PT1737962E

PT1737962E - Sequência líder universal gas1

Info

Publication number: PT1737962E
Application number: PT05729650T
Authority: PT
Inventors: Rudolph M T De Wildt
Original assignee: Domantis Ltd
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2010-12-03
Also published as: US20070026462A1; WO2005093074A1; PL1737962T3; US7846721B2; DK1737962T3; EP1737962A1; EP2172553A1; ATE479760T1; CY1111063T1; EP1737962B1; SI1737962T1; ES2351509T3; DE602005023291D1

Description

DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIA LÍDER UNIVERSAL GAS1"

ANTECEDENTES

Os péptidos sinal de secreção auxiliam as proteínas a atravessar as em membranas celulares. Estes são utilizados por células procarióticas, tal como E. coli, e células eucarióticas. A grande maioria das proteínas de secreção não partilha uma sequência de consenso uniforme (Watson, Nucl. Acids. Res. 12:5145 (1984)). De facto, estas são bastantes divergentes. As substituições entre as sequências sinal de diferentes espécies é altamente imprevisível e normalmente resulta em secreção inconsistente entre espécies, e. g., procarióticas e eucarióticas. Poucas sequências sinal resultam em secreção eficiente em procarióticos e eucarióticos.

Existe um interesse significativo na produção de proteínas recombinantes numa forma secretada. A secreção permite a fácil recuperação da proteína recombinante de interesse a partir do meio em que é cultivada a célula hospedeira.

Rafaella et al. (Biotechnology and Applied Biotechnology (1988) 27, 81-88) divulgam a expressão de uma proteína de fusão de GAS1 com beta-galactosidase em S. cerevísiae. 0 documento WO03/068956 refere-se a métodos e composições para expressar proteínas ou polipéptidos em hospedeiros procarióticos utilizando sequências sinal eucarióticas. Vai et al. {Journal of Biological Chemistry (1991) 266, 12242-12248) divulgam o i isolamento e a sequência de aminoácidos deduzida do gene que codifica gp 115, uma proteína ancorada em glicofosfolípidos de levedura contendo uma região rica em serina. 0 documento US 6555310 refere-se a métodos de produção de uma biblioteca de apresentação de polipéptido multivalente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona composições e métodos para aumentar a secreção polipeptídica através da utilização de polipéptidos sinal de secreção. Numa forma de realização, as composições e métodos são particularmente úteis para criar uma biblioteca polipeptídica do domínio variável de imunoglobina e para a criação dos próprios anticorpos de domínio simples. A invenção refere-se ainda a moléculas polinucleotídicas compreendendo polipéptidos sinal de secreção GAS1 (SEQ ID N°: 2), particularmente polipéptidos sinal de secreção GAS1 que foram optimizados para expressão bacteriana. Uma sequência de ácido nucleico optimizada que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 é, de um modo preferido, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N° 3 ou 4.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um bacteriófago compreendendo uma molécula polinucleotídica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica, em ligação operacional: uma sequência sinal de secreção GAS1, um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina, e uma proteína de revestimento de bacteriófago. A molécula polinucleotídica pode estar operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido heterólogo.

De um modo preferido, um sitio de reconhecimento de enzima de restrição é interposto entre a sequência de ácido nucleico que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 e a sequência que codifica o domínio variável de imunoglobulina. A invenção pode utilizar uma biblioteca de moléculas polinucleotídicas, em que cada molécula da referida biblioteca compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um polipéptido sinal de secreção GAS1 que está, por sua vez, ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido heterólogo, em que o referido promotor não é um promotor de ramnose. A presente descrição também divulga uma molécula polinucleotídica compreendendo uma molécula polinucleotídica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1. 0 polinucleótido que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 está, por sua vez, ligado operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina, em que o promotor não é um promotor de ramnose.

Numa forma de realização, a sequência que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 é optimizada para expressão numa bactéria. 3

Noutra forma de realização, a sequência que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 é a sequência de SEQ ID N°: 3.

Noutra forma de realização, a sequência que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 é a sequência de SEQ ID N°: 4.

Noutra forma de realização, o polipéptido do domínio variável de imunoglobulina compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) .

Noutra forma de realização, o polipéptido do domínio variável de imunoglobulina compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) .

Noutra forma de realização, a sequência que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 está operacionalmente ligada na sua extremidade 3' a uma sequência que codifica um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina. A presente descrição divulga uma biblioteca polinucleotídica compreendendo uma multiplicidade de moléculas de ácido nucleico de utilização na invenção.

Tipicamente, as células hospedeiras são transformadas com o bacteriófago da invenção.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o péptido sinal de secreção GAS1 é um péptido sinal de secreção GAS1 de S. cerevisiae. A descrição também divulga uma molécula polinucleotídica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1, que está, por sua vez, liqado operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que codifica um único polipéptido do dominio variável de imunoglobulina.

Noutra forma de realização, a sequência que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 está ligada operacionalmente na sua extremidade 3' a uma proteína de revestimento de bacteriófago. A presente descrição divulga uma molécula polinucleotídica que codifica uma cadeia de imunoglobulina secretável, compreendendo a molécula polinucleotídica um ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um polipéptido seleccionado do grupo consistindo de uma cadeia leve de imunoglobulina, fragmento da cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina e fragmento da cadeia pesada de imunoglobulina.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago compreendendo uma molécula polinucleotídica, compreendendo o polinucleótido uma unidade de transcrição dicistrónica compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, uma extremidade 5' de cada um dos referidos domínios variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina e estando operacionalmente ligada à extremidade 3' de um ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1. 5

Numa forma de realização, o ácido nucleico que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 possui a sequência de SEQ ID N°: 3.

Noutra forma de realização, o ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção de GAS1 possui a sequência de SEQ ID N°: 4.

Noutra forma de realização, a unidade de transcrição dicistrónica está ligada operacionalmente a uma sequência promotora procariótica.

Numa forma de realização, a extremidade C-terminal do referido polipéptido do domínio variável de imunoglobulina está, por sua vez, ligada a uma proteína de revestimento de bacteriófago.

Numa outra forma de realização, o polipéptido está integrado na cápside do bacteriófago.

Noutra forma de realização, o polipéptido do domínio variável de imunoglobulina está operacionalmente ligado no seu terminal N a um péptido sinal de secreção GAS1.

Noutra forma de realização, o polipéptido do domínio variável de imunoglobulina compreende um polipéptido do domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina ligado no seu terminal N a um péptido sinal de secreção GAS1.

Ainda noutra forma de realização, o polipéptido do domínio variável de imunoglobulina compreende um polipéptido do domínio 6 variável da cadeia leve de imunoglobulina ligado no seu terminal N a um péptido sinal de secreção GAS1.

Numa forma de realização, o bacteriófago compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1, em que o referido promotor não é um promotor de ramnose.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um bacteriófago para seleccionar, a partir de um repertório de polipéptidos, um ou mais polipéptidos da região variável de imunoglobulina que se ligam a um ligando alvo, compreendendo o método: infectar as células hospedeiras com uma multiplicidade de bacteriófagos, de modo a expressar nas referidas células hospedeiras uma biblioteca polinucleotidica compreendendo uma multiplicidade de moléculas polinucleotidicas, as referidas moléculas codificando diferentes polipéptidos do domínio variável de imunoglobulina, para produzir a biblioteca polipeptídica; e colocar em contacto a biblioteca polipeptídica com o ligando alvo e seleccionar um ou mais bacteriófagos que expressam polipéptidos que se ligam ao ligando alvo. A presente especificação revela um método para seleccionar, a partir de um repertório de polipéptidos, um ou mais polipéptidos da região variável de imunoglobulina que se ligam a um ligando alvo, compreendendo o método, colocar em contacto a biblioteca polipeptídica com um ligando alvo e seleccionar um ou mais polipéptidos que se ligam ao ligando alvo. A presente descrição também divulga a utilização de um bacteriófago para identificar um polipéptido de anticorpo que se liga a um alvo desejado, compreendendo o método a introdução de / uma biblioteca polinucleotidica compreendendo uma multiplicidade de moléculas polinucleotidicas em bacteriófagos, como aqui referido acima, numa célula hospedeira, e selecção de um membro da biblioteca que codifica um polipéptido que se liga ao alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta uma comparação das sequências nucleotidicas de variantes do péptido sinal de secreção GAS1. GAS wt: A sequência que ocorre naturalmente em leveduras (SEQ ID N°: 1). A sequência do péptido lider wt é MLFKSLSKLATAAAFFAGVATA (SEQ ID N°: 2). Sequência líder GAS de E.coli: A sequência de nucleótidos de acordo com a utilização óptima de codões de E. coli (Wada et al. 1992 NAR 20 p 2111) (SEQ ID N°: 3). Sequência lider GAS AT: sequência de nucleótidos rica em AT (SEQ ID N°: 4). Todas as sequências de nucleótidos codificam a mesma sequência de aminoácidos. Cinzento claro indica nucleótidos que são semelhantes para todas as sequências. O cinzento escuro indica nucleótidos que são semelhantes à sequência wt. Branco indica nucleótidos que são diferentes da sequência wt. A Figura 2 apresenta o mapa de um vector de expressão para o vector utilizado para testar péptidos sinal. A Figura 3 apresenta os resultados de ensaios de ELISA do nivel de secreção de um dAb HEL4 expresso com diferentes sinais de secreção. A Figura 4 apresenta os níveis de expressão de dAb HEL4 com um péptido sinal GAS1, como medido por SDS-PAGE. Os dAb foram purificados a partir de sobrenadantes de culturas de 50 mL utilizando proteína A Sepharose de um modo descontínuo. Os dAb purificados foram analisados em SDS PAGE. Pista 1: péptido sinal de GAS rico em AT; Pista 2: péptido sinal de gene3 com marcador N FLAG terminal. Os níveis de expressão foram determinados utilizando DO280. Pista 1: GAS 32 mg/L; Pista 2: gene3 com marcador FLAG 14,3 mg/L. A Figura 5 apresenta a actividade específica de dAb HEL4 com um péptido sinal GAS. Os resultados apresentados são uma comparação da ligação de dAb HEL4 produzido com péptido sinal de GAS rico em AT versus péptido sinal gene3. Uma placa de ELISA foi revestida com lisozima e a os dAb ligados foram detectados utilizando o marcador VSV. Os valores indicados são médias de duas medições independentes. A Figura 6 apresenta uma medição separada da actividade específica de dAb HEL4 com um péptido sinal GAS. Os resultados apresentados são uma comparação da ligação de dAb HEL4 produzida com péptido sinal de GAS rico em AT versus péptido sinal de gene3. Uma placa de ELISA foi revestida com lisozima ou anticorpo anti-myc e os fagos ligados foram detectados utilizando o anticorpo conjugado anti-HRP de M13. A Figura 7 mostra que os dAb anti-TNF-α neutralizam a actividade citotóxica de TNF-α. Os dAb isolados TARl-53, 57 e 62 ligam-se a TNF-α especificamente e bloqueiam a ligação de TNF-α ao seu receptor TNF RI num ensaio de ligação ao 9 receptor à base de ELISA. Os dAb TAR1-53, 57 e 62 bloqueiam a actividade citotóxica de TNF-α em células L929.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições

Como aqui utilizado, "péptido sinal de secreção GAS1" refere-se ao péptido sinal de secreção da glicoproteina de superfície de S. cerevisiae GAS1 (Nueoffer et ai., 1990, Mol. Cell Biol., 11: 27-37). "Péptido sinal de secreção GAS1", como aqui utilizado, refere-se a um péptido sinal de secreção possuindo a sequência de SEQ ID N°: 2 e que é codificado pela sequência polinucleotidica de SEQ ID N°: 1, também possui sequências que são, pelo menos, 75%, 80%, 90 %, e até 99% idênticas com qualquer uma das sequências peptidicas de SEQ ID N° : 2 ou sequência polinucleotidica de SEQ ID N° : 1.

