BRPI1013341B1 - Variantes de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro, ligante multiespecífico e composição que compreendem as ditas variantes, bem como ácidos nucleicos e vetor - Google Patents

Variantes de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro, ligante multiespecífico e composição que compreendem as ditas variantes, bem como ácidos nucleicos e vetor Download PDF

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Abstract

variantes de ligação à anti-albumina de soro aperfeiçoadas a invenção se refere a variantes aperfeiçoadas do domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro dom7h-11, assim como ligantes e conjugados de fármacos que compreendem tais variantes, composições, ácidos nucleicos, vetores e hospedeiros

Description

[001]A invenção se refere a variantes aperfeiçoadas do domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro DOM7h-11, assim como ligantes e fármacos conjugados que compreendem tais variantes, composições, ácidos nucleicos, vetores e hospedeiros.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002]Os documentos WO 04003019 e WO 2008/096158 divulgam grupos li- gantes anti-albumina de soro (SA), tais como domínios variáveis únicos de imunoglo- bulina (dAbs) anti-SA, que têm meias-vidas terapeuticamente úteis. Estes documentos divulgam dAbs anti-SA monoméricos, assim como ligantes multiespecíficos que compreendem tais dAbs, por exemplo, ligantes que compreendem um dAb anti-SA e um dAb que se liga especificamente a um antígeno alvo, tal como TNFR1. Grupos ligantes são divulgados, as quais se ligam especificamente a albuminas de soro de mais do que uma espécie, por exemplo, dAbs anti-SA de reatividade cruzada de ser humano/camundongo.
[003]Os documentos WO 05118642 e WO 2006/059106 divulgam o conceito de conjugar ou associar um grupo ligante anti-SA, tal como um domínio variável único de imunoglobulina anti-SA, a um fármaco, de modo a aumentar a meia-vida do fár- maco. Proteínas, peptídeos e fármacos NCE (nova entidade química) são divulgados e exemplificados. O documento WO 2006/059106 divulga o uso deste conceito para aumentar a meia-vida de agentes insulinotrópicos, por exemplo, hormônios incretina, tais como peptídeo similar a glucágon (GLP)-1.
[004]Referência também é feita a Holt et al, “Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs”, Protein Engineering, Design & Selection, vol. 21, No 5, páginas 283 - 288, 2008.
[005]O documento WO 2008/096158 divulga DOM7h-11, que é um dAb antiSA satisfatório. Seria desejável fornecer dAbs aperfeiçoados que são variantes de DOM7h-11 e que se ligam especificamente à albumina de soro, preferivelmente, albuminas de espécie humana e não humana, que forneceriam utilidade em modelos animais de doenças, assim como para terapia e/ou diagnóstico em seres humanos. Também seria desejável permitir a escolha entre grupos ligantes (dAbs) anti-SA de afinidade relativamente moderada e alta. Tais grupos podem ser ligados a fármacos, elegendo-se o grupo ligante anti-SA, de acordo com a aplicação final considerada. Isto permitiria a adaptação satisfatória do fármaco para tratar e/ou prevenir indicações crônicas ou agudas, dependendo da escolha do grupo ligante anti-SA. Também seria desejável fornecer anti-dAbs, que são substanciais ou completamente monoméricos em solução. Isto seria especialmente vantajoso quando o dAb anti-SA é ligado a um grupo ligante, por exemplo, um dAb, que se liga especificamente a um receptor de superfície celular, tal como TNFR1, com o objetivo de antagonizar o receptor. O estado monomérico do dAb anti-SA é útil para reduzir a possibilidade de ligação cruzada do receptor, visto que é menos provável que se formem multímeros que podem se ligar e produzir ligação cruzada dos receptores (por exemplo, TNFR1) na superfície celular, aumentando assim a probabilidade de agonismo do receptor e sinalização prejudicial do receptor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006]Os aspectos da presente invenção resolvem estes problemas.
[007]Com esta finalidade, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que aos mutações benéficas podem ser alvejadas na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat) de DOM7h-11.
[008]Portanto, em um aspecto, a invenção fornece uma variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) de DOM7h-11, em que a variante compreende pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h-11, e em que a variante tem de 2 a 8 modificações em comparação à sequência de aminoácidos de DOM7h-11.
[009]Em um aspecto, a invenção fornece uma variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) de DOM7h-11, em que a variante compreende uma Met na posição 32 (numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h-11, e em que a variante tem de 0 a 4 modificações adicionais em comparação à sequência de aminoácidos de DOM7h-11.
[0010]Modalidades de qualquer aspecto da invenção fornecem variantes de DOM7h-11 com afinidades anti-albumina de soro satisfatórias. A escolha da variante pode levar em consideração a adaptação da meia-vida, de acordo com a situação terapêutica e/ou profilática desejada. Por exemplo, em uma modalidade, a afinidade da variante para albumina de soro é relativamente alta, tal que a variante seria útil para inclusão em produtos que encontram utilidade no tratamento e/ou prevenção de doenças crônicas ou persistentes, condições, toxicidade ou outras indicações crônicas. Em uma modalidade, a afinidade da variante para albumina de soro é relativamente moderada, tal que a variante seria útil para inclusão em produtos que encontram utilidade no tratamento e/ou prevenção de doenças agudas, condições, toxicidade ou outras indicações agudas. Em uma modalidade, a afinidade da variante para albumina de soro é intermediária, tal que a variante seria útil para inclusão em produtos que encontram utilidade no tratamento e/ou prevenção de doenças agudas ou crônicas, condições, toxicidade ou outras indicações agudas ou crônicas.
[0011]É concebível que uma molécula com uma afinidade e especificidade apropriadamente altas para albumina de soro permaneça em circulação tempo suficiente para ter o efeito terapêutico desejado (Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521 - 522 (2004)). Neste relatório, uma variante anti-SA de alta afinidade permaneceria na circulação no soro, coincidindo com a albumina de soro da espécie (WO 2008096158). Uma vez na circulação, qualquer agente terapêutico fundido à variante AlbudAb™ (um AlbudAb é um dAb anti-albumina de soro ou domínio variável único de imunoglobu- lina), ou NCE, peptídeo ou proteína, consequentemente seria capaz de atuar durante mais tempo sobre seu alvo e exibir um efeito terapêutico mais duradouro. Isto levaria em consideração doenças crônicas ou persistentes sem a necessidade de dosagens frequentes.
[0012]Uma variante com afinidade moderada (porém especificidade para SA) permaneceria unicamente na circulação do soro durante um tempo curto (por exemplo, durante algumas horas ou alguns dias), considerando o alvejamento específico dos alvos terapêuticos envolvidos em doenças agudas pelo agente terapêutico fundido.
[0013]Deste modo, é possível adaptar o produto que contém anti-SA à área de doença terapêutica através da escolha de uma variante anti-SA com a afinidade de ligação à albumina e/ou meia-vida no soro apropriadas.
[0014]Um aspecto da invenção fornece um ligante multiespecífico que compreende qualquer variante anti-SA, conforme descrito acima, e um grupo ligante que se liga especificamente a um antígeno alvo distinto de SA.
[0015]Um aspecto da invenção fornece um produto de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão ou fusão com um peptídeo ou fármaco NCE (nova entidade química), que compreende um polipeptídeo, proteína, peptídeo ou fármaco NCE fundido ou conjugado (para um NCE) a qualquer variante, conforme descrito acima, em que a variante é DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P (ou uma variante tendo um ami- noácido que é pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntico à sequência de aminoácidos de DOM7h-11-15) ou DOM7h-11-12 (ou uma variante tendo um aminoácido que é pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntico à sequência de aminoácidos de DOM7h- 11-12). DOM7h-11-15 e DOM7h-11-12 fornecem apenas uma diminuição moderada na afinidade quando fundidos ou conjugados ao parceiro tornando-os úteis nos produtos de fusão. DOM7h-11-15S12Pé idêntico a DOM7h-11-15, exceto que na posição 12 (numeração de acordo com Kabat) há uma prolina no lugar de uma serina. Isto fornece vantagens apresentadas no documento WO 08052933, incluindo a redução de ligação á Proteína-L das proteínas de fusão que contém este anticorpo de domínio e para facilitar a purificação. A divulgação completa do documento WO 08052933 é incorporada como referência neste relatório. Similarmente, a invenção fornece uma variante de DOM7h-11, conforme divulgado neste relatório, em que a variante compreende uma sequência de aminoácidos apresentada abaixo, com a exceção de que na posição 12 (numeração de acordo com Kabat) há uma prolina. A invenção também fornece proteínas de fusão, conjugados ou composição que compreendem tais variantes de DOM7h-11.
[0016]Um aspecto da invenção fornece uma variante de DOM7h-11 que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de DOM7h-11-15S12P ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de ami- noácidos de DOM7h-11-15S12P, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat).
[0017]Um aspecto da invenção fornece uma composição que compreende uma variante, proteína de fusão ou ligante de qualquer aspecto precedente e um dilu- ente, portador, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0018]Um aspecto da invenção fornece um método de tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um paciente, o qual compreende administrar pelo menos uma dose de uma variante, de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, ao dito paciente.
[0019]Um aspecto da invenção fornece uma fusão ou conjugado de polipeptí- deo que compreende um dAb anti-albumina de soro, conforme divulgado neste relatório (por exemplo, DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-3 ou DOM7h-11-15S12P ou DOM7h-11-15S12P com até 4 modificações em comparação à sequência de aminoáci- dos de DOM7h-11-15S12P) e uma incretina ou agente insulinotrópico, por exemplo, exendina-4, GLP-1(7-37), GLP-1(6-36) ou qualquer incretina ou agente insulinotrópico divulgado no documento WO 06/059106, incorporando-se explicitamente estes agentes como referência neste relatório, conforme descrito para inclusão na presente invenção e reivindicações abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0020]Figura 1: Alinhamento da sequência de aminoácidos para dAbs de variante de DOM7h-11. Um “.” em uma posição particular indica que nesta posição se encontra o mesmo amino em DOM7h-11. As CDRs são indicadas sublinhadas e em negrito (a primeira sequência sublinhada é CDR1, a segunda sequência sublinhada é CDR2 e a terceira sequência sublinhada é CDR3).
[0021]Figura 2: Parâmetros cinéticos de variantes de DOM7h-11. Unidades KD = nM; Unidades Kd = s-1; Unidades Ka = M-1 s-1. A anotação A e -B significa A x 10-B e Ce D significa C x 10D. As faixas cinéticas globais em várias espécies, conforme sustentado pelos exemplos abaixo, são indicadas. Faixas opcionais também são fornecidas para o uso em situações terapêuticas particulares (indicações, condições ou doenças agudas ou crônicas e “intermediário” para o uso em situações crônicas e agudas). dAbs de alta afinidade e produtos que compreendem os mesmos são úteis para situações crônicas. dAbs de média afinidade e produtos que compreendem os mesmos são úteis para situações intermediárias. dAbs de baixa afinidade e produtos que compreendem os mesmos são úteis para situações agudas. A afinidade neste respeito é a afinidade para a albumina de soro. Vários exemplos de dAbs antissoro e proteínas de fusão são listados, e os mesmos sustentam as faixas divulgadas. Muitos dos exemplos têm cinética favorável em seres humanos e um ou mais animais não humanos (por exemplo, em seres humanos e macaco Cynomolgus e/ou camundongo). A escolha de dAb ou produto que compreende o mesmo pode ser adaptada, de acordo com a invenção, dependendo da situação (por exemplo, crônica ou aguda) a ser terapeuticamente tratada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0022]Neste relatório descritivo, a invenção foi descrita com referência às modalidades, de maneira que se permitiu realizar um relatório descritivo claro e conciso. Deve ser avaliado que as modalidades podem ser combinadas ou separadas de diversas maneiras, sem divergir da invenção.
