CN103930128A

CN103930128A - 组成型活性uPAR变体及其在抑制性抗体的生成与分离中的应用

Info

Publication number: CN103930128A
Application number: CN201280038620.3A
Authority: CN
Inventors: N·西顿纽斯; S·甘地
Original assignee: IFOM FOND ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE
Current assignee: IFOM FOND ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE; IFOM Fondazione Istituto FIRC di Oncologia Molecolare
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2014-07-16
Also published as: US20140161803A1; JP2014529581A; AU2012293720A1; EP2739305A1; WO2013020898A1; BR112014002659A2; IL230427A0; CA2842281A1

Abstract

本发明涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的变体，所述变体显示显著增加的玻连蛋白(VN)结合活性，这可能因VN结合位点的更有效暴露所致。本发明还涉及针对所述uPAR变体产生的抗体，其能够结合uPAR的VN结合位点，然后作为uPAR功能抑制剂起作用，作为VN活化的uPAR功能的功能拮抗剂起作用。在本发明中，此类抗体是单克隆、多克隆抗体，其合成或重组衍生物，如来自噬菌体展示文库的合成抗体(scFv)。本发明的抗体作为竞争性拮抗剂起作用。

Description

组成型活性uPAR变体及其在抑制性抗体的生成与分离中的应用

背景技术

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR，也称为CD87)是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着子固定在质膜上的膜糖蛋白。所述尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在生理学过程(例如伤口愈合、炎症和干细胞动员)以及严重病理学病症(例如HIV-1感染、肿瘤侵入和转移)中起重要作用。所述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)是在炎症过程中和几乎所有人类癌症中过表达的质膜受体。uPAR在肿瘤细胞粘附、迁移、侵入和增殖中的重要作用使该受体成为癌症治疗中吸引人的药物靶点。就抑制肿瘤生长而言，已经或正在开发抑制uPA系统的若干治疗方案。uPAR除在调节细胞外周蛋白水解中的明确的作用以外，其还通过与胞外基质中存在的蛋白质(包括玻连蛋白(VN))相互作用来调节细胞的粘附、迁移和增殖。

尽管充分记录了与VN相互作用的重要性(Madsen等,2007；Smith等,2008)，该相互作用对uPAR的信号转导活性至关重要，但该相互作用在体内的重要性仍未经阐明。

定向VN相互作用是必要的，并且足以引发uPAR诱导的细胞形态、迁移以及定向侧接蛋白-蛋白相互作用的独立信号传导的变化。uPAR和VN之间的单独相互作用可能是由uPAR引发的多种蛋白质水解非依赖性生物作用的原因。开发所述uPAR/玻连蛋白相互作用的抑制剂是另一个吸引人的靶标，并且可从玻连蛋白的结合uPAR的生长调节素B结构域开始，其为天然且有力的uPAR/玻连蛋白相互作用拮抗剂。

有数个国际申请公开了尿激酶受体的肽配体，例如WO01/17544。

WO97/35969公开了能够结合uPAR并抑制整联蛋白与玻连蛋白结合的肽。该文献并未提及uPA结合。所述文献中没有确定所述肽在uPAR中的结合位点，并且没有关于所述肽的功能阻断活性的数据。

WO2008/073312涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体表位和由其衍生的单克隆抗体。该文献公开了对尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)具有特异性的抗体及其抗原结合片段、以及它们在癌症治疗或预防中的用途。具体地，所述公开的抗体对uPAR上的特定表位具有特异性。WO2008/073312中描述的抗体识别的表位与本发明所述那些不重叠。

Rabbani SA等(Neoplasia(2010)12,778-788)测试了给予单克隆抗uPAR抗体(ATN-658)对体外和体内前列腺癌发展的影响。ATN-658(小鼠IgG1)能够以高亲和性结合uPAR的D2D3(K_d约为1nM)，不抑制uPA与uPAR的结合，并且甚至能够与结合了uPA的uPAR结合。本研究中使用的抗体(ATN-658)在WO2008/073312中有所描述。由ATN-658抗体识别的表位与本发明描述的那些不重叠。所述ATN-658抗体不是uPAR/玻连蛋白相互作用的竞争性拮抗剂，因为它不与uPAR中的玻连蛋白结合位点结合。uPAR中与所述ATN-658抗体结合的表位和另一种透彻研究的单克隆抗体R2相似或相同(Sidenius等.JBC(2002)27727982-90)。ATN-658与完整的uPAR和截短的D2D3受体的结合性一样好。因此，其中所述的抗体不与完整uPAR优先结合。

WO2005/116077鉴定了对二元uPA-uPAR复合物、对含uPA-uPAR的三元复合物以及对uPAR与除uPA以外的蛋白质(例如整联蛋白)的复合物具有特异性的抗体或其它配体。这些抗体抑制uPA和uPAR的复合物与其它分子间的相互作用。此类抗体或其它配体被用在诊断和治疗方法，特别是抗癌的诊断和治疗方法中。所述文献涉及不抑制玻连蛋白结合但抑制玻连蛋白成分组装的配体；此外，它们识别的表位与本文所述那些不重叠。

WO2006/094828公开了优先识别uPAR受体的截短形式和可溶形式(D2D3)的抗体。其中所述的抗体不优先结合完整uPAR。

CN101050237公开了能够阻断uPA和uPAR之间相互作用的化合物及其应用。所述化合物包括uPA的ATF、ATF片段、uPAR片段、抗ATF抗体和抗uPAR抗体。所述化合物可阻断uPA和uPAR之间的相互作用，并且可用于制备预防和治疗动脉粥样硬化所用的药物。

Tressler RJ等人(APMIS.1999年1月；107(1):168-73)公开了基于人和鼠尿激酶的生长因子结构域的尿激酶受体拮抗剂。此类拮抗剂显示对它们的同源受体具有亚纳摩尔级亲和力。通过制备与人IgG恒定区的融合体来进一步修饰这些分子，导致具有高亲和性和体内长半衰期的分子。通过噬菌体展示和肽类似物合成的组合已获得较小的肽抑制剂。所有这些分子抑制uPA的生长因子结构域与uPA受体的结合并且增强uPA受体与玻连蛋白的结合。

Gardsvoll H等，(J Biol Chem,2011年9月23日；286(38):33544-56)提出一种使uPA和玻连蛋白协作以加强在玻连蛋白基质上的uPAR依赖性板状伪足引入的模型；这就暗示着靶向uPAR功能的药物开发，即，表位定位的单克隆抗体。该研究中被研究的抗体都不阻断玻连蛋白在uPA的存在下结合uPAR。

因此，需要优先结合完整uPAR的抗体以作为uPAR功能的有力抑制剂。

发明内容

本发明涉及所述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的独特变体，其显示显著增加的玻连蛋白(VN)结合活性(表观Kd增加>10.000倍)，这可能是因更有效地暴露了VN结合位点所致。

作者表示，针对所述uPAR变体产生的单克隆抗体是uPAR功能的有力抑制剂。抗体结合表位作图显示，这些抗体与uPAR的VN结合位点结合，这将它们分类为竞争性拮抗剂。

作者还显示使用上述uPAR变体从噬菌体展示库分离合成的抗体(scFv)是uPAR的功能抑制剂。所述受抑制的功能是：细胞粘附(图11)和因而的细胞迁移和细胞增殖(其为与细胞粘附相关的下游事件)。这些功能是VN依赖性的。

发明详述

本发明的目的是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体分子，其相比野生型分子具有增强的VN结合活性。

本发明的uPAR变体分子优选包含与以下部分连接的野生型uPAR氨基酸序列：

a)连接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生长因子样结构域(GFD)序列，和/或

b)连接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗体分子的Fc区域的链，

其中，如果Fc区域的所述链存在，则所述uPAR变体分子是二聚体。

就“野生型uPAR氨基酸序列”而言，其意在指保持VN结合活性的全长野生型蛋白质或其片段的序列。

在一个优选实施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸32-92组成的序列，或者基本由SEQ ID NO:2的成熟muPAR的氨基酸32-93组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

更优选地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271组成的序列，或者基本由SEQ ID NO:2的成熟muPAR的氨基酸3-270组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

甚至更优选地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277组成的序列，或者基本由SEQ ID NO:2的成熟muPAR的氨基酸1-273组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

在本发明另一个优选实施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQID NO:1或SEQ ID NO:2组成的序列，或由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。

在本发明中，uPA的GFD序列优选包含基本由SEQ ID NO:3的人uPA的GFD的氨基酸11-42组成的序列，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43组成的序列，或来自GDF直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

在本发明的uPAR变体分子中，uPA的GFD序列优选基本以下物质序列组成：SEQ ID NO:3的人uPA的GFD序列，或SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD序列，或来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。

在本发明中，所述Fc区域的链优选是人源性并且包含基本由SEQ ID NO:5组成的序列，或所述Fc区域的链优选是小鼠源性并且包含基本由SEQ ID NO:6组成的序列或来自Fc区域的链直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。

在本发明的uPAR变体分子中，所述Fc区域的人链(human chain)优选基本由SEQ ID NO:5组成，或者所述小鼠Fc区域优选由SEQ ID NO:6组成，或由来自Fc区域人链的直系同源基因的对应区域编码的多肽组成，或其功能突变体或衍生物或类似物。

在一个优选实施方式中，本发明的uPAR变体分子还包含：

a)在uPA的GFD序列和野生型uPAR序列的N末端之间的第一接头区域，和/或

b)在抗体分子Fc区域的链和野生型uPAR序列的C末端之间的第二接头区域。

优选地，所述第一接头区域基本由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列组成。

所述第二接头区域优选基本由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11的序列组成。

在一个优选实施方式中，所述uPAR变体分子包含的序列基本具有SEQ IDNO:12、13、14、15、16或17的序列。

本发明的另一个目的是本发明的uPAR变体分子作为抗原在获得具有uPAR功能拮抗剂活性的特异性抗体中的应用，或在选择所述抗体的重组体或合成的抗原结合片段中的应用。

本发明的另一个目的是能够结合上述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段优选具有uPAR功能拮抗剂活性。

所述抗体可用于人类治疗应用。所述抗体通常是完全人抗体，或嵌合或人源化的，以在给予患者时使针对所述抗体的免疫应答的风险最小化。如本文所述，可从此类抗体设计或衍生出其它抗原结合分子，例如，抗原结合抗体片段、抗体衍生物和多特异性分子。

此类抗体的抗体结合片段，以及包含此类抗原结合片段的分子，包括工程改造的抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子等，也是本发明的目的。

在一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段能够结合uPAR分子的表位，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸残基中的至少一种。

优选地，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含如下至少一个重链互补决定区(CDRH3)氨基酸序列，所述重链互补决定区(CDRH3)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21或25的氨基酸90-102、SEQ ID NO:24以及SEQ ID NO:22或23的氨基酸90-101；和/或如下至少一个重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列，所述重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57；和/或如下至少一个重链互补决定区(CDRH1)氨基酸序列，所述重链互补决定区(CDRH1)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21或24的氨基酸22-26、SEQ ID NO:25的氨基酸17-26。

优选地，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含如下至少一个轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列，所述轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68或69，和SEQ ID NO:74或85的氨基酸80-87；和/或如下至少一个轻链互补决定区(CDRL2)氨基酸序列，所述至少一个轻链互补决定区(CDRL2)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸41-47；和/或至少一个轻链互补决定区(CDRL1)氨基酸序列，所述轻链互补决定区(CDRL1)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸15-23。

在一个优选实施方式中，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、分别与SEQ ID NO:18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及分别与SEQ ID NO:18、19、20或21的氨基酸90-102或SEQ ID NO:24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。

在另一个优选实施方式中，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含与SEQ ID NO:25的氨基酸17-26具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、与SEQ ID NO:25的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:25的氨基酸90-102具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。

在又一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段还包含与SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRL1氨基酸序列、分别与SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分别与SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。

在又一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段还包含：与SEQ ID No.18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、分别与SEQ ID No.18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列、分别与SEQ ID NO:18、19、20或21的氨基酸90-102，或SEQ ID NO:24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:66、65、68、67或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRL1氨基酸序列、分别与SEQ ID NO:66、65、68、67或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分别与SEQ IDNO:66、65、68、67或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。

在另一方面，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ.ID NO:18、19、20、21、24和25，所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQID NO:65、66、67、68或69。

在一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、19、20、21和24，所述轻链可变区包含与分别选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、65、68、67和69。

在本发明中，“至少80%相同性”指所述相同性可以是与提及序列的至少80%或至少85%或90%或95%或100%的序列相同性。

优选地，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段是单克隆抗体或嵌合或人源化的，或去免疫化的或完全人抗体。

本发明的又一个目的是作为药物使用的上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，特别是用于癌症治疗，优选是前列腺癌治疗。

本发明的另一个目标是编码上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，或与上述核酸杂交，或由其简并序列组成的核酸分子。本发明的另一个目的是编码本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段的表达载体。本发明的另一个目的是包含上述核酸的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞产生本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。

本发明的另一个目的是产生本发明抗体、其重组体或合成的抗原结合片段的方法，所述方法包括培养产生上述抗体的细胞并从细胞培养物回收所述抗体。

在本发明中，公开的CDR的突变体可通过使所述CDR序列中的一个或多个氨基酸突变来产生。已知合适位于CDR中的单氨基酸取代就足可改善亲和性。研究人员已采用定点突变来使一些免疫球蛋白产物的亲和性增加约10倍。这种通过使CDR突变来增加或减少(即，调节)抗体亲和性的方法是常识(参见，例如，Paul,W.E.,1993)。因此，使本发明CDR发生氨基酸取代、缺失或添加以增加或减少(即，调节)结合亲和性或特异性也在本发明的范围内。

简洁起见，可用以下名称来表示本发明的优选抗体：10H6(包含SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:65)、8B12(包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:66)、13D11(包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:67)、19.10(包含SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:68)、AL6(包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:69)(如图9所示)、OMD4(包含SEQ ID NO:25)(如图22所示)。虽然本发明着眼于此类抗体以作为本发明的示例，但本领域普通技术人员应理解，一旦确定本公开内容，其它类似的抗体及其抗体片段，以及这些类似抗体的抗体片段的产生和使用都落在本发明范围内。此类类似抗体可由本领域技术人员通过合理量的实验来产生。

另优选所述抗体是含有所述表位结合区的scFv、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片段、多聚体抗体、肽或蛋白水解片段。优选所述scFv片段包含

a)SEQ ID NO:22和/或74(本文以名称3B6表示，如表3所示)或b)SEQ IDNO:23和/或85(本文以名称3C10表示，如表3所示)。

包含本发明抗体的试剂盒或其它物品也是本发明的部分。

本发明的另一个目的是包含上述至少一种抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，以及合适的稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。所述组合物包含有效量的所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。药物组合物在该领域中是常规的，并且可由本领域技术人员基于一般常识来制备。包含所述抗体和/或其片段和/或重组衍生物和/或偶联物与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体混合的药物组合物包括在本发明的范围内。