Identidade refere-se ao alinhamento óptimo de sequências (seja de nucleótidos ou aminoácidos), que podem ser realizados por implementações computorizadas de algoritmos. A identidade em relação a polinucleótidos, por exemplo, pode ser determinada por análise com BLASTN versão 2.0 utilizando os parâmetros por defeito. A identidade, com respeito aos polipéptidos (i. e., aminoácidos), pode ser determinada utilizando um programa, tal como BLASTP versão 2.2.2 com os parâmetros por defeito, que alinha os polipéptidos ou fragmentos que estão a ser comparados e determina a extensão da identidade de aminoácidos ou semelhança entre elas.

Como aqui utilizado, um "péptido sinal de secreção GAS1" também se refere a um péptido sinal de secreção que é codificado ru por uma sequência polinucleotídica GAS1 que foi optimizada para expressão em bactérias. "Optimizada", como aqui utilizado, refere-se à modificação do codão de uma sequência polinucleotídica para uma sequência de codão que é expressa em bactérias, tal como E. coli, a um nivel que é, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80% e até 100% superior a uma sequência não optimizada. Uma sequência de ácido nucleico "optimizada para A/T", de acordo com um aspecto da invenção, é uma sequência na qual os nucleótidos G ou C são mutados para um nucleótido A ou T, desde que a mutação não altere o aminoácido codificado pelo codão. Se nem um nucleótido A ou T pode ser substituído por um nucleótido G ou C numa sequência sem alterar o aminoácido, o nucleótido G ou C não é mutado para um nucleótido A ou T. Uma sequência de ácido nucleico "optimizada" que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 de acordo com a invenção é, de um modo preferido, SEQ ID N° 3 ou 4.

Como aqui utilizado, o termo "polipéptido de região variável de imunoglobulina" inclui i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) , ou seu fragmento de ligação ao antigénio, com ou sem domínios de região constante ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou seu fragmento de ligação de antigénio, com ou sem domínios de região constante iii) um polipéptido de domínio de VH ou VL sem domínios de região constante ligados a outro domínio variável (um polipéptido de domínio de VH ou VL), isto é, com ou sem domínios de região constante, (e. g., VH-VH, VH-VL, ou VL-VL) e iv) anticorpos Fv de cadeia simples (scFv), isto é, um polipéptido de domínio VL sem regiões constantes ligadas a outro polipéptido de domínio VH sem regiões constantes (VH-VL), formando os domínios variáveis, em conjunto, um sítio de ligação ao antigénio. Numa forma de realização da opção (i), (ii) ou (iii), 11 cada domínio variável forma um sítio de ligação ao antigénio independentemente de qualquer outro domínio variável. Podem ser utilizadas as opções (i) ou (ii) para formar um anticorpo de fragmento Fab ou um anticorpo Fv. Assim, como aqui utilizado, o termo "polipéptido de região variável de imunoglobulina" refere-se a anticorpos que podem conter, ou não, domínios de região constante. Adicionalmente, como aqui utilizado, o termo "polipéptido de região variável de imunoglobulina" refere-se a fragmentos de anticorpo de ligação ao antigénio, que podem conter a totalidade ou apenas uma porção das regiões constantes pesadas ou leves correspondentes. Adicionalmente, um "polipéptido de região variável de imunoglobulina", como aqui utilizado, inclui cadeia leve, cadeia pesada, cadeias leves e pesadas (e. g., scFv) , Fd (í. e., VH-CH1) ou VL-CL. Um "polipéptido de região variável de imunoglobulina" como aqui utilizado, não se refere a uma molécula de anticorpo total (e. g., IgG) compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Um "anticorpo total", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de anticorpo, em que duas cadeias pesadas são, cada uma delas, ligadas por ligações persulfureto a uma cadeia leve, e em que duas cadeias pesadas são ligadas por ligações persulfureto na região da dobra uma à outra.

Como aqui utilizado, o termo "domínio" refere-se a uma estrutura de proteína enrolada que retém a sua estrutura terciária independentemente do resto da proteína. Geralmente, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais discretas das proteínas, em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função da restante proteína e/ou do domínio. 12

Os termos equivalentes "anticorpo de domínio variável único" e "imunoglobulina de domínio variável único" referem-se a um domínio de polipéptido enrolado que compreende sequências características de domínio variável de imunoglobulinas e que se liga especificamente a um antigénio (i. e., constante de dissociação de 500 nM ou inferior) , e que liga o antigénio como um domínio variável único; isto é, sem qualquer domínio variável complementar. Um "anticorpo de domínio variável único" inclui, por isso, domínios variáveis de anticorpo completo, assim como domínios variáveis modificados, por exemplo, em que um ou mais ansas foram substituídas por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões do terminal N- ou C-, assim como fragmentos enrolados de domínios variáveis que retêm uma constante de dissociação de 500 nM ou inferior (e. g., 450 nM ou inferior, 400 nM ou inferior, 350 nM ou inferior, 300 nM ou inferior, 250 nM ou inferior, 200 nM ou inferior, 150 nM ou inferior, 100 nM ou inferior) e a especificidade de antigénio alvo do domínio de comprimento total. De um modo preferido, um domínio variável único de anticorpo útil na invenção é seleccionado do grupo de VH e VL, incluindo Vkappa e Viambda.

As frases "anticorpo de domínio variável único" e "imunoglobulina de domínio variável único" englobam não apenas um polipéptido do domínio variável único de anticorpo isolado, mas também polipéptidos maiores que compreendem um ou mais monómeros de uma sequência de polipéptido do domínio variável único de anticorpo. Um "anticorpo de domínio" ou "dAb" é equivalente a um polipéptido de "domínio variável único de anticorpo", como o termo é aqui utilizado. Um polipéptido do domínio variável único de anticorpo, como aqui utilizado, refere-se a um polipéptido de domínio único variável de imunoglobulina de mamífero, de um modo preferido humano, mas também inclui dAb de roedores ou camelídeos.

Como aqui utilizado, "biblioteca" refere-se a uma mistura de polipéptidos ou ácidos nucleicos heterogéneos contendo no intervalo de 10-1012 (e. g., 109 até 1012) diferentes membros. Cada membro compreende uma variante de polipéptido ou sequência de ácido nucleico de uma região variável de imunoglobulina.

Neste sentido, biblioteca é sinónimo de repertório. As diferenças de sequência entre membros da biblioteca são responsáveis pela diversidade presente na biblioteca. Uma "biblioteca" pode referir-se a uma mistura simples de polipéptidos ou ácidos nucleicos, ou podem ser organismos ou células, por exemplo, bactérias, vírus, células de animais ou plantas e semelhantes, transformadas com uma biblioteca de ácidos nucleicos. De um modo preferido, cada organismo individual, vírus ou célula contém apenas um membro da biblioteca. Vantajosamente, os ácidos nucleicos são incorporados em vectores de expressão, de modo a permitir a expressão dos polipéptidos codificados pelos ácidos nucleicos. Num aspecto preferido, por isso, uma "biblioteca" refere-se a uma população de organismos hospedeiros, contendo cada organismo uma ou mais cópias de um vector expressão contendo um membro único da biblioteca de ácido nucleico da qual podem ser expressos para produzir o seu membro de polipéptido correspondente. Assim, a população de organismos hospedeiros possui o potencial para codificar um vasto repertório de variantes polipéptidos geneticamente diversos.

Como aqui utilizado, um "pacote genético replicável" refere-se a uma entidade que combina o fenótipo e genótipo de 14 membros de uma biblioteca de (poli)péptidos/proteinas através da ligação da informação genética que codifica o membro de biblioteca e o (poli)péptido/proteina expresso a partir dai. A biblioteca pode ser rastreada e/ou seleccionada para uma propriedade desejada, e o (poli)péptido/proteina a ser rastreado e/ou seleccionado pode ser identificado através de informação genética associada com o mesmo. Exemplos para "pacotes genéticos replicáveis" compreendem células, tais como bactérias (documento WO 90/02809; Georgiou et al., 1993; Francisco & Georgiou, 1994; Daugherty et al., 1998), leveduras (Boder & Wittrup, 1997; Kieke et al., 1997; Cho et al., 1998; Kieke et al., 1999) células de insecto (Ernst et al., 1998), virus, tais como bacteriófagos (WO 90/02809; Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996) retrovírus (Russell et al., 1993), esporos (documento WO 90/02809), ou complexos de moléculas de ácidos nucleicos e (poli)péptidos/proteinas expressos a partir dai, tais como em complexos de ribossoma (Hanes & Pluckthun, 1997; Hanes et al., 1998; Hanes et al., 1999) ou em complexos ligados quer não covalentemente (Cull et al., 1992; Schatz, 1993; Schatz et al., 1996; Gates et al., 1996) ou covalentemente (Nemoto et al., 1997).

Como aqui utilizado, "secretável" refere-se à capacidade dos polipéptidos para serem secretados extracelularmente após a sua síntese nas células. Por exemplo, polipéptidos compreendendo o péptido sinal de secreção GAS1 são capazes de ser secretados pelo polipéptido para o periplasma de E. coli gram negativa. Um polipéptido "secretável" ou "secretado", acumula-se no espaço periplásmico de, por exemplo, um hospedeiro bacteriano, ou acumula-se no meio de cultura. Métodos para determinar se um polipéptido, e. g., um anticorpo de domínio único, é "secretável" ou "secretado" incluem, por exemplo, ELISA, como explicado no Exemplo 2, transferência de western e purificação de sobrenadantes da cultura utilizando proteína A Sepharose, com subsequente e visualização em SDS PAGE como explicado no

Exemplo 3. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos "secretáveis" podem permear membranas celulares, tais como o produto que se acumula entre 100 pg/mL e 1 g/L, e. g., 1 mg/L até 1 g/L, 1 mg/L até 50 mg/L, 1 mg/L até 100 mg/L, 1 mg/L até 150 mg/L, 1 mg/L até 200 mg/L, 1 mg/L até 250 mg/L, 1 mg/L até 300 mg/L, 1 mg/L até 350 mg/L, 1 mg/L até 400 mg/L, 1 mg/L até 450 mg/L, 1 mg/L até 500 mg/L, 1 mg/L até 550 mg/L, 1 mg/L até 600 mg/L, 1 mg/L até 650 mg/L, 1 mg/L até 700 mg/L, 1 mg/L até 750 mg/L, 1 mg/L até 800 mg/L, 1 mg/L até 850 mg/L, 1 mg/L até 900 mg/L, 1 mg/L até 950 mg/L, no sobrenadante da cultura.

Como aqui utilizado, "proteína de revestimento de bacteriófago" refere-se às proteínas de bacteriófago que proporcionam a estrutura das partículas de bacteriófago.

