MXPA06010505A - Composiciones y conjugados, basados en polimeros, de inhibidores de ingreso de vih. - Google Patents

Abstract

En la presente invencion se proveen conjugados de polimero soluble en agua y composiciones basadas en polimero de inhibidores de ingreso de VIH. Tambien se proveen metodos para sintetizar y administrar dichos conjugados y composiciones.

Description

con algunas estimaciones, casi un millón de personas en los Estados unidos puede estar actualmente infectada con VIH. Cuando el SIDA apareció por primera vez en los Estados Unidos, no existían medicinas paxa combatir el VIH; sin embargo, a lo largo de los últimos 11 años, se han desarrollado fármacos para luchar tanto contra la infección por VIH como contra sus infecciones y cánceres asociados . Estos fármacos se pueden clasificar en clases diferentes tomando como base su modo de acción. Tres clases de fármacos anti-VIH, aunque actúan en tiempos diferentes durante el ciclo de vida viral, interrumpen la replicación viral después que el virus ha infectado una célula T. Estas clases de medicamentos anti-VIH incluyen inhibidores tipo nucleósido de transcriptasa inversa (NRTI) , inhibidores de proteasa (PI) , e inhibidores de transcriptasa inversa de tipo no nucleósido (NNRTI) . Los fármacos que caen en estas diversas clases incluyen ???, zalcitabina, didesoxinosina, estavudina, y lamivudina (inhibidores de transcriptasa inversa de tipo nucleósido) ; delvaridina, nevirapina, y efravirenz (inhibidores de transcriptasa inversa de tipo no nucleósido) , y ritonavir, saquinavir, e indinavir (inhibidores de proteasa) . Sin embargo, existe otra clase de agentes anti-retrovirales, los inhibidores de ingreso, que funcionan de manera diferente a la de las clases convencionales previamente descritas de fármacos anti-VIH.

En lugar de funcionar contra el VIH después de la infección de célula T, un inhibidor del ingreso realmente evita que el VIH infecte una célula T en primer lugar. De manera más especifica, los inhibidores de ingreso funcionan uniéndose por si mismos a las proteínas en la superficie de las células T o proteínas en la superficie del VIH. Para que el VIH se una a las células T, las proteínas en la cubierta exterior del VIH deben unirse a las proteínas en la superficie de las células T. Los inhibidores de ingreso evitan que suceda dicha unión. Algunos inhibidores de ingreso eligen como blanco las proteínas gpl20 o gp41 en la superficie del VIH, mientras que otros inhibidores de ingreso eligen como blanco la proteína CD4 o los receptores CCR5 o CXCR4 en la superficie de una célula T. Los inhibidores del ingreso incluyen T-20 (también conocido como enfuvirtida) , PRO-542, SCH-C, SCH-D, y T-1249. Hasta la fecha únicamente un inhibidor de ingreso, T-20, ha sido aprobado por la FDA. T-20 inhibe la fusión de VIH-1 con las células CD4+. Los inhibidores de ingreso (incluyendo inhibidores de fusión) son un nuevo tipo prometedor de fármaco anti-VIH. Los inhibidores de ingreso como T-20 son particularmente atractivos para individuos VIH-positivos que no han respondido utilizando los fármacos anti-VIH tradicionales, por ejemplo, PI, NRTI, y NNRTI, ya sea solos o en terapia de combinación. T-20 es un péptido sintético de 36 aminoácidos que tiene un extremo N-terminal acetilado y el extremo C-terminal modificado como la carboxamida. T-20 (FUZEON™) recibió su aprobación para comercialización de la FDA en marzo de 2003. Por desgracia, a pesar de las altas expectativas, las ventas del fármaco han sido obstaculizadas por sus precios elevados y de manera más importante, su dificultad de administración. T-20 se inyecta bajo la piel dos veces por dia. Dicha dosificación frecuente al paciente puede ser muy poco atractiva para los pacientes - muchos de los cuales ' finalmente no pueden mantener el régimen de dosificación necesario, debido a la elevada frecuencia de dosificación, modo de administración, y fatiga general asociada con la preparación y administración del fármaco. En efecto, 98% de los pacientes de FUZEON™ reporta por lo menos un caso de reacciones en el sitio de inyección (ISR) local dolorosas o problemáticas. Los síntomas de ISR incluyen dolor, molestia, induración, eritema, y nodulos/quistes. Las reacciones de hiper-sensibilidad reportadas incluyen erupciones, fiebre, náusea y vómito, escalofríos, rigores, e hipotensión. Se ha hecho cada vez más evidente que fármacos tales como T-20 no son fármacos de fácil administración por parte de los pacientes. El dolor asociado con ISR se considera de ligero a moderado, y la duración promedio de cada ISR es de alrededor de 7 dias . Asimismo, se puede desarrollar resistencia a T-20 en forma bastante rápida si las dosis completas no se toman en una base consistente. {GMHC Treatment Issues, Vol . 17, No. 1/2, enero/febrero 2003) . Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica respecto a agentes anti-VIH mejorados, y en particular, inhibidores de ingreso mejorados, que tengan tiempos de vida media en circulación más largos en el torrente sanguíneo y que al mismo tiempo mantengan un grado de actividad mensurable, y más preferido significativo, con lo cual se permite una dosificación menos frecuente al paciente y por lo tanto una ocurrencia reducida de reacciones de sitio de inyección local. Esta invención satisface estas necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCION Por consiguiente, en un aspecto, la invención provee composiciones de suministro sostenido de agentes anti-VIH retrovirales , y en particular, inhibidores del ingreso basados en peptidilo, tales como T-20 y T-1249, entre otros. Los conjugados y composiciones de la invención poseen propiedades de liberación sostenida, por ejemplo, tiempos de vida media en circulación más largos en el torrente sanguíneo que sus contra-partes de El sin ß modificar, con lo cual se solucionan algunos de los problemas relacionados con la administración relacionados con los El sin modificar tales como T-20. Los conjugados y composiciones descritos en la presente invención reducen de manera conveniente el carácter inmunogénico . Igualmente importante, los conjugados y composiciones de la presente invención requieren de una frecuencia de dosificación reducida en comparación con las composiciones de El tradicionales carentes de polímero soluble en agua, ya sea en forma conjugada o no conjugada. Por lo tanto, los conjugados y composiciones que se proveen en la presente invención reducen de manera conveniente el número de inyecciones dolorosas y de reacciones de sitio de inyección local asociadas típicamente enfrentadas por individuos infectados con VIH-1 que toman los fármacos inhibidores de ingreso correspondientes carentes de polímero soluble en agua, ya sea unidos en forma covalente al mismo o asociados con el mismo, en virtud de sus propiedades de liberación sostenida los cuales actúan para proveer niveles extendidos y terapéuticos de un El en el torrente sanguíneo, de preferencia un El basado en polipéptido. En un aspecto, la invención está dirigida a un conjugado de un polímero soluble en agua y un compuesto inhibidor de ingreso. Los ejemplos de conjugados de conformidad con este aspecto de la invención se proveen en las tablas en la presente invención. En una modalidad preferida, los conjugados y composiciones de la invención se pueden degradar, es decir, comprenden por lo menos un enlace degradable, de preferencia un enlace hidrolizable . Por ejemplo, un enlace hidrolizable contenido en un conjugado o composición de la invención puede contener una porción susceptible de hidrólisis tal como un éster carboxilato, un éster fosfato, un carbamato, un anhídrido, un acetal, un cetal, un éter aciloxialguilo, una imina, un ortoéster, un tioéster, un tioléster, o un carbonato. En una modalidad preferida, la porción susceptible de hidrólisis es un carbamato, éster o un carbonato hidrolizable. Incluso en una modalidad adicional, un conjugado de la invención posee la siguiente estructura: I en la cual POLY es un polímero soluble en agua, LD es un enlace degradable, El es un inhibidor de ingreso, y k corresponde al número de sitios reactivos en el El al cual está unido en forma covalente un segmento de polímero independiente ( POLY-LD) · Cada uno de los segmentos de polímero (es decir, componentes individuales del segmento de polímero) se selecciona de manera independiente, aunque de preferencia, cada uno de los segmentos de polímero unidos en forma covalente al El es el mismo. Típicamente, k varía desde 1 aproximadamente hasta 8 aproximadamente, es decir, se selecciona a partir del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8. De preferencia, k es 1, 2, 3 ó 4, o incluso más preferido es 1. En una modalidad preferida de éste y otros aspectos de la invención, el polímero soluble en agua es un polietilenglicol . El polímero soluble en agua, por ejemplo, polietilenglicol, típicamente tiene un peso molecular que cae dentro de uno de los siguientes intervalos: desde 500 Daltons aproximadamente hasta 100,000 Daltons aproximadamente, desde 2,000 Daltons aproximadamente hasta 85,000 Daltons aproximadamente, desde 5,000 Daltons aproximadamente hasta 60,000 Daltons aproximadamente, desde 10,000 Daltons aproximadamente hasta 50,000 Daltons aproximadamente, o desde 15,000 Daltons aproximadamente 40,000 Daltons aproximadamente, y muchos poseen cualquiera de un número de arquitecturas (por ejemplo, lineal, ramificado, en horquilla, y similares) . Los inhibidores de ingreso para ser utilizados en los conjugados y composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, T-20, T-1249, PRO 542 (también conocido como CD4-IgG2), PRO-140, PRO-367, SCH-417690, TXN-355, UK-427, UK-857, GSK-873, GSK-140, PA9, PA10, PAll, y PA12. En una modalidad particular, el inhibidor de ingreso es T-20, T-1249, PRO 542, o PRO-140. En una modalidad adicional, el sitio reactivo de El al cual está unido un segmento de polímero tal como aquellos mostrados anteriormente en la estructura I, se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste del extremo N-terminal, el extremo C-terminal, un grupo amino, un grupo hidroxilo, y un tiol. En términos generales, el LD posee una longitud tal como desde 1 aproximadamente hasta 20 átomos aproximadamente, desde 2 aproximadamente hasta 15 átomos aproximadamente, o desde 3 aproximadamente hasta 10 átomos aproximadamente. Es decir, típicamente LD tiene una longitud de átomos total que se selecciona a partir del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y 20. Incluso otra modalidad particular de la invención abarca un conjugado que comprende una de las siguientes estructuras generalizadas: O G POLY—L—Ar O—HC—NH ?—El J k II POLY — NH — P — Z III en las cuales L es cualquiera de -0- o -NH-C(O), Ar es un grupo aromático, tal como un fenilo sustituido en las posiciones orto, meta, o para, -NH- en la estructura II es un residuo amino proveniente del El, P es un espaciador, Z es -0-, -NH-, o -CH2- y 0 en la estructura III es un residuo hidroxilo proveniente del El. En una modalidad más particular, en la estructura III, P, cuando se toma junto con -NH-P-Z-C (0) , es el residuo de un aminoácido presente o no presente en la naturaleza . También forma parte de este aspecto presente invención un conjugado que corresponde a la estructura III, en la cual "POLY-NH-" corresponde a los polímeros 1-1 a 1-40 en la tabla 1, carentes de la porción El. Incluso en otra modalidad adicional, un conjugado de conformidad con la invención se caracteriza por la estructura : IV ó O o I I I I (OCH2CH2)n - O - CH2 — C - O - CHCH2 — C — NH -El CH, VI en las cuales n varia desde 2 hasta 3400 aproximadamente. También forman parte de la invención los conjugados de polímeros solubles en agua de brazos múltiples . En una modalidad particular de este aspecto de la invención, el polímero de brazos múltiples comprende un núcleo central a partir del cual se extienden tres o más brazos poliméricos los cuales típicamente son homopoliméricos o co-poliméricos . Incluso en otra modalidad de un conjugado de polímero de brazos múltiples de conformidad con la invención, cada brazo de polímero comprende un copolímero que comprende un segmento de polipéptido interior unido covalentemente a un núcleo central y un segmento de polímero hidrofílico externo unido covalentemente al segmento de polipéptido. Los conjugados de ejemplo de conformidad con este aspecto de la invención por lo general comprenden la siguiente estructura: R- POLY-LD—El VII en la cual R es una molécula central, POLY es un polímero soluble en agua, LD es un enlace degradable, El es un inhibidor de ingreso, y "y" varía desde 3 a 15 aproximadamente . De manera alternativa, el conjugado puede comprender la estructura: VIII en la cual m se selecciona a partir de 3, 4, 5, 6, 7, y 8. Incluso en una modalidad adicional y más específica, un conjugado de este tipo puede corresponder a la estructura: O R-j-POLY— H—P—Z—C—O—El IX en la cual P es un espaciador, Z es -0-,-NH-, o -CH2-, y 0 es un residuo hidroxilo proveniente del El. En una modalidad preferida, P cuando se toma junto con -NH-P-Z-C(O) es un residuo de aminoácido presente o no presente en la naturaleza. Incluso en otro aspecto, la invención abarca una composición que comprende una pluralidad de conjugados de El mono-poliméricos, lo que significa que los conjugados de El tienen cada uno un reactivo polimérico unido covalentemente al El, pero en sitios reactivos o posiciones diferentes en el mismo. En otro aspecto de la invención, se mezcla un El con un hidrogel, de manera más preferida, un hidrogel que se pueda degradar hidrolíticamente, es decir, uno que se degrade bajo condiciones fisiológicas. Dichos hidrogeles pueden ser entrelazados o no entrelazados. En una modalidad preferida, el hidrogel es un hidrogel para gelificacion no inversa que comprende un inhibidor de ingreso, y como uno de los componentes del gel, un poli (óxido de alquileno) . En una modalidad particular, el inhibidor de ingreso está en forma de un conjugado polimérico soluble en agua. De manera alternativa, el inhibidor de ingreso está unido covalentemente de manera opcional a uno o más componentes del gel . También forma parte de la invención un método para elaborar un conjugado polimérico. El método comprende el paso de poner en contacto, bajo condiciones de conjugación, un inhibidor de ingreso con un reactivo polimérico soluble en agua para formar un conjugado de polímero-inhibidor de ingreso. De preferencia, dicho conjugado comprende un enlace degradable. Incluso es un aspecto adicional, se provee un método para preparar un hidrogel de gelificacion no inversa que comprende un inhibidor de ingreso. Dicho método incluye el paso de poner en contacto reactivos precursores de hidrogel apropiados uno con otro y con el inhibidor de ingreso bajo condiciones efectivas para promover la gelificacion de los reactivos precursores, para de esta manera formar un hidrogel de gelificacion no inversa que tiene al inhibidor de ingreso atrapado en el mismo. El inhibidor de ingreso puede estar en forma conjugada o no conjugada, y los reactivos precursores de hidrogel no presentan propiedades de gelificacion inversa. Incluso en otra modalidad de la invención, se proveen composiciones que comprenden un conjugado de la invención en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones abarcan todos los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son apropiadas para inyección, tales como polvos que pueden ser reconstituidos, asi como líquidos (por ejemplo, suspensiones y soluciones) . En una modalidad adicional de la invención, se provee un método para inhibir la infección por VIH. En el método, se administra a un individuo o a células infectadas por VIH-1 un conjugado de El o composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho conjugado. Típicamente, el paso de administrar un conjugado o composición de El se efectúa mediante inyección (por ejemplo inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección subcutánea, etc) . Los objetivos, ventajas y características novedosas adicionales de la invención se indican en la siguiente descripción, y en parte, serán evidentes a los expertos en la técnica después de leer lo siguiente, o se puede aprender mediante la practica de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un gel de SDS-PAGE de ejemplos de muestras de conjugado provenientes del ejemplo 1 (carril 4) y ejemplo 2 (relación molar 4:1) (carril 3). El carril 2 corresponde al péptido libre, T-1249, como referencia. El carril 1 corresponde a los patrones de referencia MARK 12. La figura 2 es un gel de SDS-PAGE gel de ejemplos de muestras de conjugado provenientes del ejemplo 2 (sistema de solvente DMSO) y ejemplo 3 (sistema de solvente DMSO acuoso mixto) . El carril 1 corresponde a los patrones de referencia MARK 12. El carril 2 corresponde al péptido libre, T1249; el carril 3 corresponde a una reacción en DMSO con relación molar 1:1 (ejemplo 2); el carril 4 corresponde a una reacción en DMSO con relación molar 1:2 (ejemplo 2) ; el carril 5 corresponde a una reacción mixta acuosa/DMSO (1:1) utilizando una relación molar 4:1 (ejemplo 3) . La figura 3 ilustra un cromatograma de HPLC para la mezcla de conjugado del ejemplo 3, relación molar 1:1. La muestra inyectada es una relación molar 1:1 en una reacción acuosa/DMSO y muestra una distribución de péptido y producto similar a aquella observada en el carril 3 de la figura 2. La figura 4 corresponde a un gel de SDS-PAGE de mono-PEG T1249 purificado, como se describe en el ejemplo 5A. El carril 1 es el patrón de referencia, carril 2 es T1249 sólo, y los carriles 3 y 4 representan cantidades cargadas diferentes de la preparación purificada final; y La figura 5 es una gráfica que demuestra la hidrólisis in vitro de un conjugado mono-sustituido con PEG que se prepara utilizando un péptido de modelo unido en forma covalente a un reactivo de mPEG degradable de ejemplo, carbonato de mPEG-succinimidilfenilo, 20 kDa (ej emplo 5D) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Antes de describir la presente invención con mayor detalle, se debe entender que esta invención no queda limitada a los polímeros, hidrogeles, técnicas de síntesis, inhibidores de ingreso particulares, y similares, debido a que estos pueden variar, como será evidente a partir de la descripción y figuras anexas. Se debe mencionar que, tal como se utiliza en esta descripción y en las reivindicaciones pretendidas, las formas en singular "un", "una", y "el (la)" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un polímero individual así como dos o más de los mismos polímeros o polímeros diferentes, la referencia a un "excipiente opcional" se refiere a un excipiente opcional individual así como a dos o más de los mismos excipientes opcionales o excipientes opcionales diferentes, y similares.

