 9 proteínas, incluida la 3dwt, para el modelado homológico multiplaca basado en la secuencia del nanocuerpo PD-L1 de la SEQ ID NO: 8. Finalmente, se obtuvieron 10 estructuras. Las estructuras con el molpdf más bajo se seleccionaron según la clasificación de la función de puntuación de arriba a abajo y se dejaron para el proceso posterior.
(3) Para las mejores estructuras obtenidas a partir del modelado, se utilizó como valor de corte la accesibilidad al disolvente de los residuos calculada por el servidor ProtSA (es decir, la relación de la superficie contactable con el disolvente de los residuos entre el estado de plegado y el de plegado). Los residuos con un valor superior al 40 % se tomaron como residuos expuestos al disolvente.
(4) Se realizó un alineamiento entre las mejores estructuras obtenidas del modelado y la secuencia DP-47 y se sustituyeron los residuos correspondientes expuestos al disolvente. Un nanocuerpo PD-L1 humanizado de la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 14 se determinó finalmente. Las secuencias de los nanocuerpos antes y después de la humanización se muestran en la Tabla 2:
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
La comparación de la identidad entre la región marco del nanocuerpo y la región marco del DP-47 antes y después de la humanización se muestra en la Tabla 3 a continuación:
Tabla 3
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 6: La actividad de los nanocuerpos anti-PD-Ll se determina mediante el procedimiento MOA
En este experimento, se tomaron dos nanocuerpos anti-PD-Ll disponibles en el mercado (Atezolizumab, ATE y Durvalumab, DUR) como nanocuerpos de control positivo, y las líneas celulares (Promega) se detectaron utilizando MOA. La activación de la señal NFAT se reflejó mediante la determinación del gen reportero fluorescente, detectando así los efectos inhibidores de los nanocuerpos (secuencia mostrada en el Ejemplo 5) sobre la unión de PD-1/PD-L1. Los pasos se mostraron de la siguiente manera:
(1) Las células CHOK1-PDL1 se sembraron un día antes del ensayo de actividad: CHOK1-PDL1 se pasó 1-2 días antes. El sobrenadante del cultivo se descartó y el resultante se lavó con PBS. Se añadieron cantidades apropiadas de tripsina para digerir a 37 °C/5 % de CO2 durante 3-5 minutos. Se añadió medio de cultivo a 4 veces el volumen de tripsina, y las células se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml y se sometieron al recuento de células. Las células con el volumen requerido se centrifugaron durante 10 minutos a 230 g. Se añadió el medio y se resuspendieron las células hasta alcanzar 4 x105 células/ML. Las células se añadieron a una placa blanca de cultivo celular de 96 pocillos a 100 pl/pocillo. Se añadió PBS a los pocillos laterales a 200 pl/pocillo. Las células se incubaron en un incubador a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche.
(2) Tratamiento de células Jurkat-PDl: Las células se pasaron dos días antes del ensayo de actividad. Tras el recuento, las células del volumen requerido se centrifugaron durante 5 minutos a 170 g. Las células se resuspendieron entampón de ensayo hasta alcanzar 1,25 x106 células/ml.
(3) Se añadieron las muestras y las células Jurkat-PDl a la placa de ensayo: se descartó el sobrenadante de las células CHOK1-PDL1 (95 pl/pocillo). Se añadieron 40 pl de muestra (nanocuerpos purificados obtenidos a partir de sobrenadante de hibridoma o sobrenadante de hibridoma diluido en serie), controles positivos y controles negativos. Se añadieron 40 pl de células Jurkat-PDl y el resultado se incubó en un incubador a 37 °C/5 % de CO2 durante 6 horas.
(4) Ensayo: El tampón Bio-GloTM se descongeló previamente y se añadió el sustrato Bio-GloTM y se mezcló bien. Tras 6 horas, se añadió el reactivo Bio-GloTM a 80 pl/pocillo y se colocó a temperatura ambiente durante 5-10 minutos para su lectura.
Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 4 y en la Figura 11. Bajo diversas concentraciones, los nanocuerpos de la presente invención antes de la humanización fueron generalmente más activos que el control positivo, y la actividad de los nanocuerpos de la invención después de la humanización fue comparable a la del control positivo. Por lo tanto, tanto los nanocuerpos Nb-Fc como los Nb-Fc humanizados pueden bloquear eficazmente las interacciones PD1/PD-L1.
Tabla 4
Concentración (nm) Nb-Fc nb-Fc humanizado ATE DUR igG1 Célula 100.000 89222 89341 94006 94061 15659.5 23860
33.333 95361 92060 97992 102218
11.111 95122 92012 96453 97936
3.704 97307 74598 96932 102944
1.235 96119 68937 70803 89708
0.412 95249 43734 29286 53071
0.137 85291 23035 19240 23210
0.046 60302 19080 17246 20308
0.015 36885 19016 18355 17757
0.005 26336 17079 16927 18243
Ejemplo 7: Expresión de nanocuerpos de PD-L1 humanizados en eucariocitos HEK293 y purificación
(1) Las secuencias de PD-L1 Nb antes y después de la humanización se sintetizaron en el vector pFUSE-IgG1 (comprado a Invivogen), y el plásmido pFUSE-IgG1-Nb (humanizado) se extrajo utilizando el kit Omega plasmid maxi.
(2) Las células HEK293F se cultivaron hasta una DO de 2,0*10® células/ML;
(3) El plásmido y el reactivo de transfección PEI (1:3) se mezclaron y se dejaron reposar durante 20 minutos, luego se añadieron a las células HEK293F, y se cultivaron en un agitador con 6 % de CO2 a 37° C durante 5-6 días;
(4) Se recogieron los sobrenadantes celulares y se sometieron a la unión con perlas de proteína A a temperatura ambiente durante 1 hora;
(5) Después de lavar las perlas con tampón fosfato (pH 7,0), las proteínas se eluyeron con Glicina 0,1M pH 3,0; (6) Las proteínas eluidas se ultrafiltraron en PBS y se midió el rendimiento. A continuación, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE (los resultados se muestran en la Figura 1D y la Figura 7). Las proteínas restantes se almacenaron en un refrigerador a -80° C. Se puede observar en la Figura 7 que la pureza de los nanocuerpos humanizados alcanza más del 90 %.
Ejemplo 8: Efectos de bloqueo de los nanocuerpos humanizados de PD-L1 determinados por citometría de flujo
El procedimiento es idéntico al del Ejemplo 5:
(1) Se resuspendieron 2*105 líneas celulares de cáncer de pulmón humano (EBC-1) que expresaban naturalmente PD-L1 en cada muestra en tampón BSA-PBS al 0,5 % y se añadieron 10 pg de nanocuerpos PD-L1 humanizados purificados. hIgGI se estableció como grupo de control negativo y PBS como grupo en blanco. Se añadieron 5pg de hPD-1-Fc-biotina en cada muestra, y los productos se incubaron a 4 ° C durante 20min; (2) Las células se lavaron con PBS dos veces, y se añadió SA-PE de eBioscience. Las resultantes se incubaron durante 20 minutos a 4° C, y las células se lavaron con PBS dos veces y se cargaron para las pruebas. Los resultados se muestran en la Figura 8: se pudo observar que en el blanco y en el control negativo, la tasa de unión de la PD-1-Fc-biotina a las células EBC-1 fue superior al 90 %. Mientras que tras la adición de nanocuerpos de PD-L1 y nanocuerpos humanizados, la tasa de unión de PD-1-Fc-biotina a las células EBC-1 fue inferior al 10 %. Esto indica que los nanocuerpos añadidos pueden bloquear significativamente la interacción de PD-1 con PD-L1.
Ejemplo 9: Determinación de la afinidad de los nanocuerpos
Para la detección se utilizó el BiaCore T200.
