JP2023500110A

JP2023500110A - Ｐｄ－ｌ１結合分子

Info

Publication number: JP2023500110A
Application number: JP2022525333A
Authority: JP
Inventors: コン，チャオ; ラン，グオジュン; ウ，チ; リウ，チャンジュアン; ヤン，ルン; ヤン，シンチアン; タン，ルンメイ
Original assignee: サンヨウバイオファーマシューティカルズカンパニーリミテッド
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2023-01-04
Also published as: WO2021083335A1; EP4059962A1; US20230002494A1; KR20220087488A; EP4059962A4

Abstract

本願は、単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、具体的には、単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明は、更に、当該単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸及び当該核酸を含む発現ベクター又は宿主細胞、並びに当該ＰＤ－Ｌ１結合分子を含む薬物組成物又はキットを提供する。【選択図】図９

Description

［優先権の主張］
本願は、２０１９年１０月３０日に提出された中国特許出願第２０１９１１０４４２９７．０号及び２０２０年７月３１日に提出された中国特許出願第２０２０１０７６５５３０．０号の権益を主張し、上記出願の内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

本願は、バイオテクノロジー分野に属し、一般的には、抗体に関する。より具体的には、本願は、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する結合分子（例えば、単一ドメイン抗体）、その調製方法及びその使用に関する。

免疫チェックポイントは、免疫系において抑制作用を果たす調節分子であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３などを含み、現在、ＣＴＬＡ－４とＰＤ－１との２つの免疫チェックポイントに基づく抗体薬物は多く出回っている。ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１，プログラム細胞死受容体１）は、最初にアポトーシスしたマウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４．１１からクローニングされた重要な免疫抑制分子である。ＰＤ－１を標的とする免疫調節は、抗腫瘍、抗感染、抗自己免疫性疾患及び臓器移植の生存などのいずれにも重要な意義がある。

ＰＤ－１の主なリガンドは、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２であり、前記ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞の逃避を媒介する過程で重要な役割を果たし、腫瘍細胞及びいくつかの抗原提示細胞において高度に発現され、且つその発現量がＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βなどの種々のサイトカインによって誘導され得る。腫瘍微小環境において、ＰＤ－Ｌ１の発現上昇は、ＰＤ－１シグナル伝達経路を介してＴ細胞の抗腫瘍反応を直接抑制し、腫瘍細胞による免疫逃避を媒介することができる。

単一ドメイン抗体は、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ，シングルドメイン抗体）と略称され、単一の抗体重鎖可変領域ドメインからなる抗体である。ＩｇＧ抗体と類似し、特定の抗原に選択的に結合することができるが、シングルドメイン抗体の分子量がＩｇＧ抗体よりも遥かに小さい。最初のシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物において見出された重鎖抗体から改変されたものである（Ｈａｍｅｒｓ－ＣａｓｔｅｒｍａｎＣ，ＡｔａｒｈｏｕｃｈＴ，ＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓＳ，ＲｏｂｉｎｓｏｎＧ，ＨａｍｅｒｓＣ，ＳｏｎｇａＥＢ，ＢｅｎｄａｈｍａｎＮ，ＨａｍｅｒｓＲ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｄｅｖｏｉｄｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ３６３（６４２８）：４４６－４４８）。これらのラクダ科動物において見出された重鎖抗体は、ＶＨＨ断片とも呼ばれる。現在、シングルドメイン抗体に対する研究は、殆ど重鎖可変ドメインに基づくものである。

シングルドメイン抗体は、多くの利点を有する。例えば、それらは、高い溶解度、良好な熱安定性及び組織浸透性を有し、いくつかのシングルドメイン抗体は、分子内ジスルフィド結合の存在により、パパインなどの分解に更に耐えることができる。また、シングルドメイン抗体は、酵母、植物及び哺乳動物細胞などの様々な宿主細胞において発現することができ、且つ発現量が高いため、コストの面で非常に大きなメリットを有する。（ＨａｒｍｓｅｎＭＭ，ＤｅＨａａｒｄＨＪ（２００７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｃａｍｅｌｉｄｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７７（１）：１３－２２．）。シングルドメイン抗体は、その多くの利点により、様々なバイオテクノロジー及び医療分野で良好な応用の将来性を有する。現在、Ａｂｌｙｎｘ社の最初のシングルドメイン抗体薬物の販売が承認された。

現在、ＰＤ－Ｌ１を標的とする市販の抗体薬物は、多くないため、癌の免疫治療に用いられ、より低い毒性や副作用及びより優れた臨床薬効を有する、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する新規な結合分子（例えば、単一ドメイン抗体）を開発する必要がある。

本発明は、新規なＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、具体的には、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する新規な単一ドメイン抗体を提供することを目的とする。従来のＰＤ－Ｌ１結合分子と比べ、本発明のＰＤ－Ｌ１結合分子は、より低い毒性や副作用及びより優れた臨床薬効を有し、癌をより効果的に治療することができる。

全体的には、本発明は、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する結合分子を提供し、具体的には、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体を提供する。前記単一ドメイン抗体は、以下でＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、ナノボディ形態のＰＤ－Ｌ１抗体、ＰＤ－Ｌ１ナノボディ又はＰＤ－Ｌ１のＶＨＨ抗体とも呼ばれ、以上の用語は、交換可能に使用される。本願は、更に、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子の構築及びスクリーニング方法、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸分子、ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現するためのベクター及び宿主細胞、並びに前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を含む組成物又はキットを提供する。本願のＰＤ－Ｌ１結合分子は、免疫系を調節することで様々な癌を治療することができるため、癌を治療する薬剤の調製に使用することができる。

具体的には、本発明は、高親和性、低分子量などの利点を保ちながら、免疫原性修飾を行い、創薬可能性を改善し、非常に大きな治療上の利点を有するナノボディ形態のＰＤ－Ｌ１抗体及びそのヒト化改変又は親和性成熟後の誘導体分子を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）式ＲＴＤＳＮＩＸ_１ＧＭＨに示すＣＤＲ１（Ｘ_１がＨ、Ｆ又はＮである）、
（ｉｉ）式ＴＩＦＩＤＸ_２ＮＴＸ_３に示すＣＤＲ２（Ｘ_２がＧ、Ｌ又はＡであり、Ｘ_３がＩ又はＬである）、及び、
（ｉｉｉ）式ＤＶＳＧＹＧＲＸ_４に示すＣＤＲ３（Ｘ_４がＡ又はＹである）を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：８からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：９からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１１からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１２からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１３からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１９からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２２からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子を提供し、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記重鎖可変領域はＦＲ領域を更に含み、前記ＦＲ領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、且つＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と前記重鎖可変領域において間隔を置いて配列されてＮ末端からＣ末端までＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である構造を形成する。

好ましい実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。

好ましい実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。

好ましい実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。

いくつかの実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列を含むか、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有し、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）を有し、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持するアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態において、前記１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）は、５つを超えず、好ましくは３つを超えない。

いくつかの態様において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子は、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体又は創薬可能性改変後の分子である。

いくつかの態様において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片である。従って、本発明は、更に、単離されたナノボディ形態のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を提供する。

いくつかの態様において、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子は、重鎖可変領域が別の分子に融合可能であり、前記別の分子は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）のＦｃドメイン、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片又は蛍光タンパク質から選択される。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４）のＦｃドメインに融合される。

いくつかの態様において、本発明は、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターを提供する。

いくつかの態様において、本発明は、本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか又は本発明に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、本発明に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子及び薬学的に許容されるベクターを含む薬物組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、本発明に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容されるベクターを含む。

いくつかの態様において、本発明は、本発明に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子の調製方法を提供し、前記方法は、
適切な宿主細胞において本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を発現させ、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を生成するステップ（１）と、
前記宿主細胞から前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を単離するステップ（２）と、を含む。

いくつかの態様において、本発明は、被験者における免疫応答が調節されるように、被験者に本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子を投与するステップを含む被験者の免疫応答を調節する方法に関する。

いくつかの実施形態において、前記被験者は、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患に罹患したヒト又は哺乳動物である。具体的には、前記被験者は、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性固形腫瘍などに罹患する可能性があるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、本発明は、前記ＰＤ－Ｌ１に関する疾患に罹患した患者又は前記ＰＤ－Ｌ１に関する疾患に罹患する傾向のある被験者に、有効量の本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子を投与し、又は、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を投与し、又は、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子を含む有効量の薬物組成物を投与し、又は、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む有効量の薬物組成物を投与するステップを含む、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患を治療又は予防するための方法に関する。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１活性の消失、抑制又は低減によって改善、緩和、抑制又は予防可能な任意の疾患又は症状を治療する方法に関する。

別の態様において、本発明の方法は、更に、被験者に有効量の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片及び１つ又は複数の他の薬物を投与するステップを含む併用療法による腫瘍の治療又は予防の方法に関する。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、被験者に有効量の第２の薬物を併用投与するステップを更に含み、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子又はＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片は、第１の薬物である。一実施形態において、第２の薬物は、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患を治療するための化学療法剤、放射線療法剤又は生体高分子薬物である。一実施形態において、前記生体高分子薬物は、例えばＴ細胞によって腫瘍細胞を認識して攻撃する様々なモノクローナル抗体薬であり、例えば、リツキシマブ、セツキシマブ及びトラスツズマブである。本明細書で使用される「第２の薬物」という用語は、第１の薬物以外の唯一の薬物を指すことを意味するわけではない。従って、第２の薬物は、必ずしも１種の薬物であるとは限らず、複数のそのような薬物を構成するか又は含むものであってもよい。