Exemplos não limitantes de proteínas de revestimento de bacteriófago incluem, sem limitação, Ml3 gene III, gene VIII; proteína pIII de revestimento menor de rd (Saggio et al., Gene 152:35, 1995); proteína de lambda D (Sternberg & Hoess, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:1609, 1995; Mikawa et al., J. Mol Biol. 262:21, 1996); proteína pV da cauda do fago lambda (Maruyama et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8273, 1994; Patente U.S. N° 5627024); proteína da cápside de fr (documentos W096/11947; DD 292928; DD 286817; DD 300652) ; proteína gp9 da cauda 29 (Lee, Virol. 69:5018, 1995); proteína da cápside de MS2; proteína da cápside externa pequena 1'4 (Ren et al., Protein Sei. 5:1833, 1996), proteína IPIII da estrutura da cápside não essencial de T4 (Hong e Black, Virology 194:481, 1993) ou gene da proteína da fibritina extensa de T4 (Efimov, Virus Genes 10:173, 1995); gene III de PRD-1; proteína da cápside de Q 3 lb (desde que a dimerização não interfira com ela); e proteína da ponta da cauda de P22 (Carbonell e Villaverde, Gene 176:225, 1996) .

Como aqui utilizado, uma "unidade de transcrição dicistrónica" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que permite a co-expressão de mais do que uma grelha de leitura aberta de um promotor único. Uma "unidade de transcrição" é um ácido nucleico contendo um gene que codifica uma proteína desejada, sob o controlo de um promotor adequado e possuindo todas as funções essenciais para permitir a expressão. A "unidade de transcrição dicistrónica" é uma unidade de transcrição em que dois genes estão sob o controlo do mesmo promotor. Para informação adicional sobre a "unidade de transcrição dicistrónica" ver Dirks, et ai., Gene, vol. 128, pp. 247-249 (1993). A presente invenção utiliza um polipéptido sinal de secreção de GAS1 adequado para expressão eficiente em diferentes vectores e ambos os organismos procarióticos e eucarióticos. É também proporcionado um péptido sinal de secreção que permite um transporte fácil entre fagos, bactérias, leveduras e células de mamíferos. Assim, num aspecto, a invenção refere-se a moléculas polinucleotídicas compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Superfície Ancorada a Glicofosfolípido, aqui referida como GAS1, péptido sinal de secreção. Em algumas formas de realização, o promotor não é um promotor de ramnose. Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um polinucleótido compreendendo um polipéptido sinal de secreção de GAS1 que está ligado operacionalmente a um anticorpo de domínio único.

De acordo com a invenção, os péptidos sinal de secreção de GAS1 incluem os péptidos codificados pela sequência de ácido nucleico GAS1 do tipo selvagem, encontrada em Saccharomyces cerevisiae e aqui divulgada em SEQ ID N°: 1.

Preparar Sequências de Nucleótidos de GAS1 Ricas em AT

Os ácidos nucleicos do péptido sinal de secreção GAS1 clonado do tipo selvagem (SEQ ID N°: 1) podem ser mutados para criar ácidos nucleicos ricos em AT de sinal de secreção de GAS1 (SEQ ID N°: 3 e 4) . Os ácidos nucleicos ricos em AT da presente invenção permitem a expressão optimizada em E. coli. As regiões que codificam o péptido sinal foram optimizadas de acordo com a utilizam de codão de E. coli utilizando o Vector NTI v. 7 (www.informaxinc.com) como descrito no Exemplo 2. Além disso, a utilização de codões em 5' do ARNm é importante para a expressão óptima da proteína (Tessler et al. NAR. 12:7663; Wood et al. NAR 20: 2111). De modo a codificar o melhor péptido sinal de secreção GAS1, as sequências ricas em A/T são favorecidas (Humphreys et al. 2000, Protein Expression and Purification. 20:252). Cada guanina ou citosina foi substituída por uma adenina ou uma timina se não resultou numa alteração do aminoácido.

Os métodos para criar péptidos sinal de secreção de GAS1 ricos em AT são explicados abaixo e são conhecidos outros métodos na técnica. A sequência de ácido nucleico de secreção sinal de GAS1 do tipo selvagem pode ser utilizada para preparar os ácidos nucleicos de GAS1 ricos em AT.

Num aspecto, um péptido sinal de secreção de GAS1 rico em AT pode ser preparado por modificação genética (e. g., modificando a sequência de ADN que codifica um péptido sinal de secreção de 10 GAS1 do tipo selvagem). São conhecidos vários métodos na técnica que permitem a mutação direccionada de sequências de ADN (ver, por exemplo, Ausubel et. al. Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3a Ed. John Wiley & Sons, Inc.).

Existem vários métodos de mutagénese dirigida a um sítio conhecidos na técnica que permitem mutar um sítio ou região particular de um modo linear. Existem vários kits que estão disponíveis comercialmente para o desempenho de mutagénese dirigida a um sítio, incluindo tanto métodos convencionais como à base de PCR. Exemplos úteis incluem o EXSITE™ PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit disponível a partir de Stratagene (N° de Catálogo 200502; à base de PCR) e o QUIKCHANGE™ Site-directed mutagenesis Kit da Stratagene (N° de Catálogo 200518; sem incluir PCR) e o CHAMELEON® doublestranded Site-directed mutagenesis kit, também da Stratagene (N° de Catálogo 200509).

Os métodos mais antigos de mutagénese dirigida a um sítio conhecidos na técnica baseiam-se na subclonagem da sequência a ser mutada num vector, tal como um vector de bacteriófago M13, que permite o isolamento do molde de ADN de cadeia simples. Nestes métodos foi emparelhado um iniciador mutagénico (i. e., um iniciador capaz de emparelhar com o sítio a ser mutado, mas contendo um ou nucleótidos desemparelhados no sítio a ser mutado) com o molde de cadeia simples e depois polimerizado o complemento do molde começando na extremidade 3' do iniciador mutagénico. Os duplexes resultantes foram então transformados em bactérias hospedeiras e as placas foram rastreadas para a mutação desejada.

Mais recentemente, a mutagénese dirigida a um sítio tem empregado metodologias por PCR, que têm a vantagem de não necessitar de um molde de cadeia simples. Adicionalmente, foram desenvolvidos métodos que não necessitam de subclonagem. Foram considerados vários aspectos quando foi realizada a mutagénese dirigida a um sitio com base na PCR. Em primeiro lugar, nestes métodos pode ser desejável reduzir o número de ciclos de PCR para prevenir a expansão de mutações não desejadas introduzidas pela polimerase. Em segundo lugar, pode ser empregue uma selecção de modo a reduzir o número de moléculas parentais não mutadas que persistem na reacção. Em terceiro lugar, pode ser preferido um método de PCR de comprimento expandido de modo a permitir a utilização de um único conjunto de iniciadores de PCR. E em quarto lugar, devido à actividade de extensão terminal não dependente do molde de algumas polimerases termoestáveis pode ser necessário incorporar um passo final de polimento no processo antes da ligação com extremidades rombas do produto mutante criado por PCR.

Em algumas formas de realização, um sinal de secreção de GAS1 do tipo selvagem é clonado por isolamento de ADN genómico ou ADNc, utilizando métodos de biologia molecular, para servir como um molde para mutagénese. Alternativamente, o ADN genómico ou ADNc pode ser amplificado por PCR e o produto de PCR pode ser utilizado como molde para mutagénese. 0 protocolo não limitante descrito abaixo cumpre com estas considerações através dos seguintes passos. Primeiro, a concentração de molde utilizada é de aproximadamente 1000 vezes superior do que a utilizada em reacções de PCR convencionais, permitindo uma redução no número de ciclos de 25-30 até 5-10 sem reduzir dramaticamente o rendimento do produto. Em segundo lugar, a endonuclease de restrição Dpnl (sequência alvo de reconhecimento: 5-Gm6ATC-3, em que o resíduo A é metilado) é zu utilizada para selecção contra ADN parental, uma vez que as estirpes mais comuns de E. coli Dam metilam o seu ADN na sequência 5-GATC-3. Em terceiro lugar, é utilizada Taq Extender na mistura de PCR de modo a aumentar a proporção de produtos de PCR longos (i. e., de comprimento de plasmídeo total).

Finalmente, a polimerase de ADN Pfu é utilizada para polir as extremidades do produto de PCR antes da ligação intramolecular utilizando a ligase de ADN de T4.

Um método é descrito em detalhe como se segue para mutagénese dirigida a um sitio, à base de PCR, de acordo com uma forma de realização da invenção. ADN molde de plasmídeo compreendendo um polinucleótido de sinal de secreção de GAS1 (aproximadamente 0,5 pmole) é adicionado a um cocktail de PCR contendo: tampão de mutagénese a lx (Tris HC1 a 20 mM, pH 7,5; MgCl2 a 8 mM; BSA a 40 pg/mL) ; 12-20 pmole de cada iniciador (um especialista na técnica pode sintetizar um iniciador mutagénico como necessário, tendo em consideração factores, tais como composição de bases, comprimento do iniciador e as concentrações salinas do tampão pretendidas que afectam as características de emparelhamento dos iniciadores oligonucleotídicos; um iniciador deve conter a mutação desejada na sequência que codifica a polimerase de ADN, e uma (a mesma ou a outra) deve conter um fosfato 5' para facilitar esta última ligação), 250 μΜ de cada dNTP, 2,5 U de Taq DNA polimerase, e 2,5 U de Taq Extender (Disponível em Stratagene; Ver Nielson et al. (1994) Strategies 7: 27, e

Patente U.S. N°. 5 556 772).

Os iniciadores podem ser preparados utilizando o método do triéster de Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. zi 103:3185-3191. Alternativamente, pode ser preferida a síntese automatizada, por exemplo, num Biosearch 8700 DNA Synthesizer utilizando a química da fosforoamidite de cianoetilo. A ciclagem por PCR é realizada como se segue: 1 ciclo de 4 min a 94 °C, 2 min a 50 °C e 2 min a 72 °C; seguido por 5-10 ciclos de 1 min a 94 °C, 2 min a 54 °C e 1 min a 72 °C. O ADN molde parental e o linear, ADN regenerado por PCR incorporando o iniciador mutagénico são tratados com Dpnl (10 U) e Pfu DNA polimerase (2,5 U) . Isto resulta na digestão de Dpnl do molde parental metilado in vivo e ADN híbrido e a remoção, por Pfu DNA polimerase, da(s) base(s) estendidas pela Taq DNA polimerase não dirigida pelo molde no produto linear de PCR. A reacção é incubada a 37 °C durante 30 min e depois transferida para 72 °C durante mais 30 min. O tampão de mutagénese (115 pL de lx) contendo 0,5 mM de ATP é adicionado aos produtos de PCT polidos com Pfu DNA polimerase, digeridos com Dpnl. A solução é misturada e são removidos 10 pL para um novo tubo de microcentrífuga e é adicionada T4 DNA ligase (2-4 U) . A ligação é incubada durante mais de 60 min a 37 °C. Finalmente, a solução tratada é transformada em E. coli competente de acordo com métodos convencionais.

Pode ser utilizado um iniciador oligonucleotídico degenerado para criar os nucleótidos de sinal de secreção de GAS1 enriquecido em AT da presente invenção. Em algumas formas de realização, a síntese química de um iniciador degenerado é realizada num sintetizador de ADN automático, e o objectivo de um iniciador degenerado é proporcionar, numa mistura, a totalidade das sequências que codificam um sítio de mutação específica desejado da sequência da DNA polimerase. A síntese de oligonucleótidos degenerados é bem conhecida na técnica (e. g.,

Narang, S. A, Tetrahedron 39:3 9, 1983; Itakura et al.,

Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromol., Walton, ed., Elsevier, Amsterdam, pp 273-289, 1981; Itakura et al.,

Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura et al., Science 198:1056, 1984; e Ike et al., Nucleic Acids Res. 11:477 1983).

