CN102405233A - 改良的抗血清清蛋白结合变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗血清清蛋白免疫球蛋白单一可变域DOM7h-11的改良变体，以及包含此类变体的配体和药物偶联物、组合物、核酸、载体和宿主。

Description

改良的抗血清清蛋白结合变体
本发明涉及抗血清清蛋白免疫球蛋白单一可变域DOM7h-11的改良变体，以及包含此类变体的配体和药物偶联物、组合物、核酸、载体和宿主。
发明背景
WO04003019和WO2008/096158披露了抗血清清蛋白(SA)结合模块，诸如抗SA免疫球蛋白单一可变域(dAb)，它们具有治疗上有用的半衰期。这些文件披露了单体抗SA dAb以及包含此类dAb的多特异性配体，例如包含抗SA dAb和特异性结合靶抗原诸如TNFR1的dAb的配体。披露了特异性结合来自超过一种物种的血清清蛋白的结合模块，例如人/小鼠交叉反应性抗SA dAb。
WO05118642和WO2006/059106披露了偶联或联合抗SA结合模块，诸如抗SA免疫球蛋白单一可变域至药物以延长药物半衰期的概念。披露和例示了蛋白质、肽和NCE(新化学实体)药物。WO2006/059106披露了使用这种概念来延长促胰岛素剂例如肠降血糖素激素诸如胰高血糖素样肽(GLP)-1的半衰期。
还可参考Holt et al，“Anti-Serum albumin domain antibodies for extendingthe half-lives of short lived drugs”，Protein Engineering，Design & Selection，vol21，no 5，pp283-288，2008。
WO2008/096158披露了DOM7h-11，它是一种优秀的抗SA dAb。会希望提供作为DOM7h-11变体的且特异性结合血清清蛋白(优选来自人和非人物种的清蛋白)的改良dAb，这会提供在疾病的动物模型中以及对于人治疗和/或诊断的效用。还会希望提供介于相对适度和高亲和力抗SA结合模块(dAb)之间的选择。此类模块可连接至药物，抗SA结合模块根据设想的目的应用来选择。这会容许更好地剪裁药物来治疗和/或预防慢性或急性适应证，取决于抗SA结合模块的选择。还会希望提供在溶液中是单体或基本上这样的抗dAb。这在抗SA dAb连接至结合模块例如特异性结合细胞表面受体诸如TNFR1的dAb(其目的是拮抗该受体)时会是尤其有利的。抗SA dAb的单体状态在减少受体交联的机会方面是有用的，因为不太可能形成多聚体，多聚体能结合并交联细胞表面上的受体(例如TNFR1)，如此增加受体激动和有害受体信号传导的可能性。
发明概述
本发明的各方面解决了这些问题。
为此目的，本发明人令人惊讶地发现有益突变可靶向DOM7h-11的FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)。
因此，在一个方面，本发明提供DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与DOM7h-11相比包含FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有2至8处变化。
在一个方面，本发明提供DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与DOM7h-11相比包含位置32(编号方式依照Kabat)处的Met，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有0至4处别的变化。
本发明任一方面的各实施方案提供具有优秀抗血清清蛋白亲和力的DOM7h-11变体。变体的选择能容许根据期望的治疗和/或预防背景来剪裁半衰期。例如，在一个实施方案中，变体对血清清蛋白的亲和力相对较高，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防慢性或持久疾病、状况、毒性或其它慢性适应证的产物中会是有用的。在一个实施方案中，变体对血清清蛋白的亲和力相对适度，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防急性疾病、状况、毒性或其它急性适应证的产物中会是有用的。在一个实施方案中，变体对血清清蛋白的亲和力是中等的，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防急性或慢性疾病、状况、毒性或其它急性或慢性适应证的产物中会是有用的。
能想到对血清清蛋白具有适宜高亲和力和特异性的分子会在循环中停留足够久来具有期望治疗效果(Tomlinson，Nature Biotechnology 22，521-522(2004))。在此，高亲和力抗SA变体在血清循环中的停留会匹配物种的血清清蛋白(WO2008096158)。一旦在循环中，任何融合至AlbudAbTM变体(AlbudAb是抗血清清蛋白dAb或免疫球蛋白单一可变域)的治疗剂(它是NCE、肽或蛋白质)因此会能够对其靶物作用更久并展现更持久的治疗效果。这会容许靶向慢性或持久病，无需频繁服药。
具有适度亲和力(但是对SA的特异性)的变体只会在血清循环中停留较短时间(例如几小时或几天)，容许融合的治疗剂特异性靶向急性病中涉及的治疗靶。
这样有可能通过选择具有适宜清蛋白结合亲和力和/或血清半衰期的抗SA变体来剪裁含有抗SA的产物适应治疗疾病领域。
本发明的一个方面提供多特异性配体，其包含任何上文所述抗SA变体和特异性结合SA以外的靶抗原的结合模块。
本发明的一个方面提供融合产物，例如与肽或NCE(新化学实体)药物的融合蛋白或融合物，其包含融合或偶联(对于NCE)至任何上文所述变体的多肽、蛋白质、肽或NCE药物，其中所述变体是DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P(或具有与DOM7h-11-15的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列的变体)或DOM7h-11-12(或具有与DOM7h-11-12的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列的变体)。DOM7h-11-15和DOM7h-11-12在融合或偶联至配偶时只给出亲和力的适度下降，使得它们在融合产物中有用。DOM7h-11-15S12P与DOM7h-11-15相同，除了位置12(编号方式依照Kabat)是脯氨酸而非丝氨酸。这提供WO08052933中所列优点，包括降低含有此域抗体的融合蛋白对蛋白L的结合和便于纯化。通过述及将WO08052933的整个公开内容收入本文。类似地，本发明提供本文所公开DOM7h-11变体，其中所述变体包含下文所列氨基酸序列，除了位置12(编号方式依照Kabat)是脯氨酸。本发明还提供包含此类DOM7h-11变体的融合蛋白、偶联物或组合物。
本发明的一个方面提供DOM7h-11变体，其包含与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相同或与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，前提是所述变体的氨基酸序列具有FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变。
本发明的一个方面提供组合物，其包含任何前述方面的变体、融合蛋白或配体和药学可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介。
本发明的一个方面提供在患者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括将至少一剂依照本发明任何方面或实施方案的变体施用于所述患者。
本发明的一个方面提供多肽融合物或偶联物，其包含本文所公开抗血清清蛋白dAb(例如DOM7h-11-15或DOM7h-11-3或DOM7h-11-15S12P或与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相比具有多至4处变化的DOM7h-11-15S12P)和肠降血糖素或促胰岛素剂，例如毒蜥肽-4、GLP-1(7-37)、GLP-1(6-36)或WO06/059106中披露的任何肠降血糖素或促胰岛素剂，这些药剂通过述及而明确收入本文就像在本文中写明包括在本发明和所附权利要求中。
附图简述
图1：DOM7h-11变体dAb的氨基酸序列比对。特定位置处的“.”指示与在DOM7h-11中在该位置处找到的氨基酸相同的氨基酸。CDR以下划线和粗体文本指示(第一段标有下划线的序列是CDR1，第二段标有下划线的序列是CDR2，而第三段标有下划线的序列是CDR3)。
图2：DOM7h-11变体的动力学参数。KD单位＝nM；Kd单位＝sec-1；Ka单位＝M-1sec-1。记数法Ae-B表示Ax 10-B而Ce D表示C x 10D。指示了多种物种中的总体动力学范围，如得到下文例子支持的。还提供了供特定治疗背景(急性或慢性适应证、状况或疾病和供慢性和急性背景二者使用的“中等”)使用的任选范围。高亲和力dAb和包含这些的产物对于慢性背景是有用的。中等亲和力dAb和包含这些的产物对于中间背景是有用的。低亲和力dAb和包含这些的产物对于急性背景是有用的。这方面的亲和力是对血清清蛋白的亲和力。列举了抗血清dAb和融合蛋白的多种例子，而且这些支持公开的范围。许多例子具有在人和一种或多种非人动物中(例如在人和猕猴和/或小鼠中)有利的动力学。可依照本发明，根据要治疗性处理的背景(例如慢性或急性)来剪裁dAb或包含这种的产物的选择。
发明详述
在本说明书内参照实施方案以清楚简要的书面说明方式描述了本发明。意图且应当领会，可以对实施方案进行各种组合或分拆，而不背离本发明。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员普遍理解相同的含义(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。分子、遗传和生物化学方法(一般参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.及Ausubel et al.，Short Protocols inMolecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley & Sons，Inc。通过述及将其收入本文)和化学方法使用标准技术。
本文中，术语“肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的拮抗剂”或“抗TNFR1拮抗剂”等等指结合TNFR1且能抑制TNFR1的(一种或多种)功能的药剂(例如分子、化合物)。例如，TNFR1的拮抗剂能抑制TNFα结合TNFR1和/或抑制经由TNFR1介导的信号转导。因而，TNFR1介导的过程和细胞应答(例如标准L929细胞毒性测定法中TNFα诱导的细胞死亡)能用TNFR1的拮抗剂来抑制。
“患者”为任何动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物(诸如狒狒、恒河猴或猕猴)、小鼠、人、家兔、大鼠、犬、猫或猪。在一个实施方案中，患者为人。
本文中，“肽”指经肽键连接在一起的约2个至约50个氨基酸。
本文中，“多肽”指通过肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽一般包含三级结构且折叠成功能域。
本文中，抗体指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(诸如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、双抗体)，无论自天然生成抗体的任何物种衍生的，或者通过重组DNA技术创建的；无论自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的。
本文中，“抗体格式”指任何合适多肽结构，其中可掺入一个或多个抗体可变域以在该结构上赋予对抗原的结合特异性。多种合适抗体格式是本领域已知的，诸如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、任何上述的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键合的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单一抗体可变域(例如dAb、VH、VHH、VL)、和任何上述的修饰型式(例如通过共价附着聚乙二醇或其它合适聚合物或人源化VHH而修饰的)。
短语“免疫球蛋白单一可变域”指不依赖不同V区或域而特异性结合抗原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单一可变域可以以与其它可变区或可变域一起的格式(例如同或异多聚体)存在，其中所述其它区或域不是所述单一免疫球蛋白可变域的抗原结合所需要的(即其中所述免疫球蛋白单一可变域不依赖所述别的可变域而结合抗原)。在本文中使用时，术语“域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单一可变域”相同。在本文中使用时，术语“单一免疫球蛋白可变域”与“免疫球蛋白单一可变域”相同。在本文中使用时，术语“单一抗体可变域”或“抗体单一可变域”与“免疫球蛋白单一可变域”相同。在一个实施方案中，免疫球蛋白单一可变域为人抗体可变域，但是也包括来自其它物种的单一抗体可变域，诸如啮齿类动物(例如如WO 00/29004中披露的，通过述及将其内容完整收入本文)、铰口鲨和驼类(Camelid)VHH dAb。驼类VHH为自包括骆驼(camel)、美洲驼羊(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)、和大羊驼(guanaco)的生成天然没有轻链的重链抗体的物种衍生的免疫球蛋白单一可变域多肽。VHH可以人源化。
“域”为经过折叠的蛋白质结构，其具有不依赖蛋白质其余部分的三级结构。一般地，域负责蛋白质的离散功能特性，而且在许多情况中可以添加、消除或转移至其它蛋白质而不丧失蛋白质的剩余部分和/或该域的功能。“单一抗体可变域”为经过折叠的多肽域，其包含抗体可变域特征性的序列。它因此包括完整抗体可变域和经过修饰的可变域，例如其中一个或多个环已被抗体可变域非特征性的序列替换，或截短的或包含N或C端延长的抗体可变域，以及可变域的折叠片段，其至少保留全长域的结合活性和特异性。
在本申请中，术语“预防”和“防止”涉及在诱发疾病或状况之前施用保护性组合物。“治疗”和“处理”涉及在疾病或状况症状变得明显之后施用保护性组合物。“阻抑”或“抑制”指在诱发事件之后，但在疾病或状况的临床表现之前施用组合物。
本文中，术语“剂量”指就一次(单位剂量)或在规定时间间隔里在两次或更多次施用中施用于受试者的配体数量。例如，剂量可以指在1天(24小时)(日剂量)、2天、1周、2周、3周、1个月或多月的过程里(例如通过单次施用，或者通过两次或更多次施用)施用于受试者的配体(例如包含结合靶抗原的免疫球蛋白单一可变域的配体)数量。剂量间的间隔可以是任何期望量的时间。术语“药学有效(的)”在指剂量时表示配体、域或药学活性剂提供期望效果的足够量。“有效的”量会根据个体的年龄和一般状况、具体药物或药学活性剂等等而在受试者间变化。如此，并非总是可能规定适用于所有患者的确切“有效”量。然而，本领域普通技术人员使用常规实验可确定在任何个别病例中适宜的“有效”剂量。
用于药动学分析和测定配体(例如单一可变域、融合蛋白或多特异性配体)半衰期的方法是本领域技术人员熟悉的。详情可见Kenneth，A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters etal，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。还可参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，published by Marcel Dekker，2ndRev.ex edition(1982)，其记载了药动学参数，诸如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。任选地，本文中引用的所有药动学参数和数值解读为人中的数值。任选地，本文中引用的所有药动学参数和数值解读为小鼠或大鼠或猕猴中的数值。