いくつかの実施形態において、被験者、患者又は個体は、マウス又はヒトなどの哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患を治療又は予防するための薬物の調製における本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子の使用に関する。

いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患を治療又は予防するための薬物の調製における本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。

いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１に関する疾患は、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性固形腫瘍などから選択されるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を使用したキット又は装置及び関連する方法、並びに癌などのＰＤ－Ｌ１に関する疾患の治療に使用できる本明細書に開示された薬物組成物に関する。そのため、本発明は、本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１結合分子、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含有する容器を含む上記の症状を治療できる製品、及び本明細書に開示されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を使用してＰＤ－Ｌ１に関する疾患又はその進行又は再発を治療、改善又は予防するための説明資料を提供することが好ましい。

本発明は、本明細書に記載の任意の実施形態の任意の組み合わせを更に含む。本明細書に記載の任意の実施形態又はその任意の組み合わせは、本明細書に記載の発明の任意の及び全てのＰＤ－Ｌ１結合分子、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片、方法及び使用に適用される。

ＰＤ－Ｌ１に結合するＶＨＨ抗体の溶解液サンプルの結合親和性のスクリーニング結果を示す。抗ＰＤ－Ｌ１候補抗体分子のブロッキング実験のスクリーニング結果を示す。候補抗体分子の細胞結合実験の検証結果を示す：（Ａ）アイソタイプ対照、（Ｂ）ＮＢ２２Ｄ－２１、（Ｃ）ＮＢ２２ｇｂ－１０、（Ｄ）陽性対照ＫＮ０３５。ＮＢ２２Ｄ－２１分子の特異的結合反応実験の検証結果を示す。ＮＢ２２Ｄ－２１分子の混合リンパ球反応実験の検証結果を示す。ＮＢ２２Ｄ－２１分子及びそのヒト化改変された誘導体分子の結合実験の検証結果を示す。ＮＢ２２Ｄ－２１分子及びそのヒト化改変された誘導体分子のヒトとマウスの交差反応実験の結果を示す。ヒト化改変された誘導体分子ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１のヒトとマウスの交差反応実験のフローサイトメトリーによるピーク図の結果を示す：（Ａ）対照分子ＫＮ０３５、（Ｂ）ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１。ＮＢ２２Ｄ－２１分子及びそのヒト化改変分子の結合ブロッキング実験の結果を示す。親和性成熟後の分子のＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯでの親和性検出結果を示す。親和性成熟後の分子によるＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞へのＰＤ－１の結合の遮断を示す。二次親和性成熟分子がヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞に結合する親和性の検出を示す。二次親和性成熟分子がヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞へのＰＤ－１の結合を遮断する活性の検出を示す。二次親和性成熟分子がマウスＰＤ－Ｌ１細胞に結合する活性の検出を示す。アイソタイプ対照（ｉｓｏｔｙｐｅ）がヒトＩｇＧ１である、創薬可能性改変後の分子のＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯでの遮断活性を示す。創薬可能性改変後の分子の混合リンパ球反応でのＩＦＮ－γ（Ａ）及びＩＬ－２（Ｂ）の分泌への影響を示す。ＣＤＲ配列が枠で囲まれた、候補抗体分子の配列アラインメントを示す。

［配列表の概況］
本願には、多くのヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む配列表が付いている。以下の表Ａ、Ｂ及びＣには、含まれる配列の概況が提供される。

本明細書に記載の特定の方法論、実施形態及び試薬は、例示的な説明に過ぎないため、本発明はこれらに限定されないことが当業者に理解されるべきである。なお、本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲のみによって限定されることを理解されたい。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

また、文脈で別段の要求がない限り、単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。より具体的には、文脈で別途明らかに指摘されていない限り、本明細書及び添付される特許請求の範囲において使用される単数形「１つ」及び「このような」は、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「１つの抗体」に言及する場合、複数の抗体を含む。

Ｉ．定義
本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義及び解釈は、以下のように提供される。

「約」という用語は、数字や数値と組み合わせて使用される場合、指定された数字や数値よりも５％小さい下限から指定された数字や数値よりも５％大きい上限までの範囲内の数字や数値を含むことを意味する。

「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、複数種の抗体構造体を含み、前記抗体構造体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むが、これらに限定されず、それらが必要な抗原結合活性を示せばよい。完全な抗体は、通常、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むが、場合によって少ない鎖を含んでもよく、例えば、ラクダ科動物に天然に存在する抗体は、重鎖のみを含んでよい。

本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、標的抗原に特異的に結合する部分を指す。当該用語は、標的抗原に特異的に結合できる抗体及び他の天然分子（例えば、受容体、リガンド）や合成分子（例えばＤＡＲＰｉｎ）を含む。好ましい一実施形態において、本発明の抗体の抗原結合部分は、抗体断片である。

「全長抗体」、「無傷抗体」及び「完全な抗体」という用語は、本明細書において、天然抗体の構造と実質的に類似する構造を有するか又はＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために互換可能に使用される。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指すものであり、その生成方法を指すものではない。モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、ＣＤＲ移植などの合成技術、又はこのような又は当分野で既知の他の技術の組み合わせによって生成することができる。

本明細書で使用される「ＰＤ－１」という用語とは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫系を負に調節するために共抑制性受容体として機能するプログラム細胞死タンパク質を指す。ＰＤ－１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を含む２つの既知のリガンドを有する。ＰＤ－１の別名又は同義語は、ＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９及びＳＬＥＢ２などを含む。ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５００９．２でヒトＰＤ－１の代表的なアミノ酸配列が開示され、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００５０１８．３でヒトＰＤ－１をコードする代表的な核酸配列が示されている。

本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１，例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら，（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７を参照）を意味する。ＰＤ－Ｌ１の別名又は同義語は、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ２７４及びＢ７－Ｈなどを含む。ヒトＰＤ－Ｌ１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１で開示され、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする代表的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１４１４３．４で示される。ＰＤ－Ｌ１は、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、心臓、胎児の肝臓において発現され、多くの腫瘍又は癌細胞においても発現される。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞で発現される受容体ＰＤ－１又はＢ７－１に結合する。ＰＤ－Ｌ１とその受容体の結合は、シグナル伝達を誘導してＴＣＲ媒介性のサイトカインの生成及びＴ細胞増殖の活性化を抑制する。従って、ＰＤ－Ｌ１は、特定のイベント（例えば、妊娠、自己免疫疾患、組織同種異系移植片）の間に免疫系を抑制するために主な役割を果たし、腫瘍又は癌細胞が免疫チェックポイントを迂回して免疫応答を逃避することを許容すると考えられる。

本明細書で使用される「結合」及び「特異的結合」という用語とは、抗体又は抗原結合部分が、インビトロアッセイ、好ましくは精製された野生型抗原を用いた生物光学干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において抗原エピトープに結合することを指す。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合部分がタンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物におけるその標的抗原を好ましく認識する場合、抗体又は抗原結合部分を特異的結合抗原と呼ぶ。

その重鎖定常領域のアミノ酸配列により、抗体を「クラス」でＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分ける。且つ、これらのクラスのうちのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などのサブクラスに更に分けることができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ［ｉｍａｇｅ］δ、ε、γ及びμと呼ばれる。５つの抗体クラスの全てで見られる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ及びλと呼ばれる。全長軽鎖及び重鎖において、通常、可変領域と定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、且つ重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を更に含む。例えば、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．監修，第２版，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにここでその全体を参照として援用する）を参照する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、通常、抗原結合部位を形成する。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、通常、類似した構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔら，ＫｕｂｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．９１ページ（２００７）を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるには十分である。更に、特定の抗原に結合した抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて前記抗原に結合した抗体を単離し、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、及びＣｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照する。本開示におけるＦＲ及びＣＤＲは、ＡｂＭの標準に応じて分けられるが、本開示におけるＣＤＲは、ＡｂＭによる分割方式に限定されず、当分野で慣用の他の何れか１つの分割方式であってもよく、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ、Ｋａｂａｔ、ＡＨｏ及びＩＭＧＴなどの方式で分割してもよいことを指摘しておく。

可変領域は、通常、３つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示し、前記超可変領域は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる。通常、フレームワーク領域によって各対の２つの鎖からのＣＤＲをアライン（ａｌｉｇｎ）し、前記ＣＤＲにより、抗体は、特異的エピトープに結合できるようになる。２つの軽鎖及び重鎖可変領域は、Ｎ末端からＣ末端まで、通常、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。

「抗体断片」は、完全な抗体が結合する抗原に結合する完全な抗体の一部を含む、完全な抗体と異なる分子を指す。

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の全ての非共有相互作用の合計の強度を指す。別に断らない限り、本明細書で用いられる場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹへの親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）で表現することができる。親和性は、従来技術から知られているもの及び本明細書に記載されたものを含む当分野で知られている慣用の方法によって測定することができる。