治疗和/或预防对象内癌症的方法也是本发明的目的，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量的上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。本发明的一个目的是减少和/或抑制uPAR的方法，所述方法包括给予有效量的上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。

本发明提供包含治疗有效量的本文公开的抗体、pH保持在约4.5～约6.5的缓冲液和可任选的表面活性剂的制剂。所述制剂典型地用于本发明公开的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其活性浓度原则为约0.1mg/ml～约100mg/ml。在某些实施方式中，所述抗体、其重组或合成抗原结合片段的浓度是约0.1mg/ml～1mg/ml；优选为1mg/ml～10mg/ml，优选为10～100mg/ml。出于本文目的，“药物组合物”是适合且合适给予哺乳动物，尤其是人的药物组合物。因此，所述组合物可用于治疗哺乳动物中的疾病或病症。此外，所述组合物中的抗体已经过一次或多次纯化或分离步骤，从而已将可能对其治疗应用产生干扰的污染物分离在外。所述药物组合物通常包含治疗性的蛋白质和药学上可接受的运载体或稀释剂。所述组合物通常是无菌的，并且可被冻干。下文对药物制备进行更详细的描述。可通过使具有所需纯度的抗体和可任选的生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)第16版，Osol,A.编，1980)混合来制备冻干制剂或水溶液形式的所述一种或多种抗体的治疗制剂。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂就使用的剂量和浓度而言是对接受者无毒的，并且可包括缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、肽、蛋白质、亲水性聚合物、螯合剂(例如EDTA)、糖类、成盐的反荷离子(如钠)；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂(例如或聚乙二醇(PEG))。活性成分也可包入通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入乳浊液(macroemulsion)中。此类技术可参见《雷明顿药物科学》第16版，Osol，A.编(1980)。用于体内给予的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。

在另一个实施方式中，就疾病预防或治疗而言，本发明的一种或多种抗体的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、所述疾病的严重性和疗程、所述抗体是否以预防或治疗目的给予、先前治疗、患者的临床史和对所述抗体的应答，以及主治医师的判断力。所述抗体适合于以一次或经一系列治疗给予所述患者。

根据疾病的类型和严重性，给予患者的抗体或其片段的初始候选剂量是约1μg/kg～15mg/kg，例如，通过一次或多次分开给予或通过连续输注来给予。就经数天或更长时间的重复给予而言，根据所述病症，使所述治疗持续直至疾病症状得到所需的抑制。然而，也可采用其他剂量方案。可通过常规技术和方法来容易地监测该治疗进展。所述抗体组合物应以遵循良好医学实践的方式来制备、配剂和给予。本发明的抗体/衍生物可通过任何合适的途径给予。这包括(但不限于)腹膜内、肌肉内、静脉内、皮下、关节内、气管内、口服、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤给予。就该范围考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、所述病症的起因、试剂的递送位点、给予方法、给予安排，以及医学从业人员已知的其它因素。待给予的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑来决定，并且是所需的最小量，以预防、改善或治疗疾病或病症。所述抗体不需要，但可任选地与一种或多种当前使用的试剂一同配制以预防或治疗所针对的病症。此类其它试剂的有效量取决于所述制剂中抗体的量、病症或治疗类型，以及上述其它因素。

在本发明中，抗体指

a)单克隆、多克隆或嵌合的，或人源化的，或去免疫的，或亲和性成熟的抗体，或完全人抗体或scFv；

b)其重组体或合成的抗原结合片段，以及包含此类抗原结合片段的分子，包括工程改造的抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子。

本文的术语“抗体”以其最广泛含义使用，并且涵盖不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段(前提是它们显示所需的抗原结合活性)。

“抗体片段”指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结合与所述完整抗体结合的抗原。

抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链部分来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同的来源或物种的抗体。

本文术语"Fc区"优选用于定义抗体的C末端区域，优选是免疫球蛋白，更优选是人IgG，含有至少恒定区的部分的重链，更优选用于定义人IgG铰链和恒定区(hFc)或小鼠IgG铰链和恒定区(mFc)。该术语也包括来自其它免疫球蛋白类型和/或物种的，形成二聚体或寡聚体的类似序列。所述术语还包括天然序列Fc区和变体Fc区。

术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括"转化株"和"转化细胞"，其包括最初转化的细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量可不与亲本细胞完全相同，并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代。

“人抗体”是具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体，或具有的氨基酸序列来源于非人来源但使用人抗体库的抗体，或具有其它编码人抗体的序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化的”抗体指含有来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化的抗体将基本包含至少一个、通常两个可变结构域的全部，其中，全部或基本全部的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本全部的FR对应于人抗体的那些。人源化的抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体的“人源化形式”，例如，非人抗体，指已经过人源化的抗体。

“去免疫化的”抗体是基于HLA结合(T细胞刺激的基本要求)被破坏的免疫原性降低的抗体。

本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群的抗体，即，除可能的变体抗体(例如少量存在的包含天然发生的突变或在单克隆抗体制备生产过程中出现的变体)以外，所述群包含的单独抗体是相同的和/或结合相同的表位。不同于通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体均针对抗原的单一决定簇。因此，定语"单克隆"表明的抗体特征在于获自基本均一的抗体群，而不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过不同技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。

与参照多肽序列相关的"氨基酸序列相同性百分率(%)"被定义为，在对齐所述序列并引入缺口（如有需要）以达到最大序列相同性百分率之后，候选序列中与参照多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率，并且认为任何保守性取代都不作为所述序列相同性的部分。以测定氨基酸序列相同性百分率为目的的对齐可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定合适的参数供于对齐序列，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。

术语"药物制剂"指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。

本文中所用的“治疗”(及其语法变化形式)指企图改变受治疗的个体的自然病程，并且可供预防或在临床病理学的病程中进行的临床介入。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。在一些实施方式中，本发明的抗体用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。

本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段可以与分子偶联，所述分子优选是治疗剂。

通过参考下图的非限制性实施例来描述本发明。

图1：分别描述三种uPAR变体：uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc(作为对照)的结构域结构的卡通图。(A)描述uPAR-hFc(含有人Fc标签的uPAR的可溶性二聚体形式)的结构的卡通图。uPAR-hFc(序列1，对应于SEQ ID NO:14)由人uPAR(序列4的全部序列，对应于SEQ ID NO:1)的残基1-277(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277、结构域D1、D2和D3)、接头区(序列1B，对应于SEQ ID NO:9)和人IgG重链(序列1C，对应于SEQ ID NO:5)的铰链和恒定区(Fc)组成。hFc-标签的存在导致同源二聚体形成，其中两个多肽通过二硫键连接在一起。

(B)描述uPAR-mFc(含有小鼠Fc标签的uPAR的可溶性二聚体形式)的结构的卡通图。uPAR-mFc(序列2，对应于SEQ ID NO:15)由人uPAR(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)的残基1-277、接头区(序列2A，对应于SEQ IDNO:10)和鼠IgG重链(序列2B，对应于SEQ ID NO:6)的铰链和恒定区(Fc)组成。就uPAR-hFc而言，所述mFc-标签的存在导致同源二聚体形成，其中两个多肽通过二硫键连接在一起。(C)描述uPARmyc(含有C末端myc-标签的uPAR的可溶单体形式)的结构的卡通图。uPARmyc(序列3，对应于SEQ ID NO:26)由人uPAR(序列3A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)的残基1-274和C末端myc-标签(序列3B，对应于SEQ ID NO:27)组成。如图所示，成熟野生型uPAR由三种同源结构域(称作D1、D2和D3)组成。

图2：使用免疫球蛋白重链恒定区的uPAR的强制二聚化增加VN结合亲和性，但不增加uPA的结合亲和性。(A)uPAR-hFc与经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板在有过量前uPA(黑色)或无过量前uPA(灰色)存在下用递增浓度的uPAR-hFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值±SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，采用Prism5.0软件包来计算结合曲线、平衡解离常数(Kd，以纳摩尔单位计)和最大结合能力(Bmax，以CPS单位计(计数/秒))。注意到与图B所示的单体uPARmyc相比，uPAR-hFc具有约10倍更高的亲和性和约3倍更高的结合能力。(B)uPARmyc和经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板在有过量前uPA(黑色)或无过量前uPA(灰色)存在下用递增浓度的uPARmyc在室温下孵育2小时。完全按照图A所述检测并分析uPARmyc的结合。(C)uPAR-hFc和uPARmyc与经固定的前uPA的结合。使采用前uPA被覆的96孔板用递增浓度的uPAR-hFc(圆形)和uPARmyc(方形)在室温下孵育2小时。完全按照图A所述检测并分析uPARmyc的结合。注意到uPAR-hFc和uPARmyc与经固定的前uPA的结合的Kd和B_最大非常相似。

图3：由uPA的生长因子样结构域和uPAR通过其N末端结合的嵌合分子制成的uPAR变体，其增加VN结合并且减少uPA结合。(A)描述野生型人uPAR和uPAR变体GFD-uPAR嵌合体的结构域结构的卡通图。成熟的野生型uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))由3个同源蛋白结构域(D1、D2和D3)组成，其通过位于uPAR的C末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)脂质锚着子连接所述细胞膜的外叶。所述GFDuPAR-嵌合体(序列5，(SEQ ID NO:16))与野生型uPAR(序列4，(SEQ IDNO:1))具有相同序列，但额外包含uPA的受体结合生长因子样结构域GFD(序列5A，(SEQ ID NO:3))，该结构域利用短接头序列(序列5B，(SEQ ID NO:7))被工程改造到uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))的N末端上。(B)293细胞中的GFDuPAR表达促进细胞对玻连蛋白的粘附。使表达野生型uPAR(uPAR)、VN结合缺陷型uPAR突变体(uPARW32A和uPARR91A，(Madsen等,2007))、GFDuPAR嵌合体(GFDuPAR)或无uPAR(模拟)的293细胞于37℃在采用整联蛋白结合缺陷型VN片段(VN(1-66)RAD,(Madsen等,2007))被覆的孔中粘附1小时。清洗后，将粘附的细胞固定，用结晶紫染色，然后通过在530nm检测吸光度来定量。通过减去非特异性结合(在未被覆孔中检测)来计算特异性细胞粘附，并以粘附聚-L-赖氨酸的百分率(%)表示。数据以独立实验(n=3)的平均值±SD表示。注意到uPAR和GFDuPAR都促进细胞对VN的稳健粘附，但W32A和R91A突变受体，以及模拟转染细胞都未能粘附。(C)GFDuPAR-嵌合体未能促进细胞对经固定的前uPA的粘附。使表达不同uPAR变体的293细胞与采用前uPA被覆的孔在37℃下结合1小时，并如图B所述定量细胞粘附。注意到uPAR、uPARW32A和uPARR91A的表达诱导细胞对前uPA的牢固粘附，而GFDuPAR嵌合体并非如此，因此证明该嵌合体无法结合前uPA。图4：可溶性的GFDuPAR显示对VN的uPA非依赖性高亲和性和减少的uPA结合。(A)描述GFDuPARmyc的结构域组织的卡通图。GFDuPARmyc(序列6(SEQ ID NO:28))是含有C末端myc标签的GFDuPAR的分泌的变体(图3A)。GFDuPARmyc-嵌合体(序列6(SEQ ID NO:28))由uPA的受体结合生长因子样结构域，GFD(序列5A(SEQ ID NO:3))、短接头(序列5B(SEQ IDNO:7))、uPAR残基1-274(序列3A，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)和C末端myc标签(序列3B(SEQ ID NO:27))组成。(B)GFDuPARmyc和uPARmyc对固定的VN的结合。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPARmyc(黑色方形)和uPARmyc(灰色圆形)在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值±SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，使用Prism5.0软件包来计算结合曲线和解离常数(Kd)。注意到，GFDuPARmyc但非uPARmyc以高亲和性结合VN。(C)GFDuPARmyc和uPARmyc对经固定的前uPA的结合。使采用前uPA被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPARmyc(黑色方形)和uPARmyc(灰色圆形)在室温下孵育2小时，并如图B所述检测结合的受体。通过上述非线性回归计算结合曲线、Kd和B_最大。注意到与uPARmyc相比，GFDuPARmyc结合uPA的亲和性降低约30倍，结合能力减少约5倍。

图5：其它uPAR变体：uPAR的强制二聚化和在其N末端上添加GFD结构域协同增加所述受体的VN结合活性。

(A)描述GFDuPAR-hFc的结构域结构的卡通图。GFDuPAR-hFc(序列7(SEQ ID NO:12))结合了通过如图1A所示添加C末端人Fc标签的强制二聚化和如图3A所示的在N末端上附加的GFD结构域。(B)描述GFDuPAR-mFc结构域结构的卡通图。GFDuPAR-mFc(序列8(SEQ ID NO:13))与GFDuPAR-hFc相同，不同之处在于，所示Fc区源自小鼠免疫球蛋白(参见图1B)。(C)GFDuPAR-mFc以极度高亲和性结合经固定的VN。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPAR-mFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过用小鼠IgG恒定区特异性的生物素化的抗体和Eu3+标记的链霉亲和素依次孵育来检测结合的受体。结合的物质通过检测时间分辨的荧光来定量。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值±SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。

图6：不同形式的可溶性uPAR的VN结合活性的直接比较(A)GFDuPAR-hFc以高亲和性结合经固定的VN。使采用VN被覆的96孔板在无前uPA存在下或用递增浓度的GFDuPAR-hFc孵育，或在有或无过量前uPA存在下用uPAR-hFc和uPARmyc孵育。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。数据来自单一实验，并且以平均值±SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。注意到GFDuPAR-hFc以比所测其它任何uPAR形式高的亲和性和能力结合VN。(B)GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc对经固定的VN结合的比较。使采用VN被覆的96孔板在无前uPA存在下用递增浓度的GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。数据来自单一实验，并且以平均值±SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。注意到二聚体GFDuPAR-hFc以比单体GFDuPARmyc更高的亲和性(约4倍)和能力(约2.5倍)结合VN。图7：对连接uPAR-hFc中的GFD和uPAR结构域的接头区缺乏特殊要求(A)测试的接头区。为了比较GFDuPAR-hFc(参见图5A)中的GFD和uPAR结构域之间的不同接头长度的可能的影响，用指示的接头序列(长度为5、8、16或20个残基)制得GFDuPAR-hFc变体。接头8与全部上述实验中所用的序列5B(SEQ ID NO:7)和序列9B(SEQ IDNO:8)相同。(B)与经固定VN的结合。使采用VN被覆的孔在有或无10nM前uPA存在下用来自用指示的uPAR变体瞬时转染的293细胞的条件培养基(稀释10倍)孵育。清洗后，通过用Eu3+标记的抗人Fc抗体孵育并检测时间分辨的荧光来检测结合的物质。注意到，不依赖接头长度，全部GFDuPAR-hFc变体都不依赖前uPA而结合VN。(C)对经固定uPA的结合。使采用前uPA被覆的孔用来自用指示的uPAR变体瞬时转染的293细胞的条件培养基(稀释10倍)孵育。清洗后，如图B所述检测结合的物质。注意到，不依赖于接头长度，全部GFDuPAR-hFc变体显示相较于uPAR-hFc减少的uPA结合。图8：描述在uPAR上附加GFD能增加VN结合并减少uPA结合的两种可能机制的卡通图。(A)分子内结合。若空间上允许，则GFDuPAR中的GFD结构域会结合uPAR中的uPA结合口袋，导致所述嵌合受体的自动饱和。uPAR的自动饱和可诱导所述受体内的构象变化，导致VN结合位点的有效暴露，并防止与uPA结合。(B)分子间结合。如果图A所示的自动饱和就空间原因没有可能，那么GFDuPAR将是杂二价的，并因而显示uPA和uPAR结合活性。在该情况下，GFDuPAR可能形成寡聚体，该寡聚体具有减少的uPA结合活性和和增加的VN结合活性。图9：8个抗体可变区的氨基酸序列。从通过如材料与方法中所述的PCR扩增获得的cDNA序列推出重链和轻链的可变区的氨基酸序列。按照Kabat系统对所述氨基酸序列编号。互补决定区(CDR)1、2和3(从左到右)有下划线。连字符表示引入所述序列以保持对齐的缺口。对应序列表中的Xaa的标点符号表示所述序列是未知的或不确定的。因此，Xaa可以是任何天然发生的氨基酸。