可以自配体血清浓度对时间的曲线确定半衰期(t1/2α和t1/2β)和AUC。可使用例如WinNonlin分析包，例如5.1版(可得自Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA)来对曲线建模。在使用两隔室建模时，在第一阶段(α阶段)中，配体主要经历在患者中的分配，有一些消除。第二阶段(β阶段)是配体完成分配和血清浓度随配体自患者清除而降低的阶段。tα半衰期为第一阶段的半衰期，而tβ半衰期为第二阶段的半衰期。如此，在一个实施方案中，在本发明的背景中，可变域、融合蛋白或配体具有在(约)15分钟或更久的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，该范围的下限是(约)30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外/或者，依照本发明的可变域、融合蛋白或配体会具有在上至且包括(约)12小时的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，该范围的上限是(约)11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的一个例子是(约)1至6小时、2至5小时或3至4小时。
在一个实施方案中，本发明提供依照本发明的可变域、融合蛋白或配体，其具有在(约)2.5小时或更久的范围中的tβ半衰期。在一个实施方案中，该范围的下限是(约)3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时、或12小时。另外/或者，tβ半衰期上至且包括(约)21或25天。在一个实施方案中，该范围的上限是(约)12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天、19天、20天、21天或22天。例如，依照本发明的可变域、融合蛋白或配体会具有在(约)12至60小时的范围中的tβ半衰期。在又一个实施方案中，它会在(约)12至48小时的范围中。在又一个实施方案中，它会在(约)12至26小时的范围中。
作为使用两隔室建模的代替，技术人员会熟悉非隔室建模的使用，其可用于确定终末半衰期(在这个方面，本文中，术语“终末半衰期”表示使用非隔室建模确定的终末半衰期)。可使用例如WinNonlin分析包，例如5.1版(可得自Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA)来以这种方式对曲线建模。在这种情况中，在一个实施方案中，单一可变域、融合蛋白或配体具有至少(约)8小时、10小时、12小时、15小时、28小时、20小时、1天、2天、3天、7天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天的终末半衰期。在一个实施方案中，此范围的上限是(约)24小时、48小时、60小时或72小时或120小时。例如，人中的终末半衰期是例如(约)8小时至60小时、或8小时至48小时或12至120小时。
作为上述标准的补充或代替，依照本发明的可变域、融合蛋白或配体具有在(约)1mg.min/ml或更大的范围中的AUC面积(曲线下面积)。在一个实施方案中，该范围的下限是(约)5、10、15、20、30、100、200或300mg.min/ml。另外/或者，依照本发明的可变域、融合蛋白或配体具有在多至(约)600mg.min/ml的范围中的AUC。在一个实施方案中，该范围的上限是(约)500、400、300、200、150、100、75或50mg.min/ml。有利地，可变域、融合蛋白或配体会具有在选自下组的范围中的AUC：(约)15至150mg.min/ml，15至100mg.min/ml，15至75mg.min/ml，和15至50mg.min/ml。
“表面等离振子共振(Surface Plasmon Resonance)”：可使用竞争测定法来确定一种特定抗原或表位(诸如人血清清蛋白)是否与另一种抗原或表位(诸如猕猴血清清蛋白)竞争对本文所述血清清蛋白结合配体(诸如一种特定dAb)的结合。类似地，可使用竞争测定法来确定第一配体(诸如dAb)是否与第二配体(诸如dAb)竞争对靶抗原或表位的结合。本文中，术语“竞争”指物质(诸如分子、化合物，优选蛋白质)能够以任何程度干扰两种或更多种分子之间的特异性结合相互作用。短语“没有竞争性抑制”表示物质(诸如分子、化合物，优选蛋白质)没有以任何可测量的或显著的程度干扰两种或更多种分子之间的特异性结合相互作用。两种或更多种分子之间的特异性结合相互作用优选包括单一可变域与其关联配偶或靶物之间的特异性结合相互作用。干扰或竞争分子可以是另一种单一可变域，或者它可以是在结构上和/或在功能上与关联配偶或靶物相似的分子。
术语“结合模块(binding moiety)”指不依赖不同表位或抗原结合域而特异性结合抗原或表位的域。结合模块可以是域抗体(dAb)，或者可以是作为结合天然配体以外的配体(在本发明的情况中，所述模块结合血清清蛋白)的非免疫球蛋白蛋白质支架衍生物的域，例如选自下组的支架：CTLA-4，脂笼蛋白，SpA，adnectin，affibody，avimer，GroEl，运铁蛋白，GroES和纤连蛋白。参见WO2008/096158，其披露了蛋白质支架的例子和用于自全集选择抗原或表位特异性结合域的方法(参见实施例17至25)。通过述及明确将WO2008/096158的这些具体公开内容收入本文，就像在本文中明确写明，并用于本发明，而且涵盖可以将此类公开内容的任何部分掺入本文中的一项或多项权利要求)。
在一个方面，本发明提供DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与相比DOM7h-11包含FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有2至8处变化。任选地，位置49(依照Kabat)是Leu。另外/或者，位置50(依照Kabat)任选是Ala或Trp。另外/或者，位置51(依照Kabat)任选是Phe或Asn。在一个实施方案中，所述变体与DOM7h-11相比包含位置49、50和51(编号方式依照Kabat)每一个处的突变。在一个实施方案中，所述变体包含LFG基序，其中L位于位置49(编号方式依照Kabat)，其中L、F和G分别是Leu、Phe和Gly。
在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-3、DOM7h-11-15、DOM7h-11-12和DOM7h-11-19的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有FW2/CDR2接点中的至少一处突变，如上文限定的。在一个实施方案中，所述变体包含与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变。在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-3的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置49处的L、位置50处的W和位置51处的N。在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-12的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的M和位置49处的L。在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的M、位置49处的L、位置50处的A和位置51处的F。在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-18的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的M和位置87处的H。在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-19的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的M、位置49处的L和位置91处的T。此段中的所有编号方式依照Kabat。
本发明的一个方面提供DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与DOM7h-11相比包含位置32(编号方式依照Kabat)处的Met，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有0至4处别的变化。任选地，所述变体与DOM7h-11相比包含FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变。
在本发明的任何方面的一个实施方案中，所述变体与DOM7h-11相比包含至少一处选自下述的突变
位置49＝L，
位置50＝A或W，
位置51＝F或N，
位置87＝H，和
位置91＝T。
在一个实施方案中，所述变体包含与选自DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-11-15S12P、DOM7h-11-18和DOM7h-11-19的单一可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的Met。
在一个实施方案中，所述变体包含一项或多项下述动力学特征：-
(a)所述变体包含以(约)0.1至(约)10000nM、任选(约)1至(约)6000nM的解离常数(KD)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(b)所述变体包含以(约)1.5x 10-4至(约)0.1sec-1、任选(约)3x 10-4至(约)0.1sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(c)所述变体包含以(约)2x 106至(约)1x 104M-1sec-1、任选(约)1x 106至(约)2x 104M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(d)所述变体包含以(约)0.1至(约)10000nM、任选(约)1至(约)6000nM的解离常数(KD)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(e)任何前述权利要求的变体，其中所述变体包含以(约)1.5x 10-4至(约)0.1sec-1、任选(约)3x 10-4至(约)0.1sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(f)任何前述权利要求的变体，其中所述变体包含以(约)2x 106至(约)1x104M-1sec-1、任选(约)1x 106至(约)5x 103M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(g)所述变体包含以(约)1至(约)10000nM、任选(约)20至(约)6000nM的解离常数(KD)特异性结合大鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(h)所述变体包含以(约)2x 10-3至(约)0.15sec-1、任选(约)9x 10-3至(约)0.14sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合大鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(i)所述变体包含以(约)2x 106至(约)1x 104M-1sec-1、任选(约)1x 106至(约)3x 104M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合大鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(j)所述变体包含以(约)1至(约)10000nM的解离常数(KD)特异性结合小鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；
(k)所述变体包含以(约)2x 10-3至(约)0.15sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合小鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的；和/或
(1)所述变体包含以(约)2x 106至(约)1x 104M-1sec-1、任选(约)2x 106至(约)1.5x 104M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合小鼠SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
任选地，所述变体具有
I：依照(a)和(d)的KD，依照(b)和(e)的Kd，和依照(c)和(f)的Ka；或
II：依照(a)和(g)的KD，依照(b)和(h)的Kd，和依照(c)和(i)的Ka；或
III：依照(a)和(j)的KD，依照(b)和(k)的Kd，和依照(c)和(1)的Ka；或
IV：依照I和II的动力学；或
V：依照I和III的动力学；或
VI：依照I、II和III的动力学。
本发明还提供包含任何前述本发明方面或实施方案的变体的配体。例如，所述配体可以是双特异性配体(双特异性配体的例子见WO04003019)。在一个方面，本发明提供包含任何前述本发明方面或实施方案的抗SA变体和特异性结合SA以外的靶抗原的结合模块的多特异性配体。所述结合模块可以是任何特异性结合靶物的结合模块，例如所述模块是抗体、抗体片段、scFv、Fab、dAb或包含非免疫球蛋白蛋白质支架的结合模块。此类模块详细披露于WO2008/096158(见实施例17至25，通过述及将其公开内容收入本文)。非免疫球蛋白支架的例子有CTLA-4、脂笼蛋白、葡萄球菌蛋白A(spA)、AffibodyTM、AvimersTM、adnectins、GroEL和纤连蛋白。
在一个实施方案中，在抗靶物结合模块和抗SA单一变体之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选ASTSGPS。备选接头记载于WO2007085814(通过述及而收入本文)和WO2008/096158(见第135页第12行至第140页第14行一节，通过述及明确将其公开内容和所有接头序列收入本文，就像在本文中明确写明，并用于本发明，而且涵盖可以将此类公开内容的任何部分掺入本文中的一项或多项权利要求)。
在多特异性配体的一个实施方案中，靶抗原可以是多肽、蛋白质或核酸或其部分，它们可以是天然存在的或合成的。在这点上，本发明的配体可结合靶抗原且起拮抗剂或激动剂(例如EPO受体激动剂)的作用。本领域技术人员会领会选择很多且多样。它们可以是例如人或动物蛋白质、细胞因子、细胞因子受体(其中细胞因子受体包括细胞因子的受体)、酶、酶的辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但优选不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心肌营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENA-78，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-2，EpoR，FGF-酸性，FGF-碱性成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72个a.a.)，IL-8(77个a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，瘦蛋白，LIF，淋巴细胞趋化因子，Mullerian抑制性物质，单核细胞集落抑制因子，单核细胞引诱蛋白，M-CSF，MDC(67个a.a.)，MDC(69个a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67个a.a.)，MDC(69个a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER 3和HER 4，CD4，人趋化因子受体CXCR4或CCR5，来自乙肝病毒的3型非结构蛋白(NS3)，TNF-α，IgE，IFN-γ，MMP-12，CEA，幽门螺旋杆菌(H.pylori)，TB，流感，戊型肝炎，MMP-12，在某些细胞上过表达的内化受体诸如表皮生长因子受体(EGFR)，肿瘤细胞上的ErBb2受体，内化细胞受体，LDL受体，FGF2受体，ErbB2受体，运铁蛋白受体，PDGF受体，VEGF受体，PsmAr，胞外基质蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，α1-抗胰蛋白酶，组织因子蛋白酶抑制剂，PDK1，GSK1，Bad，胱天蛋白酶-9，Forkhead，幽门螺旋杆菌的抗原，结核分枝杆菌的抗原，和流感病毒的抗原。会领会此列表绝非穷举的。