本明細書で使用される「ＥＣ_５０」という用語は、「半有効濃度」とも呼ばれ、特定の暴露時間後にベースラインと最大値の間の５０％の応答を誘導する薬物、抗体又は毒剤の濃度を指す。本出願の文脈において、ＥＣ_５０の単位は「ｎＭ」である。

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって生成されるか又は非ヒト供給源に由来し、ヒト抗体ライブラリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体という定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択中に最もよく出現するアミノ酸残基を代表するフレームワークを指す。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブタイプから選択される。一般的には、当該配列のサブタイプは、Ｋａｂａｔら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ（１９９１），１～３巻におけるサブタイプである。一実施形態において、ＶＬについて、当該サブタイプは、Ｋａｂａｔら（上記を参照）におけるサブタイプκＩである。一実施形態において、ＶＨについて、当該サブタイプは、Ｋａｂａｔら（上記を参照）におけるサブタイプＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常、２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全ての又は実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のものに対応し、且つ全ての又は実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する少なくとも一部の抗体定常領域を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。

「保存的置換」という用語は、１つのアミノ酸が同一のクラス内の別のアミノ酸で置換され、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸で置換され、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換され、又は、１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸で置換されることを指す。例示的な置換を以下の表Ｄに示す。

アミノ酸は、よく見られる鎖側の性質に応じて以下のようにグループ分けすることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。

置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、更なる研究のために選択して得られた１つ又は複数の変異体は、親抗体に対して特定の生物学的性質が改良され（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）、及び／又は親抗体によって基本的に保持された特定の生物学的性質を有する。１つの例示的な置換変異体は、例えば本明細書に記載の技術のようなファージに基づく親和性成熟技術によって容易に生成できる親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、１つ又は複数のＨＶＲ残基を変異させるとともに、変異体抗体をファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に対してスクリーニングを行う。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るために前記配列をアラインメントし（必要に応じてギャップを導入）、且ついかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした時の、候補配列におけるアミノ酸残基と参照ポリペプチド配列における同じアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定するために当分野の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアといった公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、配列アラインメントを行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するために適切なパラメータを決定することができる。本願において配列同一性パーセントに言及する場合、特に断らない限り、これらのパーセントは、より長い配列の全長に対して計算される。より長い配列の全長に対する計算は、核酸配列及びポリペプチド配列の両方に適用される。

「有効量」、「治療有効量」という用語とは、患者に単回投与又は複数回投与された後、治療される被験者で被験者の症状改善（例えば、１つ又は複数の症状改善）及び／又は症状進行の遅延などを含む所望の効果を生じる本発明の抗体又は抗原結合断片の量又は用量を指す。「有効量」、「治療有効量」は、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を低減させるために十分な量を指すこともできる。

有効量は、当業者である主治医が、哺乳動物の種、その大きさ、年齢及び全般的な健康状況、関連する具体的な疾患、疾患の程度又は重症度、個々の患者の応答、投与される具体的な抗体、投与モード、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択される投与レジメン、及び任意の併用療法の使用などの様々な因子を考慮した上で、容易に決定することができる。

本明細書で使用される「遮断」という用語は、本発明の抗体が存在する場合にＰＤ－Ｌ１のシングル伝達を低減させることを示す。ＰＤ－Ｌ１媒介性のシグナル伝達の遮断は、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が存在する場合にＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のレベルがＰＤ－Ｌ１の対照レベル（即ち、抗体が存在しない場合のＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のレベル）よりも低いことを指し、低減の程度は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％以上である。種々の標準的な技術を用いてＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のレベルを測定することができ、例えば、非限定的な実施例として、下流遺伝子活性化及び／又はＰＤ－Ｌ１への応答の活性化を測定するルシフェラーゼレポーターアッセイが挙げられる。当業者は、例えば市販のキットを含む様々な試験を用いてＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のレベルを測定できることを理解すべきである。

「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞、及びこのような細胞の子孫を指す。宿主細胞は、継代数を考慮せず、一次形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含む。子孫は、核酸含有量について親細胞と完全に同じでなない場合があり、突然変異を含んでもよい。本明細書において、最初に形質転換された細胞からスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫を含む。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それと連結される別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及びそれを導入した宿主細胞のゲノムに結合するベクターを含む。いくつかのベクターは、それに操作可能に連結される核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

「個体」又は「被験者」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ、アルパカ、及び齧歯類動物（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体又は被験者は、ヒトである。

ＩＩ．ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片
本発明に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であり得る。換言すれば、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できる単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体及びその抗原結合断片を提供する。

従って、本発明は、更に、以下の実施形態を提供する。

１．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

２．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）式ＲＴＤＳＮＩＸ_１ＧＭＨに示すＣＤＲ１（Ｘ_１がＨ、Ｆ又はＮである）、
（ｉｉ）式ＴＩＦＩＤＸ_２ＮＴＸ_３に示すＣＤＲ２（Ｘ_２がＧ、Ｌ又はＡであり、Ｘ_３がＩ又はＬである）、及び、
（ｉｉｉ）式ＤＶＳＧＹＧＲＸ_４に示すＣＤＲ３（Ｘ_４がＡ又はＹである）を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

３．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

４．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

５．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

６．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：８からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：９からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

７．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１１からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１２からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

８．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１３からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

９．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

１０．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

１１．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：１９からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

１２．前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む実施形態１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

１３．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２２からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

１４．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２５からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３を含む。

１５．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２７からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

１６．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

１７．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１からなるＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３を含む。

１８．ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、重鎖可変領域を含む単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲを含む。

１９．前記重鎖可変領域はＦＲ領域を更に含み、前記ＦＲ領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、且つＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と前記重鎖可変領域において間隔を置いて配列されてＮ末端からＣ末端までＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である構造を形成する実施形態１～１８の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２０．前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む実施形態１９に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２１．前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む実施形態１９に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２２．前記ＦＲ領域は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、
及び、
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と少なくとも９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に対して２つ以下（例えば０、１、２）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む実施形態１９に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２３．前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列を含むか、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列からなる実施形態１～２２の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２４．前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有し、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持するアミノ酸配列を含む実施形態１～２２の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２５．前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２の何れか１つに示すアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）を有し、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持するアミノ酸配列を含み、前記１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）は、５つを超えず、好ましくは３つを超えない実施形態１～２２の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２６．前記ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体又は創薬可能性改変後の分子である実施形態１～２５の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２７．前記重鎖可変領域は、別の分子に融合され、前記別の分子は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）のＦｃドメイン、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片又は蛍光タンパク質から選択される実施形態１～２６の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２８．前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４）のＦｃドメインに融合される実施形態２７に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

２９．実施形態１～２８の何れか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。

３０．実施形態２９に記載の核酸分子を含むベクター。

３１．実施形態３０に記載のベクターを含む宿主細胞。

３２．有効量の実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容されるベクターを含む薬物組成物。

３３．実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、
－宿主細胞において実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を発現させ、前記ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を生成するステップと、
－前記宿主細胞から前記ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を単離するステップと、を含む方法。

３４．被験者のＰＤ－Ｌ１に関連する疾患を予防又は治療するための方法であって、前記被験者に治療有効量の実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を投与し、又は、実施形態１～２７の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む有効量の薬物組成物を投与するステップを含む方法。

３５．被験者における免疫応答が調節されるように、被験者に治療有効量の実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を投与し、又は、実施形態１～２８の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む有効量の薬物組成物を投与するステップを含む被験者の免疫応答を調節するための方法。

３６．前記被験者は、哺乳動物であり、好ましくはマウス又はヒトであり、より好ましくはヒトである実施形態３４又は３５に記載の方法。

３７．前記ＰＤ－Ｌ１に関する疾患は、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性固形腫瘍から選択される実施形態３６に記載の方法。

３８．前記方法は、被験者に有効量の第２の薬物を併用投与するステップを更に含み、前記第２の薬物は、ＰＤ－Ｌ１に関する疾患を治療するための化学療法剤、放射線療法剤又は生体高分子薬物である実施形態３４又は３５に記載の方法。

３９．前記生体高分子薬物は、例えばＴ細胞によって腫瘍細胞を認識して攻撃する様々なモノクローナル抗体薬であり、例えば、リツキシマブ、セツキシマブ及びトラスツズマブである実施形態３８に記載の方法。

４０．容器を含む被験者のＰＤ－Ｌ１に関する疾患を予防又は治療するためのキットであって、前記容器は、少なくとも１つの実施形態１～２９の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む被験者のＰＤ－Ｌ１に関する疾患を予防又は治療するためのキット。

４１．被験者のＰＤ－Ｌ１に関する疾患を予防又は治療するために用いられる実施形態１～２９の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

４２．被験者の免疫応答を調節するために用いられる実施形態１～２９の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片。

４３．被験者の免疫応答を調節するための薬物組成物の調製における実施形態１～２９の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片の使用。

４４．被験者のＰＤ－Ｌ１に関する疾患を予防又は治療するための薬物組成物の調製における実施形態１～２９の何れか一項に記載のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片の使用。

４５．前記被験者は、哺乳動物であり、好ましくはマウス又はヒトであり、より好ましくはヒトである実施形態４３又は４４に記載の使用。

４６．前記ＰＤ－Ｌ１に関する疾患は、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性固形腫瘍から選択される実施形態４５に記載の使用。

実施例
以下の実施例を参照することにより、本明細書で一般的に説明される本発明は、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、本発明を制限することを意図するものではない。