En la descripción y reclamo de la presente invención, se utiliza la siguiente terminología de conformidad con las definiciones descritas a continuación. "PEG", "polietilenglicol" y "polil(etilenglicol) " tal como se utilizan en la presente invención, son intercambiables y pretenden abarcar cualquier poli (óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, los PEG para uso de conformidad con la invención comprenden la siguiente estructura "- (OCH2CH2) n" e la cual (n) varía desde 2 hasta 4000 aproximadamente. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "PEG" también se refiere a las estructuras particulares "-CH2CH2-0 (CH2CH20) n-CH2CH2-" o (OCH2CH2) 0-", dependiendo de si se han desplazado o no los oxígenos terminales. A través de toda la descripción y reivindicaciones, se debe recordar que el término "PEG" incluye estructuras que tienen diversos grupos terminales "bloqueadores de extremo" etc. El término "PEG" se refiere a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de subunidades repetitivas -OCH2CH2-. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como de estructuras o geometrías, tales como "ramificada", "lineal", "en horquilla", "multi-funcional", y similares, que serán descritas con mayor detalle más adelante. Los términos "de extremo bloqueado" y "bloqueado en los extremos terminales" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para hacer referencia a una punto terminal o final de un polímero que tiene una porción bloqueadora de extremo. Típicamente, aunque no necesariamente, la porción bloqueadora de extremo comprende un grupo hidroxi o alcoxi de Ci_2o o grupo benciloxi, más preferido un grupo alcoxi de Ci-io y de manera incluso más preferida un grupo alcoxi de C1-5. Por lo tanto, los ejemplos de porciones bloqueadoras de extremo incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y benciloxi) , así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y similares. Se debe recordar que la porción bloqueadora de extremo puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [por ejemplo, la porción bloqueadora de extremo "metoxi" en CH3 (OCH2CH2) n-] · Además, se contemplan las formas saturada, insaturada, sustituida y no sustituida de cada uno de los anteriores. Asimismo, el grupo bloqueador de extremo puede ser un silano. El grupo bloqueador de extremo también puede comprender, de manera conveniente, una marca detectable. Cuando el polímero tiene un grupo bloqueador de extremo que comprende una marca detectable, se puede determinar la cantidad o ubicación del polímero y/o la porción (por ejemplo, agente activo) a la cual se acopla el polímero utilizando un detector apropiado. Dichas marcas incluyen, sin limitación, agentes fluorescentes, agentes quimio-luminiscentes , porciones utilizadas en el marcado de enzimas, marcas colorimétricas (por ejemplo colorantes), iones metálicos, porciones radioactivas, y similares. Los detectores apropiados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros, y similares. El grupo bloqueador de extremo también puede comprender de manera conveniente un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo bloqueador de extremo que comprende un fosfolípido, se imparten propiedades únicas al polímero y al conjugado resultante. Los fosfolípidos de ejemplo incluyen, sin limitación, aquellos que se seleccionan a partir de la clase de fosfolípidos denominados fosfatidilcolinas . Los fosfolípidos específicos incluyen, sin limitación, aquellos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de dilauroilfostatidilcolina, dioleoilfostatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diesteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina, y lecitina. " o presente en la naturaleza" con respecto a un polímero como el descrito en la presente invención, significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero no presente en la naturaleza de la invención puede, sin embargo, contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que se presenten en la naturaleza, en tanto que la estructura polimérica global no se encuentre en la naturaleza. El término "soluble en agua" tal como en "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que sea soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero soluble en agua transmite por lo menos 75% aproximadamente, más preferido por lo menos 95% aproximadamente de luz transmitida por la misma solución después de filtrar. En una base en peso, un polímero soluble en agua de preferencia será por lo menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferido por lo menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, incluso más preferido aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, e incluso más preferido aún aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, es más preferido que el polímero soluble en agua sea aproximadamente 95% en peso soluble en agua o completamente soluble en agua. El peso molecular, en el contexto de un polímero soluble en agua de la invención, tal como PEG, se puede expresar ya sea como un peso molecular promedio en número o un peso molecular promedio en peso. A menos que se indique de otra manera, todas las referencias a peso molecular en la presente invención se refieren al peso molecular promedio en peso. Ambas determinaciones de peso molecular, promedio en número y promedio en peso, se pueden medir utilizando cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. También se pueden utilizar otros métodos para medir los valores de peso molecular, tales como el uso de análisis de grupo final o la medición de las propiedades coligativas (por ejemplo, disminución del punto de congelamiento, elevación del punto de ebullición, o presión osmótica) para determinar el peso molecular promedio en número o el uso de técnicas de dispersión de luz, ultra-centrifugación o viscosimetría para determinar el peso molecular promedio en peso. Los polímeros de la invención típicamente son poli-dispersos (es decir, el peso molecular promedio en número y el peso molecular promedio en peso de los polímeros no son iguales) , y poseen valores de poli-dispersión bajos de preferencia menores de 1.2 aproximadamente, más preferido menores de 1.15 aproximadamente, incluso más preferido menores de 1.10 aproximadamente, e incluso más preferido aún menores de 1.05 aproximadamente, y de preferencia menores de 1.03 aproximadamente. Con el término longitud de átomos total, por ejemplo, en el contexto de un enlazador de la invención, se quiere decir el número de átomos en una cadena individual, sin contar los sustituyentes . Por ejemplo, -CH2- cuenta como un átomo con respecto a la longitud del enlazador total, -CH2CH20- cuenta como tres átomos en longitud, y un grupo no lineal tal como un anillo fenilo cuenta como cuatro átomos de longitud. El término "activo" o "activado" cuando se utiliza en conjunto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto está en oposición a aquellos grupos que requieren de catalizadores fuertes o de condiciones de reacción bastante imprácticas para que reaccionen (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte") . Tal como se utiliza en la presente invención, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo pretende abarcar formas protegidas del mismo así como las formas no protegidas. Los términos "enlace" o "enlazador" se utilizan en la presente invención para hacer referencia a un átomo o un grupo de átomos utilizados opcionalmente para enlazar porciones que se conectan entre sí tales como un extremo terminal de un segmento polimérico y un inhibidor de ingreso (por ejemplo T-20 o T-1249) . ün enlazador puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. "Alquilo"se refiere a una cadena de hidrocarburo, que típicamente varía desde 1 hasta 15 átomos de longitud aproximadamente. Dichas cadenas de hidrocarburo de preferencia, pero no necesariamente, están saturadas y pueden ser ramificadas o de cadena recta, aunque típicamente se prefiere la cadena recta. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo, y similares. Tal como se utiliza en la presente invención, "alquilo" incluye cicloalquilo así como alquilo que contenga cicloalquileno . "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena recta o ramificado, como queda ejemplificado por metilo, etilo, .n-butilo, i-butilo, y t-butilo. "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, incluyendo compuestos cíclicos con estructura en puente, fusionados, o espiro, constituidos de preferencia por 3 hasta 12 átomos de carbono, más preferido 3 a 8 átomos de carbono aproximadamente. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que está insertado en una cadena alquilo mediante unión de la cadena en cualesquiera dos átomos de carbono en el sistema de anillo cíclico. "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R-, en el cual R es alquilo o alquilo sustituido, de preferencia alquilo de Ci_6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etc) . El término "sustituido" tal como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a una porción (por ejemplo un grupo alquilo) sustituida con uno o más sustituyentes no interferentes , tales como, pero sin limitarse a: alquilo, cicloalquilo de C3_8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, y similares; halógeno, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo, y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene un o más grupos no interferentes como un sustituyente . Para las sustituciones en un anillo fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta, o para) . "Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente son no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula. "Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono centrales . Arilo incluye anillos arilo múltiples que pueden estar fusionados, tal como en naftilo o no fusionados, como en bifenilo. Los anillos arilo pueden estar fusionados o no fusionados con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heteroarilo, o heterocíclico . Tal como se utiliza en la presente invención, "arilo" incluye heteroarilo. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos , de preferencia azufre, oxígeno, o nitrógeno o una combinación de los mismos. Los anillos heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heterocíclico, arilo o heteroarilo . "Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, de preferencia 5-7 átomos, con o sin instauración o carácter aromático y que tienen por lo menos un átomo de anillo que no sea carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno, y nitrógeno . "Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes . "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales que se forman a partir de sustituyentes no interferentes . "Electrófilo" y "grupo electrofílico" se refieren a un ión o átomo o grupo de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrofílico, es decir, un centro que busca electrones, que puede reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" y "grupo nucleofílico" se refieren a un ión o átomo o grupo de átomos que pueden ser iónicos y que tienen un centro nucleofílico, es decir, un centro que busca un centro electrofílico o con un electrófilo. Un enlace "fisiológicamente disociable" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua depende no solamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los enlaces íiidroliticamente inestables o débiles apropiados incluyen pero no se limitan a éster carboxilato, éster fosfato, anhídridos, acétales, cetales, éter aciloxialquílico, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos . En algunas modalidades de la invención, se prefieren los enlaces que tienen un tiempo de vida media de hidrólisis a pH 8, 25 °C menor de 30 minutos aproximadamente, aunque dicha preferencia no pretende ser limitativa en ningún sentido . Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que está sujeto a degradación mediante una o más enzimas . Un enlazamiento o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no experimenta hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en ningún grado apreciable a lo largo de un período extendido de tiempo. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: enlaces carbono-carbono, (por ejemplo en cadenas alifáticas) , ésteres, amidas, uretanos, y similares. En términos generales, un enlace hidrolíticamente estable es uno que presenta una velocidad de hidrólisis menor de aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las velocidades de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de libros de texto de química normales. "Excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede estar incluido opcionalmente en las composiciones de la invención y que no ocasiona efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. "Cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad fisiológicamente efectiva", y "cantidad terapéuticamente efectiva" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para hacer referencia a la cantidad de un conjugado o composición de inhibidor de ingreso (por ejemplo, un hidrogel) que es necesaria para proveer un nivel deseado del conjugado (o inhibidor de ingreso no conjugado correspondiente) en el torrente sanguíneo o en un tejido objetivo. La cantidad precisa puede depender de numerosos factores, por ejemplo, el inhibidor de ingreso particular, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes pretendida, las consideraciones del paciente individual, y similares, y puede ser determinada fácilmente por el experto en la técnica, tomando como base la información suministrada en la presente invención. "Ramificado", con referencia a la geometría o estructura general de un polímero, se refiere a un polímero que tiene dos o más "brazos" de polímero que se extienden desde un punto de ramificación, ün polímero ramificado puede poseer 2 brazos poliméricos, 3 brazos poliméricos, 4 brazos poliméricos, 6 brazos poliméricos, 8 brazos poliméricos o más. Un subconjunto de polímeros ramificados son los polímeros con brazos múltiples, es decir, polímeros que tienen 3 o más brazos que se extienden desde un núcleo central . _ Un "punto de ramificación" se refiere a un punto de bifurcación que comprende uno o más átomos en los cuales un grupo enlazador o polímero se divide o ramifica desde una estructura lineal en uno o más brazos poliméricos adicionales . El término "reactivo" o "activado" se refiere a un grupo funcional que reacciona fácilmente o a una velocidad práctica bajo condiciones convencionales de síntesis orgánica. Esto es opuesto a aquellos grupos que no reaccionan o que requieren de catalizadores fuertes o condiciones de reacción imprácticas para que reaccionen (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte") . Un grupo funcional en "forma protegida" se refiere a un grupo funcional que tiene un grupo protector. Tal como se utiliza en la presente invención, el término wgrupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo pretende abarcar formas protegidas del mismo. Los grupos protectores representativos se describen en, Greene, T., Wuts, P. G. , "Protective Groups in Organic Synthesis", 3ra Ed. , John Wiley & Sons, Inc., 1999. "Multi-funcional" significa un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en el mismo, en el cual los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multi-funcionales de la invención típicamente contienen desde 3 hasta 100 grupos funcionales aproximadamente, o desde 3 hasta 50 grupos funcionales o desde 3 hasta 25 grupos funcionales, o desde 3 hasta 15 grupos funcionales, o desde 3 hasta 10 grupos funcionales, o pueden contener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 grupos funcionales dentro de la estructura base del polímero . "Inhibidores de ingreso" son una clase particular de fármacos anti-retrovirales que eligen como objetivo un paso o pasos en el ciclo de vida del VIH que ocurre antes de la infección viral de una célula objetivo. Específicamente, estos son compuestos diseñados para alterar las funciones de replicación de VIH-1, de manera más prominente, la fusión y entrada de VIH-1 a la célula.