在一个实施方案中，所述多特异性配体包含本发明的抗SA dAb变体和抗TNFR1结合模块，例如抗TNFR1dAb。任选地，所述配体只具有一个抗TNFR1结合模块(例如dAb)以降低受体交联的机会。在一个实施方案中，所述抗SAdAb变体是DOM7h-11-3或DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P。
在一个实施方案中，所述抗TNFR1结合模块是WO2008149148中披露的DOM1h-131-206(通过述及明确将该PCT申请中披露的其氨基酸序列和其核苷酸序列收入本文，就像在本文中明确写明，并用于本发明，而且涵盖可以将此类公开内容的任何部分掺入本文中的一项或多项权利要求)。在一个实施方案中，所述多特异性配体包含DOM1h-131-206的氨基酸序列和DOM7h-11-3或DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列或由DOM1h-131-206的氨基酸序列和DOM7h-11-3或DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述抗TNFR1结合模块或dAb是共同悬而未决的申请USSN 61/153,746中披露的任何此类模块或dAb，通过述及将其公开内容收入本文。在一个实施方案中，所述抗TNFR1结合模块包含与DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列或表3中公开的任何抗TNFR1dAb的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多特异性配体包含DOM1h-574-156的氨基酸序列和DOM7h-11-3或DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列或由DOM1h-574-156的氨基酸序列和DOM7h-11-3或DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的配体是融合蛋白，其包含直接或间接融合至一种或多种多肽的本发明的变体。例如，所述融合蛋白可以是如WO2005/118642中披露的“药物融合物”(通过述及将其公开内容收入本文)，其包含本发明的变体和该PCT申请中限定的多肽药物。
本文中，“药物”指任何可施用于个体以经由结合和/或改变个体中生物学靶分子的功能而产生有益的治疗或诊断效果的化合物(例如有机小分子、核酸、多肽)。所述靶分子可以是由个体的基因组编码的内源靶分子(例如由个体的基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或由病原体的基因组编码的外源靶分子(例如由病毒、细菌、真菌、线虫或其它病原体的基因组编码的酶)。适合在包含本发明抗SA dAb变体的融合蛋白和偶联物中使用的药物披露于WO2005/118642和WO2006/059106(通过述及将其整个公开内容收入本文，而且包括具体药物的整个列表，就像在本文中明确写明此列表，而且涵盖此类收录提供具体药物的公开，用于包括在本文中的权利要求中)。例如，所述药物可以是胰高血糖素样肽1(GLP-1)或变体、干扰素α2b或变体或毒蜥肽-4或变体。
在一个实施方案中，本发明提供如WO2005/118642和WO2006/059106中定义和公开的药物偶联物，其中所述偶联物包含本发明的变体。在一个例子中，所述药物共价连接至所述变体(例如所述变体和所述药物作为单一多肽的部分而表达)。或者，在一个例子中，所述药物与所述变体非共价键合或联合。所述药物可以直接地或间接地(例如经由合适接头和/或互补结合配偶(例如生物素和亲合素)的非共价结合)共价或非共价键合至所述变体。当采用互补结合配偶时，结合配偶之一可以直接地或经由合适接头模块共价键合至所述药物，而且互补结合配偶可以直接地或经由合适接头模块共价键合至所述变体。当所述药物是多肽或肽时，所述药物组合物可以是融合蛋白，其中所述多肽或肽、药物和所述多肽结合模块是连续多肽链的离散部分(模块)。如本文中描述的，所述多肽结合模块和多肽药物模块可以经由肽键直接彼此键合，或者经由合适氨基酸、或肽或多肽接头而连接。
含有一个本发明特异性结合血清清蛋白的单一可变域(单体)变体或超过一个单一可变域(如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)的配体可进一步包含一个或多个选自但优选不限于标记物、标签、另外的单一可变域、dAb、抗体、抗体片段、标志物和药物的实体。这些实体中一个或多个可位于包含单一可变域(免疫球蛋白或非免疫球蛋白单一可变域任一)的配体的COOH末端或N末端或N末端和COOH末端二者。这些实体中一个或多个可位于含有一个单一可变域(单体)或超过一个单一可变域(如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)的配体的特异性结合血清清蛋白的单一可变域的COOH末端、或N末端、或N末端和COOH末端二者。可位于这些末端之一或二者的标签的非限制性例子包括HA、his或myc标签。实体(包括一个或多个标签、标记物和药物)可以如上所述直接地或经由接头结合至含有一个结合血清清蛋白的单一可变域(单体)或超过一个单一可变域(如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)的配体。
本发明的一个方面提供融合产物，例如融合蛋白或与肽的融合物或与NCE(新化学实体)药物的偶联物，它们包含融合或偶联(用于NCE)至任何上文所述变体的多肽药物，任选其中所述变体是DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P(或具有与DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列的变体)或DOM7h-11-12(或具有与DOM7h-11-15或DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列的变体)。DOM7h-11-15、DOM7h-11-15S12P和DOM7h-11-12在融合或偶联至配偶时只给出适度的亲和力下降，使它们在融合产物中有用。
本发明提供组合物，其包含本发明任何方面的变体、融合蛋白、偶联物或配体和药学可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介。
本文中还涵盖分离的核酸，其编码本文中描述的任何变体、融合蛋白、偶联物或配体，例如含有一个特异性结合血清清蛋白或特异性结合人血清清蛋白和至少一种非人血清清蛋白的本发明单一可变域(单体)变体或超过一个单一可变域(例如如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)变体的配体或其功能活性片段。本文中还涵盖载体和/或表达载体、包含所述载体的宿主细胞(例如经载体转化的植物或动物细胞和/或细胞系)、表达和/或生产由所述载体编码的一种或多种含有一个特异性结合血清清蛋白的单一可变域(单体)变体或超过一个单一可变域变体(例如如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)的变体、融合蛋白或配体或其片段的方法，在一些情况中包括培养所述宿主细胞，使得所述一种或多种变体、融合蛋白或配体或其片段表达并任选自宿主细胞培养液回收所述含有一个特异性结合血清清蛋白的单一可变域(单体)或超过一个单一可变域(例如如本文中定义的多体、融合蛋白、偶联物、和双特异性配体)的配体。还涵盖使本文所述配体与血清清蛋白(包括血清清蛋白和/或非人血清清蛋白)和/或血清清蛋白以外的一种或多种靶物(其中所述靶物包括生物学活性分子，而且包括动物蛋白质、上文所列细胞因子)接触的方法，而且包括其中所述接触在体外以及将本文所述任何变体、融合蛋白或配体施用于个体宿主动物或体内和/或离体细胞的方法。优选地，施用本文所述包含单一可变域(免疫球蛋白或非免疫球蛋白)针对血清清蛋白和/或非人血清清蛋白，和一种或多种针对血清清蛋白以外的一种或多种靶物的域的配体会延长抗靶物配体的半衰期，包括Tβ和/或终末半衰期。本文中涵盖编码变体、融合蛋白或含有单一域的配体或其片段(包括其功能性片段)的核酸分子。本文中涵盖编码核酸分子的载体，包括但优选不限于表达载体，正如来自含有一种或多种这些载体的细胞系或生物体的宿主细胞。还涵盖生产任何变体、融合蛋白或配体的方法，包括但优选不限于任何上述核酸、载体和宿主细胞。
本发明的一个方面提供核酸，其包含编码依照本发明的变体或本发明的多特异性配体或本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的一个方面提供核酸，其包含选自DOM7h-11-3、DOM7h-11-15、DOM7h-11-15S12P、DOM7h-11-12、DOM7h-11-18和DOM7h-11-19的DOM7h-11变体的核苷酸序列或与所述选定序列至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％相同的核苷酸序列。
本发明的一个方面提供载体，其包含本发明的核酸。本发明的一个方面提供分离的宿主细胞，其包含所述载体。
文库载体系统、组合单一可变域、双特异性配体的表征、双特异性配体的结构、用于构建双特异性配体的支架、抗血清清蛋白dAb和多特异性配体和半衰期延长的配体的用途、及包含抗血清清蛋白dAb的组合物和配制剂的详情可参考WO2008/096158。通过述及将这些公开内容收入本文以提供与本发明(包括本发明的变体、配体、融合蛋白、偶联物、核酸、载体、宿主和组合物)一起使用的指导。
不是依照本发明的DOM7h-14变体序列披露于与本申请同一天提交的、共同悬而未决的题为改良的抗血清清蛋白结合变体的美国临时专利申请。通过述及将DOM7h-14变体的这些序列(所述共同悬而未决的申请中的SEQ IDNO：1-10)收入本文，就像在本文中明确写明。
序列
表1：DOM7h-11变体dAb的氨基酸序列
DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-11-15(SEQ ID NO：2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-11-18(SEQ ID NO：3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYHCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-11-19(SEQ ID NO：4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQTGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-11-3(SEQ ID NO：5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLILWNSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
表2：DOM7h-11变体dAb的核苷酸序列
DOM7h-11-12(SEQ ID NO：6)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC
ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT
GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-11-15(SEQ ID NO：7)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC
ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTGCT TTTTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT
GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGCGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-11-18(SEQ ID NO：8)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC
ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CAAAGCTCCT GATCTGGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT
GAAGATTTTG CTACGTACCA CTGTGCGCAG GCGGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-11-19(SEQ ID NO：9)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC
ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACGGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT
GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG ACTGGGACGC ATCCCACGAC GTTCGGCCAA
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-11-3(SEQ ID NO：10)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC
ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGACGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTTGG AATTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT
GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
表3：抗TNFR1dAb的氨基酸序列