[0023]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado, conforme comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica (por exemplo, em cultura celular,genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridização e bioquímica). Técnicas padrão são usadas para métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (veja, em geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc., os quais são incorporados como referência neste relatório) e métodos químicos.
[0024]Conforme usado neste relatório, o termo “antagonista do receptor do fator de necrose tumoral 1 (TNFR1)” ou “antagonista anti-TNFR1” ou semelhantes se refere a um agente (por exemplo, uma molécula, um composto) que se liga a TNFR1 e pode inibir uma (isto é, uma ou mais) função de TNFR1. Por exemplo, um antagonista de TNFR1 pode inibir a ligação de TNFα a TNFR1 e/ou inibir a transdução de sinal mediada através de TNFR1. Consequentemente, processos e respostas celulares mediados por TNFR1 (por exemplo, morte celular induzida por TNFα em um ensaio de citotoxicidade L929 padrão) podem ser inibidos com um antagonista de TNFR1.
[0025]Um “paciente” é qualquer animal, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um primata não humano (tal como um babuíno, macaco-reso ou macaco Cynomolgus), camundongo, ser humano, coelho, rato, cão, gato ou porco. Em uma modalidade, o paciente é um ser humano.
[0026]Conforme usado neste relatório, “peptídeo” se refere a cerca de dois a cerca de 50 aminoácidos que são reunidos por intermédio de ligações peptídicas.
[0027]Conforme usado neste relatório, “polipeptídeo” se refere a pelo menos cerca de 50 aminoácidos que são reunidos por intermédio de ligações peptídicas. Em geral, os polipeptídeos compreendem estruturas terciárias e dobra em domínios funcionais.
[0028]Conforme usado neste relatório, um anticorpo se refere à IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE ou um fragmento (tal como um Fab, F(ab’)2, Fv, Fv ligado por pontes dis- sulfeto, scFv, anticorpos multiespecíficos de conformação fechada, scFv ligado por ponte dissulfeto, diacorpos), se derivado de qualquer espécie que produz naturalmente um anticorpo, ou criado por tecnologia de DNA recombinante; se isolado do soro, células B, hibridomas, transfectomas, leveduras ou bactérias.
[0029]Conforme usado neste relatório, “formato de anticorpo” se refere a qualquer estrutura polipeptídica adequada, em que um ou mais domínios variáveis de anticorpo podem ser incorporados, de modo a conferir especificidade de ligação para o antígeno na estrutura. Uma variedade de formatos de anticorpos adequados é conhecida na técnica, tal como, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia única, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de anticorpos, homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/ou cadeia leves de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um entre os anteriores (por exemplo, um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeiaúnica (scFv), um Fv ligado por pontes dissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2), um domínio variável de anticorpo único (por exemplo, um dAb, VH, VHH, VL) e versões modificadas de qualquer um entre os anteriores (por exemplo, modificados pela ligação covalente de polietilenoglicol ou outro polímero adequado ou um VHH humanizado).
[0030]A frase “domínio variável único de imunoglobulina” se refere a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que se liga especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de regiões V ou domínios diferentes. Um domínio variável único de imunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo, homo ou heteromultimérico) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis, onde as outras regiões ou domínios não são exigidos para a ligação ao antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina único (isto é, onde o domínio variável único de imu- noglobulina se liga ao antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um “anticorpo de domínio” ou “dAb” é o mesmo que um “domínio variável único de imunoglobulina”, conforme o termo é usado neste relatório. Um “domínio variável de imunoglobulina único” é o mesmo que um “domínio variável único de imunoglobu- lina”, conforme o termo é usado neste relatório. Um “domínio variável de anticorpo único” ou um “domínio variável único de anticorpo” é o mesmo que um “domínio variável único de imunoglobulina”, conforme o termo é usado neste relatório. Um domínio variável único de imunoglobulina é, em uma modalidade, um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui domínios variáveis de anticorpos únicos a partir de outras espécies, tais como roedores (por exemplo, conforme divulgado no documento WO 00/29004, os conteúdos do qual são integralmente incorporados como referência neste relatório), lambaru e dAbs VHH de Camelidae. VHH de Camelidae são polipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina que são derivados de espécies, incluindo camelos, lhamas, alpacas, dromedários e lhama silvestre, que produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves. O VHH pode ser humanizado.
[0031]Um “domínio” é uma estrutura de proteína dobrada que tem uma estru-turaterciária independente do resto da proteína. Geralmente, os domínios são responsáveis pelas propriedades funcionais distintas das proteínas e, em muitos casos, podem ser adicionados, removidos ou transferidos a outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável de anticorpo único” é um domínio de polipeptídeo dobrado que compreende sequências características de domínios variáveis de anticorpo. Portanto, inclui domínios variáveis de anticorpo completos e domínios variáveis modificados, por exemplo, em que um ou mais loops foram substituídos por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo, ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendemextensões N- ou C-terminal, assim como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade e especificidade de ligação do domínio de comprimento total.
[0032]No presente pedido, o termo “prevenção” e “prevenir” envolve a administração da composição protetora antes da indução da doença ou condição. “Tratamento” e “tratar” envolvem a administração da composição protetora depois que os sintomas da doença ou condição começaram a se manifestar. “Supressão” ou “suprimir” se refere à administração da composição depois de um evento indutor, mas antes do aparecimento clínico da doença ou condição.
[0033]Conforme usado neste relatório, o termo “dose” se refere à quantidade de ligante administrado a um paciente ao mesmo tempo (dose unitária), ou em duas ou mais administrações durante um intervalo de tempo definido. Por exemplo, dose pode se referir à quantidade de ligante (por exemplo, ligante que compreende um domínio variável único de imunoglobulina que se liga ao antígeno alvo) administrada a um paciente durante o curso de um dia (24 horas) (dose diária), dois dias, uma semana, duas semanas, três semanas ou um ou mais meses (por exemplo, através de uma administração única, ou através de duas ou mais administrações). O intervalo entre as doses pode ser qualquer intervalo de tempo desejado. O termo “farmaceuti- camente eficaz”, quando se refere a uma dose, significa quantidade suficiente do ligante, domínio ou agente farmaceuticamente ativo para fornecer o efeito desejado. A quantidade que é “eficaz” variará de paciente para paciente, dependendo da idade e condição geral do indivíduo, do fármaco ou agente farmaceuticamente ativo particular e semelhantes. Desse modo, nem sempre é possível especificar uma quantidade “eficaz” exata aplicável para todos os pacientes. Entretanto, uma dose “eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica usando experimentação de rotina.
[0034]Métodos para a análise farmacocinética e determinação da meia-vida do ligante (por exemplo, domínio variável único, proteína de fusão ou ligante multies- pecífico) serão familiares àqueles habilitados na técnica. Detalhes podem ser encontrados em Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, e em Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Referência também é feita a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado pela Marcel Dekker, 2aRev. edição ex. (1982), que descreve parâmetros farma- cocinéticos, tais como meias-vidas t alfa e t beta, e área sob a curva (AUC). Opcionalmente, todos os parâmetros farmacocinéticos e valores indicados neste relatório devem ser interpretados como valores em um ser humano. Opcionalmente, todos os parâmetros farmacocinéticos e valores indicados neste relatório devem ser interpretados como valores em um camundongo ou rato ou macaco Cynomolgus.
[0035]As meias-vidas (t% alfa e t% beta) e AUC podem ser determinadas a partir de uma curva de concentração no soro do ligante contra o tempo. O pacote de análise WinNonlin, por exemplo, versão 5.1 (disponível da Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) pode ser usado, por exemplo, para modelar a curva. Quando modelos de dois compartimentos são usados, em uma primeira fase (a fase alfa) o ligante é principalmente distribuído no paciente, com alguma eliminação. Uma segunda fase (fase beta) é a fase quando o ligante é distribuído e a concentração no soro é diminuída, conforme o paciente elimina o ligante. A meia-vida t alfa é a meia- vida da primeira fase e a meia-vida t beta é a meia-vida da segunda fase. Desse modo, em uma modalidade, no contexto da presente invenção, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante tem uma meia-vida tα na faixa de (ou de cerca de) 15 minutos ou mais. Em uma modalidade, o limite inferior da faixa é (ou é de cerca de) 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas. Além disso, ou alternativamente, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante, de acordo com a invenção, terá uma meia-vida tα na faixa de até e incluindo 12 horas (ou cerca de 12 horas). Em uma modalidade, o limite superior da faixa é (ou é de cerca de) 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 horas. Um exemplo de uma faixa adequada é (ou é de cerca de) 1 a 6 horas, 2 a 5 horas ou 3 a 4 horas.
[0036]Em uma modalidade, a presente invenção fornece o domínio variável, proteína de fusão ou ligante, de acordo com a invenção, que tem uma meia-vida tβ na faixa de (ou de cerca de) 2,5 horas ou mais. Em uma modalidade, o limite inferior da faixa é (ou é de cerca de) 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas. Além disso, ou alternativamente, a meia-vida tβ é (ou é de cerca de) de até e incluindo 21 ou 25 dias. Em uma modalidade, o limite superior da faixa é (ou é de cerca de) 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias ou 22 dias. Por exemplo, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante, de acordo com a invenção, terá uma meia-vida tβ na faixa 12 a 60 horas (ou cerca de 12 a 60 horas). Em uma outra modalidade, estará na faixa 12 a 48 horas (ou cerca de 12 a 48 horas). Em uma outra modalidade, estará na faixa 12 a 26 horas (ou cerca de 12 a 26 horas).
[0037]Como uma alternativa para usar um modelo de dois compartimentos, a pessoa habilitada estará familiarizada com o uso de modelos não compartimentais, que podem ser usados para determinar meias-vidas terminais (neste sentido, o termo “meia-vida terminal”, conforme usado neste relatório, significa uma meia-vida terminal determinada através do uso de modelos não compartimentais). O pacote de análise WinNonlin, por exemplo, versão 5.1 (disponível da Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) pode ser usado, por exemplo, para modelar a curva. Neste exemplo, em uma modalidade, o domínio variável único, proteína de fusão ou ligante tem uma meia-vida terminal de pelo menos (ou pelo menos cerca de) 8 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 28 horas, 20 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias ou 25 dias. Em uma modalidade, o limite superior desta faixa é (ou é de cerca de) 24 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas ou 120 horas. Por exemplo, a meia-vida terminal é (ou é de cerca de) de 8 horas a 60 horas, ou 8 horas a 48 horas ou 12 a 120 horas, por exemplo, em um ser humano.
[0038]Além disso, ou alternativamente aos critérios acima, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante, de acordo com a invenção, tem um valor AUC (área sob a curva) na faixa de (ou de cerca de) 1 mg.min/ml ou mais. Em uma modalidade, o limite inferior da faixa é (ou é de cerca de) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ou 300 mg.min/ml. Além disso, ou alternativamente, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante, de acordo com a invenção, tem uma AUC na faixa de (ou de cerca de) até 600 mg.min/ml. Em uma modalidade, o limite superior da faixa é (ou é de cerca de) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ou 50 mg.min/ml. Vantajosamente, o domínio variável, proteína de fusão ou ligante terá uma AUC na (ou aproximadamente na) faixa selecionada a partir do grupo que consiste em: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml e 15 a 50mg.min/ml.