(1) Inmovilización: Los antígenos de fase inmóvil se inmovilizaron en la superficie de un chip sensor CM-5 mediante una reacción carboxi-amino;
(2) Unión: Los nanocuerpos se diluyeron con tampón HBS hasta una concentración adecuada (cinco gradientes de concentración) para observar el proceso de unión antígeno-nanocuerpo;
(3) Regeneración de chips: Cuando se realizó la siguiente medición de nano cuerpos, se utilizó 10 mM de Glicina para la regeneración.
(4) Análisis de los resultados experimentales. Los resultados del ensayo se muestran en la figura 9. La afinidad de los nanocuerpos antes de la humanización era de 2,34*10'6 *9 M, y la afinidad de los nanocuerpos humanizados era de 2,26*10'9 M. La humanización no cambia la afinidad del nanocuerpo.
Ejemplo 10: La especificidad de los nanocuerpos purificados mediante ELISA
(1) Los nanocuerpos antes y después de la humanización fueron biotinilados por procedimientos convencionales; (2) Se recubrieron las proteínas antigénicas PD-L1 (humano), PD-L1 (rata), PD-L1 (mono), PD-L2 (humano), B7H4 (humano), B7H3 (humano): 0.5 pg por pocillo (5 pg/ML, 100 pl), se recubrió IgG1 como control, se dejó toda la noche a 4° C;
(3) Los productos se lavaron con PBST 3 veces y se añadieron 200 pl de BSA al 1 % para bloquearlos en RT durante 2 horas;
(4) Cada uno de los nanocuerpos biotinilados se diluyó a 10 pg/ML, y se incubaron 100 pl de cada uno en cada pocillo y se dejaron reaccionar a RT durante 1 hora.
(5) Los nanocuerpos no unidos se lavaron con PBST, se añadieron 100 pl de estreptavidina-HRP (dilución 1:1000) y el resultado se dejó reposar durante 1 hora a temperatura ambiente.
(6) Se añadió la solución de desarrollo de color y se leyó la absorbancia a la longitud de onda de 450 nm en ELISA. La especificidad de los nanocuerpos se determinó a partir de los valores de absorbancia. Los resultados se muestran en la figura 10. Ambos nanocuerpos, antes y después de la humanización, interactuaron con el PD-L1 humano y el derivado de mono, pero no con el PD-L1 derivado de ratón. Los dos nanocuerpos tenían una buena especificidad de especie. Ninguno de los nanocuerpos, antes o después de la humanización, interactuó con los miembros de la familia PD-L1 y tuvieron una buena especificidad familiar.
Ejemplo 11: Pruebas de linfocitos mixtos
En este experimento, los nanocuerpos fueron incubados con células DC maduras y células T CD4+ derivadas de diferentes donantes y cultivadas in vitro. Se detectaron los niveles de expresión relativos de IL2 e IFN-y en el sistema para reflejar la activación de las células T por los diferentes nanocuerpos. Los pasos son los siguientes:
(1) Aislamiento de PBMC: Se tomaron 50 ml de sangre fresca de los donantes y se añadieron 2,5 veces de PBS. El producto se añadió suavemente en FiColl (Thermo) (12,5 ml, 4 tubos), se centrifugó a 400g durante 30min y se paró a 0 deceleración. La banda blanca central se aspiró en PBS (Gibco) y se lavó dos veces con PBS.
(2) Aislamiento de la célula de CC: Se tomaron las células PBMC aisladas y se añadieron 5 ml de medio de cultivo de células T. Las células fueron sometidas a un cultivo adherente a 37 ° C bajo 6 % de CO2 durante 2 horas. Se tomaron las células en suspensión para separar las células CD4+. Se añadieron 3 ml de DC a las células restantes. Tras 2 días de cultivo, se añadieron 3 ml de medio DC para seguir cultivando hasta el quinto día. A continuación, se cultivaron rTNFa (R&D Systems) (1000 U/ml), IL-1b (R&D Systems) (5 ng/ml), IL-6 (R&D Systems (10 ng/ml) y 1 pM PGE2 (Tocris) durante 2 días como células DC para la reacción linfocitaria mixta (MLR).