＞DOM1h-509(SEQ ID NO：11)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYRMHWVRQAPGKSLEWVSSIDTRGSSTYYADPVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAVTMFSPFFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-510(SEQ ID NO：12)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYGMRWVRQAPGKGLEWVSSITRTGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWRNRHGEYLADFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-543(SEQ ID NO：13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMRYRMHWVRQAPGKGLEWVSSIDSNGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRTERSPVFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-549(SEQ ID NO：14)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMHWVRQAPGKGLEWVSSISESGTTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRFSASTFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574(SEQ ID NO：15)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGHWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-1(SEQ ID NO：16)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPYDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-2(SEQ ID NO：17)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-7(SEQ ID NO：18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-8(SEQ ID NO：19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-9(SEQ ID NO：20)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYMQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-10(SEQ ID NO：21)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-11(SEQ ID NO：22)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDHWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-12(SEQ ID NO：23)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-13(SEQ ID NO：24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-14(SEQ ID NO：25)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-15(SEQ ID NO：26)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-16(SEQ ID NO：27)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-17(SEQ ID NO：28)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-18(SEQ ID NO：29)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-19(SEQ ID NO：30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-25(SEQ ID NO：31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-26(SEQ ID NO：32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-27(SEQ ID NO：33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-28(SEQ ID NO：34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-29(SEQ ID NO：35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-30(SEQ ID NO：36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAAYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-31(SEQ ID NO：37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFNYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-32(SEQ ID NO：38)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-33(SEQ ID NO：39)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFDNWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-35(SEQ ID NO：40)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFITYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFQYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-36(SEQ ID NO：41)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-37(SEQ ID NO：42)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-38(SEQ ID NO：43)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-39(SEQ ID NO：44)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-40(SEQ ID NO：45)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFKYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-53(SEQ ID NO：46)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGERRYYADSVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-54(SEQ ID NO：47)
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＞DOM1h-574-65(SEQ ID NO：48)
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＞DOM1h-574-66(SEQ ID NO：49)
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＞DOM1h-574-67(SEQ ID NO：50)
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＞DOM1h-574-68(SEQ ID NO：51)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-69(SEQ ID NO：52)
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＞DOM1h-574-70(SEQ ID NO：53)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-71(SEQ ID NO：54)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-72(SEQ ID NO：55)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-73(SEQ ID NO：56)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-74(SEQ ID NO：57)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-75(SEQ ID NO：58)
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＞DOM1h-574-76(SEQ ID NO：59)
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＞DOM1h-574-77(SEQ ID NO：60)
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＞DOM1h-574-78(SEQ ID NO：61)
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＞DOM1h-574-79(SEQ ID NO：62)
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＞DOM1h-574-84(SEQ ID NO：63)
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＞DOM1h-574-85(SEQ ID NO：64)
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＞DOM1h-574-86(SEQ ID NO：65)
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＞DOM1h-574-87(SEQ ID NO：66)
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＞DOM1h-574-88(SEQ ID NO：67)
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＞DOM1h-574-90(SEQ ID NO：68)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLKFSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-91(SEQ ID NO：69)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-92(SEQ ID NO：70)
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＞DOM1h-574-93(SEQ ID NO：71)
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＞DOM1h-574-94(SEQ ID NO：72)
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＞DOM1h-574-95(SEQ ID NO：73)
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＞DOM1h-574-96(SEQ ID NO：74)
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＞DOM1h-574-141(SEQ ID NO：118)
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＞DOM1h-574-142(SEQ ID NO：119)
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＞DOM1h-574-143(SEQ ID NO：120)
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＞DOM1h-574-144(SEQ ID NO：121)
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＞DOM1h-574-145(SEQ ID NO：122)
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＞DOM1h-574-146(SEQ ID NO：123)
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＞DOM1h-574-147(SEQ ID NO：124)
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＞DOM1h-574-148(SEQ ID NO：125)
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＞DOM1h-574-149(SEQ ID NO：126)
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＞DOM1h-574-150(SEQ ID NO：127)
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＞DOM1h-574-151(SEQ ID NO：128)
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＞DOM1h-574-152(SEQ ID NO：129)
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＞DOM1h-574-153(SEQ ID NO：130)
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＞DOM1h-574-159(SEQ ID NO：136)
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＞DOM1h-574-162(SEQ ID NO：139)
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＞DOM1h-574-163(SEQ ID NO：140)
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＞DOM1h-574-164(SEQ ID NO：141)
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＞DOM1h-574-165(SEQ ID NO：142)
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＞DOM1h-574-166(SEQ ID NO：143)
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＞DOM1h-574-167(SEQ ID NO：144)
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＞DOM1h-574-169(SEQ ID NO：145)
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＞DOM1h-574-170(SEQ ID NO：146)
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＞DOM1h-574-171(SEQ ID NO：147)
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＞DOM1h-574-172(SEQ ID NO：148)
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＞DOM1h-574-173(SEQ ID NO：149)
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＞DOM1h-574-174(SEQ ID NO：150)
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＞DOM1h-574-175(SEQ ID NO：151)
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＞DOM1h-574-176(SEQ ID NO：152)
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＞DOM1h-574-177(SEQ ID NO：153)
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＞DOM1h-574-178(SEQ ID NO：154)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIADTADRRYYDHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-179(SEQ ID NO：155)
