JP2018527908A - Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物 - Google Patents

Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、この抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の作製方法、前記抗体構築物の医学的使用、及び前記抗体構築物を含むキットを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の作製方法、前記抗体構築物の医学的使用、及び前記抗体構築物を含むキットを提供する。
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、予後不良な、治療選択肢の限られた進行性肺癌であり、肺癌の新規診断数全体の約１５％を占め、これは年間にして米国で約２５，０００件の新規症例、全世界で１８０，０００件の新規症例に相当する。生存率は数十年間、低いままであり、ＳＣＬＣ患者の５年生存数はわずか５％である。その理由の大部分は、この形態の肺癌に対抗する新療法が不十分であることによる。大部分の患者は進行期疾患を示すが、患者の約３分の１は、胸部の片側だけに腫瘍が存在し、それが単一の照射野に収まることによって定義される限局期疾患を示す。このような疾患の段階は利用可能な治療計画に影響を与え、限局期疾患は化学療法及び放射線で治療され、進行期疾患は化学療法単独で治療される。リンパ腫様の特徴を有する播種性転移腫瘍がＳＣＬＣの顕著な特徴である。最初に発見されたＳＣＬＣ患者の診断ではリンパ系の疾患として説明され、１９２６年まで肺癌であると認識されなかった。このことは、他の固形腫瘍と比べてＳＣＬＣ腫瘍に特有な性質の一端を明らかにするものである。
患者は通常、エトポシド及びシスプラチンを含む現行の最先端療法に対して良好に応答するが、現状では治療選択肢が提供されていない化学療法抵抗性疾患を示し、決まってすぐに再発する。再発後の難治性状況での予後は極めて悪く、疾患が急速に進行し、生存期間中央値は６か月未満と短い。さらに、ＳＣＬＣ患者は、高血圧、心臓病、糖尿病、及び腫瘍随伴症候群を含む、併存疾患の割合が高い。このことは、ＳＣＬＣ患者が一般に高齢であることと相まって、患者が過酷な化学療法計画に耐える能力に影響し、さらに治療の選択肢を制限する。
Ｔ細胞上に発現するＣＤ３を認識するｓｃＦｖと、腫瘍関連抗原を認識する別のｓｃＦｖとを含む二重特異性抗体様式は、難治性Ｂ−ＡＬＬなどの血液悪性腫瘍における応答率の高さによって有望な臨床有効性を示し（Ｔｏｐｐ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２．１２０（２６）：ｐ．５１８５−５１８７（非特許文献１））、結果、Ｂｌｉｎｃｙｔｏが承認を得ている。固形腫瘍適応症ではＴ細胞誘導療法による有効性はまだ示されていないが、ＳＣＬＣはこの疾患の播種性を考慮すると、ＣＤ３ｘ腫瘍を標的とする二重特異性抗体様式の有望な固形腫瘍適応症である可能性がある。したがって、特異的腫瘍抗原にＴ細胞を誘導する二重特異性Ｔ細胞誘導療法は、ＳＣＬＣ治療における新たな治療選択肢としての新たな可能性を示すものである。
原発性患者腫瘍のパネルと大規模な正常組織集団でのＤＬＬ３ ｍＲＮＡの有病率を比較した次世代シーケンシングによって、現在、ＤＬＬ３はＳＣＬＣ特異的腫瘍抗原として同定された。ＳＣＬＣ腫瘍におけるＤＬＬ３の発現レベルは中等度であるものの極めてよく見られ、分析された腫瘍の約９０％がＲＮＡ−ｓｅｑによりＤＬＬ３発現の証拠を示した。ＳＣＬＣ腫瘍とは対照的に、正常組織では、ＤＬＬ３転写物の発現は極めて低く、精巣、視神経、及び小脳においてわずかに検出されるに留まった。ＲＮＡ−ｓｅｑによるＳＣＬＣ細胞株及び腫瘍の比較は同様の発現レベルを示したが、ＳＣＬＣ細胞株でのＤＬＬ３発現の細胞表面定量では、一般的な発現レベルが２０００ ＤＬＬ３／細胞未満であるのに対して、ＤＬＬ３の発現レベルが細胞あたり５０００未満を示した。ＤＬＬ３タンパク質の発現をＩＨＣによって確認したところ、ＳＣＬＣ腫瘍の８６％がＤＬＬ３に対して、均一の膜染色パターンを有する陽性染色を示した。小脳の微弱な染色を除いて、他のすべての正常組織がＤＬＬ３染色陰性であった。
ＤＬＬ３は非古典的Ｎｏｔｃｈリガンドであり、細胞自律的に機能して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害し、Ｎｏｔｃｈにシス配置で結合し、それによって古典的Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の顕著な特徴である標的細胞内でのＮｏｔｃｈの細胞間相互作用及び内在化を阻止する。ＤＬＬ３の主要な役割は、胚発生中の体節形成にある。ＤＬＬ３がノックアウトされたマウスは、軸骨格ならびに頭蓋及び神経の発生において区域性欠損を示す。体節パターン形成の欠損はまた、ある種の生殖細胞系列のＤＬＬ３変異をもつヒトにおいても見られ、脊椎肋骨異骨症と呼ばれる病態を生じさせる。
ＤＬＬ３は、ＳＣＬＣに加えて神経膠腫の、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用した診断及び治療方法に既に提案されている（ＷＯ２０１３／１２６７４６（特許文献１））。ＤＬＬ３は細胞表面上のタンパク質の発現レベルが低く、また、低発現の標的に対してはＡＤＣの性能が低下することを考慮すると、ＡＤＣによる方法をＤＬＬ３に用いることには限界がある可能性がある。さらに、ＡＤＣ分子は、多くはリンカーの分解で生じる、遊離した弾頭薬物に付随して毒性を示すことが多く、そのため最大耐性用量に限界があり、抗体に対して選択された標的とは無関係な効力に影響する可能性がある。１細胞あたり数百個の標的タンパク質を発現する細胞株で、必要とされる標的に対するＴ細胞の感受性、及び非常に強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性が実証されていることから、ＤＬＬ３及びＣＤ３を同時に誘導するように設計されたＴ細胞誘導二重特異性分子にとって、この点が問題となる可能性は低い。さらに、正常抗体（全長ＩｇＧ）と比べ、通常はサイズの小さい二重特異性Ｔ細胞誘導抗体構築物は、ＤＬＬ３及びＣＤ３標的をより効率的に誘導するため、組織浸透を促して効力を高めることができ、それによりＴ細胞と標的腫瘍細胞との間のシナプス形成を強化することができる。
ＷＯ２０１３／１２６７４６
Ｔｏｐｐ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２．１２０（２６）：ｐ．５１８５−５１８７
ＳＣＬＣには未充足の医療ニーズが未だ残されており、この相当数の患者集団の予後を改善する新たな治療選択肢が必要とされている。上記で述べた二重特異性抗体様式は臨床的に立証されており、そのようなＤＬＬ３及びＣＤ３を標的とする抗体構築物は、ＳＣＬＣの治療にとって有望である新たな可能性を示し、この適応症に罹患する患者の生存率を高める可能性を示すものである。ＤＬＬ３の過剰発現に関連する腫瘍または癌疾患を治療するための利用可能なさらなる選択肢が未だ必要とされているが、本明細書では、ＤＬＬ３に誘導される第１の結合ドメインと、Ｔ細胞上のＣＤ３に誘導される第２の結合ドメインとを有する二重特異性抗体構築物の形態によりこの問題を解決する手段及び方法を提供する。
したがって、第１の態様では、本発明は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインが、配列番号２６０に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、二重特異性抗体構築物を提供する。
エピトープマッピングでＣＨＯ細胞に発現したＤＬＬ３ ＥＣＤ／短縮型ＤＬＬ３構築物の模式図。膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインはＥｐＣＡＭに由来する。実施例１を参照のこと。 抗ＤＬＬ３抗体構築物のエピトープマッピング。エピトープマッピングによって検出された、それぞれＥＧＦ−３ドメイン及びＥＧＦ−４ドメインを認識する二重特異性抗体構築物の例。ｘ軸はＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン、Ａ＝シグナル領域）を示し、ｙ軸は計数を示す。実施例２を参照のこと。 フローサイトメトリーによって検出された抗ＤＬＬ３抗体構築物の交差反応性：ヒト及びマカクのＤＬＬ３及びＣＤ３への結合性。ｘ軸はＦＬ２−Ｈを示し、ｙ軸は計数を示す。実施例５を参照のこと。 フローサイトメトリーによる抗ＤＬＬ３抗体構築物の分析：ヒトパラログＤＬＬ１及びＤＬＬ４への非結合性。ｘ軸はＦＬ１−Ｈを示し、ｙ軸は計数を示す。実施例６を参照のこと。 ヒト血漿中で９６時間インキュベートした後の抗ＤＬＬ３抗体構築物の安定性。実施例１１を参照のこと。 抗ＤＬＬ３抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの効力差。実施例１５を参照のこと。 実施例１６に記載した通りに実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ内在化アッセイ。Ｔ細胞を欠く標的細胞（ＳＨＰ−７７）で抗体構築物をプレインキュベートし、内在化に起因する抗体構築物の損失を測定した。結果は有意な内在化が起こらないことを示唆している。内在化が周知である対照標的で得た結果を右側に比較として示す。 ＳＨＰ−７７モデル（図８Ａ）及びＷＭ２６６−４モデル（図８Ｂ）のマウス異種移植片有効性試験の結果。腫瘍容積を時間に対してプロットしている。実施例１８を参照のこと。 実施例２０で測定された、種々のＨＬＥ抗体構築物（図９Ａのアルブミン融合体及び図９ＢのＦｃ融合体）の薬物動態。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象物を包むことに留意すべきである。したがって、例えば「試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）」に関する言及は、１つ以上のそのような異なる試薬を含み、「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」に関する言及は、本明細書に記載される方法を変更または置き換えることができる、当業者に既知である同等のステップ及び方法に関する言及を含む。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素のすべてを指すと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を理解するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができる。このような等価物は、本発明に包含されるものとする。
本明細書で使用される「及び／または」という用語は、「及び」、「または」、及び「前記用語によって接続された要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内、及び最も好ましくは±５％以内を意味する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上、特に必要がない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定された整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群を包含するが、いかなる他の整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群をも排除することを意味しないことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と置き換え可能であり、あるいは本明細書で使用される場合、場合によって用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と置き換え可能である。
本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項要素に指定されていない、いかなる要素、ステップ、または成分をも除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない材料またはステップを除外しない。
本明細書の各例において、用語「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」は、他の２つの用語のいずれとも置き換え可能である。
用語「抗体構築物」は、構造及び／または機能が、抗体、例えば全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づいている分子を指す。したがって、抗体構築物は、その特異的標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体構築物は、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、好ましくは６つすべてのＣＤＲの存在によって特定することができる。本発明による構築物を基にした抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含む。
本発明による「抗体構築物」の定義内には、バイオテクノロジーまたはタンパク質工学の方法またはプロセスによって作製されるラクダ抗体及び他の免疫グロブリン抗体も含む全長抗体または全抗体である。これらの全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体であり得る。ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）などの、全長抗体の断片もまた「抗体構築物」の定義内である。本発明による抗体構築物はまた、抗体変種とも称される改変された抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖもしくはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、以下の構造によって例示される「ミニボディ」：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）、もしくは（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２、マルチボディ、例えばトリアボディもしくはテトラボディ、及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディ、または他のＶ領域もしくはドメインの抗原もしくはエピトープに独立して特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ、もしくはＶＬであり得る可変ドメインを１つだけ含む単一可変ドメイン抗体であり得る。本発明による抗体構築物のさらに好ましい形態は、クロスボディ、マキシボディ、ヘテロＦｃ構築物、及びモノＦｃ構築物である。これらの形態の例を以下に説明する。
結合ドメインは一般に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得るが、その両方を含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、無傷の抗原結合ドメインの抗原結合機能を一部保持している。抗体断片、抗体変種、または結合ドメインの形態の追加例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価断片であるＦａｂ断片； （２）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、最後のものが好ましい（例えば、ｓｃＦｖライブラリ由来）。本発明による抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。
さらに、用語「抗体構築物」の定義には、一価、二価、及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ／ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）構築物が含まれ、したがって１つの抗原性構造にのみ特異的に結合する単一特異性構築物、ならびに異なった結合ドメインを通じて２つ以上の抗原性構造、例えば２つ、３つまたはそれ以上と特異的に結合する二重特異性及び多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ／ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）構築物を含む。さらに、用語「抗体構築物」の定義には、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、ならびに同一鎖（ホモ二量体、ホモ三量体、またはホモオリゴマー）でも異なる鎖（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロオリゴマー）でもあり得る２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上記で特定した抗体及びその変種または誘導体の例は、特に、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９に記載されている。
本発明の抗体構築物は、好ましくは、「ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された抗体構築物」である。本用語は、可変領域の全部または一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏファージディスプレイ、タンパク質チップ、または候補配列の抗原結合能を試験することができる任意の他の方法により作製される、上記定義による抗体構築物を指す。したがって、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞でのゲノム再編成によってのみ作製される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学を用いて作製された抗体である。
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、少量存在する可能性がある天然の変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き同一である集団を含む個々の抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なる決定基（またはエピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位または決定基に対して誘導される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養により抗体の産生をもたらす任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することも、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
次いでハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングし、指定された抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、そのいずれもの変種または断片、ならびにその抗原性ペプチドなど、どの形態の関連抗原でも免疫原として使用することができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用すると、ＤＬＬ３またはＣＤ３イプシロンなどの、標的抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を、ヒト以外の動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ、またはラットなど）の免疫化に使用することができる。一実施形態では、ヒト以外の動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生の欠損するマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きな断片を用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、望ましい特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５を参照のこと。
モノクローナル抗体はまた、ヒト以外の動物から得た後、当技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、ヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うことができる。改変抗体構築物の例には、ヒト以外の抗体のヒト化変種、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照のこと）、及びエフェクター機能（複数可）が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）を含む。
免疫学において親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増加した抗体をＢ細胞が産生する過程である。同一抗原への反復暴露により、宿主は親和性が連続的に増加する抗体を産生する。天然のプロトタイプと同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、変異と選択の原理に基づいている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体断片の最適化に使用され、成功を収めている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原、またはエラープローンＰＣＲ法を用いて導入される。また、遺伝的多様性は、鎖シャッフリングによって増加させることができる。ファージディスプレイなどの提示方法を用いた、２または３ラウンドの変異と選択により、通常は低ナノモル範囲の親和性を有する抗体断片が得られる。
抗体構築物の好ましいアミノ酸置換変種型は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含むものである。一般に、さらなる開発を目的とする選択の結果、得られる変種（複数可）は、元となる親抗体と比べて改善された生物学的特性を有する。そのような置換変種を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を伴う。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）が、それぞれの部位で可能なアミノ酸置換がすべて生じるように変異される。そのようにして生成された抗体変種は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次いでファージディプレイされた変種を、本明細書に開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変される超可変領域部位候補を同定するには、アラニンスキャン変異導入法を実行して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいはまたは加えて、結合ドメインと例えばヒトＤＬＬ３との接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基が、本明細書で詳述する技術による置換の候補である。そのような変種を作製した後、変種のパネルに対して、本明細書に記載されるスクリーニングを施し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を示す抗体を以降の開発のために選択することができる。
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、ある特定の種に由来するかまたはある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに望ましい生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書で目的とするキメラ抗体には、ヒト以外の霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。キメラ抗体を作製する様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ ２１７７０９６を参照のこと。
抗体、抗体構築物、抗体断片、または抗体変種はまた、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によって改変することもできる。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができる。このペプチドが、潜在性Ｔ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に定義）となる。潜在性Ｔ細胞エピトープの検出には、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載されるように、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピューターモデリング手法を使用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースで、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合するため、潜在性Ｔ細胞エピトープとなる。検出された潜在性Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一のアミノ酸置換によって除去することができる。通常は保存的置換を行う。すべてではないが多くの場合、ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通するアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖細胞系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されるコンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
「ヒト化」抗体、抗体構築物、またはそれらの変種もしくは断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）とは、ヒト以外の免疫グロブリン由来の配列（複数可）を最小限に含む、大部分がヒト配列である抗体または免疫グロブリンである。主としてヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（またはＣＤＲ）由来の残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するヒト以外（例えば齧歯類）の種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ハムスター、またはウサギの超可変領域由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基で置換される。さらに、本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」はまた、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。このような改変は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するためになされる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含み得る。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列で置換することによって作製することができる。ヒト化抗体またはその断片を作製するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、ならびにＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１、ＵＳ５，６９３，７６２、ＵＳ５，８５９，２０５、及びＵＳ６，４０７，２１３に示されている。この方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインのすべてまたは一部分をコードする核酸配列を単離、操作、及び発現することを含む。そのような核酸は、上記のような、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマのほか、他の供給源から得ることができる。次いでヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニック動物、例えばマウスを用いて産生することもできる。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用することができる例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてが、ヒト以外のＣＤＲの少なくとも一部分で置換されていても、またはＣＤＲの一部のみがヒト以外のＣＤＲで置換されていてもよい。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲのみを置換する必要がある。
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換、及び／または復帰変異の導入によって最適化することができる。そのような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野で既知である複数の技術のいずれによっても作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２、及びＥＰ２３９４００を参照）。
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」、及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されたものを含む、当技術分野で既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する抗体領域、例えば可変及び定常領域またはドメインを有する抗体、抗体構築物、及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体構築物、または結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。このヒト抗体、抗体構築物、または結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の位置を有し得る。本明細書で使用される場合、ヒト抗体、抗体構築物、及び結合ドメインの定義はまた、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術またはシステムを使用することによって得ることができる、非人為的及び／または遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体を想定している。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。本明細書に開示される抗体構築物を記載するために使用される場合、「単離された」または「実質的に純粋な」は、その産生環境の成分から同定、分離、及び／または回収された抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境由来のすべての他の成分を付随しないか、または実質的に付随しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などの、その産生環境の混入成分は、通常はポリペプチドの診断または治療用途を妨げる物質であり、これには酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。抗体構築物は、例えば、所与のサンプル中の全タンパク質の少なくとも約５重量％または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、環境に応じて総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドが高い濃度レベルで生成されるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって有意に高濃度でポリペプチドを生成することができる。この定義には、当技術分野で既知の多種多様な生物体及び／または宿主細胞での抗体構築物の産生を含む。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用して、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いた非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。ただし、通常、単離された抗体構築物は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
用語「結合ドメイン」は、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、すなわち本明細書ではそれぞれＤＬＬ３及びＣＤ３と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインとみなす。第１の結合ドメイン（ＤＬＬ３を認識する）の構造及び機能、好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能も、抗体の、例えば全長免疫グロブリン分子または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第２の結合ドメインはまた、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／または第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を足場に移植する以外に、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング法によって作製されるか、または入手されることを想定している。
本発明によれば、結合ドメインは１つ以上のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたはグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含んでもよい。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及び通常３０未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、共有ペプチド結合を通じて相互に連結された（結合によってアミノ酸の鎖を形成する）２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、通常３０超のアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドはさらに、二量体、三量体、及びより高次のオリゴマーなどの多量体を形成する、すなわち複数のポリペプチド分子からなる場合もある。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても、同一でなくてもよい。そのような多量体の対応する高次構造は、したがってホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指す。本明細書で言及される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」はまた、ＰＥＧ化などの化学修飾されたものであり得る。そのような修飾は、当技術分野で周知であり、本明細書で以下に記載されている。
好ましくは、ＤＬＬ３に結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）などのヒト以外の可変及び／または定常領域を有する抗体または抗体構築物に伴う問題の一部を回避する。そのような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体または抗体構築物の迅速なクリアランスをもたらす可能性、あるいは患者による抗体または抗体構築物に対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来抗体または抗体構築物の使用を避けるには、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物を作製することができる。
ＹＡＣにおいてメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築する機能、及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する機能は、非常に大きいまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明、ならびにヒト疾患の有用なモデルの作製にとって強力な手法となる。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するそのような技術を利用すると、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達、ならびに疾患の誘発及び進行への関与について独特の見解を得ることができる。
そのような戦略の重要な実用例が、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び組み立て、ならびにＢ細胞の発生における役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、そのような戦略によって、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができる。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスｍＡｂまたはマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を向上させることが期待される。完全ヒト抗体または抗体構築物の使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫、及び癌の治療に大幅な利点が得られるものと期待され得る。
この目標に向けた手法の一つが、マウス抗体の産生に欠損があり、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有するマウス系統を、組換え操作によって作製することであり、これは、このようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きなヒトＩｇ断片は、可変遺伝子の広範な多様性に加えて、抗体の産生および発現の適切な調節も保持すると考えられる。このマウス機構を抗体の多様化及び選択のため、ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容を失わせるために利用することにより、このマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーが、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を用いることで、望ましい特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができると考えられる。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の作製と関連して示された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含むヒト重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列構成断片を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。このヒトＩｇを含むＹＡＣは、抗体の再構成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが実証されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。このことは、それらがＢ細胞の発生を誘導し、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント、及びヒトＩｇ定常領域を含むヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫刺激に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現できることを示唆した。先頃、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座それぞれのメガ塩基サイズの生殖細胞系列構成ＹＡＣ断片の導入によって、ヒト抗体レパートリーの約８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号を参照のこと。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製はさらに、米国特許出願第０７／４６６，００８号、同第０７／６１０，５１５号、同第０７／９１９，２９７号、同第０７／９２２，６４９号、同第０８／０３１，８０１号、同第０８／１１２，８４８号、同第０８／２３４，１４５号、同第０８／３７６，２７９号、同第０８／４３０，９３８号、同第０８／４６４，５８４号、同第０８／４６４，５８２号、同第０８／４６３，１９１号、同第０８／４６２，８３７号、同第０８／４８６，８５３号、同第０８／４８６，８５７号、同第０８／４８６，８５９号、同第０８／４６２，５１３号、同第０８／７２４，７５２号、及び同第０８／７５９，６２０号、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、及び同第５，９３９，５９８号、ならびに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号、同第３０６８５０６Ｂ２号、及び同第３０６８５０７Ｂ２号で議論され概説されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、及びＷＯ０３／４７３３６も参照のこと。
別の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含む他社が「ミニ遺伝子座」の手法を利用している。このミニ遺伝子座の手法では、外来性Ｉｇ遺伝子座を、このＩｇ遺伝子座からの一部分（個々の遺伝子）を含めることにより模倣する。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、及び第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物に挿入される構築物を形成する。この手法は、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙそれぞれに対する米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号及び同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、及び同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、同第０７／５７５，９６２号、同第０７／８１０，２７９号、同第０７／８５３，４０８号、同第０７／９０４，０６８号、同第０７／９９０，８６０号、同第０８／０５３，１３１号、同第０８／０９６，７６２号、同第０８／１５５，３０１号、同第０８／１６１，７３９号、同第０８／１６５，６９９号、同第０８／２０９，７４１号に記載されている。ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
Ｋｉｒｉｎもまた、ミクロセル融合によって大きな染色体片または染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願第７７３２８８号及び同第８４３９６１号を参照のこと。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、有望なヒト抗体産生技術を開発中である。この技術では、ＳＣＩＤマウスを、ヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／またはＴ細胞で再構成する。その後、マウスを抗原で免疫刺激して、その抗原に対する免疫反応を生じさせることができる。米国特許第５，４７６，９９６号、同第５，６９８，７６７号、及び同第５，９５８，７６５号を参照のこと。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応をきっかけとして、産業界ではキメラ抗体またはそれ以外のヒト化抗体が作製されている。しかし、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が、特に慢性または多用量でのこの抗体の利用において今後観察されるものと予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ反応の懸念及び／または影響をなくすために、ＤＬＬ３に対するヒト結合ドメイン及び／またはＣＤ３に対するヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましいと考えられる。
用語「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）誘導される」、及び「（特異的に）反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、すなわち本明細書ではそれぞれＤＬＬ３及びＣＤ３と相互作用する、または特異的に相互作用することを意味する。
用語「エピトープ」は、結合ドメイン、抗体もしくは免疫グロブリン、または抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、断片、もしくは変種が特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であり、したがって用語「エピトープ」は、本明細書において「抗原構造」または「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義すると理解される。
「エピトープ」は、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次元折り畳みによって近接する非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。線状エピトープは通常、固有の配列内に、少なくとも３つまたは少なくとも４つ、及びより一般的には、少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つ、例えば約８〜約１０のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。一般的に、立体構造エピトープは、線状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらの断片の三次元構造を認識する（本発明の場合、第１の結合ドメインに対する抗原構造が、ＤＬＬ３タンパク質内に含まれている）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成されている場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、ｘ線結晶解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピンラベル法、及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
エピトープマッピングの方法を以下に記載する。ヒトＤＬＬ３タンパク質の領域（隣接するアミノ酸鎖）が、ヒト以外及び霊長類以外のＤＬＬ３抗原（例えばマウスＤＬＬ３であるが、他にニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどのものも考えられる）の対応する領域で置換される場合、使用されているヒト以外、霊長類以外のＤＬＬ３に対して結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の減少が起こると予想される。前記減少は、ヒトＤＬＬ３タンパク質の対応する領域への結合を１００％とした場合に、ヒトＤＬＬ３タンパク質内の対応する領域への結合と比較して、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、または８０％、最も好ましくは９０％、９５％、またはさらには１００％である。上記のヒトＤＬＬ３とヒト以外のＤＬＬ３のキメラはＣＨＯ細胞に発現させることを想定している。また、ヒトＤＬＬ３とヒト以外のＤＬＬ３のキメラを、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合させることも想定している。
エピトープマッピングの代替的または付加的方法では、ヒトＤＬＬ３細胞外ドメインの短縮型をいくつか作製し、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定することができる。これらの短縮型では、異なる細胞外ＤＬＬ３ドメイン／サブドメインまたは領域が、Ｎ末端から開始して段階的に欠失される。本発明に関連して作製され、使用された短縮型ＤＬＬ３を図１に示す。短縮型ＤＬＬ３はＣＨＯ細胞で発現されることを想定している。また、短縮型ＤＬＬ３を、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合させることも想定している。また、短縮型ＤＬＬ３が、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドを含むことも想定している。さらに短縮型ＤＬＬ３は、細胞表面上での正確な発現を確認できるようにＮ末端（シグナルペプチドの後ろ）にｖ５ドメインを含むことも想定している。結合ドメインによって認識されるＤＬＬ３領域をそれ以上含まない短縮型ＤＬＬ３では、結合性の減少または欠失が起こると予想される。結合の減少は、ヒトＤＬＬ３タンパク質全体（またはその細胞外領域もしくはドメイン）への結合を１００％とした場合、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、及び最も好ましくは９０％、９５％、またはさらには１００％である。この結合の欠失を試験する方法については実施例２に記載する。
抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析しようとする各残基を例えば部位特異的変異誘発によってアラニンで置換するアラニンスキャン（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ ＆ Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照のこと）である。アラニンが使用される理由は、多くの他のアミノ酸が有している標準的二次構造を模倣するにもかかわらず、嵩高くなく、化学的に不活性であり、メチル官能基を有しているためである。変異させる残基のサイズを保存することが望ましい場合には、時としてバリンまたはロイシンなどの嵩高いアミノ酸を使用することができる。アラニンスキャンは、長期にわたり使用されてきた成熟した技術である。
結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域との間の相互作用とは、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原（本明細書では、それぞれＤＬＬ３及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対しては、測定可能な親和性を示し、かつ、一般にＤＬＬ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に対しては有意な反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」には、約１０−６Ｍ（ＫＤ）またはそれより強い親和性をもつ結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合に、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的に特異的に反応または結合するかどうかは、特に、標的タンパク質または抗原に対する前記結合ドメインの反応を、ＤＬＬ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することによって、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＤＬＬ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、ＤＬＬ３以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。
用語「本質的／実質的に結合しない」または「結合することができない」とは、本発明の結合ドメインが、ＤＬＬ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、ＤＬＬ３またはＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合に、ＤＬＬ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に対して３０％超、好ましくは２０％を超えない、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、または５％超の反応性を示さないことを意味する。
また、本発明の抗体構築物は、Ｆ１７２Ｃ及びＬ２１８ＰのＤＬＬ３点突然変異のうち一方または両方を有するヒトＤＬＬ３アイソフォームに結合することも想定している。実施例５を参照のこと。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらモチーフの一次、二次及び／または三次構造の結果として、ならびに前記各構造の二次的修飾の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、抗原に対する前記部位の単純結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などによって、代替的にまたは付加的に、シグナルを開始させることができる。
本発明による抗体構築物は、ＥＧＦ−３及びＥＧＦ−４領域を含むアミノ酸鎖に対応する、配列番号２６０に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する。それ以外の抗ＤＬＬ３結合物質群も作製し、そのＤＬＬ３結合特異性をエピトープマッピング時に同定した（実施例２を参照）。
作製された結合物質のうち最も大きい群は、ＤＳＬドメイン内のエピトープを認識した。しかしながら、これらの抗体構築物のいずれも、刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞とした、最初の１８時間の５１Ｃｒによる細胞傷害性アッセイにおいて、十分な細胞傷害活性の基準を満たさなかった。
さらに、最初の４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイ（非刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞として使用）において、タンパク質のＮ末端内のＤＬＬ３エピトープを認識した結合物質は、１４５５〜１５８０ｐＭのＥＣ５０値を示した。現在の状況では、患者の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性を癌細胞に対して誘導する治療用途に提供される二重特異性抗体にとって、このＥＣ５０値は適切でないと考えられる。
最後に、別の結合物質群を作製し、さまざまなアッセイにおいてその細胞傷害活性を特性決定した。これらの結合物質のエピトープマッピングから、ＥＧＦ−５領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに対する特異性が明らかとなり、またＥＧＦ−６領域内でもある程度の特異性が明らかになった（詳細については実施例２を参照）。ＤＬＬ３−１８、ＤＬＬ３−１９、ＤＬＬ３−２０、及びＤＬＬ３−２１と命名したこれらの結合物質に対する異なる細胞傷害性アッセイ（実施例８．３、８．５、８．６、及び８．７を参照）で生成されたデータの概要図から、ＥＣ５０値の有効性に関しては全アッセイにおいて結合物質すべてが不適当ではないものの、本発明による抗体構築物と比較した場合、群全体が明らかに下回っていることが明らかになった。この観察結果は、表６〜９に示す結果のうち網掛けにより強調表示されている。
要約すると、本発明による抗体構築物（配列番号２６０に示す領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する）は、異なるエピトープ特異性を有する、種々の他のＤＬＬ３結合物質群と比較して、格段に良好な活性を示していると確信できる。言い換えれば、本発明による抗体構築物は、有利なエピトープ活性関係を示すことで、強力な二重特異性抗体構築物媒介性の細胞傷害活性を裏付けている。
別の態様では、本発明は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインが、配列番号２５８に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、二重特異性抗体構築物を提供する。
好ましくは、本発明の二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む：
ａ）配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｈ）配列番号１０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｉ）配列番号１１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
用語「可変」とは、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体または免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）の対は、一体となって単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域のサブドメインに集中している。このサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、６つのＣＤＲが三次元空間内で抗原結合表面を形成する際に足場となる。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、これらが、ループ接続を形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって連結される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接した一団として保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，を参照）。
用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、それによって抗体分子の機能的活性に寄与する。すなわちこれは抗原特異性の主たる決定基である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、分類及び付番方式に従う。したがってＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔまたは任意のその他の境界の定義によって表わすことができる。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、この各方式によるＣＤＲの定義は、長さ、及び隣接するフレームワーク領域との境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（種間配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍを参照のこと（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位の特徴を決定するさらに別の標準が、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照のこと。２つの残基同定技術が同一の領域ではなく重複する領域を定義する場合に限り、両方を組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従う付番が好ましい。
通常、ＣＤＲは、カノニカル構造に分類することができるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」とは、抗原結合（ＣＤＲ）ループが取る主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造のうち限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角を特徴とし得る。したがって抗体間の対応するループは、各ループの大部分に、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、選択されるループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間には関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さによって、及びそのループ内ならびに保存的フレームワーク内（すなわち、ループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、この重要なアミノ酸残基の存在に基づいて成され得る。
用語「カノニカル構造」はまた、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）により分類されているような、抗体の線状配列に関する考慮も含む場合がある。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも述べているように本発明での適用に好ましいスキームである。さらに別の構造的な考慮事項も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用することができる。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違を、Ｃｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、及び／またはその他の技術、例えば結晶学及び二次元もしくは三次元コンピューターモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列を、特に、（例えば、さまざまなカノニカル構造をライブラリに含めたいという要望に応じて）適切なシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類することができる。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（前掲）に記載される構造的な考慮事項、ならびに抗体構造のカノニカルな外観の構築へのそれらの関与については、文献に記載されている。さまざまなクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、当技術分野で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと。
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定要因となる場合がある。いくつかの抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３が、抗原と抗体間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させること、及びどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は通常、抗体結合部位範囲での分子的多様性の最大の根源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基程度の短いもの、または２６個超のアミノ酸であり得る。
古典的な全長抗体または免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結され、同時に２つのＨ鎖はＨ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは通常ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞媒介性の細胞傷害性、及び補体活性化などのさまざまなエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えばＦｃ受容体に位置する細胞表面と相互作用することができる。
組立て及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。免疫系はそのようにして免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」とは、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体または一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントのｉｎ ｖｉｖｏでの再配置によって生成され得る。あるいは、この配列（複数可）は、再配置を生じさせるもの、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に応答して細胞から生成され得る。あるいは、この配列（複数可）の一部またはすべては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発、及びその他の方法によって得られる場合がある。（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照）レパートリーは、１つの配列のみを含んでも、遺伝的に多様なコレクション内のものを含む、複数の配列を含んでもよい。
本発明による好ましい抗体構築物はまた、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の（好ましくはヒトの）結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインがＤＬＬ３−４、ＤＬＬ３−５、ＤＬＬ３−６、ＤＬＬ３−７、ＤＬＬ３−８、ＤＬＬ３−９、及びＤＬＬ３−１０からなる群から選択される抗体と同じＤＬＬ３のエピトープに結合する二重特異性抗体構築物、すなわち、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む抗体であると定義することもできる：
ａ）配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｅ）配列番号７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｇ）配列番号９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
抗体構築物が、別の所与の抗体構築物と同じＤＬＬ３のエピトープに結合するかどうかは、例えば、本明細書の上記及び実施例２に記載するように、キメラまたは短縮型標的分子とのエピトープマッピングなどにより測定することができる。
本発明による好ましい抗体構築物はまた、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の（好ましくはヒトの）結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインがＤＬＬ３−４、ＤＬＬ３−５、ＤＬＬ３−６、ＤＬＬ３−７、ＤＬＬ３−８、ＤＬＬ３−９、及びＤＬＬ３−１０からなる群から選択される抗体と結合を競合する二重特異性抗体構築物、すなわち、上記からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む抗体であると定義することもできる。
抗体構築物が、別の所与の抗体構築物と結合を競合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞を用いた競合アッセイなどの競合アッセイで測定することができる。またアビジンを結合したマイクロ粒子（ビーズ）を使用することもできる。アビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる際、このビーズのそれぞれを基材として使用することができ、そこでアッセイを実施することができる。抗原をビーズ上にコーティングし、次いで一次抗体でプレコーティングする。二次抗体を添加して、さらに何らかの結合が生じるかを確認する。フローサイトメトリーによって測定値を読み取る。
本発明の一実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号４３５、及び配列番号５２９に示されたものからなる群から選択されるＶＨ領域を含む。
本発明のさらなる実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号４３６、及び配列番号５３０に示されたものからなる群から選択されるＶＬ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号３７＋３８、配列番号４７＋４８、配列番号５７＋５８、配列番号６７＋６８、配列番号７７＋７８、配列番号８７＋８８、配列番号９７＋９８、配列番号１０７＋１０８、配列番号１１７＋１１８、配列番号４３５＋４３６、及び配列番号５２９＋５３０に示されたＶＨ領域とＶＬ領域の対からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号４３７、及び配列番号５３１に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
上記第１の結合ドメイン（そのＣＤＲ、ＶＨ領域、及びＶＬ領域、ならびにそれらの組み合わせによって特定される）は、配列番号２５８に示される領域内に含まれたＤＬＬ３のエピトープに結合することを特徴とする結合ドメインである。
本明細書で使用される場合、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体構築物、すなわち、少なくとも第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、第１の結合ドメインが１つの抗原または標的（本明細書ではＤＬＬ３）に結合し、第２の結合ドメインが別の抗原または標的（本明細書ではＣＤ３）に結合する抗体構築物を指す。したがって、本発明による抗体構築物は、少なくとも２種類の抗原または標的に対する特異性を備える。本発明の「二重特異性抗体構築物」という用語はまた、多重特異性抗体構築物、例えば、３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体構築物、または３種を上回る（例えば、４種、５種などの）特異性を有する構築物を包含する。
本発明による抗体構築物が（少なくとも）二重特異性である場合、自然界では発生せず、天然に存在する産物とは顕著に異なる。したがって「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なった結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、さまざまな方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照のこと。
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体構築物の一方の（可変及び／または結合）ドメインと他方の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、そのペプチドリンカーがいかなる重合活性も有さない点である。特に好適なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載されているものである。ペプチドリンカーはまた、本発明の抗体構築物に他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期延長ドメインなど）を結合するために使用することもできる。