(3) Aislamiento de células CD4+: Las PBMC se incubaron durante 2 horas y las células suspendidas se introdujeron en tubos de centrífuga de 15 ml, se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos, se resuspendieron en 500 pl de suero, 100 pl de suero AB y 100 pl de nanocuerpos purificados, se incubaron durante 20 minutos a C y se lavaron una vez con la solución de separación. Se añadieron 500 pl de tampón de microesferas para incubar durante 15 minutos. Se retiró la microesfera mediante un campo magnético, se lavó una vez con medio de cultivo celular T, se resuspendió con 8 ml de medio de cultivo y se incubó a 37° C bajo 6 % de CO2. (Los procedimientos se llevaron a cabo según las instrucciones del "Human CD4+ T Cell Enrichment Kit" (19052, Stemcell)).
(4) Experimento MLR: Las células DC maduras se mezclaron con las células CD4+ a un volumen de 200 pl por pocillo, 10.000 células DC y 100.000 células CD4+. Se añadieron nanocuerpos, las DC, las células T y la MLR se utilizaron como controles negativos, y las perlas magnéticas DC+células T+anti-CD3/CD28 se utilizaron como control positivo. Las perlas se sometieron a un cultivo mixto durante 5 días, y se utilizó un kit cisbio (Human IL2 Kit 1000 Test, Human IFN gamma 1000 test) para detectar la concentración de IL2 e IFN-gamma.
Los resultados experimentales se muestran en la Figura 12. Los nanocuerpos de la presente invención (secuencia mostrada en el Ejemplo 5) estimularon al donante a producir más citoquinas que el control positivo. Tras la humanización, las citocinas producidas fueron comparables al control positivo. Por lo tanto, tanto los nanocuerpos de la presente invención como los nanocuerpos humanizados pueden activar eficazmente las células T, y el efecto de activación es similar al del anticuerpo del grupo de control positivo.
Ejemplo 12 El estudio de las actividades inhibidoras de tumores de los nanocuerpos anti-PD-Ll.
En este estudio, se utilizaron células MC38 humanas que expresan PD-L1 (MC38-PDL1) (Nanjing Galaxy) para determinar los efectos antitumorales del Nb-Fc humanizado en ratones transgénicos PD-L1. En primer lugar, se estableció un modelo de ratones portadores de tumores MC38-PDL1 mediante inoculación subcutánea. Tras la formación del tumor, se administraron diferentes nanocuerpos (las secuencias se muestran en el Ejemplo 5) y diferentes dosis de tratamiento, y se monitorizaron los volúmenes tumorales y los cambios de peso corporal en cada grupo de ratones durante la administración. La frecuencia de dosificación fue de 2 veces/semana, la frecuencia de control fue de 2 veces/semana y el control continuo duró 5 semanas. Las dosis y los procedimientos se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 13.
Tabla 5
Grupo Sujetos de
prueba dosificación Volumen de la
administración concentración Vía de administración h-IgG Control de IgG 20 mg/kg 10 ml/kg 2.0 mg/ml Inyección intraperitoneal nb-Fc nb-Fc 10 mg/kg 10 ml/kg 1.0 mg/ml Inyección intraperitoneal humanizado humanizado
Los pasos se muestran como sigue:
1) La preparación de la suspensión de células MC38/PD-L1: Las células MC38 se dispensaron con PBS (1*) hasta una densidad celular de 1*107 células/ml para preparar la suspensión celular MC38;
2) Inoculación: 25 ratones C57B1/6 de fondo PD-L1 fueron afeitados en el lado derecho de la espalda, y las células MC38/PD-L1 fueron inyectadas subcutáneamente con 1 x106 células/0,1 ml/cuerpo. Tras 6 días de inoculación de células tumorales, se examinaron los volúmenes tumorales de cada ratón, y se seleccionaron 25 ratones con un volumen tumoral que oscilaba entre 87,4 mm3 y 228,4 mm3 y se agruparon por volumen tumoral medio.
