ES2655071T3 - Variantes de unión de anti-albúmina de suero mejoradas - Google Patents

Variantes de unión de anti-albúmina de suero mejoradas Download PDF

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Abstract

Un dominio variable único de inmunoglobulina de anti-albúmina sérica (SA) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Description

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complementarias, uno de las parejas de unión puede unirse de manera covalente al fármaco directamente o mediante un resto enlazante adecuado y la pareja de unión complementaria puede unirse de manera covalente a la variante directamente o mediante un resto enlazante adecuado. Cuando el fármaco es un polipéptido o péptido, la composición del fármaco puede ser una proteína de fusión, en la que el polipéptido o péptido, fármaco y el resto de unión de polipéptido son partes específicas (restos) de una cadena polipeptídica continua. Como se describe en este documento, los restos de unión al polipéptido y los restos de fármaco polipeptídicos pueden unirse directamente entre sí mediante un enlace peptídico, o unirse mediante un aminoácido, péptido o enlazante polipeptídico adecuado.
Un ligando que contiene una variante (monómero) de dominio variable único de la descripción o más de un dominio variable único (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, puede comprender adicionalmente una o más entidades seleccionadas de, pero preferiblemente no limitadas, un marcador, un marcaje, un dominio variable único adicional, un dAb, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un marcador y un fármaco. Una o más de estas entidades puede localizarse en el extremo COOH o en el extremo N o en ambos extremos N y COOH del ligando que comprende el dominio variable único, (de dominio variable único de inmunoglobulina o no inmunoglobulina). Una o más de estas entidades pueden localizarse en el extremo COOH, o en el extremo N, o en ambos extremos N y COOH del dominio variable único que se une específicamente a la albúmina de suero del ligando que contiene un dominio variable único (monómero) o más de un dominio variable único (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define en este documento). Los ejemplos no limitantes de marcadores que pueden posicionarse en uno o ambos de estos extremos incluyen un marcador HA, his o myc. Las entidades, que incluyen uno o más marcajes, marcadores y fármacos, pueden unirse al ligando que contiene un dominio variable único (monómero) o más de un dominio variable único (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define en este documento) que se une a la albúmina de suero, de manera directa o mediante enlazantes, como se describe anteriormente.
Un aspecto de la descripción proporciona un producto de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión o fusión con un péptido o conjugado con un fármaco NCE (nueva entidad química) que comprende un fármaco polipeptídico fusionado o conjugado (para un NCE) a cualquier variante como se describe anteriormente, en la que la variante es DOM7h-11-15 o DOM7h-11-15S12P (o una variante que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95, 96, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-11-15 o DOM7h-11-15S12P) o DOM-7h-11-12 (o una variante que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95, 96, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-11-15 o DOM7h-11-15S12P) . DOM7h-11-15, DOM7h-11-15S12P y DOM7h-11-12 producen únicamente una modesta disminución de la afinidad cuando se fusiona o se conjuga con la pareja haciéndole útil en los productos de fusión.
La invención proporciona una composición que comprende una variante, proteína de fusión, conjugado o ligando de cualquier aspecto de la invención y un diluyente, transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se incluye en este documento un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las variantes, proteínas de fusión, conjugados o ligandos descritos en este documento, por ejemplo, un ligando que contiene una variante de dominio variable único (monómero) de la invención o más de una variante de dominio variable único (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando de especificidad dual como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero o que se une específicamente a la albúmina de suero humana y al menos a una albúmina de suero no humana o fragmentos funcionalmente activos de los mismos. También se incluye en este documento un vector y/o un vector de expresión, una célula huésped que comprende el vector, por ejemplo, una célula vegetal o animal y/o una línea celular transformada con un vector, un método de expresión y/o de producción de una o más variantes, restos, proteínas de fusión o ligandos que contienen una variante de dominio variable único (monómero) o más de una variante de dominio variable único (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando específico dual como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, o fragmento (o fragmentos) de la misma codificada por dichos vectores, que incluye en algunos casos cultivar la célula huésped de manera que una o más variantes, proteínas de fusión, ligandos o fragmentos de los mismos se expresen y opcionalmente recuperen el ligando que contiene un dominio variable único (monómero) o más de un dominio variable único (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando específico dual, como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, del medio de cultivo de la célula huésped. También se incluyen métodos para poner en contacto un ligando descrito en este documento con albúmina de suero, que incluye albúmina de suero y/o albúmina (o albúminas) de suero no humanas, y/o una o más dianas distintas de la albúmina de suero, en la que las dianas incluyen moléculas biológicamente activas e incluyen proteínas de animales, citocinas como las enumeradas anteriormente e incluyen métodos en los que el poner en contacto se realiza in vitro así como la administración de cualquiera de las variantes, proteínas de fusión o ligandos descritos en este documento a un animal huésped individual o célula in vitro y/o ex vivo. Preferiblemente, la administración de ligandos descritos en este documento que comprenden un dominio variable único (inmunoglobulina o no inmunoglobulina) dirigidos a la albúmina de suero y/o albúmina (o albúminas) de suero no humanas, y uno o más dominios dirigidos a una o más dianas distintas a la albúmina de suero, aumentarán la semivida, incluyendo la semivida T beta y/o terminal del ligando anti-diana. Las moléculas de ácido
nucleico que codifican las variantes, proteínas de fusión o dominios sencillos que contienen ligandos o fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos funcionales de los mismos, se contemplan en este documento. Los vectores que codifican las moléculas de ácido nucleico que incluyen, pero preferiblemente no limitan, vectores de expresión, se contemplan en este documento, como también células huésped de una línea celular u organismo que contiene uno o más
5 de estos vectores de expresión. También se contemplan métodos para producir cualquier variante, proteína de fusión o ligando, incluyendo, pero preferiblemente sin limitación, cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores y células huésped mencionadas anteriormente.
Un aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de acuerdo con la invención o un ligando multiespecífico de la invención o una proteína de fusión de la invención.
10 Un aspecto de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de una variante de DOM7h-11 seleccionada de DOM7h-11-3, DOM7h-11-5, DOM7h-11-5S12P, DOM7h-11-12 y DOM7h-11-18 o una secuencia de nucleótidos que es al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica con respecto a dicha secuencia seleccionada.
Un aspecto de la invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. Un aspecto de la 15 invención proporciona una célula huésped aislada que comprende el vector.
Se hace referencia al documento WO2008/096158 para detalles de sistemas de vectores de bibliotecas, combinación de dominios variables sencillos, caracterización de ligandos específicos duales, estructura de ligandos específicos duales, estructuras para usar en la construcción de ligandos específicos duales, usos de dAb anti-albúmina de suero y ligandos multiespecíficos y ligandos que mejoran la semivida y composiciones y formulaciones que comprenden dAb anti
20 albúmina de suero. Estas descripciones proporcionan una guía de uso con la presente invención, que incluyen variantes, ligandos, proteínas de fusión, conjugados, ácidos nucleicos, vectores, huéspedes y composiciones de la presente invención.
Las secuencias de la variante DOM7h-14, que no son de acuerdo con la invención, se describen en una Solicitud de Patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente titulada IMPROVED ANTI-SERUM ALBUMIN
25 BINDING VARIANTS, presentada el mismo día que la presente solicitud. Estas secuencias de las variantes de DOM7h-14 son las SEQ ID Nº: 1-10 en la solicitud en trámite junto con la presente.