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＞DOM1h-574-180(SEQ ID NO：156)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTADRTYYAHAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-4(SEQ ID NO：157)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFEYWGQGTLVTVSS
＞DOM1h-574-168(SEQ ID NO：158)
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表4：抗TNFR1dAb的核苷酸序列
＞DOM1h-509(SEQ ID NO：157)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTCAGTATAGGATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGAGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATACTAGGGGTTCGTCTACATACTACGCAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCTGTGACGATGTTTTCTCCTTTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-510(SEQ ID NO：158)
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＞DOM1h-543(SEQ ID NO：159)
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＞DOM1h-574-1(SEQ ID NO：162)
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＞DOM1h-574-2(SEQ ID NO：163)
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＞DOM1h-574-4(SEQ ID NO：164)
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＞DOM1h-574-180(SEQ ID NO：165)
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＞DOM1h-574-7(SEQ ID NO：166)
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＞DOM1h-574-8(SEQ ID NO：167)
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＞DOM1h-574-10(SEQ ID NO：169)
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＞DOM1h-574-12(SEQ ID NO：171)
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＞DOM1h-574-14(SEQ ID NO：173)
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＞DOM1h-574-15(SEQ ID NO：174)
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＞DOM1h-574-16(SEQ ID NO：175)
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＞DOM1h-574-17(SEQ ID NO：176)
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＞DOM1h-574-18(SEQ ID NO：177)
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＞DOM1h-574-19(SEQ ID NO：178)
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＞DOM1h-574-25(SEQ ID NO：179)
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＞DOM1h-574-26(SEQ ID NO：180)
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＞DOM1h-574-27(SEQ ID NO：181)
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＞DOM1h-574-28(SEQ ID NO：182)
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＞DOM1h-574-29(SEQ ID NO：183)
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＞DOM1h-574-30(SEQ ID NO：184)
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＞DOM1h-574-31(SEQ ID NO：185)
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＞DOM1h-574-32(SEQ ID NO：186)
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＞DOM1h-574-33(SEQ ID NO：187)
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＞DOM1h-574-35(SEQ ID NO：188)
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＞DOM1h-574-36(SEQ ID NO：189)
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＞DOM1h-574-37(SEQ ID NO：190)
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＞DOM1h-574-38(SEQ ID NO：191)
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＞DOM1h-574-39(SEQ ID NO：192)
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＞DOM1h-574-40(SEQ ID NO：193)
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＞DOM1h-574-53(SEQ ID NO：194)
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＞DOM1h-574-54(SEQ ID NO：195)
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＞DOM1h-574-65(SEQ ID NO：196)
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＞DOM1h-574-66(SEQ ID NO：197)
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＞DOM1h-574-67(SEQ ID NO：198)
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＞DOM1h-574-68(SEQ ID NO：199)
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＞DOM1h-574-70(SEQ ID NO：201)
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＞DOM1h-574-73(SEQ ID NO：204)
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＞DOM1h-574-74(SEQ ID NO：205)
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＞DOM1h-574-75(SEQ ID NO：206)
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＞DOM1h-574-76(SEQ ID NO：207)
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＞DOM1h-574-77(SEQ ID NO：208)
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＞DOM1h-574-78(SEQ ID NO：209)
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＞DOM1h-574-79(SEQ ID NO：210)
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＞DOM1h-574-90(SEQ ID NO：216)
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＞DOM1h-574-123(SEQ ID NO：249)
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＞DOM1h-574-124(SEQ ID NO：250)
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＞DOM1h-574-125(SEQ ID NO：251)
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＞DOM1h-574-126(SEQ ID NO：252)
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＞DOM1h-574-129(SEQ ID NO：255)
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＞DOM1h-574-131(SEQ ID NO：257)
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＞DOM1h-574-149(SEQ ID NO：274)
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＞DOM1h-574-150(SEQ ID NO：275)
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＞DOM1h-574-151(SEQ ID NO：276)
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＞DOM1h-574-152(SEQ ID NO：277)
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＞DOM1h-574-154(SEQ ID NO：279)
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＞DOM1h-574-155(SEQ ID NO：280)
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＞DOM1h-574-168(SEQ ID NO：293)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCGGATACCGGTGATCGTAGATACTACGATCACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-169(SEQ ID NO：294)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGCGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-170(SEQ ID NO：295)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-171(SEQ ID NO：296)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGATCACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-172(SEQ ID NO：297)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-173(SEQ ID NO：298)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-174(SEQ ID NO：299)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-175(SEQ ID NO：300)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-176(SEQ ID NO：301)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-177(SEQ ID NO：302)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-178(SEQ ID NO：303)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞DOM1h-574-179(SEQ ID NO：304)
GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATGACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCACCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGTTGGGAGCCTTTTGTCTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
表5：抗血清清蛋白dAb(DOM7h)融合物
(在大鼠研究中使用)：-
DOM7h-14/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7138
氨基酸序列(SEQ ID NO：305)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：306)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-14-10/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7139
氨基酸序列(SEQ ID NO：307)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：308)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-14-18/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7140