Essas técnicas foram empregues na evolução dirigida de outras proteínas (e. g., Scott et al., Science 249:386-390, 1980;

Roberts et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei., 89:2429-2433, 1992;

Devlin et al., Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei., 87: 6378-6382, 1990; assim como as Patentes U.S. N° 5223409, 5198346 e 5096815, sendo cada uma delas aqui incorporada por referência).

Os polinucleótidos que codificam os péptidos sinal de GAS1 enriquecidos em AT desejados criados por mutagénese podem ser sequenciados para identificar as mutações. Para estes mutantes compreendendo mais do que uma mutação, o efeito de uma dada mutação pode ser avaliado pela introdução da mutação identificada no gene do tipo selvagem por mutagénese dirigida a um sitio em isolamento a partir de outras mutações originadas a partir do mutante particular. Ensaios de rastreio do mutante único assim produzido irá então permitir a determinação do efeito dessa mutação isoladamente.

Numa forma de realização preferida, o péptido sinal de GAS1 enriquecido em AT é derivado a partir de uma S. cereviseae (SEQ ID N°:1).

Numa forma de realização preferida, o péptido sinal da GAS1 enriquecido em AT é codificado pelo ácido nucleico de SEQ ID N°:3 ou 4.

Uma descrição detalhada da clonagem de S. cereviseae da proteína GAS1 pode ser encontrada em Nuoffer et al. Molecular and Cellular Biology; 11:27 (1991).

Um especialista na técnica possuindo o benefício desta descrição irá reconhecer que os péptidos sinal de secreção de GAS1 e semelhantes podem ser utilizados adequadamente na presente invenção.

Proteínas de revestimento de bacteriófago:

Na presente invenção, podem ser utilizados vários sistemas de bacteriófago e proteínas de revestimento de bacteriófago. Exemplos de proteínas de revestimento de bacteriófago adequados incluem, sem limitação, gene III de M13, gene VIII; proteína pIII de cápside menor de rd (Saggio et al., Gene 152:35, 1995); proteína D de lambda (Stemberg & Hoess, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:1609, 1995; Mikawa et al., J. Mol Biol. 262:21, 1996); proteína pV da cauda do fago lambda (Maruyama et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 91:8273, 1994; Patente U.S. N° 5627024); proteína da cápside de fr (documentos W096/1194; DD 292928; DD 286817; DD 300652); proteína gp9 da cauda de Φ29 (Lee, Virol. 69:5018, 1995); proteína da cápside de MS2; proteína da cápside externa pequena de T4 (Ren et al., Protein Sei. 5: 1833, 1996), proteína IPIII de estrutura da cápside não essencial de T4 (Hong e Black, Virology 194:481, 1993) ou gene da proteína fibritina estendida de T4 (Efimov, Virus Genes 10:173, 1995); gene III de PRD-1; proteína da cápside de ζ)β3 (desde que a dimerização não interfira com ela); e a proteína da ponta da cauda de P22 (Carbonell e Villaverde, Gene 176:225, 1996). São bem conhecidas técnicas para inserir sequência codificante estranha num gene de fago (ver e. g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., NY, 1995).

Num aspecto preferido, é utilizada uma proteína de revestimento de bacteriófago filamentosa. Estão disponíveis comercialmente muitos vectores de bacteriófagos filamentosos que podem permitir a ligação em grelha do péptido sinal-marcador-polipéptido de região variável da proteína de fusão da imunoglobulina com uma proteína de revestimento de bacteriófago. Os vectores mais comuns aceitam inserções de ADN para fusões em grelha com o gene III ou gene VIII. Exemplos não limitantes de vectores adequados incluem, vectores M13mp (Pharmacia Biotech), pCANTAB 5e (Pharmacia Biotech), pC0MB3 e M13KE (New England Biolabs), série pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Deve ser entendido que estes vectores já contêm sequências de péptido sinal de bacteriófago e que, cada vector, pode ser modificado para conter uma sequência de péptido sinal de bacteriófago de interesse através de métodos bem conhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, N.Y., 1995.

Vectores: A presente invenção compreende moléculas polinucleotídicas que são clonadas num vector, de modo a que a molécula polinucleotídica esteja ligada funcionalmente a um promotor que 25 é funcional num procariota e num péptido sinal de secreção de GAS1.

Para os aspectos aqui descritos, podem ser utilizados tanto vectores fagemidicos como não fagemidicos. Como aqui utilizado, vector refere-se a um elemento discreto que é utilizado para introduzir ADN heterólogo nas células para a sua expressão e/ou replicação. Métodos pelos quais se pode seleccionar ou construir e, subsequentemente, utilizar esses vectores são bem conhecidos de um especialista na técnica. Estão disponíveis ao público e podem ser empregues numerosos vectores, incluindo plasmídeos bacterianos, bacteriófago, cromossomas artificiais, vectores epissómicos e vectores de expressão genética. Um vector de utilização de acordo com a invenção pode ser seleccionado para acomodar uma sequência codificante de um polipéptido de um tamanho desejado. Uma célula hospedeira adequada é transformada com o vector após manipulações de clonagem in vitro. As células hospedeiras podem ser procarióticas, tais como qualquer uma de várias estripes bacterianas, ou podem ser eucarióticas, tais como células de leveduras ou de outros fungos, células de insectos ou de anfíbios, ou células de mamíferos incluindo, por exemplo, células de roedores, símios ou humanos. Cada vector contém vários componentes funcionais, que geralmente incluem um sítio de clonagem (ou "polylinker"), uma origem de replicação e pelo menos um gene marcador de selecção. Se o dado vector é um vector de expressão, possui adicionalmente um ou mais dos seguintes: elemento intensificador, promotor, sequências de transcrição terminação e sinal, cada uma posicionada na vizinhança do sítio de clonagem, de modo a que estejam ligados operacionalmente ao gene que codifica um membro do repertório de polipéptidos de acordo com a invenção. Z b

Ambos os vectores de clonagem e de expressão contêm geralmente sequências de ácido nucleico que permitem que o vector se replique em uma ou mais células hospedeiras seleccionadas. Tipicamente em vectores de clonagem, esta sequência é uma que permite que o vector se replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Essas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e virus. Por exemplo, a origem de replicação do plasmideo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmideo de 2 micron é adequada para leveduras e várias origens virais (e. g. SV 40, adenovirus) são úteis para a clonagem de vectores em células de mamíferos. Geralmente, a origem de replicação não é necessária para vectores de expressão de mamíferos a menos que estes sejam utilizados em células de mamíferos capazes de replicar níveis elevados de ADN, tais como células COS.

Vantajosamente, um vector de clonagem ou de expressão pode conter um gene de selecção também referido como um marcador de selecção. Este gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou cultura de células hospedeiras transformadas cultivadas num meio de cultura selectiva. As células hospedeiras não transformadas com o vector que contêm o gene de selecção não sobreviverão, por isso, no meio de cultura. Genes de selecção típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos e outras toxinas, e. g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiências auxotróficas complementares ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis no meio de cultura. 27

Uma vez que a replicação de vectores de acordo com a presente invenção é realizada mais convenientemente em E. coli (e. g., estirpe TB1 ou TG1) , um marcador de selecção de E. coli, por exemplo, o gene da lactamase que confere resistência ao antibiótico ampicilina, é útil. Estes podem ser obtidos a partir de plasmideos de E. coli, tais como pBR322 ou um plasmideo pUC, tal como pUC18 ou pUC19 ou pUC119.

Vectores bacterianos particulares que podem ser utilizados incluem os plasmideos comercialmente disponíveis compreendendo elementos genéticos do vector de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pDIO, phiX174, pBluescript™ II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Vectores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Todavia, qualquer outro vector pode ser utilizado, desde que seja replicável e estável na célula hospedeira. A célula hospedeira pode ser qualquer uma das células hospedeiras familiares dos especialistas na técnica, incluindo células procarióticas ou células eucarióticas. Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces lividans, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces ambofaciens, Bacillus subrilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dos géneros Pseudmonas, Streptomyces, Bacillus e Staphylococcus, células de fungos, tais como leveduras, células de insecto, tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, células animais, tais como CHO, COS ou melanoma de Bowes, e adenovírus. A selecção do hospedeiro apropriado está dentro das capacidades dos especialistas na técnica.

Os vectores de expressão contêm normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operacionalmente à sequência codificante de interesse. Um tal promotor pode ser indutível ou constitutivo. 0 termo "ligado operacionalmente" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Uma sequência de controlo "operacionalmente ligada" a uma sequência codificante é ligada de modo que a expressão da sequência codificante é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controlo.

Promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem, por exemplo, os sistemas de promotor da β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, o sistema de promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac. Adicionalmente, os promotores podem incluir, por exemplo, os promotores PR ou PL do fago lambda, promotores do bacteriófago T7, T3, Sp6, promotor da protease alcalina de B. subtilis, e o promotor da amilase maltogénica de B. stearothermophílus, etc. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos irão também conter geralmente uma sequência de Shine-Delgarno ligada operacionalmente à sequência codificante.

Para promotores funcionais em sistemas eucarióticos, existem, por exemplo, promotores de leveduras, tais como GAL1, GAL4 e outros promotores do gene glicolítico (ver, por exemplo, Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 12073-12080; Alber & Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434), promotor LEU2 (Martinez-Garcia et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 217: 464-470), promotores do gene da álcool desidrogenase (Young et al., 1982, em "Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals", Hollaender et al., eds., Plenum Press, NI), ou o promotor TPIl (Patente U.S. N° 4599311); promotores de insectos, tais como o promotor poliedrina (Pat. U.S. N° 4745051; Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311: 7-11), o promotor PIO (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol. 69: 765-776), o promotor da proteína básica do vírus da poliedrose de Autographa californica (documento EP 397485) , o promotor do gene 1 do promotor do gene precoce imediato de baculovírus (Pat. U.S. N° 5155037 e 5162222), o promotor do gene precoce retardado de baculovírus 39K (também Pat. U.S. N°s. 5 155 037 e 5 162 222) e o promotor 2 precoce imediato de OpMNPV; promotores de mamíferos - o promotor SV40 (Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 854-864), promotor da metalotioneina (MT-1; Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814), promotor tardio principal do adenovírus 2 (Yu et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 9309-21), e promotor de citomegalovírus (CMV) (Tong et al., 1998, Anticancer Res. 18: 719-725), entre outros.

Um promotor funcional seleccionado em células eucarióticas ou procarióticas também pode estar ligado a sequências que o tornam indutível ou específico para o tecido. Por exemplo, a adição de um elemento intensificador específico para o tecido, a montante de um promotor seleccionado, pode tornar o promotor mais activo num dado tecido ou tipo celular. Alternativamente, ou adicionalmente, a expressão indutível pode ser alcançada através da ligação do promotor a qualquer um de vários elementos de sequência que permitem a indução através de, por exemplo, alterações térmicas (sensíveis à temperatura), tratamento químico (por exemplo, indutível por ião metálico ou IPTG) ou a 30 adição de um antibiótico ou outro agente de indução (por exemplo, tetraciclina).