Secuencias
Tabla 1: Secuencias de Aminoácidos de dAbs Variante DOM7h-11
30
DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 1)
imagen10
imagen11
DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 2)
imagen12
imagen13
DOM7h-11-18 (SEQ ID NO: 3)
imagen14
imagen15
DOM7h-11-19 (SEQ ID NO: 4)
imagen16
imagen17
DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 5)
imagen18
Tabla 2: Secuencias de Nucleótidos de dAbs Variante DOM7h-11
DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 6)
imagen19
imagen20
DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 7)
imagen21
DOM7h-11-18 (SEQ ID NO: 8)
imagen22
imagen23
DOM7h-11-19 (SEQ ID NO: 9)
imagen24
imagen25
DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 10)
imagen26
Tabla 3: Secuencias de Aminoácidos de dAbs anti-TNFR1
>DOM1h-509 (SEQ ID NO: 11)
imagen27
imagen28
>DOM1h-510 (SEQ ID NO: 12)
imagen29
imagen30
>DOM1h-543 (SEQ ID NO: 13)
imagen31
imagen32
>DOM1h-549 (SEQ ID NO: 14)
imagen33
imagen34
>DOM1h-574 (SEQ ID NO: 15)
imagen35
imagen36
imagen37
>DOM1h-574-1 (SEQ ID NO: 16)
imagen38
imagen39
>DOM1h-574-2 (SEQ ID NO: 17)
imagen40
imagen41
>DOM1h-574-7 (SEQ ID NO: 18)
imagen42
imagen43
>DOM1h-574-8 (SEQ ID NO: 19)
imagen44
imagen45
>DOM1h-574-9 (SEQ ID NO: 20)
imagen46
imagen47
>DOM1h-574-10 (SEQ ID NO: 21)
imagen48
imagen49
>DOM1h-574-11 (SEQ ID NO: 22)
imagen50
imagen51
>DOM1h-574-12 (SEQ ID NO: 23)
imagen52
>DOM1h-574-13 (SEQ ID NO: 24)
imagen53
imagen54
>DOM1h-574-14 (SEQ ID NO: 25)
imagen55
imagen56
>DOM1h-574-15 (SEQ ID NO: 26)
imagen57
imagen58
>DOM1h-574-16 (SEQ ID NO: 27)
imagen59
imagen60
>DOM1h-574-17 (SEQ ID NO: 28)
imagen61
imagen62
>DOM1h-574-18 (SEQ ID NO: 29)
imagen63
imagen64
>DOM1h-574-19 (SEQ ID NO: 30)
imagen65
imagen66
>DOM1h-574-25 (SEQ ID NO: 31)
imagen67
imagen68
>DOM1h-574-26 (SEQ ID NO: 32)
imagen69
imagen70
imagen71
>DOM1h-574-27 (SEQ ID NO: 33)
imagen72
imagen73
>DOM1h-574-28 (SEQ ID NO: 34)
imagen74
imagen75
>DOM1h-574-29 (SEQ ID NO: 35)
imagen76
imagen77
>DOM1h-574-30 (SEQ ID NO: 36)
imagen78
imagen79
>DOM1h-574-31 (SEQ ID NO: 37)
imagen80
imagen81
>DOM1h-574-32 (SEQ ID NO: 38)
imagen82
imagen83
>DOM1h-574-33 (SEQ ID NO: 39)
imagen84
imagen85
>DOM1h-574-35 (SEQ ID NO: 40)
imagen86
imagen87
>DOM1h-574-36 (SEQ ID NO: 41)
imagen88
imagen89
>DOM1h-574-37 (SEQ ID NO: 42)
imagen90
imagen91
>DOM1h-574-38 (SEQ ID NO: 43)
imagen92
imagen93
>DOM1h-574-39 (SEQ ID NO: 44)
imagen94
imagen95
>DOM1h-574-40 (SEQ ID NO: 45)
imagen96
imagen97
>DOM1h-574-53 (SEQ ID NO: 46)
imagen98
imagen99
>DOM1h-574-54 (SEQ ID NO: 47)
imagen100
imagen101
>DOM1h-574-65 (SEQ ID NO: 48)
imagen102
imagen103
>DOM1h-574-66 (SEQ ID NO: 49)
imagen104
imagen105
imagen106
>DOM1h-574-67 (SEQ ID NO: 50)
imagen107
imagen108
>DOM1h-574-68 (SEQ ID NO: 51)
imagen109
imagen110
>DOM1h-574-69 (SEQ ID NO: 52)
imagen111
imagen112
>DOM1h-574-70 (SEQ ID NO: 53)
imagen113
>DOM1h-574-71 (SEQ ID NO: 54)
imagen114
imagen115
>DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 55)
imagen116
imagen117
>DOM1h-574-73 (SEQ ID NO: 56)
imagen118
imagen119
>DOM1h-574-74 (SEQ ID NO: 57)
imagen120
imagen121
>DOM1h-574-75 (SEQ ID NO: 58)
imagen122
imagen123
>DOM1h-574-76 (SEQ ID NO: 59)
imagen124
imagen125
>DOM1h-574-77 (SEQ ID NO: 60)
imagen126
imagen127
>DOM1h-574-78 (SEQ ID NO: 61)
imagen128
imagen129
>DOM1h-574-79 (SEQ ID NO: 62)
imagen130
imagen131
>DOM1h-574-84 (SEQ ID NO: 63)
imagen132
imagen133
>DOM1h-574-85 (SEQ ID NO: 64)
imagen134
imagen135
>DOM1h-574-86 (SEQ ID NO: 65)
imagen136
imagen137
>DOM1h-574-87 (SEQ ID NO: 66)
imagen138
imagen139
imagen140
>DOM1h-574-88 (SEQ ID NO: 67)
imagen141
imagen142
>DOM1h-574-90 (SEQ ID NO: 68)
imagen143
imagen144
>DOM1h-574-91 (SEQ ID NO: 69)
imagen145
imagen146
>DOM1h-574-92 (SEQ ID NO: 70)
imagen147
imagen148
>DOM1h-574-93 (SEQ ID NO: 71)
imagen149
imagen150
>DOM1h-574-94 (SEQ ID NO: 72)
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imagen152
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Tabla 4: Secuencias de Nucleótidos de dAbs anti-TNFR1
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>DOM1h-574-168 (SEQ ID NO: 293)
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imagen620
>DOM1h-574-173 (SEQ ID NO: 298)
imagen621
imagen622
>DOM1h-574-174 (SEQ ID NO: 299)
imagen623
imagen624
>DOM1h-574-175 (SEQ ID NO: 300)
imagen625
imagen626
>DOM1h-574-176 (SEQ ID NO: 301)
imagen627
imagen628
>DOM1h-574-177 (SEQ ID NO: 302)
imagen629
imagen630
>DOM1h-574-178 (SEQ ID NO: 303)
imagen631
imagen632
>DOM1h-574-179 (SEQ ID NO: 304)
imagen633
Tabla 5: Fusiones dAb anti-albúmina de suero (DOM7h)
(usada en estudios con ratas):-
Fusión DOM7h-14/Exendina-4
Número DMS 7138
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 305)
imagen634
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 306)
imagen635
imagen636
imagen637
Fusión DOM7h-14-10/Exendina-4
Número DMS 7139
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 307)
imagen638
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 308)
(usada en estudios con ratas):-
Fusión DOM7h-14/Exendina-4
Número DMS 7138
imagen639
imagen640
imagen641
Fusión DOM7h-14-18/Exendina-4
Número DMS 7140
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 309)
imagen642
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 310)
imagen643
imagen644
imagen645
Fusión DOM7h-14-19/Exendina-4
Número DMS 7141
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 311)
imagen646
imagen647
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 312)
imagen648
Fusión DOM7h-11/Exendina-4
Número DMS 7142
Fusión DOM7h-14-18/Exendina-4
Número DMS 7140
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 313)
imagen649
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 314)
imagen650
Fusión DOM7h-11-12/Exendina-4
Número DMS 7147
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 315)
imagen651
imagen652
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 316)
imagen653
Fusión DOM7h-11-15/Exendina-4
Número DMS 7143
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 317)
imagen654
imagen655
imagen656
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 318)
imagen657
Fusión DOM7h14-10/ G4SC-NCE
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 319) que codifica DOM7h14-10/G4SC
imagen658
La cisteína C-terminal se puede unir a una nueva entidad química (compuesto químico farmacéutico, NCE), por ejemplo, usando un enlace de maleimida.