当業者であれば、特に断らない限り、以下の実施例で使用される試薬、プラスミド、細胞などは、いずれも市販の製品であることを理解すべきである。

実施例１ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現する細胞株の構築
本実施例において、本発明者は、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１、サルＰＤ－Ｌ１、マウスＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－ｓ細胞を構築し、Ｒｏｃｈｅ社製の対照抗体を調製した。

１．１対照抗体の調製
対照抗体－Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ）の軽鎖及び重鎖遺伝子配列（遺伝子合成供給者：通用生物）を全遺伝子合成し、対照抗体は、ＥｘｐｉＣＨＯ一過性トランスフェクション発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で発現され、培地は、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ａ２９１００－０１）であり、トランスフェクションキットは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，Ａ２９１２９）である。

具体的な方法は、以下の通りである。分子クローニングによってＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子のＥｘｐｉＣＨＯ発現プラスミドを構築し、トランスフェクションの前日にＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＧｉｂｃｏＡ２９１２７から購入）を継代し、２５ｍｌの細胞培養系において、２５μｇの構築されたプラスミド（質量比が２：１の軽鎖をコードする遺伝子と重鎖をコードする遺伝子を含むプラスミド混合物）とトランスフェクション試薬を混合してから２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞培養物に滴下し、十分に均一に混合し、３７℃で１８～２２時間発現した後、キット内の説明に従ってフィード培地を添加し、フィード後、細胞を３２℃で培養し、トランスフェクション後の５日目に、２回目のフィードを行い、細胞を３２℃で培養し、１０～１２日後、発現された細胞の懸濁液を高速で遠心分離して上清を取り、得られた上清を０．２２μｍの濾過膜で濾過した後にＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムによるアフィニティー精製方法で精製し、１００ｍＭのグリシン塩（ｐＨ３．０）で目的のタンパク質を溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌでｐＨ７．０に中和した。少量でサンプリングしてからＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した後に分注し、倉庫に入れて凍結保存する。

対照抗体ＫＮ０３５の全遺伝子配列を全遺伝子合成し、分子クローニングによってＫＮ０３５抗体遺伝子のＥｘｐｉＣＨＯ発現プラスミドを構築し、トランスフェクションの前日にＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＧｉｂｃｏＡ２９１２７から購入）を継代し、２５ｍｌの細胞培養系において、２５μｇの構築されたプラスミドとトランスフェクション試薬を混合した後、上記の対照抗体－Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを調製する方法に応じてトランスフェクションを行い、抗体を発現する。

１．２安定的な細胞株の構築
それぞれヒトＰＤ－Ｌ１（ｇｉ番号：ＮＰ＿０５４８６２．１）、マウスＰＤ－Ｌ１（ｇｉ番号：ＮＰ＿０６８６９３）及びアカゲザルＰＤ－Ｌ１（ｇｉ番号：ＡＢＯ３３１６３．１）の全長タンパク質を発現する組換えベクタープラスミドを構築し、エレクトロポレーション法によって構築されたプラスミドをＣＨＯ－ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及びＡ３７５メラノーマ細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６１９）に導入する。スクリーニングによってそれぞれ以上の３つの種のＰＤ－Ｌ１タンパク質の高発現ＣＨＯ－ｓ細胞株及びヒトＰＤ－Ｌ１を高度に発現するＡ３７５細胞株（ＰＤ－Ｌ１－Ａ３７５）を得る。

１．２．１ヒトＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１細胞外ドメインタンパク質を発現するプラスミドの構築
それぞれ遺伝子合成技術によってヒトＰＤ－Ｌ１、マウスＰＤ－Ｌ１及びアカゲザルＰＤ－Ｌ１の全長タンパク質遺伝子配列を含有する発現ベクターを合成し、連結した後に大腸菌に導入し、大腸菌のモノクローンを選別した後、配列決定によって正確なプラスミドクローンを得て、プラスミド抽出を行って再度配列決定を行う。

１．２．２ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現するＣＨＯ－ｓ細胞株の構築
１．２．２．１エレクトロポレーション
ＣＤ－ＣＨＯ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ，１０７４３０２９）でＣＨＯ－ｓ細胞を培養して維持し、エレクトロポレーションの前日に細胞を５×１０^６／ｍＬまで継代し、２日目にエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ，ＭＰＫ１００９６）及びエレクトロポレーション装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮｅｏｎＴＭＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ，ＭＰ９２２９４７）によって構築されたプラスミドをそれぞれＣＨＯ－ｓ細胞に導入する。エレクトロポレーション後の細胞を３ｍＬのＣＤ－ＣＨＯ培地に入れ、３７℃の二酸化炭素インキュベータに入れて４８時間培養する。

１．２．２．２細胞プレーティング及び培養
エレクトロポレーション後のＣＨＯ－ｓ細胞を２０００個の細胞／ウェルで９６ウェルの細胞培養プレートにプレーティングし、最終濃度が３０μＭ／ｍＬのＬ－メチオニンスルホキシイミン（Ｌ－Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ，ＭＳＸ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＳＳ－１０１５－Ｆ）を加え、体積を１００μＬ／ウェルの細胞培養体積と１×ＧＳのサプリメント（Ｓｉｇｍａ，５８６７２Ｃ）に保持し、３７℃の二酸化炭素インキュベータに入れて培養し、１０日後に３０μＭのＭＳＸ及び１×ＧＳのサプリメントを含有する５０μＬの培地を追加する。

１．２．２．３クローンの同定及び細胞の拡大培養
増殖したクローンを選別し、２４ウェルの細胞培養プレートに移して培養する。ＦＡＣＳ方法によって細胞株を同定し、発現量が高いクローンを選択して拡大培養及び凍結保存を行う。関連するＦＡＣＳ同定方法は、以下の通りである。

１）まず、空のＣＨＯ－ｓ細胞及び２×１０^５個の各ＣＨＯ－ｓ細胞クローンを収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合された２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞を９６ウェルの丸底プレートに再懸濁する。

２）９６ウェルの丸底プレートを３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。

３）対応するウェルに抗ＰＤ－Ｌ１抗体希釈液又は陰性対照抗体希釈液を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

４）インキュベートされた細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上清を捨て、対応するウェルに２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再懸濁する。

５）ステップ４）を２回繰り返し、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

６）ＰＥ標識の抗ヒトＩｇＧＦｃフローサイトメトリー抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ９８５９６）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

７）３００ｇで遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁する。

８）ステップ７）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出する。

１．２．３ＰＤ－Ｌ１を発現するＡ３７５細胞株の調製
１．２．２．１におけるＣＨＯ－ｓ細胞のエレクトロポレーションと同様の方法でＡ３７５細胞株のＰＤ－Ｌ１高発現細胞株（ＰＤ－Ｌ１－Ａ３７５）を調製し、Ａ３７５細胞株の動物モデルの構築に用いる。

実施例２動物免疫及び血清力価の検出
２．１動物免疫
ＰＤ－Ｌ１（ＮＰ＿０５４８６２．１）細胞外ドメインタンパク質（義翹神州（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ），１００８４－Ｈ０５Ｈ）を購入して２匹のアルパカ（南昌大佳科技）を免疫する。毎回５００μｇで各アルパカを免疫し、２週間に１回免疫し、合計で４回免疫する。

２．２血清力価の検出
アルパカの免疫が終了した後にアルパカ血清を採取して免疫力価の検出を行う。

免疫力価の測定は、ＥＬＩＳＡ方法によって組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１００８４－Ｈ０５Ｈ）に対する免疫血清の結合能力を測定し、結合抗体の力価に基づいて免疫効果の判定を行う。

具体的な方法は、以下の通りである。

２．２．１抗原コーティング：免疫力価の測定の前日に、抗原組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１をＰＢＳで最終濃度が２μｇ／ｍＬになるまで希釈し、希釈液を得る。得られた３０μｌの希釈液をＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩コーティングする。免疫力価の測定の当日にＰＢＳで３回リンスし、その後、５％脱脂乳を含有するＰＢＳＴで室温で２時間ブロックし、更にＰＢＳで３回リンスする。

２．２．２血清の希釈：別の希釈プレートで免疫されていない陰性血清及び免疫された血清をＰＢＳで希釈し、最初のウェルにおいて２００倍希釈し、残りの７つのウェルにおいて３倍勾配希釈する。

２．２．３抗体反応：希釈された血清を最初のＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１ｈインキュベートし、ＰＢＳで２回リンスした後に１：５０００で二次抗体であるヒツジ抗アルパカ科ＩｇＧ抗体（南京金斯瑞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）から購入）を加える。

２．２．４発色と読み取り：ＰＢＳで上記二次抗体を３回リンスした後、発色液を加えて５分間発色させ、停止液を加えた後、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｅｒＭａｘ１９０）によってＯＤ４５０でプレートを読み取り、結果を表１に示す。

そのうち、ＮＳＹ００４及びＮＳＹ００５の２列は、それぞれ２匹のアルパカを免疫した後の血清を異なる倍数に希釈したＥＬＩＳＡ発色実験の結果であり、陰性血清は、免疫されていないアルパカ血清ＥＬＩＳＡ実験の結果である。表１の結果から、２匹のアルパカの免疫力価ＩｇＧ力価は、いずれも２５６０００に達し、免疫効果が良好であり、次のステップの末梢血免疫抗体ライブラリーの構築に使用できることが分かった。