图10：针对GFDuPAR-hFc产生的单克隆抗体识别细胞表面uPAR。表达人uPAR(huPAR)、小鼠uPAR(muPAR)或不表达uPAR(模拟)的293细胞用针对GFDuPAR-hFc产生的单克隆抗体8B12、10H6、13D11、19.10、13F6、AL6、AL38和BE18染色。使用荧光素标记的山羊抗小鼠抗体检测结合的抗体，并通过流式细胞术来分析所述染色。直方图显示染色亮度(X轴，FL1-H)和频率(Y轴，以最高频亮度的%计)。注意到全部八种抗体都对表达人uPAR的细胞特异性染色。先前已对抗体BR4和AK17有所描述，并且与小鼠uPAR特异性反应(Tjwa等,2009)。

图11：mAb8B12的功能抑制活性。将表达人uPAR的293细胞接种于用玻连蛋白(A和B)或纤连蛋白(C)被覆的96孔E平板中，然后转移至实时细胞分析仪仪器(RTCA，xCELLigence，SP罗氏公司(SP Roche Corp.))。以规律间隔记录电阻抗(称为细胞指数，CI)。大约2小时后，向细胞添加前uPA(B和C)或载剂(A)并继续检测细胞指数。大约另一个小时之后，以图中指示的终浓度向孔添加稀释曲线的8B12抗体，并继续检测细胞指数。图中通过垂直点线指示了添加前uPA和8B12的时间。所述曲线显示标准化的细胞指数(NCI,Y轴)与时间(X轴)的关系。基于抗体添加之前直接检测的细胞指数对全部细胞指数进行标准化。为检测IC50值(图D)，在抗体添加后一小时检测NCI(以相同时间点的未处理细胞的NCI的百分比(%)(ΔNCI,Y轴)计算)并对与抗体浓度(X轴)的关系作图。

图12：通过流式细胞术的表位作图(I)。表达人uPAR(uPAR WT)、uPARR83/89A的293细胞用指示的不同抗体染色，并通过流式细胞术分析所述结合。在有或无前uPA的存在下进行uPAR WT细胞染色，以检测配体占用度对抗体结合的可能影响。如同阴性对照(Neg.Ct.)，全部图中的uPAR WT细胞的染色谱都显示细胞没有接纳一抗。图13：通过流式细胞术的表位作图(II)。如图12所述，但分析不同的uPAR变体。

图14：通过流式细胞术的表位作图(III)。如图12和13所述，但分析不同的uPAR变体。

图15：uPAR中的抑制性抗体的结合表位的位置。uPAR由三个结构域(D1、D2和D3)组成，其中D1通过短接头区连接D2。该接头区包含对与VN相互作用的受体而言至关重要的残基(R91和Y92，有下划线)(Madsen等,2007)(Gardsvoll和Ploug,2007)。该实施例中生成的抑制性抗体的结合位点与具有结合热点重要性的R89、R91和Y92有重叠的表位。uPAR的D2D3截短形式的结构示于下文。该变体缺乏SEQ ID NO:1的uPAR的残基1-82。

图16：抑制Eu³⁺-uPA通过mAb8B12、13F6、R3和前uPA与293/uPAR细胞结合。mAb8B12不干扰uPAR的蛋白水解功能。为了研究所述抑制性抗体8B12是否是uPAR/VN相互作用的特异性抑制剂，或其是否也干扰uPA与所述受体结合，我们进行了体外结合试验。注意到，mAb8B12显示没有或几乎没有抑制活性，说明了该抗体不干扰所述受体的蛋白水解功能。该试验的有效性通过R3抗体和未标记的前uPA显示有效竞争活性来说明。(CPS–计数/秒)。

图17：mAb8B12抑制体内PC3肿瘤生长。雄性Balb C nu/nu小鼠通过皮下(s.c.)途径接种(1x10⁶)PC-3细胞。通过腹膜内途径两周注射一次10.0mg/kg的mAb8B12、mAb13F6、非免疫对照小鼠IgG(mIgG)或PBS来处理动物。一周测量两次肿瘤，如材料与方法中所述测定肿瘤体积。在PBS和mIgG处理的动物之间没有观察到肿瘤生长差异，并且汇集这些数据然后进行统计学分析。对照动物和8B12处理动物之间的显著性差异用星号表示(NS，非显著性，P>0.05，*P<.05，**P<.01和***P<.001)。指示对照和8B12处理动物之间的肿瘤体积差异(以%计)。

图18：mAb8B12减少PC-3肿瘤细胞增殖并促进体内凋亡。雄性Balb C nu/nu小鼠用PC-3细胞皮下接种，并每两周一次地用10.0mg/kg的mAb8B12、mAb13F6或非免疫对照小鼠IgG通过腹膜内途径注射处理。异种移植后8周，收集肿瘤并如材料与方法部分所述通过免疫组化进行分析(图A)。示出Ki-67和活化的胱冬酶3染色并且用Dapi对细胞核进行复染。图B中显示对数据的定量。注意到，相较于采用对照IgG的处理，采用抑制性mAb8B12的处理显著减少肿瘤细胞增殖并增加凋亡。相同同种型的非抑制性mAb13F6没有显示该活性，说明抗增殖和促凋亡作用的原因是mAb8B12的抑制活性。Y轴的单位是每个视野下的阳性细胞数。

图19.^mGFDmuPAR-Fc的结构域组成和VN结合特性

(A)描述^mGFDmuPAR-hFc的结构域组织的卡通图。^mGFDmuPAR-hFc(序列9(SEQ ID NO:17))由鼠uPA的受体结合生长因子样结构域mGFD(序列9A(SEQID NO:4))、短接头(序列9B(SEQ ID NO:8))、小鼠uPAR残基1-273(序列9C，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-273)、另一个短接头(序列9D(SEQ ID NO:11))和C末端人Fc标签(hFc，序列1C(SEQ ID NO:5))组成。同样地，可以使用小鼠Fc标签的C末端。

(B)^mGFDmuPAR-hFc与经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的^mGFDmuPAR-hFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过用^Eu3+标记的山羊抗人Fc抗体孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值±SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，使用Prism5.0软件包来计算解离常数(Kd)。

图20.针对^mGFDmuPAR-hFc产生的抗体通过小鼠uPAR介导抑制细胞对VN的粘附。293/muPAR细胞对VN粘附的抑制通过来自骨髓瘤杂交的细胞培养上清液来达到，所述骨髓瘤杂交产生识别^mGFDmuPAR-hFc的抗体。将表达鼠uPAR的293细胞接种在VN被覆的E平板中，然后使用xCELLigence酶标仪(罗氏公司(Roche))通过阻抗测量来检测细胞粘附。当粘附到达平台(通过垂直点线表示)时，向所述孔添加来自13种不同骨髓瘤杂交的条件培养基(终浓度30%v/v)，所述骨髓瘤杂交源自用^mGFDmuPAR-hFc免疫的小鼠的脾细胞。注意到，来自4种杂交的条件培养基导致细胞粘附的大幅(OMD4、NE43和OOF12)或中等减少(NM23)(以标准化的细胞指数检测)，而来自剩余9种杂交的条件培养基显示几乎没有或没有抑制活性。

图21.抑制性抗体OMD4和NE43结合至小鼠uPAR中的VN结合位点。为了检测生成抗体的结合表位是否落在小鼠uPAR(muPAR)的VN结合位点中，对用于免疫的抗原(^mGFDmuPAR-hFc)和在muPAR的VN结合位点包含单个氨基酸取代的该嵌合体的变体(^mGFDmuPAR-hFc R92A)以及人可溶性受体(suPAR)进行体外结合试验以确定所述抗体是否也识别人uPAR。使采用^mGFDmuPAR-hFc、^mGFDmuPAR-hFc R92A或人可溶性uPAR(suPAR)被覆的96孔ELISA平板用在稀释缓冲液中以1:100稀释的杂交瘤细胞上清液封闭并孵育。清洗后，通过用Eu3+标记的山羊抗小鼠抗体孵育来探测结合的抗体，并通过增强的时间分辨荧光轻度检测(Delfia)来定量。通过减去未经被覆孔观察到的结合来计算特异性结合。注意到，OMD4和NE43不识别^mGFDmuPAR-hFc R92A变体，说明这些抗体结合muPAR中的VN结合位点。这些抗体之一(OMD4)还识别人受体。

图22.针对^mGFDmuPAR-Fc重链可变区产生的mAb OMD4的氨基酸序列。从通过如实施例2材料与方法中所述的PCR扩增获得的cDNA序列推出OMD4重链的可变区的氨基酸序列。根据Kabat系统对所述氨基酸序列编号。互补决定区(CDR)1、2和3(从左到右)有下划线。

图23.mAb OMD4、NE43、OOF12、NM23、8B12的抑制活性的物种特异性。将表达人uPAR(图A)和小鼠uPAR(图B)的293细胞接种在用VN被覆的E平板上，并通过阻抗检测来监测细胞粘附。一旦细胞粘附达到平台(垂直点线)，向孔添加纯化的孔体至100nM*的终浓度，并记录细胞粘附变化结果。注意到，表达人uPAR的细胞的粘附受mAb8B12抑制，且部分受mAb OMD4抑制，而其余的抗体没有显著影响。相反，表达鼠uPAR的细胞的粘附受mAb NE43、OOF12、NM23抑制，部分受OMD4抑制，但完全不受8B12抑制。使用13F6作为结合人uPAR的非抑制性阴性对照抗体。*所述OMD4抗体是IgA同种型，并且以1:5稀释的细胞培养物上清液形式使用。该抗体在所述上清液中的浓度未知并且可能较低。因此，采用该抗体观察到的部分影响可能归因于此。

图24：供于分离scFv识别配体占用二聚体uPAR的淘选策略。

图25：分离的scFv和细胞表面uPAR的反应性。表达人uPAR的293细胞用指示的scFv(200nM)染色。使用荧光素标记的山羊抗人F(ab)2抗体检测结合的抗体，并通过流式细胞术分析染色。直方图显示染色亮度(X轴，FL1-H)和频率(Y轴，以计数计)。

图26：scFv3B6的抑制活性。如图11中针对mAb8B12所述来检测scFv3B6的抑制活性。所述曲线显示标准化的细胞指数(NCI,Y轴)与时间(X轴)的关系。基于抗体添加之前直接检测的细胞指数对全部细胞指数进行标准化。为检测IC50值(图D)，在抗体添加后一小时检测NCI(以相同时间点的未处理细胞的NCI的百分比(%)(ΔNCI,Y轴)计算)并对与抗体浓度(X轴)的关系作图。

图27：scFv3C10的抑制活性。完全按照图26中针对scFv3B6所述来检测3C10的抑制活性。

图28：将8B12和其它已知化合物抑制uPAR/VN相互作用或uPAR功能的抑制活性做比较。如图11中针对8B12抗体所述检测SMB结构域(图A)、肽P7(图B)、抗体R3和R5(图C)以及R2抗体(图D)的抑制活性。为检测IC50值，在化合物添加后一小时检测NCI(以相同时间点的未处理细胞的NCI的百分比(%)(ΔNCI,Y轴)计算)并对与化合物浓度(X轴)的关系作图。图11的8B12的抑制曲线已经包括在全部四个图中以供比较。所测化合物各自的经计算的IC50和最大抑制常数示于表2。