リンカーを使用する場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインそれぞれが互いから独立して他と異なる結合特異性を確実に維持できるように十分な長さ及び配列であることが好ましい。本発明の抗体構築物中の少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーには、ごく少数のアミノ酸残基、例えば１２アミノ酸残基以下しか含まないペプチドリンカーが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、４、３、２、または１アミノ酸を含み、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」に関連して、特に好ましい「単一」アミノ酸はＧｌｙである。したがって、前記ペプチドリンカーは単一アミノ酸Ｇｌｙからなるものであってよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号２８６）、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘにおいて、ｘが１またはそれより大きい整数（例えば２または３）であることを特徴とする。好ましいリンカーを配列番号２８５〜２９３に示す。二次構造の促進を伴わない前記ペプチドリンカーの特徴は当技術分野で既知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）、及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメイン相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子工学によって得ることができる。融合され機能的に連結された二重特異性一本鎖構築物を調製し、哺乳動物細胞または細菌中に発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
本明細書の上記に記載するように、本発明は、抗体構築物が（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及び前述の形式のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形態である好ましい実施形態を提供する。用語「形態である」は、本明細書に記載されるように、構築物を、例えば他の部分との連結または融合などによりさらに修飾できることを除外するものではない。
特定の好ましい実施形態によれば、添付の実施例に記載されているように、本発明の抗体構築物は「二重特異性一本鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、上記に記載するように、組換え法を用いて合成リンカーによって両者を連結し、ＶＬ及びＶＨ領域を対として一価分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）。この抗体断片は当業者に既知の従来技術を使用して得られ、断片の機能は全抗体または全長抗体と同様に評価される。したがって一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、通常約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって連結される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性を得るためにはグリシンに富み、ならびに溶解性を得るためにはセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と連結することができる。このタンパク質は、定常領域を除去してリンカーを導入しているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を維持する。
二重特異性一本鎖分子は、当技術分野で既知であり、ＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３、Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の作製について記載された技術（特に、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２０１０），前掲、及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照）は、選択された標的（単数複数可）を特異的に認識する一本鎖抗体構築物の作製に適合させることができる。
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（ｄｉｖａｌｅｎｔとも呼ばれる）または二重特異性一本鎖可変断片（形態（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、上記に記載するリンカーを用いて）連結することにより設計することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、同じ標的エピトープに対して価数２を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域とを有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによって行うことができる（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８−２４４）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型はダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４−８．を参照）。
本発明の抗体構築物のさらなる好ましい実施形態によれば、（標的抗原ＤＬＬ３またはＣＤ３のいずれかに結合する）結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）を、上記のようなペプチドリンカーによって直接連結せずに、ダイアボディに関する記載のように結合ドメインを形成する。したがって、ＣＤ３結合ドメインのＶＨを、ペプチドリンカーによってＤＬＬ３結合ドメインのＶＬと融合することができ、ＤＬＬ３結合ドメインのＶＨは、そのようなペプチドリンカーによってＣＤ３結合ドメインのＶＬに融合される。
単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインと独立して、特異的抗原に選択的に結合できる抗体可変ドメインを１つのみ（単量体）含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダに見られる重鎖抗体から設計され、これはＶＨＨ断片と呼ばれている。軟骨魚類もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的手法は、例えばヒトまたは齧歯類由来の一般的な免疫グロブリンの二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨまたはＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大半の研究は現時点で重鎖可変ドメインに基づくものであるが、軽鎖由来のナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、または単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、及びＶＮＡＲを含む群から独立して選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体構築物である。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記の単一ドメイン抗体及び１つの上記のｓｃＦｖ分子から構成されるモノクローナル抗体構築物である。この場合もリンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。
さらに、本発明は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインが、配列番号２５９に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、二重特異性抗体構築物を提供することを想定している。
したがって、本発明のさらなる態様では、二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む：
ａ）配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｃ）配列番号１４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｄ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｅ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｆ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｇ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｈ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４１に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｉ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｊ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｋ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｌ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４１に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｍ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
一実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、及び配列番号４５５に示されたものからなる群から選択されるＶＨ領域を含む。
さらに別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、及び配列番号４７０に示されたものからなる群から選択されるＶＬ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１２７＋１２８、配列番号１３７＋１３８、配列番号１４７＋１４８、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１３７＋４５６、配列番号１３７＋４５７、配列番号１３７＋４５８、配列番号１３７＋４５９、配列番号１３７＋４６０、配列番号４４５＋１３８、配列番号４４６＋１３８、配列番号４４７＋１３８、配列番号４４５＋４６０、配列番号４４８＋４６１、配列番号４４９＋４６２、配列番号４５０＋４６３、配列番号４５０＋４６４、配列番号４５０＋４６５、配列番号４５０＋４６６、配列番号４５０＋４６７、配列番号４５０＋４６８、配列番号４５１＋４６３、配列番号４５２＋４６３、配列番号４５３＋４６３、配列番号４５１＋４６８、配列番号４５４＋４６９、及び配列番号４５５＋４７０に示されたＶＨ領域とＶＬ領域の対からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
さらに別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、及び配列番号４９３に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
上記第１の結合ドメイン（そのＣＤＲ、ＶＨ領域、及びＶＬ領域、ならびにそれらの組み合わせによって特定される）は、配列番号２５９に示される領域内に含まれたＤＬＬ３のエピトープに結合することを特徴とする結合ドメインである。
本発明による別の好ましい抗体構築物はまた、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の（好ましくはヒトの）結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインがＤＬＬ３−１３、ＤＬＬ３−１４、及びＤＬＬ３−１５からなる群から選択される抗体と同じＤＬＬ３のエピトープに結合する二重特異性抗体構築物、すなわち、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む抗体であると定義することもできる：
ａ）配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
ｂ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
ｃ）配列番号１４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
本発明による別の好ましい抗体構築物はまた、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の（好ましくはヒトの）結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、当該第１の結合ドメインがＤＬＬ３−１３、ＤＬＬ３−１４、及びＤＬＬ３−１５からなる群から選択される抗体と結合を競合する二重特異性抗体構築物、すなわち、上記からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む抗体であると定義することもできる。
本発明の抗体構築物は、標的分子であるＤＬＬ３及びＣＤ３に結合する機能に加えて、さらなる機能を有することも想定されている。この形態での抗体構築物は、ＤＬＬ３への結合によって標的細胞を標的化し、ＣＤ３への結合によって細胞傷害性Ｔ細胞の活性を媒介し、さらなる機能、例えば、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞の動員により抗体依存性細胞傷害性を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメイン、標識（蛍光など）、毒素もしくは放射性核種などの治療薬、及び／または血清半減期を延長する手段などを提供することによる、三機能性または多機能性抗体構築物である。
本発明の抗体構築物の血清半減期を延長する手段の例には、抗体構築物に融合されたまたはそれ以外の方法で結合されたペプチド、タンパク質、またはタンパク質のドメインを含む。ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインの群には、血清アルブミンなどの人体内で好ましい薬物動態特性を示す他のタンパク質と結合するペプチドを含む（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照）。そのような半減期を延長するペプチドに代わる概念として、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照）に結合するペプチドが挙げられ、これも本発明の構築物に使用することができる。タンパク質の大きなドメインまたは完全なタンパク質を結合する概念としては、例えば、ヒト血清アルブミンの融合、ヒト血清アルブミンの変種もしくは変異体（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６を参照）またはそれらのドメインの融合、ならびに免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメイン）及びその変種の融合が挙げられる。そのようなＦｃドメインの変種を最適化／修飾して、Ｆｃ受容体結合性（例えば、Ｆｃγ受容体）を除去するためまたはその他の理由で望ましい二量体または多量体の対合を可能にすることができる。当技術分野で既知である、人体内での小タンパク質化合物の半減期を延長するためのさらなる概念は、本発明の抗体構築物などの小タンパク質化合物のＰＥＧ化である。
好ましい実施形態では、本発明による二重特異性抗体構築物を、例えば、構築物の血清半減期の延長を目的として、（例えばペプチド結合によって）融合パートナー（タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドなど）と連結することができる。この融合パートナーは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」または「ＨＡＬＢ」）、ならびにその配列変種、ＨＳＡに結合するペプチド、ＦｃＲｎに結合するペプチド（「ＦｃＲｎ ＢＰ」）、または（抗体由来）Ｆｃ領域を含む構築物から選択することができる。この融合パートナーの例示的な配列を配列番号２９５〜３４１に示す。一般的には、融合パートナーは、直接（例えば、ペプチド結合によって）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、「ｎ」は２以上の整数、例えば２または３または４）などのペプチドリンカーを介して、本発明による二重特異性抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に連結することができる。好適なペプチドリンカーを配列番号２８５〜２９３に示す。
したがって、本発明による好ましい抗体構築物は以下を含む。
（ａ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・場合により、配列番号２９４に記載されるものなどのＨｉｓタグ；
（ｂ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・場合により、配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号２９５及び３０１〜３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・場合により、配列番号２９４に記載されるものなどのＨｉｓタグ；
（ｃ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・Ｘ１がＹまたはＨであるアミノ酸配列
Figure 2018527908
を有するポリペプチド；及び
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・アミノ酸配列
Figure 2018527908
を有するポリペプチド；ならびに
・場合により、配列番号２９４に記載されるものなどのＨｉｓタグ；
（ｄ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド
・配列番号３４８、配列番号３５７、配列番号３６６、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番号３９３、配列番号４０２、配列番号４１１、配列番号４２０、配列番号４２９、及び配列番号４３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；；
・Ｃ末端側にセリン残基が続く、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号４３６、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、及び配列番号５３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号３３１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号４３５、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、及び配列番号４５５、及び配列番号５２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・Ｃ末端側にセリン残基が続く、配列番号３４９、配列番号３５８、配列番号３６７、配列番号３７６、配列番号３８５、配列番号３９４、配列番号４０３、配列番号４１２、配列番号４２１、配列番号４３０、及び配列番号４３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３４８、配列番号３５７、配列番号３６６、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番号３９３、配列番号４０２、配列番号４１１、配列番号４２０、配列番号４２９、及び配列番号４３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号４３６、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、及び配列番号５３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３３に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、及び配列番号１６７、配列番号４３５、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、及び配列番号５２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・Ｃ末端側にセリン残基が続く、配列番号３４９、配列番号３５８、配列番号３６７、配列番号３７６、配列番号３８５、配列番号３９４、配列番号４０３、配列番号４１２、配列番号４２１、配列番号４３０、及び配列番号４３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３４に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｆ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号３３５に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｇ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３７に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３８に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｈ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３３９に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号３４０に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；または
（ｉ）以下をＮ末端から以下の順に含むポリペプチド：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号２８５〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号３４１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
例えば、本発明の好ましい二重特異性抗体構築物は、以下に示すものからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる：
配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、及び配列番号２５１。
上記のように、本発明のいくつかの好ましい抗体構築物は、アルブミンまたはアルブミン変種などの別の部分との融合によって修飾される。こうした融合構築物の特性、例えば標的親和性または細胞傷害活性などについて特性決定すれば、類似する融合構築物または非修飾二重特異性抗体構築物が、類似した（またはおそらくさらに良好な）特性を有するものと予測できることを当業者は理解されよう。例えば、アルブミンと融合された二重特異性抗体構築物が、測定可能なまたは望ましい細胞傷害活性または標的親和性を有する場合、アルブミンを含まない同様の構築物にも、同じもしくは類似した、またはさらに高い細胞傷害活性／標的親和性が観察されると予測できる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体構築物は、（２つの結合ドメインに加えて）第３のドメインを含み、このドメインは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）はペプチドリンカーを介して互いに融合される。好ましくは、前記第３のドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。前記第３のドメインの好ましいアミノ酸配列を配列番号５４１〜５４８に示す。前記ポリペプチド単量体のそれぞれは、好ましくは、配列番号５３３〜５４０からなる群から選択されるアミノ酸配列か、またはそれらの配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物の第１及び第２の結合ドメインは、例えば配列番号２８５、２８６、２８８、２８９、２９０、２９２、及び２９３からなる群から選択されるペプチドリンカーを介して第３のドメインと融合される。
本発明によれば、「ヒンジ」はＩｇＧヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔ付番法を使用した類推により特定することができる（Ｋａｂａｔ位置２２３〜２４３を参照）。上記によれば、「ヒンジ」の最小要件は、Ｋａｂａｔ付番法によるＤ２３１〜Ｐ２４３のＩｇＧ１配列鎖に対応するアミノ酸残基である。ＣＨ２及びＣＨ３という用語は、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３を意味する。これらの領域は、Ｋａｂａｔ付番法を使用した類推により特定することができる（ＣＨ２についてはＫａｂａｔ位置２４４〜３６０、及びＣＨ３についてはＫａｂａｔ位置３６１〜４７８を参照）。免疫グロブリン間には、それらのＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域、及びＩｇＥ Ｆｃ領域に関して、多少の変動があることがわかっている（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７（１９９３）を参照）。Ｆｃ単量体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ単量体はまた、これらのドメインのＮ末端に柔軟なヒンジを含むことができる。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体はＪ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３を含み、最初の２つのドメインとＣＨ２間にヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ部分の境界は変動する場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例では、例えば、ＩｇＧ４の場合、それぞれ（ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１〜（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６、またはＤ２３１〜Ｌ４７６を含むと定義することができる（付番はＫａｂａｔによる）。
したがって、本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順に以下を含み得る：
（ａ）第１の結合ドメイン；
（ｂ）配列番号２８６、２９２、及び２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２の結合ドメイン；
（ｄ）配列番号２８５、２８６、２８８、２８９、２９０、２９２、及び２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）；
（ｆ）配列番号５５０、５５１、５５２、及び５５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
（ｇ）第３ドメインの第２のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）。
本発明の抗体構築物はまた、Ｎ末端からＣ末端の順に以下を含むことが好ましい：
・配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４３７、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、及び配列番号５３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合ドメイン；
・配列番号２８６、２９２、及び２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５０、配列番号３５９、配列番号３６８、配列番号３７７、配列番号３８６、配列番号３９５、配列番号４０４、配列番号４１３、配列番号４２２、配列番号４３１、及び配列番号４３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合ドメイン；
・配列番号２８５、２８６、２８８、２８９、２９０、２９２、及び２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号５４１〜５４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、及び配列番号５２８に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
配列表（表１８）には、ＤＬＬ３−４及びＤＬＬ３−１４と命名した結合物質の配列変種も示す。これらの配列変種に挿入された点変異は、対応するｓｃＦｖ分子内にあるこの変異の位置に従って識別される。あるいは、ＣＤＲ領域またはＶＨ／ＶＬ領域でもあり得る、基準となるポリペプチドに応じて、この位置を識別する方法も可能であると理解される。例えば、ＤＬＬ３−４−００１と命名された変種は、そのｓｃＦｖ分子（配列番号４３７）内にＧ４４Ｃ−Ｇ２４３Ｃの二重変異を有する。これは、対応するＶＨ鎖のＧ４４Ｃ変異（配列番号４３５）及び対応するＶＬ鎖のＧ１０１Ｃ変異（配列番号４３６）に相当する。
抗体構築物の共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に含まれ、これは常にではないものの一般に翻訳後に行われる。例えば、抗体構築物のいくつかの種類の共有結合修飾は、抗体構築物の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートと反応させて誘導体化されるが、それはこの薬剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるという理由による。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化する他の好適な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
アルギニル残基は、１つまたは複数の従来的な試薬、特にフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、この反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応することができる。
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成することができる。１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する上記のクロラミンＴ法が適している。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は場合により異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
二官能性剤を用いた誘導体化は、本発明の抗体構築物を非水溶性の支持マトリックスまたは支持表面に架橋して、さまざまな方法に使用する際に有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生成する。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス、ならびに米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基材がタンパク質の固定化に使用される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に含まれる。
他の修飾として、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗体構築物の別の種類の共有結合修飾には、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で既知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で述べる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不在）、またはそのタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物体の両方に依存し得る。個別の発現系について以下で述べる。
ポリペプチドのグリコシル化は通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付加を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ただし、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素付加の際に認識配列となる。したがって、ポリペプチド中にこのいずれかのトリペプチド配列が存在すると、グリコシル化可能な部位となる。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの糖の、ヒドロキシアミノ酸への付加を指し、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用される場合もある。
抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することにより行うと好都合である。改変はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）開始配列への１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によって行うこともできる。簡潔には、抗体構築物のアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更、特に目的のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、予め選択された塩基で変異させることによって改変することが好ましい。
抗体構築物上の糖鎖部分の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的結合による。このような手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化の際に、グリコシル化が可能なタンパク質を宿主細胞に産生する必要がない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖（複数可）を（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加することができる。このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
出発抗体構築物上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的または酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって、及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により記載されている。ポリペプチド上の糖鎖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されている、さまざまなエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。グリコシル化可能な部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されている化合物ツニカマイシンの使用により防止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド連結の形成を妨げる。