[0039]“Ressonância superficial com plasma”: Ensaios de competição podem ser usados para determinar se um antígeno ou epítopo específico, tal como albumina de soro humana, compete com um outro antígeno ou epítopo, tal como albumina de soro de macaco Cynomolgus, para se ligar a um ligante de ligação à albumina de soro descrito neste relatório, tal como um dAb específico. Similarmente, ensaios de competição podem ser usados para determinar se um primeiro ligante, tal como dAb, compete com um segundo ligante, tal como um dAb, para se ligar a um antígeno ou epítopo alvo. O termo “compete”, conforme usado neste relatório, se refere à substância, tal como uma molécula, composto, preferivelmente uma proteína, que é capaz de interferir em qualquer grau com a interação de ligação específica entre duas ou mais moléculas. A frase “não inibe competitivamente” significa que a substância, tal como uma molécula, composto, preferivelmente uma proteína, não interfere em nenhum grau mensurável ou significante com a interação de ligação específica entre duas ou mais moléculas. A interação de ligação específica entre duas ou mais moléculas preferivelmente inclui a interação de ligação específica entre um domínio variável único e seu parceiro cognato ou alvo. A molécula interferente ou competidora pode ser um outro domínio variável único ou pode ser uma molécula que é estrutural e/ou funcionalmente similar a um parceiro cognato ou alvo.
[0040]O termo “grupo ligante” se refere a um domínio que se liga especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de um epítopo ou domínio de ligação ao antígeno diferente. Um grupo ligante pode ser um anticorpo de domínio (dAb) ou pode ser um domínio que é um derivado de uma estrutura de proteína não imunoglobulina, por exemplo, uma estrutura selecionada a partir do grupo que consiste de CTLA-4, lipocalina, SpA, uma adnectina, affibody, um avímero, GroEl, trans- ferrina, GroES e fibronectina, que se liga a um ligante, exceto o ligante natural (no caso da presente invenção, o grupo se liga à albumina de soro). Veja o documento WO 2008/096158, que divulga exemplos de estruturas de proteína e métodos para selecionar os domínios de ligação específicos do antígeno ou epítopo a partir de repertórios (veja os Exemplos 17 a 25). Estas divulgações específicas do documento WO 2008/096158 são expressamente incorporadas como referência neste relatório e são explicitamente descritas no mesmo e para o uso com a presente invenção. É considerado que qualquer parte de tal divulgação pode ser incorporada em uma ou mais reivindicações neste relatório).
[0041]Em um aspecto, a invenção fornece uma variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) de DOM7h-11, em que a variante compreende pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h-11, e em que a variante tem de 2 a 8 modificações em comparação à sequência de aminoácidos de DOM7h- 11. Opcionalmente, a posição 49 (de acordo com Kabat) é Leu. Adicional ou alternativamente, a posição 50 (de acordo com Kabat) é opcionalmente Ala ou Trp. Adicional ou alternativamente, a posição 51 (de acordo com Kabat) é opcionalmente Phe ou Asn. Em uma modalidade, a variante compreende uma mutação em cada uma das posições 49, 50 e 51 (numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h- 11. Em uma modalidade, a variante compreende um motivo LFG, onde L está na posição 49 (numeração de acordo com Kabat), em que L, F e G são Leu, Phe e Gly, respectivamente.
[0042]Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de amino- ácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-3, DOM7h-11-15, DOM7h-11-12 e DOM7h-11-19 ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoácidos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2, conforme definido acima. Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de DOM7h-11-15S12P ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de ami- noácidos de DOM7h-11-15S12P, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat). Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-3, ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoácidos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha L na posição 49, W na posição 50 e N na posição 51. Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-12, ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoáci- dos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha M na posição 32 e L na posição 49. Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P, ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoácidos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha M na posição 32, L na posição 49, A na posição 50 e F na posição 51. Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-18, ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoácidos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha M na posição 32 e H na posição 87. Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h- 11-19, ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoácidos sele-cionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha M na posição 32, L na posição 49 e T na posição 91. Todas as numerações neste parágrafo estão de acordo com Kabat.
[0043]Um aspecto da invenção fornece uma variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) de DOM7h-11, em que a variante compreende uma Met na posição 32 (numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h-11, e em que a variante tem de 0 a 4 modificações adicionais em comparação à sequência de aminoácidos de DOM7h-11. Opcionalmente, a variante compreende pelo menos uma mutação na junção FW2/CDR2 (posições 49 a 51, numeração de acordo com Kabat) em comparação a DOM7h-11.
[0044]Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, a variante compreende pelo menos uma mutação em comparação a DOM7h-11 selecionada a partir das seguintes posições: Posição 49 = L, Posição 50 = A ou W, Posição 51 = F ou N, Posição 87 = H e Posição 91 = T.
[0045]Em uma modalidade, a variante compreende uma sequência de amino- ácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único selecionado a partir de DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-11-15S12P, DOM7h-11-18 e DOM7h-11-19 ou tem até 4 modificações em comparação à sequência de aminoá- cidos selecionada, contanto que a sequência de aminoácidos da variante tenha Met na posição 32. Em uma modalidade, a variante compreende uma ou mais entre as seguintes características cinéticas: (a) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA humana com uma constante de dissociação (KD) de (ou de cerca de) 0,1 a (ou a cerca de) 10000 nM, opcionalmente de (ou de cerca de) 1 a (ou a cerca de) 6000 nM, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (b) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA humana com uma constante de taxa de dissociação (Kd) de (ou de cerca de) 1,5 x 10-4 a (ou a cerca de) 0,1 s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 3 x 10-4 a (ou a cerca de) 0,1 s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (c) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA humana com uma constante de taxa de associação (Ka) de (ou de cerca de) 2 x 106 a (ou a cerca de) 1 x 104 M-1s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 1 x 106 a (ou a cerca de) 2 x 104 M-1s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (d) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de macaco Cynomolgus com uma constante de dissociação (KD) de (ou de cerca de) 0,1 a (ou a cerca de) 10000 nM, opcionalmente de (ou de cerca de) 1 a (ou a cerca de) 6000 nM, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (e) A variante de qualquer reivindicação precedente, em que a variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de macaco Cynomolgus com uma constante de taxa de dissociação (Kd) de (ou de cerca de) 1,5 x 10-4 a (ou a cerca de) 0,1 s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 3 x 10-4 a (ou a cerca de) 0,1 s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (f) A variante de qualquer reivindicação precedente, em que a variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de macaco Cynomolgus com uma constante de taxa de associação (Ka) de (ou de cerca de) 2 x 106 a (ou a cerca de) 1 x 104 M-1s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 1 x 106 a (ou a cerca de) 5 x 103 M-1s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (g) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de rato com uma constante de dissociação (KD) de (ou de cerca de) 1 a (ou a cerca de) 10000 nM, opcionalmente de (ou de cerca de) 20 a (ou a cerca de) 6000 nM, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (h) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de rato com uma constante de taxa de dissociação (Kd) de (ou de cerca de) 2 x 103 a (ou a cerca de) 0,15 s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 9 x 10-3 a (ou a cerca de) 0,14 s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (i) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de rato com uma constante de taxa de associação (Ka) de (ou de cerca de) 2 x 106 a (ou a cerca de) 1 x 104 M-1s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 1 x 106 a (ou a cerca de) 3 x 104 M-1s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (j) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de camundongo com uma constante de dissociação (KD) de (ou de cerca de) 1 a (ou a cerca de) 10000 nM, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; (k) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de camundongo com uma constante de taxa de dissociação (Kd) de (ou de cerca de) 2 x 10-3 a (ou a cerca de) 0,15 s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma; e/ou (l) A variante compreende um sítio de ligação que se liga especificamente à SA de camundongo com uma constante de taxa de associação (Ka) de (ou de cerca de) 2 x 106 a (ou a cerca de) 1 x 104 M-1s-1, opcionalmente de (ou de cerca de) 2 x 106 a (ou a cerca de) 1,5 x 104 M-1s-1, conforme determinado por ressonância superficial com plasma.
[0046]Opcionalmente, a variante tem: I: uma KD, de acordo com (a) e (d), uma Kd, de acordo com (b) e (e), e uma Ka de acordo com (c) e (f); ou II: uma KD, de acordo com (a) e (g), uma Kd, de acordo com (b) e (h), e uma Ka, de acordo com (c) e (i); ou III: uma KD, de acordo com (a) e (j), uma Kd, de acordo com (b) e (k), e uma Ka, de acordo com (c) e (l); ou IV: cinética, de acordo com I e II; ou V: cinética, de acordo com I e III; ou VI: cinética, de acordo com I, II e III.
[0047]A invenção também fornece um ligante que compreende uma variante de qualquer aspecto ou modalidade precedente da invenção. Por exemplo, o ligante pode ser um ligante duplo específico (veja o documento WO 04003019 para exemplos de ligantes duplos específicos). Em um aspecto, a invenção fornece um ligante multi- específico que compreende uma variante anti-SA de qualquer aspecto ou modalidade precedente da invenção e um grupo ligante que se liga especificamente a um antígeno alvo distinto de SA. O grupo ligante pode ser qualquer grupo ligante que se liga espe-cificamente a um alvo, por exemplo, o grupo é um anticorpo, fragmento de anticorpo, scFv, Fab, dAb ou um grupo ligante que compreende uma estrutura de proteína não imunoglobulina. Tais grupos são divulgados em detalhes no documento WO 2008/096158 (veja os exemplos 17 a 25, cuja divulgação é incorporada como referência neste relatório). Exemplos de estruturas de proteína não imunoglobulina são CTLA-4, lipocalina, proteína A estafilocócica (spA), Affibody™, Avimers™, adnectinas, GroEL e fibronectina.
[0048]Em uma modalidade, um ligador é fornecido entre o grupo ligante antialvo e a variante única anti-SA, o ligador compreendendo a sequência de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS. Ligadores alternativos são descritos nos documentos WO 2007085814 (incorporado como referência neste relatório) e WO 2008/096158 (veja a passagem na página 135, linha 12 até a página 140, linha 14, cuja divulgação e todas as sequências ligadoras são expressamente incorporadas como referência neste relatório, conforme explicitamente descrito e para o uso com a presente invenção. É considerado que qualquer parte de tal divulgação pode ser incorporada em uma ou mais reivindicações neste relatório).
[0049]Em uma modalidade do ligante multiespecífico, o antígeno alvo pode ser, ou ser parte de, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos, que podem ser naturais ou sintéticos. Neste respeito, o ligante da invenção pode se ligar ao antígeno alvo e atuar como um antagonista ou agonista (por exemplo, agonista do receptor EPO). Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que a escolha é ampla e variada. Podem ser, por exemplo, proteínas humanas ou animais, citocinas, receptores de ci- tocina, onde os receptores de citocina incluem receptores para citocinas, enzimas, cofatores para enzimas ou proteínas de ligação ao DNA. Citocinas e fatores de crescimento adequados incluem, mas preferivelmente não são limitados a: ApoE, Apo- SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, fator 10 de crescimento de fibroblastos, li- gante de FLT3, Fractalcina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, insulina, IFN-Y, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina α, Inibina β, IP- 10, fator 2 de crescimento de queratinócitos (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, substância inibidora Mülleriana, fator inibidor da colônia de monócitos, proteína atraente de monócitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP- 3β, MIP-4, fator 1 inibidor de progenitores mieloides (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, fator de crescimento nervoso, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, fator de células-tronco (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, fator de necrose tumoral (TNF), TNF- α, TNF-β, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO- y, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 e HER 4, CD4, receptores de quimiocina humana CXCR4 ou CCR5, proteína não estrutural tipo 3 (NS3) do vírus da hepatite C, TNF-alfa, IgE, IFN-gama, MMP-12, CEA, H. pylori, TB, influenza, Hepatite E, MMP- 12, receptores de internalização que são superexpressados em determinadas células, tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de ErBb2 em células tumorais, um receptor celular internalizador, receptor de LDL, receptor de FGF2, receptor de ErbB2, receptor de transferrina, receptor de PDGF, receptor de VEGF, PsmAr, uma proteína de matriz extracelular, elastina, fibronectina, laminina, antitripsina-α1, inibidor de protease de fator tecidual, PDK1, GSK1, Bad, caspase-9, Forkhead, um antígeno de Helicobacter pylori, um antígeno de tuberculose por mico- bactéria e um antígeno do vírus influenza. Será avaliado que esta lista não é completa.
