ES2351509T3 - Secuencia lider universal de gas1. - Google Patents

Abstract

Un bacteriófago que comprende una molécula polinucleotídica que comprenden un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica, en unión operable: una secuencia señal de secreción GAS1, un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina y una proteína de la cubierta de bacteriófago.

Description

ANTECEDENTES

Los péptidos señal de secreción ayudan a las proteínas a atravesar las membranas celulares. Se usan en células tanto procariotas, como E. coli, como eucariotas. La gran mayoría de las proteínas secretoras no comparten una secuencia consenso uniforme (Watson, Nucl. Acids. Res. 12:5145 (1984)). De hecho, son bastante divergentes. Las sustituciones entre las secuencias señal de diferentes especies es altamente impredecible y normalmente tiene como resultado una secreción inconsistente entre especies, por ejemplo procariotas y eucariotas. Pocas secuencias señal tienen como resultado una secreción eficiente en procariotas y en eucariotas.

Existe un significativo interés en la producción de proteínas recombinantes en forma secretada. La secreción permite la fácil recuperación de la proteína recombinante de interés a partir del medio en el que se cultiva la célula huésped.

Rafaella y col. (Biotechnology and Applied Biotechnology (1988) 27, 81-88) divulga la expresión de una proteína de fusión de GAS1 con beta-galactosidasa en S. cerevisiae. El documento W003/068956 se refiere a procedimientos y composiciones para expresar proteínas o polipéptidos en huéspedes procariotas usando secuencias señal eucariotas. Vai y col. (Journal of Biological Chemistry (1991) 266, 12242-12248) divulga el aislamiento y la secuencia de aminoácidos deducida del gen que codifica la gp 115, una proteína de levadura anclada a glicofosfolípido que contiene una región rica en serinas. El documento US 6.555.310 se refiere a procedimientos de producción de una biblioteca de expresión de polipéptidos multivalentes. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona composiciones y procedimientos para potenciar la secreción de polipéptidos a través del uso de polipéptidos señal de secreción. En una forma de realización, las composiciones y procedimientos son particularmente útiles para generar una biblioteca de expresión de polipéptidos del dominio variable de inmunoglobulina y para la generación de los propios anticuerpos de dominio único.

La invención además se refiere a moléculas polinucleotídicas que comprenden polipéptidos señal de secreción GAS1 (SEC ID Nº 2), particularmente polipéptidos señal de secreción GAS1 que se han optimizado para su expresión bacteriana. Una secuencia de ácido nucleico optimizada que codifica un péptido señal de secreción GAS1 es, preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 3 ó 4.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un bacteriófago que comprende una molécula polinucleotídica que comprenden un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica, en unión operable: una secuencia señal de secreción GAS1, un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina y una proteína de la cubierta de bacteriófago.

La molécula polinucleotídica puede estar operablemente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

Preferentemente, un sitio de reconocimiento de enzima de restricción está intercalado entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de secreción GAS1 y la secuencia que codifica el dominio variable de inmunoglobulina.

La invención puede utilizar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas en la que cada molécula de dicha biblioteca comprende un promotor unido operablemente a una secuencia que codifica un polipéptido señal de secreción GAS1 que, a su vez, está unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, en el que dicho promotor no es un promotor de ramnosa.

La presente memoria también divulga una molécula polinucleotídica que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1. El polinucleótido que codifica un péptido señal de secreción GAS1 está, a su vez, unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina, en el que el promotor no es un promotor de ramnosa.

En una forma de realización, la secuencia que codifica el péptido señal de secreción GAS1 se optimiza para la expresión en una bacteria.

En otra forma de realización, la secuencia que codifica el péptido señal de secreción GAS1 es la secuencia de SEC ID Nº 3.

En otra forma de realización, la secuencia que codifica el péptido señal de secreción GAS1 es la secuencia de SEC ID Nº 4.

En otra forma de realización, el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina comprende un dominio variable (Vl) de la cadena ligera.

En otra forma de realización, el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina comprende un dominio variable de la cadena pesada (Vh).

En otra forma de realización, la secuencia que codifica un péptido señal de secreción GAS1 está unido operablemente en su extremo 3’ a una secuencia que codifica un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina.

La presente memoria divulga una biblioteca de polinucleótidos que comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico para usar en la invención.

Normalmente, las células huésped se transforman con el bacteriófago de la invención.

En otra forma de realización más de la invención, el péptido señal de secreción GAS1 es un péptido señal de secreción GAS1 de S. cerevisiae.

La memoria también divulga una molécula de polinucleótido que comprende un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1, que, a su vez, está unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencilla.

En otra forma de realización, la secuencia que codifica un péptido señal de secreción GAS1 está unido operablemente en su extremo 3’ a una proteína de la cubierta del bacteriófago.

La presente memoria divulga una molécula polinucleotídica que codifica una cadena de inmunoglobulina secretable, en la que la molécula polinucleotídica comprende un ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1 unido operablemente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por una cadena ligera de inmunoglobulina, un fragmento de cadena ligera de inmunoglobulina, una cadena pesada de inmunoglobulina y un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina.

En otra forma de realización, la invención proporciona un bacteriófago que comprende una molécula polinucleotídica, en la que el polinucleótido comprende una unidad de transcripción dicistrónica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina, estando el extremo 5’ de cada uno de los dominios variables de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina unido operablemente al extremo 3’ de un ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1.

En otra forma de realización, el ácido nucleico que codifica el péptido señal de secreción GAS1 tiene la secuencia de SEC ID Nº 3.

En otra forma de realización, el ácido nucleico que codifica el péptido señal de secreción GAS1 tiene la secuencia de SEC ID Nº 4.

En otra forma de realización, la unidad de transcripción dicistrónica está unida operablemente a una secuencia promotora procariota.

En una forma de realización, el extremo C-terminal de dicho polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina está, a su vez, unido a una proteína de la cubierta de un bacteriófago.

En otra forma de realización, el polipéptido está integrado en la cubierta del bacteriófago.

En otra forma de realización, el polipéptido del dominio variable de inmunoglobulina

está unido operablemente en su extremo N a un péptido señal de secreción GAS1.

En otra forma de realización, el polipéptido del dominio variable de inmunoglobulina comprende un polipéptido de dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unido en su extremo N al GAS1.

En otra forma de realización más, el polipéptido del dominio variable de inmunoglobulina comprende un polipéptido de dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina unido en su extremo N al GAS1.

En una forma de realización, el bacteriófago comprende un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1, en el que dicho promotor no es un promotor de ramnosa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un bacteriófago para seleccionar, a partir de un repertorio de polipéptidos, uno o más polipéptidos de la región variable de inmunoglobulina que se unen a un ligando diana, en el que el procedimiento comprende: Infectar las células huésped con una pluralidad de bacteriófagos, de modo que en dichas células huésped se expresa una biblioteca de polinucleótidos que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas, codificando dichas moléculas diferentes polipéptidos de dominio variable de inmunoglobulina, para producir la biblioteca de polipéptidos; y poner en contacto la biblioteca de polipéptidos con el ligando diana y seleccionar uno o más bacteriófagos que expresan polipéptidos que se unen al ligando diana.

La presente memoria divulga un procedimiento para seleccionar a partir de un repertorio de polipéptidos uno o más polipéptidos de la región variable de inmunoglobulina que se unen a un ligando diana, en el que el procedimiento comprende poner en contacto la biblioteca de polipéptidos con un ligando diana y seleccionar uno o más polipéptidos que se unen al ligando diana.

La presente memoria también divulga el uso de un bacteriófago para identificar un polipéptido de anticuerpo que se une a una diana deseada, en el que el procedimiento comprende introducir una biblioteca de polinucleótidos que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas en bacteriófagos tal como se ha citado en lo que antecede en una célula huésped y seleccionar un miembro de la biblioteca que codifica un polipéptido que se une a la diana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una comparación de la secuencia nucleotídica de las variantes del péptido señal de secreción GAS1. GAS salvaje: La secuencia natural en levaduras (SEC ID Nº 1). La secuencia salvaje del péptido líder de levaduras es MLFKSLSKLATAMFFAGVATA (SEC ID Nº 2). Líder GAS de E. coli: La secuencia nucleotídica de acuerdo con el uso óptimo del codón de E. coli (Wada y col. 1992 NAR 20 P 2111) (SEC ID Nº 3). Líder GAS AT: secuencia nucleotídica rica en AT (SEC ID Nº 4). Todas las secuencias nucleotídicas codifican la misma secuencia de aminoácidos. El color gris claro indica los nucleótidos que son similares para todas las secuencias. El color gris oscuro indica los nucleótidos que son similares a la secuencia salvaje. El color blanco indica los nucleótidos que son diferentes de la secuencia salvaje.

La Figura 2 muestra un mapa de un vector de expresión para el vector usado para los péptidos señales de ensayo.

La Figura 3 muestra los resultados de ensayos ELISA del nivel de secreción de un dAb HEL4 expresado con diferentes señales de secreción.

La Figura 4 muestra los niveles de expresión del dAb HEL4 con un péptido señal GAS1 medido mediante SDS-PAGE. Los dAb se purificaron a partir de 50 ml de sobrenadantes de cultivo usando proteína A sefarosa de un modo discontinuo. Los dAB purificados se analizaron en SDS-PAGE. Calle 1: Péptido señal GAS rico en AT; Calle 2: péptido señal gen3 con marca FLAG en el extremo N. Los niveles de expresión se determinaron usando DO280. Calle 1: GAS 32 mg/I; Calle 2: Gen3 con marga FLAG 14,3 mg/l.

La Figura 5 muestra la actividad específica del dAb de HEL4 con un péptido señal GAS. Los datos mostrados son una comparación de la unión de dAb de HEL4 producido con el péptido señal GAS rico en AT frente al péptido señal de gen3. La lisozima se introdujo en una placa de ELISA y se detectó la unión de los dAb usando la marca VSV. Los valores indicados son las medias de dos mediciones independientes.

La Figura 6 muestra una medición separada de la actividad específica del dAb de HEL4 con un péptido señal GAS. Los datos mostrados son una comparación de la unión de dAb de HEL4 producido con el péptido señal GAS rico en AT frente al péptido señal de gen3. La lisozima o el anticuerpo anti-myc se introdujo en una placa de ELISA y se detectó la unión al fago usando un anticuerpo conjugado con HRP anti-M13.