Los inhibidores de ingreso incluyen inhibidores de fusión, inhibidores de unión, e inhibidores de co-receptor. Todos los inhibidores de ingreso trabajan bloqueando la capacidad de VIH para ingresar exitosamente y de esta manera infectar a una célula objetivo. Típicamente, aunque no necesariamente, el inhibidor de ingreso de la presente invención es un péptido o un péptido modificado, tal como una proteina de fusión híbrida, u otro péptido quimérico, que tenga por lo menos un grupo electrofílico o grupo nucleofílico apropiado para reacción con un reactivo polimérico. El término "inhibidor de ingreso" o "El" abarca tanto al inhibidor de ingreso antes de, así como después de, la conjugación. Un "hidrogel" es un material que absorbe un solvente (por ejemplo agua) , experimenta una expansión rápida sin disolución distinguible, y mantiene redes tridimensionales con capacidad de deformación reversible. Los hidrogeles pueden no estar entrelazados o estar entrelazados. Las redes entrelazadas covalentemente (químicamente) de polímeros hidrofílicos , tales como PEG, pueden formar hidrogeles (o acuageles) en estado hidratado. Los hidrogeles no entrelazados típicamente son copolímeros en bloque que tienen regiones hidrofílicas e hidrofóbicas . Estos materiales no entrelazados pueden formas hidrogeles cuando se colocan en un entorno acuoso, debido a fuerzas de entrelazamiento físicas que resultan de las atracciones iónicas, formación de puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, etc. Estos pueden absorber agua pero no se disuelven debido a la presencia de regiones hidrofóbicas e hidrofílicas . "Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, 95% o más de cierta cantidad dada. El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que padece de o está propenso a una condición que se puede evitar o tratar mediante administración de un agente activo de la invención (por ejemplo, conjugado), e incluye tanto a humanos como animales . "Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita inmediatamente puede o puede no presentarse, de modo que la descripción incluye casos en los cuales la circunstancia se presenta y casos en los cuales ésta no se presenta. Los residuos de aminoácido en los péptidos se abrevian con cualquiera de las abreviaturas de una sola letra o las abreviaturas de aminoácido correspondientes de la siguiente manera: F Phe Fenilalanina L Leu Leucina es Leu I He Isoleucina M Met Metionina V Val Valina S Ser Serina P Pro Prolina T Thr Treonina A Ala Alanina y Tyr Tirosina H His Histidina Q Gln Glutamina N Asn Asparagina K Lys Lisina D Asp Ácido aspártico E Glu Ácido glutámico C Cys Cisteina Trp Triptófano R Arg Arginina G Gly Glicina Generalidades Composiciones poliméricas de liberación sostenida de inhibidores de ingreso Como se indicó previamente, la presente invención provee composiciones y métodos para el suministro sostenido de compuestos inhibidores de ingreso de VIH tales como T-20, T-1249 y otros. En la presente invención se describen ejemplos de polímeros, conjugados y composiciones para prolongar el tiempo de vida media de compuestos inhibidores de ingreso de acción corta, en particular aquellos que están basados en péptido, mientras que también mantienen por lo menos un grado mensurable, y más preferido, significativo de su actividad retroviral después de la administración. En algunos casos, se prefieren conjugados de polímero que tengan uno o más enlaces hidrolizables diseñados para liberar la porción polimérica del conjugado in vivo o composiciones basadas en hidrogel degradable, que serán descritos con mayor detalle más adelante en la presente invención. En particular, para fármacos tales como inhibidores de ingreso, los conjugados que poseen uno o más enlaces degradables poseen la ventaja de tener tanto un tiempo de vida media en circulación prolongado como de presentar bio-actividad in vivo debido a la naturaleza degradable del polímero unido, debido a que el polímero se libera del inhibidor de ingreso después de hidrólisis. Por lo tanto, en dichas modalidades, el impacto del tamaño y posición del polímero unido sobre la capacidad del El para evitar que el VIH ingrese a las células T no es una preocupación particular, debido a que la porción polimérica de la molécula se desprende en el cuerpo para liberar el inhibidor de ingreso.

INHIBIDORES DE INGRESO Inhibidores de ingreso Los conjugados y composiciones de la invención comprenden por lo menos un fármaco anti-VIH que de preferencia es un inhibidor de ingreso. Los inhibidores de ingreso se designan genéricamente en las estructuras en la presente invención como ??". Los inhibidores de ingreso preferidos para ser utilizados en la invención son aquellos que están basados en péptido, es decir, que comprenden tres o más residuos de aminoácido contiguos. Dichos El incluyen T-20, T-1249, PRO 542 (también conocido como CD4-IgG2) , PRO-140, PRO-367, SCH-417690, TXN-355, ÜK-427, UK-857, GSK-873, y GSK-140. Volviendo al primer inhibidor de ingreso discutido anteriormente, T-20 es un péptido sintético de 36 aminoácidos lineal que tiene un extremo N-terminal acetilado y un grupo carboxamida en su extremo C-terminal . El peso molecular de T-20 es 4492. T-20 está constituido por residuos de L-aminoácido presentes en la naturaleza, y posee la secuencia de aminoácido primaria mostrada a continuación como SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 1. Acetil-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2.

Utilizando las abreviaturas de aminoácido, SEQ ID NO: 1 se puede representar de manera alternativa como: SEQ ID NO: 1. YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. T-20 interfiere con el ingreso de VIH-l en las células inhibiendo la fusión de las membranas viral y celular. T-20 se une a la primera heptada repetitiva (HR1) en la subunidad gp41 de la glucoproteina de envoltura viral, con lo cual evita los cambios de configuración requeridos para la fusión a la membrana. HR1 se torna accesible a T-20 únicamente después que gpl20 se une a CD4. Se cree que la unión al co-receptor induce los cambios en configuración finales que conducen a la fusión a membrana. Parece ser que T-20 se une a un intermediario estructural en el proceso de fusión, y parece poseer una ventana cinética muy estrecha en la cual se intercala por si mismo en las células en fusión. Debido a su mecanismo de acción, en una modalidad de la invención se prefiere un polímero de bajo peso molecular para unión covalente a un inhibidor de fusión tal como T-20 o en una modalidad alternativa, un polímero que tiene uno o más enlaces hidrolizables, de modo tal que no se impida la unión por parte de T-20 a la primera región helicoidal de gp41 (HR1) , debido a que el polímero se desprende después de hidrólisis in vivo. Para uso en la presente invención, la secuencia del polipéptido T-20 puede estar bloqueada y/o modificada como derivado en uno o en ambos de sus extremos terminales amino o carboxi, como se describe en la patente E.U.A. No. 5,464,933, o puede poseer un grupo bloqueador en una o más de las posiciones de lisina para ayudar, por ejemplo, en la unión selectiva de sitio del polímero, dependiendo de la química utilizada para unir el polímero al El. La secuencia de T-20 contiene lisinas en las posiciones Lysl8 y Lys28, de las cuales cada una o ambas, en algunas modalidades de la invención, son preferidas para la unión covalente de un polímero soluble en agua. En particular, la tirosina del extremo amino terminal se puede bloquear o modificar como derivado con un grupo arilo y los extremos carboxi terminales de fenilalanina se pueden bloquear o modificar como derivados con un grupo amino. Las secuencias tipo T-20 adicionales contempladas para uso en la presente invención comprenden los aminoácidos 638 a 673 de la proteína gp41 de HIV-lLai, y fragmentos, análogos, y homólogos de la misma, como se describe en la patente E.U.A. No. 5,464,933, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. Las secuencias de péptido particularmente preferidas corresponden a las SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, y 7 como se describen en la patente E.U.A. No. 5, 464, 933, que corresponden a SEQ ID NOS: 1 a 6 respectivamente en la presente invención. Los sitios para unión de polímero soluble en agua preferidos incluyen el grupo amino de la(s) lisina(s), el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, los grupos hidroxilo presentes en tirosina, treonina, o serina. Como se indicó anteriormente, los polipéptidos tipo T-20 adicionales para uso en las composiciones de la presente invención abarcan: SEQ ID NO: 2 YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF SEQ ID NO: 3 YTG1IYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF SEQ ID NO: 4 YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF SEQ ID NO: 5 LEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIFGNWF SEQ ID NO: 6 LEANISQSLEQAQIQQEKN YELQKLNSWDVFTNWL, en las cuales cada residuo de aminoácido está presentado mediante su código de una sola letra. T-1249 representa otro inhibidor de ingreso para uso en los conjugados de la presente invención. En forma similar a T-20, T-1249 también se obtiene a partir de diversas secuencias de proteína (gp41) de la envoltura retroviral, pero posee propiedades farmacocinéticas que están un tanto mejoradas con respecto a aquellas de T-20. T-1249 es un polipéptido híbrido que contiene una secuencia de polipéptido central ligada a una secuencia de péptido incrementador . T-1249 posee 39 aminoácidos y se une a una región ligeramente diferente de gp41 de VIH que la de T-20.

La secuencia de aminoácido de T-1249 se muestra en la figura 13B de la patente E.U.A. No. 6,656,906. T-1249 presenta actividad in vitro contra aislados de VIH-1, VIH- 2, y VIS. La secuencia de polipéptido de T1249 es: SEQ ID NO: 7 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF. Como se puede observar a partir de la secuencia anterior, el aminoácido del extremo N-terminal es triptófano y el aminoácido del extremo C-terminal es fenilalanina . Como se describe en la tabla 1 de la patente E.U.A. No. 6,348,568, (SEQ ID NO: 1071), la secuencia de T-1249 puede estar bloqueada y/o modificada como derivado en uno o en ambos de los extremos amino terminal y carboxi terminal. Por ejemplo, el extremo terminal triptófano se puede bloquear o modificar como derivado con un grupo acilo y la fenilalanina del extremo carboxi terminal se puede bloquear con un grupo amino, lo cual da como resultado la formación de un grupo funcional amida. La secuencia de T-1249 contiene Usinas en las siguientes cuatro posiciones, las cuales, en función del tipo de reactivo polimérico empleado, pueden ser apropiadas para unión covalente de un polímero soluble en agua (Lys7, Lys21, Lys28 y Lys31) . Las secuencias de inhibidor de ingreso de ejemplo adicionales (similares a aquellas de T-1249) para uso en la presente invención se describen en la patente E.Ü.A. No. 6,656,906, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. Las secuencias particularmente preferidas son aquellas mostradas en las figuras 13A-C en la patente E.U.A. No. 6,656,906. Los métodos útiles para determinar la actividad anti-viral de cualesquiera de las secuencias de polipéptido obtenidas a partir de gp- 1 híbridas anteriores, o la actividad de un conjugado polimérico o composición del mismo correspondiente, también se describen en la patente E.U.A. No. 6, 656, 906. Otro inhibidor de ingreso basado en péptido preferido es PRO-542, una proteina de fusión híbrida que combina la región de unión de VIH del receptor CD4 con una molécula de anticuerpo de humano. PRO 542 neutraliza a VIH uniéndose a gpl20, con lo cual evita la unión viral a las células hospederas. De manera más particular, PRO 542 es un heterotetrámero quimérico de CD4-IgG2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la patente E.U.A. No. 6,187,748, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. De manera incluso más especifica, PRO 542 está constituida por los dominios N-terminales de CD4 de humano fusionados a las regiones constantes de cadena ligera y pesada de IgG2. PRO 542 se considera como un inhibidor de unión, y actúa muy tempranamente en el proceso de ingreso viral. Pruebas tales como la prueba de inhibición del sincitio y métodos para determinar las propiedades antivirales de dichas proteínas de fusión híbridas se describen en la patente E.U.A. No. 6,187,748, y pueden ser utilizadas por un experto en la técnica para determinar en forma similar la actividad antiviral de los conjugados o composiciones de polímero correspondientes. Las modalidades preferidas de la invención son aquellas en las cuales un polímero soluble en agua tal como PEG está unido en forma covalente a PRO 542, o cualesquiera de los otros inhibidores de ingreso descritos en la presente invención, a través de un enlace covalente degradable, que será descrito con mayor detalle más adelante. Los ejemplos nó limitativos adicionales de inhibidores de ingreso basados en péptido para uso en la presente invención incluyen péptidos de CCR5, tanto las formas sulfonadas como no sulfonadas de los mismos, por ejemplo PRO 140 y PRO 367. Los péptidos de CCR5 sulfatados se describen en la publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2003/0139571. PRO 140 (conocido previamente como PA14) es un anticuerpo monoclonal humanizado de inmunoglobulina Gl de ratón el cual se clasifica como un inhibidor del co-receptor de CCR5. PRO 140, y el anticuerpo monoclonal anti-CCR5, se unen a un epítope complejo que abarca dominios extracelulares múltiples en CCR5. Este inhibe en forma potente el ingreso de VIH-1 mediado por CCR5 en las células objetivo, en especifico células T CD4+ y macrófagos, a concentraciones que no evitan la señalización de CC-quimiocina (Trkola, A., et al., Journal of Virology, enero de 2001, Vol. 75, No. 2, 579-588). La preparación, aislamiento y purificación de PRO 140 típicamente se efectúa en la forma descrita en Olson, W. C. et al., 1999, J. Virol. 73:4145-4155. El anticuerpo monoclonal, PRO 140, también corresponde al número de acceso HB-12610 del ATCC, como se describe en Olsen et al, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2004/0228869. Los anticuerpos monoclonales adicionales apropiados para ser utilizados en la presente invención incluyen anticuerpos designados como PA8 (número de acceso HB-12605 del ATCC), PA9 (número de acceso HB-12606 del ATCC), PA10 (número de acceso HB-12607 del ATCC), PAll (número de acceso HB-12608 del ATCC) y PA12 (número de acceso HB-12609 del ATCC) como se describe en Olsen, et al., publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2004/0228869. Estos anticuerpos comprenden regiones determinantes de complementariedad (CDR) que se unen a un epítope del receptor de quimiocina 5 (CCR5) . CCR5 es un receptor de quimiocina que se une a los miembros del grupo C-C de quimiocinas, y cuya secuencia de aminoácido comprende aquellas provistas en el número de acceso 1705896 de GenBank. El epitope de la presente invención comprende residuos de aminoácido consecutivos presentes en i) un extremo N-terminal de CCR5, ii) una de tres regiones de bucle extracelular de CCR5, o iii) una combinación de (i) y (ii) · Los fragmentos, variantes de deleción, variantes de sustitución o variantes de adición biológicamente activas de cualesquiera de los anteriores que mantengan por lo menos cierto grado de actividad anti-retroviral también pueden funcionar como un El de conformidad con la invención. Los El de la invención se pueden elaborar en forma recombinante o utilizando métodos de síntesis bien conocidos en la técnica. Los El de la invención se pueden modificar, de manera conveniente, si fuera necesario, para que incluyan uno o más residuos de aminoácido tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, para proveer la unión fácil del polímero a un átomo dentro de la cadena lateral del aminoácido. Las técnicas para agregar residuos de aminoácido son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a. edición. Los sitios preferidos en un peptidil-EI para unión covalente de un polímero soluble en agua incluyen los extremos N-terminal o C-terminal, el grupo amino de lisina, los grupos hidroxilo presentes en tirosina, treonina, o serina, y el grupo sulfhidrilo de cisteina.