[0050]Em uma modalidade, o ligante multiespecífico compreende uma variante dAb anti-SA da invenção e um grupo ligante anti-TNFR1, por exemplo, um dAb anti-TNFR1. Opcionalmente, o ligante tem apenas um grupo ligante anti-TNFR1 (por exemplo, dAb) para reduzir a possibilidade de ligação cruzada do receptor. Em uma modalidade, a variante dAb anti-SA é DOM7h-11-3 ou DOM7h-11-15 ou DOM7h-11- 15S12P.
[0051]Em uma modalidade, o grupo ligante anti-TNFR1 é DOM1h-131-206 divulgado no documento WO 2008149148 (a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos do qual, conforme divulgado no pedido PCT, são expressamente incorporadas como referência neste relatório, conforme explicitamente descrito e para o uso com a presente invenção. É considerado que qualquer parte de tal divulgação pode ser incorporada em uma ou mais reivindicações neste relatório). Em uma modalidade, o ligante multiespecífico compreende ou consiste na sequência de aminoáci- dos de DOM1h-131-206 e da sequência de aminoácidos de DOM7h-11-3 ou DOM7h- 11-15 ou DOM7h-11-15S12P.
[0052]Em uma modalidade, o grupo ligante anti-TNFR1 ou dAb é qualquer grupo ou dAb divulgado no pedido copendente USSN 61/153.746, a divulgação do qual é incorporada como referência neste relatório. Em uma modalidade, o grupo li- gante anti-TNFR1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 % idêntica à sequência de aminoácidos de DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 ou DOM1h-574-180 ou à sequência de aminoácidos de qualquer dAb anti-TNFR1 divulgado na Tabela 3. Em uma modalidade, o ligante multiespecífico compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos de DOM1h-574-156 e da sequência de aminoácidos de DOM7h-11-3 ou DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P.
[0053]Em uma modalidade, o ligante da invenção é uma proteína de fusão que compreende uma variante da invenção fundida direta ou indiretamente a um ou mais polipeptídeos. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser uma “fusão ao fár- maco”, conforme divulgado no documento WO 2005/118642 (a divulgação do qual é incorporada como referência neste relatório), que compreende uma variante da invenção e um fármaco polipeptídico, conforme definido em tal Pedido PCT.
[0054]Conforme usado neste relatório, “fármaco” se refere a qualquer composto (por exemplo, molécula orgânica pequena, ácido nucleico, polipeptídeo) que pode ser administrado a um indivíduo para produzir um efeito benéfico, terapêutico ou diagnóstico através da ligação a e/ou alteração da função de uma molécula biológica alvo no indivíduo. A molécula alvo pode ser uma molécula alvo endógena codificada pelo genoma do indivíduo (por exemplo, uma enzima, receptor, fator de crescimento, citocina codificada pelo genoma do indivíduo) ou uma molécula alvo exógena codificada pelo genoma de um patógeno (por exemplo, uma enzima codificada pelo ge- noma de um vírus, bactéria, fungo, nemátodo ou outro patógeno). Fármacos adequados para o uso em proteínas e conjugados de fusão que compreendem uma variante de dAb anti-SA da invenção são divulgados nos documentos WO 2005/118642 e WO 2006/059106 (as divulgações integrais dos quais são incorporadas como referência neste relatório, incluindo a lista completa de fármacos específicos, conforme esta lista foi expressamente descrita neste relatório. É considerado que tal incorporação fornece a divulgação de fármacos específicos para inclusão nas reivindicações neste relatório). Por exemplo, o fármaco pode ser peptídeo similar a glucágon 1 (GLP-1) ou uma variante, interferon alfa 2b ou uma variante ou exendina-4 ou uma variante.
[0055]Em uma modalidade, a invenção fornece um conjugado de fármaco, conforme definido e divulgado nos documentos WO 2005/118642 e WO 2006/059106, em que o conjugado compreende uma variante da invenção. Em um exemplo, o fármaco é covalentemente ligado à variante (por exemplo, a variante e o fármaco são expressos como parte de um polipeptídeo único). Alternativamente, em um exemplo, o fármaco não é covalentemente ligado ou associado com a variante. O fármaco pode ser covalente ou não covalentemente ligado à variante direta ou indiretamente (por exemplo, através de um ligador adequado e/ou ligação não covalente de parceiros de ligação complementares (por exemplo, biotina e avidina)). Quando os parceiros de ligação complementares são utilizados, um dos parceiros de ligação pode ser cova- lentemente ligado ao fármaco diretamente ou através de um grupo ligador adequado, e o parceiro de ligação complementar pode ser covalentemente ligado à variante diretamente ou através de um grupo ligador adequado. Quando o fármaco é um poli- peptídeo ou peptídeo, a composição do fármaco pode ser uma proteína de fusão, em que o polipeptídeo ou peptídeo, fármaco e o grupo ligante ao polipeptídeo são partes distintas (grupos) de uma cadeia polipeptídica contínua. Conforme descrito neste relatório, os grupos ligantes ao polipeptídeo e grupos de fármaco polipeptídico podem ser diretamente ligadas entre si através de uma ligação peptídica, ou ligadas através de um aminoácido, ou peptídeo ou ligador polipeptídico adequado.
[0056]Um ligante que contém uma variante de domínio variável único (monô- mero) da invenção ou mais do que um domínio variável único (multímero, proteína de fusão, conjugado, e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório) que se liga especificamente à albumina de soro, pode compreender ainda uma ou mais entidades selecionadas a partir de, mas preferivelmente não limitadas a uma marcação, uma etiqueta, um domínio variável único adicional, um dAb, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um marcador e um fármaco. Uma ou mais destas entidades podem estar localizadas no terminal COOH ou no terminal N ou nos terminais N e COOH do ligante que compreende o domínio variável único, (domínio variável único de imu- noglobulina ou não imunoglobulina). Uma ou mais destas entidades pode estar localizada no terminal COOH, ou no terminal N, ou nos terminais N e COOH do domínio variável único que se liga especificamente à albumina de soro do ligante que contém um domínio variável único (monômero) ou mais do que um domínio variável único (multímero, proteína de fusão, conjugado e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório). Exemplo não limitantes de etiquetas que podem estar posicionadas em um ou ambos estes terminais incluem uma etiqueta HA, his ou uma myc. As entidades, incluindo uma ou mais etiquetas, marcações e fármacos, podem ser ligadas ao ligante que contém um domínio variável único (monômero) ou mais do que um domínio variável único (multímero, proteína de fusão, conjugado e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório), que se liga à albumina de soro, diretamente ou através de ligadores, conforme descrito acima.
[0057]Um aspecto da invenção fornece um produto de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão ou fusão com um peptídeo ou conjugado com um fármaco NCE (nova entidade química), que compreende um fármaco polipeptídico fundido ou conjugado (para uma NCE) a qualquer variante, conforme descrito acima, opcionalmente em que a variante é DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P (ou uma variante tendo um aminoácido que é pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntico à sequência de amino- ácidos de DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P) ou DOM7h-11-12 (ou uma variante tendo um aminoácido que é pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntico à sequência de aminoácidos de DOM7h-11-15 ou DOM7h-11-15S12P). DOM7h-11-15, DOM7h-11- 15S12P e DOM7h-11-12 fornecem apenas uma diminuição moderada na afinidade quando fundidos ou conjugados ao parceiro, tornando-os úteis em produtos de fusão.
[0058]A invenção fornece uma composição que compreende uma variante, proteína de fusão, conjugado ou ligante de qualquer aspecto da invenção e um dilu- ente, portador, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0059]Também abrangido neste relatório é um ácido nucleico isolado que codifica qualquer uma das variantes, proteínas de fusão, conjugados ou ligantes descritos neste relatório, por exemplo, um ligante que contém uma variante de domínio variável único (monômero) da invenção ou mais do que uma variante de domínio variável único (por exemplo, multímero, proteína de fusão, conjugado e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório) que se liga especificamente à albumina de soro, ou que se liga especificamente à albumina de soro humana e pelo menos uma albumina de soro não humana, ou fragmentos funcionalmente ativos da mesma. Também abrangido neste relatório é um vetor e/ou um vetor de expressão, uma célula hospedeira que compreende o vetor, por exemplo, uma célula vegetal ou animal e/ou linhagem celular transformada com um vetor, um método de expressar e/ou produzir uma ou mais variantes, proteínas de fusão ou ligantes que contém uma variante de domínio variável único (monômero) ou mais do que uma variante de domínio variável único (por exemplo, multímero, proteína de fusão, conjugado e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório) que se liga especificamente à albumina de soro, ou fragmento(s) da mesma codificada pelos ditos vetores, incluindo, em alguns exemplos, cultivar a célula hospedeira, de modo que uma ou mais variantes, proteínas de fusão ou ligantes ou fragmentos dos mesmos sejam expressados e, opcionalmente, recuperar o ligante que contém um domínio variável único (monômero) ou mais do que um domínio variável único (por exemplo, multímero, proteína de fusão, conjugado e ligante específico duplo, conforme definido neste relatório) que se liga especificamenteà albumina de soro, a partir do meio de cultura da célula hospedeira. Também abrangidos são métodos de contatar um ligante descrito neste relatório com albumina de soro, incluindo albumina de soro e/ou albumina de soro não humana, e/ou um ou mais alvos distintos de albumina de soro, onde os alvos incluem moléculas biologicamente ativas, e incluem proteínas animais, citocinas listadas acima, e incluem métodos onde o contato ocorre in vitro, assim como administrar qualquer uma das variantes,proteínas de fusão ou ligantes descritos neste relatório a um animal hospedeiro individual ou célula in vivo e/ou ex vivo. Preferivelmente, a administração de ligantes descritos neste relatório, que compreendem um domínio variável único (imunoglobulina ou não imunoglobulina) dirigidos à albumina de soro e/ou albumina de soro não humana, e um ou mais domínios dirigidos a um ou mais alvos distintos de albumina de soro, aumentará a meia-vida, incluindo a meia-vida T beta e/ou terminal, do ligante anti-alvo. Moléculas de ácido nucleico que codificam as variantes, proteínas de fusão ou domínio único que contém ligantes ou fragmentos das mesmas, incluindo fragmentos funcionais das mesmas, são considerados neste relatório. Vetores que codificam as moléculas de ácido nucleico, incluindo, mas preferivelmente não limitados aos vetores de expressão, são considerados neste relatório, como também as células hospedeiras a partir de uma linhagem celular ou organismo contendo um ou mais destes vetores de expressão. Também considerados são métodos de produzir qualquer variante, proteína de fusão ou ligante, incluindo, mas preferivelmente não limitado a qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras anteriormente mencionados.
[0060]Um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma variante, de acordo com a invenção, ou um ligante multiespecífico da invenção ou proteína de fusão da invenção.
[0061]Um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de uma variante de DOM7h-11 selecionada a partir de DOM7h-11-3, DOM7h-11-15, DOM7h-11-15S12P, DOM7h-11-12, DOM7h-11-18 e DOM7h-11-19 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à dita sequência selecionada.
[0062]Um aspecto da invenção fornece um vetor que compreende o ácido nu- cleico da invenção. Um aspecto da invenção fornece uma célula hospedeira isolada que compreende o vetor.
[0063]A referência será feita ao documento WO 2008/096158 para detalhes de sistemas de vetores de bibliotecas, combinação de domínios variáveis únicos, caracterização de ligantes específicos duplos, estrutura de ligantes específicos duplos, estruturas para o uso na construção de ligantes específicos duplos, usos de dAb anti- albumina de soro e ligantes multiespecíficos e ligantes que acentuam a meia-vida, e composições e formulações que compreendem dAb anti-albumina de soro. Estas divulgações são incorporadas como referência neste relatório para fornecer um guia para o uso com a presente invenção, incluindo variantes, ligantes, proteínas de fusão, conjugados, ácidos nucleicos, vetores, hospedeiros e composições da presente invenção.