La Figura 7 muestra que los dAb anti-TNF-α neutralizan la actividad citotóxica del TNFα. Los dAb aislados TAR1-53, 57 y 62 se unen al TNF-α de forma específica y bloquean la unión del TNF-α a su receptor TNF R1 en un ensayo ELISA de unión a receptor. Los dAb TAR1-53, 57 Y 62 bloquean la actividad citotóxica del TNF-α sobre las células L929.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones

Como se usa en la presente memoria, “péptido señal de secreción GAS1” se refiere al péptido señal de secreción de la glicoproteína de superficie GAS1 de S. cerevisiae (Nueoffer y coI., 1990, Mol. Cell BioI., 11: 27-37). “Péptido señal de secreción GAS1”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un péptido señal de secreción que tiene la secuencia de SEC ID Nº 2 y que está codificado por la secuencia polinucleotídica de SEC ID Nº 1, además tiene secuencias que son idénticas en al menos 75%, 80 % , 90 % , y hasta 99 % a la secuencia peptídica de SEC ID Nº 2 o a la secuencia polinucleotídica de SEC ID Nº 1. Identidad se refiere a la alineación óptima de secuencias (bien nucleótidos o aminoácidos), que se puede realizar mediante implementaciones computerizadas de algoritmos. La identidad con respecto a los polinucleótidos puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis con BLASTN versión 2.0 usando los parámetros por defecto. La identidad con respecto a los polipéptidos (es decir, aminoácidos) se puede determinar usando un programa, como el BLASTP versión 2.2.2 con los parámetros por defecto, que alinea los polipéptidos o fragmentos que se están comparando y determina la extensión de la identidad de los aminoácidos o la similitud entre ellos.

Como se usa en la presente memoria, un “péptido señal de secreción GAS1" también se refiere a un péptido señal de secreción que está codificado por una secuencia polinucleotídica GAS1 que se ha optimizado para su expresión en bacterias. Como se usa en la presente memoria, “optimizado” se refiere a la modificación del codón de una secuencia polinucleotídica en una secuencia del codón que se expresa en bacterias, como E. coli, a un nivel que es almenos 10% ,20% , 30% , 50% , 70% , 80%yhasta100%superiorauna secuencia no optimizada. Una secuencia de ácido nucleico “A/T optimizada” de acuerdo con un aspecto de la invención es una secuencia en la que los nucleótidos G o C han mutado a un nucleótido a o T, siempre que la mutación no cambie el aminoácido codificado por el codón. Si ningún nucleótido A o T se puede sustituir con un nucleótido G o C en una secuencia sin cambiar el aminoácido, el nucleótido G o C no muta a un nucleótido A o T. Una secuencia de ácido nucleico “optimizada” que codifica un péptido señal de secreción GAS1 de acuerdo con la invención es, preferentemente, la SEC ID Nº 3 o 4.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “polipéptido de la región variable de inmunoglobulina” incluye i) un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, con o sin dominios de la región constante ii) un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, con o sin dominios de la región constante iii) un polipéptido del dominio VH o VL sin dominios de región constante unido a otro dominio variable (un polipéptido del dominio VH o VL) que está con o sin dominios de región constante (p. ej., VH-VH, VH-VL o VL -VL ) y iv) anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv), que es un polipéptido de dominio VL sin las regiones constantes unidas a otro polipéptido de dominio VH sin regiones constantes (VH-VL), los dominios variables juntos forman un sitio de unión al antígeno. En una forma de realización de la opción (i), (ii) o (iii), cada dominio variable forma un sitio de unión a antígeno de forma independiente de cualquier otro dominio variable. Se puede usar la opción (i) o (ii) para formar un anticuerpo fragmento Fab o in anticuerpo Fv. Por tanto, como se usa en la presente memoria, la expresión “polipéptido de región variable de inmunoglobulina” se refiere a anticuerpos que pueden o no contener dominios de la región constante. Además, como se usa en la presente memoria, la expresión “polipéptido de la región variable de inmunoglobulina” se refiere a los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno que puede contener todas o sólo una porción de las correspondientes regiones constantes de la cadena pesada o ligera. De forma adicional, un “polipéptido de la región variable de inmunoglobulina”, como se usa en la presente memoria, incluye la cadena ligera, la cadena pesada, las cadenas pesada y ligera (p. ej., scFV), Fd (es decir VH-CH1) o VL-CL. “Polipéptido de la región variable de inmunoglobulina”, como se usa en la presente memoria, no se refiere a una molécula completa de anticuerpo (p, ej., IgG) que comprende dos cadenas pesadas y dos ligeras. Un “anticuerpo completo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de anticuerpo en la que dos cadenas pesadas están unidas mediante disulfuro a una cadena ligera y en la que las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante disulfuro por la región bisagra.

Como se usa en la presente memoria, el término “dominio" se refiere a una estructura proteica plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las discretas propiedades funcionales de las proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin que se pierda la función del resto de la proteína y/o del dominio.

Las expresiones equivalentes “anticuerpo de dominio variable sencillo” y “dominio variable de inmunoglobulina sencilla” se refieren a un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno (es decir, constante de disociación de 500 nM o menor) y que se une a antígeno como dominio variable sencillo; es decir, sin ningún dominio variable complementario. Por tanto, un “anticuerpo de dominio variable sencillo” incluye dominios variables del anticuerpo completo así como dominios variables modificados en los que, por ejemplo, uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables del anticuerpo, o dominios variables del anticuerpo que se han truncado o que comprenden extensiones en los extremos N o C, así como fragmentos plegados de los dominios variables que retienen una constante de disociación de 500 nM o menor (p. ej., 450 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especificidad por el antígeno diana del dominio de longitud completa. Preferentemente, un dominio variable sencillo de anticuerpo útil en la invención se selecciona del grupo de VH y VL, incluidos Vkappa y Vlambda.

Las expresiones “anticuerpo de dominio variable sencillo" y "dominio variable de inmunoglobulina sencillo" no sólo abarca un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo aislado sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de dominio variable sencillo de anticuerpo. Un “anticuerpo de dominio” o “dAb" es equivalente a un polipéptido de “dominio variable sencillo de anticuerpo" tal como la expresión se usa en la presente memoria descriptiva. Un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo de mamífero, preferentemente de ser humano, también incluye dAb de roedor o de camélido.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “biblioteca” se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos que contienen en el intervalo de 10-1012 (p. ej., 109 a 1012) miembros diferentes. Cada miembro comprende una variante polipeptídica o de secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina. Hasta este punto, biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. Una “biblioteca” puede hacer referencia a una mezcla sencilla de polipéptidos o ácidos nucleicos o puede ser organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con una biblioteca de ácidos nucleicos. Preferentemente, cada organismo individual, virus o célula contiene sólo un miembro de la biblioteca. De forma ventajosa, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. Por tanto, en un aspecto preferido, una “biblioteca” puede hacer referencia a una población de organismos huésped, en la que cada organismo contiene una o más copias de un vector de expresión que contiene un único miembro de la biblioteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro polipeptídico correspondiente. Por tanto, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de variantes polipeptídicas diversas genéticamente.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un “paquete genético replicable” se refiere a una entidad que combina el fenotipo y el genotipo de miembros de una biblioteca de (poli)péptidos/proteínas vinculando la información genética que codifica el miembro de la biblioteca y el (poli)péptido/proteína expresado en ella. La biblioteca se puede someter a detección selectiva y/o a selección según una propiedad deseada y el (poli)péptido/proteína que se está detectando y/o seleccionando se puede identificar a través de la información genética asociada con la misma. Ejemplos de “paquetes genéticos replicables” comprenden células, tales como bacterias (documento 90/02809; Georgiou y coI., 1993; Francisco & Georgiou, 1994; Daugherty y coI., 1998), levaduras (Boder & Wittrup, 1997; Kieke y col., 1997; Cho y col. , 1998; Kieke y coI., 1999) células de insecto (Ernst y col. , 1998), virus, tal como bacteriófagos (documento WO 90/02809; Kay y col. , 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996) retrovirus (Russell y coI., 1993), esporas (documento WO 90/02809), o complejos de moléculas de ácido nucleico y (poli)péptidos/proteínas expresados en ellas, tales como en complejos de ribosomas (Hanes & Pluckthun, 1997; Hanes y coI., 1998; Hanes y coI., 1999) o en complejos conectados bien no covalentemente (Cull y coI., 1992; Schatz, 1993; Schatz y coI., 1996; Gates y coI., 1996) o bien covalentemente (Nemoto y coI., 1997).

Como se usa en la presente memoria, "secretable" se refiere a la capacidad de los polipéptidos para ser secretados extracelularmente tras su síntesis en el interior de las células. Por ejemplo, los polipéptidos que comprenden el péptido señal de secreción GAS1 pueden ser secretados en el periplasma de E.coli gramnegativa. Un polipéptido “secretable” o “secretado” se acumula en el espacio periplásmico de, por ejemplo, un huésped bacteriano, o se acumula en el medio de crecimiento. Entre los procedimientos para determinar si un polipéptido, por ejemplo un anticuerpo de dominio sencillo, es “secretable” o “secretado” se incluyen, por ejemplo, ELISA, como se indica en el ejemplo 2, transferencia de tipo western y purificación de sobrenadantes de cultivo usando proteína A sefarosa, con la posterior visualización en SDS PAGE como se indica en el Ejemplo 3. En una forma de realización preferida, los polipéptidos “secretables” pueden atravesar las membranas celulares de modo que el producto se acumula hasta entre 10 µg/ml y 1 g/l, por ejemplo 1 mg/l a 1 g/l, 1 mg/l a 50 mg/l, 1 mg/l a 100 mg/l, 1 mg/l a 150 mg/l, 1 mg/l a 200 mg/l, 1 mg/l a 250 mg/l, 1 mg/l a 300 mg/l, 1 mg/l a 350 mg/l, 1 mg/l a 400 mg/l, 1 mg/l a 450 mg/l, 1 mg/l a 500 mg/l, 1 mg/l a 550 mg/l, 1 mg/l a 600 mg/l, 1 mg/l a 650 mg/l, 1 mg/l a 700 mg/l, 1 mg/l a 750 mg/l, 1 mg/l a 800 mg7l, 1 mg/l a 850 mg/l, 1 mg/l a 900 mg/l, 1 mg/l a 950 mg/l, en el sobrenadante del cultivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “proteína de la cubierta del bacteriófago” se refiere a las proteínas del bacteriófago que proporcionan la estructura las partículas del bacteriófago. Ejemplos no limitantes de proteínas de la cubierta de bacteriófago incluyen, sin limitaciones, M13 gen III, gen VIII; proteína minoritaria de la cubierta rd pIII (Saggio y coI., Gene 152:35, 1995); proteína lambda D (Sternberg & Hoess, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609, 1995; Mikawa y coI., J. Mol BioI. 26221 (1996); proteína de la cola del fago lambda pV (Maruyama y coI., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :8273, 1994; patente de EE.UU. nº 5627024); proteína fr de la cubierta (documento W096/11947; documento DD 292928; documento DD 286817; documento DD 300652); proteína 29 de la cola gp9 (Lee, Virol. 69:5018,1995); proteína MS2 de la cubierta; proteína pequeña 1'4 de la cápside externa (Ren y col., Protein Sci. 5:1833,1996), proteína armazón de la cápsula no esencial T4 IPIII (Hong y Black, Virology 194:481, 1993), o gen de la proteína fibritina alargada T4 (Efimov, Virus Genes 10: 173, 1995); gen III PRD-1; proteína Q 3 de la cápside (siempre que no interfiera con la dimerización); y proteína de la cola DE P22 (Carbonell y Villaverde, Gene 176:225, 1996).