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imagen660
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 320) que codifica DOM7h14-10/G4SC
imagen661
Fusión DOM7h14-10/TVAAPSC
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 321)
imagen662
La cisteína C-terminal se puede unir a una nueva entidad química (compuesto químico farmacéutico, NCE), por ejemplo, usando un enlace de maleimida.
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 322)
imagen663
(usada en estudios con ratones):-
Fusión DOM7h-11/DOM1m-21-23
Número DMS 5515
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 323)
imagen664
imagen665
Aminoácido más nucleótido más secuencia myc tag (SEQ ID NO: 324)
imagen666
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 325)
Fusión DOM7h14-10/TVAAPSC
imagen667
Nucleótido más secuencia myc tag (SEQ ID NO: 326)
imagen668
imagen669
Fusión DOM7h-11-12/DOM1m-21-23
Número DMS 5516
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 327)
imagen670
Aminoácido más nucleótido más secuencia myc tag (SEQ ID NO: 328)
imagen671
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 329)
Fusión DOM7h-11-12/DOM1m-21-23
Número DMS 5516
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Nucleótido más secuencia myc tag (SEQ ID NO: 330)
imagen673
imagen674
imagen675
DOM7h-11-15/DOM1m-21-23 fusion
Número DMS 5517
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 331)
imagen676
Aminoácido más nucleótido más secuencia myc tag(SEQ ID NO: 332)
imagen677
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 333)
Fusión DOM7h-11-12/DOM1m-21-23
Número DMS 5516
imagen678
imagen679
Nucleótido más secuencia myc tag (SEQ ID NO: 334)
imagen680
Cuando en esta tabla se indica una molécula marcada con myc, ésta era la versión usada en estudios PK en los ejemplos. Cuando no se proporcionan secuencias marcadas con myc, los estudios PK en los ejemplos no se realizaron con material marcado con myc, es decir, los estudios se realizaron con las construcciones mostradas no marcadas.
5
Ejemplificación
En el apartado experimental toda la numeración se realiza de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interest, 5ª ed. (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institues of Health, Bethesda, MD, 1991)).
10 Se describen variantes derivadas de DOM7h-11 y DOM7h-14. Las variantes DOM7h-14 no son de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1: Maduración de Afinidad Vk
Selecciones:
Se obtuvieron antígenos de HSA (Albúmina de Suero Humana) y RSA (Albúmina de Suero de Rata) de Sigma
15 (esencialmente sin ácidos grasos, 99% (electroforesis en gel de agarosa), polvo liofilizado Cat. Nº A3782 y A6414, respectivamente).
Se prepararon productos biotinilados de los dos antígenos anteriores usando Sulfo-NHS-SS-Biotina unida a Ez (Pierce, Cat. Nº 21331). El reactivo sin biotina se eliminó pasando las muestras dos veces a través de una columna de desalinización PD10 seguido de diálisis durante una noche frente un volumen sobrante 1000x de PBS a 4ºC. El producto
20 resultante se ensayó por espectrofotometría de masas y se observaron 1-2 biotinas por molécula.
Bibliotecas de maduración de afinidad:
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imagen682
mediante exploración de velocidad de disociación. Los clones se secuenciaron revelando secuencias dAb únicas.
La identidad mínima de los clones seleccionados con respecto al parental (a nivel de aminoácidos) eral del 97,2% (DOM7h-11-3: 97,2%, DOM7h-11-12: 98,2%, DOM7h11-15: 96,3%, DOM7h-11-18: 98,2%, DOM7h-11-19: 97,2%).
La identidad mínima de los clones seleccionados con respecto al parental (a nivel de aminoácidos) era del 96,3% 5 (DOM7h-14-10: 96,3%, DOM7h-14-18: 96,3%, DOM7h-14-19: 98,2%, DOM7h-14-28: 99,1%, DOM7h-14-36: 97,2%).
Los dAb únicos se expresaron como sobrenadantes bacterianos en un matraz agitador de 2,5 l en medio Onex a 30ºC durante 48 h a 250 rpm. Los dAb se purificaron del medio de cultivo mediante absorción por proteína L agarosa seguido de elución con glicina 10 mM pH 2,0. La unión a HSA, CSA, MSA y RSA por BIAcore se confirmó usando proteína purificada a 3 concentraciones 1 M, 500 nM y 50 nM. Para determinar la afinidad de unión (KD) de los AlbudAbs para
10 cada albúmina de suero; los dAb purificados se analizaron por BIAcore sobre un intervalo de concentración de albúmina de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM).
Tabla 6
AlbudAb
Afinidad (KD) para SA (nM) Kd Ka
Rata
DOM7h-14
60 2,095E-01 4,00E+06
DOM7h-14-10
4 9,640E-03 4,57E+06
DOM7h-14-18
410 2,275E-01 5,60E+05
DOM7h-14-19
890 2,870E-01 3,20E+05
DOM7h-14-28
45 (140) 7,0E-02 (1,141e-1) 2,10E+06 (8,3e5)
DOM7h-14-36
30 (6120) 2,9E-02 (5,54e-2) 1,55E+06 (9e3)
DOM 7h-11
2100 1,00E-01 4,80E+04
DOM 7h-11-3
10000 (88000) (7,18e-1) (8,11e3)
DOM7h-11-12
200 5,22E-01 2,76E+06
DOM7h-11-15
20 2,10E-02 1,10E+06
DOM7h-11-18
80 (29000) 6,0E-02 (3,7e-1) 1,64E+06 (1,3e4)
DOM7h-11-19
28 (17000) 9,1e-02 (1,4e-1) 9,80E+05 (8,1e3)
Cyno
DOM 7h-14
66 9,65E-02 1,50E+06
DOM7h-14-10
9 1,15E-02 1,60E+06
DOM7h-14-18
180 1,05E-01 6,30E+5
DOM7h-14-19
225 1,56E-01 7,00E+05
DOM7h-14-28
66 (136) 1,3E-01 (1,34e-1) 2,50E+06 (9,8e5)
DOM7h-14-36
35 (7830) 1,9E-02 (1,1e-1) 9,80E+06 (1,43e4)
DOM 7h-11
1000 6,82E-01 8,00E+05
AlbudAb
Afinidad (KD) para SA (nM) Kd Ka
DOM 7h-11-3
670 (200) 9,6E-02 (1,5e-1) 2,90E+05 (7,26e5)
DOM7h-11-12
6000
DOM7h-11-15
3 5,57E-03 5,80E+06
DOM7h-11-18
10000 (65000) 1,36 (4,8e-1) 2,25E+05 (7,3e3)
DOM7h-11-19
10000 (375000) (6,2e-1) (1,7e3)
Ratón
DOM 7h-14
12 4,82E-02 4,10E+06
DOM7h-14-10
30 3,41E-02 1,29E+06
DOM7h-14-18
65 9,24E-02 2,28E+06
DOM7h-14-19
60 5,76E-02 1,16E+06
DOM7h-14-28
26 (31) 3,4E-02 (7,15e-2) 1,60E+06 (2,28e6)
DOM7h-14-36
35 (33) 2,3E-02 (7,06e-2) 8,70E+05 (2,11e6)
DOM 7h-11
5000 9,00E-01
DOM 7h-11-3
10000 (36000) (6,12e-1) (1,67e4)
DOM7h-11-12
130 1,89E-01 1,53E+06
DOM7h-11-15
10 9,40E-03 1,10E+06
DOM7h-11-18
150 (1600) 2,4E-02 (6,23e-2) 4,40E+05 (4e4)
DOM7h-11-19
100 (18000) 3,7E-02 (8,8e-2) 1,40E+06 (4,9e3)
Humana
DOM 7h-14
33 4,17E-02 1,43E+06
DOM 7h-14-10
12 1,39E-02 1,50E+06
DOM 7h-14-18
280 3,39E-02 1,89E+05
DOM 7h-14-19
70 5,25E-02 8,26E+05
DOM 7h-14-28
30 (8260) 3,3E-02 (5,6e-2) 1,24E+06 (6,78e3)
DOM 7h-14-36
28 (1260) 2,4E-02 (6,7e-2) 1,23E+06 (5,4e4)
DOM 7h-11
2800 6,41E-01 7,00E+05
DOM 7h-11-3
32 (130) 1,6E-02 (2,35e-2) 6,50E+05 (1,86e5)
DOM7h-11-12
350 4,13E-01 1,26E+06
AlbudAb
Afinidad (KD) para SA (nM) Kd Ka
DOM7h-11-15
1 1,84E-03 2,00E+06
DOM7h-11-18
36 (32000) 5,1E-02 (2,7e-1) 3,40E+06 (8,39e3)
DOM7h-11-19
65 (38000) 1,1E-01 (2,09e-1) 1,80E+06 (5,4e3)
*: los valores entre paréntesis proceden de un segundo experimento SPR independiente.