[0064]As sequências da variante de DOM7h-14, que não estão de acordo com a invenção, são divulgadas em um Pedido de Patente Provisório U.S. copendente intitulado IMPROVED ANTI-SERUM ALBUMIN BINDING VARIANTS, depositado no mesmo dia do presente pedido. Estas sequências de variantes de DOM7h-14 (SEQ ID NO: s 1 a 10 no pedido copendente) são incorporadas como referência neste relatório, conforme explicitamente descrito neste relatório. SEQUÊNCIAS Tabela 1: Sequências de Aminoácidos de dAbs Variante DOM7h-11 DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGS RLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFS RLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR DOM7h-11-18 (SEQ ID NO: 3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLIWFG SRLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYHCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR DOM7h-11-19 (SEQ ID NO: 4) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGS RLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQTGTHPTTFGQGTKVEIKR DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLILWNS RLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR Tabela 2: Sequências de Nucleotídeos de dAbs Variante DOM7h-11 DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 6) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGG AGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTT AA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC T GGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTA CGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGA CCAAGG TGGAAATCAA ACGG DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 7) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGG AGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTT AA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTGCT TTTTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TG GGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTAC GTACTA CTGCGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGAC CAAGG TGGAAATCAA ACGG DOM7h-11-18 (SEQ ID NO: 8) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGG AGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTT AA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CAAAGCTCCT GATCTGGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC T GGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTA CGTACCA CTGTGCGCAG GCGGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGG ACCAAGG TGGAAATCAA ACGG DOM7h-11-19 (SEQ ID NO: 9) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGG AGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTT AA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC T GGGACGGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTA CGTACTA CTGTGCGCAG ACTGGGACGC ATCCCACGAC GTTCGGCCAA GGGA CCAAGG TGGAAATCAA ACGG DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 10) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGG AGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGACGTT AA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTTGG AATTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC T GGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTA CGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGA CCAAGG TGGAAATCAA ACGG Tabela 3: Sequências de Aminoácidos de dAbs anti-TNFR1 >DOM1h-509 (SEQ ID NO: 11) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYRMHWVRQAPGKSLEWVS SIDTRGSSTYYADPVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAVTMFSPF FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-510 (SEQ ID NO: 12) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYGMRWVRQAPGKGLEWVS SITRTGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWRNRHGE YLADFDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-543 (SEQ ID NO: 13) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMRYRMHWVRQAPGKGLEWV SSIDSNGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRTERS PVFDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-549 (SEQ ID NO: 14) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMHWVRQAPGKGLEWVS SISESGTTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRFSASTF DYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574 (SEQ ID NO: 15) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGHWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-1 (SEQ ID NO: 16) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEP YDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-2 (SEQ ID NO: 17) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-7 (SEQ ID NO: 18) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-8 (SEQ ID NO: 19) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-9 (SEQ ID NO: 20) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYMQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-10 (SEQ ID NO: 21) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-11 (SEQ ID NO: 22) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEP FDHWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-12 (SEQ ID NO: 23) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-13 (SEQ ID NO: 24) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-14 (SEQ ID NO: 25) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-15 (SEQ ID NO: 26) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS QISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-16 (SEQ ID NO: 27) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVS QISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-17 (SEQ ID NO: 28) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVS QISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-18 (SEQ ID NO: 29) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVS QISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-19 (SEQ ID NO: 30) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVS QISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEP FDYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-25 (SEQ ID NO: 31) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVS 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GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTCAGTATAGGAT GCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGAGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTG ATACTAGGGGTTCGTCTACATACTACGCAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCTGTGACGATGTTTTCTCCT TTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-510 (SEQ ID NO: 158) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTGATTATGGGAT GCGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTA CGCGGACTGGTCGTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGGCGGAATCGGCATGGTGA GTATCTTGCTGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG C >DOM1h-543 (SEQ ID NO: 159) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATGAGGTATAGGAT GCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTG ATTCTAATGGTTCTAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA 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>DOM1h-574-167 (SEQ ID NO: 292) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTGAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTT CGGATACCGGTGATCGTAGATACTACGATCACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACTA TCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTG CCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCT TTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-168 (SEQ ID NO: 293) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTT CGGATACCGGTGATCGTAGATACTACGATCACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACTA TCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTG CCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCCT TTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-169 (SEQ ID NO: 294) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGCGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGC CTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-170 (SEQ ID NO: 295) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTAAGTATTCGATG GGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTC GGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTG CTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTT TTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-171 (SEQ ID NO: 296) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGATCACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCT TTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-172 (SEQ ID NO: 297) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCC TTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-173 (SEQ ID NO: 298) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGC CTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-174 (SEQ ID NO: 299) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTT CGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCC TTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-175 (SEQ ID NO: 300) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGCACACGCGGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGC CTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-176 (SEQ ID NO: 301) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTT CGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGCC TTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-177 (SEQ ID NO: 302) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGC CTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-178 (SEQ ID NO: 303) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATT GCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACTCCGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCG TGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGGTGGGCGC CTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-179 (SEQ ID NO: 304) GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGAT GGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTT CGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATGACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCACCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGGTCGTTGGGAGCC TTTTGTCTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC Tabela 5: Fusões dAb anti-albumina de soro (DOM7h) (usado em estudos de Rato): Fusão DOM7h-14/Exendina-4número DMS 7138 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 305) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIM WRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVE IKR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 306) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTC AGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGT GGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACG TACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA GGTGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-14-10/Exendina-4número DMS 7139 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 307) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIM WRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKV EIKR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 308) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTC AGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGT GGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACG TACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAA GGTGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-14-18/Exendina-4número DMS 7140 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 309) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIM WRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLMKPMTFGQGTKV EIKR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 310) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTC AGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGT GGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACG TACTACTGTGCTCAGGGTCTTATGAAGCCTATGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-14-19/Exendina-4número DMS 7141 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 311) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQWIGSQLSWYQQKPGEAPKLLIM WRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVE IKR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 312) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTC AGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGGAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGT GGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACG TACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA GGTGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-11/Exendina-4número DMS 7142 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 313) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIWF GSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEI KR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 314) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA CGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-11-12/Exendina-4número DMS 7147 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 315) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILF GSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEI KR Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 316) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h-11-15/Exendina-4número DMS 7143 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 317) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAF SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIK R Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 318) CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGG AGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGG GCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGC GGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTG CTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG Fusão DOM7h14-10/G4SC-NCE Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 319) que codifica DOM7h14- 10/G4SC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEI KRGGGGSC
[0065]A cisteína C-terminal pode ser ligada a uma nova entidade química (composto químico farmacêutico, NCE), por exemplo, usando ligação maleimida. Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 320) que codifica DOM7h14- 10/G4SC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTT GGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCC TCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGA TTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGT GCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAACGGGGTGGCGGAGGGGGTTCCTGT Fusão DOM7h14-10/TVAAPSC Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 321) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEI KRTVAAPSC
[0066]A cisteína C-terminal pode ser ligada a uma nova entidade química (composto químico farmacêutico, NCE), por exemplo, usando ligação maleimida. Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 322) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTT GGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCC TCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGA TTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGT GCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAACGGACCGTCGCTGCTCCATCTTGT (usado em estudos de camundongo): Fusão DOM7h-11/DOM1m-21-23número DMS 5515 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 323) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLS WYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQ AGTHPTTFGQGTKVEIKR Sequência de aminoácidos mais nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 324) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLS WYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQ AGTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 325) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA CGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGG Sequência de nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 326) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA CGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG AATTAA Fusão DOM7h-11-12/DOM1m-21-23número DMS 5516 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 327) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLS WYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQ AGTHPTTFGQGTKVEIKR Sequência de aminoácidos mais nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 328) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLS WYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQ AGTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 329) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGG Sequência de nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 330) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGT TTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG AATTAA Fusão DOM7h-11-15/DOM1m-21-23número DMS 5517 Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 331) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLS WYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQA GTHPTTFGQGTKVEIKR Sequência de aminoácidos mais nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 332) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVS RIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSN AFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLS WYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQA GTHPTTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN Sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 333) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTG CTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG Sequência de nucleotídeos mais etiqueta myc (SEQ ID NO: 334) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTAT GGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGGATT GATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGC ATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGT GCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAAT GCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCAC CAGTGGTCCATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGA TGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTG CTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTA CTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCT GAATTAA
[0067]Onde uma molécula etiquetada com myc é indicada nesta tabela, esta foi a versão usada em estudos PK nos exemplos. Onde sequências etiquetadas com myc não são fornecidas, os estudos PK nos exemplos não foram realizados com material etiquetado com myc, isto é, os estudos foram feitos com os constructos não etiquetados mostrados.
EXEMPLIFICAÇÃO
[0068]Toda a numeração na seção experimental está de acordo com Kabat (Kabat, E.A. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interst, 5aed. (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)).
[0069]A derivação de variantes de DOM7h-11 e DOM7h-14 será descrita. As variantes de DOM7h-14 não estão de acordo com a invenção.
Exemplo 1: Maturação de Afinidade Vk Seleções:
[0070]Antígenos de HSA (Albumina de Soro Humana) e RSA (Albumina de Soro de Rato) foram obtidos da Sigma (essencialmente sem ácidos graxos, ~99 % (eletroforese em gel de agarose), pó liofilizado Cat. No A3782 e A6414, respectivamente.
[0071]Produtos biotinilados dos dois antígenos acima foram preparados atravésdo uso de Sulfo-NHS-SS-Biotina ligada a EZ (Pierce, Cat. No 21331). O reagente sem biotina foi removido através da passagem das amostras duas vezes através de uma coluna de dessalinização PD10, seguido por diálise durante a noite contra volume em excesso 1000x de PBS a 4 °C. O produto resultante foi testado por espec. de massas e 1 a 2 biotinas por molécula foram observadas.
Bibliotecas de maturação de afinidade:
[0072]Bibliotecas propensas a erro e CDR foram criadas usando dAbs parentais de DOM7h-11 e DOM7h-14 (veja o documento WO 2008/096158 para as sequências de DOM7h-11 e DOM7h-14). As bibliotecas de CDR foram geradas no vetor pDOM4 e as bibliotecas propensas a erro foram geradas no vetor pDOM33 (para permitir a seleção com ou sem tratamento com protease). O vetor pDOM4 é um deri-vado do vetor de fago Fd, em que a sequência de peptídeos de sinal de gene III é substituída com o peptídeo de sinal de proteína de superfície glicolipídica ancorada (GAS) de levedura. Este também contém uma etiqueta c-myc entre a sequência líder e o gene III, que restabelece o gene III no quadro de leitura. Esta sequência líder funciona satisfatoriamente em vetores de exibição de fago, mas também em outros vetores de expressão procarióticos, e pode ser universalmente usada. pDOM33 é uma versão modificada do vetor pDOM4, onde a etiqueta c-myc foi removida, o que tornou a fusão dAb-fago resistente à tripsina protease. Isto permitiu o uso da tripsina na se-leção do fago para selecionar os dAbs que são mais estáveis à protease (veja o do-cumento WO 2008149143).
[0073]Para bibliotecas de maturação propensas a erro, o DNA de plasmídeo que codifica o dAb a ser maturado foi amplificado por PCR, usando o kit de Mutagê- nese Aleatória GeneMorf® II (kit de mutagênese aleatória único Stratagene). O produto foi digerido com Sal I e Not I e usado em uma reação de ligação com vetor de fago de corte pDOM33.