Preparación de un El Se puede preparar cualquiera de los inhibidores de ingreso anteriores utilizando una o más de las siguientes estrategias de síntesis bien conocidas en la técnica de síntesis y preparación de polipéptidos en general. Por ejemplo, se puede sintetizar un El utilizando síntesis paso a paso convencional de fase en solución o en fase sólida, condensación de fragmento, química de F-MOC o T-BOC, por ejemplo, como se describe en Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, William et al., Eds., 1997, CRC Press, Boca Ratón, Fia, y en las referencias citadas en la misma; en Solid Phase Peptide Synthesis: A Practica! Approach, Atherson & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, Inglaterra, y en Sheppard, R. C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Comía., pp. 165-166 (1985)), utilizando, por ejemplo, un aparato Advanced Chemtech modelo 200 disponible de Advanced Chemtech., Louisville, Ky., un aparato Millipore 9050+ disponible de Millipore, Bedford Mass, u otra instrumentación disponible. De manera alternativa, los compuestos El de la invención se pueden diseñar en forma recombinante incorporando secuencias codificadoras de ADNc en vectores de ADN de plásmido virales o circulares funcionales. Los vectores o plásmidos se utilizan después para transfectar o transformar los microorganismos seleccionados. Los microorganismos transformados o transfectados se cultivan bajo condiciones que conduzcan a la expresión de secuencias de ADN portadas por el vector, seguido por aislamiento de los péptidos deseados desde el medio de crecimiento. Véase, por ejemplo patente E.U.A. No. 5,955,422. Los vectores que se pueden utilizar incluyen aquellos obtenidos a partir de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN cósmido. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores plásmidos tales como las series de vectores pcDNA3, pBR322, püC 19/18, pUC 118, 119 y M13 mp. Los vectores de bacteriófago incluyen gtlO, gtll, ?gtl8-23, ????/R y las series EMBL de vectores de bacteriófago. Los vectores de cósmido que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS y pNNI. También se pueden utilizar vectores virales recombinantes incluyendo aquellos obtenidos a partir de herpes virus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus, o baculovirus . Los compuestos El de la invención también se pueden preparar utilizando técnicas estándar de tecnología de ADN recombinante que son bien conocidos en el campo, tales como aquellas descritas en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) o en Ausubel et al., Current Protocole in Molecular B ology, de las cuales ambas se incorporan en la presente invención para referencia. Los métodos ilustrativos para preparar T-1249 y T-20 se describen en la patente E.Ü.A. No. 6,767,993, patente E.U.A. No. 6,015,881 (T-20), patente E.Ü.A. No. 6,258, 782 (T-1249) y en la patente E.Ü.A. No. 6,348,568 (OJ1249) . Después del corte y desprotección, se purificar un El polipeptidico, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía por exclusión de tamaño, precipitación, y similares. De manera alternativa, se puede utilizar HPLC normal o de fase inversa para purificar/separar polipéptidos de longitud completa a partir de fragmentos más pequeños. Las secuencias de aminoácidos de un inhibidor de ingreso se pueden confirmar e identificar utilizando análisis estándar de aminoácido, así como degradación de Edman manual o automatizada y determinación de cada aminoácido, utilizando por ejemplo, aparatos para determinación de secuencia de aminoácido automatizados tales como aquellos fabricados por Applied Biosystems. Los aparatos para determinación de secuencia automatizados apropiados incluyen el aparato para determinación de secuencia de proteína Applied Biosystems 476A o el aparato para determinación de secuencia de proteína Procise 494. Ambos instrumentos utilizan química de degradación de Edman en fase gaseosa estándar o líquida pulsada. También se puede utilizar análisis de HPLC o espectrometría de masas para confirmar la identidad de un El dado. Los anticuerpos monoclonales humanizados tales como PRO 140, PA 8, 9, 10, 11 ó 12 se preparan como se describe en Olsen, W. C. et al., J. of Virol., mayo de 1999, p. 4145-4155, Vol . 73, No. 5, y en la publicación de solicitud de patente E.Ü.A. No. 2004/0228869. Brevemente, los anticuerpos monoclonales tales como éstos se pueden preparar a partir de células Ll.2-CCR5+ de múrido (Wu, L., et al., Nature, 384:179-183, 1996) utilizando técnicas de hibridoma estándar, acopladas con técnicas para elaborar anticuerpos humanizados. Las publicaciones ilustrativas que describen la manera en la cual se producen los anticuerpos humanizados incluyen patente E.Ü.A. No. 4,816,567, patente E.Ü.A. No. 5,225,539, patente E.Ü.A. No. 5,585,089, patente E.Ü.A. No. 5,693,761 y WO 90/07861. PRO-542, un heterotetrámero quimérico de CD4-IgG2, se puede preparar utilizando las técnicas y vectores de expresión descritas en la patente E.Ü.A. No. 6,451,313.

Los inhibidores de ingreso adicionales tales como péptidos de CCR4 sulfatados se preparan como se describe en la publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2003/0139571.