Todas las variantes derivadas de DOM7h-14 tienen reactividad cruzada para la albúmina de suero de ratón, rata, ser humano y cyno. DOM7h-14-10 tenía afinidad mejorada para la albúmina de suero de rata, cyno y ser humano en comparación con la parental. DOM7h-14-28 tenía afinidad mejorada para RSA. DOM7h-14-36 tenía afinidad mejorada
5 para RSA, CSA y MSA.
DOM7h-11-3 tenía afinidad mejorada para CSA y HSA. DOM7h-14-12 tenía afinidad mejorada para RSA, MSA y HSA. DOM7h-11-15 tenía afinidad mejorada para RSA, MSA, CSA y HSA. DOM7h-11-18 y DOM7h-11-19 tenía la afinidad mejorada para RSA, MSA y HSA.
Ejemplo 3: Orígenes de clones clave del linaje DOM7h-11:
10 DOM7h-11-3: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51, S53), producción de la ronda 3 HSA 10 nM.
DOM7h-11-12: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 (HSA, 100 nM) con tripsina 100 g/ml.
DOM7h-11-15: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas 15 adicionales de selección frente a RSA usando la biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51, S53) a selección de 3 rondas con 1 nM de RSA.
DOM7h-11-18: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas adicionales de selección frente a RSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 con 20 nM de RSA.
DOM7h-11-19: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas de 20 selección adicionales frente a RSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 con 5 nM de RSA.
Tabla 7: Secuencias CDR (de acuerdo con Kabat; ref. como se ha indicado anteriormente) Ejemplo 4: Orígenes de clones clave del linaje DOM7h-14:
AlbudAb
CDR
CDR1
CDR2 CDR3
DPK9 Vk ficticia
SQSISSYLN (SEQ ID NO: 335) YAASSLQS (SEQ ID NO: 336) QQSYSTPNT (SEQ ID NO: 337)
DOM7h-11
SRPIGTTLS (SEQ ID NO: 338) WFGSRLQS (SEQ ID NO: 339) AQAGTHPTT (SEQ ID NO: 340)
DOM7h-11-12
SRPIGTMLS (SEQ ID NO: 341) LFGSRLQS (SEQ ID NO: 342) AQAGTHPTT (SEQ ID NO: 343)
DOM 7h-11-15
SRPIGTMLS (SEQ ID NO: 344) LAFSRLQS (SEQ ID NO: 345) AQAGTHPTT (SEQ ID NO: 346)
DOM 7h-11-18
SRPIGTMLS (SEQ ID NO: 347) WFGSRLQS (SEQ ID NO: 348) AQAGTHPTT (SEQ ID NO: 349)
DOM 7h-11-19
SRPIGTMLS (SEQ ID NO: 350) LFGSRLQS (SEQ ID NO: 351) AQTGTHPTT (SEQ ID NO: 352)
AlbudAb
CDR
CDR1
CDR2 CDR3
DOM 7h-11-3
SRPIGTTLS LWFSRLQS AQAGTHPTT
(SEQ ID NO: 353)
(SEQ ID NO: 354) (SEQ ID NO: 355)
DOM7h-14-19: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca propensa a error, producción ronda 3 (HSA, 100 nM) con tripsina 100 g/ml.
DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca de CDR3 (Y92, Y93, T94, N96), producción ronda 3.
Tabla 8: Secuencias CDR (de acuerdo con Kabat); ref. como se ha indicado anteriormente)
AlbudAb
CDR
CDR1
CDR2 CDR3
DPK9 Vk ficticia
SQSISSYLN (SEQ ID NO: 335) YAASSLQS (SEQ ID NO: 336) QQSYSTPNT (SEQ ID NO: 337)
DOM 7h-14
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 356) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 357) AQGAALPRT (SEQ ID NO: 358)
DOM 7h-14-10
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 359) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 360) AQGLRHPKT (SEQ ID NO: 361)
DOM 7h-14-18
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 362) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 363) AQGLMKPMT (SEQ ID NO: 364)
DOM 7h-14-19
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 365) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 366) AQGAALPRT (SEQ ID NO: 367)
DOM 7h-14-28
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 368) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 369) AQGAALPKT (SEQ ID NO: 370)
DOM 7h-14-36
SQWIGSQLS (SEQ ID NO: 371) MWRSSLQS (SEQ ID NO: 372) AQGFKKPRT (SEQ ID NO: 373)
Ejemplo 5: Expresión y Caracterización Biofísica:
10 El nivel de expresión bacteriano se determinó de la manera habitual en matraces de agitación de 2,5 l seguido del cultivo en medio Onex a 30ºC durante 48 horas a 250 rpm. Las características biofísicas se determinaron por SEC MALLS y DSC.
SEC MALLS (cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz LÁSER multiángulo) es una técnica no invasiva para la caracterización de macromoléculas en solución. En resumen, las proteínas (a una concentración de 1 15 mg/ml en tampón PBS de Dubelcco a 0,5 ml/min) se separaron de acuerdo con sus propiedades hidrodinámicas por cromatografía de exclusión por tamaño (columna: TSK3000 de TOSOH Biosciences; S200 de Phamarcia). Después de laseparación, se midió la propensión de la proteína a la dispersión lumínica usando un detector de dispersión de luz LÁSER multiángulo (MALLS). La intensidad de la luz dispersa cuando la proteína pasa a través del detector se mide como una función de ángulo. Esta medida tomada junto con la concentración de la proteína determinada usando el detector de 20 índice refractivo (RI) permite calcular la masa molar usando ecuaciones apropiadas (parte integral del análisis informático
Astra v.5.3.4.12).