Como se usa en la presente memoria, una “unidad de transcripción dicistrónica” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que permite la coexpresión de más de un marco de lectura abierto a partir de un único promotor. Una “unidad de transcripción” es un ácido nucleico que contiene un gen que codifica una proteína deseada bajo el control de un promotor adecuado y que tiene todas las funciones esenciales para permitir la expresión. La “unidad de transcripción dicistrónica” es una unidad de transcripción en la que dos genes están bajo el control del mismo promotor. Para información adicional sobre la "unidad de transcripción dicistrónica", véase Dirks, y coI., Gene, vol. 128, pp. 247-249 (1993).

La presente invención utiliza un polipéptido señal de secreción GAS1 adecuado para la expresión eficiente en diferentes vectores y en los organismos procariotas y eucariotas. También se proporciona un péptido señal de secreción que permite un desplazamiento fácil entre fagos, bacterias, levaduras y células de mamífero. Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que comprenden un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína glicofosfolípido-anclada a la superficie, en la presente memoria denominada GAS-1, péptido señal de secreción. En algunas formas de realización, el promotor no es un promotor de ramnosa. En otra forma de realización, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende un polipéptido señal de secreción GAS1 que está unido operablemente a un anticuerpo de dominio sencillo.

De acuerdo con la invención, los péptidos señal de secreción GAS1 incluyen los péptidos codificados por la secuencia de ácido nucleico salvaje de GAS1 que se encuentra en Saccharomyces cerevisiae y en la presente memoria se indica en la SEC ID Nº 1. Preparación de secuencias de nucleótidos de GAS1 ricas en AT

Los ácidos nucleicos del péptido señal de secreción GAS1 salvaje (SEC ID Nº 1) clonado se pueden mutar para generar ácidos nucleicos de señal de secreción GAS1 ricos en AT (SEC ID Nº 3 y 4). Los ácidos nucleicos ricos en AT de la presente invención permiten la expresión optimizada en E. coli. Las regiones codificadoras del péptido señal se optimizaron de acuerdo con el uso del codón de E. coli usando el vector NTI v.7 (www.informaxinc.com) como se ha descrito en el ejemplo 2. De forma adicional, el uso del codón en el extremo 5’ del ARNm es importante para la expresión óptima de la proteína (Tessler y col. NAR. 12:7663; Wood y col. NAR 20: 2111). Con el fin de codificar el mejor péptido señal de secreción GAS1 se favorecen las secuencias ricas en A/T (Humphreys y col. 2000, Protein Expression and Purification. 20:252). Cada guanina o citosina se cambió a una adenina o una timina si no dio como resultado un cambio de aminoácido.

Los procedimientos para crear péptidos señal de secreción GAS1 ricos en AT se indican más adelante y en la técnica se conocen otros procedimientos. La secuencia de ácido nucleico señal de secreción GAS1 salvaje se puede usar para preparar los ácidos nucleicos GAS1 ricos en AT.

En un aspecto se puede preparar un péptido señal de secreción GAS1 rico en AT mediante modificación genética (p. ej., mediante modificación de la secuencia de ADN que codifica un péptido señal de secreción GAS1 salvaje). En la técnica se conocen una serie de procedimientos que permiten la mutación dirigida de secuencias de ADN (véase, por ejemplo, Ausubel y col. Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc.)

En la técnica hay una serie de procedimientos conocidos de mutagénesis dirigida a sitio que permiten mutar un sitio o región concreto de una forma directa. Existe una serie de kit comercialmente disponibles para la realización de la mutagénesis dirigida a sitio, incluidos procedimientos tanto convencionales como basados en PCR. Ejemplos útiles incluyen el kit de mutagénesis dirigida a sitio basado en PCR EXSITETM disponible en Stratagene (nº de catálogo 200502; basado en PCR) y el kit de mutagénesis dirigida a sitio QUIK-CHANGETM de Stratagene (nº de catálogo 200518; no basado en PCR) y el kit de mutagénesis dirigida a sitio de doble cadena CHAMELEON®, también de Stratagene (nº de catálogo 200509).

Los procedimientos antiguos de mutagénesis dirigida a sitio conocidos en la técnica dependían de la subclonación de la secuencia que se va a mutar en un vector, tal como un vector de bacteriófago M13, que permite el aislamiento del molde de ADN monocatenario. En estos procedimientos se hibridaba un cebador mutagénico (es decir, un cebador capaz de hibridar con el sitio que se va a mutar pero portando uno o más nucleótidos no coincidentes en el sitio que se va a mutar) con el molde monocatenario y, después, se polimerizaba el complementario del molde a partir del extremo 3' del cebador mutagénico. Los dúplex resultantes se transformaron después en las bacterias huésped y las placas se sometieron a detección selectiva según la mutación deseada.

Más recientemente, la mutagénesis dirigida a sitio ha empleado metodologías de PCR que tienen la ventaja de no requerir un molde monocatenario. Además, se han desarrollado procedimientos que no requieren subclonación. Al realizar la mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR se pueden considerar varios aspectos. En primer lugar, en estos procedimientos puede ser deseable reducir el número de ciclos de PCR para prevenir la expansión de mutaciones no deseadas introducidas por la polimerasa. En segundo lugar, se puede emplear una selección con el fin de reducir el número de moléculas parentales no mutadas persistentes en la reacción. En tercer lugar se puede preferir un procedimiento de PCR de longitud expandida con el fin de permitir el uso de un conjunto de cebadores sencillos para PCR. Y, en cuarto lugar, dada la actividad de la extensión terminal no dependiente de molde de algunas polimerasas termoestables puede ser necesario incorporar una etapa final de pulido en el procedimiento antes de la ligadura de los extremos romos del producto mutante generado por PCR.

En algunas formas de realización, una señal de secreción GAS1 salvaje se clona mediante aislamiento ADNc o genómico usando procedimientos biológicos moleculares, para servir como molde para la mutagénesis. Como alternativa, el ADN genómico o ADNc se puede amplificar mediante PCR y el producto de PCR puede usarse como molde para la mutagénesis.

El protocolo no limitante descrito más adelante se ajustó a estas consideraciones a través de las etapas siguientes. En primer lugar, la concentración del molde usado es aproximadamente 1000 mayor que la usada en las reacciones de PCR convencionales, lo que permite una reducción del número de ciclos desde 25-30 a 5-10 sin reducir espectacularmente el rendimiento del producto. En segundo lugar, se usa la endonucleasa de restricción DpnI (secuencia diana de reconocimiento: 5-Gm6ATC-3, donde el residuo A está metilado) para seleccionar frente al ADN parental, ya que las cepas más frecuentes de E. coli Dam metilan su ADN en la secuencia 5-GATC-3. En tercer ligar, se usa la extensora Taq en la mezcla de PCR con el fin de incrementar la proporción de los productos de PCR largos (es decir, la longitud completa del plásmido).. Por último, la ADN polimerasa Pfu se usa para pulir los extremos del producto de PCR antes de la unión intramolecular usando la ADN ligasa T4.

Un procedimiento se describe con detalle del siguiente modo para la mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR de acuerdo con una forma de realización de la invención.

El ADN molde del plásmido que comprende el polinucleotídico señal de secreción GAS1 (aproximadamente 0,5 pmol) se añade a un cóctel de PCR que contiene: 1x tampón de mutagénesis (Tris HCl 20 mM, pH 7,5; MgCI2 8 mM; 40 µg/ml de BSA); 12-20 pmol de cada cebador (un experto en la técnica puede diseñar un cebador mutagénico según sea necesario, dando importancia a factores tales como la composición de bases, la longitud del cebador y las concentraciones previstas de las sales tampón que afectan a las características de hibridación de los cebadores oligonucleotídicos; un cebador debe contener la mutación deseada dentro de la secuencia de codificación de la ADN polimerasa y uno (el mismo u otro) debe contener un 5’´fosfato para facilitar la posterior unión), 80 uM de cada dNTP, 2,5 U de ADN polimerasa Taq y 2,5 U de Extensor Taq (disponible en Stratagene; véase Nielson y col. (1994) Strategies 7: 27, y la patente de EE.UU. 5.556.772).

Los cebadores se pueden preparar usando el procedimiento del triéster de Matteucci y coI., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191. Como alternativa se puede preferir la síntesis automática en, por ejemplo, un sintetizador de ADN Biosearch 8700 usando química de fosforoamidita de cianoetilo.

Los ciclos de la PCR se realizan del siguiente modo: 1 ciclo de 4 min a 94ºC, 2 min a 50ºC y 2 min a 72ºC; seguido por 5-10 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 54ºC y 1 min a 72ºC. El ADN molde parental y el ADN lineal generado mediante PCR que incorpora el cebador mutagénico se tratan con DpnI (10 U) y ADN polimerasa Pfu (2,5 U). Esto tiene como resultado la digestión con DpnI del molde parental metilado in vivo y el ADN híbrido y la eliminación, por la ADN polimerasa PFU, de las bases extendidas mediante la ADN polimerasa Taq no dirigida al molde sobre el producto lineal de PCR. La reacción se incuba a 37ºC durante 30 min y después se transfiere a 72ºC durante 3 min adicionales. El tampón de mutagénesis (115 µl de 1x) que contiene ATP 0,5 Mm se añade a los productos de la PCR digeridos por DpnI pulidos mediante ADN polimerasa Pfu. La solución se mezcla y se extraen 10 µl y se introducen en un nuevo tubo de microcentrífuga y se añade ADN ligasa T4 (2-4 U). La unión se incuba durante más de 60 min a 37ºC. Por último, la solución tratada se transforma en E. coli competente de acuerdo con procedimientos estándar.