氨基酸序列(SEQ ID NO：309)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLMKPMTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：310)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTCTTATGAAGCCTATGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-14-19/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7141
氨基酸序列(SEQ ID NO：311)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQWIGSQLSWYQQKPGEAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：312)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGGAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-11/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7142
氨基酸序列(SEQ ID NO：313)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：314)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-11-12/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7147
氨基酸序列(SEQ ID NO：315)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：316)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-11-15/毒蜥肽-4融合物    DMS编号7143
氨基酸序列(SEQ ID NO：317)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
核苷酸序列(SEQ ID NO：318)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h14-10/G4SC-NCE融合物
编码DOM7h14-10/G4SC的氨基酸序列(SEQ ID NO：319)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRGGGGSC
C端半胱氨酸可连接至新的化学实体(药学化学化合物，NCE)，例如使用马来酰亚胺连接。编码DOM7h14-10/G4SC的核苷酸序列(SEQ ID NO：320)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGGTGGCGGAGGGGGTTCCTGT
DOM7h14-10/TVAAPSC融合物
氨基酸序列(SEQ ID NO：321)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRTVAAPSC
C端半胱氨酸可连接至新的化学实体(药学化学化合物，NCE)，例如使用马来酰亚胺连接。
核苷酸序列(SEQ ID NO：322)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACCGTCGCTGCTCCATCTTGT
(在小鼠研究中使用)：-
DOM7h-11/DOM1m-21-23融合物    DMS编号5515
氨基酸序列(SEQ ID NO：323)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
氨基酸加核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：324)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN
核苷酸序列(SEQ ID NO：325)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：326)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
DOM7h-11-12/DOM1m-21-23融合物    DMS编号5516
氨基酸序列(SEQ ID NO：327)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
氨基酸加核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：328)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN
核苷酸序列(SEQ ID NO：329)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：330)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
DOM7h-11-15/DOM1m-21-23融合物    DMS编号5517
氨基酸序列(SEQ ID NO：331)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
氨基酸加核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：332)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN
核苷酸序列(SEQ ID NO：333)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
核苷酸加myc标签序列(SEQ ID NO：334)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
若此表中指示带myc标签的分子，这是实施例中的PK研究中使用的型式。若给出不带myc标签的序列，实施例中的PK研究不是用带myc标签的材料进行的，即该研究是用所示不带标签的构建物进行的。
实验
实验部分中的所有编号方式依照Kabat(Kabat，E.A.National Institutes ofHealth(US)& Columbia UniVersity.Sequences of proteins of immunologicalinterst，edn 5(US Dept.Of Health and Human Services Public Health Service，National Institues of Health，Bethesda，MD，1991))。
描述DOM7h-11和DOM7h-14变体的衍生。DOM7h-14变体不是依照本发明的。
实施例1：Vk亲和力成熟
选择：
HSA(人血清清蛋白)和RSA(大鼠血清清蛋白)抗原得自Sigma(基本上没有脂肪酸，～99％(琼脂糖凝胶电泳)，冻干粉目录号分别为A3782和A6414)
使用EZ Link Sulfo-NHS-SS-生物素(Pierce，目录号21331)生成上述两种抗原的生物素化产物。通过使样品两次穿过PD10脱盐柱，接着于4℃针对1000倍过量体积的PBS透析过夜，清除游离生物素试剂。通过质谱术测试所得产物，并观察到1-2个生物素每个分子。
亲和力成熟文库：
使用DOM7h-11和DOM7h-14亲本dAb(DOM7h-11和DOM7h-14的序列参见WO2008/096158)创建了错误倾向和CDR文库二者。CDR文库是在pDOM4载体中生成的，而错误倾向文库是在pDOM33载体中生成的(以容许在有或无蛋白酶处理的情况下进行选择)。载体pDOM4AFd噬菌体载体的一种衍生物，其中基因III信号肽序列用酵母糖脂锚定表面蛋白(GAS)信号肽替换。它还含有前导序列和基因III之间的c-myc标签，使得基因III回到读框中。此前导序列在噬菌体展示载体中以及在其它原核表达载体中都能较好发挥功能，而且能普遍使用。pDOM33是pDOM4载体的一种修饰型式，其中消除了c-myc标签，使得dAb-噬菌体融合物对蛋白酶胰蛋白酶有抗性。这容许在噬菌体选择中使用胰蛋白酶以选择对蛋白酶更稳定的dAb(参见WO2008149143)。
对于错误倾向成熟文库，使用
Figure BDA0000100028380000831
II随机诱变试剂盒(随机、唯一诱变试剂盒，Stratagene)，通过PCR扩增编码要成熟的dAb的质粒DNA。产物用SalI和Not I消化，并与经过切割的噬菌体载体pDOM33一起用于连接反应。
对于CDR文库，使用含有NNK或NNS密码子的简并寡核苷酸实施PCR反应以使要亲和力成熟的dAb中的所需位置多样化。然后使用装配PCR来生成全长多样化插入物。将插入物用SalI和Not I消化，并与用于多残基诱变的pDOM4和用于单残基诱变的pDOM5一起用于连接反应。pDOM5载体是一种基于pUC119的表达载体，其中蛋白质表达由LacZ启动子驱动。GAS1前导序列(参见WO 2005/093074)确保分离的可溶性dAb分泌入大肠杆菌的周质和培养物上清液中。在此载体中SalI/NotI克隆dAb，在dAb的C末端附加myc标签。使用SalI和Not I的此方案导致在N末端包括ST氨基酸序列。
然后通过电穿孔使用通过任一方法生成的连接体系来转化大肠杆菌菌株TB1，并将经过转化的细胞在含有15μg/ml四环素的2xTY琼脂上涂板，产生＞5×107个克隆的库容量。
错误倾向文库具有下述平均突变率和容量：DOM7h-11(2.5处突变每个dAb)，容量：6.1x 108，DOM7h-14(2.9处突变每个dAb)，容量：5.4x 108。
每个CDR文库具有四处氨基酸多样性。生成了CDR 1和3的各两个文库，和CDR2的一个文库。每个文库内多样化的位置如下(基于VK虚拟DPK9序列的氨基酸)：
Figure BDA0000100028380000832
Figure BDA0000100028380000841
实施例2：选择策略
采用三种噬菌体选择策略来进行VκAlbudAbTM(抗血清清蛋白dAb)亲和力成熟：
1)只针对HSA的选择：
进行了三轮针对HSA的选择。选择错误倾向文库和每个CDR文库作为所有轮次中的个体集合。第一轮选择针对以1mg/ml被动包被到免疫管上的HSA实施。第2轮针对100nM HSA实，而第3轮针对10nM(CDR选择)或20或100nM(错误倾向选择)HSA，二者均为可溶性选择，接着是错误倾向文库针对1.5nM HSA的第四轮选择，是可溶性选择。用0.1M甘氨酸pH 2.0洗脱错误倾向文库，之后用1M Tris pH 8.0中和，而用1mg/ml胰蛋白酶洗脱CDR文库，之后感染入对数期TG1细胞中。将每种选择的第三轮亚克隆入pDOM5中进行筛选。可溶性选择使用生物素化HSA。
2)针对HSA的胰蛋白酶选择：
为了选择具有与亲本克隆相比升高的蛋白酶抗性和潜在改良生物物理学特性的dAb，在噬菌体选择中使用胰蛋白酶(参见WO2008149143)。针对HSA实施了四轮选择。错误倾向文库的第一轮选择针对以1mg/ml被动包被的HSA在无胰蛋白酶的情况下实施；第二轮针对以1mg/ml被动包被的HSA，有20μg/ml胰蛋白酶，37℃，1小时；第三轮选择通过可溶性选择使用生物素化HSA针对100nM HSA在有20μg/ml或100μg/ml胰蛋白酶的情况下于37℃实施1小时。最后一轮选择通过可溶性选择使用生物素化HSA针对100nM HSA在有100μg/ml胰蛋白酶的情况下于37℃实施过夜。
3)针对HSA(第1轮)和RSA(第2-4轮)的交叉选择：
第一轮选择针对1mg/ml被动包被的HSA或1μM HSA(可溶性选择)进行，接着是下面三轮针对生物素化RSA的可溶性选择，浓度为第1轮1μM、第2轮100nm、和第3轮20nM、10nM或1nM。
筛选策略和亲和力测定：
在每种情况中，在选择后，使用QIAfilter midiprep试剂盒(Qiagen)制备来自适宜轮次选择的噬菌体DNA集合，使用限制酶SalI和NotI消化DNA，并将富集的V基因连接入pDOM5的相应位点中，pDOM5是表达带myc标签的dAb的可溶性表达载体(参见PCT/EP2008/067789)。使用经过连接的DNA来电转化大肠杆菌HB 2151细胞，然后在含有抗生素羧苄青霉素的琼脂板上培养过夜。多所得菌落个别评估抗原结合。在每种情况中，通过BIAcoreTM(表面等离振子共振)对至少96个克隆测试对HSA、CSA(猕猴血清清蛋白)、MSA(小鼠血清清蛋白)和RSA的结合。MSA抗原得自Sigma(基本上没有脂肪酸，～99％(琼脂糖凝胶电泳)，冻干粉目录号A3559)，并使用prometic蓝树脂(Amersham)自猕猴血清清蛋白纯化CSA。在96孔板中在ONEX培养基(Novagen)中在细菌培养中于37℃生产可溶性dAb片段过夜。将含有可溶性dAb的培养物上清液离心，并通过BIAcore分析对高密度HSA、CSA、MSA和RSA CM5芯片的结合。通过解离速率筛选发现克隆结合所有这些物种的血清清蛋白。对克隆测序，揭示了唯一的dAb序列。
所选克隆对亲本的最低同一性(在氨基酸水平)是97.2％(DOM7h-11-3：97.2％，DOM7h-11-12：98.2％，DOM7h11-15：96.3％，DOM7h-11-18：98.2％，DOM7h-11-19：97.2％)
所选克隆对亲本的最低同一性(在氨基酸水平)是96.3％(DOM7h-14-10：96.3％，DOM7h-14-18：96.3％，DOM7h-14-19：98.2％，DOM7h-14-28：99.1％，DOM7h-14-36：97.2％)
在2.5L摇瓶中在Onex培养基中作为细菌上清液于30℃以250rpm表达唯一dAb 48小时。通过吸收至蛋白L琼脂糖，接着用10mM甘氨酸pH2.0洗脱，自培养液纯化dAb。使用纯化的蛋白质在3个浓度1μM、500nM和50nM通过BIAcore确认了对HSA、CSA、MSA和RSA的结合。为了测定AlbudAb对每种血清清蛋白的结合亲和力(KD)，通过BIAcore在5000nM至39nM的清蛋白浓度范围(5000nM，2500nM，1250nM，625nM，312nM，156nM，78nM，39nM)上分析了纯化的dAb。
表6
Figure BDA0000100028380000851
Figure BDA0000100028380000861
Figure BDA0000100028380000871
Figure BDA0000100028380000881
*：括号中的数值来自第二项独立的SPR实验。
所有DOM7h-14衍生的变体对小鼠、大鼠、人和猕猴血清清蛋白有交叉反应性。DOM7h-14-10具有与亲本相比改良的对大鼠、猕猴和人血清清蛋白的亲和力。DOM7h-14-28具有改良的对RSA的亲和力。DOM7h-14-36具有改良的对RSA、CSA和MSA的亲和力。
DOM7h-11-3具有改良的对CSA和HSA的亲和力。DOM7h-11-12具有改良的对RSA、MSA和HSA的亲和力。DOM7h-11-15具有改良的对RSA、MSA、CSA和HSA的亲和力。DOM7h-11-18和DOM7h-11-19具有改良的对RSA、MSA和HSA的亲和力。
实施例3：关键DOM7h-11谱系克隆的起源
DOM7h-11-3：来自使用CDR2文库(Y49，A50，A51，S53)针对HSA实施的亲和力成熟，10nM HSA的第3轮输出
DOM7h-11-12：来自使用错误倾向文库针对HSA实施的亲和力成熟，有100ug/ml胰蛋白酶的第3轮输出(100nM，HSA)。
DOM7h-11-15：来自使用CDR2文库(Y49，A50，A51，S53)针对HSA作为第1轮，接着另外3轮选择针对RSA实施的交叉选择，1nM RSA的第3轮选择。
DOM7h-11-18：来自使用错误倾向文库针对HSA作为第1轮，接着另外3轮选择针对RSA实施的交叉选择，20nM RSA的第3轮输出
DOM7h-11-19：来自使用错误倾向文库针对HSA作为第1轮，接着另外3轮选择针对RSA实施的交叉选择，5nM RSA的第3轮输出
表7：CDR序列(依照Kabat；ref.如上文)
Figure BDA0000100028380000882
Figure BDA0000100028380000891
实施例4：关键DOM7h-14谱系克隆的起源
DOM7h-14-19：来自使用错误倾向文库针对HSA实施的亲和力成熟，有100ug/ml胰蛋白酶的第3轮输出(100nM，HSA)。