DSC (Calorimetría de Escáner Diferencial): en resumen, la proteína se calentó a una velocidad constante de 180 ºC/h (a 1 mg/ml en PBS) y se midió un cambio térmico detectable asociado a la desnaturalización térmica. Se determinó el punto medio de transición (appTm), que se describe como la temperatura en la cual el 50% de la proteína se encuentra en su conformación nativa y el otro 50% desnaturalizada. En este caso, el valor DSC determinó el punto medio de transición aparente (appTm) ya que la mayoría de las proteínas examinadas no estaban completamente replegadas. A mayor Tm, más estable era la molécula. Las curvas desdobladas se analizaron mediante ecuaciones que no eran de 2 estados. El paquete informático usado era OriginR v7.0383.
Tabla 9
AlbudAb
Parámetros Biofísicos
SEC MALLS
DSC Tm (ºC)
DOM7h-14
M 60
DOM 7h-14-10
M 59
DOM 7h-14-18
M 58
DOM 7h-14-19
M 59
DOM 7h-14-28
M 58,3/60,2
DOM 7h-14-36
M 59,2
DOM 7h-11
M 66,9-72,2
DOM 7h-11-3
M (95%)* 66,6/70,5
DOM 7h-11-12
M (<2% D) 71,7
DOM 7h-11-15
M (<5% D) 58,5-60,5
DOM 7h-11-18
M (98%) 58,9/65,8
DOM 7h-11-19
M 71,8/76,6
10 *en otro ensayo, se observó principalmente el monómero mediante SEC MALLS, aunque inferior al 95%.
En la Tabla 9 se observan los niveles de expresión para todos los clones en el intervalo de 15 a 119 mg/l en E. coli.
En las variantes DOM7h-14 y DOM7h-11, durante la maduración de afinidad se mantuvieron los parámetros biofísicos favorables (monoméricos en solución según se determina por SEC MALL y appTm >55 ºC según se determina por DSC) y los niveles de expresión. El estado monomérico es ventajoso porque evita la dimerización y el riesgo de productos que
15 puedan entrecruzarse con las dianas tales como receptores de la superficie celular.
Ejemplo 6: Determinación de semivida en suero en rata, ratón y mono Cynomolgus
Se clonaron AlbudAbs DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-19, DOM7h-11, DOM7h11-12 y DOM7h-11-15 en el vector pDOM5. Para cada AlbudAb, se expresaron cantidades de 20-50 mg en E. coli y se purificaron del sobrenadante de cultivo bacteriano usando la resina de afinidad para proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH 2. Las proteínas se
20 llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, el tampón se intercambió a PBS y la endotoxina se agotó usando columnas de giro Q (Vivascience). Para realizar el análisis farmacocinético (PK) de rata, se dosificaron AlbudAbs como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg usando 3 ratas por compuesto. Las muestras de suero se tomaron a 0,16, 1, 4, 12, 24, 48, 72, 120, 168 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
25 Para el PK de ratón, se dosificaron DOM7h-11, DOM7h11-12 y DOM7h-11-15 como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg por dosis a un grupo de 3 sujetos y las muestras de suero se tomaron a 10 min; 1 h; 8 h; 24 h; 48 h; 72 h; 96 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
Para el PK del mono Cynomolgus se dosificaron DOM7h-14-10 y DOM7h11-15 como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg por dosis a un grupo de tres hembras de mono Cynomolgus y las muestras de suero se tomaron a 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
Método de ELISA anti-myc
5 La concentración de AlbudAb en suero se midió por ELISA anti-myc. En resumen, en placas Nunc Maxisorp de 96 pocillos, se revistió durante una noche anticuerpo policlonal de cabra anti-myc (1:500; Abcam, catálogo número ab9132) y se bloqueó con BSA/PBS al 5% + tween al 1%. Se añadieron muestras de suero a un intervalo de diluciones junto a concentraciones conocidas convencionales. La unión de AlbudAb marcado con myc se detectó a continuación usando un anti-Vk policlonal de conejo (1:1000; reactivo casero, las extracciones se agruparon y la proteína A se purificó antes del
10 uso) seguido de un anticuerpo HRP anti-IgG de conejo (1:10.000; Sigma, catálogo número A2074). Las placas se lavaron entre cada etapa del ensayo con PBS 3 x + Tween 20 al 0,1% seguido de PBS 3 x. Después del último lavado se añadió TMB (Sustrato de Peroxidasa para Micropocillo de Componente SureBlue TMB1, KPL, catálogo número 52-00-00) y se dejó desarrollar. El proceso se detuvo con HCl 1 M y después se midió la señal usando una absorbancia a 450 nm.
A partir de datos ELISA sin procesar, la concentración de muestras desconocidas se estabilizó por interpolación frente a la
15 curva convencional teniendo en cuenta los factores de dilución. La concentración media que resulta de cada momento se determinó a partir de valores de repetición y se introdujeron en un paquete de análisis WinNonLin (por ejemplo, versión
5.1 (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.). Los datos se ajustaron usando un modelo nocompartimental, en el que los parámetros PK se estimaron mediante el programa informático para proporcionar las semividas terminales. La información de la dosificación y los momentos se seleccionaron para reflejar la fase terminal de
20 cada perfil PK.

Tabla 10: PK de AlbudAb Sencillo
Especie
AlbudAb Albúmina KD (nM) Parámetros PK
AUC h x g/ml
CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
DOM7h-14* 60
DOM7h-14-10
4 2134,6 1,2 42,1 71,2
DOM7h-14-18
410 617,3 4,1 38,4 228,1
DOM7h-14-19
890 632,6 4,1 36,3 213,3
DOM7h-11
2100 320,1 7,8 23,3 263,9
DOM7h-11-12
200 398,7 6,4 35,5 321,2
DOM7h-11-15
20 843,4 3,0 30,3 130,7
Ratón
DOM7h-11 5000 304,7 8,2 18,3 216,8
DOM7h-11-12
130 646,6 3,9 43,9 244,8
DOM7h-11-15
10 499,2 5,0 33,7 243,4
Cyno
DOM7h-14* 66 217,5
DOM7h-14-10
9 6174,6 0,4 200,8 117,8
imagen683
extensión de solapamiento simple) usando únicamente los cebadores flanqueantes. IFN2b SOE fragmento 5’ GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEQ ID NO: 380) Vk SOE fragmento 3’ para introducir también GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC
un marcador myc
TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 381) La digestión del producto PCR ensamblado se realizó con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y el gen se ligó en los sitios correspondientes en el pDOM50, un vector de expresión de mamíferos que es un derivado de pTT5 con una secuencia líder secretora IgG de ratón V-J2-C N-terminal para facilitar la expresión en el medio celular.
5 Secuencia líder (aminoácidos): METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 382) Secuencia líder (nucleótidos): ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC (SEQ ID NO: 383) Se preparó un ADN plasmídico usando QIAfilter megaprep (Qiagen). Se transfectó ADN 1 g /ml con Fectin-293 en
10 células HEK293E y se cultivaron en medio sin suero. La proteína se expresó en el cultivo durante 5 días y se purificó del sobrenadante del cultivo usando la resina de afinidad a proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH 2. Las proteínas se llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, se cambió el tampón a PBS y las endotoxinas se agotaron usando columnas de giro Q (Vivascience).
Tabla 11: Secuencias de interferón alfa 2b-AlbudAb con y sin marcador-myc (como secuencias de aminoácidos y 15 nucleótidos)
El Interferón alfa 2b es N-terminal con respecto a AlbudAb en las siguientes fusiones.