Se puede usar un cebador oligonucleotídico degenerado para generar nucleótidos señal de secreción GAS1 enriquecidos con AT de la presente invención. En algunas formas de realización, la síntesis química de un cebador degenerado se lleva a cabo en un sintetizador de ADN automático y el fin de un cebador degenerado es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican un sitio de mutación deseada de la secuencia de la ADN polimerasa. La síntesis de los oligonucleótidos degenerados es bien conocida en la técnica (p. ej., Narang,

S. A, Tetrahedron 39:3 9, 1983; Itakura y coI., Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromol., Walton, ed., Elsevier, Amsterdam, pp 273-289, 1981; Itakura y coI., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura y coI., Science 198: 1056, 1984; and Ike y colI., Nucleic Acid Res. 11 :477 1983). Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (p. ej., Scott y coI., Science 249:386-390, 1980; Roberts y coI., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 89:2429-2433, 1992; Devlin y coI., Science 249: 404-406, 1990; Cwirla y coI., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 87: 6378-6382,1990; así como las patentes de EE.UU. nº 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815, cada una de las cuales se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia).

Los polinucleótidos que codifican los péptidos señal GAS1 enriquecidos con AT generados mediante mutagénesis se pueden secuenciar para identificar las mutaciones. Para estos mutantes que comprenden más de una mutación, el efecto de una mutación dada se puede evaluar mediante la introducción de la mutación identificada en el gen salvaje mediante mutagénesis dirigida a sitio en aislamiento de las otras mutaciones transportadas por el mutante concreto. En consecuencia, los ensayos de detección selectiva del mutante sencillo producido de este modo permitirán la determinación del efecto de dicha mutación sola.

En una forma de realización preferida, el péptido señal GAS1 enriquecido con AT deriva de S. cervisiae (SEC ID Nº 1).

En una forma de realización preferida, el péptido señal GAS1 enriquecido con AT está codificado por el ácido nucleico de SEC ID Nº 3 ó 4.

Una descripción detallada de la clonación en S. cervisiae de la proteína GAS1 se puede encontrar en Nuoffer y col. Molecular and Cellular Biology; 11 :27 (1991).

Un experto en la técnica que tenga el beneficio de esta divulgación reconocerá que los péptidos señal de secreción GAS1 y similares pueden usarse de forma adecuada en la presente invención.

Proteínas de la cubierta del bacteriófago

En la presente invención se puede usar diversos sistemas de bacteriófagos y proteínas de la cubierta de bacteriófagos. Ejemplos de proteínas de la cubierta de bacteriófago adecuadas incluyen, sin limitaciones, M13 gen III, gen VIII; proteína Pili minoritaria de la cubierta rd (Saggio y coI., Gene 152:35,1995, 1995); proteína lambda D (Sternberg & Hoess, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609, 1995; Mikawa y coI., J. Mol BioI. 262:21, 1996); proteína de la cola del fago lambda pV (Maruyama y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91 :8273, 1994; patente de EE.UU. nº 5627024); proteína fr de la cubierta (documento W096/1194; documento DD 292928; documento DD 286817; documento DD 300652); proteína 29 de la cola gp9 (Lee, Virol. 69:5018, 1995); proteína MS2 de la cubierta; proteína pequeña T4 de la cápside externa (Ren y col., Protein Sci. 5: 1833, 1996), proteína estructural no esencial de la cápside de T4 IPIII (Hong y Black, Virology 194:481, 1993); o gen de la proteína fibritina alargada de T4 (Efimov, Virus Genes 10:173, 1995); gen III PRD-1; proteína Q~3 de la cápside (siempre que no interfiera con la dimerización); y proteína de la cola P22 (Carbonell y Villaverde, Gene 176:225, 1996). Se conocen bien las técnicas para insertar secuencia codificadora extraña en un gen del fago (véase, p. ej., Sambrook y coI., Molecular Cloning: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., NY, 1995).

En un aspecto preferido se usa una proteína de la cubierta del bacteriófago filamentoso. Comercialmente se disponen de muchos vectores bacteriófagos filamentosos que pueden permitir la unión en marco de la proteína de fusión péptido señal-cola-polipéptido de la región variable de inmunoglobulina a una proteína de la cubierta del bacteriófago. Los vectores más frecuentes aceptan insertos de ADN para las fusiones en el marco con el gen III o gen VIII. Ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen vectores M13mp (Pharmacia Biotech), pCANTAB 5e (Pharmacia Biotech), pCOMB3 y M13KE (New England Biolabs), serie pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Debe entenderse que estos vectores ya contienen secuencias del péptido señal de bacteriófago y que cada vector se puede modificar de modo que contenga la secuencia del péptido señal de bacteriófago de interés mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (Sambrook y coI., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, y coI., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, N.Y., 1995.

Vectores:

La presente invención abarca moléculas polinucleotídicas que se clonan en un vector tal que la molécula polinucleotídica esté funcionalmente unida a un promotor que es funcional en un procariota y a un péptido señal de secreción GAS1.

Para los aspectos descritos en la presente memoria se pueden usar vectores fagemidos y no fagemidos. Como se usa en la presente memoria descriptiva, vector se refiere a un elemento pequeño que se usa para introducir ADN heterólogo en las células para su expresión y/o replicación. En experto en la técnica conocen bien los procedimientos mediante los cuales seleccionar o construir y, posteriormente usar, dichos vectores. Numerosos vectores están públicamente disponibles, incluidos plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales, vectores episomales y se pueden emplear vectores de expresión génica. Se puede seleccionar un vector de uso de acuerdo con la invención para alojar una secuencia codificadora de polipéptido de un tamaño deseado. Una célula huésped adecuada se transforma con el vector tras manipulaciones de clonación in vitro. Las células huésped pueden ser procariotas, tal como cualquiera de una serie de cepas bacterianas, o pueden ser eucariotas, tal como levaduras u otras células fúngicas, células de insecto o de anfibio o células de mamífero, incluidas, por ejemplo, células de roedores, simios o seres humanos. Cada vector contiene varios componentes funcionales, que, en general, incluyen un sitio de clonación (o “poliligador”), un origen de replicación y al menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, posee adicionalmente uno o más de los siguientes: Elemento potenciador, promotor, secuencias de la terminación de la transcripción y seña, cada una colocada en las proximidades del sitio de clonación de modo que están operablemente unidas al gen que codifica un miembro del repertorio de polipéptidos de acuerdo con la invención.

Generalmente, tanto los vectores de clonación como de expresión contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Normalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique de forma independiente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Estas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (p. ej., de SV40, de adenovirus) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no se necesita para vectores de expresión en mamíferos, a menos que éstos se usen en células de mamífero capaces de replicar niveles altos de ADN, tales como células COS.

De forma ventajosa, un vector de clonación o de expresión puede contener un gen de selección también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Por tanto, las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias auxótrofas o suministran nutrientes cruciales no disponibles en el medio de cultivo.

Dado que la replicación de los vectores de acuerdo con la presente invención se realiza de forma más conveniente en E. coli (p. ej., cepa TB1 o TG1) se usa un marcador seleccionable en E.coli, por ejemplo el gen de lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Éstos se pueden obtener de plásmidos de E.coli, tal como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19 o pUC119.

Vectores bacterianos concretos que se pueden usar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD1 0, phiX174, pBluescripFM II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7 vectores eucariotas concretos incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). No obstante se puede usar cualquier otro vector siempre que sea replicable y estable en la célula huésped.

La célula huésped puede ser cualquiera de las células huésped familiares para los expertos en la técnica, incluidas células procariotas o células eucariotas. Como ejemplos representativos de huéspedes adecuados se pueden mencionar: Células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces lividans, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces ambofaciens, Bacillus subrilis, Salmonella typhimurium y varias especies del género Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus y Staphylococcus, células fúngicas, tales como levaduras, células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La selección de un huésped adecuado está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Normalmente, los vectores de expresión contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operablemente unido a la secuencia codificadora de interés. Dicho promotor puede ser constitutivo o inducible. La expresión “operablemente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en el modo previsto. Una secuencia control “operablemente unida” a una secuencia codificadora está unida de tal modo que se consigue la expresión de la secuencia codificadora en condiciones compatibles con las secuencias control.

Promotores adecuados para usar con huéspedes procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de β-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. De forma adicional, los promotores pueden incluir, por ejemplo, los promotores PR o PL del fago lamdba, promotores de bacteriófago T7, T3, Sp6, promotor de la proteasa alcalina de B. subtilis y el promotor de la amilasa maltogénica de B. stearothermophilus etc. Generalmente, los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Delgarno unida operablemente a la secuencia codificadora.

Para promotores funcionales en sistemas eucarióticas hay, por ejemplo, promotores de levaduras, tales como GAL1, GAL4, y otros promotores de gen glicolítico (véase, por ejemplo, Hitzeman y coI., 1980, J. BioI. Chem. 255: 12073-12080; Alber & Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434), promotor LEU2 (Martinez-Garcia y coI., 1989, Mol. Gen. Genet. 217: 464470), promotores del gen de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., 1982, en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y coI., eds., Plenum Press, NY), o el promotor TPI1 (patente de EE.UU. nº 4.599.311); promotores de insectos, tal como el promotor de polihedrina (patente de EE.UU. nº 4.745.051; Vasuvedan y coI., 1992, FEBS Lett. 311: 711), el promotor P10 (Vlak y col., 1988, J. Gen. Virol. 69: 765-776), el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis de Autographa californica (documento EP 397485), el promotor 1 del gen del promotor del gen inmediato-temprano de baculovirus (patentes de EE.UU. nº 5.155.037 y 5.162.222), el promotor del gen tardío-temprano de 39K de baculovirus (también las patentes de EE.UU. nº 5.155.037 y 5.162.222) y el promotor 2 temprano inmediato de OpMNPV; promotores de mamífero -el promotor de SV40 (Subramani y col., 1981, Mol. Cell. BioI. 1: 854-864), promotor de la metalotioneína (MT-1; Palmiter y coI., 1983, Science 222: 809-814), promotor principal tardío 2 de adenovirus (Yu y coI., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 9309, -21) y promotor de citomegalovirus (CMV) (Tong y coI., 1998, Anticancer Res.

18: 719-725), entre otros.

Un promotor seleccionado funcional en células eucariotas o procariotas también puede estar unido a secuencias que lo convierten inducible o específico de tejido. Por ejemplo, la adición de un elemento potenciador específico de tejido antes de un promotor seleccionado puede hacer que el promotor esté más activo en un tejido o tipo de célula dados. Como alternativa, o de forma adicional, se puede conseguir expresión inducible uniendo el promotor a cualquiera de una serie de elementos de secuencia que permiten inducción mediante, por ejemplo, cambios térmicos (sensible a la temperatura), tratamiento químico (por ejemplo inducible por iones metálicos o IPTG) o la adición de un antibiótico u otro agente inductor (por ejemplo tetraciclina).