本明細書では抗体構築物の他の修飾も想定されている。例えば、抗体構築物の別の種類の共有結合修飾には、さまざまな非タンパク質性ポリマーへの抗体構築物の架橋を含み、このポリマーには、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される様式の種々のポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない。加えて、当技術分野で既知のように、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体構築物内のさまざまな位置でアミノ酸置換を行うことができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。立体障害の可能性を低減するために、さまざまな長さのスペーサーアームによって標識基を抗体構築物に結合することができる。タンパク質を標識するさまざまな方法が当技術分野で既知であり、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」または「標識基」とは、任意の検出可能な標識を指す。一般に標識は、標識を検出しようとするアッセイに応じて、さまざまなクラスに分類され、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの放射性同位体または重同位体であり得る、同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基、及び「低分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（発色団、蛍光体、及びフルオロフォアを含むがこれらに限定されない）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出することができる任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー、及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
また好適なタンパク質性蛍光標識としては、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ， １９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）、及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号、同第５，４１８，１５５号、同第５，６８３，８８８号、同第５，７４１，６６８号、同第５，７７７，０７９号、同第５，８０４，３８７号、同第５，８７４，３０４号、同第５，８７６，９９５号、同第５，９２５，５５８号）が挙げられるが、これらに限定されない。
ロイシンジッパードメインは、それが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは当初、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、それ以降、さまざまな異なるタンパク質に見出されている。特に知られているロイシンジッパーは、二量体化または三量体化する、天然に存在するペプチド及びその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質の作製に適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーはＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載されている。そこに融合される異種タンパク質の安定的な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用については、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。ある手法では、ロイシンジッパーペプチドに融合されたＤＬＬ３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、好適な宿主細胞に発現させ、得られる可溶性オリゴマーＤＬＬ３抗体断片または誘導体を培養上清から回収する。
本発明の抗体構築物はまた、例えばその分子の単離に役立つ、またはその分子の薬物動態プロファイルの適合に関連する追加ドメインを含んでもよい。抗体構築物の単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離用カラムで捕捉できるペプチドモチーフまたは二次的に導入される部分から選択することができる。そのような追加ドメインの非限定的な実施形態には、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）、ならびにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。ＣＤＲの同定によって特徴付けられる本明細書に開示する抗体構築物はすべて、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン）のリピートとして一般に知られているＨｉｓタグドメインを含むことが好ましい。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体構築物のＮ末端にもＣ末端にも位置することができるが、Ｃ末端に位置することが好ましい。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を、ペプチド結合を介して本発明による抗体構築物のＣ末端に連結する。
本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する。ヒトＤＬＬ３の好ましいアミノ酸配列は、配列番号２５２によって表される。用語「表面に」は、本発明に関連して、結合ドメインがＤＬＬ３細胞外ドメイン（ＤＬＬ３ ＥＣＤ）内に含まれるエピトープに特異的に結合することを意味するものと理解される。したがって、本発明による第１の結合ドメインは、好ましくは、天然に発現する細胞もしくは細胞株によって、及び／またはＤＬＬ３で形質転換されたもしくは（安定的に／一過性に）トランスフェクトされた細胞もしくは細胞株によって発現される場合に、ＤＬＬ３に結合する。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインはまた、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＳｃａｔｃｈａｒｄなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて、ＤＬＬ３を「標的」または「リガンド」分子として使用する場合に、ＤＬＬ３に結合する。「標的細胞」は、その表面にＤＬＬ３を発現するいずれの原核細胞または真核細胞でもあり得るが、好ましくは標的細胞は、ヒトまたは動物の身体の一部である細胞、例えばＤＬＬ３を特異的発現する癌細胞または腫瘍細胞である。
用語「ＤＬＬ３ ＥＣＤ」とは、ＤＬＬ３の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まないＤＬＬ３の一形態を指す。本発明のＤＬＬ３ポリペプチドでの膜貫通ドメインの同定は、当技術分野でその種の疎水性ドメインの同定に慣用的に用いられている基準に従って同定されることを当業者は理解されよう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変動し得るが、本明細書で具体的に述べるドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸以下までである可能性が高い。好ましいヒトＤＬＬ３ ＥＣＤを配列番号２５３に示す。
ヒトＤＬＬ３に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦２０ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦２ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．６ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、最も好ましくは≦０．４ｎＭである。例えば、親和性は、例えば実施例に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはＳｃａｔｃｈａｒｄアッセイにおいて測定することができる。それ以外の親和性の測定方法も当業者に周知である。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体、白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在する点で他のリンパ球、例えばＢ細胞及びＮＫ細胞と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担い、２種類のタンパク質鎖から構成される。９５％のＴ細胞で、ＴＣＲはアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と接触すると、Ｔリンパ球が、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子、及び活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて活性化される。
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物では、この複合体にＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖が含まれる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む、関連性の高い免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含む。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトの第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７の範囲に含まれる。
多特異性、少なくとも二重特異性抗体構築物によるＴ細胞の動員を通じてリダイレクトされる標的細胞の溶解には、細胞溶解シナプスの形成ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。関与するＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示、またはクローン性Ｔ細胞の分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照）。
ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害性は、さまざまな方法で測定することができる。実施例８．１〜８．７を参照のこと。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または未刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合、またはマカクＤＬＬ３を発現するもしくはマカクＤＬＬ３でトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もまた、マカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源であるべきである。標的細胞は、ＤＬＬ３、例えばヒトまたはマカクＤＬＬ３（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、ＤＬＬ３、例えばヒトまたはマカクＤＬＬ３で安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株（例えば、ＣＨＯ）であり得る。あるいは、標的細胞は、ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７などの天然ＤＬＬ３陽性発現細胞株であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面に高レベルのＤＬＬ３を発現する標的細胞株では低くなると予測される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は通常、約１０：１であるが、これは変更することもできる。ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１クロム放出アッセイ（インキュベーション時間約１８時間）において、またはＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（インキュベーション時間約４８時間）において測定することができる。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰに基づくアッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ、及びＥＣＩＳ技術を含む。
本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定される。また、５１クロム放出アッセイでも測定することができる。細胞傷害活性はＥＣ５０値によって表され、これは最大半量有効濃度（ベースラインと最大値の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体構築物の濃度）に相当する。好ましくは、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭまたは≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦４００ｐＭまたは≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭまたは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。
さまざまなアッセイにおいて、上記に定めたＥＣ５０値を測定することができる。刺激された／濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した場合、未刺激のＰＢＭＣと比較して、ＥＣ５０値が低くなると予想できることを当業者は認識している。さらにＥＣ５０値は、標的細胞が多数の標的抗原を発現する場合、標的発現の少ないラットと比べ低くなると予測することができる。例えば、刺激された／濃縮ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する（及びＣＨＯ細胞などのＤＬＬ３トランスフェクト細胞またはＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７のいずれかを標的細胞として使用する）とき、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するとき、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ（特に、標的細胞がＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７である場合）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に標的細胞がＣＨＯ細胞などのＤＬＬ３トランスフェクト細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭ、またはそれ以下である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＨＯ細胞などのマカクＤＬＬ３トランスフェクト細胞株を標的細胞株として使用するとき、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦２０００ｐＭまたは≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭまたは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭである。
好ましくは、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＤＬＬ３陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、または溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」、または「溶解を本質的に媒介しない」とは、ＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７（上記参照）を１００％とした場合に、本発明の抗体構築物がＤＬＬ３陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、または５％超の溶解を誘導または媒介しないことを意味する。これは通常、５００ｎＭまでの抗体構築物の濃度で当てはまる。当業者であれば、特に労力を要さずに細胞溶解を測定する方法を理解している。さらに、本明細書では細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。
個々のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差を「効力差（ｐｏｔｅｎｃｙ ｇａｐ）」と称する。この効力差は、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との比率で算出することができる（実施例１５を参照）。本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力差は、好ましくは≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２、最も好ましくは≦１である。
本発明の抗体構築物の第１及び／または第２の（または任意のさらなる）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーにおいて種間特異的である。種間特異的ＣＤ３結合ドメインについては、例えばＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態によれば、第１及び／または第２の結合ドメインは、それぞれ、ヒトＤＬＬ３及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル、オランウータン、及びヒト以外のヒト亜科物を含む（がこれらに限定されない）霊長類のＤＬＬ３／ＣＤ３にも結合する。標的細胞の表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインはまた、少なくともマカクＤＬＬ３にも結合し、及び／またはＴ細胞の表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインはまた、少なくともマカクのＣＤ３にも結合することが想定される。好ましいマカクは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）もまた想定される。
本発明の好ましい二重特異性抗体構築物は、標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３及び少なくともマカクＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む。本実施形態の一態様では、第１の結合ドメインは、配列番号２６０に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する。
本発明の一態様では、第１の結合ドメインは、ヒトＤＬＬ３に結合し、さらにカニクイザルのＤＬＬ３などのマカクＤＬＬ３、より好ましくはマカクＤＬＬ３ ＥＣＤに結合する。好ましいカニクイザルＤＬＬ３を配列番号２７１に示す。好ましいマカクＤＬＬ３ ＥＣＤを配列番号２７２に示す。マカクＤＬＬ３に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ、最も好ましくは≦０．０５ｎＭ、またはさらには≦０．０１ｎＭである。
好ましくは、本発明による抗体構築物の、マカクＤＬＬ３対ヒトＤＬＬ３［ｍａ ＤＬＬ３：ｈｕ ＤＬＬ３］の結合親和性の差は（例えば、ＢｉａＣｏｒｅまたはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により測定したとき）、０．１〜１０、より好ましくは０．２〜５、さらにより好ましくは０．３〜４、さらにより好ましくは０．５〜３または０．５〜２．５、最も好ましくは０．５〜２または０．６〜２である。実施例３及び４を参照のこと。
本発明の抗体構築物の一実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、またはコモンリスザルのＣＤ３イプシロンに結合する。好ましくは、第２の結合ドメインはこれらのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する。また、第２の結合ドメインは、ヒト及びマカク属ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することも想定されている。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７の範囲に含まれる。さらに具体的には、エピトープは少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む。コモンマーモセット及びワタボウシタマリンはいずれもマーモセット科に属する新世界霊長類であり、一方、コモンリスザルはオマキザル科に属する新世界霊長類である。
本発明の抗体構築物にとって、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
本発明の抗体構築物の好ましい代替実施形態では、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３。
本発明の抗体構築物にとって、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
あるいは、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、以下からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを特徴とする：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域；ならびに
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域。
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、結合ドメイン、及び特に（Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する）第２の結合ドメインは、ＶＨ領域及びＶＬ領域の対が、一本鎖抗体の形態（ｓｃＦｖ）である形態を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域はリンカー配列のＮ末端側に位置し、ＶＬ領域はリンカー配列のＣ末端側に位置することが好ましい。
本発明の上記抗体構築物の好ましい実施形態は、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを特徴とする。
したがって、一実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号４３８、及び配列番号５３２に示されるものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。この抗体構築物は、配列番号２５８に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する第１の結合ドメインを有する。
代替的実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号１３０、配列番号１４０、配列番号１５０、配列番号１６０、配列番号１７０、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、及び配列番号５１６に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。この抗体構築物は、配列番号２５９に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する第１の結合ドメインを有する。
本明細書に記載される抗体構築物のアミノ酸配列修飾もまた企図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性の改善が望ましい場合である。抗体構築物のアミノ酸配列変種は、抗体構築物の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾はすべて、未修飾の親分子の目的とする生物学的活性（ＤＬＬ３及びＣＤ３への結合）を引き続き保持している抗体構築物を生成するはずである。
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は通常、その技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）；ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、望ましい場合は修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または希少アミノ酸を使用してもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）の存在によって分類することができる。
アミノ酸修飾は、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換を含む。最終構築物が望ましい特徴を保持する限り、最終構築物に到達するように欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行う。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変化などの抗体構築物の翻訳後過程も変化させ得る。
例えば、ＣＤＲそれぞれにおいて１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸（無論、ＣＤＲの長さ次第）が挿入または欠失される場合があり、対するＦＲそれぞれにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が挿入または欠失される場合がある。好ましくは、アミノ酸配列の挿入には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合体及び／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本発明の抗体構築物の挿入変種は、抗体構築物のＮ末端もしくはＣ末端への酵素の融合体、または抗体構築物の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合体を含む。
置換変異誘発にとって最も重要な目的部位は、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域を含むが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲの変更もまた想定される。置換は好ましくは、本明細書に記載される保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が置換される場合があり、対するフレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が置換される場合がある。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの１、２、または３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、または６個が置換されることが想定される。
変異誘発にとって好ましい位置である抗体構築物の特定の残基または領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されている「アラニンスキャン変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、抗体構築物内の残基または標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性または負電荷アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換する。
次いで、さらなる変種または他の変種を置換部位にまたは置換部位の代わりに導入することによって、置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の働きを分析または最適化するため、アラニンスキャンまたはランダム変異誘発を標的コドンまたは標的領域に実施することができ、発現される抗体構築物の変種を目的の活性に最適な組み合わせについてスクリーニングする。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、ＤＬＬ３またはＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
一般に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つ以上またはすべてにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は「当初」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一であることが好ましい。これは、ＣＤＲが「置換された」配列とどの程度同一であるかはＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲが、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するには、その置換されたアミノ酸配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、その置換配列に対して、程度の異なる同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有し、ＣＤＲＬ３が９０％を有する場合がある。
好ましい置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓまたはｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）は、保存的置換である。ただし、抗体構築物が第１の結合ドメインを介してＤＬＬ３に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３またはＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、及び／または抗体構築物のＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一である）限り、（非保存的置換または以下の表１に列挙される「例示的な置換」の１つ以上を含む）いずれの置換をも想定される。
保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出し下に示す。そのような置換が生物学的活性を変化させる場合、表１で「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスに関連して以下でさらに記載する、より実質的な変更を導入し、望ましい特性について産物をスクリーニングすることができる。
（表１）アミノ酸置換
Figure 2018527908
本発明の抗体構築物の生物学的特性における実質的な変更は、（ａ）例えばシート状もしくはらせん状の立体構造である、置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に与える効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、この各クラスのいずれか１つのメンバーの別のクラスとの交換を伴うことになる。抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンで置換すると、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋を回避することができる。逆に、抗体にシステイン結合（複数可）を付加すると、（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）安定性を改善することができる。
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／または類似性は、当技術分野で既知の技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の部分配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより、または目視により決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメーターに基づきＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から複数の配列アラインメントを生成する。これはまた、アラインメントの生成に使用されたクラスター化関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法はＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３により記載されたものと類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ重みが３．００、デフォルトのギャップ長重みが０．１０であり、重み付けエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）を含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０から得たＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは、以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的な値であり、個々の配列の組成、及び目的配列を検索する特定のデータベースの組成に応じてプログラム側で決定されるが、この値を調整して感度を上げることができる。
その他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメーターは９に設定され、ギャップなし伸長を実行するｔｗｏ−ｈｉｔ法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは１６に設定され、Ｘｇはデータベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップありアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによって実行される。
一般に、個々の変種ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より一般的には相同性または同一性が少なくとも６５％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体構築物のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の百分率と定義される。具体的方法では、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションをそれぞれ１及び０．１２５とするデフォルトパラメーターに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