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
DMS7321 (IFN2b-DOM7h-14)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEQ ID NO: 384) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR (SEQ ID NO: 386) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTG CGGCGTTGCCTAG GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEQ ID NO: 385)
GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTG CGGCGTTGCCTAG GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGG (SEQ ID NO: 387)
DMS732 (IFN2b-
CDLPQTHSLGSRRT TGCGACTTGCCAC CDLPQTHSLGSRRT TGCGACTTGCCAC
DOM7h-14-10)
LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGLRHPKTFG QGTKVEIKR AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGLRHPKTFG QGTKVEIKR (SEQ AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
AAAEQKLISEEDLN*
TGAACGATCTAGA ID NO: 390) TGAACGATCTAGA
(SEQ ID NO: 388)
GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTT TGAGGCATCCTAA GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEQ ID NO: 389) GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTT TGAGGCATCCTAA GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGG (SEQ ID NO: 391)
DMS7323 (IFN2b-DOM7h-1418)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGLMKPMTFG QGTKVEIKRAAAEQ KLISEEDLN* (SEQ ID NO: 392)
CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTC TTATGAAGCCTATG ACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGA AATCAAACGGGCG GCCGCAGAACAAA AACTCATCTCAGA AGAGGATCTGAAT TAA (SEQ ID NO: 393) ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGLMKPMTFG QGTKVEIKR (SEQ ID NO: 394) CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTC TTATGAAGCCTATG ACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGA AATCAAACGG (SEQ ID NO: 395)
DMS7324 (IFN2b-
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
DOM7h-14-19)
LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTISCRASQWIG SQLSWYQQKPGEA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEQ ID NO: 396) GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTcTC CATCCTCCCTGTCT GCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCAT CTCTTGCCGGGCA AGTCAGTGGATTG GGTCTCAGTTATCT TGGTACCAGCAGA AACCAGGGGAAGC CCCTAAGCTCCTG ATCATGTGGCGTT CCTCGTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAC GTTTCAGTGGCAG TGGATCTGGGACA GATTTCACTCTCAC CATCAGCAGTCTG CAACCTGAAGATTT TGCTACGTACTACT GTGCTCAGGGTGC GGCGTTGCCTAGG ACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGA LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTISCRASQWIG SQLSWYQQKPGEA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR (SEQ ID NO: 398) GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTcTC CATCCTCCCTGTCT GCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCAT CTCTTGCCGGGCA AGTCAGTGGATTG GGTCTCAGTTATCT TGGTACCAGCAGA AACCAGGGGAAGC CCCTAAGCTCCTG ATCATGTGGCGTT CCTCGTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAC GTTTCAGTGGCAG TGGATCTGGGACA GATTTCACTCTCAC CATCAGCAGTCTG CAACCTGAAGATTT TGCTACGTACTACT GTGCTCAGGGTGC GGCGTTGCCTAGG ACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGA
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
AATCAAACGGGCG GCCGCAGAACAAA AACTCATCTCAGA AGAGGATCTGAAT TAA (SEQ ID NO: 397)
AATCAAACGG (SEQ ID NO: 399)
DMS7325 (IFN2b-DOM7h-11)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT TLSWYQQKPGKAP KLLIWFGSRLQSGV PSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYY CAQAGTHPTTFGQ GTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEQ ID NO: 400) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCGTCCGATT GGGACGACGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCTGGTTTGGT TCCCGGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT TLSWYQQKPGKAP KLLIWFGSRLQSGV PSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYY CAQAGTHPTTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 402) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCGTCCGATT GGGACGACGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCTGGTTTGGT TCCCGGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEQ ID NO: 401)
AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGG (SEQ ID NO: 403)
DMS7326 (IFN2b-DOM7h-1112)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT MLSWYQQKPGKAP KLLILFGSRLQSGVP SRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC AQAGTHPTTFGQG TKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEQ ID NO: 404) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT MLSWYQQKPGKAP KLLILFGSRLQSGVP SRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC AQAGTHPTTFGQG TKVEIKR (SEQ ID NO: 406) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
AAGTCGTCCGATT GGGACGATGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCTTGTTTGGT TCCCGGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEQ ID NO: 405
AAGTCGTCCGATT GGGACGATGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCTTGTTTGGT TCCCGGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGG (SEQ ID NO: 407)
DMS7327 (IFN2b-DOM7h-1115)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT MLSWYQQKPGKAP KLLILAFSRLQSGVP SRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC AQAGTHPTTFGQG TKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEQ ID NO: 408) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT MLSWYQQKPGKAP KLLILAFSRLQSGVP SRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC AQAGTHPTTFGQG TKVEIKR (SEQ ID NO: 410) TGCGACTTGCCAC AGACACATAGTTTG GGATCAAGAAGAA CATTGATGTTATTA GCACAAATGCGTA GAATTTCTTTGTTC TCTTGTCTAAAGGA CCGTCACGACTTC GGATTCCCTCAGG AAGAGTTTGGAAA CCAATTCCAAAAAG CAGAAACTATTCCT GTCTTGCACGAAAT GATCCAGCAAATAT TCAATTTGTTTTCTA CAAAGGACTCATCA GCCGCTTGGGATG AAACTCTGTTAGAT AAATTCTACACTGA ACTATATCAACAAC TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA
aa + myc
nt + myc Aminoácidos sin marcador Nucleótidos sin marcador
ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCGTCCGATT GGGACGATGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCCTTGCTTTT TCCCGTTTGCAAAG TGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCA GTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGCGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEQ ID NO: 409)
ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCGTCCGATT GGGACGATGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCCTTGCTTTT TCCCGTTTGCAAAG TGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCA GTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGCGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGG (SEQ ID NO: 411)
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos resaltadas en negrita representan el sitio de clonación y el marcador MYC. * representa el codon de terminación en el extremo del gen.
Determinación de Afinidad y Caracterización Biofísica:
Para determinar la afinidad de unión (KD) de las proteínas de fusión AlbudAb-IFN2b a cada albúmina de suero; las proteínas de fusión purificadas se analizaron por BIAcore sobre albúmina (inmovilizada mediante acoplamiento de amina primaria sobre matrices CM5; BIAcore) usando concentraciones de las proteínas de fusión de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM) en tampón HBS-EP BIAcore.

Tabla 12: Afinidad para SA
AlbudAb
Fusión Afinidad para SA (nM) Kd Ka
Rata
DOM7h-14
IFN2b 350 4,500E-02 1,28E+05
DOM7h-14-10
IFN2b 16 4,970E-03 5,90E+05
DOM 7h-14-18
IFN2b 780 2,127E-01 5,80E+05
DOM 7h-14-19
IFN2b 1900 1,206E-01 7,96E+04
AlbudAb
Fusión Afinidad para SA (nM) Kd Ka
DOM 7h-11
IFN2b 6000 7,500E-01 nd
DOM 7h-11-12
IFN2b 1700 3,100E-01 1,30E+05
DOM 7h-11-15
IFN2b 200 1,660E-02 1,50E+05
Cyno
DOM 7h-14
IFN2b 60 1,32E-02 5,0E+05
DOM 7h-14-10
IFN2b 19 7,05E-03 4,50E+05
DOM 7h-14-18
IFN2b sin unión sin unión sin unión
DOM 7h-14-19
IFN2b 520 8,47E-02 2,73E+05
DOM 7h-11
IFN2b 3300 3,59E-01 1,20E+05
DOM 7h-11-12
IFN2b 630 3,45E-01 7,00E+05
DOM 7h-11-15
IFN2b 15 4,86E-03 3,60E+05
Ratón
DOM 7h-14
IFN2b 240 3,21E-02 1,50E+06
DOM 7h-14-10
IFN2b 60 3,45E-02 6,86E+05
DOM 7h-14-18
IFN2b 180 1,50E-01 9,84E+05
DOM 7h-14-19
IFN2b 490 4,03E-02 1,19E+05
DOM 7h-11
IFN2b 6000 1,55E-01 nd
DOM 7h-11-12
IFN2b 150 9,49E-02 6,30E+05
DOM 7h-11-15
IFN2b 28 6,69E-03 2,80E+05
Humano
DOM 7h-14
IFN2b 244 2,21E-02 9,89E+04
DOM 7h-14-10
IFN2b 32 6,58E-03 3,48E+05
DOM 7h-14-18
IFN2b 470 2,75E-01 6,15E+05
DOM 7h-14-19
IFN2b 350 4,19E-02 1,55E+05
DOM 7h-11
IFN2b 670 2,02E-01 7,00E+05
DOM 7h-11-12
IFN2b 500 1,66E-01 3,90E+05
AlbudAb
Fusión Afinidad (nM) para SA Kd Ka
DOM 7h-11-15
IFN2b 10 1,87E-03 3,50E+05
Cuando IFN2b está unido a las variantes AlbudAb, en todos los casos la afinidad de unión de AlbudAb para la albúmina de suero se reduce. DOM7h-14-10 y DOM7-11-15 conservan afinidad de unión mejorada para la albúmina de suero en todas las especies en comparación con el parental. DOM7h-11-12 también muestra afinidad de unión mejorada para la albúmina de suero en todas las especies en comparación con el parental.