[0074]Para as bibliotecas CDR, reações PCR foram realizadas usando oligo- nucleotídeos degenerados contendo códons NNK ou NNS para diversificar as posições exigidas no dAb a ser maturado por afinidade. A PCR de montagem depois foi usada para gerar um inserto diversificado de comprimento total. O inserto foi digerido com Sal I e Not I e usado em uma reação de ligação com pDOM4 para mutagênese de múltiplos resíduos e pDOM5 para mutagênese de resíduos únicos. O vetor pDOM5 é um vetor de expressão com base em pUC119, onde a expressão da proteína é realizada pelo promotor LacZ. Uma sequência líder GAS1 (veja o documento WO 2005/093074) garante a secreção de dAbs isolados e solúveis no periplasma e sobre- nadante de cultura de E. coli. dAbs foram clonados usando SalI/NotI neste vetor, que junta uma etiqueta myc no C-terminal de dAb. Este protocolo usando SalI e Not I resultou na inclusão de uma sequência de aminoácidos ST no N-terminal.
[0075]A ligação produzida por qualquer método depois foi usada para transformar a cepa E. coli TB1 por eletroporação e as células transformadas foram plaque- adas em 2xTY ágar contendo 15 μg/ml de tetraciclina, produzindo tamanhos de bibliotecas de >5 x 107 clones.
[0076]As bibliotecas propensas a erro apresentaram a seguinte taxa e tamanho de mutação média: DOM7h-11 (2,5 mutações por dAb), tamanho: 6,1 x 108, DOM7h-14 (2,9 mutações por dAb), tamanho: 5,4 x 108.
[0077]Cada biblioteca CDR tem uma diversidade de quatro aminoácidos. Duas bibliotecas foram geradas para cada uma das CDRs 1 e 3, e uma biblioteca para CDR2. As posições diversificadas em cada biblioteca são as seguintes (aminoácidos com base na sequência DPK9 fictícia para VK): Tamanho da Biblioteca DOM7h-11DOM7h-14 1 - Q27, S28, S30, S31 (CDR1)8,8 x 1075,8 x 107 2 - S30, S31, Y32, N34 (CDR1)4,6 x 1084,2 x 108 3 - Y49, A50, A51, S53 (CDR2)3,9 x 1082,4 x 108 4 - Q89, S91, Y92, S93 (CDR3) 1,8 x 1082,5 x 108 5 - Y92, Y93, T94, N96 (CDR3)4,0 x 1083,3 x 108 Exemplo 2: Estratégias de seleção: Três estratégias de seleção de fagos foram adotadas para maturação de afinidade de VK AlbudAb™ (dAb anti-albumina de soro):
1) Seleções apenas contra HSA:
[0078]Três rodadas de seleção contra HSA foram realizadas. As bibliotecas propensas a erro e cada biblioteca CDR foram selecionadas como um grupo individual em todas as rodadas. A primeira rodada de seleção foi realizada contra HSA passivamente revestida em um imunotubo a 1 mg/ml. A segunda rodada foi realizada contra HSA 100 nM e a terceira rodada contra HSA 10 nM (seleções para CDR) ou 20 ou 100 nM (seleções para propensas a erro), ambas como seleções solúveis, seguido por uma quarta rodada de seleção com as bibliotecas propensas a erro contra HSA 1,5 nM como uma seleção solúvel. As bibliotecas propensas a erro foram eluídas com glicina 0,1 M, pH 2,0, antes da neutralização com Tris 1 M, pH 8,0, e as bibliotecas CDR foram eluídas com tripsina 1 mg/ml antes da infecção em células TG1 em fase log. A terceira rodada de cada seleção foi subclonada em pDOM5 para triagem. As seleções solúveis usaram HSA biotinilada.
2) Seleções de tripsina contra HSA:
[0079]De modo a selecionar dAbs com resistência à protease aumentada em comparação ao clone parental e com propriedades biofísicas potencialmente aperfeiçoadas, tripsina foi usada em seleções de fagos (veja o documento WO 2008149143). Quatro rodadas de seleção foram realizadas contra HSA. A primeira rodada de seleção de bibliotecas propensas a erro foi realizada contra HSA passivamente revestida a 1 mg/ml sem tripsina; a segunda rodada contra HSA passivamente revestida a 1 mg/ml com 20 μg/ml de tripsina durante 1 h a 37 °C; a terceira rodada de seleção foi realizada por seleção solúvel usando HSA biotinilada contra HSA 100 nM com 20 μg/ml ou 100 μg/ml de tripsina durante 1 h a 37 °C. A rodada final de seleção foi realizada por seleção solúvel usando HSA biotinilada contra HSA 100 nM com 100 μg/ml de tripsina durante a noite a 37 °C.
3) Seleções de cruzamento contra HSA (rodada 1) e RSA (rodadas 2 a 4):
[0080]A primeira rodada de seleção foi realizada contra 1 mg/ml de HSA passivamente revestida ou 1 μM de HSA (seleção solúvel), seguido por três rodadas adicionais de seleções solúveis contra RSA biotinilada em concentrações de 1 μM para a rodada 1, 100 nm para a rodada 2 e 20 nM, 10 nM ou 1 nM para a rodada 3.
Estratégia de triagem e determinação de afinidade:
[0081]Em cada caso, depois que a seleção de um grupo de DNA de fago a partir da rodada de seleção apropriada é preparada usando um kit QIAfilter midiprep (Qiagen), o DNA é digerido usando as enzimas de restrição Sal1 e Not1 e os genes V enriquecidos são ligados nos sítios correspondentes em pDOM5, o vetor de expressão solúvel que expressa o dAb com uma etiqueta myc (veja o documento PCT/EP2008/067789). O DNA ligado é usado para eletrotransformar células HB 2151 de E. coli que depois são cultivadas durante a noite em placas de ágar contendo o antibiótico carbenicilina. As colônias resultantes são individualmente avaliadas quanto à ligação ao antígeno. Em cada caso, pelo menos 96 clones foram testados quanto à ligação à HSA, CSA (albumina de soro de macaco Cynomolgus), MSA (albumina de soro de camundongo) e RSA por BIAcore™ (ressonância superficial com plasma). O antígeno de MSA foi obtido da Sigma (essencialmente sem ácido graxo, ~99 % (eletroforese em gel de agarose), pó liofilizado Cat. No A3559) e CSA foi purificada a partir de albumina de soro de macaco Cynomolgus usando resina azul prometic (Amers- ham). Fragmentos solúveis de dAb foram produzidos em culturas bacterianas em meios de cultura ONEX (Novagen) durante a noite a 37 °C em placas de 96 cavidades. O sobrenadante de cultura contendo dAb solúvel foi centrifugado e analisado por BI- Acore para a ligação a microplacas CM5 com HSA, CSA, MSA e RSA de alta densidade. Descobriu-se que os clones foram ligados a todas as espécies de albumina de soro através de triagem de taxa de dissociação. Os clones foram sequenciados, reve-lando sequências de dAb únicas.
[0082]A identidade mínima dos clones selecionados com respeito ao precursor (no nível de aminoácidos) foi de 97,2 % (DOM7h-11-3: 97,2 %, DOM7h-11-12: 98,2 %, DOM7h11-15: 96,3 %, DOM7h-11-18: 98,2 %, DOM7h-11-19: 97,2 %).
[0083]A identidade mínima dos clones selecionados com respeito ao precursor (no nível de aminoácidos) foi de 96,3 % (DOM7h-14-10: 96,3 %, DOM7h- 14-18: 96,3 %, DOM7h-14-19: 98,2 %, DOM7h-14-28: 99,1 %, DOM7h-14-36: 97,2 %).
[0084]dAbs únicos foram expressos como sobrenadantes bacterianos em frascos agitadores de 2,5 L em meio Onex a 30 °C durante 48 h a 250 rpm. dAbs foram purificados do meio de cultura por absorção à proteína L agarose, seguido por eluição com glicina 10 mM, pH 2,0. A ligação à HSA, CSA, MSA e RSA por BIAcore foi confirmada usando proteína purificada em 3 concentrações 1 μM, 500 nM e 50 nM. Para determinar a afinidade de ligação (KD) de AlbudAbs para cada albumina de soro, dAbs purificados foram analisados por BIAcore sobre uma faixa de concentração de albumina de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM).Tabela 6
Figure img0001
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*: os valores entre parênteses foram derivados de um segundo experiment SPR independente.
[0085]Todas as variantes derivadas de DOM7h-14 apresentam reatividade cruzada para a albumina de soro de camundongo, rato, ser humano e macaco Cyno- molgus. DOM7h-14-10 apresentou afinidade aperfeiçoada para a albumina de soro de rato, macaco Cynomolgus e ser humano em comparação ao precursor. DOM7h-14- 28 apresentou uma afinidade aperfeiçoada para RSA. DOM7h-14-36 apresentou uma afinidade aperfeiçoada para RSA, CSA e MSA.
[0086]DOM7h-11-3 apresentou afinidade aperfeiçoada para CSA e HSA. DOM7h-11-12 apresentou afinidade aperfeiçoada para RSA, MSA e HSA. DOM7h- 11-15 apresentou afinidade aperfeiçoada para RSA, MSA, CSA e HSA. DOM7h-11- 18 e DOM7h-11-19 apresentaram afinidade aperfeiçoada para RSA, MSA e HSA.
Exemplo 3: Origens de clones principais de linhagem DOM7h-11:
[0087]DOM7h-11-3: A partir da maturação de afinidade realizada contra HSA usando a biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51, S53), produção da rodada 3 HSA10 nM
[0088]DOM7h-11-12: A partir da maturação de afinidade realizada contra HSA usando a biblioteca propensa a erro, produções da rodada 3 (100nM, HSA) com 100 μg/ml de tripsina.
[0089]DOM7h-11-15: A partir de seleções de cruzamento realizadas contra HSA como na rodada 1, seguido por 3 rodadas adicionais de seleções contra RSA usando a biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51, S53) na seleção de 3 rodadas com 1 nM de RSA.
[0090]DOM7h-11-18: A partir de seleções de cruzamento realizadas contra HSA como na rodada 1, seguido por 3 rodadas adicionais de seleções contra RSA usando a biblioteca propensa a erro, produção da rodada 3 a 20 nM de RSA.
[0091]DOM7h-11-19: A partir de seleções de cruzamento realizadas contra HSA como na rodada 1, seguido por 3 rodadas adicionais de seleções contra RSA usando a biblioteca propensa a erro, produção da rodada 3 a 5 nM de RSA. Tabela 7: Sequências CDR (de acordo com Kabat; ref. acima)
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Exemplo 4: Origens de clones principais da linhagem DOM7h-14:
[0092]DOM7h-14-19: A partir da maturação de afinidade realizada contra HSA usando a biblioteca propensa a erro, produções da rodada 3 (100nM, HSA) com 100 μg/ml de tripsina.
[0093]DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36: A partir da maturação de afinidade realizada contra HSA usando a biblioteca CDR3 (Y92, Y93, T94, N96), produção da rodada 3. Tabela 8: Sequências CDR (de acordo com Kabat; ref. acima)
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Exemplo 5: Expressão e Caracterização Biofísica:
[0094]O nível de expressão bacteriana de rotina em frascos agitadores de 2,5 L foi determinado após a cultura em meio Onex a 30 °C durante 48 h a 250 rpm. As características biofísicas foram determinadas por SEC MALLS e DSC.
[0095]SEC MALLS (cromatografia de exclusão por tamanho com dispersão de luz LASER multiângulo) é uma técnica não invasiva para a caracterização de ma- cromoléculas em solução. Brevemente, as proteínas (na concentração de 1 mg/mL em tampão PBS de Dulbecco a 0,5 ml/min) foram separadas, de acordo com suas propriedades hidrodinâmicas, através de cromatografia de exclusão por tamanho (coluna: TSK3000 de TOSOH Biosciences; S200 da Pharmacia). Após a separação, a propensão da proteína à dispersão de luz foi medida usando um detector de dispersão de luz LASER multiângulo (MALLS). A intensidade da luz dispersa, quando a proteína passa através do detector, foi medida como uma função do ângulo. Esta medição, tomada com a concentração da proteína determinada usando o detector de índice refrativo (RI), permite o cálculo da massa molar usando equações apropriadas (parte integral do software de análise Astra v.5.3.4.12).