Polímeros Como se discutió previamente, un aspecto de la invención está dirigido a un conjugado de un El, tal como T-20 o T-1249 o similares (como se describió anteriormente) unido a un polímero soluble en agua, con frecuencia designado en la presente invención simplemente como POLY. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua es no peptídico, no tóxico, no presente en la naturaleza y biocompatible . Una sustancia se considera generalmente como biocompatible si los efectos benéficos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo agente activo tal como un inhibidor de ingreso) en conexión con tejidos vivos (por ejemplo, administración a un paciente) supera cualesquiera efectos perjudiciales según es evaluado por un profesional clínico, por ejemplo, un médico. Respecto al carácter no inmunógeno, se considera que una sustancia es no inmunógena si el uso pretendido de la sustancia ín vivo no produce una respuesta inmune indeseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, que dicha respuesta no se considere clínicamente significativa o importante según es evaluado por un profesional clínico. Se prefiere en particular que el polímero soluble en agua de la invención sea tanto biocompatible como no inmunógeno . Los ejemplos de dichos polímeros incluyen, pero no se limitan a, poli (alquilenglicoles) tales como polietilenglicol (PEG) , poli (propilenglicol) ("PPG") , copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (cc-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Un polímero de la invención puede ser un homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero en bloque, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio, o tripolímero en bloque constituido por monómeros de cualquiera de los polímeros precedentes. De preferencia, el polímero es un copolímero, o de manera más preferida, es un homopolímero, por ejemplo, de polietilenglicol. Aunque mucha de la discusión en la presente invención se enfoca sobre PEG como un polímero soluble en agua ilustrativo, la discusión y estructuras presentadas en la presente invención pretenden abarcar cualquiera de los polímeros solubles en agua descritos anteriormente. De manera más especifica, para las estructuras y figuras de ejemplo que demuestran a "PEG" como el polímero soluble en agua, el término "PEG" también pretende ser sustituido con cualquiera de los polímeros solubles en agua alternativos descritos en la presente invención, de modo tal que las estructuras y figuras provistas en la presente invención se extiendan explícitamente a dichos polímeros solubles en agua alternativos . El polímero per se, antes de la conjugación a un El, típicamente se caracteriza por tener desde 2 hasta 300 extremos terminales aproximadamente, más preferido desde 2 aproximadamente hasta 25 extremos terminales aproximadamente, incluso más preferido tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 extremos terminales. El polímero no está limitado a una estructura particular y puede ser lineal (por ejemplo PEG con extremos bloqueados o PEG bifuncional lineal) , ramificado o de brazos múltiples. Típicamente, PEG y otros polímeros solubles en agua, antes de la conjugación con un El, se activan con un grupo activador apropiado adecuado para copulación a un sitio deseado en el El. Los reactivos poliméricos representativos y los métodos para conjugar estos polímeros a una porción activa son conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en Zalipsky, . S., et al., "Use of Funcionalized Poly (Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemístry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-185, en Roberts, M. et al., "Chemístry for Peptide and Proteín PEGylation", Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) : 459-475, y en "Nektar Advanced PEGylation": Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Catálogo 2004. Típicamente, el peso molecular promedio en peso del polímero soluble en agua no peptídico en el conjugado es desde 100 Daltons aproximadamente hasta 150,000 Daltons aproximadamente. Sin embargo, los intervalos de ejemplo incluyen pesos moleculares promedio en peso en el intervalo de aproximadamente 500 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons, en el intervalo de aproximadamente 2,000 Daltons hasta aproximadamente 90,000 Daltons, en el intervalo de aproximadamente 5,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons, en el intervalo de aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 50,000 Daltons, o en el intervalo de aproximadamente 15,000 Daltons hasta aproximadamente 40,000 Daltons. Los polímeros de peso molecular más alto, por ejemplo, que tienen un peso molecular mayor de 20,000 Daltons aproximadamente o más, o 30,000 Daltons o más, o incluso 40,000 Daltons o más, o incluso 50,000 Daltons o más, son preferidos en el presente caso cuando están unidos covalentemente a un El por medio de un enlace hidrolizable . En una modalidad, se prefiere el uso de un polímero de alto peso molecular y/o ramificado degradable, debido a que por razón de las restricciones espaciales en el polipeptidil-EI, podría ser posible unir covalentemente sólo una o dos moléculas de polímero de alto peso molecular al El. De esta manera, se favorece la formación de un conjugado monopolimérico (es decir, que tenga solamente una molécula de polímero unida covalentemente al El) o conjugado dipolimérico hidrolizable. Esto puede conducir de manera conveniente a rendimientos más altos, junto con una síntesis y separación, purificación y caracterización subsiguientes de conjugado más limpia, debido a la ausencia de formación de especies conjugadas múltiples, aunque los diferentes PEG-meros (conjugados en los cuales el agente activo tiene 1, 2, 3, o más cadenas poliméricas unidas en forma covalente al mismo) se pueden separar como se describe con mayor detalle más adelante. Asimismo, cuando se considera la acción del conjugado in vivo, la hidrólisis de un conjugado monopolimérico puede ser particularmente conveniente, debido a que únicamente se implica una sola reacción de hidrólisis, es decir, una hidrólisis efectiva para liberar el El y el polímero, en contraste a la unión covalente, degradable de un polímero a sitios reactivos múltiples en el El, o de manera alternativa, fármacos de tipo El múltiples unidos en forma covalente a un polímero de brazos múltiples, en el cual la liberación del polímero o del fármaco se complica por la cinética implicada en los pasos de hidrólisis múltiples y las especies intermedias. Aunque el uso de un polímero de peso molecular más grande, degradable, en algunos casos, puede ofrecer ciertas ventajas con respecto a las estructuras o arquitecturas de conjugado alternativas, esto no quiere decir que las modalidades alternativas, tales como el uso de polímeros más pequeños, ya sea unidos en forma individual o múltiple a un El, u otras modalidades adicionales como las descritas en la presente invención, estén sin sus propias ventajas asociadas, lo que será descrito con mayor detalle más adelante . Los pesos moleculares promedio en peso de ejemplo para el segmento de polímero soluble en agua incluyen 100 Daltons aproximadamente, 200 Daltons aproximadamente, 300 Daltons aproximadamente, 400 Daltons aproximadamente, 500 Daltons aproximadamente, 600 Daltons aproximadamente, 700 Daltons aproximadamente, 750 Daltons aproximadamente, 800 Daltons aproximadamente, 900 Daltons aproximadamente, 1,000 Daltons aproximadamente, 2,000 Daltons aproximadamente, 2,200 Daltons aproximadamente, 2,500 Daltons aproximadamente, 3,000 Daltons aproximadamente, 4,000 Daltons aproximadamente, 4,400 Daltons aproximadamente, 5,000 Daltons aproximadamente, 6,000 Daltons aproximadamente, 7,000 Daltons aproximadamente, 7,500 Daltons aproximadamente, 8,000 Daltons aproximadamente, 9,000 Daltons aproximadamente, 10,000 Daltons aproximadamente, 11,000 Daltons aproximadamente, 12,000 Daltons aproximadamente, 13,000 Daltons aproximadamente, 14,000 Daltons aproximadamente, 15,000 Daltons aproximadamente, 20,000 Daltons aproximadamente, 22,500 Daltons aproximadamente, 25,000 Daltons aproximadamente, 30,000 Daltons aproximadamente, 35,000 Daltons aproximadamente, 40,000 Daltons aproximadamente, 45,000 Daltons aproximadamente, 50,000 Daltons aproximadamente, 55,000 Daltons aproximadamente, 60,000 Daltons aproximadamente, 65,000 Daltons aproximadamente, 70,000 Daltons aproximadamente, y 75,000 Daltons aproximadamente. También se pueden utilizar las versiones ramificadas u otras versiones de brazos múltiples del polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero soluble en agua de 40, 000 Daltons ramificado que tenga dos "brazos" poliméricos de 20,000 Daltons) que tenga un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En casos en los cuales el polímero es PEG, el PEG típicamente comprende un número de monómeros (OCH2CH2) . Tal como se utiliza a través de toda la descripción, el número de unidades repetitivas se identifica con el subíndice ?" en " (OCH2CH2) n" · Por lo tanto, el valor de (n) típicamente cae dentro de uno o más de los siguientes intervalos: desde 2 hasta 3,400 aproximadamente , desde 100 aproximadamente hasta 2, 300 aproximadamente, desde 100 aproximadamente hasta 2,270 aproximadamente, desde 136 aproximadamente hasta 2, 050 aproximadamente, desde 225 aproximadamente hasta 1,930 aproximadamente, desde 450 aproximadamente hasta 1, 930 aproximadamente, desde 1 ,200 aproximadamente hasta 1, 930 aproximadamente, desde 568 aproximadamente hasta 2,727 aproximadamente, desde 660 aproximadamente hasta 2, 730 aproximadamente, desde 795 aproximadamente hasta 2, 730 aproximadamente, desde 909 aproximadamente hasta 2, 730 aproximadamente, y desde 1 ,200 aproximadamente hasta 1,900 aproximadamente. Para cualquier polímero dado en el cual se conozca el peso molecular, es posible determinar el número de unidades de repetición (es decir, "n") dividiendo el peso molecular total del polímero entre el peso molecular de la unidad de repetición. Un polímero particularmente preferido para uso en la invención es un polímero con extremos bloqueados, es decir, un polímero que tiene por lo menos un extremo terminal bloqueado con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi de Cxs inferior o un grupo benciloxi, aunque también se puede utilizar un grupo hidroxilo. Cuando el polímero es PEG, por ejemplo, en muchos casos se prefiere utilizar un metoxi-PEG (comúnmente conocido como mPEG) , el cual es una forma de PEG, típicamente lineal, en el cual un extremo terminal del polímero es un grupo metoxi (-OCH3) , mientras que el otro extremo terminal es un grupo hidroxilo u otro grupo funcional que opcionalmente se puede modificar químicamente. La estructura de un mPEG se da a continuación. CH3O- (CH2CH20)n-CH2CH2-, en la cual el valor de (n) es como se describió anteriormente. De manera alternativa, en lugar de estar bloqueado por los extremos, un reactivo polimérico (y el producto correspondiente) puede poseer una estructura lineal bifuncional o tipo mancuerna, de modo tal que el conjugado resultante sea uno en el cual los El estén interconectados mediante un POLY lineal central, por ejemplo PEG. De manera más específica, en una modalidad, dicho conjugado se representa mediante la estructura EI-PEG-EI, en la cual los El pueden ser iguales o diferentes. Es decir, cada El independiente se selecciona a partir del grupo que consiste de: T-20, T-1249, PRO 542, PRO-140, PA 8, PA 9, PA 10, PA 11, PA 12, PRO-367, SCH-417690, TXN-355, UK-427, ÜK-857, GSK-873 y GSK-140. de preferencia, un conjugado de la invención es aquel en el cual el polímero, POLY, está unido covalentemente a un El que se selecciona a partir del grupo que consiste de T-20, T-1249, PRO-542 y PRO-140. En situaciones en las cuales la terapia de combinación es conveniente, por ejemplo, cuando la terapia de combinación es útil para evitar la resistencia al VIH, o cuando existe un efecto sinergista, los conjugados que comprenden dos fármacos El diferentes unidos covalentemente a un polimero representan una modalidad preferida. Por ejemplo, T-20, en combinación con PRO 542 y PRO 140, actúa en forma sinergista para bloquear la infección de células sanas (4th Annual Fortis Bank Biotechnology Conference, Londres, mayo 4, 2004) . Por lo tanto, las modalidades de ejemplo de conformidad con este aspecto de la invención incluyen una estructura de polimero en mancuerna que tiene T-20 y PRO-542 unidos en los extremos terminales opuestos, o T-20 y PRO-140 unidos en los extremos terminales opuestos, o PRO 542 y PRO 140 unidos en ,los extremos terminales opuestos, o PRO 542 y PRO 140 unidos en los extremos terminales opuestos, o PRO 542 y PRO 140 unidos en los extremos terminales opuestos, en la que el tercer El simplemente se coadministra con los mismos. Incluso en otra modalidad, se utiliza una arquitectura de polimero de tres brazos, con uno de los tres fármacos El unidos cada uno covalentemente a cada uno de los brazos poliméricos. Incluso en una modalidad adicional, un conjugado de conformidad con la invención posee una estructura en mancuerna con T-20 en un extremo terminal del polímero y T-1249 en el otro extremo terminal. Incluso en otra modalidad, el conjugado bifuncional lineal posee la estructura EI-POLY-A, en la cual A en su sentido más amplio representa un grupo funcional apropiado para unión a otra porción. De preferencia, ? es un agente retroviral, y de manera más preferida, es un agente anti-VIH que trabaja en un modo sinergista con El. Un polímero para uso en la invención puede poseer 2 brazos, 3 brazos, 4 brazos, 5 brazos, 6 brazos, 7 brazos, 8 brazos o más. Los polímeros con brazos múltiples se pueden utilizar para formar conjugados, o de manera alternativa, se pueden utilizar para formar hidrogeles, y pueden poseer cualquier cantidad entre 2 a 300 o más extremos terminales reactivos. En una modalidad de la Invención, se prefieren los segmentos de polímero ramificado que tienen 2 o 3 brazos poliméricos . Un POLY ramificado ilustrativo, como se describe en la patente E.U.A. No. 5,932,462, corresponde a la estructura: PEG—P I R"—C I PEG—Q En esta representación, R" es una porción no reactiva, tal como H, metilo o un PEG, y P y Q son enlaces no reactivos. En la configuración ramificada particular anterior, el segmento de polímero ramificado posee un solo sitio reactivo que se extiende desde el punto de ramificación "C" para posicionamiento del El, opcionalmente a través de un enlazador, el cual puede incluir opcionalmente un enlace degradable. En una modalidad ilustrativa, el segmento de polímero de PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi-poli (etilenglicol) con un solo sitio de unión para unión covalente a un El. Dependiendo del sitio de unión en el El, el grupo éster reactivo de la lisina disustituida también se puede modificar o activar adicionalmente para formar un grupo funcional apropiado para reacción con un grupo objetivo en el fármaco El. Los PEG ramificados que tienen la estructura generalizada antes descrita para uso en la presente invención típicamente tienen menos de 4 brazos de PEG, y de manera más preferida, tienen 2 o 3 brazos de PEG. Dichos PEG ramificados ofrecen la ventaja de tener un solo sitio reactivo, acoplado con una nube polimérica más densa, más grande que sus contrapartes de PEG lineales. Un tipo particular de conjugado de PEG-EI ramificado corresponde a la estructura: (MeO-PEG) ¿G-, en la cual "i" es igual a 2 ó 3, y G es una lisina u otro residuo de aminoácido apropiado, con un sitio apropiado para unión a un El. Los PEG ramificados adicionales para uso en la presente invención incluyen aquellos descritos en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 2005/000360. Por ejemplo, un polímero ramificado adicional para preparar un conjugado de El posee la siguiente estructura, en la cual POLY1 es un polímero soluble en agua; POLY2 es un polímero soluble en agua; (a) es 0, 1, 2 ó 3; (b) es 0, 1, 2 ó 3; (e) es 0, 1, 2 ó 3; (f) es 0, 1, 2 ó 3; (g) es 0, 1, 2 ó 3; (h) es 0, 1, 2 ó 3; (j) es 0 a 20; cada R1 es de manera independiente H o un radical orgánico que se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; X1, cuando está presente, es una primera porción espaciadora; X2, cuando está presente, es una segunda porción espaciadora; X5, cuando está presente, es una quinta porción espaciadora; X6, cuando está presente, es una sexta porción espaciadora; X7, cuando está presente, es una séptima porción espadadora; X , cuando está presente, es una octava porción espadadora; R5 es una porción de ramificación; y Z es un grupo reactivo para copulación a un El, opcionalmente a través de un espaciador intermedio. De preferencia, POLY1 y POLY2 en la estructura de polímero ramificado precedente son idénticos, es decir, son del mismo tipo de polímero (estructura) y peso molecular. Un polímero ramificado representativo que cae en la clasificación anterior, apropiado para ser utilizado en la presente invención es: en la cual (m) es 2 a 4000, y (f) es 0 a 6 y (n) es 0 a 20. Los polímeros ramificados útiles en la preparación de un conjugado o hidrogel de la invención incluyen de manera adicional aquellos representados de manera más general por la fórmula R(POLY)y, en la cual R es una molécula central o de núcleo a partir de la cual se extienden 2 o más brazos POLY tales como PEG. La variable "y" representa el número de brazos POLY, en la cual cada uno de los brazos de polímero puede de manera independiente estar bloqueado en los extremos, o de manera alternativa, poseer un grupo funcional reactivo en sus extremos terminales. Una estructura más explícita de conformidad con esta modalidad de la invención posee la estructura, R(POLY- Z)y, en la cual cada Z es de manera independiente un grupo bloqueador de extremo, o un grupo reactivo, por ejemplo, apropiado para reacción con un entrelazador o con un El. En una modalidad incluso adicional, cuando Z es un grupo reactivo, después de reacción con, por ejemplo, cualquiera de un entrelazador o un El, el enlace resultante puede ser hidrolíticamente estable, o de manera alternativa, puede ser degradable, es decir hidrolizable . Típicamente, por lo menos un brazo polimérico posee un grupo funcional terminal apropiado para reacción con un El. Los PEG ramificados tales como aquellos representados en términos generales por la fórmula R(PEG)y, anterior poseen 2 brazos poliméricos hasta 300 brazos poliméricos aproximadamente (es decir, "y" varía desde 2 hasta 300 aproximadamente) . De preferencia, dichos PEG ramificados poseen desde 2 hasta 25 brazos poliméricos aproximadamente, más preferido desde 2 hasta 20 brazos poliméricos aproximadamente, e incluso más preferido desde 2 hasta 15 brazos poliméricos aproximadamente, o desde 3 hasta 15 brazos poliméricos aproximadamente o menos. De manera más preferida, son polímeros de brazos múltiples que tienen 3, 4, 5, 6, 7 u 8 brazos. Las moléculas centrales preferidas en los PEG ramificados como los descritos anteriormente son polioles, los cuales se funcionalizan también posteriormente. Dichos polioles incluyen polioles alifáticos que tienen desde 1 hasta 10 átomos de carbono y desde 1 hasta 10 grupos hidroxilo, incluyendo etilenglicol, alcanodioles, alquil-glicoles, alquilidenalquildioles , alquilcicloalcanodioles, 1, 5-decalindiol, 4, 8-bis (hidroximetil) triciclodecano, cicloalquilendioles, dihidroxialcanos , trihidroxi-alcanos, y similares. También se pueden utilizar polioles cicloalifáticos, incluyendo azúcares de cadena recta o de anillo cerrado y alcoholes de azúcar, tales como manitol, sorbitol, inositol, xilitol, quebraquitol, treitol, arabitol, eritritol, adonitol, ducitol, facosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ramnosa, galactosa, glucosa, fructosa, sorbosa, mañosa, piranosa, altrosa, talosa, tagitosa, piranósidos, sacarosa, lactosa, maltosa, y similares . Los polioles alifáticos adicionales incluyen derivados de gliceraldehido, glucosa, ribosa, mañosa, galactosa, y estereoisómeros relacionados. Otros polioles centrales que se pueden utilizar incluyen éter corona, ciclodextrinas , dextrinas y otros carbohidratos tales como almidones y amilosa. Los polioles preferidos incluyen glicerol, pentaeritritol, sorbitol, y trimetilolpropano . Una estructura de brazos múltiples representativa que corresponde a un conjugado polimérico de brazos múltiples de la invención se muestra a continuación, en la cual "y" de preferencia varia desde 3 aproximadamente hasta 8 aproximadamente, R es como se definió anteriormente, y L es un enlazador que une en forma covalente cada brazo polimérico al El, opcionalmente a través de un enlace hidrolizable . Como será discutido con mayor detalle en la sección de enlazador más adelante, aunque se puede utilizar cualquiera de un número de enlaces para unir en forma covalente un polímero o brazo polimérico a un El, en algunos casos, el enlace de preferencia es degradable, designado en la presente invención como LD, es decir, contiene por lo menos un enlace o porción que se hidroliza bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, un éster, carbamato hidrolizable, carbonato, u otro de tales grupos.

R-fJpOLY—L—El)y Los polímeros de brazos múltiples adicionales útiles para formar un conjugado El de brazos múltiples o hidrogel de la invención incluyen los PEG de brazos múltiples disponibles de Nektar (Huntsville, Alabama) . Los polímeros activados de brazos múltiples preferidos para ser utilizados en el método de la invención corresponden a la siguiente estructura, en la cual E representa un grupo reactivo apropiado para copulación a un El. En una modalidad, E de preferencia es un grupo -OH (para reacción con un grupo carboxi de El o equivalente) , un grupo ácido carboxilico o equivalente, o un ácido carbónico (para reacción con los grupos -OH de El) , o un grupo amino (para reacción con un extremo C-terminal) .