La Caracterización Biofísica se realizó por SEC MALLS y DSC como se ha descrito anteriormente para los AlbudAbs sencillos.

Tabla 13: Caracterización Biofísica
AlbudAb
Fusión Número DMS Parámetros biofísicos
SEC MALLS
DSC Tm (ºC)
DOM 7h-14
IFN2b DMS7321 M/D 58-65
DOM 7h-14-10
IFN2b DMS7322 M/D 55-65
DOM 7h-14-18
IFN2b DMS7323 M/D 55-65
DOM 7h-14-19
IFN2b DMS7324 M/D 59-66
DOM 7h-11
IFN2b DMS7325 M/D 65,8-66,2
DOM 7h-11-12
IFN2b DMS7326 M/D 67-67,3
DOM 7h-11-15
IFN2b DMS7327 M/D 56,3-66,2
10 En la Tabla 13 se observa la expresión para todos los clones en el intervalo de 17,5 a 54 mg/l en HEK293.
Para las variantes IFN2b-DOM7h-14 e IFN2b-DOM7h-11, durante la maduración de afinidad se mantuvieron parámetros biofísicos y niveles de expresión favorables.
Determinación del PK para fusiones AlbudAb-IFN2b
Las fusiones AlbudAbs IFN2b DMS7321 (IFN2b-DOM7h-14) DMS7322 (IFN2b-DOM7h-14-10) DMS7323 (IFN2b
15 DOM7h-14-18), DMS7324 (IFN2b-DOM7h-14-19), DMS7325 (IFN2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFN2b-DOM7h-11-12), DMS7327 (IFN2b-DOM7h-11-15) se expresaron con el marcador myc en cantidades de 20-50 mg en células HEK293 y se purificaron del sobrenadante de cultivo usando resina de afinidad a proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH2. Las proteínas se llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, se intercambio de tampón en PBS de Dulbecco y la endotoxina se agotó usando columnas de giro Q (Vivascience).
20 Para el PK de rata, se dosificó IFN-AlbudAb como inyecciones i.v. únicas de 2,0 mg/kg usando 3 ratas por compuesto. Se tomaron muestras de suero a 0,16, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168 h. El análisis de los niveles en suero se realizó por EASY ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, número de catálogo RPN5960).
Para el PK de ratón, se dosificó DMS7322 (IFNαb-DOM7h-14-10) DMS7325 (IFN2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFN2bDOM7h-11-12), DMS7327 (IFN2b-DOM7h-11-15) todos marcados con myc como inyecciones i.v. únicas de 2,0 mg/kg
25 por grupos de dosis de 3 sujetos y las muestras de suero se tomaron a 10 min; 1 h, 8 h; 24 h; 48 h; 72 h; 96 h. El análisis de los niveles en suero se realizó por EASY ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, número de catálogo RPN5960).
Tabla 14:
Especie
AlbudAb Fusión Albúmina KD (nM) Parámetros PK
AUC h x g/ml
CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
7h-14 IFN2b 350 832,1 2,4 27 94,5
7h-14-10
IFN2b 16 1380,7 1,5 35,8 75,2
7h-14-18
IFN2b 780 691,2 2,9 22,4 93,7
7h-14-19
IFN2b 1900 969,4 2,2 25 78,7
7h-11
IFN2b 6000 327,9 6,5 11 101,9
7h-11-12
IFN2b 1700 747,1 2,8 25,8 104,7
7h-11-15
IFN2b 200 1118,7 1,8 39,5 103,6
Ratón
7h-14 IFN2b 240 761,2 2,6 30,4 115,3
7h-14-10
IFN2b 60 750,5 2,7 30,9 118,6
7h-11
IFN2b 6000 493,9 4,0 8,8 51,2
7h-11-12
IFN2b 150 439,6 4,5 21,5 140,9
7h-11-15
IFN2b 28 971,8 2,1 33,6 99,6
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos de estudios de rata y ratón se ajustaron usando un modelo nocompartimental. Clave: AUC: Área bajo la curva del tiempo de dosificación extrapolado al infinito; CL: eliminación; t1/2: es 5 el tiempo durante el cual la concentración en sangre se divide en dos; Vz: volumen de distribución en base a la fase terminal.
Se ensayaron IFN2b-AlbudAbs en rata y ratón. Para todas las proteínas de fusión de la variante IFN2b-DOM7h-11 tanto en rata como en ratón, el valor t1/2 mejoró en comparación con el parental. La mejora del t1/2 equivale a una KD mejorada in vitro para la albúmina de suero.Para las variantes IFN2b-DOM7h-14-10 la mejora de KD in vitro para la
10 albúmina de suero también equivale a una mejora del t1/2 en rata.
Todas las proteínas de fusión IFN2b-AlbudAbs mostraron una disminución en la unión a RSA de 5 a 10 veces en comparación con AlbudAb sencillo. Este efecto es más pronunciado (es decir, 10 veces) en la serie DOM7h-14 que en la serie DOM7h-11 (únicamente una disminución de 5 veces).
Ejemplo 8: Fusiones AlbudAb adicionales con proteínas, péptidos y NCE.
15 Se ensayaron diversas AlbudAbs fusionadas a otras entidades químicas concretamente anticuerpos de dominio (dAbs), péptidos y compuestos NCE. Los resultados se muestran en la tabla 15.
Tabla 15:
Especie
AlbudAb Fusión Albúmina KD (nM) Parámetros PK
AUC h x g/ml
CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
DOM7h-14 Exendina-4 2400 18 57,1 11 901,9
DOM7h-14-10
Exendina-4 19 43,6 23,1 22,1 740,3
DOM7h-14-18
Exendina-4 16000 16,9 75,7 9,4 1002,5
DOM7h-14-19
Exendina-4 17000 31,4 32,5 11,9 556,7
DOM7h-11
Exendina-4 24000 6,1 168 7,1 1684,1
DOM7h-11-12
Exendina-4 1400 24,2 59,9 13 1068,7
DOM7h-11-15
Exendina-4 130 36,3 27,6 19,3 765,7
DOM7h14-10
NCE-GGGGSC 62
DOM7h14-10
NCE-TVAAPSC 35
Huma-no
DOM7h-14 NCE 204
Ratón
DOM7h-11 DOM1m-21-23 234 10,7 4,7 72,5
DOM7h-11-12
DOM1m-21-23 755 3,3 18 86,2
DOM7h-11-15
DOM1m-21-23 1008 2,5 17,4 62,4
Anteriormente se ha descrito el uso de fusiones genéticas con un dAb de unión a albúmina (AlbudAb) para ampliar la semivida PK del dAbs anti-TNFR1 in vivo (véase, por ejemplo los documentos WO04003019, WO2006038027, 5 WO2008149148). En estas solicitudes PCT se hace referencia a los protocolos. En la tabla anterior, DOM1m-21-23 es un dAb anti-TNFR1 de ratón.