実施例３アルパカ免疫ライブラリーの構築及び一次スクリーニング
動物の免疫終了後、５０ｍＬのアルパカの新鮮な血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配分離液（ＧＥ，１７１４４００３Ｓ）で末梢血単核細胞（ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌ，ＰＢＭＣ）を分離し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のファージアルパカ免疫ライブラリーの構築を行う。

具体的な方法は、以下の通りである。

採取されたアルパカ血をＰＢＳで１：１（ｖ／ｖ）の割合で希釈し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配分離液を５０ｍｌの遠心分離管に徐々に加え、遠心分離管を傾斜させて管壁に沿って３０ｍＬの希釈されたアルパカ血を徐々に加え、２つの液体が明確な分離界面を保持する。４℃で２０ｍｉｎ遠心分離し、加速３、減速０に保持する。遠心分離後、液面全体は、４つの層に分けられ、上層は血漿混合物であり、下層は赤血球及び顆粒球であり、中層はＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳであり、上層と中層の境界にＰＢＭＣを主とする狭幅帯状白濁層、即ちＰＢＭＣ細胞層がある。ピペットを注意深く使用して中間のＰＢＭＣ細胞を吸引して新しい５０ｍＬの遠心分離管に移す。ＰＢＳで２回リンスし、４℃、１５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ水平に遠心分離し、最後に１．５ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、顕微鏡によってカウントする。

単離されたＰＢＭＣ細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写キット（ＴａＫａＲａ，６２１０Ａ）によって抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。アルパカ抗体の分子形態が一般的な抗体と異なり、軽鎖を含まず、且つ重鎖がＣＨ１を含有しないため、最初にＶＨ前端及びＣＨ２に一般的なプライマーを設計することで、ＰＣＲにより、大きさの異なる２つの断片を得て、タッピングにより小さい目的断片を回収する。そして、一般的なＶＨＨの全ての生殖細胞系列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）のアミノ酸配列をアライメントすることにより、両端がそれぞれＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断部位を含有するＧｅｒｍｌｉｎｅ特異的縮重プライマーを設計し、回収された生成物をテンプレートとして全てのＶＨＨ遺伝子を増幅し、最後に二重消化及び連結によって目的の抗体遺伝子断片をファージディスプレイ用のベクターに挿入する。当該発現ベクター上のＶＨＨ遺伝子のＣ末端は、ファージ発現ベクターにおけるＧＩＩＩ遺伝子に融合されることを指摘しておく。連結生成物は、回収キット（Ｏｍｅｇａ，Ｄ６４９２－０２）によって回収され、最後にエレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）によってコンピテント大腸菌ＳＳ３２０に形質転換され、アンピシリン耐性の２－ＹＴ固体プレートに塗布される。ライブラリーサイズを計算するために、１０μｌのライブラリー菌液に対して１０倍勾配希釈を行い、希釈勾配ごとに２μｌの菌液をプレートにスポットし、プレートに形成されたクローンを計算することで、エレクトロポレーションにより形成された全てのクローンの総数、即ちライブラリーサイズを計算する。この免疫ライブラリーのライブラリーサイズは、１×１０^９である。

このライブラリーサイズに基づき、ライブラリーサイズの１０倍の量の細菌（約２０ＯＤ）を新鮮な２－ＹＴ液体培地に加え、菌液希釈液の初期ＯＤ値が０．０５になるように培地の添加量を調整する。３７℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期まで培養し、この時、細菌数の５０倍の量でＶＳＣＭ１３ヘルパーファージを加え、十分に均一に混合し、３０ｍｉｎ静置し、２２０ｒｐｍの条件下で１ｈ培養し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後にカルベニシリン／カナマイシン二重耐性２－ＹＴ培地に置換し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養する。翌日、１３０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、その上清に２０％のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加え、沈殿してアルパカ免疫抗体ライブラリーに対応するファージを得て、ＰＢＳで１回リンスした後、目的のＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体のスクリーニングに用いる。

ファージのスクリーニングには、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質が使用され、磁気ビーズによるスクリーニング及び免疫管によるスクリーニングという２つの方法が採用され、具体的な方法は、以下の通りである。

３．１磁気ビーズによるスクリーニング
ビオチン標識の組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質をアビジン結合磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入され、製品番号：１１２０５Ｄ）に結合することでスクリーニングを行い、まず、ビオチンで組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ビオチン標識方法は、Ｒｏｃｈｅ社のビオチンタンパク質標識キットの仕様書を参照し、製品番号：１１４１８１６５００１）を標識し、ビオチン標識のＰＤ－Ｌ１タンパク質を磁気ビーズと共にインキュベートし、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を磁気ビーズに結合する。ＰＤ－Ｌ１抗原が結合された磁気ビーズを、ナノボディディスプレイを有するファージライブラリーと共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６～８回リンスした後、非特異的に吸着されたファージを除去し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えて２０ｍｉｎ軽く均一に混合し、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合するナノボディディスプレイファージを溶出する。次に、溶出されたファージで対数増殖期のＳＳ３２０菌体（Ｌｕｃｉｇｅｎ，ＭＣ１０６１Ｆ）に感染させ、ファージで感染したＳＳ３２０菌体をカルベニシリン耐性プレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、翌日に菌体を収集する。ＳＳ３２０菌体を用いてファージを調製し、調製方法の詳細は、以上のライブラリーファージの調製方法を参照する。最終的に得られたファージを２回目のスクリーニングに使用し続け、２回目のスクリーニングの終了時にトリプシンによって溶出する。２回目のスクリーニングにより得られたファージを３回目のスクリーニングに使用し、３回目のスクリーニングの終了時にトリプシンによって溶出する。このように繰り返し、毎回ランダムに選別された１０個のクローンを使用して配列分析を行う。結果から分かるように、３回のスクリーニングにより得られたモノクローナルファージについて、配列決定された単一クローンにおいて、異なるクローンの遺伝子配列が繰り返され、配列の濃縮が明らかであることが証明された。

３．２免疫管によるスクリーニング
免疫管によるスクリーニングは、抗原を免疫管の表面にコーティングし、目的の抗原に結合する抗体ディスプレイファージをスクリーニングすることで行われる。スクリーニングの前日に組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質で免疫管を事前にコーティングし、ＰＤ－Ｌ１抗原が結合された免疫管を、ナノボディディスプレイを有するファージライブラリーと共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６～８回リンスした後、非特異的に吸着されたファージを除去し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えて２０ｍｉｎ軽く均一に混合し、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合するナノボディディスプレイファージを溶出する。次に、溶出されたファージで対数増殖期のＳＳ３２０菌体（Ｌｕｃｉｇｅｎ，ＭＣ１０６１Ｆ）に感染させ、ファージで感染したＳＳ３２０菌体をカルベニシリン耐性プレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、翌日に菌体を収集する。ＳＳ３２０菌体を用いてファージを調製し、調製方法の詳細は、以上のライブラリーファージの調製方法を参照する。最終的に得られたファージを２回目のスクリーニングに使用し続ける。２回目のスクリーニングの終了時にＴｒｙｐｓｉｎによって溶出する。２回目のスクリーニングにより得られたファージを３回目のスクリーニングに使用し、３回目のスクリーニングの終了時にＴｒｙｐｓｉｎによって溶出する。このように繰り返し、毎回ランダムに選別された１０個のクローンに対して配列決定を行ってから配列分析を行う。結果から分かるように、３回のスクリーニング及び配列決定を経た後の単一クローンにおいて、異なるクローンの遺伝子配列が繰り返され、配列の濃縮が明らかであることが証明された。

２つの異なるスクリーニング方法により得られたファージライブラリーに対して単一クローンのスクリーニングを行い、それぞれ磁気ビーズによるスクリーニング及び免疫管によるスクリーニングの３回目の生成物における陽性クローンを選別する。具体的な方法は、以下の通りである。

スクリーニングの前日に組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、翌日に９６ウェルのプレートにファージ誘導上清を調製し、ファージＥＬＩＳＡによってヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する陽性クローンをスクリーニングし、その後、全ての陽性クローンを選別して配列決定及び分析を行い、配列が唯一であるクローンを用いて溶解液を調製し、調製方法は、以下の通りである。前日に当該クローンの菌液を１：１００で５０ｍＬ、３７℃の恒温シェーカーに接種して１４ｈ振盪培養し、常温で１００００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、ＰＨが９．０の１ｍＬのｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ含有のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で細菌を再懸濁し、氷上で３０ｍｉｎ溶解し、４℃で１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集して陽性クローン溶解液を得る。

調製された陽性クローン溶解液を更にフローサイトメトリーレベルで検証し、ヒトＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する候補抗体をスクリーニングする。フローサイトメトリーレベルで検証する方法は、以下の通りである。

１）まず、培養されたヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）ＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

３）対応するウェルに勾配希釈した候補抗体溶解液及び対照抗体希釈液を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