En un aspecto preferido se usa un sistema de vector bacteriófago filamentoso para la expresión de la proteína de fusión polipeptídica, de modo que las proteínas se incorporan en el bacteriófago para su expresión sobre la superficie externa de la partícula del bacteriófago. Comercialmente se disponen de muchos vectores bacteriófagos filamentosos (vectores fagos) para usar que permiten la unión en el marco de al ADN que codifica la proteína de fusión péptido señal-cola-polipéptido de la región variable de inmunoglobulina a una proteína de la cubierta del bacteriófago. Los vectores más frecuentes aceptan insertos de ADN para las fusiones en el marco con las proteínas de la cubierta del bacteriófago del gen III o el gen VIII del bacteriófago VIII como se ha citado con anterioridad. Ejemplos no limitantes de vectores bacteriófagos adecuados incluyen vectores M13mp (Pharmacia Biotech), pCANTAB 5e (Pharmacia Biotech), pCOMB3 y M13KE (New England Biolabs), y otros tal como se describe en el documento WO 00/29555. Debe entenderse que estos vectores ya contienen secuencias del péptido señal de secreción del bacteriófago y que cada uno de estos vectores se puede modificar de modo que contenga la secuencia del péptido señal de secreción GAS1 mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (Sambrook y coI., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, y coI., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, N.Y., 1995.

En un aspecto, hay un sitio de reconocimiento de enzima de restricción está intercalado entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de secreción GAS1 y la secuencia que codifica un polipéptido de interés, por ejemplo un polipéptido de anticuerpo. Las endonucleasas de restricción y sus sitios de reconocimiento son bien conocidas para los expertos en la técnica. Una amplia variedad de endonucleasas de restricción, que reconocen una variedad de diferentes sitios de restricción, se describe en, por ejemplo, el catálogo de New England Biolabs (edición de 2004).

En otro aspecto, un constructo de ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria comprende una reordenación génica dicistrónica, es decir una ordenación en la que una única molécula de ARNm codifica dos polipéptidos distintos en dos regiones codificadoras distintas. La ordenación génica dicistrónica preferida comprende ácido nucleico que codifica un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina, cada uno de los cuales está operablemente unido en su extremo 5’ al extremo 3’ de un péptido señal de secreción GAS1. Aunque relativamente infrecuente en los sistemas eucarióticos, las ordenaciones codificadoras dicistrónicas son frecuentes en los sistemas procariotas. La preparación de un constructo dicistrónico es directa una vez que se tienen las secuencias de codificación individuales a mano, de modo que sólo se requieren técnicas de clonación estándar. Por tanto, un orden de secuencias para un constructo dicistrónico tal como se ha divulgado en la presente memoria es el siguiente: Promotor-secuencia señal-polipéptido 1-secuencia señal-polipéptido 2. Como se ha indicado, se prefiere que ambas secuencias señal sean una secuencia señal GAS1, aunque se puede usa otra secuencia señal para una de las secuencias señal si se desea. En una ordenación alternativa, la segunda secuencia señal está interna en la segunda secuencia polipeptídica. Construcción de bibliotecas:

Un aspecto implica la generación de bibliotecas de ácido nucleico y polipeptídicas que contienen diversos polipéptidos expresados como fusiones de una secuencia señal de secreción GAS1 como se ha descrito en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el término “biblioteca” se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por miembros, una pluralidad de los cuales tiene una secuencia única de polipéptido o de ácido nucleico. Hasta este punto, biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una mezcla sencilla de polipéptidos o ácidos nucleicos o puede estar en forma de organismos

o células, por ejemplo bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con una biblioteca de ácidos nucleicos. Normalmente, cada organismo individual o célula contiene sólo un miembro de la biblioteca. En ciertas aplicaciones, cada organismo o célula individual puede contener dos o más miembros de la biblioteca. De forma ventajosa, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. Por tanto, en un aspecto, una biblioteca puede tomar la forma de una población de organismos huésped, en la que cada organismo contiene una o más copias de un vector de expresión que contiene un único miembro de la biblioteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro polipeptídico correspondiente. Por tanto, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de variantes polipeptídicas diversas genéticamente.

De uso particular en la construcción de bibliotecas son sistemas de expresión de selección, que permiten que un ácido nucleico se una al polipéptido que expresa. Un sistema de expresión de selección es un sistema que permite la selección, por medios de expresión adecuados, de los miembros individuales de la biblioteca.

Se puede usar un sistema de expresión de selección junto con una biblioteca tal como se ha descrito en la presente memoria. Por ejemplo, las proteínas de fusión polipeptídica como se ha descrito en la presente memoria se pueden expresar sobre cápsides (cuerpos del fago) del fago lambda. Sistemas de selección preferidos de la invención son los sistemas de bacteriófagos filamentosos. Los protocolos de selección para aislar los miembros deseados de bibliotecas grandes se conocen en la técnica, tipificados mediante técnicas de expresión en fagos. Una ventaja de los sistemas de expresión basados en fagos es que, ya que son sistemas biológicos, determinados miembros de la biblioteca se pueden amplificar simplemente cultivando el fago que contiene el miembro seleccionado en la biblioteca en células bacterianas. Además, dado que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la biblioteca de polipéptidos está contenida en un fago o vector fago, la secuenciación, la expresión y la posterior manipulación genética es relativamente directa.

En la técnica se conocen bien los procedimientos para la construcción de bibliotecas de expresión de anticuerpos en bacteriófagos y bibliotecas de expresión en fago (McCafferty y coI., Nature, 348:552-554, 1990; Kang y coI., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88: 11120-11123, 1991; Clackson y coI., Nature, 352:624-628, 1991; Lowman y coI., Biochemistry, 30:1083210838, 1991; Burton y coI., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88:10134-10137, 1991; Hoogenboom y col., Nucleic Acid Res., 19:4133 4137, 1991; Chang y coI., J. lmmunol., 147:3610-3614, 1991; Breitling y coI., Gene, 104: 147 153, 1991; Marks y coI., J. BioI. Chem., 267:1600716010,1991; Barbas y coI., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:10164-10168,1992; Hawkins y Winter, Eur. J. lmmunol., 22:867-870, 1992; Marks y coI., J. BioI. Chem., 267:16007-16010, 1992; Lerner y col., Science, 258: 1313-1314, 1992). En resumen, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión del polipéptido de región variable de inmunoglobulina se clonan en un vector fago que comprende una señal de empaquetamiento de bacteriófagos y un gen de codifica al menos una proteína de la cubierta del bacteriófago tal como se ha descrito en la presente memoria o tal como se conoce en la técnica, que permite la incorporación del ácido nucleico en una partícula de fago.

Otros sistemas para generar bibliotecas de polipéptidos o polinucleótidos implican el uso de maquinaria enzimática sin células para la síntesis in vitro de los miembros de la biblioteca. Por ejemplo, la traducción in vitro puede usarse para sintetizar polipéptidos como procedimiento para generar bibliotecas grandes. Estos procedimientos se describen más a fondo en los documentos W088/08453, W090/05785, W090/07003, W091/02076, W091/05058, y W092/02536. Sistemas de expresión alternativos que no se basan en fagos, tales como los divulgados en el documento W095/22625 y el documento W095/11922 (Affymax), usan los polisomas para expresar polipéptidos para selección.

En la técnica se conocen bien procedimientos para genera diversas bibliotecas de proteínas de fusión polipeptídicas. Por ejemplo, el documento U.S. 6.696.245 describe la generación de diversas bibliotecas de polipéptidos de anticuerpo. Los procedimientos descritos en dicho documento normalmente implican la aleatorización de regiones seleccionadas de regiones codificadoras de gen de inmunoglobulina, en particular regiones codificadoras de VH y VL, mientras que dejan otras regiones no aleatorizadas. La patente ‘245 también describe la generación de constructos de scFV que comprenden dominios VH y VL aleatorizados de forma individual.

Las bibliotecas de dominios variables de inmunoglobulina pueden diseñarse de forma ventajosa de modo que estén basadas en una conformación predeterminada de la cadena principal. Dichas bibliotecas pueden construirse como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/20749. Por tanto, en un aspecto, un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina o anticuerpo de dominio sencillo condensado a un péptido señal de secreción GAS1 comprende un polipéptido de la región variable de la cadena pesada de anticuerpo o anticuerpo de dominio sencillo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácido del segmento VH de la línea germinal DP-47. En otro aspecto, un polipéptido de la región variable de inmunoglobulina o anticuerpo de dominio sencillo condensado con un polipéptido señal de secreción GAS1 comprende un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del segmento Vκ de la línea germinal DPK9. Dichos polipéptidos de región variable se pueden usar para la producción de scFv o Fab, por ejemplo un scFv o Fab que comprende (i) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del segmento VH de la línea germinal DP-47 y (ii) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del segmento Vκ de la línea germinal DPK9. Introducción de vectores en células huésped:

Los constructos de vectores o bibliotecas de constructos de vectores que contienen

moléculas polinucleotídicas como se describe en la presente memoria se pueden introducir en células huésped seleccionadas mediante cualquiera de una serie de procedimientos adecuados conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los constructos de vectores se pueden introducir en las células bacterianas adecuadas mediante infección, en el caso de partículas de vector bacteriófago tal como lambda o M13, o mediante cualquiera de una serie de procedimientos de transformación para vectores plasmídicos o para ADN de bacteriófago. Por ejemplo, todavía es de uso frecuente la transformación bacteriana estándar mediada por cloruro cálcico para introducir ADN desnudo en bacterias (Sambrook y coI., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), aunque también se puede usar la electroporación (Ausubel y col., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley &Sons, Inc., NY, NY)).

Para la introducción de constructos de vectores en levaduras u otras células fúngicas normalmente se usan procedimientos de transformación química (p. ej., como describen Rose y coI., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Para la transformación de, por ejemplo, S. cerevisiae, las células se tratan con acetato de litio para conseguir eficiencias de transformación de aproximadamente 104 unidades formadoras de colonias (células transformadas)/µg de ADN. Después, las células transformadas se aíslan en medio selectivo adecuado al marcador seleccionable usado. Como alternativa, o de forma adicional, cuando el vector codifica GFP como marcador, las placas o filtros obtenidos de las placas se pueden someter a detección de fluorescencia de GFP para identificar los clones transformados.

Para la introducción de vectores en células de mamífero, el procedimiento usado dependerá de la forma del vector. Los vectores plasmídicos se pueden introducir mediante cualquiera de una serie de procedimientos de transfección, incluida, por ejemplo, transfección mediada por lípidos (“lipofección”), transfección mediada por DEA-dextrano, electroporación o precipitación de fosfato cálcico. Estos procedimientos se detallan en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y coI., 1988, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY).