3) Dosificación: Véase la figura 13.
4) Prueba: Se midió el peso antes y después de cada administración y el peso corporal y los volúmenes tumorales. El peso se midió con una balanza electrónica, 2 veces por semana.
5) Medición de los volúmenes tumorales: La longitud máxima (L) y la anchura máxima (W) de los tumores se midieron con un calibre. Los volúmenes tumorales se calcularon según la siguiente fórmula: V = L*W /2.
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 14. Los ratones vacunados con Nb-Fc humanizado tuvieron un muy buen control de los volúmenes tumorales en comparación con el grupo de control y no mostraron un aumento significativo, lo que indica que el Nb-Fc humanizado tiene un efecto inhibidor del tumor significativo.
Ejemplo 13. La solubilidad de los nanocuerpos detectados por el procedimiento de precipitación de PEG
En este experimento, la solubilidad de los nanocuerpos se reflejó mediante el procedimiento de precipitación de PEG a través de la detección de la disolución de nanocuerpos alternativos (secuencia mostrada en el Ejemplo 5) en diferentes concentraciones de PEG. Los procedimientos se muestran de la siguiente manera:
1) Se concentró la muestra de nanoalimento a 5 mg/ml.
2) Las muestras se añadieron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos con 40 pl de muestras de nanoanticuerpos por pocillo hasta una concentración final de 1 mg/ml. 26.7 pl, 40 pl, 46,7 pl, 53,3 pl, 60 pl, 66,7 pl, 73,3 pl, 80 pl, 86,7 pl, 93. Se añadieron 3 pl, 100 pl y 106,7 pl de PEG al 30 % en las columnas 1 a 12, respectivamente, y se añadió el tampón IBI301 hasta un volumen total de 200 pl. Los gradientes de concentración de PEG fueron del 4 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % y 16 %, respectivamente.
3) El producto se colocó a temperatura ambiente durante 1 hora y se midió la DO500 nm.
Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 6 y en la Figura 15. El Nb-Fc humanizado apareció turbio al 8 % (p/v) de PEG, mientras que el anticuerpo de control (agente postcomercialización, Humira) apareció turbio al 6 % (p/v) de PEG. Esto indica que el Nb-Fc humanizado de la presente invención tiene una solubilidad superior a la del nanocuerpo de control.
Tabla 6
DO500 nm 4 % 6 % 7 % 8 % 9 % 10 %
nb-Fc humanizado 0.0352 0.0356 0.0354 0.0602 0.0411 0.1792 Humira 0.0365 0.0367 0.0387 0.2144 0.3627 0.6293 DO500 nm 11 % 12 % 13 % 14 % 15 % 16 %
nb-Fc humanizado 0.4778 0.5807 0.8418 0.8687 0.928 1.0514 Humira 0.8409 0.7891 0.9194 0.9589 0.9086 0.9444
Ejemplo 14. Prueba de estabilidad acelerada
En este experimento, se evaluó la estabilidad térmica a largo plazo de los nanocuerpos mediante la detección de cambios en la pureza y la actividad biológica de los nanocuerpos (secuencia mostrada en el Ejemplo 5) después de dejarlos a 40° C durante 30 días. La pureza de los nanocuerpos deseados después de 0, 14 y 30 días de almacenamiento a 40° C se determinó mediante SEC. Como se muestra en la Tabla 7 y la Figura 16, la pureza del Nb-Fc humanizado no cambió significativamente. En este experimento, la combinación de la muestra de prueba de estabilidad acelerada y las células CHO-PDL1 se detectó mediante el procedimiento FACS. Los pasos son los siguientes:
1) Preparación de las células: Se contaron las células CHO-PDL1 y se diluyeron a 2 x106 células/ml, después se añadieron las células en una placa de 96 pocillos con fondo en U a 100 pl/pocillo, y se añadieron 50 pl de células a los pocillos de la primera columna;
2) Pasos de detección: se añadieron nanocuerpos al primer pozo hasta la concentración final de 200 nM, y se mezclaron. Se pipetearon 50 pl en el segundo pozo, y así sucesivamente. El control negativo es el control IgG. El producto se sometió a un baño de hielo durante 20 minutos. Se añadió PBS a 100 pl/pocillo. El resultante se centrifugó a 400 g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante y las células se lavaron con PBS una vez. El anti-IgG-PE de cabra diluido (1:100) (eBioscience) se añadió a 100 pl/pocillo. El resultante se sometió a un baño de hielo durante 20 minutos, se centrifugó a 400 g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante, se lavó una vez con PBS a 100 pl/pocillo, se resuspendió con 100 pl de PBS y se detectó por FACS.