Para producir las fusiones genéticas de exendina-4 o con DOM7h-14 (u otro AlbudAb) que se unen a la albúmina de suero, la secuencia exendina-4-enlazante-AlbudAb se clonó en el vector pTT-5 (obtenible de CNRC, Canadá). En cada caso la exendina-4 estaba en el extremo 5’ de la construcción y el dAb en el extremo 3’. El enlazante era un conector 10 (G4S)3. Se preparó ADN sin endotoxina en E. coli usando lisis alcalina (usando el kit Giga para plásmido sin endotoxina, obtenible de Qiagen CA) y se usó para transfectar células HEK293E (obtenibles de CNRC, Canadá). La transfección se realizó en matraces de células HEK293E / 250 ml a 1,75x106 células/ml usando 333 l de fectin 293 (Invitrogen) y 250 g de ADN por matraz y la expresión se realizó a 30ºC durante 5 días. El sobrenadante se recogió por centrifugación y la purificación se realizó por purificación de afinidad en proteína L. La proteína se unió en lotes a la resina, se rellenó en una
15 columna y se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS. La proteína se eluyó con 50 ml de glicina 0,1 M pH 2 y se neutralizó con Tris pH 8. La proteína del tamaño esperado se identificó sobre un gel SDS-PAGE.
Fusiones NCE Albudab:
Se ensayó una fusión de AlbudAb con una nueva entidad química (NEC). La NCE, un inhibidor de ADAMTS-4 de molécula pequeña se sintetizó con un conector de PEG (enlazante de PEG 4 (es decir, 4 moléculas de PEG antes de la 20 maleimida) y un grupo maleimida para la conjugación al AlbudAb. La conjugación del NCE al AlbudAb se realiza
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30
mediante un resto de cistina modificado por ingeniería genética en la posición de aminoácido R108C o después de un espaciador de 5 aminoácidos (GGGGSC) o 6 aminoácidos (TVAAPSC) en el extremo del AlbudAb. En resumen, el AlbudAb se redujo con TCEP (Pierce, Catálogo Número 77720), se desalinizó usando una columna PD10 (GE healthcare) en Bis-Tris 25 mM, EDTA 5 mM, glicerol al 10% (v/v) pH 6,5. Se añadió un exceso molar de 5 veces del NCE activado con maleimida en DMSO no sobrepasando el 10% de la concentración final (V/V). La reacción se incubó durante una noche a temperatura ambiente y se dializó exhaustivamente en Tris 20 mM pH 7,4.
Enlazante PEG:
imagen684
Secuencias:
DOM7h-14 R108C:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKC (SEQ ID NO: 412)
Nucleótidos:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA GTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAATGC (SEQ ID NO: 413)
Véase la Tabla 5 para las secuencias de DOM7h-14-10/TVAAPSC y DOM7h-14-10/GGGGSC (es decir, DOM7h-14-10/G4SC).
NCE-AlbudAbs DOM7h-14-10 GGGGSC y DOM7h14-10 TVAAPSC muestran una disminución de afinidad in vitro de 5 a 10 veces (KD) para RSA según se determina por BIAcore cuando se fusionan a la entidad química. Aún no se dispone de los datos PK para estas moléculas.
Fusión dAb-Albudab: los 2 AlbudAbs DOM7h-11 con la mayor afinidad para RSA experimentaron una disminución de afinidad para RSA de 2 veces en un BIAcore cuando se fusionaron a un anticuerpo de dominio terapéutico (DOM1m-2123) en comparación con AlbudAb no fusionado. El clon DOM7h-11 muestra una KD micromolar cuando se fusiona (2,8 M) así como cuando no se fusiona (5 M).
Fusión Exendina-4 AlbudAb: el efecto de la fusión de AlbudAbs a un péptido en la capacidad de unión a RSA es aproximadamente de 10 veces, excepto DOM7h-14-10, que únicamente muestra una disminución de unión de 4 veces. El efecto, sin embargo, es más pronunciado para la serie DOM7h-14 (excepto DOM7h-14-10) que lo que parece ser para la serie DOM7h-11.
Para todos los datos anteriores, el T1/2 de la fusión aumentó con afinidad mejorada para las SA de las especies.
Generalmente se clasifican los efectos terapéuticos de Albudab como que son terapéuticamente susceptibles (para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades, afecciones o indicaciones) cuando las fusiones AlbudAb-fármaco muestran un intervalo de afinidad (KD) de 0,1 nM a 10 nM para la unión a la albúmina de suero.
Los intervalos terapéuticos de las fusiones AlbudAbs y AlbudAb (Proteína-AlbudAb por ejemplo IFNa2b-DOM7h-14-10; Péptido-AlbudAbs por ejemplo Exendina-4-DOM7h-14-10; dAb-AlbudAbs por ejemplo DOM1m21-23-DOM7h11-15; NCE-AlbudAb por ejemplo ADAMTS-4-DOM7h-14-10) se definen a continuación: se muestran intervalos de afinidad (KD) que son útiles para la terapia de afecciones, enfermedades o indicaciones crónicas o agudas que se muestran. También se muestran intervalos de afinidad marcados como “intermedios”. AlbudAb y las fusiones en este intervalo son útiles en enfermedades, afecciones o indicaciones agudas o crónicas. De este modo, la afinidad de la AlbudAb o fusión para la albúmina de suero puede adaptarse o seleccionarse de acuerdo con la enfermedad, afección o indicación a tratar. Como se describe anteriormente, la descripción proporciona AlbudAbs con afinidades que permiten que cada AlbudAb se clasifique como “afinidad elevada”, “afinidad media” o “afinidad baja”, permitiendo de esta manera al experto en la materia seleccionar la AlbudAb apropiada de la descripción de acuerdo con la terapia en cuestión. Véase la Figura 2.
Ejemplo 9: Secuencias DOM7h-11-15S12P
Secuencia de Aminoácidos de DOM7h-11-15S12P
DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 414)
Un aspecto de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de DOM7h-1115S12P o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a dicha secuencia seleccionada. DOM7h-11-15S12P se produjo usando la siguiente secuencia de ácidos nucleicos (la C subrayada indica el cambio (frente a los ácidos nucleicos que codifican DOM7h-11-15) que conduce a una prolina en la posición 12):
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA GTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTT TCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACGG (SEQ ID NO: 415)
DOM7h-11-15S12P se construyó usando DOM7h-11-15 como un molde en una PCR en la que se usó un cebador para introducir la mutación S12P. La secuencia del cebador es:
GCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGG (SEQ ID NO: 416).
Un aspecto alternativo de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 415 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a dicha secuencia seleccionada. En una realización, DOM7h-11-15S12P se codifica por, y se expresa a partir de, un vector que contiene una región enlazante y una secuencia C-terminal que codifica una proteína o un fármaco peptídico de un dominio variable simple u otro fragmento de anticuerpo para preparar el producto de fusión de proteína en-línea. El enlazante, en una realización, comprende la secuencia de aminoácidos TVA, por ejemplo, TVAAPS. Otros aspectos de la descripción son un vector que comprende el ácido nucleico; y una célula huésped aislada que comprende el vector. La descripción también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un paciente, que comprende administrar al menos una dosis de DOM7h-11-15S12P a dicho paciente.

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  1. imagen1
ES10706187.1T 2009-02-19 2010-02-17 Variantes de unión de anti-albúmina de suero mejoradas Active ES2655071T3 (es)

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