一般に、個々の変種ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列間の核酸配列相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より一般的には相同性または同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「変種ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して指定された相同性、類似性、または同一性を有するものであり、かつ親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むがこれらに限定されない生物学的機能を共有している。
一実施形態では、本発明による抗体構築物のヒト生殖細胞系列に対する同一性パーセントは、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、またはさらには≧９６％である。実施例７を参照のこと。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が、治療中の患者の薬物に対する免疫反応を誘発するリスクを低減する上で重要な機能であると考えられる。Ｈｗａｎｇ ＆ Ｆｏｏｔｅ（“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３−１０）は、薬物抗体構築物のヒト以外の部分を減らすことが、治療中の患者における抗薬物抗体の誘発リスクの減少につながることを示している。膨大な数の臨床評価済み抗体薬物及び対応する免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変のヒト以外のＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が少ない（患者の平均５．１％）という傾向を示している。したがって、Ｖ領域を用いた抗体構築物の形態でのタンパク質治療薬にとって、ヒト配列に対する同一性が高度であることが望ましい。この生殖細胞系列同一性の決定を目的として、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いて、ＶＬのＶ領域をヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）とアラインメントし、同一アミノ酸残基数をＶＬの総アミノ酸残基数で割って百分率を求めることによりアミノ酸配列を算出することができる。ＶＨセグメント（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）についても同様の方法が可能であるが、ＶＨ ＣＤＲ３は多様性が高く、既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントパートナーに乏しいため、除外される。その後、組換え技術を用いて、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増加させることができる。
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究規模の条件下で、例えば、標準的な二段階精製方法において、高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体構築物の単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
同様に、この抗体構築物の二量体抗体構築物アイソフォームの収量、及びそれによる単量体率（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体抗体構築物の生産性、ならびに算出される単量体率は、例えば、ローラーボトル中での、標準化された研究規模の製造から得られる培養上清のＳＥＣ精製工程で取得することができる。一実施形態では、抗体構築物の単量体率は、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。
一実施形態では、抗体構築物は、好ましくは≦５または≦４、より好ましくは≦３．５または≦３、さらにより好ましくは≦２．５または≦２、最も好ましくは≦１．５または≦１の血漿安定性（血漿不在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比率）を有する。抗体構築物の血漿安定性は、構築物をヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することにより試験することができる。細胞傷害性アッセイでは濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞でエフェクター細胞を刺激することができる。標的細胞は、例えば、ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１を選択することができる。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液から得る。細胞成分を遠心分離により除去して、上部血漿相を回収し、その後にプールする。対照として、抗体構築物を、細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈する。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率で算出する。実施例１１を参照のこと。
さらに、本発明の抗体構築物の単量体から二量体への変換率は、低いことが好ましい。変換率は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。実施例９を参照のこと。例えば、抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内で、例えば１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度にて、３７℃で７日間、行うことができる。これらの条件下で、本発明の抗体構築物は、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％または≦０．５％、またはさらには０％の二量体率を示すことが好ましい。
本発明の二重特異性抗体構築物が数回の凍結／解凍サイクル後に、ごく低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、抗体構築物の単量体を、例えば一般処方緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で３０分間の凍結、その後に室温で３０分間の解凍）を施し、続いて高速ＳＥＣにかけ、二量体抗体構築物に変換された初期単量体抗体構築物の割合を決定する。好ましくは、二重特異性抗体構築物の二量体率は、例えば３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％、またはさらには≦０．５％である。
本発明の二重特異性抗体構築物は、好ましくは、≧４５℃または≧５０℃、より好ましくは≧５２℃または≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃または≧５７℃、最も好ましくは≧５８℃または≧５９℃の凝集温度で良好な熱安定性を示す。抗体の凝集温度の観点から熱安定性パラメーターを以下のように決定することができる。濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に置く。０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃までサンプルを加熱し、測定された半径を常時取得する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を利用して、抗体の凝集温度を算出する。実施例１０を参照のこと。
あるいは、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するために、融解温度曲線を示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により決定することができる。この実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ−ＤＳＣ装置を使用して行う。抗体構築物を含むサンプルのエネルギー取り込みを２０℃から９０℃まで記録して、処方緩衝液のみを含むサンプルと比較する。抗体構築物を、例えばＳＥＣランニングバッファー中、最終濃度２５０μｇ／ｍｌに調整する。それぞれの融解曲線を記録するため、サンプルの全体温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔでのサンプル及び処方緩衝液標準物質のエネルギー取り込みを記録する。サンプルから標準物質を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差を、それぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
さらに、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＤＬＬ３パラログＤＬＬ１及び／またはＤＬＬ４と交差反応しない（すなわち、本質的に結合しない）ことが想定される。さらに、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、マカク／カニクイザルＤＬＬ３パラログＤＬＬ１及び／またはＤＬＬ４と交差反応しない（すなわち、本質的に結合しない）ことが想定される。実施例６を参照のこと。
本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１、最も好ましくは≦０．０８の濁度（精製された単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０により測定）を有する。実施例１２を参照のこと。
本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、内在化しないか、または標的細胞による有意な内在化を受けないことも想定される。例えば、実施例１６に記載するように内在化の速度を分析することができる。好ましくは、抗体構築物を標的細胞と２時間（プレ）インキュベートした後の内在化速度（例えば、細胞傷害性の減少として測定）は、≦２０％、より好ましくは≦１５％、さらにより好ましくは≦１０％、最も好ましくは≦５％である。
さらに、排出されたまたは可溶性のＤＬＬ３は本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の有効性または生物学的活性を有意に損なうことはないと想定される。これは、例えば細胞傷害性アッセイにおいて、可溶性ＤＬＬ３を例えば濃度０ｎＭ−０．３ｎＭ−０．７ｎＭ−１ｎＭ−３ｎＭ−７ｎＭ−１２ｎＭへと増加させながらアッセイに添加して、測定することができる。試験した抗体構築物のＥＣ５０値は、可溶性ＤＬＬ３の存在下で有意に増加しないはずである。実施例１７を参照のこと。
さらなる実施形態では、本発明による抗体構築物は、酸性ｐＨ下で安定である。非生理学的ｐＨ、例えばｐＨ５．５（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーの実行に必要とされるｐＨ）下で抗体構築物が示す耐性が高いほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出する抗体構築物の回収率が高くなる。ｐＨ５．５下でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗体構築物の回収率は、好ましくは≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％、最も好ましくは≧９９％である。実施例１３を参照のこと。
本発明の二重特異性抗体構築物は、治療有効性または抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、以下の進行段階のヒト腫瘍異種移植モデルの実施例に開示される試験において評価することができる。
研究第１日目に、５ｘ１０６細胞のヒトＤＬＬ３陽性癌細胞株（例えば、ＳＨＰ−７７）を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側面に皮下注射する。平均腫瘍容積が約１００ｍｍ３に達したとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、動物の腹腔への約２ｘ１０７細胞の注射によりマウスに移植する。ビヒクル対照群１のマウスにはエフェクター細胞を与えず、ビヒクル対照群２（エフェクター細胞を与える）と比較するための未移植対照として使用し、腫瘍成長に対するＴ細胞単独の影響をモニタリングする。抗体治療は、平均腫瘍容積が約２００ｍｍ３に達したときに開始する。治療開始日における各治療群の平均腫瘍サイズは、他のいずれの群とも統計差がない必要がある（分散分析）。マウスを、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物を用いて、約１５〜２０日間の静脈内ボーラス注射により処置する。試験中、腫瘍をカリパスによって測定し、進行を腫瘍容積（ＴＶ）の群間比較によって評価する。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、Ｔ／Ｃ％＝１００ｘ（分析群のＴＶ中央値）／（対照群２のＴＶ中央値）でＴＶを算出することにより決定する。
当業者は、この試験の特定のパラメーター、例えば、注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体構築物の量及びタイムラインを、変更または適合しても、有意性と再現性のある結果を得る方法を理解している。好ましくは、腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０もしくは≦６０、より好ましくは≦５０もしくは≦４０、さらにより好ましくは≦３０もしくは≦２０、最も好ましくは≦１０もしくは≦５、またはさらには≦２．５である。
本発明はさらに、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３個以上のヌクレオチド単量体から構成される生体高分子である。ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であり得る。好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内に、それが含まれることが好ましい。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを用いた形質転換またはトランスフェクション後に、抗体構築物を発現することができる。それを目的として、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は制御配列に機能的に連結される。
遺伝コードは、遺伝物質（核酸）内のコードされた情報をタンパク質に翻訳する一連のルールである。生細胞内での生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドを一度に読み取るｔＲＮＡ分子を利用して、ｍＲＮＡによって指定された順にアミノ酸を結合させるリボソームによって行われる。このコードは、コドンと呼ばれる３つ１組のヌクレオチド配列が、タンパク質の合成時に次に付加されるアミノ酸をどのように指定するかを定義する。いくつかの例外はあるが、核酸配列内の３ヌクレオチドのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子は厳密に同じコードで暗号化されているため、この特定のコードを基準遺伝コードまたは標準遺伝コードと称する場合が多い。遺伝コードは特定の暗号化領域のタンパク質配列を決定するが、いつどこでこれらのタンパク質を産生するかは他のゲノム領域に作用される可能性がある。
さらに、本発明は本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞内に運搬するための伝達手段として使用される核酸分子である。用語「ベクター」には、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含するがこれらに限定されない。一般に、遺伝子操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを含む。ベクター自体は一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」の役割をする、より大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグといった追加機能を含む場合がある。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞に導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に制御配列を有する。
用語「制御配列」とは、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主生物に発現させるのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、そのＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列の転写に影響する場合、それらはコード配列に機能的に連結されており、またはリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合、それはコード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結」は、連結されるＤＮＡ配列が連続していること、及び分泌リーダーの場合は、連続し、かつ読み取り枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって成される。そのような部位が存在しない場合、従来の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入する方法である。この用語は、ほとんどの場合、真核細胞における非ウイルス的方法に使用される。形質導入は、しばしば、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介移入を表す際に使用される。動物細胞のトランスフェクションは通常、細胞膜に一過性の細孔（ｐｏｒｅ）すなわち「穴（ｈｏｌｅ）」を開け、物質の取り込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションによって、細胞圧縮（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）によって、またはカチオン性脂質とリポソームを産生する物質とを混合し、細胞膜と融合させ、内部の運搬物を蓄積することによって行うことができる。
用語「形質転換」は、細菌への、また植物細胞を含む動物以外の真核細胞への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を表す際に使用される。したがって形質転換は、細胞膜（複数可）を通じたその周辺からの直接的取り込み及びそれに続く外来性遺伝物質（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌または動物以外の真核細胞の遺伝的改変である。形質転換は、人為的手段によって行うことができる。形質転換を生じさせるには、細胞または細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限応答として形質転換が起こり得るコンピテントな状態でなければならない。
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」または「レシピエント細胞」は、本発明の抗体構築物をコードするベクター、外来性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエントであり得る、もしくは既にレシピエントである任意の個々の細胞もしくは細胞培養物、ならびに／またはその抗体構築物のレシピエントを含むことを意図する。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実施される。用語「宿主細胞」はまた、単一細胞の子孫または潜在的子孫を含むことも意図する。後継世代で、自然発生的、偶発的、もしくは意図的な変異のいずれかに起因して、または環境的影響に起因して、一定の変化が生じ得るため、そのような子孫は、実際には、（形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体に関して）親細胞と完全に同一ではない場合もあるが、その場合でも本明細書で使用されるこの用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞には、原核生物または真核細胞を含み、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカク、またはヒトを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体構築物は、細菌内で産生することができる。発現後、本発明の抗体構築物を、可溶性画分中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離し、例えば親和性クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除によって精製することができる。最終精製は、例えばＣＨＯ細胞に発現させた抗体の精製方法と同様に実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、本発明の抗体構築物に適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物のうち最も一般的に使用されている。しかしながら、多くの他の属、種、及び系統が一般に利用可能であり、かつ本発明において有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２ ２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３ ０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４ ２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株及び変種、ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのためのさまざまなウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変種、及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本発明による本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションに使用することができる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ、及びタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に既知である。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６−７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０−７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５−７５０、及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９−９８６を参照のこと。
しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の増殖は慣用的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養による増殖用にサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４−６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物の作製方法であって、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生された抗体構築物を培養物から回収することと、を含む前記方法を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「培養」とは、培地中の好適な条件下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の維持、分化、成長、増殖、及び／または繁殖を指す。用語「発現」には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない、本発明の抗体構築物の作製に関与するいずれの工程をも含む。
組換え技術を使用する場合、抗体構築物は、細胞内、すなわち細胞周辺腔内で作製することも、または培地中に直接分泌させることもできる。抗体構築物を細胞内で作製する場合、第１段階として、例えば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解した断片の粒子残骸を除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７ （１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離する手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞の残骸は遠心分離により除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合、一般にそのような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、前述の段階のいずれかでＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を追加してもよく、また外来不純物の増殖を防止するため、抗生物質を追加してもよい。
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて回収または精製することができる。回収される抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降もまた利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーが、好ましい精製技術である。親和性リガンドを付加するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えばコントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるものよりも高速な流速及び短い処理時間を可能にする。
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って作製された抗体構築物を含む、医薬組成物を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に適した組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の抗体構築物（複数可）を、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物はさらに、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、及び／またはアジュバントの好適な製剤を含む。許容される組成物の成分は、用いる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。本発明の医薬組成物は、液体、凍結、及び凍結乾燥組成物を含むがこれらに限定されない。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合するあらゆる水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、さまざまな種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒、及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野で周知であり、そのような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化することができる。
特定の実施形態は、本発明の抗体構築物及びさらには１つ以上の賦形剤、例えばこのセクション及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、例えば製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的特性の調整、例えば粘度の調整、ならびに／または効果を改善する及び／もしくはそのような製剤を安定化させるための本発明の方法、ならびに、例えば製造、輸送、保管、使用前調製、投与、及びそれ以降の期間に発生する負荷に起因する劣化及び損傷への対策など幅広い目的を考慮して、本発明に使用することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸収性、または浸透性を変更、持続、または保護することを目的とする製剤材料を含有してもよい（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８” Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。そのような実施形態では、好適な製剤材料に以下を含み得るが、これらに限定されない：
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタメート、及び／またはヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２−フェニルアラニン；
・抗菌剤及び抗真菌剤などの抗微生物剤；
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；
・生理学的ｐＨ、またはそれより多少低いｐＨ、通常は約５〜約８または９のｐＨ範囲内に組成物を維持するために使用される緩衝液、緩衝系、及び緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、またはその他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、及び酢酸塩；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液；
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル；
・生理食塩水及び緩衝媒を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む水性担体；
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー；
・マンニトールまたはグリシンなどの充填剤；
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；
・増量剤；
・単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；炭水化物は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトールまたはキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質性担体、例えばヒトもしくはウシ血清アルブミン、ゼラチン、または好ましくはヒト起源の免疫グロブリン；
・着色及び着香剤；
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；
・ナトリウムなどの塩形成対イオン；
・抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの防腐剤（例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素である）；
・Ｚｎ−タンパク質錯体などの金属錯体；
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトール スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ｍｙｏイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ｍｙｏイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁化剤；
・界面活性剤または湿潤剤、例えばプルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗浄液、及び／または好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得る；好ましい洗浄液の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、及びＴｗｅｅｎ ８５である；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、及びＰＥＧ ５０００である；
・スクロースまたはソルビトールなどの安定増強剤；
・等張性増強剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油を含む非経口送達ビヒクル；
・体液及び栄養補給液、電解質補給液（リンゲルデキストロースを基剤にしたものなど）を含む静脈内送達ビヒクル。
医薬組成物の異なる成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は緩衝液、安定化剤、及び／または抗酸化剤として作用することができ、マンニトールは充填剤及び／または等張性増強剤として作用することができ、塩化ナトリウムは送達ビヒクル及び／または等張性増強剤として作用することができるなどである。
本発明の組成物は、組成物の使用目的に応じて、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物、及び／または当技術分野で既知のサイトカインなどの薬剤であり得る。また、本発明の抗体構築物が、併用療法で、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定される。
ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び望ましい投薬量に応じて、当業者が決定する。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照のこと。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響し得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の物質が補充される。中性の緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、凍結乾燥ケークまたは水性溶液の形態で、望ましい度合いの純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（前掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって保存用に調製することができる。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の抗体構築物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化することができる。
非経口投与が企図される場合、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に、本発明の目的の抗体構築物を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水性溶液の形態で提供することができる。非経口注射に特に適したビヒクルは滅菌蒸留水であり、本発明の抗体構築物はその中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。ある特定の実施形態では、調製物は、デポ注射を介して送達できる産物の制御放出または持続放出を提供できる薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームと、目的分子との製剤を含み得る。ある特定の実施形態では、血中での持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用される場合がある。ある特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを使用して、目的の抗体構築物を導入することができる。