实施例1

材料与方法

表达载体的构建

用于带有人IgG恒定区(hFc)标签的重组蛋白的表达载体基于pFRT/TO-Fc质粒(Madsen等,2007)，然而，引入了许多修饰以便于不同编码区的改组并促进蛋白质产量。首先，通过定点突变利用寡核苷酸dXu/dXd破坏位于hFc编码区的载体序列下游的XhoI限制性位点。第二，将通过对寡核苷酸PreF/PreR进行退火所制备的编码PreScission蛋白酶的切割序列的接头插入到位于信号肽/Fc连接处的XhoI位点。为了去除所述构建体的Fc区中存在的内含子(发现这样做增加重组蛋白的产量(我们未经公开的观察结果))，将所述载体转染进入CHO细胞，提取RNA，逆转录，然后用寡核苷酸hVNukpn/FcNr扩增cDNA，并KpnI/NotI克隆进入pcDNA5/FRT-TO(英杰公司(Invitrogen corp.))和pEGFP-N1(克隆泰克公司(Clontech corp.))，以分别生成pFRT/TO-hFc和pN1-hFc。带有小鼠IgG恒定区(mFc)标签的重组蛋白的表达载体如下生成：通过使用寡核苷酸mFcU/mFcD来PCR扩增小鼠IgG1cDNA(克隆IRAVp968B035D，获自imaGenes GmbH)，并XhoI/NotI克隆进入pFRT/TO-hFc和pN1-hFc中，以分别生成pFRT/TO-mFc和pN1-mFc。编码带有人Fc标签的可溶性uPAR(uPAR-hFc，序列1(SEQ ID NO:14))和带有小鼠Fc标签的可溶性uPAR(uPAR-mFc，序列2(SEQ ID NO:15))的构建体如下制备：通过用寡核苷酸URskF/UpreR2D扩增全长uPAR cDNA(Madsen等,2007)，并KpnI/XhoI克隆进入pFRT/TO-hFc和pFRT/TO-mFc以分别生成pFRT/TO-uPAR-hFc和pFRT/TO-uPAR-mFc。编码带有myc标签的可溶性uPAR(uPARmyc，序列3(SEQ ID NO:26))的构建体如下生成：通过用寡核苷酸URskF/URMYCR扩增uPAR cDNA，并KpnI/NotI克隆进入pcDNA5/FRT-TO以生成pFRT/TO-uPARmyc。所述表达载体编码uPA的生长因子结构域(GFD，序列 5A(SEQ ID NO:3))和全长uPAR(序列4(SEQ ID NO:1))的嵌合体。^GFDuPAR(序列5(SEQ ID NO:16))通过两步PCR重叠扩增法生成。首先，用寡核苷酸ATFkpnF/GFD1r扩增uPA cDNA，并用寡核苷酸UL8f/FO12394扩增uPARcDNA。第二，混合所述两种PCR产物，使用寡核苷酸ATFkpnF/FO12394共扩增，并KpnI/NotI克隆进入pcDNA5/FRT-TO以生成pFRT/TO- ^GFD uPAR。编码带有C末端myc标签的可溶性^GFDuPAR(^GFDuPARmyc，序列6(SEQ ID NO:28))的表达载体如下生成，通过采用寡核苷酸ATFkpnF/URMYCR扩增pFRT/TO-^GFDuPAR，并将产物KpnI/NotI克隆进入pcDNA5/FRT-TO以生成pFRT/TO- ^GDF uPARmyc。编码带有C末端人Fc标签的可溶性二聚体^GFDuPAR变体(^GFDuPAR-hFc，序列7(SEQID NO:12))和带有小鼠Fc标签mFc标签的可溶性二聚体^GFDuPAR变体(^GFDuPAR-mFc，序列8(SEQ ID NO:13))的表达载体如下生成：通过采用寡核苷酸ATFkpnF/UpreR2D扩增pFRT/TO-^GFDuPAR并将产物与KpnI/XhoI克隆进入pFRT/TO-hFc和pFRT/TO-mFc以分别生成pFRT/TO- ^GDF uPAR-hFc和pFRT/TO- ^GDF uPAR-mFc。如上所述，用uL5f、uL12f、uL16f或uL20f替代寡核苷酸uL8f来制备编码多种嵌合体的表达载体，所述多种嵌合体中的GFD和uPAR结构域之间的接头区的长度不同。将编码^GFDuPAR-hFc的区域及其含不同长度接头的变体KpnI/NotI转移到pEGFP-N1表达载体(克隆泰克公司)，生成pN1-^GFDuPAR-hFc供于瞬时表达实验。

重组蛋白的表达和纯化

将pFRT/TO-uPAR-hFc、pFRT/TO-^GFDuPAR-hFc、pFRT/TO-uPAR-mFc、pFRT/TO-^GFDuPAR-mFc、pFRT/TO-uPARmyc pFRT/TO-^GFDuPARmyc表达载体转染进入CHO Flp-In细胞(英杰公司)，而在无血清条件下表达的重组蛋白如先前所描述(Madsen等,2007)。通过标准蛋白A亲和层析从所述条件培养基纯化带有人或小鼠Fc标签的重组体，并用PBS充分透析。将用pFRT/TO-uPARmyc和^GFDuPARmyc转染的细胞的条件培养基浓缩约20倍，无需进一步纯化即用于结合试验。使用标准ELISA试验来测定浓缩的条件培养基中的uPARmyc浓度。通过用pN1-^GFDuPAR-hFc载体变体瞬时转染培养在OptiMEM无血清培养基(英杰公司)中的Phoenix细胞来使所述多种^GFDuPAR-hFc变体(在GFD和uPAR部分之间具有不同长度的接头)表达，并在培养6-8天后回收所述条件培养基。结合试验

4℃下用在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)中稀释的前uPA或VN(10nM)被覆黑色96孔免疫板。平板用清洗缓冲液(含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-T))清洗，并用封闭缓冲液(含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS)在室温下使非特异性结合位点饱和>2小时。用PBS-T清洗后，使孔在有或无指示前uPA存在下用在稀释缓冲液(含1%BSA的PBS)中稀释的指示浓度的uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc孵育。在室温下允许所述结合发生2小时，之后通过用清洗缓冲液漂洗来去除未结合的试剂。通过用抗uPAR单克隆抗体(13F6,1μg/ml)和Eu³⁺标记的山羊抗小鼠抗体(1:5.000,珀金埃尔默公司(Perkin Elmer Corp.))依次孵育来检测结合的uPAR-hFc和uPARmyc。通过使用Envision Xcite酶标仪(帕金埃尔默公司)，使用DELFIA标记方案检测时间分辨荧光强度来检测Eu³⁺标记。为了计算特异性结合，从被覆孔中检测到的总结合减去在用相同样品孵育的未被覆孔中检测到的非特异性结合。

细胞系和细胞粘附试验

通过按照已公开的方法(Madsen等,2007)用pFRT/TO-^GFDuPAR载体转染来生成表达^GFDuPAR的HEK293Flp-In T-Rex细胞(293)。用空载体转染的293细胞和表达uPAR^W32A与uPAR^R91A的细胞在先前已经描述(Madsen等,2007)。

寡核苷酸序列

dXu:5’-gtaaatgagcggccgcgtcgagtctagaggg-3’(SEQ ID NO:29)

dXd:5’-ccctctagactcgacgcggccgctcattta-3’(SEQ ID NO:30)

PreF:5’-tcgagctggaagttctgttccaggggccca-3’(SEQ ID NO:31)

PreR:5’-agctacccggggaccttgtcttgaaggtcg-3’(SEQ ID NO:32)

hVNukpn:5’-cggggtaccatggcacccctgaga-3’(SEQ ID NO:33)

FcNr:5’-ttgcggccgctcatttacccggagacag-3’(SEQ ID NO:34)

mFcU:5’-gcctcgaggcaggagcaggacccagggattgtggttgtaa-3’(SEQ ID NO:35)

mFcD:5’-gcgcggccgctcatttaccaggagagtg-3’(SEQ ID NO:36)

URskF:5’-gcgtcgacggtacccgccaccatgggtcacccgccgctgctg-3’(SEQ ID NO:37)

UpreR2D:5’-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccact-3’(SEQ ID NO:38)

URMYCR:

5’-gcgcggccgctcacagatcctcttcagagatgagtttctgctctcctcctgggtggttacagccact-3’(SEQ ID NO:39)

ATFkpnF:5’-gcggtacccgccaccatgagagccctgctggcgcgc-3’(SEQ ID NO:40)

GFD1r:5’-tgtgaaatagataagtcaaaagggggggccggggcg-3’(SEQ ID NO:41)

uL8f:5’-gggggggccggggcggctggaggactgcggtgcatgcagtgtaag-3’(SEQ ID NO:42)

FO12394:5’-tagtttagcggccgcttaggtccagaggagagt-3’(SEQ ID NO:43)

UpreR2D:5’-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccact-3’(SEQ ID NO:44)

URMYCR:

5’-gcgcggccgctcacagatcctcttcagagatgagtttctgctctcctcctgggtggttacagccact-3’(SEQ ID NO:45)

uL5f:5’-gggggggccggggcgctgcggtgcatgcagtgtaag-3’(SEQ ID NO:46)

uL16f:

5’-gggggggccggggcggctggagcaggagcaggtgctggtgctggaggactgcggtgcatgcagtgtaag-3’(SEQ ID NO:47)

uL20f:

5’-gggggggccggggcggctggagcaggagcaggtgctggtgctggagcaggtgctggtggtctgcggtgcatgcagtgtaag-3’(SEQ ID NO:48)

结果

uPAR的强制二聚化大幅增强对玻连蛋白的结合

背景和理论基础

数条证据指示，受体-二聚化在uPAR和VN间的相互作用中起重要作用(Caiolfa等,2007;Sidenius等,2002)，然而，通过表面等离振子共振(SPR)测定的经固定uPAR和可溶性VN之间相互作用的解离常数(约1μM,(Gardsvoll和Ploug,2007))明显不足以解释由使用经固定VN和可溶性uPAR的平衡结合实验预测的高亲和性相互作用(Gardsvoll和Ploug,2007;Sidenius等,2002)。为了直接落实uPAR-二聚化对VN结合所起的作用，作者在此描述重组二聚uPAR的可溶形式的构建、表达和纯化，并比较其与那些uPAR的“常规”可溶性单体之间的配体结合特性。

二聚uPAR的构建与表达

为了直接确定受体二聚化对可溶性uPAR和经固定VN之间相互作用的重要性，作者构建了在C末端上带有人IgG1(hFc)的铰链和恒定区标记的可溶性人uPAR。获得的uPAR-hFc嵌合体是共价同源二聚体，其中两个多肽通过位于所述Fc标签的铰链区内的二硫键保持在一起(图1A)。所述uPAR-hFc嵌合体(序列1(SEQ ID NO:14))由uPAR(序列1A的残基1～277，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)、接头区(LEVLFQGPLE，序列1B(SEQ ID NO:9))和人Fc标签(241个残基，序列1C(SEQ ID NO:5))组成。还使用小鼠免疫球蛋白的Fc区制备相似的构建体A(序列按图1B的描述)，并且该嵌合体预计的结构域结构，uPAR-mFc(序列2(SEQ ID NO:15))与uPAR-hFc相同，不同之处在于接头区(序列2A(SEQ IDNO:10))和小鼠Fc标签(序列2B(SEQ ID NO:6))稍有不同。作者构建了C末端带有myc标签(uPARmyc，序列3(SEQ ID NO:26))的可溶性人uPAR(如图1C所述)作为单体对照受体。该蛋白质由uPAR(序列3A的残基1～274，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)和C末端myc标签(GGEQKLISEEDL，序列3B(SEQ ID NO:27))组成。使所述重组蛋白在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并通过标准蛋白A亲和层析从条件培养基纯化(uPAR-hFc和uPAR-mFc)或通过ELISA定量之后不经纯化直接使用(uPARmyc)。

二聚uPAR的结合特性

通过使经固定的VN在有或无过量的前uPA(uPA的催化失活酶原形式)存在下与递增浓度的重组受体孵育来检测uPAR-hFc(图2A)和uPARmyc(图2B)的VN结合活性。清洗后，用小鼠单克隆抗uPAR抗体(13F6)、Eu³⁺标记的山羊抗小鼠抗体依次孵育来显示结合的受体，并通过时间分辨荧光检测法来定量。在无前uPA存在下，uPAR-hFc和uPARmyc都显示对VN的较差结合，且无法可靠估计相互作用的亲和性。然而，在过量的前uPA存在下，uPAR-hFc和uPARmyc都显示对VN的特异性和剂量依赖性结合。通过对结合曲线的非线性回归分析，uPAR-hFc、uPARmyc和经固定VN之间的相互作用的表观解离常数(kd)经计算分别为约10nM和约80nM。相反，单体和二聚可溶性受体以类似的表观亲和性(约6nM(uPAR-hFc)和约10nM(uPARmyc))结合经固定的uPA。

这些数据说明，使用免疫球蛋白Fc标签的uPAR的强制二聚化导致相较于单体受体而言，所述受体对VN的表观亲和性增加了约10～100倍。单体(uPARmyc)和二聚(uPAR-hFc和uPAR-mFc)可溶性uPAR的结合都取决于uPA的伴随占用度，因为在其缺失下没有或几乎没有观察到结合。uPAR的强制二聚化无法使所述受体在无uPA存在下与经固定VN的结合以及与经固定uPA的结合增加，说明表观亲和力的增加涉及独特构象变化，并且其不仅是亲和力增加的结果。

uPA和uPAR的嵌合体显示强VN结合和减少的uPA结合

背景和理论基础

如文献中所述，并如图2所述，可溶性uPAR与VN的结合密切取决于所述受体的uPA伴随占用度。就该观察结果的看似合理的解释是，uPA与uPAR结合诱导了所述受体中的构象变化，导致所述被占据的受体中的VN结合表位暴露。出于生成显示结构的uPAR变体(即，uPA非依赖性，VN结合性且缺乏uPA结合性)的目的，作者设想，这可通过构建合适的uPA/uPAR嵌合体的构建体来实现，其中，预计在如此嵌合体中发生的分子内结合反应将导致VN结合表位暴露并以反式方式防止uPA的结合。

uPA/uPAR嵌合体^GFDuPAR的构建

为了生成具有VN结合组成型活性但缺乏uPA结合活性的uPAR变体，作者将uPA的生长因子样结构域(GFD)工程改造至人uPAR的N末端上(如图3A所示)。获得的嵌合体(^GFDuPAR，序列5(SEQ ID NO:16))由通过短接头(序列5B(SEQ IDNO:7))连接至完整成熟人uPAR(序列4(SEQ ID NO:1))的来自人uPA的生长因子样结构域(序列5A(SEQ ID NO:3))组成。

细胞表面^GFDuPAR的结合特性

为了分析^GFDuPAR嵌合体的结合特性，作者生成了在细胞表面表达^GFDuPAR的293细胞系，并将其粘合特性与表达野生型uPAR和uPAR变体(特定缺乏VN结合能力)的细胞做比较(图3)。在这些试验中，作者发现，^GFDuPAR，如同野生型受体，促进稳固的，整联蛋白非依赖性的，对VN的细胞粘附(图3B)，证实所述嵌合体保留了全部VN结合活性。此外，^GFDuPAR的表达未能促进细胞与经固定的uPA结合，说明该嵌合体也达到了预计的uPA结合活性缺失(图3C)。

可溶性^GFDuPAR的构建和结合特性

uPAR介导的细胞对VN的粘附不需要结合uPA，只要细胞表面的表达水平足够高即可(Madsen等,2007;Sidenius和Blasi,2000)，因此，作者随后生成了^GFDuPAR的可溶性变体供于体外结合实验。出于该目的，作者构建了截短形式的^GFDuPAR，其以所带的C末端myc标签替代了野生型uPAR的膜锚着序列。图4A中描述了所述构建的嵌合体(^GFDuPARmyc，序列6(SEQ ID NO:28))，所述嵌合体具有与前述^GFDuPAR相同的N末端GFD结构域(序列5A(SEQ ID NO:3))和接头序列(序列5B(SEQ ID NO:7))以及与图1C中所述的uPARmyc相同的uPAR序列(序列3A(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274))和C末端myc标签(序列3B(SEQ ID NO:27))。

所述^GFDuPARmyc嵌合体在CHO细胞中产生，并且通过对经固定VN(图4B)和经固定的前uPA(图4C)的体外结合试验来分析其结合特性。如图所示，所示^GFDuPARmyc嵌合体在无uPA存在下以高亲和性(Kd约为1.3nM)结合经固定的VN。在相同条件下进行试验，缺乏N末端GFD结构域的对照受体uPARmyc甚至在多至1μM的浓度都未能显示与经固定VN的任何可测量的结合。因此，在uPAR的N末端上附加GFD结构域使所述受体对VN的所测结合亲和性增加了至少三个数量级。当用相同蛋白质(^GFDuPARmyc和uPARmyc)测试对经固定的前uPA的结合亲和性时(图4C)，作者发现所述^GFDuPARmyc嵌合体显示相较于所述对照受体(uPARmyc)而言减少约30倍的结合亲和性和减少约5倍的活性。