６）ＰＥ標識のフローサイトメトリー抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

抗ＰＤ－Ｌ１ＶＨＨ溶解液サンプルの結合親和性のスクリーニング結果を図１に示す。

図１から明らかなように、示されたクローン番号のＶＨＨ分子は、いずれもＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して一定の親和性を有する。本検出実験は、ただ定性的及び半定量的であるため、どのクローン番号のＶＨＨ抗体分子の親和性がより良いかを確認することができず、更なる実験を行って確認する必要がある。

調製された陽性クローン溶解液に対して更にフローサイトメトリーレベルで遮断スクリーニングを行い、ヒトＰＤ－Ｌ１を特異的に認識してそのＰＤ－１タンパク質への結合を遮断する候補抗体をスクリーニングする。フローサイトメトリーレベルで検証する方法は、以下の通りである。

１）まず、培養されたヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６／ｍＬに調整する。

３）対応するウェルに勾配希釈して得られた濃度勾配が１：１、１：５及び１：２５の候補抗体溶解液及び対照抗体希釈液を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

４）インキュベートされた細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上清を捨て、対応するウェルに２００μＬ加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再懸濁する。

６）対応するウェルにＰＤ－１－Ｆｃタンパク質希釈液（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、細胞を再懸濁して細胞を４℃で３０分間インキュベートする。

７）インキュベートされた細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上清を捨て、対応するウェルに２００μＬ加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再懸濁する。

８）ステップ７）を２回繰り返し、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

９）ＰＥ標識の抗ヒトＩｇＧＦｃフローサイトメトリー抗体（Ａｂｃａｍ）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

１０）３００ｇで遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁する。

１１）ステップ１０）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出する。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体候補分子のブロック実験のスクリーニング結果を図２に示し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳなどの方法による一次スクリーニングにより、スクリーニングされた抗体配列で調製された抗体溶解液にＰＤ１へのＰＤ－Ｌ１の結合の反応に対してブロック効果を有する抗体を含有することが分かり、本発明者は、良好な親和性及び遮断活性を有する候補分子を１０個スクリーニングした。

実施例４キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体の生成及び発現
スクリーニングにより得られた陽性ＶＨＨ候補抗体をヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片と融合し、陽性ＶＨＨ遺伝子配列のＣ末端をヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片遺伝子配列のＮ末端に連結する方法によって融合発現ベクターを構築し、当該融合発現ベクタープラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に形質転換し、発現を誘導してＦｃ断片が融合されたＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体タンパク質を得る。

抗体の発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ一過性トランスフェクション発現系を採用し、培地は（Ｇｉｂｃｏ，Ａ２９１００－０１）であり、トランスフェクションキットは（Ｇｉｂｃｏ，Ａ２９１２９）である。具体的な方法は、以下の通りである。トランスフェクションの前日にＥｘｐｉＣＨＯ細胞を継代し、２５ｍｌの体系で、２５μｇの構築されたプラスミドとトランスフェクション試薬を混合した後に２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞培養物に滴下し、十分に均一に混合し、３７℃で１８～２２時間発現した後、キット内の説明に従ってフィード培地を添加し、フィード後、細胞を３２℃で培養し、トランスフェクション後の５日目に、２回目のフィードを行い、細胞を３２℃で培養し、１０～１２日後、発現された細胞懸濁液を高速で遠心分離して上清を取り、得られた上清を０．２２μｍで濾過した後にＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇアフィニティー精製方法によって精製し、１００ｍＭのグリシン塩（ｐＨ３．０）で目的のタンパク質を溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和する。

実施例５キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体細胞レベルの親和活性検証
得られたＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってその細胞上ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

３）対応するウェルに勾配希釈した候補抗体希釈液及び対照抗体希釈液を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

８）ステップ１０）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出する。

表２に示すように、ＦＡＣＳ実験により、本発明者は、高親和性が高い２つのナノボディ候補分子（ＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０）をスクリーニングし、親和性がいずれも対照抗体よりも高いか又はそれに類似する。

実施例６キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体のＰＤ－１に対する遮断活性の検証
得られたＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってそのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する遮断活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６／ｍＬに調整する。

６）対応するウェルにビオチン標識のＰＤ－１－Ｆｃタンパク質希釈液（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、細胞を再懸濁して細胞を４℃で３０分間インキュベートする。

７）インキュベートされた細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上清を捨て、対応するウェルに２００μＬのＦＡＣＳを加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再懸濁する。

９）ＰＥ標識のストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４３１７－８７）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

表３に示すように、ＦＡＣＳ実験により、本発明者は、実施例５におけるクローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０の２つのナノボディ候補分子がいずれも高い遮断活性を有し、その遮断活性がいずれも対照抗体よりも高いか又は対照抗体に類似することを証明した。

実施例７キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体のＣＤ８０に対する遮断活性の検証
得られたＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってそのＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１に対する遮断活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

６）対応するウェルにビオチン標識のＣＤ８０タンパク質希釈液（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、細胞を再懸濁して細胞を４℃で３０分間インキュベートする。

９）ＰＥ標識のストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４３１７－８７）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

表４に示すように、ＦＡＣＳ実験により、本発明者は、実施例５におけるクローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０の２つのナノボディ候補分子がいずれも高い遮断活性を有し、その遮断活性がいずれも対照抗体よりも高いか又は対照抗体と類似することを証明した。

実施例８キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体の腫瘍細胞での結合活性
ＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体のヒトメラノーマ細胞系Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１６１９）での結合活性を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってその細胞上ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）０．２５％のＥＤＴＡを含有するＴｒｙｐｓｉｎでＡ３７５細胞を消化し、細胞を収集して３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）Ａ３７５細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

６）対応するウェルに各候補抗体及び対照抗体希釈液（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、細胞を再懸濁して細胞を４℃で３０分間インキュベートする。

９）ＰＥ標識の抗ビオチン（ａｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎ）フローサイトメトリー抗体（Ａｂｃａｍ）を加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にし、４℃で３０分間インキュベートする。

１１）ステップ１０）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出し、検出結果を図３に示す。

図３から分かるように、クローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０の２つのナノボディ候補分子のヒトメラノーマ細胞系Ａ３７５細胞での結合活性は、対照抗体に相当する。

実施例９キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体のマウス、サルＰＤ－Ｌ１への結合活性の検証
ＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体とサル、マウスＰＤ－Ｌ１との交差結合活性を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってその細胞上ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたマウスＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞及びサルＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して培地を除去し、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６／ｍＬに調整する。

２）それぞれマウスＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞及びサルＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

ヒトとマウスとの交差反応の検出結果により、クローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１のナノボディ候補分子は、一定のマウスＰＤ－Ｌ１結合活性を有することを示す。

ヒトとサルとの交差反応の検出結果を表５に示し、それから分かるように、クローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０の２つのナノボディ候補分子は、いずれも優れたサルＰＤ－Ｌ１認識活性を有する。

実施例１０キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体のＰＤ－Ｌ１への結合特異性検出
候補分子のＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合特異性を確認するために、ＥＬＩＳＡ法によって候補分子のＢ７ファミリーの他のタンパク質への結合活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

実験の前日にＥＬＩＳＡプレートに３０μＬの最終濃度が２μｇ／ｍＬのＢ７－Ｈ１（即ち、ＰＤＬ１）、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－ＤＣ（以上のタンパク質は、いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入され、製品番号は、それぞれ１００８４－ＨＮＡＨ、１１５５９－Ｈ０８Ｈ、１１１８８－Ｈ０８Ｈ、１０７３８－Ｈ０８Ｈ、１０２９２－Ｈ０８Ｈ－Ｂである）などのタンパク質希釈液を加え、４℃で一晩インキュベートする。翌日にＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回リンスし、その後、１５０μＬの５％ＰＢＳＭを加えてＥＬＩＳＡプレートをブロックし、常温で２時間インキュベートする。更にＰＢＳＴでプレートを３回リンスしてから、３０μＬの候補抗体及び対照抗体の希釈液をＥＬＩＳＡプレートに加え、常温で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴでプレートを３回リンスし、１：７０００で希釈された抗ヒトＩｇＧＦｃ－ＨＲＰ二次抗体を３０μＬ／ウェルで加え、常温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳＴでプレートを６回リンスした後にＴＭＢを加えて発色させ、最後に２ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｅｒＭａｘ１９０）によって４５０ｎＭの波長で読み取り、その結果を表６及び図４に示す。

抗体分子の特異的結合反応の実験検証結果を表６及び図４に示す。

表６及び図４の結果から分かるように、クローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１及びＮＢ２２ｇｂ－１０の２つのナノボディ候補分子は、Ｂ７－Ｈ１以外のＢ７ファミリー分子に対して結合活性を有しておらず、Ｂ７－Ｈ１のみに対して結合活性を有し、この結合特異性は、対照抗体に一致する。

実施例１１キメラＶＨＨ－Ｆｃ抗体のインビトロでの生物学的活性の検証
候補分子がインビトロでＴ細胞を活性化するように刺激する能力を確認するために、本発明者は、インビトロで混合リンパ球反応体系を構築し、具体的な方法は、以下の通りである。