Num aspecto preferido, um sistema de vector de bacteriófago filamentoso é utilizado para expressão da proteína de fusão do polipéptido, de modo a que as proteínas sejam incorporadas no bacteriófago para apresentação na superfície externa da partícula de bacteriófago. Muitos vectores de bacteriófago filamentoso (vectores fágicos) estão comercialmente disponíveis para utilização, que permitem a ligação em grelha do ADN que codifica o polipéptido de região variável da proteína de fusão da imunoglobulina a uma proteína de revestimento de bacteriófago. Os vectores mais comuns aceitam inserções de ADN para fusões em grelha com as proteínas de revestimento de bacteriófago M13 do gene III ou do gene VIII, como referido acima. Exemplos não limitantes de vectores de bacteriófago adequados incluem, vectores M13mp (Pharmacia Biotech), pCANTAB 5e (Pharmacia Biotech), pC0MB3 e M13KE (New England Biolabs) e outros, como descritos no documento WO 00/29555. Deve ser entendido que estes vectores já contêm as sequências do péptido sinal de secreção do bacteriófago e que, cada um destes vectores, pode ser modificado para conter a sequência do péptido sinal de secreção de GAS1 através de métodos bem conhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Y, 1995).

Num aspecto, existe um sítio de reconhecimento de enzima de restrição interposto entre a sequência de ácido nucleico que codifica um péptido sinal de secreção GAS1 e a sequência que codifica um polipéptido de interesse, e. g., um polipéptido de anticorpo. As endonucleases de restrição e os seus sítios de reconhecimento são bem conhecidos dos especialistas na técnica. É descrita uma larga variedade de endonucleases de restrição, reconhecendo uma variedade de diferentes sítios de restrição em, por exemplo, o catálogo da New England Biolabs (edição de 2004) .

Noutro aspecto, uma construção de ácido nucleico, como aqui descrita, compreende um arranjo de gene dicistrónico - i. e., um arranjo no qual uma molécula de ARNm única codifica dois polipéptidos separados em duas regiões codificantes separadas. 0 arranjo do gene discistrónico preferido compreende ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, estando cada um destes domínios operacionalmente ligado na sua extremidade 5' à extremidade 3' de um péptido sinal de secreção de GAS1. Embora seja relativamente pouco comum em sistemas eucarióticas, os arranjos de codificação dicistrónicos são comuns em sistemas procarióticos. A preparação de uma construção dicistrónica é linear, assim que se tenha disponível uma sequência codificante individual, sendo apenas necessárias técnicas de clonagem convencionais. Assim, uma ordem de sequências para uma construção dicistrónica como aqui divulgada é como se segue: promotor-sequência sinal-polipéptido 1-sequência sinal-polipéptido 2. Como referido, é preferido que ambas as sequências sinal sejam uma sequência sinal de GAS1, embora possa ser utilizada outra sequência sinal para uma das sequências sinal, se desejado. Num arranjo alternativo, a segunda sequência sinal é interna em relação à segunda sequência de polipéptido.

Construção de Bibliotecas:

Um aspecto envolve a criação de bibliotecas de polipéptidos e ácidos nucleicos contendo diversos polipéptidos expressos como fusões de uma sequência sinal de secreção GAS1, como aqui descrito. Como aqui utilizado, o termo "biblioteca" refere-se a uma mistura de polipéptidos ou ácidos nucleicos heterogéneos. A biblioteca é composta por membros, uma multiplicidade dos quais possui uma sequência de polipéptido ou ácido nucleico único. Neste sentido, biblioteca é sinónimo de repertório. Diferenças de sequência entre os membros da biblioteca são responsáveis pela diversidade presente na biblioteca. A biblioteca pode tomar a forma de uma mistura simples de polipéptidos ou ácidos nucleicos, ou pode estar na forma de organismos ou células, por exemplo, bactérias, vírus, células animal ou vegetais e semelhantes, transformadas com uma biblioteca de ácidos nucleicos. Tipicamente, cada organismo ou célula individual contém apenas um membro da biblioteca. Em certos pedidos, cada organismo ou célula individual pode conter dois ou mais membros da biblioteca. Vantajosamente, os ácidos nucleicos são incorporados em vectores de expressão, de modo a permitir a expressão dos polipéptidos codificados pelos ácidos nucleicos. Num aspecto preferido, por isso, uma biblioteca pode tomar a forma de uma população de organismos hospedeiros, contendo cada organismo uma ou mais cópias de um vector de expressão contendo um único membro da biblioteca na forma de ácido nucleico que pode ser expressa para produzir o seu membro de polipéptido correspondente. Assim, a população de organismos hospedeiros possui o potencial para codificar um vasto repertório de variantes de polipéptido geneticamente diversas. 33

De particular utilização na construção de bibliotecas são sistemas de apresentação de selecção, que permitem que um ácido nucleico seja liqado ao polipéptido que expressa. Um sistema de apresentação de selecção é um sistema que permite a selecção, por meios de apresentação adequados, dos membros individuais da biblioteca.

Qualquer sistema de apresentação de selecção pode ser utilizado em conjunção com uma biblioteca como aqui descrito. Por exemplo, as proteínas de fusão de polipéptido como aqui descrito podem ser apresentadas em cápsides de fago lambda (corpos fágicos) . Sistemas de selecção preferidos da invenção são os sistemas de bacteriófago filamentosos. Os protocolos de selecção para isolar os membros desejados das bibliotecas fágicas são conhecidos na técnica, como tipificado por técnicas de apresentação de fagos. Uma vantagem de sistemas de apresentação à base de fagos é que, porque são sistemas biológicos, os membros da biblioteca seleccionados podem ser simplesmente amplificados através da cultura de fagos contendo o membro da biblioteca seleccionado, em células bacterianas. Além disso, devido à sequência de nucleótidos que codifica o membro da biblioteca polipeptídica estar contido num fago ou vector fágico, a sequenciação, expressão e subsequente manipulação genética é relativamente directa.

Os métodos para a construção de bibliotecas de exposição de anticorpo em bacteriófagos e bibliotecas de expressão do fago lambda são bem conhecidos na técnica (McCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990; Kang et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 88: 11120-11123, 1991; Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Lowman et al., Biochemistry, 30:10832-10838, 1991; Burton et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 88:10134-10137, 1991;

Hoogenboom et al, Nucleic Acid Res., 19:4133-4137, 1991; Chang et al., J. Immunol., 147:3610-3614, 1991; Breitling et al., Gene, 104:147-153, 1991; Marks et al., J. Biol. Chem., 267:16007-16010, 1991; Barbas et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 89:10164-10168, 1992; Hawkins & Winter, Eur. J. Immunol., 22:867-870, 1992; Marks et al., J. Biol. Chem., 267:16007-16010, 1992; Lerner et al., Science, 258: 1313-1314, 1992). Resumidamente, os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão de polipéptido da região variável de imunoglobulina são clonados num vector de fago que compreende um sinal de empacotamento de bacteriófago e um gene que codifica, pelo menos, uma proteína de revestimento de bacteriófago como aqui descrito ou como conhecido na técnica, que permite a incorporação do ácido nucleico numa partícula de fago.

Outros sistemas para produção de bibliotecas de polipéptidos ou polinucleótidos envolvem a utilização da maquinaria enzimática isenta de células para a síntese in vitro dos membros da biblioteca. Por exemplo, a tradução in vitro pode ser utilizada para sintetizar polipéptidos como num método para a produção de grandes bibliotecas. Estes métodos são ainda descritos nos documentos WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, W091/02076, W091/05058 e WO92/02536. Os sistemas de apresentação alternativos que não são baseados em fago, tais como os revelados nos documentos W095/22625 e W095/11922 (Affymax), utilizam os polissomas para apresentar polipéptidos para selecção.

Os métodos de produzir bibliotecas diversas de polipéptidos de proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o documento U.S. 6696245 descreve a produção de bibliotecas diversas de polipéptidos de anticorpo. Os métodos aqui descritos envolvem geralmente a randomização de regiões seleccionadas de regiões de codificação do gene de imunoglobulinas, em particular as regiões codificantes VH e VL, enquanto deixa outras regiões não randomizadas. A patente '245 também descreve a produção de construções de scFv compreendendo domínios VH e VL individualmente randomizados.

As bibliotecas de domínio variável de imunoglobulina podem vantajosamente ser concebidas para ter, como base, uma conformação de cadeia principal pré-determinada. Estas bibliotecas podem ser construídas como descrito no Pedido Internacional de Patente WO 99/20749. Deste modo, num aspecto, um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina ou anticorpo de domínio único em fusão com um péptido sinal de secreção GAS1 compreende um polipéptido da região variável da cadeia pesada de anticorpo ou anticorpo de domínio único compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) ou um seu fragmento de ligação de antigénio, compreendendo a sequência de aminoácidos do segmento DP-47 da VH da linha germinal. Noutro aspecto, um polipéptido da região variável de imunoglobulina ou anticorpo de domínio único em fusão com um polipéptido sinal de secreção GAS1 compreende um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (Vl) ou um seu fragmento de ligação a antigénio, que compreende a sequência de aminoácidos do segmento DPK9 de VK da linha germinal. Estes polipéptidos da região variável podem ser utilizados para a produção de scFv ou Fab, e. g., um scFv ou Fab compreendendo (i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) , ou um seu fragmento de ligação a antigénio, que compreende a sequência de aminoácidos do segmento DP-47 da VH da linha germinal e (ii) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou um seu fragmento de 36 ligação a antigénio, que compreende a sequência de aminoácidos do segmento DPK9 da VK da linha germinal.

Introdução de vectores em células hospedeiras:

As construções de vector ou bibliotecas de construção de vector contendo moléculas polinucleotidicas como aqui descrito podem ser introduzidas em células hospedeiras seleccionadas por qualquer dos vários métodos adequados conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, as construções de vector podem ser introduzidas em células bacterianas apropriadas por infecção, no caso de partículas de vector de bacteriófago, tais como lambda ou M13, ou por qualquer dos vários métodos de transformação para vectores de plasmídeo ou para ADN de bacteriófago. Por exemplo, a transformação bacteriana convencional mediada por cloreto de cálcio é, ainda, normalmente utilizada para introduzir ADN simples em bactérias (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) , mas a electroporação pode também ser utilizada (Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Inc., NI, NI)).

Para a introdução de construções de vector em leveduras ou outras células de fungo, os métodos químicos de transformação são geralmente utilizados (e. g. como descrito por Rose et al., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) . Para a transformação de S. cerevisiae, por exemplo, as células são tratadas com acetato de lítio para conseguir eficiências de transformação de aproximadamente 104 unidades formadoras de colónias (células transformadas)/yg de ADN. As células transformadas são depois isoladas em meio selectivo apropriado para o marcador seleccionável utilizado. Alternativamente, ou adicionalmente, quando o vector codifica GFP como um marcador, as placas ou filtros levantados das placas podem ser visualizados quanto à fluorescência de GFP para identificar clones transformados.

Para a introdução de vectores em células de mamífero, o método utilizado dependerá da forma do vector. Os vectores plasmídicos podem ser introduzidos por qualquer um de vários métodos de transfecção, incluindo, por exemplo, transfecção mediada por lípidos ("lipofecção"), transfecção mediada por DEAE-dextrano, electroporação ou precipitação de fosfato de cálcio. Estes métodos são detalhados, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et ai., 1988, John Wiley & Sons, Inc., NI, NI).