结论

这些数据证明，在uPAR的N末端上附加uPA的GFD结构域使所述受体对VN的亲和性增加大于三个数量级。

强制二聚化和uPA：uPAR嵌合协同增加VN结合活性

背景和理论基础

如上所述，uPAR对VN的表观亲和性可通过强制二聚化或通过在uPAR的N末端上附加uPA的GFD结构域来大幅增加。最终，作者在此说明，强制二聚化和附加GFD结构域的联合协同增加对VN的表观亲和性。

二聚^GFDuPAR的构建与表达

编码在uPAR的N末端上含有GFD结构域的二聚uPAR的表达载体通过联合如图1A-B所示的C末端Fc标签和如图3A所示的将uPAR的GFD结构域工程改造到uPAR的N末端上来构建。获得的嵌合体蛋白^GFDuPAR-hFc(序列7(SEQ IDNO:12))和^GFDuPAR-mFc(序列8(SEQ ID NO:13))分别在图5A和B中描述，并且由uPA的GFD结构域(序列5A(SEQ ID NO:3))、接头区(序列5B(SEQ ID NO:7))、uPAR残基1-277(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)、另一个接头区(序列1B(SEQ ID NO:9)或序列2A(SEQ ID NO:10))和来自人IgG的C末端Fc标签(序列1C(SEQ ID NO:5))或小鼠IgG的C末端Fc标签(序列2B(SEQ ID NO:6))组成。

二聚^GFDuPAR-hFc和^GFDuPAR-mFc的结合特性

使^GFDuPAR-hFc和^GFDuPAR-mFc嵌合体在CHO细胞中表达，并通过蛋白A亲和层析从条件培养基纯化。为了测定所述重组受体的VN结合性质，作者首先检测了^GFDuPAR-mFc对经固定VN的结合(图5C)。如图所示，^GFDuPAR-mFc以非常高的亲和性结合(约20pM)，说明强制二聚化(使用Fc标签)和配体自动饱和(使用GFD结构域)协同增加uPAR的VN结合活性。

为了更直接地比较可溶性uPAR的不同形式的VN结合特性，另外进行了结合实验(图6)。相较于uPA存在下的uPAR-hFc，^GFDuPAR-hFc具有约3倍更高的亲和性和结合能力。相较于uPA存在下的单体可溶性uPAR(uPARmyc)，^GFDuPAR-hFc显示约600倍更高的亲和性和6倍更高的结合能力。uPAR的单体(uPARmyc)和二聚体(uPAR-hFc)形式都显示在无uPA存在下没有或几乎没有对VN的结合，因此难以对亲和性差异定量。然而，相较于VN对经固定uPAR的结合的已公开的值而言(1.3μM,(Gardsvoll和Ploug,2007))，^GFDuPAR-hFc显示约10.000倍更高的亲和性。直接相较于^GFDuPARmyc(图6B)而言，^GFDuPAR-hFc显示3倍更高的亲和性和2.5倍更高的结合能力，证明二聚化和配体自动饱和都有助于^GFDuPAR-hFc的显著结合活性，并且可能就^GFDuPAR-mFc而言也是如此。

对连接GFD和uPAR的接头区的要求

为了测定在^GFDuPAR-hFc嵌合体中连接GFD结构域和uPAR的N末端的接头区的长度与序列的重要性，作者生成了所述嵌合体的含较短接头(5个残基)和较长接头(16和20个残基)的变体，并且与贯穿本研究中所用的“标准”接头(8个残基)的嵌合体比较VN和uPA结合活性(图7A)。通过瞬时转染进入293细胞系使这些变体表达，并检测条件培养基中的结合活性(图7)。如图所示，在uPAR的N末端添加GFD结构域增强VN结合(图7B)并减少uPA结合(图7C)，并不依赖于应用的接头长度，说明该序列就长度而言是很灵活的。解释^GFDuPAR嵌合体对VN的高亲和性的可能机制

构建^GFDuPAR的设想是，工程改造至uPAR的N末端上的GFD结构域将以分子内方式结合至uPAR中的uPA结合腔，如图8A所示。不过，所述分子内结合可能受空间约束而被禁止。在该情况下，^GFDuPAR的单分子可有效展示uPAR和uPA结合活性，并可能自聚集并如图8B所示寡聚化。

实施例2

材料与方法

抗原制备

按照实施例1的详述使^GFDuPAR-hFc和^GFDuPAR-mFc表达并纯化。

小鼠的免疫

通过腹膜内(i.p.)注射内含67μg ^GFDuPAR-hFc的200μl的1:1乳剂(100μl PBS中的免疫原和100μl完全弗氏佐剂(CFA))来免疫三只2月龄雄性C57Bl/6uPAR^-/-小鼠(Ms^#21574、Ms^#1416和Ms^#1417)。所述经免疫的动物以3周间隔通过IP注射内含67μg ^GFDuPAR-hFc的200μl的1:1乳剂(100μl PBS中的免疫原和100μl不完全弗氏佐剂(IFA))加强免疫3次。7周的间歇期之后，在融合前4天使用内含200μg^GFDuPAR-hFc的200μl PBS经i.p.对Ms^#21574施加最终融合前免疫加强。以3周间隔用内含34μg ^GFDuPAR-hFc的200μl的1:1PBS/IFA乳剂对Ms^#1416和Ms^#1417施加三次额外的IP免疫加强。在7周的间歇期之后，在融合前3和4天使用内含250μg^GFDuPAR-mFc的200μl PBS(i.p.)加内含250μg ^GFDuPAR-mFc的200μl PBS(皮下)对Ms^#1416和Ms^#1417施加最终融合前免疫加强。

融合、杂交瘤细胞培养和克隆

取出脾脏，并通过聚乙二醇法使用标准步骤(Galfre等,1977)使脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞系融合。融合后，使细胞在非选择性培养基(伊可夫氏(Iscove),10%FBS,1xHFCS)中培养一天，然后铺板至96孔板(35000个脾细胞/孔)中的补充有1xHFCS(杂交瘤融合与克隆添加剂(Hybridoma Fusion andCloning Supplement)，罗氏公司)的选择性HAT培养基(Iscove,1xHAT)中。所述抗原特异性免疫球蛋白产物呈阳性的杂交瘤细胞通过ELISA(见下文)鉴定，在12孔板中扩增并冷冻。选择的杂交瘤细胞通过在96孔板内有限稀释来亚克隆。将细胞以0.4～0.1个细胞/孔的密度铺板于补充有1xHFCS的HT培养基(伊可夫氏(Iscove),1xHT)中。必要时，可重复所述亚克隆步骤直至通过ELISA评价全部亚克隆呈阳性。由不同杂交瘤细胞产生的免疫球蛋白的同种型使用市售可得的ELISA试剂盒(小鼠免疫球蛋白同种型ELISA试剂盒(Mouse ImmunoglobulinIsotyping ELISA Kit)，BD法敏公司(BD Pharmingen Corp.))来测定。

上清液的筛选

透明的96孔板(MAXI-SORP,NUNC公司)用^GFDuPAR-hFc(内含1μg/ml的0.1M碳酸钠缓冲液，pH9.5)被覆。在用PBST(包含0.1%吐温-20的PBS)清洗后，所述孔用内含3%BSA的PBST封闭，清洗并用以1:2在PBST中稀释的细胞培养上清液孵育。结合的小鼠免疫球蛋白使用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体检测，随后清洗并使用内含ABTS的柠檬酸盐缓冲液来比色检测，并在451nm处对板进行读取。抗体可变链的克隆

基本按照先前的描述扩增重链和轻链可变区(Wang等,2000)。简言之，使用试剂盒(RNAeasy，恰根公司(Qiagen))提取总RNA，并使用随机六聚物和寡(dT)20引物通过逆转录来生成cDNA的第一条链。所述重链的可变区使用正向引物MH1和MH2与反向引物IGG1的混合物来扩增。所述轻链的可变区使用正向引物MK和反向引物KC来扩增。PCR产物通过凝胶纯化，并使用引物MH1和IGG1(重链PCR产物)或MK和KC(轻链PCR产物)来双向测序。序列经组装并使用IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析。

抑制活性的定量

使96孔E平板在4℃下用VN(5μg/ml)或FN(10μg/ml)被覆过夜。平板用PBS清洗，添加0.1ml无血清培养基(DMEM,0.1%牛血清白蛋白，25mM Hepes pH7.0)并转移至实时细胞分析仪仪器(xCELLigence SP，罗氏公司)。检测背景阻抗(细胞指数，CI)，将所述平板从所述仪器上取下，用悬浮在100μl无血清培养基中的15x10³个293/uPAR细胞替代培养基。将所述平板放回所述仪器，并于每三分钟记录细胞指数。孵育1.5-2小时后，将所述平板从所述仪器取出，并向孔中添加10μl的200nM前uPA或载剂对照，然后将所述平板放回至所述仪器。另检测1-1.5小时后，再次将所述平板取出，并向孔中添加(20μl)经稀释的抗体以获得指示的终浓度。将所述平板放回至所述仪器，并于每3分钟进行检测，持续2小时，然后每15分钟进行检测，持续15小时。

细胞系和流式细胞术(FACS)

用指示的受体或空载体(模拟)转染的293Flp-In T-Rex细胞(英杰公司(Invitrogen Corp.))经收取并依次用单克隆抗体(10μg/ml)和荧光素标记的二抗染色。通过流式细胞术(FACSCalibur，BD公司(BD Corp.))记录荧光，并使用FlowJo软件包分析数据。寡核苷酸序列

IGG1 5’-GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’(SEQ ID NO:49)

MH1 5’–CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3’(对应于

5’–CTTCCGGAATTC(G/C)A(A/G)GT(A/T/G/C)(A/C)AGCTG(G/C)AG(G/C)AGTC-3’)(SEQ ID NO:50)

MH2 5’–CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3’(对应于

5’–CTTCCGGAATTC(G/C)A(A/G)GT(A/T/G/C)(A/C)AGCTG(G/C)AG(G/C)AGTC(A/T)GG-3’)(SEQ ID NO:51)

KC 5’–GGTGCATGCGGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’(SEQ IDNO:52)

MK 5’–GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’(对应于5’–GGGAGCTCGA(C/T)ATTGTG(A/C)T(G/C)AC(A/C)CA(A/G)(A/T)CT(A/C)CA-3’)(SEQ ID NO:53)。

命名法：本文中对于冗余核苷酸位置使用IUPAC命名(参见：http://www.bioinformatics.org/sms/iupac.html)。

细胞结合

将293/uPAR细胞接种于FN被覆的96孔板中，并使其粘附2小时。然后，所述细胞在有或无递增浓度的待测试抑制剂(如指示)的存在下用恒定浓度的Eu³⁺标记的前uPA(4nM,^Eu3+uPA)孵育。在4℃下允许结合发生2小时，然后清洗所述细胞以去除未结合试剂。用Delfia增强溶液溶解Eu³⁺标记，然后通过时间分辨荧光强度检测法使用EnVision酶标仪(帕金埃尔默(PerkinElmer))来定量。通过减去在没有细胞但经相同处理的孔中观察到的结合来计算特异性结合。

异种移植实验

从查尔斯河公司(Charles River)获得6周龄的雄性Balb C nu/nu小鼠。接种前，在含血清培养基中生长的PC-3细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗，通过胰蛋白酶消化来收取，并以1200rpm离心7分钟来沉淀。使细胞(1.0x10⁶)重悬于含20%基质胶(Matrigel)的200μl PBS中。动物通过腹膜内(i.p.)注射阿佛丁(Avertin)来麻醉，并使用26号针头向麻醉小鼠的右侧皮下(s.c.)接种1.0x10⁶个细胞。异种移植后5天，将动物随机分成两个对照组，其中为，一周两次用载剂i.p.处理的动物(n=5,PBS)，非免疫小鼠IgG1(n=5,10mg/kg)，和两个实验组，其中为用mAb8B12处理的动物(n=5,10mg/kg)或用mAb13F6处理的动物(n=5,10mg/kg)。每周两次监测肿瘤发展与生长，持续7周。以如下公式确定肿瘤体积：肿瘤体积＝较短直径²x较长直径/2。将一只没有发展明显肿瘤的小鼠，(来自IgG对照组的一只小鼠)从数据分析中排除。PBS和IgG1处理的动物中的肿瘤生长之间没有显著差异(数据未显示)，并且将来自这些小鼠的数据汇集成库(n=9)以供与实验组8B12(n=5)和13F6(n=5)做比较。结果以平均值±SE来分析，并通过不成对、双尾、相等方差，t检验来分析实验数据的比较。免疫组化分析

就免疫组化分析而言，切除原发性肿瘤，在4%多聚甲醛(福尔马林)中固定，并包埋于最佳切片温度(OCT)树脂(Killik，生物光学公司(BIO-OPTICA))中。以8μm对组织块切片，并固定在带正电荷的载玻片上以供免疫染色。使切片在4℃用丙酮孵育1分钟以供Ki-67染色。载玻片用PBS清洗，之后于室温下在孵育前缓冲液(含6%BSA和10%FBS的PBS)中封闭1小时。载玻片在4℃用Ki-67抗体(以1:500稀释)孵育过夜，随后用PBS清洗。使用抗兔Cy3(1:200)和DAPI(1:2500)检测。载玻片用Vectamount AQ固定。切片在室温下用80%乙醇孵育1分钟以供凋亡细胞检测。载玻片用PBS清洗，然后在室温下在孵育前缓冲液中封闭1小时。在4℃用一抗(经切割的胱冬酶-3，1:200)孵育过夜，然后用PBS清洗。对Ki-67染色的载玻片进行检测。就每只动物而言，以10X放大倍数分别分析总共24张切片，以供细胞增殖和凋亡定量。数据以每个视野中的阳性细胞平均数显示。

结果

背景和理论基础

如实施例1所述，相较于可溶性uPAR的“常规”形式，uPA/uPAR-嵌合体^GFDuPAR-hFc、^GFDuPAR-mFc和^GFDuPARmyc显示对VN显著增加(>10.000倍)的结合亲和性。该增加的结合性看似是由这些嵌合体中VN结合位点的更有效暴露所致。有效暴露的VN结合位点的存在说明，可将这些嵌合受体开发成供于生成和/或分离与uPAR中的VN结合位点结合的分子并具有竞争性对抗活性。在该实施例中，作者实际显示了针对^GFDuPAR-hFc产生的单克隆抗体通常结合uPAR中的VN结合位点，并且通常是uPAR功能的有力抑制剂。免疫