Como se muestra en la Figura 17, la unión de las células Nb-Fc humanizadas y CHO-PDL1 no cambió significativamente. Los resultados muestran que el Nb-Fc humanizado tiene una buena estabilidad térmica.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo de dominio único anti-PD-LI (VHH), que comprende una región determinante complementaria (CDR) que consiste en la CDR1 como se establece EN la SEQ ID NO: 5, CDR2 como se establece en la SEQ ID NO: 6 y CDR3 como se establece en la SEQ ID NO: 7, en el que dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están separadas por las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena VHH, y el anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
2. Un anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH), que comprende la región marco (FR) y la región determinante complementaria (CDR) de la reivindicación 1, y dicha región marco
(a) que consiste en FR1 como se establece en la SEQ ID NO.:1, FR2 como se establece en la SEQ ID NO: 2, FR3 como se establece en la SEQ ID NO: 3, y FR4 como se establece en la SEQ ID NO: 4; o
(b) que consiste en FR1 como se establece en la SEQ ID NO.:10, FR2 como se establece en la SEQ ID NO: 11, FR3 como se establece en la SEQ ID NO: 12, y FR4 como se establece en la SEQ ID NO: 13, y el anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
3. Un anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1, en el que se trata de un anticuerpo de dominio único (VHH) contra el epítopo PD-L1, y tiene una cadena VHH como se establece en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o s Eq ID NO: 14, y el anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) puede bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1.
4. Un polinucleótido, en el que dicho polinucleótido codifica la proteína seleccionada del grupo que consiste en el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 1, el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 2, y el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 3.
5. El polinucleótido según la reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o 15.
6. Un vector de expresión, en el que dicho vector contiene el polinucleótido según la reivindicación 4.
7. Una célula huésped, en la que dicha célula huésped contiene el vector de expresión según la reivindicación 6, o el polinucleótido según la reivindicación 4 está integrado en el genoma de la célula huésped.
8. Un procedimiento para producir un anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) que comprende los pasos de:
(a) cultivar dicha célula huésped según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para producir nanocuerpos, obteniendo así un cultivo que contenga dicho anticuerpo de dominio único anti-PD-Ll (VHH); y (b) aislar o recuperar dicho anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) de dicho cultivo.
9. Un inmunoconjugado, en el que dicho inmunoconjugado contiene:
(a) el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 2, o el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 3; y
(b) una parte de conjugación seleccionada del grupo que consiste en un marcador detectable, un fármaco, una toxina, una citoquina, un radionúclido y una enzima.
10. El anticuerpo de dominio único anti-PD-L1 (VHH) según la reivindicación 3 para su uso como (a) un agente para detectar la molécula PD-L1; o (b) un medicamento para tratar el cáncer.
11. Una composición farmacéutica que comprende:
(i) el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-Ll según la reivindicación 1, el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 2, el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-L1 según la reivindicación 3, o el inmunoconjugado según la reivindicación 9; y
(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento del cáncer.
13. Uso del anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-Ll según la reivindicación 2, el anticuerpo de dominio único (VHH) anti-PD-Ll según la reivindicación 3, o el inmunoconjugado según la reivindicación 9 para preparar un agente, placa de detección o kit, en el que dicho agente, placa de detección o kit se utiliza para detectar la proteína PD-L1 en una muestra de ensayo.
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