Os reagentes e métodos de lipofecção adequados para a transfecção transiente de uma vasta variedade de células transformadas e não transformadas ou primárias estão largamente disponíveis, tornando a lipofecção um método atractivo de introdução de construções em eucarióticos e, particularmente, em células de mamífero em cultura. Por exemplo, estão disponíveis os kits de LipofectAMINE™ (Life Technologies) ou LipoTaxiTM (Stratagene) . Outras companhias que oferecem reagentes e métodos para lipofecção incluem Bio-Rad Laboratories, CLONTECH, Glen Research, InVitrogen, JBL Scientific, MBI Ferments, PanVera, Promega, Quantum Biotechnologies, Sigma-Aldrich, e Wako Chemicals USA.

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Polipéptidos de Anticorpo: A molécula polinucleotídica ligada a uma sequência que codifica o péptido sinal de secreção GASl-que codifica um polipéptido de anticorpo. Os anticorpos convencionais são moléculas grandes de proteína de multi-subunidades compreendendo, pelo menos, quatro cadeias de polipéptido. Por exemplo, a IgG humana possui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves que são ligadas por persulfureto para formar o anticorpo funcional. 0 tamanho de uma IgG convencional é cerca de 150 kD. Enquanto os anticorpos convencionais são muito úteis, foram efectuados esforços consideráveis na identificação e produção de pequenos fragmentos de anticorpo que retêm a função de ligação ao antigénio e solubilidade.

As cadeias de polipéptido pesada e leve de anticorpos compreendem regiões variáveis (V) que participam directamente em interacções de antigénio e regiões constantes (C) que proporcionam o suporte e função estrutural em interacções específicas para antigénio com efectores imunitários. O domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo convencional é constituído por dois domínios separados: um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL: que pode ser VK ou VÀ) . O sítio de ligação ao próprio antigénio é formada por seis ansas de polipéptido: três domínios do domínio VH (Hl, H2 e H3) e três do domínio VL (Ll, L2 e L3) . In vivo, um repertório de genes V primários diversos que codificam os domínios VH e VL são produzidos pelo rearranjo combinatória de segmentos de gene. As regiões C incluem as regiões C da cadeia leve (referidas como regiões Cl) e as regiões C de cadeia pesada (referidas como regiões CH1, CH2 e CH3) . Vários pequenos fragmentos de ligação ao antigénio de anticorpos que ocorrem naturalmente foram identificados após digestão com protease. Estes incluem, por exemplo, o "fragmento Fab" (Vl-Cl-CHi-Vh) , "fragmento Fab'" (um Fab com a região de charneira da cadeia pesada) e "fragmento F(ab')2" (um dimero de fragmentos Fab' ligado pela região de charneira da cadeia pesada). Foram utilizados métodos recombinantes para produzir fragmentos de ligação ao antigénio ainda mais pequenos, referidos como "Fv de cadeia simples" (fragmento variável) ou "scFv," consistindo em VL e VH ligado por um ligante péptido sintético. A tecnologia de exposição em fagos (ver, e. g., Smith, 1985, Science 228: 1315; Scott & Smith, 1990, Science 249: 386;

McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552) proporciona uma abordagem para a selecção de polipéptidos de anticorpo que se ligam ao alvo desejado a partir de repertórios vastos e diferentes de polipéptidos de anticorpo. Estas bibliotecas fago-anticorpo podem ser agrupadas em duas categorias: bibliotecas naturais que utilizam genes V rearranjados recolhidos a partir de células B humanas (Marks et ai., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech., 14: 309) ou as bibliotecas sintéticas em que os segmentos do gene V da linha germinal são "rearranjadas" in vitro (Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol., 248: 97) ou em que os CDR sintéticos são incorporados num gene V único rearranjado (Barbas et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4457) . Mais frequentemente, os polipéptidos de anticorpo apresentados no fago compreendem fragmentos de ligação a antigénio, em vez das moléculas de anticorpo convencionais. Como notado acima, estes fragmentos incluem, por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve, dimero cadeia pesada-cadeia leve, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um scFv ou domínio variável de imunoglobulinas único (ver a seguir) . Os métodos para a preparação das bibliotecas de exposição em fagos que apresentam vários fragmentos de anticorpo são conhecidos dos especialistas na técnica. Estes métodos são também descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 6696245.

Enquanto a unidade de ligação ao antigénio de um anticorpo que ocorre naturalmente (e. g., em humanos e maioria de outros mamíferos) é geralmente conhecida como sendo constituída por um par de regiões V (VL/VH), as espécies camelídeas expressam uma grande proporção totalmente funcional, de anticorpos altamente específicos que não possuem sequências de cadeia leve. Os anticorpos camelídeos de cadeia pesada são encontrados como homodímeros de uma cadeia pesada única, dimerizada através das suas regiões constantes. Os domínios variáveis destes anticorpos camelídeos de cadeia pesada são referidos como domínios VhH e retêm a capacidade, quando isolados como fragmentos da cadeia VH, para se ligarem ao antigénio com elevada especificidade ((Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Os domínios VH únicos de ligação ao antigénio foram também identificados em, por exemplo, uma biblioteca de genes VH de muríneo amplifificados a partir de ADN genómico a partir de baços de murganhos imunizados e expressos em E. coli (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Ward et al. denominaram os domínios únicos VH isolados "dAb" , para "anticorpos de domínios". 0 termo "dAb" refere-se aqui a um polipéptido de domínio variável de imunoglobulina único(VH ou VL) que se liga especificamente ao antigénio. Um "dAb" liga-se ao antigénio independentemente de outros domínios V; no entanto, um "dAb" pode estar presente num homo- ou heteromultímero com outros domínios VH ou VL quando os outros domínios não são necessários para a ligação ao antigénio pelo dAb, í. e., quando dAb se liga ao antigénio independentemente dos domínios VH ou VL adicionais. A preparação do domínio variável único de imunoglobulinas é descrita abaixo.

Um domínio variável de imunoglobulina único é um domínio de polipéptido organizado que compreende sequências características de domínio variável de imunoglobulinas e que se ligam especificamente a um antigénio (i. e., constante de dissociação de 500 nM ou inferior) e que se liga ao antigénio como um domínio variável único; ou seja é, sem qualquer domínio variável complementar. Um domínio variável de anticorpo único inclui, deste modo, domínios variáveis de anticorpo completo, assim como domínios variáveis modificados, por exemplo, em que uma ou mais voltas foram substituídas por sequências que não são características dos domínios variáveis de anticorpo ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões N- ou C-terminais, assim como fragmentos organizados de domínios variáveis que retêm uma constante de dissociação de 500 nM ou inferior (e. g., 450 nM ou inferior, 400 nM ou inferior, 350 nM ou inferior, 300 nM ou inferior, 250 nM ou inferior, 200 nM ou inferior, 150 nM ou inferior, 100 nM ou inferior) e a especificidade do antigénio alvo do domínio de comprimento total. De um modo preferido, o domínio variável de anticorpo único útil na invenção, é seleccionado do grupo VH e Vl, incluindo Vkappa e

Os domínios variáveis únicos de imunoglobulinas são preparados de vários modos. Para cada uma destas abordagens, métodos bem conhecidos de preparação (e. g., amplificação, mutação, etc.) e manipulação de sequências de ácido nucleico são aplicáveis.

Uma abordagem é amplificar e expressar a região VH ou VL de um gene de cadeia pesada ou de cadeia leve para um anticorpo clonados conhecido por se ligar ao antigénio desejado. Os flancos dos domínios VH e VL, assim como outros dominios de polipéptido de anticorpo, são apresentados por Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5a ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. A informação relacionada com os flancos dos domínio VH e VL dos genes das cadeias pesada e leve é utilizada para conceber iniciadores de PCR que amplificam o domínio V a partir de uma sequência codificante de cadeia pesada ou leve clonada, que codifica um anticorpo conhecido por se ligar a um determinado antigénio. 0 domínio V amplificado é inserido num vector de expressão adequado, e. g., pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 4133-4137) e expresso, isoladamente ou como fusão com outra sequência de polipéptido. É preferido, como aqui descrito, que o domínio V (ou qualquer outro domínio de anticorpo) seja expresso como uma fusão com uma sequência sinal do polipéptido GAS1. 0 domínio VH ou VL expresso é depois seleccionado pela sua afinidade de ligação ao antigénio desejado em isolamento em relação com o restante polipéptido da cadeia pesada ou leve. Por todos os aspectos da presente invenção, a pesquisa para a ligação é efectuada como conhecido na técnica ou como aqui a seguir descrito.

Um repertório de domínios VH ou VL expostos em fago é pesquisado por bioselecção contra o antigénio desejado. Os métodos para a construção de bibliotecas de exposição em bacteriófagos e bibliotecas de expressam em fago lambda são bem conhecidas na técnica, e apresentadas por, por exemplo:

McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et ai., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 4133; Chang et al. ,1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104: 147; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 4457; Hawkins e Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; e Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313. as bibliotecas de scFv em fago são apresentadas, por exemplo, por Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, supra; Clackson et al., 1991, supra; Marks et al., 1991, supra; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10:80; e Marks et al., 1992, supra. Várias formas de realização de bibliotecas de scFv expostas em proteína de revestimento de bacteriófagos foram descritas. Os refinamentos da abordagem da exposição em fago são também conhecidas, por exemplo como descrito nos documentos WO96/06213 e WO92/01047 (Medicai Research Council et al.) e WO97/08320 (Morphosys, supra) .

Como se nota, o repertório dos domínios VH ou VL pode ser um repertório de sequências de imunoglobulinas que ocorre naturalmente ou um repertório sintético. Um repertório que ocorre naturalmente é um preparado, por exemplo, a partir de células que expressam imunoglobulinas recolhidas a partir de um ou mais animais, incluindo humanos. Estes repertórios podem ser "naíve", i. e., preparados, por exemplo, a partir de células que expressam imunoglobulinas humanas fetais ou de recém nascidos, ou rearranjadas, i. e., preparadas a partir de, por exemplo, células B humanos de adulto. Os repertórios naturais são descritos, por exemplo, por Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 e Vaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14: 309. Se desejado, os clones identificados a partir de um repertório natural ou de qualquer repertório, para essa questão, que se ligam ao antigénio alvo, são depois sujeitos a mutagénese e posteriormente pesquisados de modo a produzir e seleccionar variantes com caracteristicas de ligação melhoradas.

Os repertórios sintéticos de domínio variável de imunoglobulinas simples são preparados por introdução artificial de diversidade num domínio V clonado. Os repertórios sintéticos são descritos, por exemplo, por Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; e documento WO 99/20749.