さらなる医薬組成物は当業者に明らかであり、これには、持続または制御系の送達／放出製剤中に本発明の抗体構築物を含む製剤が含まれる。さまざまな他の持続送達または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子、または多孔ビーズ及び蓄積注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照のこと。持続放出調製物には、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に記載）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を含み得る。持続放出組成物にはまた、当技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号；同第ＥＰ０８８，０４６号及び同第ＥＰ１４３，９４９号を参照のこと。
抗体構築物はまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入されていてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる医薬組成物は通常、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過によって行うことができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後いずれに実施されてもよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。非経口組成物は一般に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアル中に入れられる。
本発明の別の態様は、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載される、医薬組成物として使用することができる、本発明の製剤の自己緩衝性抗体構築物を含む。タンパク質の安定化ならびにこれに関して有用な製剤材料及び方法に関して、さまざまな説明が利用可能であり、例えば、Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，” Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）、特に獣医学的及び／またはヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関しては、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照のこと。
塩は、本発明の特定の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／もしくは等張性を調整するため、ならびに／または本発明による組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解度及び／もしくは物理的安定性を改善するために使用することができる。周知のように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、ならびにタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を減少させることによってネイティブ状態のタンパク質を安定化させることができる。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化させることができる。さらにタンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用はまた、分子間静電相互作用を減少させ、それによってタンパク質の凝集及び不溶化を防止または減少させることができる。
イオン種は、タンパク質に対する効果が大幅に異なる。イオンとタンパク質に対するその効果のカテゴリー別の順位付けが多数解明されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に利用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化させる溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化させる溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは一般に、タンパク質を変性及び／または可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果によって、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤、及び抗酸化剤として、ならびにその他の標準的用途で、本発明のさまざまな実施形態による本発明の製剤の抗体構築物に使用することができる。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化させるために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥においてケークの適切な構造及び特性を確保する際に有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥いずれの製剤においてもタンパク質の凝集を防止する際に有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース、及びソルビトール、ならびに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール、ならびに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。ポリオールは、液体及び凍結乾燥いずれの製剤においても、タンパク質を物理的及び化学的劣化作用から保護する際に有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の等張性を調整する際に有用である。本発明の選ばれた実施形態において特に有用なポリオールはマンニトールであり、これは凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために広く使用される。マンニトールはケークの構造安定性を確保する。一般にこれは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤、及び輸送中または製造工程でのバルク調製時の凍結解凍負荷から保護するための安定化剤として特に好ましい。還元糖（遊離アルデヒド基またはケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、一般にそれは、本発明による使用にとって特に好ましいポリオールではない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースもまた、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で、本発明の特に好ましいポリオールではない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化させる際、及び凍結保護剤として有用であり、この観点から本発明に使用することができる。
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態はさらに、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面への吸着、ならびに気体−液体界面、固体−液体界面、及び液体−液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすい場合がある。これらの効果は一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は一般に、タンパク質濃度と反比例し、主として例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は慣例的に、表面吸着の防止、最小化、または低減に使用される。この点で本発明において有用な界面活性剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するために広く使用されている。任意の所与の界面活性剤は通常、一部のタンパク質を安定化させ、他を不安定化させるので、この点で界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、供給されるときには、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含んでいる。したがって、ポリソルベートは注意して使用すべきであり、使用の際は、最低有効濃度で用いる必要がある。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最低有効濃度で用いるべきとする一般通則の一例である。
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態はさらに、１つ以上の抗酸化剤を含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することによって、ならびに光に当てないようにすることによって、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。抗酸化性賦形剤は、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤は、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、及びキレート剤である。本発明による治療用タンパク質製剤に使用される抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤はタンパク質を損傷する可能性がある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは特に、分子内ジスルフィド連結を破壊する恐れがある。したがって、本発明に使用される抗酸化剤は、特に、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性がないかまたは可能性が十分に低いものを選択する。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子でありタンパク質配位錯体を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば、特定のインスリン懸濁物を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかの過程を阻害し得る。しかし、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程を触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を向上させ得る。しかし、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様にＣａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させることができ、これはＭｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集はＡｌ＋３イオンによって増大し得る。
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態はさらに、１つ以上の防腐剤を含む。防腐剤は、同じ容器からの複数回の採取を伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主たる機能は、医薬品の有効期間または使用期間にわたって微生物の成長を阻害し、製品の滅菌性を確保することである。広く使用されている防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。防腐剤は低分子の非経口薬での使用においては長い歴史をもつが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する大きな要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかし、複数回用量製剤が可能であれば、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。保存処理された製剤の開発により、利便性の高い複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含み、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）にはｍ−クレゾールが配合されている。保存処理された剤形の製剤化及び開発の期間に、いくつかの態様を考慮する必要がある。医薬品中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。それには、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物効果を付与する濃度範囲で、剤形中の所与の防腐剤を試験する必要がある。
予想できるように、防腐剤を含む液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に防腐剤を含む希釈剤で再構成することができる。これにより防腐剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に極小化される。液体製剤の場合、防腐剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８〜２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、防腐剤の有効性は活性薬物及びすべての賦形剤成分を含む最終製剤において実証される必要がある。
本明細書に開示される抗体構築物はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用であるさまざまな種類の脂質、リン脂質、及び／または界面活性物質から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質の配置と同様、二層形式で配置される。抗体構築物を含むリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；ならびにＷＯ９７／３８７３１に記載されるような当技術分野で既知の方法によって調製される。血中に長時間滞留するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。望ましい直径のリポソームを得るには、リポソームを所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗体構築物のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応によって、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、リポソームとコンジュゲートすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に封入される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１ （１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
医薬組成物を製剤化した後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。そのような製剤は、即時使用形態でも、投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥）形態でも保存することができる。
本明細書で定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、ＷＯ９９／５４４４０に、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）によって記載されている細胞傷害性アッセイによって決定することができる。本明細書で使用される場合、用語「有効性」または「ｉｎ ｖｉｖｏ有効性」は、例えば標準化されたＮＣＩの反応性基準を用いた、本発明の医薬組成物による治療に対する反応性を指す。本発明の医薬組成物を用いる療法の成功またはｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、その意図された目的、すなわち組成物がその望ましい効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の減少を引き起こす能力に対する組成物の有効性を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、それぞれの疾患実体についての確立された標準方法によってモニタリングすることができる。加えて、さまざまな疾患特異的臨床化学パラメーター及びその他の確立された標準方法を使用することができる。さらに、コンピューター断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、米国立がん研究所基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層走査、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、及びさまざまなリンパ腫に特異的な臨床化学パラメーター（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびにその他の確立された標準方法を使用することができる。
本発明の医薬組成物などの薬物の開発におけるもう一つの主な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。それを目的として、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち、特定の薬物が所与の病態を治療する能力に影響する薬物動態パラメーターのプロファイルを立証することができる。薬物が特定の疾患を治療する能力に影響する薬物の薬物動態パラメーターとしては、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝、及び血液血清結合度が挙げられるがこれらに限定されない。所与の薬物の有効性は、上記のパラメーターそれぞれによって影響を受ける可能性がある。
「半減期」とは、投与された薬物の５０％が生物学的過程、例えば代謝、排泄などを通じて排出される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」とは、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」とは、例えば細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器などのような、身体のさまざまな区画にわたる薬物の保持度、ならびにこれらの区画内での薬物の分布度を意味する。「血液血清結合度」とは、薬物がアルブミンなどの血液血清タンパク質と相互作用して結合し、薬物の生物学的活性が減少または喪失する傾向を意味する。
薬物動態パラメーターにはまた、投与される所与量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、即効性（ｍｏｒｅ ｏｎｓｅｔ）及び／またはＣｍａｘを含む。「バイオアベイラビリティ」とは、血液区画中の薬物量を意味する。「ラグタイム」とは、薬物の投与から、血液または血漿中での薬物の検出及び測定可能段階までの遅延時間を意味する。「Ｔｍａｘ」とは、それ以降に薬物の最大血中濃度が達成される時間であり、「Ｃｍａｘ」とは、所与の薬物によって得られる最大の血中濃度である。薬物が生物学的効果に必要とされる血中濃度または組織濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメーターに影響される。先に概説したチンパンジー以外の霊長類における前臨床動物試験において決定することができる種間特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメーターは、例えばＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）による刊行物にも定められている。
一実施形態では、腫瘍もしくは癌疾患、または転移性癌疾患の予防、治療、または改善に使用される本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って作製された抗体構築物を提供する。
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的病態を治療、改善、及び／または予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置及び予防的または抑止的手段の両方を指す。治療には、疾患、疾患の症状、または疾患素因の治癒（ｃｕｒｅ、ｈｅａｌ）、緩和／軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ、ｒｅｌｉｅｖｅ）、変化、回復、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ、ｉｍｐｒｏｖｅ）、またはそれに対する作用を目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織または細胞に対する製剤の適用または投与を含む。
本明細書で使用される場合、用語「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、本発明による抗体構築物のそれを必要とする対象への投与によって、本明細書の以下に示す腫瘍もしくは癌、または転移性癌を有する患者の疾患状態を改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）することを指す。そのような改善はまた、患者の腫瘍もしくは癌、または転移性癌の進行の鈍化または停止として見られる場合もある。本明細書で使用される場合、用語「予防」は、本発明による抗体構築物のそれを必要とする対象への投与によって、本明細書の以下に示す腫瘍もしくは癌、または転移性癌を有する患者の発症または再発を回避することを意味する。
用語「疾患」とは、本明細書に記載される抗体構築物または医薬組成物を用いた治療から利益が得られるであろういずれの病態をも指す。これには、哺乳動物を当該疾患に罹患させやすくする病理学的病態を含む、慢性及び急性の障害または疾患を含む。
「新生物」とは、組織の異常な増殖であり、必ずしもそうではないが通常は腫瘤を形成する。また腫瘤を形成するとき、それは一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物または腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）、または悪性であり得る。悪性新生物は一般に癌と呼ばれる。悪性新生物は通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得る、すなわち身体の他の部分、組織、または臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織または臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病はリンパ系新生物である。本発明の目的では、これらはまた、用語「腫瘍」または「癌」に包含される。
本発明の好ましい実施形態では、腫瘍または癌疾患は、肺癌、好ましくはＳＣＬＣ、乳房、子宮頸部、結腸、結腸直腸、子宮内膜、頭頸部、肝臓、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、甲状腺、副腎、腎臓、膀胱、子宮、食道、尿路上皮、及び脳の腫瘍または癌、リンパ腫、癌腫、及び肉腫、ならびに前述のいずれかに由来する転移性癌疾患を含む（または、それらからなる）が、これらに限定されない群から選択される。
より具体的には、腫瘍または癌疾患は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、神経内分泌前立腺癌、神経内分泌膵癌、肝芽細胞腫、及び肝細胞癌腫からなる群から選択することができる。転移性癌疾患は、前述のいずれかに由来する可能性がある。
本発明はまた、腫瘍もしくは癌疾患、または転移性癌疾患の治療または改善のための方法であって、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って作製された抗体構築物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
用語「必要とする対象」または「治療を必要とする」ものは、既にその障害のある対象に加え、その障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的いずれかの治療を受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗体構築物は一般に、特にバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲で、特定の投与経路及び投与方法、特定の投薬量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計される。組成物の成分は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。
したがって製剤及び組成物は、本発明に従って、任意の好適な投与経路による送達に合わせて設計することができる。本発明に関連して、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚、吸入、鼻、眼、耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ／ａｕｒａｌ）、膣、粘膜）；
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨髄内、筋内、脳内、脳室内、硬膜外、くも膜下、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）を含むが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、例えばボーラス注射などの注射による、または連続注入などの注入による、非経口投与、例えば皮下または静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与することができる。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；及び同第５，３９９，１６３号に記載されている。
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のないまたは実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を計量する、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現することができる。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは一般に当技術分野で既知であり、通常は注入する治療薬を収容するカートリッジの定期交換が必要である。そのようなポンプシステムでは、カートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が生じる場合がある。そのような場合であっても、カートリッジ交換前の投与段階とカートリッジ交換後の投与段階の両方で、そのような治療薬の１つの「中断のない投与」を構成するという意味で、本発明の薬学的手段及び方法の範囲内と見なされる。
本発明の抗体構築物の連続投与または中断のない投与は、流体をリザーバーから送り出すための流体送出機構、及び送出機構を作動させるための作動機構を含む、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内または皮下投与であり得る。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に穿刺し、好適な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含み得る。前記ポンプシステムは、静脈、動脈、または血管を問わず、患者の皮膚に直接固定または装着することで、ポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることができる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間から数日間装着することができる。リザーバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物に適したリザーバーの容積は、０．１〜５０ｍｌであり得る。
連続投与はまた、皮膚に装着され一定間隔で交換されるパッチによる経皮投与であってもよい。当業者は、この目的に適した、薬物送達用のパッチシステムを熟知している。経皮投与の注目すべき点は、例えば第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることである。流入の中断または電池切れの問題は生じない。
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥された材料を投与前に適切な液体で最初に再構成する。凍結乾燥された材料は、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成することができる。
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される種間特異性を示す、漸増用量の本発明の抗体構築物をチンパンジー以外の霊長類、例えばマカクに投与することによる用量漸増試験によって決定できる好適な用量で対象に投与することができる。上述のように、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、同一の形態で、チンパンジー以外の霊長類における前臨床試験に、及びヒトにおける薬物として使用できるという利点がある。投薬計画は、主治医が臨床的要因に応じて決定することになる。医学分野で周知のように、ある１人の患者に対する投薬量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因によって異なる。
用語「有効用量」または「有効投薬量」は、望ましい効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患に既に罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量または用量は、治療される病態（適応症）、送達する抗体構築物、治療の内容及び目的、疾患の重度、治療歴、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積、または臓器サイズ）、及び／または患者の状態（年齢及び全身健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全身状態によって異なる。適当な用量は、１回の投与または複数回にわたる投与で患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために、主治医の判断に従って調整することができる。
通常の投薬量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投薬量は、１．０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、場合により１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗体構築物は、好ましくは、疾患症状の重度を低下させ、無疾患症状期の頻度もしくは期間を増加させ、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害を防止する。ＤＬＬ３発現腫瘍の治療の場合、治療有効量の本発明の抗体構築物、例えば抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３抗体構築物は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を未処置患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルにおいて評価することができる。
医薬組成物は、１回の治療で投与することも、または必要に応じて抗癌療法などの追加治療、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に投与しても、または前記抗体構築物の投与前もしくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「有効かつ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずにまたは本質的に生じさせずに、病的細胞の減少、腫瘍の除去、腫瘍の縮退、または疾患の安定化をもたらすに足る、本発明の抗体構築物の許容用量を指す。そのような有効かつ非毒性用量は、例えば当技術分野で記載されている用量漸増試験によって決定することができ、その用量は重篤な有害副事象（ａｄｖｅｒｓｅ ｓｉｄｅ ｅｖｅｎｔ）を誘因する用量を下回るべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
本明細書で使用される場合、用語「毒性」とは、有害事象または重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如、及び／または投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性はまた、その薬物によって引き起こされる催奇性作用または発癌性作用を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「安全性」、「ｉｎ ｖｉｖｏ安全性」、または「忍容性」は、投与直後に（局所忍容性）及びより長期の薬物適用期間の間に、重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「ｉｎ ｖｉｖｏ安全性」または「忍容性」は、例えば、治療中及びフォローアップ期間中に定期的に評価することができる。測定値には、臨床評価、例えば臓器の兆候、及び検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価を実施し、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ標準に従って、正常所見からの逸脱を記録／コード化することができる。臓器の兆候には、例えばＣｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験することができる検査パラメーターは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル、及び尿検査、ならびにその他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液、または脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって安全性は、例えば身体検査、画像化技術（すなわち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、工業装置を用いたその他の計測（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメーターを測定し有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジー以外の霊長類における有害事象を組織病理学的方法及び／または組織化学法により試験することができる。