DOM7h-14-10，DOM7h-14-18，DOM7h-14-28，DOM7h-14-36：来自使用CDR3文库(Y92，Y93，T94，N96)针对HSA实施的亲和力成熟，第3轮输出。
表8：CDR序列(依照Kabat；ref.如上文)
Figure BDA0000100028380000901
实施例5：表达和生物物理表征
在Onex培养基中于30℃以250rpm培养48小时后，测定了在2.5L摇瓶中的常规细菌表达水平。通过SEC MALLS和DSC测定了生物物理特征。
SEC MALLS(大小排阻层析及多角度激光散射)是一种用于表征溶液中的高分子的非侵入性技术。简言之，通过大小排阻层析(柱：来自TOSOHBiosciences的TSK3000；来自Pharmacia的S200)将蛋白质(在缓冲液Dulbecco氏PBS中浓度为1mg/mL)以0.5ml/min依照它们的流体动力学特性分开。分开后，使用多角度激光散射(MALLS)检测仪测量蛋白质散射光的特性。作为角度的函数，测量蛋白质穿过检测仪时散射光的强度。此测量与使用折光率(RI)检测仪测定的蛋白质浓度一起容许使用适宜方程计算摩尔质量(分析软件Astra v.5.3.4.12的组成部分)。
DSC(差示扫描量热法)：简言之，以恒定速率180℃/hr加热蛋白质(在PBS中1mg/mL)，并测量与热变性有关的可检测热变化。确定跃迁中点(appTm)，其描述为50％的蛋白质处于其天然构象而另50％变性的温度。在此，DSC测定表观跃迁中点(appTm)，因为大多数检查的蛋白质没有完全重折叠。Tm越高，则分子越稳定。通过非2态方程分析解折叠曲线。使用的软件包是OriginRv7.0383。
表9
Figure BDA0000100028380000902
Figure BDA0000100028380000911
*在另一项试验中，通过SEC MALLS主要看到单体，尽管低于95％
我们观察到表9中所有克隆在大肠杆菌中的表达水平在15至119mg/L的范围中。
对于DOM7h-14和DOM7h-11变体，有利的生物物理参数(通过SECMALLS测定的溶液中的单体和通过DSC测定的＞55℃的表观Tm)和表达水平在亲和力成熟期间得到维持。单体状态是有利的，因为它避免二聚化和可使靶物诸如细胞表面受体交联的产物的风险。
实施例6：大鼠、小鼠和猕猴中的血清半衰期的测定
将AlbudAb DOM7h-14-10、DOM7h-14-18、DOM7h-14-19、DOM7h-11、DOM7h11-12和DOM7h-11-15克隆入pDOM5载体中。对于每种AlbudAbTM，在大肠杆菌中表达20-50mg数量，并使用L亲和树脂自细菌培养物上清液纯化并用100mM甘氨酸pH2洗脱。将蛋白质浓缩至大于1mg/ml，缓冲液交换入PBS并使用Q旋转柱(Vivascience)消减内毒素。对于大鼠药动学(PK)分析，作为单次静脉内注射以2.5mg/kg给药AlbudAb，每种化合物使用3只大鼠。于0.16、1、4、12、24、48、72、120、168小时采集血清样品。通过抗myc ELISA按照下文所述方法分析血清水平。
对于小鼠PK，作为单次静脉内注射以2.5mg/kg给药DOM7h-11、DOM7h11-12和DOM7h-11-15，每组3个受试者，并于10分钟、1小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时采集血清样品。通过抗myc ELISA按照下文所述方法分析血清水平。
对于猕猴PK，作为单次静脉内注射以2.5mg/kg给药DOM7h-14-10和DOM7h-11-15，每组3只雌性猕猴，并于0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96、144、192、288、336、504小时采集血清样品。通过抗myc ELISA按照下文所述方法分析血清水平。
抗myc ELISA方法
通过抗myc ELISA来测量血清中的AlbudAb浓度。简言之，将山羊抗myc多克隆抗体(1：500；Abcam，目录号ab9132)包被到Nunc 96孔Maxisorp板上过夜，并用5％BSA/PBS+1％Tween封闭。在已知浓度的标准品旁边以一系列稀释度添加血清样品。然后使用家兔多克隆抗Vk(1：1000；内部试剂，合并血液并在使用前用蛋白A纯化)，接着用抗家兔IgG HRP抗体(1∶10,000；Sigma，目录号A2074)检测结合的带myc标签的AlbudAb。在测定法的每个阶段之间用3x PBS+0.1％Tween20，接着用3x PBS清洗板。在最后一次清洗后添加TMB(SureBlue TMB一成分微孔过氧化物酶底物，KPL，目录号52-00-00)，并容许显色。这用1M HCl来终止，然后使用450nm处的吸光度来测量信号。
根据原始ELISA数据，考虑到稀释因子，通过针对标准曲线的内插来建立未知样品的浓度。自重复数值确定来自每个时间点的均值浓度结果，并输入WinNonLin分析包(例如5.1版(可得自Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA)。使用非隔室模型拟合数据，其中由软件评估PK参数来给出终末半衰期。选择反映每种PK概况的终末期的给药信息和时间点。
表10：单一AlbudAb TM  PK
Figure BDA0000100028380000931
*历史数据
使用非隔室模型拟合自大鼠、小鼠和猕猴研究推导的药动学参数。索引：AUC：在剂量给药时间外推至无穷的曲线下面积；CL：清除；t1/2：为血液浓度减半时的时间；Vz：基于终末期的分布容量。
DOM7h-11-12和DOM7h-11-15在大鼠和小鼠中具有与亲本相比改良的AUC和t1/2。DOM7h-11-15在猕猴中也具有与亲本相比改良的AUC和t1/2。AUC/t1/2的这种改良与改良的对血清清蛋白的体外KD有关。
实施例7：AlbudAb TM  IFN融合物
克隆和表达
与单一AlbudAb一样，将亲和力成熟的Vk Albudab连接至干扰素α2b(IFNα2b)以确定AlbudAb的有用PK作为融合蛋白得到维持。
干扰素α2b氨基酸序列：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKED SILAVRKYF QRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO：374)
干扰素α2b核苷酸序列：
TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA(SEQ ID NO：375)
经TVAAPS接头区(参见WO2007085814)将IFNa2b连接至AlbudAb。通过SOE-PCR(依照Horton et al.Gene，77，p61(1989)的方法的单一交叠延长)来克隆构建物。AlbudAb和IFN序列的PCR扩增使用在TVAAPS接头区处有约15碱基对交叠的引物分开进行。使用的引物如下：-
                  GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG
IFNα2b SOE片段5′
                  (SEQ ID NO：376)
                   GGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTC
IFNα2b SOE片段3′
                  (SEQ ID NO：377)
                  GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC
Vk SOE片段5′
                 (SEQ ID NO：378)
                  GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC
Vk SOE片段3’，
                  TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT
还引入myc标签
                  TTGATTTCCACCTTGGTCCC(SEQ ID NO：379)
片段分开纯化，并随后只使用侧翼引物在SOE(单一交叠延长PCR延长)反应中装配。
                   GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG
IFNα2b SOE片段5′
                   (SEQ ID NO：380)
                   GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC
Vk SOE片段3’，
                   TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT
还引入myc标签
                   TTGATTTCCACCTTGGTCCC(SEQ ID NO：381)
使用限制酶BamHI和HindIII消化装配好的PCR产物，并将基因连接入pDOM50中的相应位点中，pDOM50是一种哺乳动物表达载体，是一种pTT5衍生物，具有N端V-J2-C小鼠IgG分泌前导序列以便于表达入细胞培养液中。
前导序列(氨基酸)：
METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：382)
前导序列(核苷酸)：
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC(SEQ ID NO：383)
使用QIAfilter megaprep(Qiagen)制备质粒DNA。用293-Fectin将1μgDNA/ml转染入HEK293E细胞中，并在无血清培养基中培养。蛋白质在培养中表达5天，并使用蛋白L亲和树脂自培养物上清液纯化并用100mM甘氨酸pH2洗脱。将蛋白质浓缩至大于1mg/ml，缓冲液交换入PBS中，并使用Q旋转柱(Vivascience)消减内毒素。
表11：有和无myc标签的干扰素α2b-AlbudAb序列(作为氨基酸和核苷酸 序列)
在下述融合物中，干扰素α2b位于AlbudAb的N端。
Figure BDA0000100028380000951
Figure BDA0000100028380000961
Figure BDA0000100028380000971
Figure BDA0000100028380000981
Figure BDA0000100028380000991
Figure BDA0000100028380001021
Figure BDA0000100028380001031
Figure BDA0000100028380001041
Figure BDA0000100028380001051
Figure BDA0000100028380001061
Figure BDA0000100028380001081
以粗体突显的氨基酸和核苷酸序列代表克隆位点和MYC标签。*代表基因末端处的终止密码子。
亲和力测定和生物物理表征：
为了测定AlbudAb-IFNα2b融合蛋白对每种血清清蛋白的结合亲和力(KD)，使用HBS-EP BIAcore缓冲液中5000nM至39nM(5000nM，2500nM，1250nM，625nM，312nM，156nM，78nM，39nM)的融合蛋白浓度，通过BIAcore在清蛋白(通过伯胺偶联固定化到CM5芯片上；BIAcore)上分析了纯化的融合蛋白。
表12：对SA的亲和力
 AlbudAb   融合物   对SA的亲和力(nM)   Kd   Ka
  大鼠
  DOM7h-14   IFNα2b   350   4.500E-02   1.28E+05
  DOM7h-14-10   IFNα2b   16   4.970E-03   5.90E+05
  DOM 7h-14-18   IFNα2b   780   2.127E-01   5.80E+05
  DOM 7h-14-19   IFNα2b   1900   1.206E-01   7.96E+04
  DOM 7h-11   IFNα2b   6000   7.500E-01   nd
  DOM 7h-11-12   IFNα2b   1700   3.100E-01   1.30E+05
  DOM 7h-11-15   IFNα2b   200   1.660E-02   1.50E+05
  猕猴
  DOM 7h-14   IFNα2b   60   1.32E-02   5.0E+05
  DOM 7h-14-10   IFNα2b   19   7.05E-03   4.50E+05
  DOM 7h-14-18   IFNα2b   无结合   无结合   无结合
  DOM 7h-14-19   IFNα2b   520   8.47E-02   2.73E+05
  DOM 7h-11   IFNα2b   3300   3.59E-01   1.20E+05
  DOM 7h-11-12   IFNα2b   630   3.45E-01   7.00E+05
  DOM 7h-11-15   IFNα2b   15   4.86E-03   3.60E+05
  小鼠
  DOM 7h-14   IFNα2b   240   3.21E-02   1.50E+06
  DOM 7h-14-10   IFNα2b   60   3.45E-02   6.86E+05
  DOM 7h-14-18   IFNα2b   180   1.50E-01   9.84E+05
  DOM 7h-14-19   IFNα2b   490   4.03E-02   1.19E+05
  DOM 7h-11   IFNα2b   6000   1.55E-01   nd
  DOM 7h-11-12   IFNα2b   150   9.49E-02   6.30E+05
  DOM 7h-11-15   IFNα2b   28   6.69E-03   2.80E+05
  人
  DOM 7h-14   IFNα2b   244   2.21E-02   9.89E+04
  DOM 7h-14-10   IFNα2b   32   6.58E-03   3.48E+05
  DOM 7h-14-18   IFNα2b   470   2.75E-01   6.15E+05
  DOM 7h-14-19   IFNα2b   350   4.19E-02   1.55E+05
  DOM 7h-11   IFNα2b   670   2.02E-01   7.00E+05
  DOM 7h-11-12   IFNα2b   500   1.66E-01   3.90E+05
  DOM 7h-11-15   IFNα2b   10   1.87E-03   3.50E+05
当IFNα2b连接至AlbudAb变体时，在所有情况中，AlbudAb结合血清清蛋白的亲和力降低。DOM7h-14-10和DOM7-11-15在物种间保留与亲本相比改良的对血清清蛋白的结合亲和力。DOM7h-11-12也显示在物种间与亲本相比改良的对血清清蛋白的结合亲和力。
表13：生物物理表征
如上文关于单一AlbudAb所述，通过SEC MALLS和DSC进行生物物理表征。
Figure BDA0000100028380001101
M/D指示通过SEC MALLS测定的单体/二聚体平衡
我们观察到表13中的所有克隆在HEK293中的表达在17.5至54mg/L的范围中。
对于IFNα2b-DOM7h-14和IFNα2b-DOM7h-11变体，有利的生物物理参数和表达水平在亲和力成熟期间得到维持。
AlbudAb-IFNα2b融合物的PK测定
在HEK293细胞中以20-50mg数量表达带myc标签的AlbudAb IFNα2b融合物DMS7321(IFNα2b-DOM7h-14)、DMS7322(IFNα2b-DOM7h-14-10)、DMS7323(IFNα2b-DOM7h-14-18)、DMS7324(IFNα2b-DOM7h-14-19)、DMS7325(IFNα2b-DOM7h-11)、DMS7326(IFNα2b-DOM7h-11-12)、DMS7327(IFNα2b-DOM7h-11-15)，并使用蛋白L亲和树脂自培养物上清液纯化并用100mM甘氨酸pH2洗脱。将蛋白质浓缩至大于1mg/ml，缓冲液交换入Dulbecco氏PB S中，并使用Q旋转柱(Vivascience)消减内毒素。
对于大鼠PK，作为单次静脉内注射以2.0mg/kg给药IFN-AlbudAb，使用3只大鼠每种化合物。于0.16、1、4、8、24、48、72、120、168小时采集血清样品。通过EASY ELISA依照制造商的指令(GE Healthcare，目录号RPN5960)分析血清水平。