Em um aspecto; os repertórios sintéticos de domínios variáveis podem ser preparados em ambientes de VH ou Vk, com base em sequências de VH ou Vk de uma linha germinal artificialmente diversificada. Por exemplo, o repertório do domínio VH é baseado nos segmentos V3-23/DP47 do gene de VH da linha germinal clonados (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768) e JH4b. O repertório do domínio VK é baseado, por exemplo, nos segmentos O2/012/DPK do gene VK da linha germinal (Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) e JK1. A diversidade é introduzida nestes ou noutros segmentos de gene, por exemplo, por mutagénese por PCR. A diversidade pode ser aleatoriamente introduzida, por exemplo, por erros de PCR (Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) ou mutagénese química. Como discutido acima, é no

entanto preferido que a introdução de diversidade seja dirigida para resíduos particulares. É ainda preferido que os resíduos desejados sejam alvo pela introdução do codão NNK utilizando iniciadores mutagénicos (utilizando a nomenclatura IUPAC, em que N = G, A, T ou C, e K = G ou T) , que codifica todos os aminoácidos e o codão stop TAG. Outros codões que conseguem extremidades semelhantes têm também utilização, incluindo o codão NNN (que conduz à produção dos codões stop adicionais TGA e TAA), codão DVT ((A/G/T) (A/G/C)T), codão DVC ((A/G/T) (A/G/C)C) e codão DVY ((A/G/T) (A/G/C) (C/T). 0 codão DVT codifica 22% de serina e 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina e cisteína, que mima mais proximamente a distribuição de resíduos de aminoácidos para os sítios de ligação de antigénio de anticorpos humanos naturais. Os repertórios são preparados utilizando iniciadores de PCR possuindo o codão degenerado seleccionado ou codões em cada sítio a ser diversificado. A mutagénese por PCR é bem conhecida na técnica; no entanto, as considerações para a concepção de iniciadores e mutagénese por PCR úteis nos métodos da invenção são aqui discutidos na secção intitulada "Mutagénese por PCR".

Repertórios diversificados são clonados em vectores de exposição em fagos como fusões com um péptido sinal de secreção GAS1 como aqui descrito. Em geral, as moléculas de ácido nucleico e construções de vector necessárias para a presente invenção estão disponíveis na técnica e são construídas e manipuladas como apresentado em manuais convencionais de laboratório, tais como Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, EUA.

Antigénios Alvo

Os antigénios alvo para a ligação de polipéptidos como aqui descrito, são antigénios humanos relacionados com uma doença ou um distúrbio. Ou seja, os antigénios alvo como aqui descritos são alvos terapeuticamente relevantes. Um "alvo terapeuticamente relevante" é um que, quando ligado a um polipéptido de ligação, e. g., um domínio variável de imunoglobulina único ou outro polipéptido de anticorpo que se liga ao antigénio alvo e actua como um antagonista ou agonista dessa actividade do alvo, possui um efeito benéfico no indivíduo humano no qual o alvo é ligado. Um "efeito benéfico" é demonstrado por, pelo menos, uma melhoria em 10% em um ou mais indícios clínicos de uma doença ou distúrbio, ou, alternativamente, quando é desejada uma utilização profiláctica do polipéptido de ligação, através de um aumento de, pelo menos, 10% no tempo antes dos sintomas da doença ou distúrbio alvos serem observados, relativamente a um indivíduo não tratado com a preparação de polipéptido de ligação. Os exemplos não limitantes de antigénios que são alvos adequados para a ligação de polipéptidos como aqui descrito, incluem citocinas, receptores de citoquina, enzimas, co-factores de enzimas, ou proteínas de ligação a ADN. As citocinas factores de crescimento adequadas incluem mas não são limitadas a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF-acídico, FGF-básico, factor-10 do crecimento de fibroblastos, ligando FLT3, Fractalkine (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βΙ, insulina, IFNg, IGF-I, IGF-II, IL-Ια, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina a, Inibina β, IP-10, factor-2 do crescimento de queratinócitos (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, substância inibitória Mullerian, factor inibitório do crescimento de monócitos, proteína atractiva de monócitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, ΜΙΡ-la , ΜΙΡ-Ιβ, ΜΙΡ-3α, ΜΙΡ-3β, MIP-4, factor-1 inibidor do progenitor mielóide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor do crescimento do Nervo, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFla, SDF^, SCF, SCGF, factor de células estaminais (SCF), TARC, sítio de reconhecimento TACE, TGF-a, TGF-β, Τ0Γβ2, TGF^3, factor de necrose de tumor (TNF), TNF-a, TNF-β, receptor I de TNF (p55) , receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-a, GRO-β, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 e HER 4. Os receptores de citoquina incluem receptores para cada uma das citocinas anteriores, e. g., IL-1R, IL-6R, IL-10R, IL-18R, etc. deverá ser entendido que esta lista não é, de algum modo exaustiva.

Produzindo um Polipéptido Seleccionado:

Uma vez que um polipéptido é seleccionado de uma biblioteca polipeptídica em fusão com péptido sinal de secreção GAS1 expressos como embalagens de exposição em fago, esse fago pode ser utilizado para produzir mais do polipéptido. Em um aspecto, o próprio fago pode ser utilizado para infectar células frescas, produzindo, deste modo, o polipéptido. Em outro aspecto, a sequência codificante pode ser excisada, em conjunto com o péptido sinal de secreção GAS1, a partir do ácido nucleico do fago (e. g., por digestão por restrição ou por amplificação por PCR) e inserida num vector de expressão apropriado. Nesta circunstância, quando o vector de expressão é introduzido numa célula hospedeira procariótica, e. g., E. coli, o péptido sinal de secreção GAS1 dirigirá a secreção polipeptidica para o espaço periplásmico. Na alternativa, quando a célula hospedeira é, por exemplo, uma célula de levedura, tal como S. cerevisiae, o polipéptido sinal de secreção GAS1 dirigirá a secreção polipeptidica para o meio. São largamente conhecidos sistemas de vectores e células hospedeiras para a produção de proteína com nível elevado e podem ser seleccionados por um dos especialistas na técnica.

Em termos gerais, pode-se produzir um polipéptido desejado através da introdução de um vector que codifica esse polipéptido sob o controlo de um promotor forte ou indutível numa célula hospedeira apropriada e cultivar a célula hospedeira sob condições tais que o polipéptido é produzido. Em um aspecto, quando o polipéptido desejado é um polipéptido de anticorpo que compreende um polipéptido VH e um VL, o método envolve a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector que codifica uma construção dicistrónica, possuindo um promotor procariótico que conduz a expressão de sequências que codificam um VH e um VL, cada um dos quais está em fusão com um péptido sinal de secreção GAS1, sob condições tais que as sequências dos polipéptidos VH e VL são expressas. É garantida uma abordagem semelhante sempre que a construção codifica apenas uma sequência VH ou uma VL em fusão com o péptido sinal de secreção GAS1, í. e., uma construção monocistrónica. Os métodos de purificação de proteína são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Selecção dos péptidos sinal eucarióticos. 0 péptido sinal GAS1 de levedura foi identificado como um péptido sinal de secreção candidato adequado para utilização na expressão da proteína de fusão em células eucarióticas e procarióticas. Num aspecto, foi desejado maximizar a expressão da proteína de fusão em células de E. coli. A E. coli utiliza um subconjunto específico dos 61 codões de aminoácidos disponíveis para a produção da maior parte das moléculas de ARNm (Wada et al. 1992 NAR 20 p2111). As regiões de codificação iniciais do péptido sinal foram optimizadas de acordo com este codão de E. coli (ver Figura 1) utilizando o Vector NTI v7 (InVitrogen) . A utilização de codões foi modificada para optimizar a natureza rica em A/T da sequência codificante do péptido sinal - cada nucleótido que pode ser alterado para um A ou um T sem modificar os aminoácidos codificados foi alterado.

Exemplo 2. Comparação de péptidos sinal eucarióticos.

Os péptidos sinal líder eucariótico de um precursor de 1,3-p-glucosidase de glucano de levedura e o precursor da cadeia b-I de gonadotropina de salmão foram clonados num vector de expressão com base em pUC119 sob o controlo do promotor lacZ (Figura 2) para comparação com o péptido sinal GAS1 de levedura. Os péptidos sinal foram comparados quanto à sua capacidade para segregar dAb HEL4 no periplasma. Os sobrenadantes destes clones foram testados numa ELISA de ligação a lisozima (Figura 3) . Os valores na Figura 3 estão as médias de quatro culturas independentes testadas. O péptido sinal GAS com a sequência de ou nucleótidos rica em AT produziram os melhores sinais de ELISA e esta variante do lider GAS foi utilizada em todas as experiências subsequentes a seguir descritas.

Exemplo 3: Nivel de expressão dos péptidos sinal eucarióticos.

Os niveis de expressão de dAb HEL4 foram determinados quando produzidos com o GAS (rico em AT) versus o péptido sinal Gene 3. A expressão dos dAb foi induzida em culturas de 50 mL e os dAb foram purificados a partir do sobrenadante utilizando proteína A Sepharose de uma forma descontínua. Os dAb purificados foram analisados em SDS-PAGE (Figura 4). O péptido sinal GAS produziu um rendimento de 32 mg/mL que foi 2 vezes melhor do que os 14 mg/mL de rendimento obtidos utilizando o péptido sinal Gene3. O péptido sinal GAS foi agora utilizado para expressar mais do que 100 dAb diferentes. Os níveis de expressão variam entre 1 e 50 mg/L por sobrenadante de cultura. As diferenças no nivel de expressão são principalmente devidas à sequência do dAb particular expresso.

Exemplo 4: Processamento rigoroso e clivagem do péptido sinal GAS.

Os dAb purificados produzidos com o péptido sinal GAS (rico em AT) foram utilizados para sequenciação N-terminal e análise de espectrometria de massa. A sequenciação das bandas de proteína transferidas a partir da SDS-PAGE redutora produziu a sequência N terminal esperada nSTDIQc (SEQ ID N°: 5). Isto é a sequência esperada, como os dAb utilizados são precedidos por 01 resíduos Ser-Thr que estão presentes no poliligante para acomodar um sítio de clonagem Sall. A espectrometria de massa mostrou, predominantemente, a presença de um dAb de comprimento total, correctamente processado incluindo as marcações C-terminais 8xHIS e VSV com um Peso Molecular de 15669 Daltons. Isto difere por menos do que 0,01% do valor previsto (PM = 15671). A sequenciação N-terminal e a Espectrometria de Massa mostra que os dAb produzidos com um péptido sinal GAS são correctamente processados e clivados (dados não apresentados).

Exemplo 5. A actividade especifica semelhante com o péptido sinal GAS. A actividade específica de dAb HEL4 produzido com o péptido sinal GAS (rico em AT) ou gene3 foi comparado numa ELISA de ligação ao antigénio (Figura 5) . Isto mostra que o dAb HEL4 produzido com GAS possui uma melhor actividade específica em comparação a produzida com o péptido sinal gene3. O decréscimo na actividade especifica é devido à presença do marcador FLAG N-terminal que afecta a ligação de HEL4 à lisozima. Este decréscimo foi observado com HEL4 em laboratório independentemente do péptido sinal que é utilizado.

Exemplo 6: Funções do péptido sinal GAS no fago Fd. O péptido sinal GAS (rico em AT) foi clonado num vector de fago Fd para substituir o péptido sinal gene3 que ocorre naturalmente. Este péptido sinal GAS foi testado quanto à sua capacidade para produzir partículas de fago e foi comparado com o péptido sinal gene3. Os sobrenadantes produzidos a partir dos clones foram testados em ensaios ELISA para a ligação a lisozima ou ao anticorpo anti-myc. A Figura 6 mostra que os fagos produzidos com o péptido sinal GAS ou gene3 possuem um padrão de ligação praticamente idêntico em ELISA. Isto mostra que os níveis de apresentação dos dAb no fago são muito semelhantes para o GAS e o péptido sinal gene3.

Exemplo 7: Biblioteca de fagos com o péptido sinal GAS no fago Fd.

Uma vasta biblioteca de fagos foi construída utilizando vector de fago com um péptido sinal GAS (rico em AT) e umo marcador myc C-terminal. A diversidade foi introduzida pela combinação aleatória de CDRl, CDR2 e CDR3 utilizando PCR de montagem. A biblioteca foi pré-seleccionada utilizando proteína A ou proteína L (que se ligam correctamente ao dAb montado) seguida por montagem aleatória combinatória das regiões CDR. Esta abordagem resulta na maior biblioteca de fago único até à data, com uma dimensão de 3,3 x IO10 da qual a maioria (52%) é funcional.