上記の用語はまた、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６，１９９７にも参照されている。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明の方法に従って作製された抗体構築物、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞が含まれるキットを提供する。
本発明に関連して、用語「キット」とは、２つ以上の構成要素がコンテナ、容器、またはその他にまとめて梱包されており、構成要素の１つが本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクター、または宿主細胞に相当するものを意味する。したがってキットは、単品として販売することができる特定の目的を達成するに足る製品及び／または器具の一式であると説明することができる。
キットは、投与に適した投薬量（上記参照）の本発明の抗体構築物または医薬組成物を含む任意の適切な形状、サイズ、及び材質（好ましくは防水性、例えばプラスチックまたはガラス）の１つ以上の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットはさらに、（例えば、リーフレットまたは指示マニュアルの形態の）使用説明書、本発明の抗体構築物を投与するための手段、例えば、シリンジ、ポンプ、インフューザーなど、本発明の抗体構築物を再構成するための手段、及び／また本発明の抗体構築物を希釈するための手段を含み得る。
本発明はまた、単回用量投与単位のためのキットを提供する。本発明のキットはまた、乾燥／凍結乾燥された抗体構築物を含む第１の容器、及び水性製剤を含む第２の容器を含み得る。本発明の特定の実施形態では、単チャンバー及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））が含まれるキットが提供される。
以下の実施例により本発明を例示的に説明する。各実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例１
野生型及び短縮型ＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＤＬＬ３抗原の細胞外ドメインは、実施例１及び２を目的として、以下のアミノ酸位置により画定される個々のサブドメインまたは領域に細分化することができる。
シグナルペプチド：１〜２６
Ｎ末端：２７〜１７５
ＤＳＬ：１７６〜２１５
ＥＧＦ−１：２１６〜２４９
ＥＧＦ−２：２７４〜３１０
ＥＧＦ−３：３１２〜３５１
ＥＧＦ−４：３５３〜３８９
ＥＧＦ−５：３９１〜４２７
ＥＧＦ−６：４２９〜４６５
エピトープマッピングに使用する短縮型ＤＬＬ３分子を構築するため、ヒトＤＬＬ３の８個の細胞外ドメイン（シグナルペプチド＋Ｎ末端、ＤＳＬ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、及びＥＧＦ６）の対応する配列を、Ｎ末端から開始して抗原から段階的に欠失させた。以下の分子を作製した。図１も参照のこと。
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／全ＥＣＤ配列番号２６３
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＤＳＬまで配列番号２６４
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−１まで配列番号２６５
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−２まで配列番号２６６
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−３まで配列番号２６７
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−４まで配列番号２６８
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−５まで配列番号２６９
・Ｈｕ ＤＬＬ３ ＥＣＤ／ＥＧＦ−６のみ配列番号２７０
ヒトＤＬＬ３、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）ＤＬＬ３、及び短縮型ヒトＮ末端Ｖ５タグＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞を作製するため、ヒトＤＬＬ３−ＥＣＤ（配列番号２５３、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６９４１も参照）、カニクイザルＤＬＬ３−ＥＣＤ（配列番号２７２）、及び７つの短縮型ヒトＮ末端Ｖ５タグＤＬＬ３−ＥＣＤ型（上記参照）を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと命名したプラスミドにクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１）１４１−１５０に記載されている）。ヒト及びカニクイザルＤＬＬ３の細胞表面発現の場合、本来のシグナルペプチドを使用し、短縮形ヒトＮ末端ＤＬＬ３の細胞表面発現の場合は、マウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドを使用し、その後ろにＶ５タグを置いた。記載したすべてのＤＬＬ３−ＥＣＤ配列の後ろにインフレームで、人工Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカーと、それに続くヒトＥｐＣＡＭの膜貫通／細胞内ドメインに由来するドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２３５４に公開されている配列のアミノ酸２６６〜３１４）のコード配列が位置する。クローニング手順はすべて標準プロトコールに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））。Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７−５６６に記載のように、対応するプラスミドをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトして真核発現させ、各構築物を得た。
ＣＨＯ細胞でのヒト及びカニクイザルＤＬＬ３の発現は、モノクローナルマウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＤＬＬ３抗体を用いたＦＡＣＳアッセイで確認した。７つの短縮型ヒトＤＬＬ３−ＥＣＤの発現は、モノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗ｖ５タグ抗体を用いて確認した。結合したモノクローナル抗体は、抗マウスＩｇＧのＦｃガンマ−ＰＥを用いて検出した。陰性対照として、細胞を一次抗体の代わりにアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。各サンプルをフローサイトメトリーで測定した。
実施例２
抗ＤＬＬ３抗体構築物のエピトープマッピング
ヒトＤＬＬ３及び短縮型ヒトＤＬＬ３分子（実施例１を参照）でトランスフェクトした細胞を、ＰＢＳ／１．５％ＦＣＳ中で、ヒトアルブミン（変種１）と融合された二重特異性ＤＬＬ３ｘＣＤ３抗体構築物（Ｉ２Ｃと命名されたＣＤ３結合ドメインをもつ）を含む、未加工、未希釈のペリプラズム抽出物で染色した。結合した分子を、内製したマウスモノクローナル抗ＣＤ３結合ドメイン抗体（５０μｌ）、続いて抗マウスＩｇＧのＦｃガンマ−ＰＥ（１：１００、５０μｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５−１１６−０７１）で検出した。抗体はすべてＰＢＳ／１．５％ＦＣＳで希釈した。陰性対照として、細胞をペリプラズム抽出物の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳとインキュベートした。各サンプルをフローサイトメトリーで測定した。
それぞれのＤＬＬ３結合ドメインが認識した領域を配列表（表１８）に示す。結合物質は、ＤＬＬ３のＮ末端内、ＤＳＬドメイン内、及び個々のＥＧＦドメイン内に位置するエピトープに特異的にマッピングされた。
図２は、ＥＧＦ−３領域内に含まれたＤＬＬ３エピトープに結合する２個の例示的な結合物質を示す（ＥＧＦ−３を含まない、対応する短縮型ＤＬＬ３構築物ではＦＡＣＳシグナルがない）。図２はまた、ＥＧＦ−３領域内に含まれたＤＬＬ３エピトープに結合する例示的な結合物質を示す（ＥＧＦ−４を含まない、対応する短縮型ＤＬＬ３構築物ではＦＡＣＳシグナルがない）。
結合物質のいくつかは、ＥＧＦ−５／［６］と命名された領域に位置するエピトープに特異的であることを示している。角括弧は、ＥＧＦ−６ドメインのみが残っている短縮型ＤＬＬ３構築物（図１の最後の構築物）では、結合物質のＦＡＣＳシグナルの減少を示す（すなわち、完全に存在することも、完全に失われることもない）ことを意味する。
以下の実施例で使用される二重特異性ＤＬＬ３ｘＣＤ３構築物は、ＣＤ３結合ドメインとして「Ｉ２Ｃ」を有する構築物、及び野生型ヒト血清アルブミンへのＣ末端融合を有する構築物から選択される（例えば、配列番号２２４〜２３０、２３３〜２３５、２３８〜２４１）。
実施例３
ヒト及びカニクイザルＤＬＬ３に対する抗体親和性のＢｉａｃｏｒｅによる測定
ニワトリアルブミンとの組換えヒト／カニクイザルＤＬＬ３−ＥＣＤ融合タンパク質を用いてＢｉａｃｏｒｅ分析実験を実施し、本発明の抗体構築物の標的結合性を測定した。
詳細には、製造業者の説明書に従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、酢酸緩衝液ｐＨ４．５を用いて約６００〜８００ＲＵでそれぞれの組換え抗原を固定した。ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、及び３．１３ｎＭの濃度に希釈した希釈系列にＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のサンプルをロードした。３分間は流速を３０μｌ／分にし、その後ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを再び流速３０μｌ／ｍｌで８分間〜２０分間使用した。チップの再生は、１０ｍＭグリシンと１０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ１．５）の溶液を用いて行った。データセットはＢｉａＥｖａｌソフトウェアを使用して分析した。全体を通して２回の独立実験を行った。
本発明によるＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＤＬＬ３に対してナノモル以下の極めて高い親和性を示した（例外としてＤＬＬ３−１３のＫＤ値は非常に低く、１桁ナノモル範囲であった）。マカクＤＬＬ３に対する結合性を対照したところ、これもまた同様の範囲の親和性を示した。親和性値ならびに算出した親和性の差を表２に示す。
（表２）Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ならびに算出した種間の親和性の差によって決定した、ヒト及びマカクＤＬＬ３に対するＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性
Figure 2018527908
さらに、ヒトＣＤ３及びマカクＣＤ３の両方に対する二重特異性抗体構築物の結合性をＢｉａｃｏｒｅアッセイで確認したところ、２桁ナノモル範囲と低かった（データは示さず）。
実施例４
標的抗原陽性細胞でのヒト及びマカクＤＬＬ３に対するＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性のスキャッチャード分析、ならびに種間親和性の差の測定
またヒトまたはマカクＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性を、ヒトとマカクＤＬＬ３との間に起こり得る親和性の差を測定する方法として最も信頼性が高いスキャッチャード分析により測定した。スキャッチャード分析に備え、それぞれの細胞株に対するＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の一価の結合を正確に測定するため、一価検出系を用いて飽和結合実験を実施する。
それぞれの細胞株（組換えヒトＤＬＬ３発現ＣＨＯ細胞株、組換えマカクＤＬＬ３発現ＣＨＯ細胞株）２ｘ１０４細胞を、対応するＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の３連の希釈系列（１：２で１２回希釈）５０μｌ（開始濃度１０〜２０ｎＭ）とそれぞれ（飽和状態に到達するまで）インキュベートし、続いて撹拌下での４℃、１６時間のインキュベーション、及び１回の残渣洗浄工程を行った。次に細胞を、３０μｌのＣＤ３ｘＡＬＥＸＡ４８８コンジュゲート溶液とさらに１時間インキュベートした。１回の洗浄工程後、３．５％ホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌに細胞を再懸濁し、さらに１５分間インキュベートして遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。データは、それぞれ３連による２回の独立実験から生成した。それぞれのスキャッチャード分析を算出し、最大結合性（Ｂｍａｘ）を推定した。最大半数結合時のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の濃度を、それぞれのＫＤを基に決定した。３連の測定値をプロットして、最小から最大の結合まで適切な濃度範囲を示す双曲線及びＳ字曲線を得た。
表３に示した値は、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物ごとに２回の独立実験から得たものである。細胞に基づくスキャッチャード分析により、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＤＬＬ３及びマカクＤＬＬ３に対してナノモル以下の親和性があり、カニクイザル／ヒト種間に約１のわずかな親和性の差が存在することが確認された。
（表３）細胞に基づくスキャッチャード分析によって決定した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性（ＫＤ）と、マカクＤＬＬ３のＫＤ／ヒトＤＬＬ３のＫＤで算出した親和性の差。抗体構築物は、それぞれ３連による２回の独立実験で測定した。
Figure 2018527908
実施例５
二重特異性結合及び種間交差反応性
ヒトＤＬＬ３及びＣＤ３、ならびにカニクイザルＤＬＬ３及びＣＤ３に対する結合を確認するため、本発明の二重特異性抗体構築物を、以下を用いてフローサイトメトリーにより試験した。
・ヒトＤＬＬ３、人工ヒトＤＬＬ３アイソフォーム（点突然変異Ｆ１７２Ｃ及びＬ２１８Ｐを特徴とする）、及びマカクＤＬＬ３でそれぞれトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、
・ヒトＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７、
・ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ４８３）、及び
・カニクイザルＣＤ３を発現するＴ細胞株ＬｎＰｘ ４１１９
フローサイトメトリーのため、それぞれの細胞株２００，０００細胞を、濃度５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性抗体構築物５０μｌと４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、次いで４℃で３０分間、二重特異性抗体構築物のＣＤ３結合部分に特異的な内製マウス抗体（２μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体を、ヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥ（１：１００）を用いて４℃で３０分間検出した。各サンプルをフローサイトメトリーで測定した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。
結果を図３に示す。本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＤＬＬ３、人工ＤＬＬ３アイソフォーム、及びカニクイザルＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色し、またヒトＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７（自然発現体）を染色した。ＣＤ３を発現するヒト及びカニクイザルＴ細胞株はまた、二重特異性抗体構築物によって認識された。また、陰性対照細胞（非トランスフェクトＣＨＯ、実施例６にデータを示す）の染色は見られなかった。
実施例６
ヒトパラログへの非結合性の確認
ヒトＤＬＬ３パラログＤＬＬ１及びＤＬＬ４を、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトした。本実施例で使用したパラログの配列は、配列表に示されている（配列番号２８３及び２８４）。それぞれのパラログに特異的な抗体を用いてＦＡＣＳ分析でタンパク質の発現を確認した。抗体は、抗ヒトＤＬＬ１ ＭＡＢ１８１８（Ｒ＆Ｄ；５μｇ／ｍｌ）、及びＤＬＬ４に対する抗ヒトＤＬＬ４ ＭＡＢ１５０６（Ｒ＆Ｄ、５μｇ／ｍｌ）であった。
フローサイトメトリーアッセイは、結合したマウス抗体をヤギ抗マウスＦＩＴＣ（１：１００）を用いて検出した以外は実施例５に記載した通りに実施した。結果を図４に示す。この分析から、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物はいずれも、ヒトＤＬＬ３パラログＤＬＬ１及びＤＬＬ４と交差反応しないことが確認された。
実施例７
ヒト生殖細胞系列との同一性
ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する抗体構築物の配列の同一性／類似性を分析するため、本発明のＤＬＬ３結合ドメインを次のようにアラインメントした。ＣＤＲをすべて含む完全なＶＬと、ＣＤＲ１及び２を含むが、ＣＤＲ３を除いた完全なＶＨを、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子（Ｖｂａｓｅ）に対してアラインメントした。詳細は本出願の明細書で参照することができる。結果を以下の表４に示す。
（表４）ＶＨ及びＶＬのヒト生殖細胞系列との同一性
Figure 2018527908
実施例８
細胞傷害活性
本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物がエフェクターＴ細胞をＤＬＬ３発現標的細胞にリダイレクトする能力を、以下の５種類のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイで分析した。
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトする能力を、１８時間の５１−クロム放出アッセイで測定した。
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７にリダイレクトする能力を、１８時間の５１−クロム放出アッセイで測定した。
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、未刺激のヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞をヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトする能力を、４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイで測定した。
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、未刺激のヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞をＤＬＬ３陽性ヒト細胞株ＳＨＰ−７７にリダイレクトする能力を、４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイで測定した。
・交差反応性ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＴ細胞をマカクＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトできることを確認するため、エフェクターＴ細胞としてマカクＴ細胞株を用いて４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイを実施した。
実施例８．１
未刺激のヒトＴ細胞を用いたクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した刺激Ｔ細胞を以下の記載のように得た。ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ）を３７℃で１時間、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）でコーティングした。結合していないタンパク質をＰＢＳによる１回の洗浄工程で除去した。３〜５ｘ１０７のヒトＰＢＭＣを、安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０を入れたプレコーティングされたペトリ皿に加え、２日間刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を加えて最終濃度２０Ｕ／ｍｌにし、細胞を上記と同じ細胞培養培地中で１日間再び培養した。製造業者のプロトコールに従い、Ｄｙｎａｌビーズを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除去し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を濃縮した。
カニクイザルＤＬＬ３またはヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを加えた最終容積１００μｌのＲＰＭＩ中にて、１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒを用いて３７℃で６０分間、標識した。その後、標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄した後、細胞傷害性アッセイに使用した。このアッセイは、１０：１のＥ：Ｔ比で総容積２００μｌのＲＰＭＩを補充した９６ウェルプレート中で実施した。開始濃度０．０１〜１μｇ／ｍｌの精製された二重特異性抗体構築物と、その３倍希釈物を使用した。アッセイ時のインキュベーション時間は１８時間であった。細胞傷害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）と自発的溶解（エフェクター細胞なし）との差に対する、上清中に放出されるクロムの相対値から求めた。すべての測定は４連で実施した。上清中のクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ ３’’ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。結果の解析は、Ｐｒｉｓｍ ５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実施した。シグモイド用量反応曲線から、解析プログラムによって算出したＥＣ５０値を、細胞傷害活性の比較に使用した。
実施例８．２
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトする能力
本発明によるＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いて、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析した。この実験は実施例８．１に記載した通りに実施した。
結果を表５に示す。ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して、１桁ピコモル範囲の極めて強力な細胞傷害活性を示した。
（表５）ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、刺激されたヒトＣＤ８ Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いて、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］
Figure 2018527908
実施例８．３
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７にリダイレクトする能力
ＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７を標的細胞源として用い、刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いて、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイでＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。このアッセイは実施例８．１に記載した通りに実施した。
刺激された濃縮ヒトＣＤ８＋ Ｔリンパ球をエフェクター細胞として、ヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞として用いた、５１クロム放出アッセイの結果によれば、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、自然発現体の標的細胞に対する細胞傷害活性も強力である（表６を参照）。
（表６）ＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７を標的細胞源として、刺激された濃縮ヒトＣＤ８ Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた、１８時間の５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで分析した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］
行１〜１０：配列番号２６０に示した領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する、本発明による抗体構築物。（行１〜７：ＥＧＦ−３領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。行８〜１０：ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。）行１１〜１４：ＥＧＦ−５／［ＥＧＦ−６］領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。
Figure 2018527908
実施例８．４
未刺激のヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、濃縮されたリンパ球調製物（バフィーコート）、輸血用血液を採取した血液バンクの副生成物から、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により調製した。バフィーコートは地域の血液バンクによって供給され、ＰＢＭＣは採血と同日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離、及びダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）での徹底した洗浄後、残存する赤血球を、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１００μＭ ＥＤＴＡ）とのインキュベーションによりＰＢＭＣから除去した。１００ｘｇでＰＢＭＣを遠心分離し、血小板を上清から除去した。残存するリンパ球には、主にＢリンパ球及びＴリンパ球、ＮＫ細胞、ならびに単球が含まれる。ＰＢＭＣは培養中、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）にて３７℃／５％ＣＯ２に維持した。
ＣＤ１４＋細胞及びＣＤ５６＋細胞の除去
ＣＤ１４＋細胞の除去には、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、＃１３０−０５０−２０１）を、ＮＫ細胞の除去にはヒトＣＤ５６マイクロビーズ（ＭＡＣＳ、＃１３０−０５０−４０１）を使用した。ＰＢＭＣを計数し、３００ｘｇで室温にて１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ分離緩衝液［８０μｌ／１０７細胞；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２００１２−０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１０２７０−１０６）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｅ−６５１１）］に再懸濁した。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μｌ／１０７細胞）を添加し、４〜８℃で１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ分離緩衝液（１〜２ｍＬ／１０７細胞）で洗浄した。遠心分離後（上記参照）、上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ分離緩衝液（５００μｌ／１０８細胞）に再懸濁した。次に、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０４２−４０１）を使用して単離した。ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を含まないＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ完全培地、すなわち１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｓ０１１５）、１ｘ非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｋ０２９３）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｌ１６１３）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｌ０４７３）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ａ２２１３）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃ＦＧ１２１５）中で、必要になるまでインキュベーターにて３７℃で培養した。
標的細胞の標識
フローサイトメトリーアッセイで細胞溶解を分析するため、蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｖ２２８８６）を使用して、ヒトＤＬＬ３またはマカクＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞として標識し、エフェクター細胞と区別した。簡単に述べると、細胞を採取して、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μｌ／１０６細胞）を含有するＰＢＳで１０６細胞／ｍＬに調整した。３７℃で３分間のインキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、細胞数を１．２５ｘ１０５細胞／ｍＬに調整した。０．５％（ｖ／ｖ）の等張エオシンＧ溶液（Ｒｏｔｈ、＃４５３８０）を使用して細胞の活力を判定した。
フローサイトメトリーによる分析
このアッセイでは、ＤＬＬ３二重特異性抗体構築物の系列希釈物の存在下で、カニクイザルまたはヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞の溶解を定量することを目的とした。ＤｉＯ標識した標的細胞とエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４＋細胞を含まないＰＢＭＣ）を等容積で混合し、Ｅ：Ｔ細胞比を１０：１にした。この懸濁液のうち１６０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに移した。４０μｌのＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の系列希釈物、及び陰性対照の二重特異性（無関係な標的抗原を認識するＣＤ３ベースの二重特異性抗体構築物）またはＲＰＭＩ完全培地を追加の陰性対照として加えた。二重特異性抗体媒介性の細胞傷害反応を７％ＣＯ２加湿インキュベーター内で４８時間続行した。次いで、細胞を新しい９６ウェルプレートに移し、標的細胞膜の完全性の喪失を、最終濃度１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加することによりモニタリングした。ＰＩは、生細胞からは通常排除されるが、死細胞はそれを捕捉し、蛍光発光により識別可能になる膜不透過性色素である。
サンプルをＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ装置でフローサイトメトリーにより測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで解析した（いずれもＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）。ＤｉＯ陽性細胞を標的細胞と判定した。ＰＩ陰性標的細胞を生標的細胞に分類した。細胞傷害性の百分率を、以下の式に従って算出した。
Figure 2018527908
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して、細胞傷害性の百分率を対応する二重特異性抗体構築物の濃度に対してプロットした。用量反応曲線を４パラメーターロジスティック回帰モデルを用いて解析し、一定ヒル勾配をもつシグモイド用量反応曲線を導出し、ＥＣ５０値を算出した。
実施例８．５
未刺激のヒトＰＢＭＣをヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトする能力
ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、未刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いて、ＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイでＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。このアッセイは上記実施例８．４に記載した通りに実施した。
未刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的として用いた、ＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイの結果を表７に示す。
（表７）未刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的として用いた、４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイで測定した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］
行１〜１０：配列番号２６０に示した領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する、本発明による抗体構築物。（行１〜７：ＥＧＦ−３領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。行８〜１０：ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。）行１１〜１４：ＥＧＦ−５／［ＥＧＦ−６］領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。
Figure 2018527908