Existe una amplia disponibilidad de reactivos de lipofección y procedimientos adecuados para la transfección transitoria de una amplia variedad de células transformadas y no transformadas o primarias, lo que convierte a la lipofección en un atractivo procedimiento para introducir constructos en células eucariotas y, particularmente, de mamíferos en cultivo. Por ejemplo, se disponen kit LipofectAMINE™ (Life Technologies) o LipoTaxiTM (Stratagene). Otras empresas que ofrecen reactivos y procedimientos para lipofección incluyen Bio-Rad Laboratories, CLONTECH, Glen Research, InVitrogen, JBL Scientific, MBI Ferments, PanVera, Promega, Quantum Biotechnologies, Sigma-Aldrich y Wako Chemicals USA.

Polipéptidos de anticuerpo:

La molécula polinucleotídica unida a la secuencia codificadora del péptido señal de secreción GAS1 codifica un polipéptido de anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son granes moléculas proteicas de múltiples subunidades que comprenden al menos cuatro cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, la IgG humana tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que están unidas por disulfuro para formar el anticuerpo funcional. El tamaño de un IgG convencional es de aproximadamente 150 kD. Aunque los anticuerpos convencionales son muy útiles, esfuerzos considerables se han centrado en la identificación y producción de fragmentos de anticuerpo más pequeños que conservan su función de unión a antígeno y su solubilidad.

Las cadenas polipeptídicas pesada y ligera de los anticuerpos comprenden regiones variables (V) que participan directamente en las interacciones con el antígeno y regiones constantes (C) que proporcionan soporte estructural y funcionan en interacciones no específicas de antígeno con efectores inmunitarios. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional está compuesto por dos dominios distintos: un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL: que pueden ser Vκ oVλ). El propio sitio de unión a antígeno está formado por seis bucles polipeptídicos: Tres procedentes del dominio VH (H1, H2 y H3) y tres procedentes del dominio VL (L1, L2 y L3). In vivo, un diverso repertorio principal de genes V que codifican los dominios VH y VL se produce mediante la reordenación combinatoria de los segmentos génicos. Las regiones C incluyen las regiones C de la cadena ligera (denominadas regiones CL) y las regiones C de la cadena pesada (denominadas regiones CH1, CH2 y CH3).

Tras digestión con proteasa se ha identificado una serie de fragmentos de unión a antígeno más pequeños de anticuerpos naturales. Estos incluyen, por ejemplo, el “fragmento Fab” (VL-CL-CH1-VH), “fragmento Fab’” (un Fab con la región bisagra de la cadena pesada) y “fragmento F(ab’)2” (un dímero de fragmentos Fab’ unidos a través de la región bisagra de la cadena pesada). Se han usado procedimientos recombinantes para generar fragmentos de unión a antígeno todavía más pequeños, denominados “Fv de cadena sencilla” (fragmento variable) o “scFv”, constituidos por VL y VH unidas mediante un ligador peptídico sintético.

La tecnología de expresión en fagos (véase, por ejemplo, Smith, 1985, Science 228: 1315; Scott y Smith, 1990, Science 249: 386; McCafferty y coI., 1990, Nature 348: 552) proporciona un abordaje de la selección de polipéptidos de anticuerpo que se unen a una diana deseada de entre repertorios diversos granes de polipéptidos de anticuerpo. Estas bibliotecas de anticuerpos-fagos se pueden agrupar en dos categorías: bibliotecas naturales que usan genes V reordenados recogidos de células B humanas (Marks y col., 1991, J. Mol. BioI., 222: 581; Vaughan y coI., 1996, Nature Biotech., 14: 309) o bibliotecas sintéticas en las que los segmentos génicos V de línea germina se “reordenan” in vitro (Hoogenboom y Winter, 1992, J. Mol. BioI., 227: 381; Nissim y coI., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths y coI., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif y coI., 1995, J. Mol. BioI., 248: 97) o en las que CDR sintéticas se incorporan en un gen V reordenado sencillo (Barbas y coI., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Con mayor frecuencia, los polipéptidos de anticuerpo expresados sobre el fago comprenden fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno en lugar de moléculas de anticuerpo convencional. Como se ha indicado en lo que antecede, dichos fragmentos incluyen, por ejemplo, cadena pesada, cadena ligera, dímero cadena pesada-cadena ligera, un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un scFv o dominios variables de inmunoglobulina sencilla (véase más adelante). Los expertos en la técnica conocen los procedimientos para la preparación de bibliotecas de expresión en fagos que expresan varios fragmentos de anticuerpo. Dichos procedimientos también se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.696.245.

Aunque generalmente se sabe que la unidad de unión a antígeno de un anticuerpo natural (p. ej., en seres humanos y la mayoría de los demás mamíferos) está constituida por un par de regiones V (VL/VH), las especies de camélido expresan una gran proporción de anticuerpos completamente funcionales altamente específicos que están desprovistos de las secuencias de la cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos se encuentran en forma de homodímeros de una cadena pesada sencilla, dimerizados a través de sus regiones constantes. Los dominios variables de estos anticuerpos de cadena pesada de camélidos se denominan dominios VHH y conservan la capacidad, cuando están aislados en forma de fragmentos de la cadena VH, de unirse al antígeno con especificidad elevada ((Hamers-Casterman y coI., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi y coI., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Los dominios VH de unión a antígeno también se han identificado a partir de, por ejemplo, una biblioteca de genes de VH murinos amplificados de ADN genómico de los bazos de ratones inmunizados y expresados en E.coli (Ward y col., 1989, Nature 341: 544-546). Ward y col. denominaron a los dominios VH sencillos aislados “dAb” por “anticuerpos de dominio”. En la presente memoria, el término “dAb” hará referencia a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo (VH o VL) que se une específicamente al antígeno. Un “dAb” se une al antígeno de forma independiente de otros dominios V; no obstante, un “dAb” puede estar presente en un homo o heteromultímero con otros dominios VH o VL en el que los otros dominios no se requieren para la unión a antígeno por el dAb, es decir en el que el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios VH o VL adicionales. A continuación se describe la preparación de dominios variables de inmunoglobulina sencilla.

Un dominio variable de inmunoglobulina sencilla es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno (es decir, constante de disociación de 500 nM o menor) y que se une a antígeno como dominio variable sencillo; es decir, sin ningún dominio variable complementario. Por tanto, un anticuerpo de dominio variable sencillo incluye dominios variables del anticuerpo completo así como dominios variables modificados en los que, por ejemplo, uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables del anticuerpo, o dominios variables del anticuerpo que se han truncado o que comprenden extensiones en los extremos N o C, así como fragmentos plegados de los dominios variables que retienen una constante de disociación de 500 nM o menor (p. ej., 450 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especificidad por el antígeno diana del dominio de longitud completa. Preferentemente, un dominio variable sencillo de anticuerpo útil en la invención se selecciona del grupo de VH y VL, incluidos Vkappa y Vlambda.

Los dominios variables de inmunoglobulina sencilla se preparan de diversas formas. Para cada uno de estos abordajes son aplicables procedimientos bien conocidos de preparar

(p. ej., amplificar, mutar etc.) y manipular secuencias de ácido nucleico.

Un abordaje es amplificar y expresar la región VH o VL de un gen de cadena pesada o de cadena ligera para un anticuerpo clonado que se sabe que se une al antígeno deseado. Kabat y coI., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health &Human Services, Washington, D.C. han establecido los límites de los dominios VH y VL, así como otros dominios polipeptídicos de anticuerpo. La información sobre los límites de los dominios VH y VL de los genes de las cadenas pesada y ligera se usa para diseñar cebadores para PCR que amplifican el dominio V de una secuencia codificadora de cadena pesada o ligera clonada que codifica un anticuerpo que se sabe que se une a un antígeno dado. El dominio V amplificado se inserta en un vector de expresión adecuado, por ejemplo pHEN-1 (Hoogenboom y coI., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) y se expresa solo o como una fusión con otra secuencia polipeptídica. Se prefiere, como se describe en la presente memoria, que el dominio V (o cualquier otro dominio de anticuerpo) se exprese como una fusión con una secuencia señal polipeptídica GAS1. El dominio VH o VL expresado se somete a detección selectiva según la elevada afinidad de unión al antígeno deseado en aislamiento del resto del polipéptido de cadena pesada o ligera. Para todos los aspectos de la presente invención, la detección selectiva según la unión se realiza como se conoce en la técnica o como se describe en la presente memoria más adelante.

Un fago que expresa el repertorio de dominios de VH o VL se somete a detección

selectiva mediante “panning” contra el antígeno deseado. Los procedimientos para la construcción de bibliotecas de expresión en bacteriófagos y bibliotecas de expresión en el fago lambda son bien conocidos en la técnica y son enseñados por: McCafferty y coI., 1990, Nature

348: 552; Kang y coI., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson y coI., 1991, Nature 352: 624; Lowman y coI., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom y col., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang y coI., 1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling y coI., 1991, Gene 104: 147; Marks y coI., 1991, J. Mol. BioI. 222: 581; Barbas y coI., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks y col. (1992) J. BioI. Chem., 267: 16007; y Lerner y col. (1992) Science, 258: 1313. Las bibliotecas de fagos scFv se enseñan en, por ejemplo, Huston y coI., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary y coI., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty y coI.., 1990, supra; Clackson y coI., 1991, supra; Marks y coI., 1991, supra; Chiswell y coI., 1992, Trends Biotech. 10: 80; y Marks y coI., 1992, supra. Se han descrito varias formas de realización de bibliotecas de scFv expresadas en proteínas de la cubierta de bacteriófagos. También se conocen perfeccionamientos de abordajes de expresión en fagos, por ejemplo como se describen en el documento W096/06213 y el documento W092/01 047 (Medical Research Council y col.) y el documento W097/08320 (Morphosys, supra).

Como se ha indicado, el repertorio de dominios de VH o VL puede ser un repertorio natural de secuencias de inmunoglobulina o un repertorio sintético. Un repertorio natural es uno preparado a partir de, por ejemplo, células que expresan inmunoglobulina recogidas de uno o más animales, incluidos seres humanos. Dichos repertorios pueden ser “naive”, es decir preparados a partir de, por ejemplo, células que expresan inmunoglobulina de feto humano o de neonato, o reordenados, es decir preparados a partir de, por ejemplo, células B de humanos adultos. Los repertorios naturales se describen en, por ejemplo, Marks y coI., 1991,

J. Mol. BioI. 222: 581 y Vaughan y coI., 1996, Nature Biotech. 14: 309. Si se desea, los clones identificados de un repertorio natural, o cualquier repertorio, para dicha material, que se unen al antígeno diana se someten después a mutagénesis y detección selectiva posterior con el fin de producir y seleccionar variantes con mejores características de unión.