Esta biblioteca foi utilizada para seleccionar antigénios contra sete diferentes proteínas e produziu, pelo menos, 10 diferentes ligantes contra cada antigénio. As afinidades dos dAb seleccionados variam entre 20 ym e 10 nM. Alguns clones de dAb com actividade funcional (e. g. bloqueio da ligação do alvo ao seu ligando) foram isolados contra a maior parte dos alvos. Um exemplo destes alvos é a TNF-α humana. Os dAb isolados ligam-se especificamente a TNF-α e bloqueiam a ligação de TNF-a ao seu receptor de TNF RI. Isto foi demonstrado em ensaios com base em ELISA (ver abaixo) assim como um ensaio com base em células utilizando a linha de células L929 (descrita a seguir; ver Figura 7) . Resultados semelhantes foram obtidos com vários outros alvos de citoquina alvos.

Noutra série de experiências, uma abordagem semelhante de construção de biblioteca foi utilizada para produzir uma biblioteca ainda maior. A biblioteca foi construída utilizando o vector de fago fd com um péptido sinal GAS (rico em AT) e umo marcador myc C-terminal. A diversidade foi de novo introduzida pela combinação aleatória de CDR1, CDR2 e CDR3 utilizando PCR de montagem. A biblioteca foi pré-seleccionada utilizando proteína A ou proteína L e foi adicionada uma pré-selecção adicional para clones termodinamicamente estáveis, envolvendo o tratamento de aquecimento do fago a 80 °C seguida por selecção em proteína A ou proteína L. Esta biblioteca foi pesquisada contra oito antigénios, resultando na identificação de diferentes dAb específicos para cada antigénio, possuindo cada dAb uma IC5o ou KD no intervalo de micromolar baixo e nanomolar baixo. Os antigénios incluíram: TNFR1 (2 diferentes dAb identificados); TNF (6 diferentes dAb identificados) ; MSA (albumina do soro de murganho; 4 diferentes dAb identificados) ; RSA (albumina do soro de rato; 5 diferentes dAb identificados); HSA (albumina do soro humano; 7 diferentes dAb identificados); CD40L (9 diferentes dAb identificados); IL-4 (20 diferentes dAb identificados); e IL-13 (5 diferentes dAb identificados).

Elisa para a inibição de ligação de TNA-a:

Os dAb anti-TNF-a foram testados quanto à capacidade de inibir a ligação de TNF-α ao receptor 1 de TNF recombinante (p55). Resumidamente, placas Maxisorp foram incubadas durante a noite com 30 mg/mL de anticorpo monoclonal de murganho anti-Fc humano (Zymed, San Francisco, EUA). Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,05% de Tween-20 e depois bloqueadas com 1% de BSA em PBS antes de serem incubadas com 100 ng/mL da proteína de fusão Fc do receptor 1 do TNF (R&D Systems, Minneapolis, EUA). O dAb anti-TNF-α foi misturado com TNF-α que foi depois adicionado aos poços lavados numa concentração final de 10 ng/mL. A ligação de TNF-α foi detectada com 0,2 mg/mL de anticorpo anti-TNF-α biotinilado (HyCult biotechnology, Uben, Holanda) seguido por diluição de 1 em 500 de estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (Amersham Biosciences, RU) e incubação com substrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD). A reacção foi interrompida pela adição de HC1 e a absorvência foi lida a 450 nm. A actividade inibitória de dAb anti-TNF-α leva a um decréscimo na ligação de TNF-α e, deste modo, a um decréscimo na absorvência em comparação com o controlo de apenas TNF-a.

Ensaio de Citotoxicidade de L929:

Anti-TNF-α dAb foram testados quanto à capacidade de neutralizar a actividade citotóxica de TNF-α em fibroblastos de murganho L929 (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248) . Resumidamente, células L929 plaqueadas em placas de microtitulação foram incubadas durante a noite com anti-TNF-a dAb, 100 pg/mL TNF-α e 1 mg/mL de actinomicina D (Sigma, Poole, oo RU). A viabilidade das células foi medida por leitura da absorvência a 490 nm após uma incubação com [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil) -2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (Promega, Madison, EUA). A actividade de anti-TNF-adAb leva a um decréscimo na citotoxicidade de TNF-a e deste modo a um aumento na absorvência em comparação com o controlo de apenas TNF-a.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Domanti LTD Dewildt, Rudolph M.T. <120> Sequência Lider Universal GAS1 <130> 8039/2118 <140> Ainda não disponível <141> 2005-03-24 <150> US 60/555,764 <151> 2004-03-24 <160> 5 <170> Patentln versão 3.1

Ob 60 <210 > 1 <211> 66

<212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae < 4 Ο Ο > 1 66 atgttgttta aatccctttc aaagttagca accgctgctg ctttttttgc tggcgtcgca actgcg

<210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae < 4 O O > 2

Met Leu Phe Lys ser Leu ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 15 10 15

Ala Gly vai Ala Thr Ala 20

<210> 3 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> para <223> Sequência lider GAS de S. cerevisiae optimizada expressão em E. coli <400> 3 60 atgctgttta aaagcctgag caaactggcg accgcggcgg cgttttttgc gggcgtggcg accgcg 66 <210> 4

<211> 6 6 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência nucleotidica lider GAS de S. cerevisiae modificada para expressão optimizada < 4 0 0 > 4 atgttattta aatcattatc aaaattagca accgcagcag cattttttgc aggcgtggca 60 acagcg 66

<210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido N-terminal codificado pela sequência nucleotidica lider GAS1 rica em AT. <400> 5

Ser Thr Asp ile Gin 1 5

Lisboa, 25 de Novembro de 2010 58

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Bacteriófago compreendendo uma molécula polinucleotídica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica, em ligação operacional: uma sequência sinal de secreção GAS1, um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina, e uma proteína de revestimento de bacteriófago.
2. Bacteriófago de acordo com a reivindicação 1, em que o referido domínio variável de imunoglobulina compreende um domínio variável de cadeia leve.
3. Bacteriófago de acordo com a reivindicação 1, em que o referido domínio variável de imunoglobulina compreende um domínio variável de cadeia pesada.
4. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a sequência que codifica a sequência sinal de secreção GAS1 está operacionalmente ligada na sua extremidade 3' a uma sequência que codifica uma proteína de revestimento de bacteriófago.
5. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a sequência que codifica a sequência sinal de secreção GAS1 está operacionalmente ligada na sua extremidade 3' a uma sequência que codifica um polipéptido do domínio variável de imunoglobulina.
6. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ácido nucleico que codifica a 1 sequência sinal de secreção GAS1 possui uma sequência de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4.
7. Bacteriófago de acordo com a reivindicação 1, a molécula polinucleotidica compreendendo uma unidade de transcrição dicistrónica compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, estando a extremidade 5' de cada um dos referidos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulinas ligado à extremidade 3' de uma sequência de ácido nucleico respectiva que codifica um péptido sinal de secreção GAS1.
8. Bacteriófago de acordo com a reivindicação 7, em que a unidade de transcrição dicistrónica está operacionalmente ligada a uma sequência promotora procariótica.
9. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que um sítio de reconhecimento de enzima de restrição é interposto entre a sequência de ácido nucleico que codifica o péptido sinal de secreção GAS1 e a sequência que codifica o domínio variável de imunoglobulina.
10. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo um promotor operacionalmente ligado à sequência que codifica o péptido sinal de secreção GAS1, em que o referido promotor é outro para além do promotor de ramnose.
11. Bacteriófago de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, compreendendo ainda um polipéptido codificado pela 2 molécula polinucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 1-10.
12. Utilização de um bacteriófago para seleccionar, a partir de um repertório de polipéptidos do domínio variável de imunoglobulina, um ou mais polipéptidos do domínio variável de imunoglobulina que se ligam a um ligando alvo, compreendendo o método: infecção de células hospedeiras com uma multiplicidade de bacteriófagos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, de modo a expressar nas referidas células hospedeiras uma biblioteca polinucleotídica compreendendo uma multiplicidade de moléculas polinucleotídicas como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, codificando as referidas moléculas diferentes polipéptidos do domínio variável de imunoglobulina, para produzir a biblioteca polipeptídica; e colocando em contacto a biblioteca polipeptídica com o ligando alvo e seleccionando um ou mais bacteriófagos que expressam polipéptidos que se ligam ao ligando alvo.
13. Utilização de um bacteriófago para identificar um polipéptido de anticorpo que se liga ao alvo desejado, o método compreendendo a introdução de uma biblioteca polinucleotídica compreendendo uma multiplicidade de moléculas polinucleotídicas em bacteriófagos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, numa população de 3 células hospedeiras, e selecção de um membro da biblioteca que codifica um polipéptido que se liga ao alvo. Lisboa, 25 de Novembro de 2010 4 1/7

Figura 1: Comparação das sequências nucleotídicas de variantes da sequência líder GAS Hindlll 2/7 Sall Notl Líder

RBS Promotor LacZ dAb 8xHIS+VSV tag Vector de teste com base em pUC119 -(colE1 ori)~ AMP —Ç M13 orip- Figura 2: Mapa do vector de expressão para testar os péptidos de sinal 3/7 HEL4 com sequências líderes eucarióticas OD450

Figura 3: Péptidos sinal em ELISA de ligação ao antigénio GAS= GAS1 de levedura; GAS AT = GAS1 de levedura (rico em AT); Bgl2 = Bgl2 de levedura Gth = Gth ONCKE. Barras de erro indicam desvio padrão de 4 medições. 4/7

Figura 4: Níveis de expressão de dAb HEL4 com péptido de sinal Os dAb foram purificados a partir de sobrenadantes de culturas de 50 mL utilizando proteína A Sepharose de uma forma descontínua. Os dAb purificados foram analisados em SDS PAGE. Pista 1: péptido sinal GAS rico em AT; Pista 2: péptido sinal gene3 com marcador FLAG N terminal. Os níveis de expressão foram determinados utilizando OD280. Pista 1: GAS 32 mg/L; Pista 2: gene3 com marcação FLAG 14,3 mg/L 5/7 Actividade específica de GAS HEL4 1JB 18 1.4 1.2 OD450

-•-GAS -*-gene3 FLAG Concentração de dAb (pg/mL) 1.0 0.8 08 0.4 0,2 0.0 -0.2 Figura 5: Actividade específica de dAb HEL4 com o péptido sinal GAS. Comparação da ligação de dAb HEL4 produzido com péptido sinal GÁS rico em AT e o péptido sinal gene3. A lizozima foi o revestimento de uma placa de ELISA e a ligação de dAbs foram detectadas utilizando a marcação VSV. Os valores indicados são médias de duas medições independentes. 6/7

anti-Myc Lisozima Figura 6: Actividade específica de dAb HEL4 com péptido sinal GAS Comparação da ligação de dAb HEL4 produzido com o péptido sinal GAS rico em AT e o péptido sinal gene3. A lizozima ou anticorpo anti-myc foi o revestimento de uma placa de ELISA e a ligação do fago foi detectada utilizando anticorpo anti-M13 conjugado com HRP. 7/7 Figura 7 A.

Ensaio de citoxidade de TNF, TAR1

dAb (nM)