为了针对^GFDuPAR-hFc产生单克隆抗体，按照良好建立的方法(参见材料与方法)用重组^GFDuPAR-hFc免疫三只C57Bl6uPAR^-/-动物。用^GFDuPAR-hFc对全部小鼠初始免疫，随后用相同抗原对小鼠施加三次免疫后的免疫加强。七周的间歇期之后，用^GFDuPAR-hFc对一只动物(Ms^#21574)施加融合前免疫加强，并在四天后取出脾脏，并通过聚乙二醇方法使用标准步骤(Galfre等,1977)使脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞系融合。用减少量的^GFDuPAR-hFc对剩余两只小鼠(Ms^#1416和Ms^#1417)施加其它三次免疫加强，在七周的间歇期之后，用^GFDuPAR-mFc给予融合前免疫加强，如上所述将脾细胞分离并与小鼠SP2/0骨髓瘤融合。采用降低水平的抗原进行额外的免疫加强意在提高所得抗体的亲和性。用^GFDuPAR-mFc进行最终的免疫加强以减少与^GFDuPAR-hFc的hFc部分反应的抗体数量，因为在首次融合后鉴定发现约有一半的阳性杂交体识别hFc(数据未显示)。

阳性杂交体、亚克隆和同种型的鉴定

三种不同的融合产生了总计17种(12、3和2分别来自Ms^#21574、Ms^#1416和Ms^#1417)杂交体，所述杂交体生长并显示持续产出与^GFDuPAR-hFc反应但不结合hFc的免疫球蛋白。在所得杂交体中，8种杂交体(5、2和1分别来自Ms^#21574、Ms^#1416和Ms^#1417)通过有限稀释亚克隆以确保克隆性。通过标准蛋白A亲和层析从条件培养基纯化免疫球蛋白，并使用市售的试剂盒来测定同种型。小鼠ID、克隆号和亚克隆号以及免疫球蛋白同种型示于表1。为了测定可变区的序列，从生长中的杂交瘤细胞培养物提取RNA，对其逆转录、扩增并测序。在图9中，所述重链和轻链可变区的推出的氨基酸序列以基于Kabat系统的编号显示，其中互补决定区(CDR)有下划线。

抗体与细胞表面uPAR的反应性。由于所述抗体优选作为结合细胞表面uPAR的抑制性试剂使用，作者首先通过流式细胞术对用空载体和表达人uPAR(huPAR)或小鼠uPAR(muPAR)转染的293细胞测试了抗体特异性。如图10所示，全部8中单克隆抗体(mAb)(第一排和第二排直方图)与表达人uPAR的细胞特异性且有效地结合。除一种抗体(19.10)以外，全部抗体对人uPAR显示显著的物种选择性，因为它们未能有效标记表达小鼠uPAR的细胞。所述唯一的例外，19.10，对小鼠uPAR显示部分反应性。两种具有小鼠uPAR特异性的mAb(BR4和AK17,(Tjwa等,2009))作为对照包括在该分析中。

抑制活性

为了评价不同抗体对抑制活细胞中uPAR信号传导的活性，作者通过阻抗检测使用实时细胞分析仪(RTCA,xCELLigence SP，罗氏公司)来定量细胞粘附。(图11)。在这些实验中，作者使用表达uPAR的293细胞(293/uPAR)，由于它们显示对VN的强uPAR依赖性细胞粘附(Madsen等,2007)。当293/uPAR细胞被接种在VN或纤连蛋白(FN)被覆的孔中时，所述细胞在基质上粘附并铺展，导致细胞指数呈时间依赖性增加。大约1.5-2小时的细胞粘附之后，细胞用载剂对照(图11A)或前uPA(图11B)处理。使用前uPA的处理用配体使uPAR饱和，并增强对VN的uPAR依赖性细胞粘附(Madsen等,2007)，此处通过在前uPA添加后观察到的细胞指数的稳健增加来表明(比较图11中图A和图B的黑色曲线，并注意到前uPA添加后的细胞指数快速增加)。用前uPA处理并不调节细胞对FN的粘附，其由整联蛋白介导(Madsen等,2007)，同样，用前uPA处理没有明显增强FN被覆孔中的细胞指数(图11C)。在前uPA(或载剂)处理后大约1小时，添加稀释量的抗体，并随时间变化记录细胞指数变化。以相对于载剂处理的细胞的在添加所述抗体后一小时观察到的细胞指数的减少来定量抑制活性，并通过如图11D所示的非线性回归来计算IC50值。图11所示的数据显示对一种抗体(8B12)的分析，而针对全部抗体获得的数据汇总示于表2。在该实施例中表征的八种抗体中，发现有六种(8B12、10H6、13D11、19.10、AL38和BE18)抑制基础的uPAR介导的细胞对VN的粘附，其IC₅₀值在低纳摩尔范围。在前uPA的存在下，所述六种抗体中的四种(8B12、10H6、13D11、19.10)粗略地保持未变化的抑制活性，而发现有两种(AL38和BE18)在这些条件下无抑制性。8B12、10H6、13D11和19.10的独有特征是在前uPA的存在下对uPAR介导的对VN的细胞粘附具有抑制能力，由于发现已知的抑制性抗体(R3和R5)在这些条件下无活性(见下文)。所述抗体对针对VN的细胞粘附具有高特异性的抑制活性，由于它们不调节对FN的细胞粘附(图11的图C和D，数据未显示)。

8B12和其它已知的uPAR/VN相互作用抑制剂和/或uPAR功能抑制剂的抑制活性的比较分析。

已经描述uPAR的非蛋白水解活性的多种抑制剂。这些抑制剂包括：代表uPAR/VN相互作用的天然竞争性拮抗剂的VN的uPAR结合性N末端结构域(生长调节素B结构域，SMB)(Deng等,1996)、通过噬菌体展示分离的且显示干扰VN与uPAR结合的合成肽(P7)(WO97/35969)、两种经充分描述的已知干扰uPAR/VN相互作用和uPAR功能的常规抗体(R3和R5)(Sidenius和Blasi,2000)，以及ATN-658抗体(WO2008/073312；WO2005/116077)，所述抗体已显示在前列腺癌模型中减小肿瘤体积和骨骼损伤(Rabbani等,2010)，在肝脏中生长的结肠直肠癌细胞模型中减小体积和建立的疾病(Van Buren等,2009)并减少卵巢癌转移(Kenny等,2010)。uPAR中最小ATN-658结合表位的位置(268KSGCNHPDLD277,WO2008/073312中的Seq ID no.16，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸268-277)与uPAR的C末端距离近，且与本发明所述的抑制性抗体结合的表位(R89、R91和Y92)距离远。作为ATN-658的替代，作者使用详细描述的R2抗体，所述R2抗体与和ATN-658在完全相同的表位结合uPAR(268KSGCNHPDLD277序列中的残基D275，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸275，对于R2结合uPAR至关重要(Gardsvoll等,2007))。

为了比较上述化合物的功能抑制活性，作者在相同试验中对此进行分析，实施所述试验以测定本发明所述的抗体的抑制活性(参见图11)。这些分析的结果以图表形式示于图28，以数据形式示于表2。

在无前uPA存在下定量IC50值，8B12抗体的有效力比R3和R5抗体高4-7倍，比R2抗体高34倍，比SMB结构域高260倍，比P7肽高超过2000倍。注意到，用全部这些化合物(除SMB结构域以外)获得的最大抑制性低于用8B12获得的抑制性，说明单基于本文所用的IC50的比较实际上低估了8B12的抑制活性。在前uPA存在下定量时，仅发现SMB结构域和R2抗体具有显著(>20%)抑制性。就IC50值而言，发现8B12的有效力比R2高25倍，且比SMB结构域高330倍。鉴于在无前uPA存在下时检测的P7肽的活性极差，在前uPA存在下时没有检测该化合物。注意到，除了8B12和R2之间的IC50的25倍差异以外，后者还显示其最大抑制性减少4倍，说明在前uPA存在时8B12的抑制活性也被低估了。因为R2和ATN-658都结合uPAR的相同表位，8B12的活性似乎同样高于该抗体，这证实了体内功效。uPAR中的结合表位作图

为了确定所述抗体的抑制活性的分子基础，作者接着意图对其在uPAR中的结合表位作图。作者之前已经描述了细胞培养物中的uPAR的全功能性丙氨酸扫描(用丙氨酸系统性取代单个残基)(Madsen等,2007)。作者能够获得表达255种不同uPAR突变体的细胞的去污剂裂解物，从而进行ELISA试验以鉴定显示与不同抗体的反应性降低的uPAR突变体。出于多种原因，该筛选的数据质量不够高，不足以明确确定不同单克隆抗体与不同uPAR丙氨酸取代突变体的反应性。不过，多于一种抑制性抗体似乎显示与具有丙氨酸取代的uPAR突变体在接近R91的区域中的反应性降低(数据未显示)。为了以更严格的方式研究该发现，作者对表达所选uPAR的该区域内的丙氨酸取代突变体的293细胞进行了流式细胞术分析(FACS)(图12、13和14)。作者首先比较不同抗体与野生型uPAR以及R83和R89双丙氨酸取代突变体的反应性(图12)。如图所示，所述八种抗体中有五种(8B12、10H6、13D11、19.10和AL6)显示与R83/89A突变体的反应性大幅降低，说明供于这些抗体的结合表位包括R83和/或R89。所述染色强度的降低并非因为该受体突变体的表达水平较低，因为其余三种抗体(13F6、AL38和BE18)对野生型和突变体受体的染色同样地好。在相同实验中，作者还落实了所述受体的前uPA占用度对抗体识别的影响。大多数抗体的结合，包括全部抑制性抗体，都不受uPA存在的显著影响，证明前uPA与这些抗体的结合位点不重叠。相反，抗体AL38和BE18在前uPA的存在下显示大幅降低的反应性，说明这些抗体识别的表位与uPAR中的uPA结合位点重叠。为了测定R83/89A受体识别减少是否归因于R83A和/或R89A突变，作者接着分析了表达多种uPAR突变体的细胞，所述多种uPAR突变体携带分离的R83A和R89A取代，以及在uPAR的该区域(R91A)中的另一个精氨酸残基的丙氨酸取代(已知对VN结合uPAR而言具有重要性)(Gardsvoll和Ploug,2007;Madsen等,2007)(图13)。由此可见，本实验的结果清楚显示R91和R89但非R83是抑制性抗体8B12、10H6、19.10和13D11以及非抑制性抗体AL6的识别表位。这些抗体对uPAR的结合事实上通过R91A的突变而消除，受到R89A突变的大幅影响，但不受R83A取代的影响。剩余抗体(13F6、AL38和BE18)对表达R83A、R89A和R91A突变受体的细胞的染色同等良好，表明由这些抗体识别的表位处于该区域之外，并且所述突变受体的表达同等良好。为了完成对uPAR该区域的分析，作者分析了另一组uPAR突变体(S88A、S90A和Y92A)以及远距离突变(P218A)和uPAR的缺失性突变(其中残基1-83(结构域D1)(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-83)缺失(即残基84-283保留–结构域D2和D3))(图14)。从数据可见，该分析的结果证明除上述R91和R89以外，Y92也对抑制性抗体与uPAR的结合具有重要性。全部抗体对全长受体的识别优于对截短形式的uPAR(缺乏D1)(D2D3参见图15)的识别，说明该受体在所述细胞表面以较低水平表达。一种抗体(13F6)对D2D3受体的识别优于其它抗体，然而其余抗体对完整受体的识别优于对D2D3的识别。

8B12抗体是uPAR的VN依赖性功能的特异性抑制剂，但不干扰依赖于uPA结合的受体的蛋白水解功能。8B12即便在uPA存在下都对uPAR依赖性细胞对VN的粘附具有完整抑制活性(参见图11)，说明该抗体是NV依赖性的uPAR功能的特异性抑制剂。这与该抗体的结合表位一致，该表位以uPAR中的VN结合位点(R91)为中心(参见图13、14和15)，其不涉及uPA结合。为了实验性地测定8B12是否干扰uPA对uPAR的结合，并因而干扰所述受体的蛋白水解功能，作者进行了结合试验，其中使表达uPAR的293细胞(293/uPAR)用固定浓度的铕标记的前uPA(^Eu3+uPA)和递增浓度的待测试化合物一起孵育。如图16所示，在该试验中，抗体8B12和13F6显示没有或极小的竞争活性，而对照抗体R3为未经标记的前uPA(自竞争)有效抑制^Eu3+uPA对293/uPAR细胞的结合。

这些数据表明，8B12不干扰uPA对uPAR的结合，并因而证明该抗体是VN依赖性的uPAR功能的选择性抑制剂。这使8B12和本文所述的其它抑制性抗体(10H6、13D11和19.10)独特。R3和类似的抗体干扰uPA和VN对uPAR的结合(参见图16和图28)。

8B12抗体减少前列腺癌(PC3)的异种移植模型中的肿瘤生长。

为了测定mAb8B12的体内潜在抗肿瘤活性，我们采用前列腺癌异种移植模型进行研究。在该模型中，将一百万个PC3细胞通过皮下途径接种于雄性BalbC nu/nu小鼠的右侧。两周一次用mAb8B12、非抑制性mAb13F6、对照小鼠IgG或PBS(载剂)通过腹膜内注射处理所述异种移植动物，并通过刻度检测肿瘤体积。如图17所示，相较于对照动物而言，用mAb8B12处理的动物显示肿瘤体积显著减小。经处理的动物显示肿瘤体积减小30-40%，这和由其它使用抑制性抗uPAR抗体ATN-658观察到的结果相当(Rabbani SA,等.Neoplasia2010)。就非抑制性抗体13F6而言没有观察到相似抑制，证明8B12的抑制活性的机制是其对VN结合的抑制，而非仅仅靶向表达uPAR的细胞。

采用8B12抗体处理减少细胞增殖并增加异种移植的PC3肿瘤的凋亡。

为了研究经8B12处理的动物中PC-3肿瘤生长降低的生物学原因，作者对取自异种移植后8周的动物的肿瘤切片进行免疫组化分析(图18)。为了评价肿瘤细胞增殖，作者用抗原Ki-67对增殖中的细胞染色，而为了评价凋亡，用活化的(经切割的)胱冬酶-3对其染色。如图18A所示并如图18B中的定量，取自用8B12处理的小鼠的肿瘤显示经历凋亡的细胞数量大幅增加(通过经切割的胱冬酶-3反应性证明)和增殖细胞数量显著减少(通过Ki-67阳性率表明)，说明mAb8B12通过促凋亡和减少细胞增殖来抑制肿瘤生长。用非抑制性mAb13F6抗体处理在细胞增殖和凋亡方面没有引起任何显著变化，说明8B12的生物学活性的原因并不是简单的对表达uPAR的细胞的靶向，而是需要对uPAR/VN相互作用的抑制性作用。