对于小鼠PK，作为单次静脉内注射以2.0mg/kg给药都带myc标签的DMS7322(IFN2b-DOM7h-14-10)、DMS7325(IFN2b-DOM7h-11)、DMS7326(IFN2b-DOM7h-11-12)、DMS7327(IFN2b-DOM7h-11-15)，每组3个受试者，并于10分钟、1小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时采集血清样品。通过EASY ELISA依照制造商的指令(GE Healthcare，目录号RPN5960)分析血清水平。
表14：
Figure BDA0000100028380001111
使用非隔室模型拟合自大鼠和小鼠研究推导的药动学参数。索引：AUC：在剂量给药时间外推至无穷的曲线下面积；CL：清除；t1/2：为血液浓度减半时的时间；Vz：基于终末期的分布容量。
在大鼠和小鼠中测试了IFNα2b-AlbudAb。对于所有IFNα2b-DOM7h-11变体融合蛋白，在大鼠和小鼠二者中，t1/2与亲本相比得到改良。t1/2的改良与改良的对血清清蛋白的体外KD有关。对于IFNα2b-DOM7h-14-10变体，对血清清蛋白的体外KD的改良至还与大鼠中的t1/2的改良有关。
所有IFNα2b-AlbudAb融合蛋白展现出与单一AlbudAb相比对RSA的结合降低5至10倍。这种效果，DOM7h-14系列(即10倍)比DOM7h-11系列(只降低5倍)要更显著。
实施例8：其它与蛋白质、肽和NCE融合的AlbudAb融合物
测试了融合至其它化学实体即域抗体(dAb)、肽和NCE的各种AlbudAb。结果显示于表15。
表15：
Figure BDA0000100028380001122
Figure BDA0000100028380001131
索引：DOM1m-21-23是一种抗TNFR1dAb，毒蜥肽-4是一种长39个氨基酸的肽(GLP-1激动剂)。NCE，NCE-GGGGSC和NCE-TVAAPSC描述于下文。
先前，我们描述了使用与清蛋白结合dAb(AlbudAb)的遗传融合物来延长抗TNFR1dAb的体内PK半衰期(参见例如WO04003019，WO2006038027，WO2008149148)。参考这些PCT申请中的方案。在上表中，DOM1m-21-23是一种抗小鼠TNFR1dAb。
为了生成毒蜥肽-4的或与结合血清清蛋白的DOM7h-14(或其它AlbudAb)的遗传融合物，将毒蜥肽-4-接头-AlbudAb序列克隆入pTT-5载体(可得自CNRC，Canada)中。在每种情况中，毒蜥肽-4位于构建物的5’末端，而dAb位于3’末端。接头是(G4S)3接头。使用碱裂解(使用无内毒素质粒Giga试剂盒，可得自Qiagen CA)制备大肠杆菌中的无内毒素的DNA，并用于转染HEK293E细胞(可得自CNRC，Canada)。转染是使用每个烧瓶333ul 293fectin(Invotrogen)和250ug DNA，以1.75x106个细胞/ml进入250ml/烧瓶的HEK293E细胞，并于30℃表达5天。通过离心来收获上清液，并通过蛋白L上的亲和层析来纯化。将蛋白质分批结合至树脂，在柱上填充，并用10个柱体积的PBS洗脱。将蛋白质用50ml 0.1M甘氨酸pH2洗脱，并用Tris pH8中和。在SDS-PAGE凝胶上鉴定出预期大小的蛋白质。
NCE AlbudAb融合物：
测试了一种新化学实体(NCE)AlbudAb融合物。NCE，一种小分子ADAMTS-4抑制剂用PEG接头(PEG 4接头(即马来酰亚胺前面有4个PEG分子)和马来酰亚胺基团合成来偶联至AlbudAb。NCE对AlbudAb的偶联经氨基酸位置R108C处工程化改造的胱氨酸残基残基，或者在AlbudAb末端处工程化改造的5个氨基酸(GGGGSC)或6个氨基酸(TVAAPSC)间隔物后面。简言之，将AlbudAb用TCEP(Pierce，目录号77720)还原，使用PD 10柱(GE healthcare)脱盐入25mM Bis-Tris、5mM EDTA、10％(v/v)甘油pH6.5中。添加5倍摩尔过量的马来酰亚胺活化的NCE(在DMSO中)，不超过10％(V/V)终浓度。将反应于室温温育过夜，并广泛透析入20mM Tris pH7.4中。
PEG接头：
Figure BDA0000100028380001141
序列：
DOM7h-14R108C：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKC(SEQ ID NO：412)
核苷酸：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAATGC(SEQ IDNO：413)
DOM7h-14-10/TVAAPSC和DOM7h-14-10/GGGGSC(即DOM7h-14-10/G4SC)的序列见表5。
当融合至化学模块时，NCE-AlbudAb DOM7h-14-10GGGGSC和DOM7h14-10TVAAPSC展现出对RSA的体外亲和力(KD)降低5至10倍，如通过BIAcore测定的。目前尚未得到这些分子的PK数据。
dAb-Albudab融合物：当融合至治疗性域抗体(DOM1m-21-23)时，与未融合的AlbudAb相比，2种具有最高的对RSA的亲和力的DOM7h-11AlbudAb在BIAcore上经历对RSA的亲和力降低2倍。DOM7h-11克隆在融合时(2.8uM)以及在未融合时(约5uM)显示出微摩尔KD。
毒蜥肽4-AlbudAb融合物：AlbudAb融合至肽对结合RSA的能力的影响为约10倍，DOM7h-14-10除外，它只显示结合降低4倍。然而，该影响，DOM7h-14系列(除DOM7h-14-10以外)比DOM7h-11系列看来要更显著。
对于所有上述数据，所述融合物的T1/2随对物种SA的亲和力改良而延长。
当AlbudAb-药物融合物对血清清蛋白结合显示0.1nM至10mM的亲和力范围(KD)时，我们一般将AlbudAb治疗剂归为治疗上适合的(对于疾病、状况或适应证的治疗和/或预防)。
我们将AlbudAb和AlbudAb融合物(蛋白质-AlbudAb，例如IFNa2b-DOM7h-14-10；肽-AlbudAb，例如毒蜥肽-4-DOM7h-14-10；dAb-AlbudAb，例如DOM1m21-23-DOM7h11-15；NCE-AlbudAb，例如ADAMTS-4-DOM7h-14-10)的治疗范围定义如下：显示了可用于治疗慢性或急性状况、疾病或适应证的亲和力(KD)范围。还显示了标示为“中等”的亲和力范围。在此范围中的AlbudAb和融合物可用于慢性或急性疾病、状况或适应证。这样，能依照要解决的疾病、状况或适应证来剪裁或选择AlbudAb或融合物对血清清蛋白的亲和力。如上所述，本发明提供具有如下亲和力的AlbudAb，所述亲和力容许每种AlbudAb归类为“高亲和力”、“中等亲和力”或“低亲和力”，如此使得技术人员能够依照手边的疗法来选择适宜的本发明AlbudAb。见图2。
实施例9：DOM7h-11-15 S12P 序列
DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：414)
本发明的一个方面提供包含DOM7h-11-15S12P的核苷酸序列或与所述选定序列至少80％相同的核苷酸序列的核酸。DOM7h-11-15S12P是使用下述核酸序列生成的(标有下划线的C表示导致位置12处脯氨酸的变化(相对于编码DOM7h-11-15的核酸))：-
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO：415)
DOM7h-11-15S12P是通过在PCR中使用DOM7h-11-15作为模板，使用引物来引入S12P突变而构建的。引物序列是：-
GCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGG(SEQ ID NO：416)。
本发明的一个备选方案提供包含SEQ ID NO：415的核苷酸序列或与所述选定序列至少80％相同的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，DOM7h-11-15S12P是由如下载体编码和自如下载体表达的，所述载体含有接头区和编码蛋白质或肽药物或单一可变域或其它抗体片段的C端序列以生成串联蛋白融合产物。在一个实施方案中，所述接头包含氨基酸序列TVA，例如TVAAPS。本发明的其它方面有包含所述核酸的载体；和包含所述载体的分离的宿主细胞。本发明还提供在患者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括将至少一剂DOM7h-11-15S12P施用于所述患者。

Claims (28)

1.DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体(DOM7h-11如图1所示)，其中所述变体与DOM7h-11相比包含FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有2至8处变化。
2.权利要求1的变体，其中位置49(依照Kabat)是Leu。
3.权利要求1或2的变体，其中位置50(依照Kabat)是Ala或Trp。
4.权利要求1、2或3的变体，其中位置51(依照Kabat)是Phe或Asn。
5.权利要求1的变体，其中所述变体包含与选自DOM7h-11-3(SEQ ID NO：5)、DOM7h-11-15(SEQ ID NO：2)、DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)和DOM7h-11-19(SEQ ID NO：4)的单一可变域的氨基酸序列相同或与所选的氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，前提是所述变体的氨基酸序列具有FW2/CDR2接点中的至少一处突变，所述突变如权利要求1至4任一项限定的。
6.权利要求1的变体，其中所述变体包含与DOM7h-11-15S12P(SEQ ID NO：414)的氨基酸序列相同或与DOM7h-11-15S12P的氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，前提是所述变体的氨基酸序列具有FW2/CDR2接点中的至少一处突变，所述突变如权利要求1至4任一项中限定的。
7.DOM7h-11的抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与DOM7h-11(如图1所示)相比包含位置32(编号方式依照Kabat)处的Met，且其中所述变体与DOM7h-11的氨基酸序列相比具有0至4处别的变化。
8.权利要求7的变体，其中所述变体与DOM7h-11(如图1所示)相比包含FW2/CDR2接点(位置49至51，编号方式依照Kabat)中的至少一处突变。
9.权利要求7的变体，其中所述变体与DOM7h-11(如图1所示)相比包含至少一处突变，所述突变选自下述
位置49＝L，
位置50＝A或W，
位置51＝F或N，
位置87＝H，和
位置91＝T。
10.权利要求7的变体，其中所述变体包含与选自DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)、DOM7h-11-15(SEQ ID NO：2)、DOM7h-11-18(SEQ ID NO：3)和DOM7h-11-19(SEQ ID NO：4)的单一可变域的氨基酸序列相同或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的Met。
11.权利要求7的变体，其中所述变体包含与DOM7h-11-15S12P(SEQ ID NO：414)的氨基酸序列相同或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，前提是所述变体的氨基酸序列具有位置32处的Met。
12.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约0.1至约10000nM、任选约1至约6000nM的解离常数(KD)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
13.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约1.5x 10-4至约0.1sec-1、任选约3x 10-4至约0.1sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
14.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约2x 106至约1x 104M-1sec-1、任选约1x 106至约2x 104M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合人SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
15.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约0.1至约10000nM、任选约1至约6000nM的解离常数(KD)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
16.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约1.5x 10-4至约0.1sec-1、任选约3x 10-4至约0.1sec-1的解离速率常数(Kd)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
17.前述权利要求任一项的变体，其中所述变体包含以约2x 106至约1x 104M-1sec-1、任选约1x 106至约5x 103M-1sec-1的结合速率常数(Ka)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
18.一种多特异性配体，其包含前述权利要求任一项的抗SA变体和特异性结合SA以外的靶抗原的结合模块。
19.权利要求1至17任一项的抗SA变体单一可变域，其中所述可变域偶联至药物(任选NCE药物)，任选其中所选变体是DOM7h-11-15(SEQ ID NO：2)、DOM7h-11-15S12P(SEQ ID NO：414)或DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)。
20.一种融合蛋白，包含与依照权利要求1至17任一项的变体融合的多肽或肽药物，任选其中所选变体是DOM7h-11-15(SEQ ID NO：2)、DOM7h-11-15S12P(SEQ ID NO：414)或DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)。
21.依照权利要求20的融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述变体和所述药物之间包含接头(例如含氨基酸序列TVA的接头，任选TVAAPS)。
22.一种组合物，其包含前述权利要求任一项的变体、融合蛋白或配体和药学可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介。
23.一种核酸，其包含编码依照权利要求1至17任一项的变体或权利要求18的多特异性配体或权利要求20或21的融合蛋白的核苷酸序列。
24.一种核酸，其包含选自DOM7h-11-3(SEQ ID NO：5)、DOM7h-11-15(SEQID NO：2)、DOM7h-11-12(SEQ ID NO：1)、DOM7h-11-18(SEQ ID NO：3)和DOM7h-11-19(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列的DOM7h-11变体核苷酸序列或与所述选定序列至少80％相同的核苷酸序列。
25.一种核酸，其包含DOM7h-11-15S12P(SEQ ID NO：414)的核苷酸序列或与所述选定序列至少80％相同的核苷酸序列。
26.一种载体，其包含权利要求23、24或25的核酸。
27.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求26的载体。
28.一种在患者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括将至少一剂依照权利要求1至22任一项的变体施用于所述患者。
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