Los repertorios sintéticos de dominios variables de inmunoglobulina sencilla se preparan mediante introducción de forma artificial de una diversidad en un dominio V clonado. Los repertorios sintéticos se describen en, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1992, J. Mol. BioI. 227: 381; Barbas y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim y coI., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths y coI., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf y coI., 1995, J. Mol. BioI.

248: 97; y el documento WO 99/20749.

En un aspecto se pueden preparar repertorios de dominios variables sintéticos en antecedentes VH o Vκ, sobre la base de secuencias VH o Vκ de línea germinal diversificadas de forma artificial. Por ejemplo, el repertorio del dominio VH se basa en los segmentos génicos de VH de línea germinal clonados V3-23/DP47 (Tomlinson y coI., 1992, J. Mol. BioI. 227: 7768) y JH4b. El repertorio del dominio Vκ se basa en, por ejemplo, los segmentos génicos de Vκ de línea germinal clonados 02/0121DPK (Cox y coI., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) y Jκ1. La diversidad se introduce en éstos u otros segmentos génicos mediante, por ejemplo, mutagénesis por PCR. La diversidad se puede introducir de forma aleatoria mediante, por ejemplo, PCR propensa a error (Hawkins, y coI., 1992, J. Mol. BioI. 226: 889) o mutagénesis química. Como se ha comentado con anterioridad, se prefiere que la introducción de diversidad esté dirigida a residuos concretos. Adicionalmente se prefiere que los residuos deseados estén dirigidos mediante introducción del codón NNK usando cebadores mutagénicos (usando la nomenclatura de la IUPAC, en la que N= G, A, T o C, Y k= G o T), que codifica todos los aminoácidos y el codón de terminación TAG. También son de utilidad otros codones que alcanzan fines similares, incluido el codón NNN (que conduce a la producción de los codones de terminación adicionales TGA y TAA), el codón DVT ((A/G/T) (A/G/C)T), el codón DVC ((A/G/T)(A/G/C)C) y el codón DVY ((A/G/T)(A/G/C)(C/T). El codón DVT codifica el 22% se serina y 11% de tirosina,, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína, que simulan muy estrechamente la distribución de residuos de aminoácidos para los sitios de unión a antígeno de anticuerpos humanos naturales. Los repertorios se fabrican usando cebadores de PCR que tienen el codón o codones degenerados seleccionados en cada sitio que se van a diversificar. La mutagénesis por PCR es bien conocida en la técnica; no obstante, en la presente memoria se tratan consideraciones para el diseño del cebador y la mutagénesis por PCR útil en los procedimientos de la invención, en la sección titulada “Mutagénesis por PCR”. "

Los repertorios diversificados se clonan en vectores de expresión en fago como fusiones con un péptido señal de secreción GAS1 como se describe en la presente memoria. En general, las moléculas de ácido nucleico y los constructos de vector requeridos para la presente invención están disponibles en la técnica y se construyen y manipulan como se expone en los manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook y col. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA. Antígenos diana

Los antígenos diana para los polipéptidos de unión como se ha descrito en la presente memoria son antígenos humanos relacionados con una enfermedad o trastorno. Es decir, los antígenos diana como se describe en la presente memoria son dianas terapéuticamente relevantes. Una “diana terapéuticamente relevante” es una que, cuando se une a un polipéptido de unión, por ejemplo un dominio variable de inmunoglobulina sencilla u otro polipéptido de anticuerpo que se une al antígeno diana y actúa como antagonista o agonista de dicha actividad de la diana, tiene un efecto beneficioso sobre el individuo humano en el que se ha unido la diana. Un “efecto beneficioso” se demuestra en al menos una mejora del 10% en uno o más indicios clínicos de una enfermedad o trastorno, o, como alternativa, cuando se desea un uso profiláctico del polipéptido de unión, mediante un incremento de al menos 10% en el tiempo antes de observar los síntomas de la enfermedad o trastorno a los que se dirigen, respecto a un individuo no tratado con la preparación polipeptídica de unión. Ejemplos no limitantes de antígenos que son dianas adecuadas para los polipéptidos de unión como se describe en la presente memoria incluyen citoquinas, receptores de citoquinas, enzimas, cofactores enzimáticos o proteínas de unión a ADN. Citoquinas y factores de crecimiento adecuados incluyen, entre otros: ApoE, Apo-SM, BONF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF ácido, FGF básico, factor de crecimiento de fibroblastos -10, ligando de FLT3, Fractalkina (CX3C), GONF, G-CSF, GM-CSF, GF-β 1, insulina, IFN-g, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina α, Inhibina β, IP10, factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, Leptina, L1F, Limfotactina, sustancia inhibidora muleriana, factor inhibidor de las colonias de monocitos, proteína de atracción de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1β, MIP-3α , MIP-3β, MIP-4, factor inhibidor del progenitor mieloide-1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento neural, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, sitio de reconocimiento TACE, TGF-α, TGF-β, TGF-β 2, TGF-β 3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-α, TNF-β, receptor de TNF I (p55), receptor de TNF II, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor de VEGF 1, receptor de VEGF 2, receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4. Los receptores de citoquinas incluyen receptores para cada una de las citoquinas anteriores, por ejemplo, IL-1 R, IL-6R, IL-10R, IL-18R, etc. Se apreciará que esta lista es, de ningún modo, exhaustiva. Producción de un polipéptido seleccionado:

Una vez que un polipéptido se selecciona de una biblioteca de polipéptidos de fusión del péptido señal de secreción GAS1 expresados en forma de paquetes de expresión en fagos, dicho fago se puede usar para generar más del polipéptido. En un aspecto, el propio fago se puede usar para infectar células frescas, de modo que se produce el polipéptido. En otro aspecto, la secuencia codificadora se puede escindir junto con el péptido señal de secreción GAS1 del ácido nucleico del fago (p. ej., mediante digestión de restricción o mediante amplificación por PCR) e insertar en un vector de expresión adecuado. En este caso, cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped procariota, por ejemplo E. coli, el péptido señal de secreción GA1 dirigirá la secreción del polipéptido al especio periplásmico. En la alternativa, cuando la célula huésped es, por ejemplo, una célula de levadura, tal como S. cerevisiae, el polipéptido señal de secreción GAS1 dirigirá la secreción del polipéptido al medio. Los vectores y sistemas de células huésped adecuados para la producción de altos niveles de proteína son ampliamente conocidos y el experto en la técnica puede seleccionarlos.

En términos generales, se puede producir un polipéptido deseado introduciendo un vector que codifica dicho polipéptido bajo el control de un promotor fuerte o inducible en una célula huésped adecuada y cultivando la célula huésped en condiciones tales que se produce el polipéptido. En un aspecto, cuando el polipéptido deseado es un polipéptido de anticuerpo que comprende un polipéptido de VH y de VL, el procedimiento implica cultivar una célula huésped transformada con un vector que codifica un constructo dicistrónico, que tiene un promotor procariota que dirige la expresión de secuencias que codifican una VH y una VL, cada una de las cuales está condensada a un péptido señal de secreción GAS2 en condiciones tales que se expresan las secuencias polipeptídicas de VH y VL. Se requiere un abordaje similar cuando el constructo codifica únicamente una secuencia VH o VL condensada a un péptido señal de secreción GAS1, es decir un constructo monocistrónico. Los procedimientos de purificación proteica son bien conocidos para los expertos en la técnica. EJEMPLOS Ejemplo 1: Selección de péptidos señal eucariotas

El péptido señal GAS1 de levaduras se identificó como un péptido de señal de secreción candidato adecuado para usar en la expresión de proteínas de fusión en células tanto eucariotas como procariotas. En un aspecto, se deseaba maximizar la expresión de la proteína de fusión en células de E.coli. E coli usa un subconjunto específico de los 61 codones de aminoácidos disponibles para la producción de la mayoría de las moléculas de ARNm (Wada y col. 1992 NAR 20 P2111). Las regiones codificadoras del péptido señal inicial se optimizaron de acuerdo con este uso de codones de E.coli (véase la Figura 1) usando el vector NTI v7 (InVitrogen). El uso de codones se modificó para optimizar la naturaleza rica en A/T de la secuencia codificadora del péptido señal, se cambió cada nucleótido que podrían cambiarse a una A o T sin modificar el aminoácido codificado. Ejemplo 2. Comparación de los péptidos señal eucariotas

Los péptidos señal líder eucariotas del precursor de glucan 1,3-β-glucosidasa de levaduras y el precursor de la cadena b-I de la gonadotropina de salmón se clonaron en un vector de expresión basado en pUC119 bajo el control del promotor lacZ (Figura 2) para comparar con el péptido señal GAS1 de levaduras. Los péptidos señal se compararon por su capacidad para secretar dAb HEL4 en el periplasma. Los sobrenadantes de estos clones se analizaron en un ELISA de unión a lisozima (Figura 3). Los valores en la Figura 2 son las medias de cuatro cultivos analizados independientes. El péptido señal GAS con la secuencia nucleotídica rica en AR produjo las mejores señales en ELISA y esta variante de la secuencia líder GAS se usó en todos los experimentos siguientes que se describen más adelante. Ejemplo 3: Nivel de expresión de los péptidos señal eucariotas

Los niveles de expresión de dAb HEL4 se determinaron cuando se produjeron con GAS (rico en AT) frente al péptido señal del gen 3. La expresión de los dAb se indujo en cultivos de 50 ml y los dAb se purificaron del sobrenadante usando proteína A Sefarosa de un modo discontinuo. Los dAB purificados se analizaron en SDS-PAGE (Figura 4). El péptido señal GAS dio un rendimiento de 32 mg/l, que fue 2 veces mejor que el rendimiento de 14 mg/l obtenido usando el péptido señal Gen3. Ahora, el péptido señal GAS se ha usado para expresar más de 100 dAb diferentes. Los niveles de expresión varían entre 1 y 50 mg/l de sobrenadante de cultivo. Las diferencias en los niveles de expresión se deben, principalmente, a la secuencia del dAb concreto expresado. Ejemplo 4: Procesamiento y escisión precisos del péptido señal GAS

Los dAb purificados producidos con el péptido señal GAS (rico en AT) se usaron para la secuencia en N termina y análisis de espectrometría de masas. La secuenciación de las bandas proteicas representadas a partir del SDS-PAGE reductor dio la secuencia N terminal prevista nSTDIQc (SEC ID Nº 5). Esta es la secuencia esperada, ya que los dAb usados están precedidos por residuos de Ser-Thr que están presentes en el poliligador para alojar el sitio de clonación Sall.