ミルテニーバイオテク単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５０－２０１）によってインビトロでＣＤ１４陽性単核細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離し、インビトロで１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを用いて７日間誘導培養して単核細胞を樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）に誘導し、更にＣＤ４陽性Ｔ細胞とＤＣを１０：１の細胞数比で混合し、細胞に勾配希釈した候補抗体及び対照抗体を加え、３７℃で細胞インキュベータで５日間培養し、７２時間培養した後に細胞上清を取り、ＰＢＳで希釈してからＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットを用いて培養上清におけるＩＬ－２の分泌量を検出する。５日間培養した後に細胞上清を取り、ＰＢＳで希釈してからＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキットを用いて培養上清におけるＩＦＮ－γの分泌量を検出する。

ＩＬ－２の分泌量を検出することにより、本発明者は、図５に示す抗体分子の混合リンパ球反応試験の検証結果を得た。図５から分かるように、本発明のナノボディ候補分子は、免疫反応を活性化することができる。

実施例１２抗体のヒト化改変
インビボでの分子の免疫原性を低減させるために、本発明者は、候補分子に対してヒト化設計を行った。それぞれＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ及びＳｃｈｒoｄｉｎｇｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙＭｏｄｅｌｉｎｇを利用し、相同性モデリング方法によってモデルを構築し、５～１０個の最適な構造ソリューションを選択し、Ｌｏｏｐ領域は、一般的に相同性モデリング方法によってモデルを構築し、例えば、ＣＤＲアミノ酸配列のアラインメント結果により同一性が５０％よりも低いことを示すと、相同性モデリング方法によってＣＤＲ３構造モデルを構築する。ＰＤＢＢＬＡＳＴによって配列が最も類似する１０個の抗体結晶構造モデル（構造分解能が２．５オングストロームよりも高い）を選択し、自動モデリングによるモデルと比べ、最適な構造モデルを選別する。本発明者は、ＮＢ２２Ｄ－２１分子に対して抗体のヒト化改変を行い、２つのヒト化分子を得て、この２つのヒト化改変後の分子番号は、それぞれＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１及びＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２である。

実施例１３ヒト化改変後の誘導体分子のヒトＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞への結合
分子のヒトＰＤ－Ｌ１抗原への結合活性に対するヒト化の影響を検出するために、本発明者は、ＦＡＣＳによって候補分子及びそのヒト化改変後の誘導体分子を検出した。

８）ステップ７）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出し、結果を図６に示す。

図６から分かるように、ヒト化された誘導体分子（即ち、ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１及びＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２）のヒトＰＤ－Ｌ１への結合親和性は、その親分子（即ち、ＮＢ２２Ｄ－２１）に類似する。

実施例１４ヒト化改変された誘導体分子のマウスＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞への結合
分子のマウスＰＤ－Ｌ１抗原への結合の交差活性に対するヒト化の影響を検出するために、本発明者は、ＦＡＣＳによって候補分子を検出した。

１）培養されたマウスＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）マウスＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

４）インキュベートされた細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上清を捨て、対応するウェルに２９９μＬ加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再懸濁する。

８）ステップ７）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出し、結果を図７及び図８に示す。

図７から分かるように、ヒト化改変された誘導体分子のうち、ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１のマウスＰＤ－Ｌ１への結合親和性は、親分子（即ち、ＮＢ２２Ｄ－２１）よりも優れている。

具体的には、図７から分かるように、親分子ＮＢ２２Ｄ－２１及び対照分子ＫＮ０３５に対して、ヒト化改変された誘導体分子ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１は、マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して非常に良好な結合活性を有する。そのうちのＫＮ０３５及びＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１のフローサイトメトリーによるピーク図（図８に示す）を選択し、それから明らかなように、それぞれ２０μｇ／ｍＬのＫＮ０３５及びＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１を用いてマウスＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞に結合し、ＦＡＣＳ検出データにより、ＫＮ０３５は、ＣＨＯ細胞表面のマウスＰＤ－Ｌ１（図８Ａ）を識別することできないが、ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１は、ＣＨＯ細胞表面のマウスＰＤ－Ｌ１（図８Ｂ）を非常に良好に識別することができる（注：各図における境界線は、設定された蛍光強度閾値の位置である）。

実施例１５ヒト化改変された誘導体分子のＰＤ－１に対する遮断活性の検証
ヒト化された誘導体分子を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってそのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する遮断活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１１）ステップ１０）を２回繰り返し、ウェルにＦＡＣＳ緩衝液を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸＡＯＯ－１－１１０２）によって検出し、結果を図９に示す。

図９から分かるように、ＰＤ－１タンパク質のＰＤ－Ｌ１への結合に対するヒト化改変された誘導体分子（即ち、ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ１及びＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２）の遮断活性は、その親分子（即ち、ＮＢ２２Ｄ－２１）及び陽性対照ＫＮ０３５に相当する。

実施例１６ヒト化分子の親和性成熟
抗体分子のヒトＰＤ－Ｌ１抗原への結合親和性及び阻断活性を向上させるために、本発明者は、ヒト化改変後に得られた抗体誘導体分子に対して親和性成熟の設計を行った。

親和性成熟は、単一部位飽和突然変異、多部位組み合わせ突然変異、鎖置換などの方法を採用し、Ｔｒｉｍプライマー技術によってＣＤＲ領域に対してプライマーを指向的に設計し、親和性成熟抗体ライブラリーを構築し、ファージディスプレイ技術によって親和性成熟後の分子をスクリーニングする。単一クローンを得た後にＶＨＨ溶解液を調製し、ＦＡＣＳによってクローンの親和性及び遮断活性を検出する。スクリーニングによって親よりも優れる可能性のある４つのクローンを得て、それぞれＳＹ０１－２０１、ＳＹ０１－２０８、ＳＹ０１－ＮＢ－００４及びＳＹ０１－ＮＢ－０２７－Ｍである。

具体的な実験結果を図１０及び図１１に示し、その細胞溶解液の定性／半定量結果から大体分かるように、ＳＹ０１－２０１、ＳＹ０１－２０８、ＳＹ０１－ＮＢ－００４及びＳＹ０１－ＮＢ－０２７－Ｍという４つの分子の結合活性及び遮断活性は、いずれも親ＮＢ２２Ｄ－２１分子に類似する。

実施例１７ヒト化分子の創薬可能性改変
分子の創薬可能性を最適化し、タンパク質の折り畳み、活性及び機能に対する潜在的翻訳後修飾部位の影響を回避するために、本発明者は、ヒト化改変後に得られた抗体誘導体分子ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２に対して創薬可能性改変設計を行った。

創薬可能性改変は、点変異を用いて潜在的翻訳後修飾部位に対してランダムに変異させ、創薬可能性改変抗体ライブラリーを構築し、ファージディスプレイ技術によって創薬可能性改変後の分子をスクリーニングする。単一クローンを得た後にＶＨＨ溶解液を調製し、ＦＡＣＳによってＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯでのクローンの遮断活性を検出する。

一次スクリーニングにより、本発明者は、１０個の創薬可能性改変後の変異体分子を得て、それぞれＳＹ０１－Ｄ２１－３、ＳＹ０１－Ｄ２１－４、ＳＹ０１－Ｄ２１－５、ＳＹ０１－Ｄ２１－６、ＳＹ０１－Ｄ２１－８、ＳＹ０１－Ｄ２１－１７、ＳＹ０１－Ｄ２１－２１、ＳＹ０１－Ｄ２１－２４、ＳＹ０１－Ｄ２１－３８及びＳＹ０１－Ｄ２１－４７であり（図１５においてそれぞれ３、４、５、６、８、１７、２１、２４、３８及び４７と略記され、親分子は、ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２であり、Ｄ２１－Ｖｈ２と略記され、アイソタイプ対照（ｉｓｏｔｙｐｅ）がヒトＩｇＧ１である）、更なるスクリーニングにより、本発明者は、親よりも優れる可能性のある５つのクローンを得て、それぞれＳＹ０１－Ｄ２１－４、ＳＹ０１－Ｄ２１－８、ＳＹ０１－Ｄ２１－１７、ＳＹ０１－Ｄ２１－２４及びＳＹ０１－Ｄ２１－４７である。

実験結果を図１５に示し、その細胞溶解液の定性／半定量結果から分かるように、ＳＹ０１－Ｄ２１－４、ＳＹ０１－Ｄ２１－８、ＳＹ０１－Ｄ２１－１７及びＳＹ０１－Ｄ２１－２４という４つの創薬可能性改変候補分子の阻断活性は、いずれも親分子ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２と類似する。なお、ＳＹ０１－Ｄ２１－４７の細胞発現量が高くないため、後続の検出において当該クローンを選択しなかった。

実施例１８創薬可能性候補クローンの全長構築及びサンプルの生成
スクリーニングにより得られた陽性ＶＨＨ候補抗体ＳＹ０１－Ｄ２１－４、ＳＹ０１－Ｄ２１－８、ＳＹ０１－Ｄ２１－１７及びＳＹ０１－Ｄ２１－２４をヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片と融合し、陽性ＶＨＨ遺伝子配列のＣ末端をヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片遺伝子配列のＮ末端に連結する方法によって融合発現ベクターを構築し、当該融合発現ベクタープラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に形質転換し、発現を誘導してＦｃ断片が融合された４つのＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体タンパク質を得て、それぞれＮＢ２２Ｄ－２１－４、ＮＢ２２Ｄ－２１－８、ＮＢ２２Ｄ－２１－１７及びＮＢ２２Ｄ－２１－２４と呼ぶ。