[0096]DSC (Calorimetria de Varredura Diferencial): Brevemente, a proteína foi aquecida em uma taxa constante de 180 °C/h (1 mg/mL em PBS) e uma mudança térmica detectável associada com desnaturação térmica medida. O ponto médio de transição (appTm) foi determinado, o qual foi descrito como a temperatura na qual 50 % da proteína está em sua conformação nativa e os outros 50 % está desnaturada. Neste relatório, a DSC determinou o ponto médio de transição aparente (appTm) quando a maioria das proteínas examinadas não foi completamente redobrada. Quanto maior a Tm, mais estável será molécula. As curvas desdobradas foram analisadas pelas equações que não eram de 2 estados. O pacote de software usado foi OriginR v7.0383.Tabela 9
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* em um outro experimento, o monômero foi principalmente observado por SEC MALLS, embora menor do que 95 %
[0097]Foram observados os níveis de expressão para todos os clones na Tabela 9 na faixa de 15 a 119 mg/L em E coli.
[0098]Para as variantes de DOM7h-14 e DOM7h-11, parâmetros biofísicos favoráveis (monoméricos na solução, conforme determinado por SEC MALLs e ap- pTm de >55 °C. conforme determinado por DSC) e níveis de expressão foram mantidos durante a maturação de afinidade. O estado monomérico foi vantajoso, pois evitou a dimerização e o risco de produtos que podem apresentar ligação cruzada com alvos, tais como receptores de superfície celular.
Exemplo 6: Determinação da meia-vida no soro em ratos, camundongos e macacos Cynomolgus
[0099]AlbudAbs DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-19, DOM7h-11, DOM7h11-12 e DOM7h-11-15 foram clonados no vetor pDOM5. Para cada AlbudAbTM, quantidades de 20 a 50 mg foram expressas em E. coli e purificadas a partir do sobrenadante de cultura bacteriano usando resina de afinidade para proteína L e eluídas com glicina 100 mM, pH 2. As proteínas foram concentradas em mais do que 1 mg/ml, o tampão trocado em PBS e endotoxina depletada usando colunas de giro Q (Vivascience). Para a análise farmacocinética de rato (PK), AlbudAbs foram dosados como injeções únicas i.v de 2,5 mg/kg usando 3 ratos por composto. As amostras de soro foram tomadas a 0,16, 1, 4, 12, 24, 48, 72, 120, 168 h. A análise dos níveis no soro foi realizada por ELISA anti-myc, segundo o método descrito abaixo.
[00100]Para a PK de camundongo, DOM7h-11, DOM7h11-12 e DOM7h-11- 15 foram dosados como injeções únicas i.v de 2,5 mg/kg por dose a um grupo de 3 pacientes e as amostras de soro tomadas a 10 min, 1 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. A análise dos níveis no soro foi realizada por ELISA anti-myc, segundo o método descrito abaixo.
[00101]Para a PK de macaco Cynomolgus, DOM7h-14-10 e DOM7h-11-15 foram dosados como injeções únicas i.v de 2,5 mg/kg em 3 macacos Cynomolgus fêmeas por dose a um grupo e as amostras de soro tomadas a 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 h. A análise dos níveis no soro foi realizada por ELISA anti-myc, segundo o método descrito abaixo.
Método ELISA anti-myc
[00102]A concentração de AlbudAb no soro foi medida por ELISA anti-myc. Brevemente, anticorpos policlonais anti-myc de cabra (1:500; Abcam, catálogo número ab9132) foram revestidos durante a noite em placas Maxisorp Nunc de 96 cavidades e bloqueados com 5 % de BSA/PBS + 1 % de tween. As amostras de soro foram adicionadas em uma faixa de diluições através de um padrão em concentrações conhecidas. AlbudAb etiquetado com myc ligado depois foi detectado usando um anti- Vk policlonal de coelho (1:1000; reagente interno, as extrações foram agrupadas e a proteína A purificada antes do uso), seguido por um anticorpo HRP anti-IgG de coelho (1:10,000; Sigma, catálogo número A2074). As placas foram lavadas entre cada estágio do ensaio com 3 x PBS + 0,1 % de Tween20, seguido por 3 x PBS. TMB (Substrato de Peroxidase para Microcavidades de Componente SureBlue TMB 1, KPL, catálogo número 52-00-00) foi adicionado depois da última lavagem e foi deixado para desenvolvimento. Este processo foi interrompido com HCl 1 M e o sinal depois foi medido usando absorvância a 450 nm.
[00103]A partir dos dados brutos de ELISA, a concentração de amostras desconhecidas foi estabelecida por interpolação contra a curva padrão, levando em conta os fatores de diluição. A concentração média que resulta de cada ponto no tempo foi determinada a partir de valores replicados e foi introduzida no pacote de análise Win- NonLin (por exemplo, versão 5.1 (disponível da Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA). Os dados foram ajustados usando um modelo não compartimental, onde os parâmetros PK foram avaliados pelo software para fornecer meias-vidas terminais. A informação de dosagem e pontos no tempo foram selecionados para refletir a fase terminal de cada perfil PK.Tabela 10: PK de AlbudAbTM único
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* Dados históricos
[00104]Os parâmetros farmacocinéticos derivados de estudos em ratos, camundongos e macacos Cynomolgus foram ajustados usando um modelo não compar- timental. Chave: AUC: Área sob a curva a partir do tempo de dosagem extrapolado ao infinito; CL: eliminação; t1/2: é o tempo durante o qual a concentração sanguínea é dividida em dois; Vz: volume de distribuição com base na fase terminal.
[00105]DOM7h-11-12 e DOM7h-11-15 têm uma AUC e t1/2 aperfeiçoadas em rato e camundongo em comparação ao precursor. DOM7h-11-15 também tem uma AUC e t1/2 aperfeiçoadas em macaco Cynomolgus em comparação ao precursor. Este aperfeiçoamento em AUC/t1/2 equivale a uma KD aperfeiçoada in vitro para a albumina de soro.
Exemplo 7: Fusões de AlbudAbTM IFN Clonagem e expressão
[00106]Assim como AlbudAbs únicos, os Albudabs Vk maturados por afinidade foram ligados a Interferon alfa 2b (IFNα2b) para determinar se uma PK útil do AlbudAb foi mantida como uma proteína de fusão. Sequência de aminoácidos de Interferon alfa 2b: CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTET PLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID NO: 374) Sequência de nucleotídeos de Interferon alfa 2b: TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATG CTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACAT GACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACC ATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAG GACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTC TACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGAC AGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCA AAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGT TGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGT TTAAGAAGTAAGGAA (SEQ ID NO: 375) IFNα2b foi ligado ao AlbudAb por intermédio de uma região ligadora TVAAPS (veja o documento WO 2007085814). Os constructos foram clonados por SOE-PCR (extensão de sobreposição única, de acordo com o método de Horton et al. Gene, 77, página 61 (1989)). A amplificação por PCR do AlbudAb e sequências de IFN foi reali- zada separadamente usando primers com ~15 pares de bases sobrepostos na região ligadora TVAAPS. Os primersusados são os seguintes: GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEQ ID NO: 376) GGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTC (SEQ ID NO: 377) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC (SEQ ID NO: 378) Vk SOE fragmento 3’ GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC para introduzir também TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT uma etiqueta myc TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 379)
[00107]Os fragmentos foram purificados separadamente e subsequentemente montados em uma reação SOE (extensão PCR por extensão de sobreposição única) usando apenas os primersflanqueadores. IFNa2b SOE frag- GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEQ ID NO: 380) mento 5’ Vk SOE fragmento GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC 3’ para introduzir TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT também uma eti- TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 381) queta myc
[00108]O produto da PCR montado foi digerido usando as enzimas de restrição BamHI e HindIII e o gene ligado nos sítios correspondentes no pDOM50, um vetor de expressão de mamífero que é um derivado de pTT5 com uma sequência líder secretora de IgG de camundongo V-J2-C N-terminal para facilitar a expressão no meio celular. Sequência líder (aminoácidos): METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 382) Sequência líder (nucleotídeos): ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCC GGATCCACCGGGC (SEQ ID NO: 383)
[00109]O DNA de plasmídeo foi preparado usando QIAfilter megaprep (Qiagen). 1 μg de DNA/ml foi transfectado com 293-Fectin em células HEK293E e cultivado em meio livre de soro. A proteína foi expressa na cultura durante 5 dias e purificada do sobrenadante de cultura usando resina de afinidade à proteína L e eluída com glicina 100 mM, pH 2. As proteínas foram concentradas em mais do que 1 mg/ml, o tampão trocado em PBS e a endotoxina depletada usando colunas de giro Q (Vivas- cience).Tabela 11: Sequências de Interferon alfa 2b-AlbudAb com e sem etiqueta myc (como sequência de aminoácidos e nucleotídeos)
[00110]O Interferon alfa 2b é N-terminal com respeito a AlbudAb nas fusões seguintes.
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As sequências de aminoácidos e nucleotídeos destacadas em negrito representam o sítio de clonagem e etiqueta MYC. * representa o códon de parada na extremidade do gene. Determinação de Afinidade e Caracterização Biofísica: Para determinar a afinidade de ligação (KD) das proteínas de fusão AlbudAb- IFNα2b a cada albumina de soro, proteínas de fusão purificadas foram analisadas por BIAcore sobre albumina (imobilizada por ligação de amina primária em microplacas CM5; BIAcore) usando concentrações de proteína de fusão de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM) em tampão HBS- EP BIAcore. Tabela 12: Afinidade para SA
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[00111]Quando IFNα2b é ligado às variantes AlbudAb, em todos os casos, a afinidade de ligação de AlbudAb à albumina de soro é reduzida. DOM7h-14-10 e DOM7-11-15 conservaram afinidade de ligação aperfeiçoada à albumina de soro em todas as espécies em comparação ao precursor. DOM7h-11-12 também mostrou afi-nidade de ligação aperfeiçoada à albumina de soro em todas as espécies em compa-ração ao precursor.
Tabela 13: Caracterização Biofísica
[00112]A caracterização biofísica foi realizada por SEC MALLS e DSC,conforme descrito acima para os AlbudAbs únicos.
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M/D indica um equilíbrio de monômero/dímero, conforme detectado por SEC MALLS
[00113]Foi observada a expressão para todos os clones na Tabela 13 na faixa de 17,5 a 54 mg/L em HEK293.
[00114]Para as variantes IFNα2b-DOM7h-14 e IFNα2b-DOM7h-11, parâmetros biofísicos e níveis de expressão favoráveis foram mantidos durante a maturação de afinidade.
Determinação de PK para fusões AlbudAb-IFNα2b
[00115]As fusões AlbudAbs IFNα2b DMS7321 (IFNα2b-DOM7h-14) DMS7322 (IFNα2b-DOM7h-14-10) DMS7323 (IFNα2b-DOM7h-14-18), DMS7324 (IFNα2b-DOM7h-14-19), DMS7325 (IFNα2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFNα2b- DOM7h-11-12), DMS7327 (IFNα2b-DOM7h-11-15) foram expressas com a etiqueta myc em quantidades de 20 a 50 mg em células HEK293 e purificadas do sobrenadante de cultura usando resina de afinidade à proteína L e eluídas com glicina 100 mM, pH 2. As proteínas foram concentradas em mais do que 1 mg/ml, o tampão trocado em PBS de Dulbecco e a endotoxina depletada usando colunas de giro Q (Vivascience).