予測した通り、ＥＣ５０値は一般に、刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞（実施例８．２を参照）を用いた細胞傷害性アッセイと比べ、未刺激のＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた細胞傷害性アッセイの方が高かった。
実施例８．６
未刺激のヒトＰＢＭＣをＤＬＬ３陽性肺癌細胞株ＳＨＰ−７７にリダイレクトする能力
ＤＬＬ３陽性ヒト肺癌細胞株ＳＨＰ−７７を標的細胞源として用い、未刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いて、ＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイでＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性をさらに分析した。このアッセイは上記実施例８．４に記載した通りに実施した。結果を表８に示す。
（表８）未刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒト細胞株ＳＨＰ−７７を標的細胞源として用いて、４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイで測定した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］
行１〜１０：配列番号２６０に示した領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する、本発明による抗体構築物。（行１〜７：ＥＧＦ−３領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。行８〜１０：ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。）行１１〜１４：ＥＧＦ−５／［ＥＧＦ−６］領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。
Figure 2018527908
実施例８．７
マカクＴ細胞をマカクＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞にリダイレクトする能力
最後に、マカク（カニクイザル）ＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９５：３２５６−６１（２０００））をエフェクター細胞源として用いて、ＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイでＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。マカクＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞の標的細胞標識と、フローサイトメトリーによる細胞傷害活性の分析を上記のように実施した。
結果を表９に示す。本発明によるＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、細胞株４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞を誘導し、マカクＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞を効率的に殺傷した。このアッセイで抗体構築物は、２桁ピコモルの強力なＥＣ５０値を示し、マカク系で極めて活性であることが確認された。
（表９）マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、マカクトＤＬＬ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いて、４８時間のＦＡＣＳによる細胞傷害性アッセイで測定した、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］
行１〜１０：配列番号２６０に示した領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する、本発明による抗体構築物。（行１〜７：ＥＧＦ−３領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。行８〜１０：ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。）行１１〜１４：ＥＧＦ−５／［ＥＧＦ−６］領域内に含まれるＤＬＬ３エピトープに結合する抗体構築物。
Figure 2018527908
実施例９
２５０μｇ／ｍｌでの、（ｉ）３回の凍結／解凍サイクル後及び（ｉｉ）７日間のインキュベーション後の単量体から二量体への変換
二重特異性ＤＬＬ３ｘＣＤ３抗体の単量体構築物に、さまざまな負荷条件を施した後、高速ＳＥＣにかけ、二量体抗体構築物に変換された初期単量体抗体構築物の割合を測定した。
（ｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、一般処方緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、次いで−８０℃で３０分間凍結後、室温で３０分間解凍した。３回の凍結／解凍サイクル後、二量体含有量をＨＰ−ＳＥＣにより測定した。
（ｉｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、一般処方緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、続いて３７℃で７日間インキュベートした。二量体含有量をＨＰ−ＳＥＣにより測定した。
高分解能ＳＥＣカラムＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ−Ｊａｐａｎ）を、Ａ９０５オートサンプラーを装備したＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した。カラム平衡化バッファー及びランニングバッファーの組成は１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４にし、ｐＨ６．６に調整した。抗体溶液（２５μｇのタンパク質）を平衡化したカラムに加え、流速０．７５ｍｌ／分、最大圧力７ＭＰａで溶出を行った。２８０、２５４、及び２１０ｎｍの吸光度で実行全体をモニタリングした。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの実行評価シートに記録された２１０ｎｍのシグナルのピーク積分によって行った。二量体含有量は、単量体と二量体合計のピーク総面積で二量体のピーク面積を除算して算出した。
結果を以下の表１０に示す。本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、３回の凍結／解凍サイクル後に０．０％の二量体率を示し、３７℃で７日間のインキュベーション後に≦２％の二量体率を示した。
（表１０）高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって測定したＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体対二量体のパーセンテージ
Figure 2018527908
実施例１０
熱安定性
抗体の凝集温度を以下のように測定した。２５０μｇ／ｍｌの抗体構築物溶液４０μｌを単回使用のキュベットに移し、Ｗｙａｔｔの動的光散乱装置ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）に入れた。０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃までサンプルを加熱し、測定した半径を常時取得した。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加をＤＬＳ装置に付属のソフトウェアパッケージで利用して、抗体構築物の凝集温度を算出した。
以下の表１１に示すように、試験した本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物はすべて、凝集温度≧４５℃の熱的安定性を示した。（配列番号２５９に示す）ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する抗体構築物群はさらに、≧５０℃、正確には≧５４℃の熱安定性を有していた。
（表１１）ＤＬＳ（動的光散乱法）によって測定された二重特異性抗体構築物の熱安定性
Figure 2018527908
実施例１１
ヒト血漿中での２４時間インキュベーション後の安定性
精製した二重特異性抗体構築物を１：５の比でヒト血漿プール中にて、３７℃、最終濃度２〜２０μｇ／ｍｌで９６時間インキュベートした。血漿とのインキュベーション後、開始濃度０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの、刺激された濃縮ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞とヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞をエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比１０：１で用いて、５１クロム放出アッセイで抗体構築物を比較した（実施例８．１に記載のアッセイ）。インキュベートしていない新たに解凍した二重特異性抗体構築物を対照として含めた。
結果を以下の表１２に示す。また、２つの抗体構築物ＤＬＬ−４及びＤＬＬ−１４の例示的な結果を図５に示す。試験した抗体構築物はすべて、≦２．５の極めて良好な血漿安定性（ＥＣ５Ｏ血漿／ＥＣ５０対照）を有した。（配列番号２５９に示す）ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する抗体構築物群はさらに、≦１．５、正確には≦１．１の血漿安定性を有していた。
（表１２）血漿とのインキュベーションの有無による抗体構築物ＥＣ５０値、及び算出した血漿／対照値
Figure 2018527908
実施例１２
抗体濃度２５００μｇ／ｍｌでの濁度
濃度２５０μｇ／ｍｌの精製した抗体構築物溶液１ｍｌを回転濃縮ユニットによって２５００μｇ／ｍｌまで濃縮した。５℃で１６時間保存した後、抗体溶液の濁度を、一般処方緩衝液に対するＯＤ３４０ｎｍでの光吸収測定により判定した。
結果を以下の表１３に示す。試験した抗体構築物はすべて、１つの構築物の濁度が０．１をわずかに上回った以外は、≦０．１の極めて良好な濁度を有している。（配列番号２５９に示す）ＥＧＦ−４領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する抗体構築物群はさらに、≦０．０８の濁度を有する。
（表１３）一晩で２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮後の抗体構築物の濁度
Figure 2018527908
実施例１３
高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の均一性
本発明の抗体構築物のタンパク質均一性を、高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸで分析した。
５０μｇの抗体構築物単量体を５０ｍｌの結合緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．０１％ナトリウムオクタン酸、ｐＨ５．５）で希釈し、この溶液４０ｍｌを、Ａｋｔａ Ｍｉｃｒｏ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した１ｍｌのＢｉｏＰｒｏ ＳＰ−Ｆカラム（ＹＭＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えた。サンプルの結合後、さらに結合緩衝液で洗浄工程を行った。タンパク質を溶出するため、緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ナトリウムオクタン酸、ｐＨ５．５）を用いて、緩衝液Ｂが５０％まで、線形増加する塩勾配を１０カラム容積超で適用した。２８０、２５４、及び２１０ｎｍの光吸光度でラン全体をモニタリングした。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアのラン評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分によって行った。
結果を以下の表１４に示す。試験した抗体構築物はすべて、≧８０％（メインピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ））という極めて良好な均一性を有している。（配列番号２５８に示す）ＥＧＦ−３領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する抗体構築物群はさらに、≧９０％の均一性を有する。
（表１４）抗体構築物のタンパク質均一性（メインピークのＡＵＣ％）
Figure 2018527908
実施例１４
ＨＩＣブチルによって測定した表面疎水性
本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣで試験した。
５０μｇの抗体構築物単量体を一般処方緩衝液で最終容積５００μｌまで希釈し（１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリジンＨＣｌ、４％トレハロース、ｐＨ７．０）、Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した１ｍｌのブチルセファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えた。２８０、２５４、及び２１０ｎｍの光吸光度でラン全体をモニタリングした。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアのラン評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分によって行った。タンパク質シグナルの面積及び速度の上下を比較し、それによってＢｉＴＥアルブミンとマトリックスとが融合する相互作用強度を示すことにより溶出挙動を評価した。
抗体構築物は、良好な溶出挙動を有し、それはほぼ迅速かつ完全であった。
実施例１５
二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの効力差
個々のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差（効力差と称する）を測定するため、本明細書で上述したように（実施例８．１）、精製した二重特異性抗体構築物の単量体と二量体を用いて１８時間の５１クロム放出細胞傷害性アッセイを実施した。エフェクター細胞は刺激した濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞であった。標的細胞は、ヒトＤＬＬ３トランスフェクトＣＨＯ細胞であった。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１であった。効力差は、ＥＣ５０値の比率で算出した。
結果を以下の表１５に示す。また、２つの抗体構築物ＤＬＬ−４及びＤＬＬ−１４の例示的な結果を図６に示す。試験したＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力差は０．２〜１．０の間であった。したがって、対応する単量体と比べて活性の高い二量体は実質的に存在しない。
（表１５）単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの効力差
Figure 2018527908
実施例１６
ｉｎ ｖｉｔｒｏ内在化アッセイ
Ｔ細胞を欠く標的細胞での構築物のプレインキュベーションの関数としてＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力の変化を測定した。抗体構築物が内在化される場合、リソソーム分解を受けるはずである。時間と共に有効濃度は減少するはずであり、よって見かけの効力もまた減少するはずである。この効果は既知の現象であるため、他の標的で観察されるが、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物では影響は観察されなかった。このアッセイは以下の通り実施した。
Ｔ細胞を計数し、アッセイ培地中で濃度１ｘ１０５／ｍｌに希釈した。ＳＨＰ−７７細胞を計数し、２５００細胞／ウェル（ｃｐｗ）で播種した。開始濃度１００ｎＭで、抗体構築物を（Ｂｒａｖｏで）１：２に系列希釈した。抗体構築物を培養アッセイプレートに加え、０時間、１時間、または２時間のインキュベーション後にＴ細胞を添加した。次いで、Ｔ細胞を２５０００ｃｐｗで播種し、アッセイを３７℃で４８時間インキュベートした。ＳＨＰ−７７の細胞生存率を、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）システムによって分析した（２５μｌ／ウェル）。結果を図７に示しており、これは抗体構築物ＤＬＬ３−４ｘＣＤ３（Ｉ２Ｃ）の有意な内在化が存在しないことを示唆している。
実施例１７
排出試験
排出されたＤＬＬの存在によって、本発明のＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性が有意に損なわれるかどうかを分析するため、以下のアッセイを実施した。Ｔ細胞を計数し、アッセイ培地中で濃度１ｘ１０５／ｍｌに希釈した。ＳＨＰ−７７細胞を計数し、アッセイ培地中で濃度１．２５ｘ１０５／ｍｌに希釈し、可溶性ＤＬＬ３の濃度を０．３ｎＭ〜１２ｎＭに増加させた。ＳＨＰ−７７細胞を２５００細胞／ウェル（ｃｐｗ）で播種し、Ｔ細胞を２５０００ｃｐｗで加えた。抗体構築物を（Ｂｒａｖｏで）１：２に系列希釈し、（Ｂｒａｖｏを用いた）培養アッセイに加えた。インキュベーションを３７℃で４８時間行った。ＳＨＰ−７７の細胞生存率を、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）システム（２５μｌ／ウェル）によって分析した。
実施例１８
マウス異種移植片有効性試験
ＨＬＥ ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（配列番号５１７）の抗腫瘍活性を、試験１日目に５ｘ１０６ヒトＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ（ＳＨＰ−７７ ｌｕｃ）細胞または５ｘ１０６ヒトＤＬＬ３陽性黒色腫（ＷＭ ２６６−４）細胞を皮下注射した雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて試験した。エフェクター細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖及び活性化させた生存するヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞２ｘ１０７）を１２日目に腹腔内注射した。処置の開始は１６日目（ＷＭ ２６６−４）または１８日目（ＳＨＰ−７７ ｌｕｃ）であった。抗体構築物を５日ごとに４回（ｑ５ｄｘ４）、静脈内ボーラス注射で投与した。処置群は以下の通りである：
−ＳＣＬＣモデル（ＳＨＰ−７７ ｌｕｃ）／各群マウス７匹
・Ｔ細胞ありビヒクル処置群
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物：投与あたり１０ｍｇ／ｋｇ
−黒色腫モデル（ＷＭ２６６−４）／各群マウス９匹
・Ｔ細胞ありビヒクル処置群
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物：投与あたり１０ｍｇ／ｋｇ
・ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物：投与あたり２ｍｇ／ｋｇ
試験中、腫瘍をカリパスによって測定し、進行を腫瘍容積（ＴＶ）の群間比較によって評価した。日別の腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］を、Ｔ／Ｃ％＝１００ｘ（分析群のＴＶ中央値）／（対照群のＴＶ中央値）として腫瘍容積を算出することにより測定し、算出した値を以下の表１６に記載する。
（表１６）ＳＨＰ−７７ ｌｕｃ細胞及びＷＭ２６６−４細胞を用いたマウス異種移植試験のＴ／Ｃ値
Figure 2018527908
結果をさらに図８Ａ及び８Ｂに示す。両方の腫瘍モデルにおいて、試験した２及び１０ｍｇ／ｋｇ両方の用量レベルで有意な腫瘍成長阻害が見られた。
実施例１９
カニクイザル探索毒性試験
半減期を延長しないＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（配列番号５５４）を用いて、探索毒性試験を実施した。３匹の雌カニクイザルに１６日間（それぞれ５、１５、及び４５μｇ／ｋｇ／日を３日間、続いて１００μｇ／ｋｇ／日を７日間）連続静脈内注入により投与した。試験物品に関連した臨床観察と、体温、食餌消費量または体重の変化は見られなかった。
ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の薬理学に関する予測と一貫し、血中Ｔリンパ球集団（総Ｔリンパ球、Ｔヘルパー及びＴ細胞傷害性リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、及びＣＤ２５＋活性化Ｔリンパ球）は投与初日に減少し、全動物において試験期間を通じ低いままであった。活性化マーカー（活性化Ｔ細胞のＣＤ６９及びＣＤ２５）は初日に増加したが、試験中のそれ以降の時点では増加しなかった。
要約すると、ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、最大の試験用量（１００μｇ／ｋｇ／日、＞３００ｘＥＣ５０）であっても極めて優れた忍容性を示した。
実施例２０
カニクイザルＰＫ試験
カニクイザルＰＫ試験をナイーブ雄カニクイザルを用いて実施した。３種類のアルブミン融合ＤＬＬ３ｘＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物（ＤＬＬ３−４、ＤＬＬ３−６、及びＤＬＬ３−１４）を濃度１２μｇ／ｋｇで静脈内単回ボーラスとして投与した。分子ごとに２匹の動物群を使用した。
個々のカニクイザルＰＫ試験は、異なるＦｃ融合型のＤＬＬ３−４を除いて、同じ条件下で実施した。
血液サンプルは、投与前と、投与後０．０５、０．５、１、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、及び３３６時間に採取した。イムノアッセイにおいて分子の血清濃度を測定するため血清を調製した。抗体構築物をその標的部分を介して捕捉することによりアッセイを実施すると同時に、構築物のＣＤ３結合部分に対する抗体を検出に使用した。血清濃度−時間プロファイルをＰＫパラメーターの決定に使用した。薬物動態パラメーターは、標準的なノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）法を用いて決定した。次のＰＫパラメーターを評価した：ＡＵＣｉｎｆ（血清濃度−時間曲線下面積）、Ｖｓｓ（定常状態での分布容積）、ＣＬ（全身クリアランス）、及び終末相ｔ１／２（終末相半減期）。全抗体構築物について、投与後に全動物の全時点で血清レベルを定量化可能であった。処置動物のいずれにおいても臨床観察は行わなかった。
試験した抗体構築物の薬物動態を図９に示し、ＰＫパラメーターをｎ＝２の平均値で以下の表１７にまとめている。
アルブミン融合構築物は、ヒト患者における週１回または２回の投与スケジュールで、一貫して良好なＰＫプロファイルを示した。Ｆｃ融合構築物（ｓｃＦｃ）では、週１回の投与の維持、または隔週投与の維持でも、さらに良好なＰＫプロファイルが観察された。
（表１７）ＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＨＬＥ変種のカニクイザルにおける薬物動態パラメーター
Figure 2018527908
（表１８）配列表
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Claims (28)

  1. 標的細胞表面にあるヒトＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞表面にあるヒトＣＤ３及び少なくともマカクＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、前記第１の結合ドメインが、配列番号２６０に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、二重特異性抗体構築物。
  2. 前記第１の結合ドメインがさらに、マカクＤＬＬ３、好ましくはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＬＬ３に結合する、請求項１に記載の抗体構築物。
  3. 前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１または２に記載の抗体構築物。
  4. （ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及び前記形式のオリゴマーからなる群から選択される形態である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  5. 前記第１の結合ドメインが、配列番号２５８に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  6. 前記第１の結合ドメインが、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む、請求項５に記載の抗体構築物：
    ａ）配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｂ）配列番号４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｃ）配列番号５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｄ）配列番号６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｅ）配列番号７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｆ）配列番号８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｇ）配列番号９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｈ）配列番号１０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
    ｉ）配列番号１１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
  7. 前記第１の結合ドメインが、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号４３５、及び配列番号５２９に示されたものからなる群から選択されるＶＨ領域を含む、請求項５または６に記載の抗体構築物。
  8. 前記第１の結合ドメインが、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号４３６、及び配列番号５３０に示されたものからなる群から選択されるＶＬ領域を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  9. 前記第１の結合ドメインが、配列番号３７＋３８、配列番号４７＋４８、配列番号５７＋５８、配列番号６７＋６８、配列番号７７＋７８、配列番号８７＋８８、配列番号９７＋９８、配列番号１０７＋１０８、配列番号１１７＋１１８、配列番号４３５＋４３６、及び配列番号５２９＋５３０に示されたＶＨ領域とＶＬ領域の対からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  10. 前記第１の結合ドメインが、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号４３７、及び配列番号５３１に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  11. 配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号４３８、及び配列番号５３２に示されるものからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  12. 前記第１の結合ドメインが、配列番号２５９に示される領域内に含まれるＤＬＬ３のエピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  13. 前記第１の結合ドメインが、以下からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む、請求項１２に記載の抗体構築物：
    ａ）配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｂ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｃ）配列番号１４１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１４６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｄ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｅ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｆ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｇ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｈ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４１に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｉ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｊ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｋ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
    ｌ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４１に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
    ｍ）配列番号１３１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４０に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４２に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１３６に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
  14. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、及び配列番号４５５に示されたものからなる群から選択されるＶＨ領域を含む、請求項１２または１３に記載の抗体構築物。
  15. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、及び配列番号４７０に示されたものからなる群から選択されるＶＬ領域を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  16. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１２７＋１２８、配列番号１３７＋１３８、配列番号１４７＋１４８、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１３７＋４５６、配列番号１３７＋４５７、配列番号１３７＋４５８、配列番号１３７＋４５９、配列番号１３７＋４６０、配列番号４４５＋１３８、配列番号４４６＋１３８、配列番号４４７＋１３８、配列番号４４５＋４６０、配列番号４４８＋４６１、配列番号４４９＋４６２、配列番号４５０＋４６３、配列番号４５０＋４６４、配列番号４５０＋４６５、配列番号４５０＋４６６、配列番号４５０＋４６７、配列番号４５０＋４６８、配列番号４５１＋４６３、配列番号４５２＋４６３、配列番号４５３＋４６３、配列番号４５１＋４６８、配列番号４５４＋４６９、及び配列番号４５５＋４７０に示されたＶＨ領域とＶＬ領域の対からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  17. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、及び配列番号４９３に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  18. 配列番号１３０、配列番号１４０、配列番号１５０、配列番号１６０、配列番号１７０；配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、及び配列番号５１６に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  19. 配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４に示されたものからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  20. 先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド。
  21. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  22. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２１に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
  23. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体構築物の作製方法であって、前記抗体構築物の発現を可能にする条件下で請求項２２に記載の宿主細胞を培養することと、前記作製された抗体構築物を前記培養物から回収することとを含む、前記方法。
  24. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体構築物、または請求項２３に記載の方法に従って作製された抗体構築物を含む、医薬組成物。
  25. 腫瘍もしくは癌疾患、または転移性癌疾患の予防、治療、または改善に使用される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項２３に記載の方法に従って作製された抗体構築物。
  26. 腫瘍もしくは癌疾患、または転移性癌疾患の治療または改善のための方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項２３に記載の方法に従って作製された抗体構築物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法。
  27. 前記腫瘍または癌疾患が、肺癌、好ましくはＳＣＬＣ、乳房、子宮頸部、結腸、結腸直腸、子宮内膜、頭頸部、肝臓、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、甲状腺、副腎、腎臓、膀胱、子宮、食道、尿路上皮、及び脳の腫瘍または癌、リンパ腫、癌腫、及び肉腫、ならびに前記のいずれかに由来する転移性癌疾患からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法または請求項２４に記載の抗体構築物。
  28. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体構築物、請求項２３に記載の方法に従って作製された抗体構築物、請求項２０に記載のポリヌクレオチド、請求項２１に記載のベクター、及び／または請求項２２に記載の宿主細胞が含まれるキット。
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