PEG es - (CH2CH20) nCH2CH2-, y m se selecciona a partir del grupo que consiste de 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Desde luego, el producto de conjugado EI-polimero correspondiente posee la estructura mostrada anteriormente con excepción de que el grupo reactivo, E, está reemplazado con "-L-EI", en el cual L representa un enlace formado por reacción de E y un grupo reactivo presente en el El. Como se discutió previamente, en algunas modalidades, los enlaces preferidos son éster, carboxilo y carbamato hidrolizable, para que la porción de polímero del conjugado se hidrolice in vivo para liberar el El y el polímero. En tales casos, el enlazador L se designa como LD. De manera alternativa, el conjugado polimérico puede poseer una estructura general en horquilla. Un ejemplo de un PEG en horquilla corresponde a la siguiente estructura generalizada, en la cual la primera estructura representa un PEG en horquilla activado y la segunda estructura representa un conjugado de polímero El en horquilla : F—E F—L—El PEG—A—CH PEG-A—CH ^F'—E ^F'—L—El en las cuales PEG es cualquiera de las formas de PEG descritas en la presente invención, E es un grupo reactivo apropiado para copulación covalente con un El, A es un grupo enlazador, de preferencia un enlace hidrolíticamente estable tal como oxígeno, azufre, o -C(0)-NH-, F y F' son grupo espaciadores hidrolíticamente estables que están opcionalmente presentes, y L es como se definió anteriormente. En una modalidad preferida, el enlazador L contiene por lo menos un grupo funcional hidrolizable . En la estructura de conjugado a la derecha, los El pueden ser iguales o diferentes. Al igual que en la modalidad previa, aunque no mostrado explícitamente, también se contempla una estructura en horquilla en la cual uno de los El está reemplazado con otro agente retroviral o anti-VIH. Los grupos enlazadores y espaciadores de ejemplo correspondientes a A, F y F' se describen en la patente E.U.A. No. 6,362,254, y son útiles para formar conjugados poliméricos de conformidad con la presente invención. F y F' son grupos espaciadores que pueden se iguales o diferentes. En una modalidad particular de lo anterior, PEG es mPEG, A corresponde a -C(0)-NH-, y F y F' son ambos metileno o -C¾- . Este tipo de segmento polimérico es útil para reacción con dos agentes activos, en los cuales los dos agentes activos están posicionados a una distancia de separación precisa o predeterminada, dependiendo de la selección de F y F' . En cualquiera de las estructuras representativas provistas en la presente invención, pueden estar contenidos adicionalmente uno o más enlaces degradables en el segmento polimérico, POLY, para permitir la generación i vivo de un conjugado que tenga una cadena PEG más pequeña que en el conjugado inicialmente administrado. Los enlaces fisiológicamente disociables apropiados incluyen pero no se limitan a éster, éster carbonato, carbamato, sulfato, fosfato, éter aciloxialquilico, acetal, y cetal. Dichos enlaces cuando están contenidos en un segmento de polímero dado de preferencia son estables en almacenamiento y después de la administración inicial. De manera más particular, como se describe en términos generales anteriormente, dos o más segmentos poliméricos conectados por un enlace hidrolizable pueden ser representados por la siguiente estructura: PEG1-W-PEG2 (en la cual PEG1 y PEG2 pueden ser iguales o diferentes) y W representa un enlace hidrolizable, débil. Estas estructuras políméricas contienen segmentos de PEG que son removibles (es decir disociables) in vivo, como se describe con mayor detalle en la publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2002/0082345. El polímero de PEG utilizado para preparar un conjugado de la invención puede comprender una molécula de PEG colgante que tenga grupos reactivos, tales como carboxilo, unidos covalentemente a lo largo de la longitud del PEG en lugar de estar en el extremo de la cadena o cadenas de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden estar unidos al PEG directamente o a través de una porción espadadora, tal como un grupo alquileno. Los PEG representativos adicionales que tienen estructura ya sea lineales o ramificadas para uso en la preparación de los conjugados de la invención se pueden adquirir a partir de Nektar Therapeutics (anteriormente Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama) . Las estructuras ilustrativas se describen en el catálogo de Nektar de 2004, cuyo contenido se incorpora expresamente en la presente invención para referencia. Los enlaces hidrolíticamente degradables, útiles no sólo como un enlace susceptible de degradación dentro de una estructura a base de polímero, sino de preferencia en el caso de la presente invención, para unir en forma covalente un polímero a un El, incluyen: carbonato; imina que resulta de, por ejemplo, la reacción de una amina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al., (1997) Polymer Preprints 38 (1) : 582-3) ; éster fosfato que se forma, por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; hidrazona, que se forma, por ejemplo mediante reacción de una hidrazida y un aldehido; acetal, que se forma, por ejemplo, mediante reacción de un aldehido y un alcohol; ortoéster, formado, por ejemplo, mediante reacción entre un formiato y un alcohol; y algunos enlaces de tipo uretano . Los reactivos de PEG adicionales para uso en la invención incluyen moléculas de PEG susceptibles de hidrólisis y enlazadores hidrolizables tales como aquellos descritos en la publicación de solicitud de patente internacional No. O 04/089280. En el uso de esta estrategia, uno o más de los grupos funcionales libres dentro de un El como el descrito en la presente invención, por ejemplo, grupo amino, hidroxilo, mercapto, fosfato y/o carboxi, se convierten en derivado con un grupo sensible a condiciones básicas suaves, por ejemplo, 9-fluorenil-metoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulf?-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) , que se une covalentemente a un segmento de polímero tal como una porción de PEG. En el conjugado resultante, el El y el polímero están cada uno unidos en forma covalente en posiciones diferentes de la estructura de andamiaje de Fmoc o FMS, y se pueden liberar bajo condiciones fisiológicas . Dichas características opcionales del conjugado polimérico, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables en la cadena polimérica, pueden proveer control adicional con respecto a las propiedades farmacológicas finales deseadas del conjugado después de la administración. Por ejemplo, se puede administrar un conjugado grande y relativamente inactivo (es decir, que tiene una o más cadenas de PEG de alto peso molecular unidas al mismo, por ejemplo, una o más cadenas de PEG que tienen un peso molecular mayor de 10,000 aproximadamente, en el cual el conjugado no posee esencialmente bioactividad o posee una bioactividad insignificante) , el cual se hidroliza para generar un conjugado El bioactivo que posee una porción de la cadena de PEG original. De manera alternativa, si se utiliza un enlace degradable para unir en forma covalente el El al polímero, la hidrólisis da como resultado el El original carente del segmento polimérico, o de manera alternativa, un fármaco de El modificado que posee una porción de marca corta que queda después de la hidrólisis del segmento polimérico, en el cual el El modificado sigue conservando su propiedad de inhibición del ingreso de VIH. De esta manera, se pueden confeccionar de manera más efectiva las propiedades del conjugado para equilibrar las propiedades farmacológicas del conjugado después de la administración. Los expertos en la técnica reconocerán que la discusión anterior concerniente sustancialmente a segmentos de polímero soluble en agua es de ninguna manera exhaustiva y únicamente es ilustrativa, y que están contemplados todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas anteriormente. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "reactivo polimérico" se refiere en términos generales a una molécula completa, la cual puede comprender un segmento de polímero soluble en agua y un grupo funcional .

El enlace y ejemplos de conjugados de El Como se describió anteriormente, un conjugado de la invención comprende un polímero soluble en agua, POLY, unido covalentemente a un El. Típicamente, para cualquier conjugado dado, existen aproximadamente uno a cuatro polímeros solubles en agua unidos covalentemente al El, en el cual el polímero puede poseer cualquiera de las formas descritas en la presente invención. En una modalidad preferida, el El posee uno o dos polímeros unidos covalentemente al mismo. El enlace particular que une covalentemente el El al polímero depende de un número de factores. Dichos factores incluyen, por ejemplo, la química del enlazamiento particular empleado, el El particular, los grupos funcionales disponibles para unión covalente dentro del El, la presencia potencial de grupos funcionales reactivos adicionales dentro del El que pueden requerir opcionalmente grupos protectores, y similares. Los conjugados de la invención pueden ser, aunque no necesariamente, profármacos, lo que significa que el enlace entre el polímero y el El es hidrolíticamente degradable para permitir la liberación de la porción El. Dichos enlaces se pueden preparar fácilmente utilizando modificación apropiada de cualquiera de peptidil-EI (por ejemplo el grupo carboxilo del extremo C-terminal de la proteína o un grupo hidroxilo de la cadena lateral de un aminoácido tal como serina o treonina contenida dentro de la proteína) y/o el reactivo polimérico', utilizando métodos de copulación comúnmente utilizados en la técnica combinados con las enseñanzas de la presente solicitud. Sin embargo, son más preferidos los enlaces hidrolizables que se forman mediante reacción de un polímero activado de manera apropiada con un grupo funcional no modificado contenido dentro del El, opcionalmente a través de un enlazador intermedio. De manera alternativa, se puede utilizar un enlace hidroliticamente estable, tal como una amida, uretano (también conocido como carbamato) , amina, tioéter (también conocido como sulfuro) , o urea (también conocido como carbamida) como el enlace para copulación con el El. Un enlace hidroliticamente estable preferido es una amida. Los conjugados (en oposición a un El no conjugado) pueden o no poseer un grado mensurable de actividad retroviral, dependiendo de si el polímero está unido covalentemente o no a través de un enlazador degradable o un enlazador hidroliticamente estable. Es decir, un conjugado polimérico de conformidad con la invención puede poseer cualquier cantidad desde 0.1% aproximadamente hasta 100% aproximadamente o más de actividad anti-VIH del El precursor sin modificar. De preferencia, los conjugados que poseen poca o ninguna actividad contienen un enlace hidrolizable que conecta al polímero con el El, de modo tal que sin tomar en cuenta la ausencia de actividad del conjugado, el El activo (o un derivado del mismo) se libera después de la disociación del enlace hidrolizable inducida en medio acuoso. Para conjugados que poseen un enlace hidroliticamente estable que copula el El al polímero, el conjugado típicamente posee un grado mensurable de actividad antiviral. Por ejemplo, dichos conjugados poliméricos típicamente se caracterizan por tener una actividad de por lo menos aproximadamente 2%, 5%, 10%, 15%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%, o más con relación a aquella del El precursor sin modificar, cuando se mide en un modelo apropiado, tal como aquellos bien conocidos en la técnica. De preferencia, los conjugados que tienen un enlace hidroliticamente estable (por ejemplo, un enlace amida) poseen por lo menos cierto grado de la bioactividad del El precursor sin modificar. A continuación se describen ejemplos de conjugados poliméricos de conformidad con la invención. Existe un número de ejemplos de reactivos poliméricos solubles en agua apropiados útiles para formar enlaces covalentes con los grupos amino reactivos contenidos dentro del El. Los ejemplos particulares, junto con el conjugado correspondiente, se proveen en la siguiente tabla 1. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y -??-??" representa el El después de la conjugación al polímero soluble en agua, en el cual el "NH-" representa un grupo amino en el El. Aunque cada porción polimérica presentada en la tabla 1 termina en un grupo "CH3", éste puede ser sustituido por otros grupos (tales como H, etilo y bencilo) . Asimismo, aunque las tablas en la presente invención muestran en términos generales un solo reactivo polimérico unido a un fármaco El, esto es con propósitos ilustrativos únicamente. Se debe entender que un reactivo polimérico dado puede estar unido en forma covalente a sitios múltiples en el El, dependiendo de los grupos reactivos utilizados, la estrategia de síntesis, el tamaño del polímero, etcétera. Para simplificar, las estructuras ilustrativas en las siguientes tablas muestran un reactivo polimérico unido covalentemente a un sitio en el El, aunque dichas estructuras pretenden abarcar de manera adicional el presente reactivo polimérico unido en forma covalente a más de un sitio. De manera adicional, cualquiera de los conjugados de polímero en la tabla 1, si no es degradable en la forma en que se muestra, se puede modificar para formar un conjugado que comprenda un enlace degradable de la siguiente manera. Por ejemplo, se une en forma covalente un espaciador bifuncional, de preferencia uno que se pueda unir en forma liberable a un El, por ejemplo un aminoácido, a un sitio reactivo en el El. De preferencia, el espaciador bifuncional posee en un extremo un grupo amino, de modo tal que se pueda promover fácilmente dicha reacción con los reactivos poliméricos de ejemplo en la tabla 1. En el otro extremo del espaciador bifuncional está, por ejemplo, un grupo carboxilo efectivo para formar un éster hidrolizable después de la reacción con uno o más grupos hidroxilo presentes en el compuesto El, para que después de hidrolizarse, se corten el polímero y espaciador, lo que da como resultado la liberación del fármaco El precursor.

TABLA 1 Reactivos poliméricos selectivos de amina y sus respectivos conjugados de El TABLA 1 (cont. ) Derivado de mPEG-succinimidilo TABLA 1 (con .) TABLA 1 (cont.) TABLA 1 (cont.) TABLA 1 (con .) En una modalidad preferida de la invención, se provee un conjugado que tiene la siguiente estructura, en la cual el conjugado es un profármaco de un El: H I POLY-L-Ar—O-C-N—El II o en la cual POLY es un polímero soluble en agua como el descrito en la presente invención, L es un grupo enlazador, Ar es un grupo aromático, y NH-EI tomados juntos representan un El que tiene un grupo amino. Esta estructura particular posee un enlace carbamato hidrolizable, para que el El se libere después de la hidrólisis. De preferencia, después de la hidrólisis, se libera el El precursor, junto con C02 y el alcohol aromático correspondiente. Los grupos aromáticos preferidos son fenilo sustituido en la posición orto, meta o para. Los grupos L preferidos para esta modalidad particular de la invención son -O- y -NH-C(O)-. Una modalidad particular de dicho conjugado se presenta en la tabla 1 anterior. También quedan abarcadas por lo anterior las estructuras tipo mancuerna que tienen un El u otro agente anti-VIH unido a través de un enlace idéntico al extremo terminal de POLY. Los polímeros y conjugados particulares que caen dentro de la estructura generalizada anterior se describen en la patente E.U.A. No. 6,413,507, cuyos contenidos quedan incorporados expresamente en la presente invención para referencia. Los reactivos poliméricos preferidos incluyen aquellos descritos en los ejemplos en la patente E.Ü.A. No. 6,413,507 y mostrados en la tabla 1 anterior. Para modalidades de la invención que emplean un reactivo selectivo de amino tales como aquellos descritos anteriormente, y en los cuales se desea un conjugado hidrolizable, se emplea un compuesto inhibidor de ingreso que tenga un espaciador hidrolizable unido en forma liberable al mismo, por ejemplo como se ejemplifica mediante los ejemplos 11-15. En términos generales, esta estrategia implica los siguientes pasos de síntesis 1) protección inicial de cualesquiera aminas primarias del El, es decir lisina utilizando química de grupo protector tradicional, por ejemplo BOC, 2) adición de un espaciador apropiado (por ejemplo, glicina, alanina, etc) a los grupos funcionales hidroxilo de tirosina, serina, o treonina del El a través de un enlace degradable tal como un grupo carboxi, 3) desprotección del grupo espaciador, y 4) conjugación subsiguiente con un reactivo de PEG selectivo de amina, y 5) desprotección final de las aminas primarias. En general, esta estrategia de espaciador es apropiada para modificar cualquiera de los reactivos poliméricos descritos en la presente invención, y en particular, aquellos en la tabla 1, para de esta manera impartir propiedades de liberación a los mismos, de conformidad con una modalidad preferida de la presente invención. En las siguientes secciones se describen con mayor detalle las formulaciones de gel que emplean polímeros del tipo recién descrito. Más adelante se provee una representación gráfica adicional de conjugación de un El con un PEG ligado mediante carbamato degradable particular, en el cual el reactivo de PEG contiene un anillo fenilo sustituido en la posición para. Por ejemplo, cuando El es T-20, el reactivo de PEG ilustrativo se puede copular potencialmente a uno o ambos grupos amino de lisina del péptido.