结论

在该实施例中，作者显示针对^GFDuPAR-hFc产生的抗体通常是uPAR功能性抑制剂。本文鉴定的具有更有力抑制性的抗体(8B12、10H6、19.10和13D11)都结合uPAR的相同区域，至关重要的残基为R91、R89和Y92(图15)。所示抗体的结合位点与已公开的所述受体中对于VN的物理结合位点(Huai等,2008)和功能结合位点(Madsen等,2007)部分一致，证明这些抗体的功能性抑制活性由uPAR/VN相互作用的竞争性结抗性介导。这些数据进一步表示，^GFDuPAR-hFc中暴露了uPAR的VN结合位点，并且该区域在小鼠中是抗原性的。作者显示8B12是VN依赖性uPAR功能的选择性抑制剂。此外，8B12通过减少肿瘤细胞增殖和增加凋亡来抑制肿瘤生长。

实施例3

材料与方法

^mGFDmuPAR-Fc的克隆

编码^mGFDmuPAR-Fc的表达载体通过用寡核苷酸muPAkf/mGFDr扩增小鼠uPA cDNA，并用寡核苷酸muL8f/MUPPFCR扩增小鼠uPAR cDNA来生成。混合所述两种PCR产物，用寡核苷酸muPAkf/MUPPFCR共扩增，并与KpnI/XhoI克隆进入载体pFRT/TO-Fc。通过该载体编码的蛋白质(^mGFDmuPAR-Fc，序列9(SEQID NO:17))由小鼠uPA的49个N末端残基包括生长因子结构域(GFD，序列9A(SEQ ID NO:4))、短接头(氨基酸GGAGAAGG，序列9B(SEQ ID NO:8))、小鼠uPAR的残基1-273(序列9C，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-273)、第二短接头(氨基酸VELEVLFQGPIE，序列9D(SEQ ID NO:11))和人Fc标签(序列1C(SEQ IDNO:5))组成。

寡核苷酸序列

muPAkf:5’–GGGGTACCATGAAAGTCTGGCTGGCGAG-3’(SEQ IDNO:54)

mGFDr:5’–CGCCCCGGCCCCTCCTTTTGATGCATCTATCTCACA-3’(SEQ ID NO:55)

muL8f:5’–GGAGGGGCCGGGGCGGCTGGAGGACTGCAGTGCATGCAGTGTGAG-3’(SEQ ID NO:56)

MUPPFCR:5’–AGCGGCTGTAACAGCCCCGTCGACCG-3’(SEQ IDNO:57)

抗体生成

如对于人^GFDuPAR-hFc变体的描述(参见实施例2，材料与方法部分)，在uPAR^-/-小鼠中针对^mGFDmuPAR-Fc生成单克隆抗体。

细胞结合试验

将在含0.1%BSA和25mM Hepes pH7.0(结合缓冲液)的DMEM中悬浮的30x10³个表达人uPAR的293细胞(293/uPAR)接种于被覆了纤连蛋白(10μg/ml于PBS中)的黑色96孔ELISA平板(NUNC)孔中，并使其在37℃下粘附2-4小时。温和清洗之后，使细胞在有或无待测试竞争者的存在下用固定浓度(4nM)的铕标记的前uPA(^Eu3+uPA)孵育。在4℃使结合发生1小时，然后通过使用冷结合缓冲液重复清洗来温和去除未结合的试剂。通过添加0.1ml增强溶液(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))使细胞裂解，然后通过时间分辨荧光强度检测法(Delfia，帕金埃尔默公司)使用EnVision酶标仪(帕金埃尔默公司)来对Eu³⁺标记定量。通过减去在没有细胞但以相同方式处理的孔中检测到的结合来计算特异性结合。

结果

背景和理论基础

上述抑制性抗体都没有结合小鼠uPAR(参见图10)，并因此不可能对人癌的啮齿类异种移植模型的宿主的uPAR表达细胞有任何影响。因此，mAb812的减少肿瘤生长的功效显示，所述抗体可能直接作用于异种移植的人癌细胞。不过，这些抗体的物种特异性妨碍了可靠的临床前测试，因为无法落实其对宿主细胞的可能的正面或负面影响。为了回避该限制，作者生成具有相似抑制活性但对小鼠uPAR也有效的抗体。

鼠uPAR(^mGFDmuPAR-hFc)的构建和生成显示组成型活性的VN结合。出于该目的，作者构建了组成型活性的小鼠uPAR(^mGFDmuPAR-hFc，图19A)，该构建体基本如同GFDuPAR-hFc的描述，但使用编码GFD和uPAR的小鼠源性序列组装。如同预计，所得的嵌合体以高亲和性结合经固定的VN(Kd=0.82nM，图19B)，证明该方案是通用的，并且就不同物种来源的GFD结构域和uPAR而言都具有可行性。针对^mGFDmuPAR-hFc产生的抗体是小鼠uPAR介导的对VN的细胞粘附的有力抑制剂。为了针对^mGFDmuPAR-hFc生成单克隆抗体，如上对于人GFDuPAR-hFc的描述用重组^mGFDmuPAR-hFc使五只C57Bl6uPAR-/-动物免疫。从两只最佳应答动物取出脾，然后通过聚乙二醇法使用标准步骤使脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞系融合。

两种融合产生总共13种杂交体，所述杂交体生长并显示连续产生具有^mGFDmuPAR-hFc反应性且不结合Fc标签的免疫球蛋白(数据未显示)。为了鉴定那些产生抑制性抗体的杂交体，在对VN的细胞粘附试验中使用表达小鼠uPAR的293细胞，测试条件培养基(图20)。在该试验中，四种不同杂交体(OOF12、NM23、NE43和OMD4)的上清液显示明显的抑制活性。发现针对组成型活性人uPAR(GFDuPAR-hFc)产生的抑制性抗体识别人uPAR中的表位与VN结合位点一致，包括功能性重要的Arg91(R91)。为了测定就针对组成型活性的小鼠uPAR(^mGFDmuPAR-hFc)产生的抑制性抗体而言是否也观察到相同显著的特异性，作者用经固定的^mGFDmuPAR-Fc和该受体的单点突变体(^mGFDmuPAR-FcR92A)测试了杂交瘤细胞上清液中抗体的反应性，所述单点突变体中，Arg92(R92)(对应于人uPAR中的Arg91，R91)被丙氨酸残基取代。所述杂交瘤细胞中的两种(OMD4和NE43)的上清液清楚显示对未取代的^mGFDmuPAR-Fc的优先结合(图21)。由于发现这两种杂交体的上清液也具有抑制性，这说明产生的抗体通过结合muPAR中的VN结合位点而是VN/muPAR相互作用的竞争性抑制剂。其它两种抑制性杂交体(OOF12和NM23)同等良好地识别经取代的和未取代的^mGFDmuPAR-Fc，说明其抑制活性通过结合不同表位来介导。在该试验中，还测试了其与人可溶性uPAR(suPAR)的反应性以确定生成的抗体是否与人uPAR交叉反应。发现有一种抗体(OMD4)显示与人uPAR的反应性。

选择四种显示抑制活性的杂交体来进行进一步分析，并通过限制稀释亚克隆来确保克隆性。通过标准蛋白A亲和层析来从条件培养基纯化免疫球蛋白，并如实施例2中所述测定同种型。小鼠ID、克隆号和亚克隆号以及免疫球蛋白同种型示于表4。为了测定可变区的序列，从生长中的杂交瘤细胞培养物提取RNA，对其逆转录、扩增并测序。在图22中，所述重链可变区推得的氨基酸序列以基于Kabat系统的编号显示，其中互补决定区(CDR)有下划线。

最后，作者测试并比较了生成抗体和针对GFDuPAR-hFc(图23)与13F6产生的mAb8B12的物种特异性。与其抑制活性(图20)、对R92的结合表位依赖性(图21)和与人uPAR的反应性(图21)一致，发现抗体OMD4通过人和小鼠uPAR介导抑制细胞粘附。发现全部其它生成的抗体显示物种特异性抑制，而NM23、OOF12和NE43是小鼠uPAR的高度选择性抑制剂。包括13F6抗体作为与人uPAR反应的阴性对照。

结论

作者显示，组成型活性的小鼠uPAR变体可容易地生成，并且其可以高频用于产生抑制性抗体(13种中的4种)；这些抗体的抑制活性常通过使所述抗体直接结合VN结合位点来介导(4种中的2种)。此外，组成型活性小鼠uPAR作为抗原的使用允许生成对小鼠受体具有特异性反应性的抑制性抗体(OOF12、NM23和NE43)以及对小鼠和人受体具有反应性的抗体(OMD4)。

后者抗体将非常有助于未来在小鼠模型中的临床前研究。

实施例4

材料与方法

抗原制备

如实施例1所述表达并纯化uPAR-hFc。VN(1-66)-Fc在先前已经描述(Madsen等)。Pro-uPA获自Jack Henkin,Abbot实验室。

淘选方案

就每轮淘选而言，准备三根NUNC免疫管(immunotube)(A、B和C)并如下所述孵育。全部孵育以总体积4ml进行，并且在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中进行被覆。管先用抗人Fc抗体(管A:150μg/ml和管C:15μg/ml)或前uPA(管B:150μg/ml)被覆过夜。所述管用PBS清洗3次，在含2%牛奶的PBS(2%MPBS)中封闭2小时，并用VN(1-66)-Fc(管A:150μg/ml)孵育，而管C用uPAR/Fc(15μg/ml)和前uPA(15μg/ml)的混合物孵育。管用PBS清洗以取出未结合的试剂，并保持在2%的MPBS直至使用。在第一淘选步骤(负选择)中，向管A添加在4%MPBS中稀释的10¹³t.u.(滴定单位)的噬菌体库，然后在室温下孵育2小时，其中重复翻转30分钟，然后以直立状态放置1.5小时。在第二(负)选择步骤中，将管A的上清液转移至管B，然后如上所述孵育。就第三(正选择)淘选步骤而言，将管B的上清液转移至管C并如上所述孵育。孵育结束时，弃去上清液，所述管用含0.1%吐温-20的PBS清洗10次，用PBS清洗10次，以去除弱结合噬菌体。结合的噬菌体用1ml100mM的三乙胺在室温下重复翻转洗脱5分钟。所述噬菌体洗脱物用0.5ml的1M Tris HCl,pH7.4中和，并用于感染10ml生长中的TG1培养物(OD=0.4)。使受感染的TG1细胞在大型选择平板上铺展，在30℃生长过夜，然后通过刮下收取。噬菌体通过在液体培养物中感染VCS M13(司查塔基公司(StratageneCorp.))辅助噬菌体感染来扩增。从所述培养物上清液收取噬菌体，并通过PEG沉降来浓缩。第二轮和第三轮淘选如同第一轮淘选来进行，不同之处仅在于，在负选择步骤(即，抗人Fc抗体、VN(1-66)-Fc和前uPA)中使用的诱饵蛋白浓度全部至15μg/ml。

结果

背景和理论基础

在实施例1、2和3中，作者显示展示高VN结合活性的uPAR的工程改造形式可被应用于生成作为uPAR功能的强抑制剂的天然抗体。实施例2和3中生成的抗体是鼠源性抗体，因而可能在人中具有免疫原性，可能限制临床应用。已经开发了若干方法以生成完全人抗体，本文作者使用噬菌体展示来分离人单链可变区片段(scFv)抗体，该抗体特异性地与uPAR相互作用，并抑制其功能。由于uPAR-hFc和前uPA的复合物显示高VN结合活性(参见图2A)，作者推论分离结合该复合物的噬菌体将富集与uPAR中的VN结合位点结合的噬菌体(如图24中的卡通图所示)。噬菌体展示scFv文库

本文所用的合成人抗体噬菌体展示文库(ETH-2-Gold)已在先前被描述(Silacci等,2005)且具有30亿单一序列的复杂性。所述文库可从Philogen(http://www.philogen.com/)获得，而具有甚至更高复杂性的更新文库目前也可获得。密切按照如下英特网网址上可得的详细方案来处理所述噬菌体文库：http://www.pharma.ethz.ch/institute_groups/biomacromolecules/protocols/eth

选择步骤

为了分离与配体占用的二聚uPAR结合的scFv抗体，作者使用了基于重复轮数的负选择和正选择的淘选方案来富集与被前uPA占用的uPAR-hFc结合的噬菌体，并排除与正富集步骤的非uPAR成分结合的噬菌体。淘选方案如图24所示。在第一负选择步骤中，通过使悬浮噬菌体吸附至经固定的人Fc(hFc)、用于捕获的山羊抗人Fc抗体(抗hFc)和前uPA来移除与hFc、抗hFc和前uPA结合的噬菌体。将不吸附的噬菌体转移至第二正选择步骤，其中，使用与经固定的抗hFc抗体结合的uPAR-hFc和前uPA的复合物来捕获噬菌体。

阳性克隆的鉴定

在2和3轮选择之后挑出总共564个克隆并通过向在96孔板中生长的液体培养物添加IPTG来诱导小规模scFv生成。通过ELISA检测细菌上清液是否存在对于正淘选和负淘选步骤中所用的蛋白质和蛋白质复合物的结合活性。分析的上清液中，59%(n=335)被记为与正诱饵结合呈阳性(ELISA信号比背景高3倍)。这些之中，仅12%(n=4)也被记为与负诱饵结合呈阳性。这些数据证明，所述负选择方案就移去与正选择所用的蛋白复合物的不需要成分反应的噬菌体而言是有效的。

阳性克隆的序列分析

仅从与正诱饵反应的克隆分离质粒DNA，并对其测序。这之中，从225个克隆获得重链和轻链互补决定3区(HC-CDR3和LC-CDR3)的高质量序列信息，从而分析限于所述这些。总共发现13个单一序列含有占全部克隆的约90%(n=200)的单一序列。对明显序列同源性的手动检查指示，所述13个单一序列可被分为假定具有相似结合特异性的6个不同等级(A-F)(表3)。从所述13个单一序列各选择一个代表性的克隆，并按标准方案进行scFv表达和纯化。

使用前uPA：uPAR-hFc复合物分离scFv结合细胞表面uPAR，并且它们的结合由前uPA调节。

为了检测scFv的特异性，作者对表达人uPAR的293细胞进行了FACS分析，直方图数据示于图25并汇总于表3。四个克隆(1G5、3D9、2H10和3C10)显示强阳性染色，两个克隆显示中等染色(1C1和3B6)，而两个克隆仅弱染色(2G5和1C5)。其余7个克隆是阴性的(数据未显示)并且不进行进一步分析。在有或无前uPA存在下进行染色，以测定scFv结合表位的暴露是否受配体占用度的调节。就一个克隆(3B6)而言，前uPA的存在增加染色强度，而就三个克隆(1C1、3C10和2G5)而言，其减少染色强度。使用前uPA：uPAR-hFc复合物分离scFv抑制uPAR功能。