La espectrometrías de masas mostró principalmente la presencia de un dAb de longitud completa procesado correctamente, incluidas las marcas en el extremo C 8xHIS y VSV con un peso molecular de 15669 daltons. Esto difiere en menos del 0,01% del valor predicho (PM= 15671). La secuenciación del N-terminal y la espectrometría de masas muestran que los dAb producidos con el péptido señal GAS están procesados y escindidos correctamente (datos no mostrados). Ejemplo 5. Actividad específica simular con el péptido señal GAS.

La actividad específica del dAb HLE4 producido con el péptido señal GAS (rico en AT) o gen3 se comparó en un ELISA de unión a antígeno (Figura 5). Esto muestra que el dAb HEL4 producido con GAS tiene una actividad específica mejor comparado con la producida con el péptido señal gen3. La disminución de la actividad específica se debe a la presencia de la

marca FLAG en el extremo N, que afecta a la unión de HEL4 a la lisozima. Esta disminución se ha observado con HEL4 en nuestro laboratorio y es independiente del péptido señal que se usa. Ejemplo 6: El péptido señal GAS funciona en el fago Fd.

El péptido señal GAS (rico en AT) se clonó en un vector de fago Fd para sustituir el péptido señal gen3 natural. Este péptido señal GAS se analizó por su capacidad para producir partículas de fago y se comparó con el péptido señal gen3. Los sobrenadantes producidos a partir de los clones se analizaron en ensayos ELISA por la unión a la lisozima o al anticuerpo anti-myc. La Figura 6 muestra que los fagos producidos con el péptido señal GAS o gen2 tienen un patrón de unión casi idéntico en el ELISA. Esto muestra que los niveles de expresión de los dAb sobre el fago son muy similares para el péptido señal GAS u gen3. Ejemplo 7: Biblioteca de fagos con el péptido señal GAS funciona en el fago Fd.

Se construyó una biblioteca de fagos grande usando el vector fago con un péptido señal GAS (rico en AT) y una marca myc en el extremo C. Se introdujo diversidad mediante combinación aleatoria de CDR1, CDR2 y CDR3 usando una PCR de ensamblaje, La biblioteca se pre-seleccionó usando proteína A o proteína L (que se unen correctamente a los dAb plegados), seguido de nuevo por ensamblaje combinatorio aleatorio de las regiones CDR. Este abordaje tuvo como resultado en la biblioteca de fagos de un vector más grande hasta la fecha, con un tamaño de 3,3 x 1010 de los cuales la mayoría (52%) es funcional.

Esta biblioteca se usó para seleccionar frente a siete antígenos proteicos diferentes y dio al menos 10 aglutinantes diferentes frente a cada antígeno. Las afinidades de los dAb seleccionados varían entre 20 µm y 10 mM. Se aislaron varios clones de dAb con actividad funcional (p. ej., bloqueo de la unión de la diana a su ligando) frente a la mayoría de las dianas. Un ejemplo de estas dianas es el TNF-α humano. Los dAb aislados se unen al TNF-α específicamente y bloquean la unión del TNF-α a su receptor TNF R1. Esto se ha mostrado en ensayos basados en ELISA (véase más adelante), asó como un ensayo basado en células usando la línea celular L929 (que se describe más adelante; véase la Figura 7). Se han obtenido resultados similares con una serie de otras dianas citoquinas.

En otra serie de experimentos se usó un abordaje similar de construcción de bibliotecas para generar una biblioteca todavía más grande. La biblioteca se construyó usando el vector fago fd con un péptido señal GAS (rico en AT) y una marca myc en el extremo C. Se introdujo diversidad de nuevo mediante combinación aleatoria de CDR1, CDR2 y CDR3 usando una PCR de ensamblaje, La biblioteca se preseleccionó usando proteína A o proteína L y se añadió una pre-selección adicional por clones termodinámicamente estables, que implicó tratamiento térmico a 80ºC del fago seguido por la selección en proteína A o proteína L. Esta biblioteca se sometió a detección selectiva contra ocho antígenos, lo que tuvo como resultado la identificación de diferentes dAb específicos para cada antígeno, teniendo cada dAb una CI50 o KD en el intervalo micromolar bajo a nanomolar bajo. Los antígenos incluyeron: TNFR1 (2 dAb diferentes identificados); TNF (6 dAb diferentes identificados); MSA (seroalbúmina de ratón; 4 dAb diferentes identificados); RSA (seroalbúmina de rata; diferentes dAb identificados); HSA (seroalbúmina humana; 7 dAb diferentes identificados); CD40L (9 dAb diferentes identificados); IL-4 (20 dAb diferentes identificados); y IL-13 (5 dAb diferentes identificados). ELISA para la inhibición de la unión a TNA-α

Los dAb anti-TNF-a se analizaron por su capacidad para inhibir la unión del TNF-α al receptor de TN recombinante 1 (p55). Brevemente, placas Maxisorp se incubaron durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón de Fc anti-humano (Zymed, San Francisco, EE.UU.). Los pocillos se lavaron con solución salina tamponado con fosfato (PBS) que contiene 0,05% de Tween-20 y, después, se bloquearon con 1% de BSA en PBS antes de incubar con 100 ng/ml de la proteína de fusión del receptor del TNF 1 Fc (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.). El dAb anti-TNF-a se mezcló con TNF-α, que después se añadió a los pocillos lavados a una concentración final de 10 ng/ml. La unión de TNF-α se detectó con 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF-α biotinilado (HyCult biotechnology, Uben, Países Bajos), seguido por una dilución de 1 en 500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano (Amersham Biosciences, 20 UK) e incubación con sustrato TMB (, Gaithersburg, MD). La reacción se detuvo mediante la adición de HCl y la absorbancia se leyó a 450 nm. La actividad inhibidora del dAb anti-TNF-α conduce a una disminución de la unión a TNF-α y, por tanto, a una disminución en la absorbancia en comparación con el control sólo de TNF-α. Ensayo de citotoxidad L929:

Los dAb anti-TNF-α se analizaron por la capacidad para neutralizar la actividad citotóxica del TNF-α en fibroblastos de ratón L929 (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). Brevemente, las células L929 se sembraron en placas de microtitulación se incubaron durante la noche con dAb anti-TNF-a, 100 pg/ml de TNF-α Y 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, Reino Unido). La viabilidad de las células se midió leyendo la absorbancia a 490 nm, seguido por una incubación con [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3 carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, EE.UU.). La actividad del dAb anti-TNF-α conduce a una disminución de la citotoxicidad de TNF-α y, por tanto, a un incremento en la absorbancia en comparación con el control sólo de TNF-α. LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Domanti LTD Dewildt, Rudolph M.T.

<120> Secuencia líder universal de GAS1

<130> 8039/2118

<140> No disponible todavía 45 <141> 2005-03-24

<150> US 60/555,764

<151> 2004-03-24

<160> 5

<170> Patentln versión 3.1

<210> 1

<211> 66

<212> ADN

<213> saccharomyces cerevisiae

<400> 1 atgttgttta aatccctttc aaagttagca accgctgctg ct~tttttgc tggcgtcgca 60 actgcg 66

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2 Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe . 15 10 15 Ala Gly Val Ala Thr Ala

20

<210> 3

<211> 66

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia líder GAS de S. cerevisiae optimizada para la expresión en E.coli

<400> 3

atgctgttta aaagcctgag caaactggcg accgcggcgg cgttttttgc gggcgtggcg 60 accgcg 66

<210> 4

<211> 66 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia nucleotídica líder GAS de S. cerevisiae modificada para expresión óptima 5 <400> 4

atgttattta aatcattatc aaaattagca accgcagcag cattttttgc aggcgtggca 60 acagcg 66

<210> 5

<211> 5 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido N-terminal codificado por la secuencia nucleotídica líder GAS1 rica en AT

<400> 5 15

ser.Thr ASP Ile Gln

15

35

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un bacteriófago que comprende una molécula polinucleotídica que comprenden un promotor unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica, en unión

   5 operable: una secuencia señal de secreción GAS1, un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina y una proteína de la cubierta de bacteriófago.
2. 2. Un bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho dominio variable de

   inmunoglobulina comprende un dominio variable de la cadena ligera. 10

3. 3.

   Un bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho dominio variable de inmunoglobulina comprende un dominio variable de la cadena pesada.

4. 4.

   Un bacteriófago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en

   15 el que la secuencia que codifica una secuencia del péptido señal de secreción GAS1 está unida operablemente en su extremo 3’ a una secuencia que codifica una proteína de la cubierta del bacteriófago.
5. 5. Un bacteriófago de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia que

   20 codifica una secuencia del péptido señal de secreción GAS1 está unida operablemente en su extremo 3’ a una secuencia que codifica un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina.
6. 6. Un bacteriófago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en

   25 el que el ácido nucleico que codifica la secuencia señal de secreción GAS1 tiene la secuencia de SEC ID Nº 3 o la SECIDNº 4.
7. 7. Un bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula polinucleotídica comprenden una unidad de transcripción dicistrónica que comprende un ácido

   30 nucleico que codifica un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina, estando el extremo 5’ de cada uno de los dominios variables de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina unido operablemente al extremo 3’ de una correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción GAS1.

   35

8. 8.

   Un bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la unidad de transcripción dicistrónica está unida operablemente a una secuencia promotora procariota.

9. 9.

   Un bacteriófago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,, en el que una enzima de restricción está intercalada entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de secreción GAS1 y la secuencia que codifica el dominio variable de inmunoglobulina.

10. 10.

    Un bacteriófago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende un promotor unido operablemente a la secuencia que codifica el péptido señal de secreción GAS1, en el que dicho promotor no es un promotor de ramnosa.

11. 11.

    Un bacteriófago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que además comprende un polipéptido codificado por la molécula polinucleotídica definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. 12.

    Uso de un bacteriófago para seleccionar, a partir de un repertorio de polipéptidos de dominio variable de inmunoglobulina, uno o más polipéptidos de dominio variable de inmunoglobulina que se unen a un ligando diana, en el que el procedimiento comprende:

    infectar las células huésped con una pluralidad de bacteriófagos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, de modo que expresen en dichas células huésped una biblioteca de polinucleótidos que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, codificando dichas moléculas diferentes polipeptídicos de dominio variable de inmunoglobulina, para producir la biblioteca de polipéptidos; y poner en contacto la biblioteca de polipéptidos con el ligando diana y seleccionar uno o más bacteriófagos que expresan polipéptidos que se unen al ligando diana.

13. 13.

    Uso de un bacteriófago para identificar un polipéptido de anticuerpo que se une a una diana deseada, en el que el procedimiento comprende introducir una biblioteca de polinucleótidos que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas en bacteriófagos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en una población de células huésped y seleccionar un miembro de la biblioteca que codifica un polipéptido que se une a la diana.