Aunque mPEG se muestra como la porción POLY, se puede utilizar cualquiera de las estructuras POLY descritas en la presente invención. En casos en los que es deseable unir en forma covalente un polímero soluble en agua a un solo grupo amino contenido dentro de un El, o cuando están presentes más de un grupo amino reactivo en el El tales como aquellos presentes en las lisinas, se puede utilizar una estrategia de protección/desprotección como es sabido comúnmente en la técnica, o de manera alternativa, se pueden emplear técnicas de separación/purificación para aislar un conjugado o tipo de conjugado deseado que resulte de una estrategia de modificación con PEG aleatoria (por ejemplo, mono-PEG-meros , di-PEG-meros, tri-PEG-meros , etc) . En una modalidad preferida de un conjugado de la invención, cuando el El es T-20 o T-1249, y el polímero soluble en agua está unido al extremo N-terminal mediante reacción con un polímero soluble en agua terminado en aldehido, dicho polímero soluble en agua carece de un grupo amido interno, e incluso de manera más específica, posee una estructura disimilar a las estructuras del tipo: PEG-O- (CH2)m-C (O) -NH- (CH2)P-CHO, en la cual, m varía desde 1 a 17 aproximadamente, n varía desde 10 hasta 1,000, y p varía desde 1 hasta 3. En casos en los cuales se prefiere el uso de un polímero terminado en aldehido, los ejemplos de polímeros son aquellos descritos en la solicitud de patente internacional mancomunada No. PCT/US03/28221 titulada, "Water-Soluble Polymer Alkanals", cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia . Las condiciones de reacción para copular PEG a un El varían en función del El, el grado deseado de modificación con PEG, y el reactivo particular que está siendo utilizado. Típicamente, la conjugación de un reactivo polimérico a un grupo amino de un El se efectúa a valores de pH de alrededor de 5 hasta 9.5 aproximadamente, de preferencia desde 8 aproximadamente hasta 9.5 aproximadamente, y a temperatura ambiente, con tiempos de reacción que varían desde 30 minutos aproximadamente hasta varias horas. Las relaciones molares preferidas de reactivo de PEG a proteína varían desde 1:1 hasta 5:1 aproximadamente, o incluso 10:1, o incluso hasta 100:1. El incremento en el pH incrementa la velocidad de reacción, mientras que la reducción del pH reduce la velocidad de reacción. Se pueden efectuar reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N-terminal) , particularmente con un polímero funcionalizado con una cetona o un aldehido ramificado con alfa-metilo y/o bajo condiciones de reacción especificas (por ejemplo, pH reducido) . Véase, por ejemplo, los ejemplos 1-3 y 6-15, que demuestran la unión de polímero tanto aleatoria como selectiva de sitio para formar los conjugados y las composiciones de EI-polímero ilustrativas de la invención.

Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como un punto de unión en el El . Desde el punto de vista estructural, el conjugado comprende lo siguiente: O II EI-C-X-POLY en la cual El y el grupo carbonilo adyacente corresponden al El que contiene carboxilo, X es un enlace, de preferencia un heteroátomo que se selecciona a partir de O, N(H), y S, y POLY es un polímero soluble en agua tal como PEG, que termina opcionalmente en una porción bloqueadora de extremo . El enlace C(0)-X es el resultado de la reacción entre un derivado polimérico que tiene un grupo funcional terminal y un El que contiene carboxilo. Como se discutió anteriormente, el enlace específico depende del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero tiene grupo funcional de extremo o está "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. Si el polímero está funcionalizado con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. Cuando se emplean ciertos polímeros de brazos múltiples, ramificados o en horquilla, la porción C(0)X, y en particular la porción X, puede ser relativamente más compleja y puede incluir una estructura de enlazamiento más larga . Los derivados solubles en agua que contienen una porción hidrazida también son útiles para conjugación en los grupos carboxilo. Dichos grupos se pueden introducir en un El mediante unión de un espaciador pequeño que contiene un grupo funcional carboxi, por ejemplo, un aminoácido, o mediante oxidación de un hidroxilo. Un ejemplo de dicho derivado incluye un polímero que tiene la siguiente estructura : Los grupos tiol contenidos o introducidos dentro del El pueden servir como sitios efectivos de unión para el polímero soluble en agua. En particular, los residuos cisteína proveen grupos tiol cuando el El es un péptido o comprende una porción peptídica. Los grupos tiol en dichos residuos cisteína se pueden hacer reaccionar después con un PEG activado que sea específico para reacción con grupos tiol, por ejemplo, un polímero de N-maleimidilo u otro derivado, como se describe en las patentes E.U.A. Nos. 5,739,208 y 6,602,498, y en la publicación de patente internacional No. WO 01/62827. Los ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente, se proveen en la siguiente tabla 2. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "S-EI" representa un El después que se conjuga al polímero soluble en agua. Aunque cada porción polimérica presentada en la tabla 2 termina en un grupo "CH3", éste puede ser sustituido por otros grupos (tales como H, etilo y bencilo) .

TABLA 2 Reactivos poliméricos específicos de tiol y sus conjugados de El respectivos TABLA 2 (cont.) TABLA 2 (cont.) Con respecto a los conjugados que se forman a partir de polímeros solubles en agua que tienen uno o más grupos funcionales maleimida (sin considerar si la maleimida reacciona o no con un grupo amino o tiol en el El) , la forma o formas de ácido maleámico correspondientes del polímero soluble en agua también pueden reaccionar con el El. Bajo ciertas condiciones (por ejemplo un pH de 7-9 aproximadamente y en presencia de agua) , el anillo de maleimida se "abre" para formar el ácido maleámico correspondiente. El ácido maleámico, a su vez, puede reaccionar con un grupo amina o tiol, por ejemplo, de un El, como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 04/060966. Los ejemplos de reacciones basadas en ácido maleámico se muestran a continuación en forma esquemática. POLY representa el polímero soluble en agua, y El representa el inhibidor de ingreso .

ESQUEMA DE REACCIÓN Incluso en otra modalidad, un conjugado representativo de conformidad con la invención posee la siguiente estructura: POLY-Lo, i-C(O) Z-Y-S-S-EI en la cual POLY es un polímero soluble en agua, L es un enlazador opcional, Z es un heteroátomo que se selecciona a partir del grupo que consiste de O, NH, y S, e Y se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo de C2-iQ, alquilo sustituido de C2-io, arilo, y arilo sustituido. Los reactivos poliméricos que se pueden hacer reaccionar con un El y que den como resultado este tipo de conjugado se describen en la solicitud co-pendiente presentada el 6 de enero de 2004, titulada "Thiol Selective Water Soluble Polymer Derivatives", y a la que se le asigna el número de serie E.Ü.A. 10/753,047, que corresponde a la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 04/063250. Con respecto a los reactivos poliméricos, aquellos descritos en la presente invención y en cualquier otra parte se pueden adquirir a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Nektar Therapeutics , Huntsville AL) . Además, los métodos para, preparar los reactivos poliméricos se describen en la literatura. Típicamente, aunque no necesariamente, el enlace entre el El y el reactivo polimérico incluye uno o más átomos tales como uno o más de carbono, nitrógeno, azufre, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los enlaces hidrolíticamente estables preferidos comprenden un grupo amida, amina secundaria, carbamato, tioéter, o disulfuro. De manera opcional, átomos adicionales pueden conectar el enlace a la cadena de monómeros repetitivos dentro del reactivo polimérico. Lo mismo es cierto para modalidades en las cuales el enlace es degradable, es decir, comprende una porción hidrolíticamente degradable. Típicamente, el enlace degradable, cuando se considera en su totalidad, contiene átomos o combinaciones de átomos adicionales que conectan la porción degradable per se al polímero y/o el El. Los ejemplos no limitativos de series específicas de átomos que conectan el El a la cadena de monómero repetitivos designados en la presente invención como POLY incluyen aquellos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de: -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(0)-0-, -C(0)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -0-C(0)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2~CH2-, -CH2 -CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2- , -O-CH2- , -CH2-0-, -0-CH2~CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2~CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C (O) -NH-CH2-, -C (O) -NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0) -NH-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH-, -C (O) -NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (0) - H-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-, -C (0) -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-, -C (O) -O-CH2-, -CH2-C (O) -O-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -O-CH2-, -C (O) -O-CH2-CH2-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-NH-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-, -NH-C (O) -CH2-CH2-, -CH2-NH-C (O) -CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-CH2-, -C (0) -NH-CH2-, -C (O) -NH-CH2-CH2-, -O-C (O) -NH-CH2-, -O-C (O) -NH-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(0)-CH2-, -C(O) -CH2-CH2-, -CH2-C (O) -CH2-, -CH2-C¾-C (O) -CH2-, -CH2-CH2-C (O) -CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-CH2-, -0-C(0) -NH-[CH2]o-6- (OCH2CH2)o-2-, ~C(0)- H-ÍCHaJi-g- H-CÍO)-, -NH-C (O) -NH- (CH2) x_6-NH-C (O) -, -O-C (O) -CH2-, -O-C (O) -CH2-CH2-, y -O-C (O) -CH2-CH2~CH2- . De manera adicional, se pueden utilizar enlazadores bifuncionales tales como aminoácidos u oligómeros de PEG dif uncionales, para conectar el El al reactivo polimérxco.

Los conjugados típicamente son parte de una composición. La composición puede contener un solo tipo de conjugado polimérico, por ejemplo, únicamente monómeros de PEG-EI (es decir, que tienen solamente una cadena de PEG unida en forma covalente al El, aunque los PEG pueden estar unidos covalentemente a posiciones diferentes dentro del El, por ejemplo, en aminoácidos diferentes dentro de la secuencia) o puede contener una pluralidad de conjugados, de preferencia aunque no necesariamente, en el que cada uno tiene desde uno aproximadamente hasta tres polímeros solubles en agua aproximadamente unidos en forma covalente a un El . Como se discutió en forma breve anteriormente, se puede lograr el control del número deseado de polímeros para cualquier El determinado seleccionando el reactivo polimérico adecuado, la relación de reactivo polimérico a El, temperatura, condiciones de pH, y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, se puede lograr la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (por ejemplo, aquellos conjugados que tienen cuatro o más polímeros unidos) mediante purificación.

Conjugados poliméricos de brazos múltiples, adicionales Previamente en la presente invención describieron polímeros de brazos múltiples para uso en la formación de conjugados que tienen EIs múltiples u otros agentes anti-VIH unidos en forma covalente a los mismos. Los polímeros de brazos múltiples son particularmente atractivos en casos en los que se requieren de dosis elevadas del El para suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva de, por ejemplo T-20 o T-1249. De esta manera, el fármaco se "carga", de preferencia en forma liberable, en una sola molécula de polímero que tiene varios sitios reactivos apropiados para unión covalente. Un tipo preferido de polímero de brazos múltiples para lograr carga máxima de El es un copolímero en bloque de brazos múltiples que tiene una región central interior definida por una molécula de núcleo central que tiene segmentos polipeptídicos unidos en forma covalente a la misma y una región hidrofílica exterior definida por segmentos poliméricos hidrofílicos unidos en forma covalente a cada uno de los segmentos poliméricos del polipéptido. Por lo tanto, cada brazo de la estructura de brazos múltiples es un copolímero en bloque que comprende un segmento de polímero polipeptídico interior (es decir más cercana o próxima a la molécula de núcleo central) y un segmento de polímero hidrofílico (es decir más alejada o distal de la molécula de núcleo central) . Dichos copolímeros en bloque de brazos múltiples son particularmente bien apropiados para la encapsulación o entrampamiento de moléculas biológicamente activas dentro de la región de núcleo interior. Tal como se utiliza en el presente contexto, "encapsulación" o "entrampamiento" pretende hacer referencia al confinamiento físico de un El dentro de la región central interior del copolímero, ya sea mediante unión covalente, interacción de cargas, complejo metal-ácido, fuerzas de van der Waals, u otra fuerza de atracción o unión. Dichos copolímeros en bloque de brazos múltiples unimoleculares típicamente tienen un peso molecular promedio en número total de aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 120,000 Da, de preferencia desde aproximadamente 10,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da, y más preferido desde aproximadamente 20,000 Da hasta aproximadamente 80,000 Da. Los segmentos de polímero hidrofílico exterior de preferencia son poli (etilenglicol) , aunque también se pueden utilizar otros segmentos de polímero hidrofílico. El uso de un segmento de polímero polipeptídico como parte de la región central interior de la estructura de brazos múltiples unimolecular provee una gran flexibilidad en el diseño y ajuste de las propiedades de suministro de fármaco de la estructura de brazos múltiples. La interacción entre un El y la región central de la estructura de brazos múltiples unimolecular puede afectar en gran manera la carga de fármaco y las características de liberación del fármaco. En la presente invención, dependiendo de la estructura de los segmentos de polímero polipeptídico, la región de núcleo interior puede ser hidrofóbica, con carga, apropiada para unión covalente a moléculas de fármaco, o cualquier combinación de las anteriores. De preferencia, la molécula de núcleo central es un residuo de una poliamina que tiene por lo menos tres extremos terminales que tienen un grupo amina. Se prefiere el uso de un núcleo de poliamina debido a que los grupos amina del núcleo reaccionan fácilmente con el grupo ácido carboxílico de un aminoácido para formar un enlace tipo amida. Sin embargo, también se pueden utilizar moléculas de núcleo que tengan otros grupos funcionales disponibles para unión a los brazos del copolímero. En modalidades que utilizan un núcleo de poliamina, el número de grupos amina dicta el número de brazos de copolímero en la estructura de brazos múltiples. De preferencia, la poliamina comprende de 3 hasta aproximadamente 25 grupos amina. En diversas modalidades, la poliamina comprende por lo menos aproximadamente 5 grupos amina, por lo menos aproximadamente 8 grupos amina, o por lo menos aproximadamente 10 grupos amina. Los polímeros de brazos múltiples que tienen estos tipos de estructuras se describen con mayor detalle en la solicitud de patente mancomunada titulada, "Multi-Arm Polypeptide Poly (ethylene Glycol) Block Copolymers as Drug Delivery Vehicles", presentada el 24 de diciembre de 2003, la cual corresponde a la publicación de solicitud de patente internacional No. WO/04060977, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. Una modalidad representativa de este aspecto de la invención se provee en el ejemplo 14.c. Las estructuras de polímero ilustrativas incluyen poli- (aspartato de bencilo)-PEG de brazos múltiples (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 brazos), poli (ácido aspártico) -PEG que tiene El múltiples unidos en forma covalente al núcleo de polipéptido de la estructura, de preferencia aunque no necesariamente a través de enlaces degradables tales como éster y carbamato hidrolizable . De manera alternativa, en lugar de estar unido covalentemente, un El puede estar atrapado dentro de la región de núcleo interior . Más adelante se provee un esquema ilustrativo que muestra el enlazamiento covalente de un grupo hidroxilo particular de un El a un polímero de brazos múltiples. El enlazamiento selectivo de un polímero en un sitio hidroxi dentro del El se logra a través de una molécula espadadora que tiene en su extremo terminal, un grupo reactivo tal como una amina. Véase por ejemplo, ejemplos 11-15.