実施例１９創薬可能性改変後の候補抗体のヒトとサルＰＤ－Ｌ１への結合活性の検証
創薬可能性改変後に得られた４つのＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってそれと細胞上のヒトとサルＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたヒトとサルＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）ヒトとサルＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞をそれぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

表７に示すように、４つの候補分子のヒトとサルＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯでの結合活性を比較し、本発明者は、スクリーニングによりヒトとサルＰＤ－Ｌ１のいずれに対しても高い高親和性を有する２つのナノボディ候補分子ＮＢ２２Ｄ－２１－４及びＮＢ２２Ｄ－２１－２４を得た。

実施例２０創薬可能性改変後の候補抗体のＰＤ－１に対する遮断活性の検証
得られたＶＨＨ－Ｆｃ候補抗体を評価するために、ＦＡＣＳ方法によってそのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する遮断活性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

表８に示すように、ＦＡＣＳ実験により、本発明者は、実施例１９におけるクローン番号がＮＢ２２Ｄ－２１－４及びＮＢ２２Ｄ－２１－２４の２つのナノボディ候補分子がいずれも高い遮断活性を有し、その遮断活性がいずれもＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２抗体よりも高いことを証明した。

実施例２１創薬可能性改変後の候補抗体のＰＤ－Ｌ１への結合特異性検出
創薬可能性改変後の候補分子のＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合特異性を確認するために、ＦＡＣＳ法によって候補分子の細胞への結合特異性を検出し、具体的には２つの部分に分け、第１の部分の具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたＪｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液（緩衝液成分：１＊ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ＋２％ＢＳＡ）で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞をそれぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

５）ステップ４）を４回繰り返し、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

以下の表９に示すように、ＦＡＣＳ検出結果により、本発明者は、陽性及び陰性をそれぞれ「＋」（結合があることを表す）及び「－」（結合がないことを表す）で表し、表９から分かるように、ＮＢ２２Ｄ－２１－４及びＮＢ２２Ｄ－２１－２４クローンのうち、前者は、２つの細胞のいずれに対しても非特異的結合がなく、後者は、２つの細胞のいずれに対しても高い非特異的結合を有し、且つ対照抗体は非特異的結合を示さなかった。

第２の部分の実験において、本発明者は、ＦＡＣＳ方法によってＮＢ２２Ｄ－２１－４クローンのＢ７ファミリータンパク質への結合特異性を検出し、具体的な方法は、以下の通りである。

１）培養されたＢ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上清を捨て、配合されたＦＡＣＳ緩衝液（緩衝液成分：１＊ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ＋２％ＢＳＡ）で細胞を再懸濁し、カウントして細胞懸濁液の密度を２×１０^６個／ｍＬに調整する。

２）Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５細胞をそれぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに加え、３００ｇで遠心分離して上清を捨てる。

以下の表１０に示すように、ＦＡＣＳ検出結果により、本発明者は、陽性及び陰性をそれぞれ「＋」（結合があることを表す）及び「－」（結合がないことを表す）で表し、表１０から分かるように、ＮＢ２２Ｄ－２１－４は、複数の細胞のいずれに対しても非特異的結合がなく、且つ対照抗体は非特異的結合を示さなかった。

実施例２２ＮＢ２２Ｄ－２１－４抗体のインビトロＭＬＲ活性検証
候補分子がインビトロでＴ細胞を活性化するように刺激する能力を確認するために、本発明者は、インビトロで混合リンパ球反応体系を構築し、具体的な方法は、以下の通りである。

ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌量を検出することにより、本発明者は、図１６に示す抗体分子の混合リンパ球反応試験の検証結果を得る。図１６から分かるように、本発明のナノボディ候補分子ＮＢ２２Ｄ－２１－４は、免疫反応を活性化することができる。

実施例２３候補抗体の二次親和性成熟
抗体分子のマウスＰＤ－Ｌ１抗原への結合親和性及び遮断活性などを更に向上させるために、ヒト化改変後に得られた抗体誘導体分子に対して親和性成熟の設計を行った。

本回の親和性成熟は、単一部位飽和突然変異方法を採用し、Ｔｒｉｍプライマー技術によってＣＤＲ領域に対してプライマーを指向的に設計し、親和性成熟抗体ライブラリーを構築し、続いてファージディスプレイ技術によって親和性成熟後の分子をスクリーニングする。マウス抗原を利用してそれぞれ親和性成熟ライブラリーに対して集団選択及び一次スクリーニングを行い、単一クローンを得た後に全長抗体を構築して発現し、ＦＡＣＳによって候補クローンの親和性、ヒトとマウスの交差及び遮断活性を検出する。スクリーニングによって活性が元の親よりも優れた５つのクローンを得て、それぞれＮＢ２２Ｄ－２１－４５－１０６、ＮＢ２２Ｄ－２１－１２３、ＮＢ２２Ｄ－２１－１５４、ＮＢ２２Ｄ－２１－９４及びＮＢ２２Ｄ－２１－１０９である。

具体的な実験結果を図１２、図１３及び図１４に示し、結果から分かるように、ＮＢ２２Ｄ－２１－４５－１０６、ＮＢ２２Ｄ－２１－１２３、ＮＢ２２Ｄ－２１－１５４、ＮＢ２２Ｄ－２１－９４及びＮＢ２２Ｄ－２１－１０９という５つの分子の結合活性及び遮断活性は、いずれも対照ＮＢ２２Ｄ２１－４サンプルに高度に類似するか又はそれよりも優れ、且つマウスとの交差活性も親分子ＮＢ２２Ｄ－２１－ｈｕＶＨ２よりも優れた。実施例１５及び実施例１７の試験結果から分かるように、ＮＢ２２Ｄ２１－４分子は、親ＮＢ２２Ｄ－２１分子と比べて結合活性及び遮断活性がより優れ、親分子の親和性成熟後に得られた５つの分子の親和性及び遮断活性は、親ＮＢ２２Ｄ－２１分子に高度に類似するか又はそれよりも優れ、且つマウスとの交差活性は、親分子及び対照抗体ＫＮ０３５よりも優れたことを確認することができる。

当業者であれば、本発明は、その精神又は核心的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で実施されてもよいことを更に理解できる。本発明の前記説明がその例示的な実施形態のみを開示したため、他の変化は本発明の範囲内に属すると考えられることを理解すべきである。従って、本発明は、ここで詳しく説明された特定の実施形態に限定されない。逆に、添付される特許請求の範囲を参照して本発明の範囲及び内容を指示すべきである。

Claims

（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１と８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２と８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２と８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：３又は１２に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）式ＲＴＤＳＮＩＸ_１ＧＭＨで示され、Ｘ_１はＨ、Ｆ又はＮであるＣＤＲ１、
（ｉｉ）式ＴＩＦＩＤＸ_２ＮＴＸ_３で示され、Ｘ_２はＧ、Ｌ又はＡであり、Ｘ_３はＩ又はＬであるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）式ＤＶＳＧＹＧＲＸ_４で示され、Ｘ_４はＡ又はＹであるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：７からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：８からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：９を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：９からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２０を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：５からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２１を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３からなるＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８からなるＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３０を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０からなるＣＤＲ１、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１からなるＣＤＲ２、及び
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を含むか、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３からなるＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むＦＲ領域を更に含み、
前記ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４とＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３とは、前記重鎖可変領域において交互に配列されて、Ｎ末端からＣ末端までＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である構造を形成する、
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記ＦＲ領域が、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２；
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、
を含む、請求項１８に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記ＦＲ領域が、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、
を含む、請求項１８に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記ＦＲ領域が、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に示すアミノ酸配列を含むＦＲ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に示すアミノ酸配列を含むＦＲ２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に示すアミノ酸配列を含むＦＲ３、
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び
（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に示すアミノ酸配列を含むＦＲ４、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に比べて２つ以下（例えば、０つ、１つ及び２つ）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換の差異を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４、
を含む、請求項１８に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の同一性を有し、
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持している、
アミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３６～５２のいずれか１つのアミノ酸配列に比べて１つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）を有し、
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持している、
アミノ酸配列を含み、
前記１つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（例えば、保存的置換）は、５つ以下、好ましくは３つ以下である、
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記ＰＤ－Ｌ１結合分子が、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、又は創薬可能性改変後の分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記ＰＤ－Ｌ１結合分子が、単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のＦｃドメイン、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、又は蛍光タンパク質からなる群より選ばれる別の分子に融合されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
前記重鎖可変領域が、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４）のＦｃドメインに融合されている、請求項２７に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子。
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
請求項２９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
請求項３０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む、薬物組成物。
宿主細胞において、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするヌクレオチド配列を発現させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子を産生するステップと、
前記宿主細胞から前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を単離するステップと、
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子の調製方法。
治療的に有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を被験者に投与するステップを含む、被験者におけるＰＤ－Ｌ１に関連する疾患の予防又は治療用方法。
前記被験者が、マウス又はヒト、好ましくはヒトである、請求項３４に記載の方法。
前記ＰＤ－Ｌ１に関連する疾患が、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、及びマイクロサテライト不安定性固形腫瘍からなる群より選ばれる疾患である、請求項３４に記載の方法。
１つ以上の請求項１～２８のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を含む容器を含む、被験者におけるＰＤ－Ｌ１に関連する疾患の予防又は治療用キット。