最初的测试显示三个scFv(1C1、3B6和3C10)抑制uPAR介导的293细胞对VN的粘附(数据未显示)，然而，因为表达和纯化scFv1C1存在困难，仅对3B6(其与1C1的序列非常相似)和3C10做详细分析。为了对抑制活性定量，作者完全按照实施例2中对于单克隆抗体的描述进行实时细胞试验。如图26A所示，3B6以剂量依赖性的方式抑制uPAR介导的细胞对VN的粘附。同样地，在前uPA的存在下(图26B)，scFv3B6减少细胞粘附，但是，效率也有所减少。3B6不影响细胞对FN的粘附说明其特异性(图26C)。通过剂量应答曲线的非线性回归分析(图26D)，在无或有前uPA存在时的IC₅₀浓度经计算分别为561nM和2220nM。类似地，在无前uPA存在时，scFv3C10以剂量依赖性方式抑制uPAR介导的细胞粘附(图27A)。然而，在有前uPA存在下测试时，该scFv没有显著活性(图27B)。同样，所述抑制活性对uPAR介导的细胞对VN的粘附具有特异性，因为其不影响对FN的粘附(图27C)。从剂量应答曲线的非线性回归分析(图27D)可见，在无前uPA存在下的IC₅₀浓度经计算为108nM。

表格

表1：单克隆抗体

上表指示该实施例中所述的小鼠ID、克隆编号、亚克隆编号和单克隆抗体的同种型。

表2：单克隆抗体的抑制活性和与uPAR/VN相互作用和/或uPAR功能的其它已公开抑制剂的活性比较。

不同单克隆抗体的抑制活性汇总。“非抑制性”指以最高测试抗体浓度(300nM)观察到的抑制少于20%。IC₅₀值(即，获得一半最大抑制所需的浓度)及其相关的95%置信区间(以圆括号指示)如图11中对于抗体8B12所示确定。测量单位是纳摩尔(nM)。显示用前uPA预处理的细胞(前uPA预处理)和用载剂预处理的细胞(载剂预处理)的值。

表3：分离的scFv的序列

上表显示按照(Silacci等,2005)编号的分离scFv的重链(VH)和轻链(VL)互补决定区3(CDR3)的序列。短线间的序列是在噬菌体文库中高度突变的区域。在分析的255个克隆中总共发现了13个单一序列。就各单一序列而言，具有该序列的克隆数(#发现)与用于生化表征的代表性克隆的名称一同显示。基于序列间的同源性已将单一序列分成不同等级(A-F)。在无(FACS(-))或有(FACS(+))前uPA存在时与细胞表面uPAR的反应性(参见图25)以代表无(-)、低(+)、中等(++)和高(+++)反应性的任意单位显示。各等级中的保守残基有下划线。

表4：抗^mGFDmuPAR-hFc单克隆抗体

上表指示抗-^mGFDmuPAR-Fc的小鼠ID、克隆编号、亚克隆编号和单克隆抗体的同种型。

序列

野生型人uPAR

MGHPPLLPLLLLLHTCVPASWGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDL CNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSGAAPQPGPAHLSLTITLLMTARLWGGTLLWT(SEQ IDNO:58)

草体表示的是具有单个肽(Met^-22–Gly^-1)的野生型人uPAR的氨基酸序列，西文草体和下划线表示的是添加与Gly²⁸³连接的糖脂膜锚定物后在合成期间所去除的C末端肽(Ala²⁸⁴–Thr³¹³)，粗体表示的是成熟蛋白(Leu¹–Gly²⁸³)。

人uPAR的最小必需区(Trp³²-Tyr⁹²)预计是生成本文所述抗体所需的，并以粗体和下划线显示，对应SEQ ID NO:1的氨基酸32-92。

野生型小鼠uPAR

MGLPRRLLLLLLLATTCVPASQGLQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATN LCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDQDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPTGGAPRPGPAQLSLIASLLLTLGLWGVLLWT(SEQ ID NO:96)

草体表示的是具有单个肽(Met^-23–Gly^-1)的野生型小鼠uPAR的氨基酸序列，西文草体和下划线表示的是添加与Gly²⁷⁵连接的糖脂膜锚定物后在合成期间所去除的C末端肽(Gly²⁷⁶–Thr³⁰⁴)，粗体表示的是成熟蛋白(Leu¹–Gly²⁷⁵)。

小鼠uPAR的最小必需区(Trp³²-Tyr⁹³)预计是生成本文所述抗体所需的，并以粗体和下划线显示，对应SEQ ID NO:2的氨基酸32-93。

野生型成熟小鼠uPAR

LQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAH SEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDQDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPTG(SEQ ID NO:2)

序列1:uPAR-hFc

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)

uPAR残基(序列1A，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)以纯文本显示，接头区(序列1B(SEQ ID NO:9))有下划线，且人Fc标签的C末端(序列1C(SEQ IDNO:5))以草体显示。

序列1A:uPAR残基1-277，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-277

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHS EKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSS DMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPG CPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHG CSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDA FSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLD

预计的最小功能序列(残基3-271)有下划线。

序列1B:接头序列:LEVLFQGPLELEVLFQGPIE(SEQ ID NO:9)

对该接头的长度或序列没有预计的特殊要求。可将其整个省略。

序列1C:人IgG铰链和恒定区(hFc)

PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:5)

来自其它免疫球蛋白类型和/或物种的相似序列可能具有同样好的作用，只要它们形成二聚体或寡聚体即可。

序列2:uPAR-mFc

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLEAGAGPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:15)

uPAR-mFc的成熟序列由人uPAR残基1-277(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)(以纯文本显示)、LEVLFQGPLEAGAG接头(下划线)(序列2A(SEQ ID NO:10))和小鼠IgG1的铰链和恒定区(序列2B(SEQ ID NO:6))(以草体显示)组成。

序列2A:接头。

LEVLFQGPLEAGAG(SEQ ID NO:10)

序列2B:小鼠IgG铰链和恒定区(mFc)。

PRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:6)

小鼠IgG铰链和恒定区(mFc)标签序列由小鼠免疫球蛋白重链的残基216-441组成(根据(Adetugbo,1978)编号)。来自其它免疫球蛋白类型和/或物种的相似序列可能具有同样好的作用，只要它们形成二聚体或寡聚体即可。

序列3:uPARmyc

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPGGEQKLISEEDL(SEQ ID NO:26)

可溶性人uPAR的多肽序列(残基1-274，序列3A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)以纯文本显示，C末端myc标签(GGEQKLISEEDL,序列3B，对应于SEQ ID NO:27)以草体显示。

序列3A:uPAR残基1-274,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHS EKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSS DMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPG CPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHG CSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDA FSMNHIDVSCCTKSGCNHP

预计的最小功能序列(残基3-271(SEQ ID NO:1的氨基酸3-271))有下划线。

序列3B:myc标签

GGEQKLISEEDL(SEQ ID NO:27)

该C末端标签的唯一目的在于免疫学检测和/或纯化。所述序列可被排除而无功能性后果。

序列4:野生型成熟人uPAR

LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSG-(GPI-锚着子)(SEQ ID NO:1)

成熟人uPAR(残基1-283)通过与C末端残基(Gly283)连接的糖脂锚着子连接细胞膜。

序列5: ^GFD uPAR

SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSG-(GPI-锚着子)(SEQ IDNO:16)

^GFDuPAR的多肽序列如下显示：人uPA的GFD结构域(残基1-48，序列5A(SEQ ID NO:3))(以粗体显示)，8个残基的GGAGAAGG接头(序列5B(SEQ IDNO:7))有下划线，且成熟人uPAR(残基1-283，序列4(SEQ ID NO:1))以纯文本显示。成熟^GFDuPAR多肽通过GPI锚着子连接细胞膜，所述锚着子连接uPAR的C末端残基(Gly283)。

序列5A:人uPA的生长因子样结构域(GFD)(残基1-48)

SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(SEQ ID NO:3)

预计的最小序列有下划线。

序列5B:接头序列

GGAGAAGG(SEQ ID NO:7)

该接头的长度和序列可能影响^GFDuPAR的生化性质，因为其可决定GFD结构域与所述嵌合体的uPAR结构域的结合是否以顺式和/或反式(参见图8)进行。就实验上而言，5、8、16和20个残基长度的接头都能良好发挥作用(参见图7)，说明该接头的长度和氨基酸组成是很灵活的。

序列6: ^GFD uPARmyc

SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPGGEQKLISEEDL(SEQ ID NO:28)

^GFDuPARmyc的多肽序列如下显示：人uPA的GFD结构域(残基1-48,序列5A(SEQ ID NO:3))(为粗体)，8个残基的GGAGAAGG接头(序列5B(SEQ ID NO:7))有下划线，人uPAR残基1-274(序列3A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274))以纯文本显示，且C末端myc标签(序列3B(SEQ ID NO:27))以草体显示。

序列7: ^GFD uPAR-hFc

SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:12)

^GFDuPAR-hFc多肽由GFD结构域(序列5A(SEQ ID NO:3))(以粗体显示)、接头(序列5B(SEQ ID NO:7))(有下划线)、uPAR残基1-277(序列1A，对应SEQ IDNO:1的氨基酸1-277))(以纯文本显示)、接头(序列1B(SEQ ID NO:9))(有下划线的草体)和人Fc标签(序列1C(SEQ ID NO:5))(以草体显示)组成。

序列8: ^GFD uPAR-mFc

SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLEAGAGPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:13)

^GFDuPAR-mFc多肽由GFD结构域(序列5A(SEQ ID NO:3))(以粗体显示)、接头(序列5B(SEQ ID NO:7))(有下划线)、uPAR残基1-277(序列1A，对应SEQ IDNO:1的氨基酸1-277))(以纯文本显示)、接头(序列2A(SEQ ID NO:10))(有下划线的草体)和小鼠Fc标签(序列2B(SEQ ID NO:6))(以草体显示)组成。

序列9: ^mGFDmuPAR-Fc

GSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCPRKFQGEHCEIDASKGGAGAAGGLQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDEDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPVELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:17)

^mGFDmuPAR-Fc多肽由小鼠GFD结构域(序列9A(SEQ ID NO:4))(以粗体显示)、接头(序列9B(SEQ ID NO:8))(有下划线)、小鼠uPAR残基1-273(序列9C，对应SEQ ID NO:2的氨基酸1-273))(以纯文本显示)、接头(序列9D(SEQ IDNO:11))(有下划线的草体)和人Fc标签(序列1C(SEQ ID NO:5))(以草体显示)组成。

序列9A:小鼠uPA的生长因子样结构域(GFD)(残基1-49)

GSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCPRKFQGEHCEIDASK(SEQ ID NO:4)

预计的最小序列(残基12-43)有下划线。

序列9B:接头序列

GGAGAAGG(SEQ ID NO:8)

该接头的长度和序列可能影响^mGFDmuPAR-Fc的生化性质。就实验上而言，5、8、16和20个残基长的接头在人变体中都良好发挥作用(参见图7)，说明该接头在实践中的长度和氨基酸组成是很灵活的。序列9C：小鼠uPAR残基1-273，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-273

LQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAH SEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASC TSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDEDYTRGCGSLPGCP GTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCS SEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFP THLNVSVSCCHGSGCNSP

预计的最小功能序列(残基3-270)有下划线。

序列9D:接头

VELEVLFQGPIE(SEQ ID NO:11)

对该序列的长度或氨基酸组成没有预计的特殊要求。

参考文献

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Claims

1.一种尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体分子，所述uPAR变体分子相对于野生型分子具有增加的VN结合活性。

2.如权利要求1所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述uPAR变体分子包含与以下部分连接的野生型uPAR氨基酸序列：

a)连接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生长因子样结构域(GFD)，和/或

b)连接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗体分子的Fc区域的链，其中，若所述Fc区域的链存在，则所述uPAR变体分子是二聚体。

3.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸32-92组成的序列，或者基本由SEQ IDNO:2的成熟muPAR的氨基酸32-93组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

4.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271组成的序列，或者基本由SEQ IDNO:2的成熟muPAR的氨基酸3-270组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

5.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277组成的序列，或者基本由SEQ IDNO:2的成熟muPAR的氨基酸1-273组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

6.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成的序列，或由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

7.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，uPA的所述GFD序列包含基本由SEQ ID NO:3的人uPA的GFD的氨基酸11-42组成的序列，或者基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43组成的序列，或由来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

8.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，uPA的所述GFD序列基本由SEQ ID NO:3的人uPA的GFD序列组成，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD序列组成，或基本由来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽组成，或其功能突变体或衍生物或类似物。

9.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述Fc区的链是人源性的并且包含基本由SEQ ID NO:5组成的序列，或者所述Fc区的链是小鼠源性的并且包含基本由SEQ ID NO:6组成的序列，或者包含由来自Fc区直系同源基因的链的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。

10.如权利要求2-9中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述uPAR变体分子还包含：

a)在所述uPA的GFD序列和所述野生型uPAR序列的N末端之间的第一接头区域，和/或

b)在抗体分子的所述Fc区域的链和所述野生型uPAR序列的C末端之间的第二接头区域。

11.如权利要求10所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述第一接头区域基本由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列组成。

12.如权利要求10或11所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述第二接头区域基本由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列组成。

13.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述uPAR变体分子包含基本具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16或17的序列的序列。

14.前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子作为抗原用于获得特异性抗体分子或者用于选择所述抗体的重组体或合成的抗原结合片段的应用，其中，所述特异性抗体分子具有uPAR功能拮抗剂活性。

15.一种能够与权利要求1-13中任一项所述的尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体结合的抗体，或其重组体或合成的抗原结合片段。

16.如权利要求15所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段具有uPAR功能拮抗剂活性。

17.如权利要求15或16所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段能够与uPAR分子的表位结合，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸残基中的至少一种。

18.如权利要求15-17中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含至少一个重链互补决定区(CDRH3)氨基酸序列，所述CDRH3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21或25的氨基酸90-102、SEQID NO:24的氨基酸90-101，和SEQ ID NO:22或23，

和/或至少一个重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57，

和/或至少一个重链互补决定区(CDRH1)氨基酸序列，所述CDRH1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:18、19、20、21或24的氨基酸22-26和SEQ ID NO:25的氨基酸17-26。

19.如权利要求15-18中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含至少一个轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸80-87，和SEQID NO:74或85，

和/或至少一个轻链互补决定区(CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸41-47，

和/或至少一个轻链互补决定区(CDRL1)氨基酸序列，所述CDRL1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸15-23。

20.如权利要求15-19中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、19、20、21、24和25；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:65、66、67、68和69。

21.如权利要求20所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ IDNO:18、19、20、21和24；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与分别选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、65、68、67和69。

22.用作药物的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。

23.用于癌症治疗的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。

24.用于前列腺癌治疗的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。

25.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段和合适的稀释剂和/或赋形剂。