[00116]Para a PK de Rato, IFN-AlbudAbs foram dosados como injeções únicas i.v de 2,0 mg/kg usando 3 ratos por composto. As amostras de soro foram tomadas a 0,16, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168 h. A análise de níveis no soro foi realizada por EASY ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, catálogo número RPN5960).
[00117]Para a PK de camundongo, DMS7322 (IFN2b-DOM7h-14-10) DMS7325 (IFN2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFN2b-DOM7h-11-12), DMS7327 (IFN2b- DOM7h-11-15), todos com etiquetas myc, foram dosados como injeções únicas i.v de 2,0 mg/kg por dose a um grupo de 3 pacientes e as amostras de soro tomadas a 10 min, 1 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. A análise dos níveis no soro foi realizada por EASY ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, catálogo número RPN5960).Tabela 14:
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[00118] Os parâmetros farmacocinéticos derivados dos estudos em ratos e camundongos foram ajustados usando um modelo não compartimental. Chave: AUC: Área sob a curva a partir do tempo de dosagem extrapolado ao infinito; CL: eliminação; t1/2: é o tempo durante o qual a concentração sanguínea é dividida em dois; Vz: volume de distribuição com base na fase terminal.
[00119]IFNα2b-AlbudAbs foram testados em ratos e camundongos. Para todas as proteínas de fusão da variante IFNα2b-DOM7h-11 em ratos e camundongos, o valor t1/2 foi aperfeiçoado em comparação ao precursor. O aperfeiçoamento em t1/2 equivale a uma KD in vitro aperfeiçoada para a albumina de soro. Para as variantes IFNα2b-DOM7h-14-10, o aperfeiçoamento na KD in vitro para a albumina de soro também equivale a um aperfeiçoamento de t1/2 em ratos.
[00120]Todas as proteínas de fusão IFNα2b-AlbudAb exibiram uma diminuição de 5 a 10 vezes na ligação à RSA em comparação a AlbudAb único. Este efeito é mais significante (isto é, 10 vezes) para a série DOM7h-14 em relação à série DOM7h- 11 (única diminuição de 5 vezes).
Exemplo 8: Fusões AlbudAb adicionais com proteínas, peptídeos e NCEs.
[00121]Vários AlbudAbs fundidos a outras entidades químicas, isto é, anticorpo de domínios (dAbs), peptídeos e NCEs foram testados. Os resultados são mostrados na Tabela 15.Tabela 15:
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[00122]Chave: DOM1m-21-23 é um dAb anti-TNFR1, Exendina-4 é um peptí- deo (um agonista de GLP-1) de 39 aminoácidos. NCE, NCE-GGGGSC e NCE- TVAAPSC são descritos abaixo.
[00123]Anteriormente, foi descrito o uso de fusões genéticas com um dAb de ligação à albumina (AlbudAb) para ampliar a meia-vida PK de dAbs anti-TNFR1 in vivo (veja, por exemplo, os documentos WO 04003019, WO 2006038027, WO 2008149148). A referência será feita aos protocolos nestes pedidos PCT. Na tabela acima, DOM1m-21-23 é um dAb anti-TNFR1 de camundongo.
[00124]Para produzir fusões genéticas de exendina-4 ou com DOM7h-14 (ou outro AlbudAb) que se liga à albumina de soro, a sequência exendina-4-ligador-Albu- dAb foi clonada no vetor pTT-5 (obtenível da CNRC, Canadá). Em cada caso, a exen- dina-4 estava no terminal 5’ do constructo e o dAb no terminal 3’. O ligador foi um ligador (G4S)3. O DNA sem endotoxina foi preparado em E.coli usando lise alcalina (usando o kit Giga para plasmídeo sem endotoxina, obtenível da Qiagen CA) e usado para transfectar células HEK293E (obteníveis da CNRC, Canadá). A transfecção foi realizada em um frasco de 250 ml de células HEK293E a 1,75 x 106células/ml usando 333 μl de 293fectin (Invitrogen) e 250 μg de DNA por frasco e a expressão foi realizada a 30 °C durante 5 dias. O sobrenadante foi colhido por centrifugação e a purificação foi realizada por purificação de afinidade na proteína L. A proteína foi ligada em lotes à resina, empacotada em uma coluna e lavada com 10 volumes de coluna de PBS. A proteína foi eluída com 50 ml de glicina 0,1 M, pH 2, e neutralizada com Tris, pH 8. A proteína do tamanho esperado foi identificada em um gel SDS-PAGE.
Fusões NCE Albudab:
[00125]Uma fusão de uma nova entidade química (NCE) e AlbudAb foi testada. A NCE, um inibidor de ADAMTS-4 de molécula pequena, foi sintetizada com um ligador PEG (ligador PEG 4 (isto é, 4 moléculas PEG antes da maleimida) e um grupo maleimida para conjugação ao AlbudAb. A conjugação da NCE ao AlbudAb é realizada por intermédio de um resíduo de cisteína engenheirado na posição de aminoá- cido R108C, ou depois de um espaçador de 5 aminoácidos (GGGGSC) ou 6 aminoá- cidos (TVAAPSC) engenheirado na extremidade do AlbudAb. Brevemente, o AlbudAb foi reduzido com TCEP (Pierce, Catálogo Número 77720), dessalinizado usando uma coluna PD10 (GE healthcare) em Bis-Tris 25 mM, EDTA 5 mM, 10 % (v/v) de glicerol, pH 6,5. Um excesso molar de 5 vezes de NCE ativado por maleimida foi adicionado em DMSO não excedendo 10 % (V/V) da concentração final. A reação foi incubada durante a noite na temperatura ambiente e extensivamente dialisada em Tris 20 mM, pH 7,4. Ligador PEG:
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NH I Sequências: DOM7h-14 R108C: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEI KC (SEQ ID NO: 412) Nucleotídeos: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTT GGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCC TCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGA TTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGT GCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAATGC (SEQ ID NO: 413)
[00126]Veja a Tabela 5 para as sequências de DOM7h-14-10/TVAAPSC e DOM7h-14-10/GGGGSC (isto é, DOM7h-14-10/G4SC).
[00127]NCE-AlbudAbs DOM7h-14-10 GGGGSC e DOM7h14-10 TVAAPSC exibiram uma diminuição de 5 a 10 vezes na afinidade in vitro (KD) para RSA, conforme determinado por BIAcore, quando fundidos à entidade química. Os dados de PK ainda não estão disponíveis para estas moléculas.
[00128]Fusão dAb-Albudab: os 2 AlbudAbs DOM7h-11 com a maior afinidade para RSA experimentaram uma diminuição de 2 vezes na afinidade para RSA em um BIAcore quando fundidos a um anticorpo de domínio terapêutico (DOM1m-21-23) em comparação ao AlbudAb não fundido. O clone DOM7h-11 mostrou uma KD micromolar quando fundido (2,8 μM), assim como não fundido (~5 μM).
[00129]Fusão Exendina 4-AlbudAb: o efeito da fusão de AlbudAbs a um pep- tídeo na capacidade de ligação para RSA é de cerca de 10 vezes, além de DOM7h- 14-10, que mostrou apenas uma diminuição de 4 vezes na ligação. O efeito, entretanto, foi mais significante para a série DOM7h-14 (exceto DOM7h-14-10) em relação ao que parece ser para a série DOM7h-11.
[00130]Para todos os dados acima, T1/2 da fusão aumentou com a afinidade aperfeiçoada para a AS das espécies.
[00131]Em geral, foram classificados efeitos terapêuticos de Albudab como terapeuticamente suscetíveis (para o tratamento e/ou profilaxia de doenças, condições ou indicações) quando as fusões AlbudAb-fármaco mostraram uma faixa de afinidade (KD) de 0,1 nM a 10 mM para a ligação à albumina de soro.
[00132]Foram definidas as faixas terapêuticas de fusões AlbudAbs e AlbudAb (Proteína-AlbudAbs, por exemplo, IFNa2b-DOM7h-14-10; Peptídeo-AlbudAbs, por exemplo, Exendina-4-DOM7h-14-10; dAb-AlbudAbs, por exemplo, DOM1m21-23- DOM7h11-15; NCE-AlbudAb, por exemplo, ADAMTS-4-DOM7h-14-10) como segue: As faixas de afinidade (KD) que são úteis para a terapia de condições, doenças ou indicações crônicas ou agudas são mostradas. Também mostradas são as faixas de afinidade marcadas como “intermediárias”. AlbudAbs e fusões nesta faixa têm utilidade para doenças, condições ou indicações crônicas ou agudas. Deste modo, a afinidade do AlbudAb ou fusão para a albumina de soro pode ser adaptada ou escolhida, de acordo com a doença, condição ou indicação a ser tratada. Conforme descrito acima, a invenção fornece AlbudAbs com afinidades que permitem que cada AlbudAb seja classificado como “alta afinidade”, “média afinidade” ou “baixa afinidade”, garantindo assim que a pessoa habilitada selecione o AlbudAb apropriado da invenção, de acordo com a terapia em questão. Veja a Figura 2. Exemplo 9: Sequências de DOM7h-11 -15S12P Sequência de aminoácidos de DOM7h-11-15S12P DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 414)
[00133]Um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de DOM7h-11-15S12P ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80 % idêntica à dita sequência selecionada. DOM7h-11-15S12P foi produzido usando a seguinte sequência de ácidos nucleicos (a C sublinhada indica a mudança (versus o ácido nucleico que codifica DOM7h-11-15) levando a uma prolina na posição 12): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTT GGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCC GTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCG CGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC AAACGG (SEQ ID NO: 415) DOM7h-11-15S12P foi engenheirado através do uso de DOM7h-11-15 como um molde em uma PCR onde um primer foi usado para introduzir a mutação S12P. A sequência do primer é: GCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG CCTGCATCTGTAGG (SEQ ID NO: 416).
[00134]Um aspecto alternativo da invenção fornece um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 415 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80 % idêntica à dita sequência selecionada. Em uma modalidade, DOM7h-11-15S12Pé codificado por, e expressado a partir de um vetor que contém uma região ligadora e uma sequência C-terminal que codifica uma proteína ou fármaco peptídico ou um domínio variável único ou outro fragmento de anticorpo para preparar o produto de fusão de proteína in-line. O ligador, em uma modalidade, compreende a sequência de aminoácidos TVA, por exemplo, TVAAPS. Outros aspectos da invenção são um vetor que compreende o ácido nucleico e uma célula hospedeira isolada que compreende o vetor. A invenção também fornece um método de tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um paciente, o qual compreende administrar pelo menos uma dose de DOM7h-11-15S12P ao dito paciente.

Claims (11)

1. Variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) CARACTERIZADA pelo fato de que possui a SEQ ID NO: 421, em que a variante compreende uma sequência de aminoácidos da CDR1 como mostrada na SEQ ID NO: 344, uma sequência de aminoácidos da CDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 345, e uma sequência de aminoácidos da CDR3, como mostrada na SEQ ID NO: 346.
2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
3. Variante, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que possui um resíduo de cisteína engenheirado na posição do aminoácido 108.
4. Variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA) CARACTERIZADA pelo fato de que possui a SEQ ID NO: 421, em que a variante compreende uma sequência de aminoácidos da CDR1 como mostrada na SEQ ID NO: 353, uma sequência de aminoácidos da CDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 354, e uma sequência de aminoácidos da CDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 355.
5. Variante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável único de SEQ ID NO: 5.
6. Ligante multiespecífico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma variante anti-SA, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e uma porção de ligação que se liga especificamente a um antígeno alvo diferente da SA.
7. Variante de domínio variável único de imunoglobulina anti-albumina de soro (SA), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável é conjugado a um fármaco NCE.
8. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um diluente, carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
9. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 7.
10. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 10.
11. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 9 ou 10.
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