De manera más especifica, en esta modalidad de la invención, se utiliza un grupo hidroxilo tal como un hidroxilo de tirosina en el El como un punto selectivo para unión e introducción de un enlace hidrolizable (por ejemplo, un carbonato o éster) a través de un espaciador que tiene, por ejemplo, un grupo amino reactivo en su extremo libre no copulado. Esta estrategia toma ventaja de la diferencia en reactividad entre los hidroxilos de tirosina y serina, para lograr de esta manera una reacción selectiva de sitio en un grupo hidroxilo de tirosina. Antes de la reacción en el hidroxilo de tirosina, se protegen o bloquean los grupos amino dentro del El contra copulación utilizando cualquier grupo amino-protector apropiado conocido en la técnica. El uso de t-Boc en el siguiente esquema pretende ser únicamente ilustrativo. En la siguiente modalidad, el espaciador posee en su extremo distal al El, un grupo reactivo tal como una amina, que sea apropiado para conjugación a, por ejemplo, un PEG de brazos múltiples o un sistema copolimérico basado en PEG que tenga una región hidrofóbica interior y una región hidrofilica exterior como se describió anteriormente. La protección de las otras aminas reactivas en el El permite la introducción selectiva de un sitio amino particular que se extiende desde el El, y además, esta estrategia provee un mecanismo para introducir en la molécula un enlace covalente degradable. El El modificado, que tiene un enlazador o espaciador extendido unido covalentemente al mismo, se copula después en forma covalente a un polímero soluble en agua como se describe en la presente invención. Esta estrategia difiere de aquellas previamente descritas en la presente invención en el sentido que el "enlazador" o "precursor de enlazador" se introduce primero en el El, de preferencia en un modo selectivo, para formar un intermediario de El de ejemplo (EI-O-C (O) -Z-espaciador-NH2) el cual es entonces apropiado para unión a un polímero, que puede ser lineal, ramificado, o de brazos múltiples. En esta estructura, EI-O-, representa el residuo de un grupo hidroxilo presente dentro del El. spaciador HO OH Espaciador NH2 En este punto, los derivados mono-amino del El se pueden ligar en, por ejemplo, un polímero de brazos múltiples en un modo convencional. Después de completar la conjugación, se elimina el grupo t-Boc utilizando técnicas conocidas. En la figura anterior, Z de preferencia es O, NH o CH2, y el espaciador puede ser, por ejemplo, un aminoácido o un segmento de un aminoácido o de manera alternativa un PEG oligomérico, por ejemplo, un PEG difuncional o enlazador polimérico que tenga de 1 hasta aproximadamente 20 sub-unidades monoméricas, de preferencia de 1 a 10 sub-unidades monoméricas, más preferido que tenga un número de subunidades que se selecciona a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 9. En una estrategia ligeramente diferente, cuando se desea utilizar grupos ácido carboxílico tales como aquellos contenidos en los aminoácidos ácido glutámico y ácido aspártico, se prefiere la protección de todos los grupos amino e hidroxilo reactivos. Después de la mono-conjugación del grupo -COOH con un espaciador terminado en hidroxilo para formar un éster carboxi hidrolizable, se puede lograr en una forma similar la unión covalente a un PEG de brazos múltiples o similares. El experto en la técnica puede determinar métodos de síntesis tales como estos, cuando se consideran junto con las enseñanzas de la presente descripción y el conocimiento comúnmente disponible en la técnica. Esta metodología se puede extender para preparar conjugados de brazos múltiples similares que tengan otros enlaces (por ejemplo, degradable o no degradable) .

Hidrogeles En contraste con las composiciones de El conjugado o unido en forma covalente previamente descritas, en la presente invención se proveen de manera adicional composiciones de hidrogel-EI en las cuales el El no está necesariamente unido en forma covalente al o los componentes del polímero, las cuales están presentes en forma de un gel . Dichos hidrogeles pueden estar entrelazados o no entrelazados, y de preferencia contienen un componente de PEG. En una modalidad particular, los componentes del hidrogel no están entrelazados o están ligeramente entrelazados para facilitar la liberación del El. El El puede estar presente en forma conjugada y/o no conj ugada . Un hidrogel ilustrativo posee el segmento carbamato hidrolizable, aromático descrito previamente. En particular, el hidrogel está constituido por un polímero unido a un agente de entrelazamiento a través de un enlace tipo carbamato hidrolizable. El agente de entrelazamiento en una modalidad preferida es un polímero difuncional como el descrito anteriormente que tiene la fórmula: -C-O-Ar'-L'-POLY-L- Ar-O-C-X O O en la cual POLY, POLY' , L, L' , X, X' , Ar, y Ar' son como describieron previamente. En una modalidad preferida, el agente entrelazamiento tiene la fórmula: en la cual X y L son como se describieron anteriormente. Por lo tanto, el entrelazamiento de un polímero que tiene grupos amino múltiples con el agente de entrelazamiento anterior se ilustra a continuación: en la cual la notación en zig-zag representa un polímero que tiene grupos amina y en la cual L es como se describió anteriormente.

Como es evidente, los enlaces tipo carbamato entre las porciones del polímero y el entrelazador son hidrolizables . Por lo tanto, este hidrogel gradualmente se disocia o se degrada en el cuerpo como resultado de la hidrólisis de los enlaces tipo carbamato. Otro tipo de hidrogel conveniente para preparar una composición de El para suministro sostenido posee enlaces tipo carbonato. De manera más particular, se provee un polímero no peptídico, soluble en agua, constituido por dos o más oligómeros ligados entre sí por enlaces tipo carbonato hidrolíticamente degradables, como se describe en la patente E.Ü.A. mancomunada No. 6,348,558, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. El polímero se puede degradar hidrolíticamente en oligómeros pequeños en un ambiente acuoso, por ejemplo, in vivo, y se puede utilizar para preparar hidrogeles degradables. Un polímero representativo de este tipo se representa mediante la fórmula: X-0- [ (-CH2CH2-O-) n-C02-] m- (CH2CH20) n-Y, en la cual n es un número entero de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 2,000, m es un número entero de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200, y en la cual X y Y cada uno de manera independiente es H, alquilo, alquenilo, arilo, o una porción reactiva, y pueden ser iguales o diferentes. En el caso en el cual cualquiera de X o Y (o arabos) es reactivo con un grupo funcional del El, entonces el El puede estar, opcionalmente, unido en forma covalente al mismo en otra modalidad de la invención. Incluso en otra modalidad, un hidrogel para uso en la preparación de una composición de El es un gel de tiosulfonato como el que se describe en la solicitud de patente de utilidad mancomunada titulada, "Methods for the Formation of Hydrogels Using Thiosulfonate Compositions and Uses Thereof", presentada el 31 de diciembre de 2003, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente invención para referencia. De manera más particular, de conformidad con esta modalidad de la invención, los componentes formadores de hidrogel de preferencia son derivados de polímero de tiosulfonato de brazos múltiples que forman una composición de polímero entrelazado cuando se exponen a medio básico, sin que se requiera la presencia de un segundo reactivo entrelazador, catalizador redox, o radiación. Dichos derivados de polímero de tiosulfonato también puede formar un hidrogel mediante reacción con un polímero soluble en agua que tenga por lo menos dos grupos tiol. En términos generales, dichas composiciones comprenden componentes formadores de hidrogel que corresponden a la siguiente fórmula: O II Y(-POLY-X-S-S-R)n II O en la cual POLY es un polímero soluble en agua, n varía de 3 hasta 100 aproximadamente, X es un grupo enlazador, Y es una porción que se obtiene a partir de una molécula que tiene por lo menos tres grupos nucleofílicos, y R es un grupo alquilo o arilo. Los ejemplos de grupos enlazadores se describen en cualquier otra parte en el documento. El polímero puede contener opcionalmente por lo menos un enlace degradable, por ejemplo, un éster, carbonatos acetal, ortoéster, fosfato, o tioléster. La presencia de uno o más enlaces degradables permite la degradación de las cadenas de polímero (por ejemplo, mediante hidrólisis o degradación enzimática) con la disociación y disolución concomitantes del hidrogel. En una modalidad preferida, particularmente cuando el El es T-20 o T-1249, el hidrogel o composición que contiene polímero efectivo para formar un hidrogel, es uno que no presenta propiedades de gelificación invertida, es decir, existe como un líquido por debajo de la temperatura fisiológica pero el cual forma un hidrogel a temperatura fisiológica. Como un ejemplo, dicho hidrogel o composiciones formadoras de hidrogel típicamente se elaboran a partir de polímeros diferentes a Poloxomer 407™. Las composiciones de hidrogel de la invención se pueden preparar antes del uso. Las composiciones de hidrogel formado se pueden someter opcionalmente la deshidratación o liofilización con el fin de eliminar el agua unida y se pueden utilizar ya sea como el hidrogel intacto o se pueden reducir hasta una forma en polvo o en partículas . Las composiciones de hidrogel de la invención también se pueden utilizar sin deshidratación o liofilización como objetos configurados o se pueden incorporar en sistemas de suministro que incluyen sin limitación: inserto ocular, supositorios, óvulos farmacéuticos, parches transdérmicos, o cápsulas rellenas con las composiciones de hidrogel. Sin tomar en cuenta la forma de la composición formadora de hidrogel o la composición de hidrogel, es posible empacar las composiciones en contenedores de un solo uso, de usos múltiples o a granel. Las preparaciones se pueden esterilizar opcionalmente utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. En una modalidad preferida, los materiales se empacan en contenedores de un solo uso estériles. En otras modalidades, los materiales se empacan para facilitar la reconstitución mediante adición de agua, soluciones o suspensiones acuosas en contenedores de uso individual o de usos múltiples. En otra modalidad, los materiales se venden como un estuche con una base para iniciar la formación del gel .

Purificación de conjugados Los conjugados de polimero-EI de la invención se pueden purificar para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. De manera especifica, la mezcla de producto se puede purificar para obtener un promedio de cualquiera de uno, dos, o tres, o incluso más moléculas de PEG por cada El. Se prefieren los conjugados de El que tienen una molécula de polímero unida al mismo. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción de conjugado final depende de un número de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, el El particular, el régimen de dosificación deseado, y la actividad residual y las propiedades in vivo del conjugado o conjugados individuales. Si se desea, se pueden aislar conjugados que tengan diferentes pesos moleculares utilizando cromatografía por filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía por filtración en gel se utiliza para fraccionar relaciones de polímero a El numerados en forma diferente (por ejemplo, 1-mero, 2-mero, 3-mero, etc, en la cual "l-mero" indica un polímero a'un El, "2-mero" indica dos polímeros unidos a un El, etc) con base a sus diferentes pesos moleculares (en la cual la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la porción de polímero soluble en agua) . Por ejemplo, en una reacción de ejemplo en la cual se conjuga de manera aleatoria un polipéptido de 100,000 Daltons con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de 20,000 Daltons aproximadamente, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína sin modificar (que tiene un peso molecular de 100,000 Daltons aproximadamente) , proteína mono-sustituida con PEG (que tiene un peso molecular de 120,000 Daltons aproximadamente) , proteína di-sustituida con PEG (que tiene un peso molecular 140,000 Daltons aproximadamente), etc. Aunque esta estrategia se puede utilizar para separar PEG y otros conjugados de polímero-EI que tienen pesos moleculares diferentes, esta estrategia por lo general no es efectiva para separar isómeros de posición que tienen sitios de unión a polímero diferentes dentro del El. Por ejemplo, se puede utilizar cromatografía por filtración en gel para separar una de la otra, mezclas de 1-meros, 2-meros, 3-meros, etc, de PEG, aunque cada una de las" composiciones de PEG-mero recuperada puede contener moléculas de PEG unidas a grupos amino reactivos diferentes (por ejemplo, residuos de lisina) u otros grupos funcionales del El. Las columnas para filtración en gel apropiadas para efectuar este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . La selección de una columna particular depende del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución generalmente se efectúa utilizando una solución amortiguadora apropiada, tal como la de fosfato, acetato, o similares. Las fracciones recolectadas se pueden analizar utilizando un número de métodos diferentes, por ejemplo, (i) densidad óptica (DO) a 280 nm para contenido de proteina, (ii) análisis de proteina con seroalbúmina de bovino (BSA por sus siglas en inglés) , (iii) evaluación de yodo para contenido de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), y (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE por sus siglas en inglés) , seguido por tinción con yoduro de bario . La separación de isómeros de posición se efectúa mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna C18 para cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés) (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible de Amersham Biosciences. Se puede utilizar cualquier método para separar isómeros de polimero-agente activo que tengan el mismo peso molecular (isómeros de posición) . Las composiciones purificadas resultantes de preferencia están sustancialmente libres de proteínas que no tengan actividad anti-retroviral . Además, las composiciones de preferencia están sustancialmente libres de todos los otros polímeros solubles en agua unidos en forma no covalente.

Evaluación de actividad Se puede determinar la actividad antiviral de los conjugados y composiciones de la invención utilizando un modelo in vivo o in vitro apropiado, dependiendo de la actividad conocida del El particular utilizado. Los métodos para determinar la actividad antiviral de un conjugado o composición de El de la invención incluyen pruebas de fusión celular, pruebas de infección con virus libre de células, pruebas de transcriptasa inversa, etc., todas indicadores apropiados de actividad anti-retroviral. Los métodos útiles para determinar la actividad antiviral de cualquiera de T-20 o secuencias relacionadas con T-20 descritas en la presente invención, o la actividad de un conjugado o composición de polímero correspondiente, se describen en la patente E.U.A. No. 5,464,933. De manera adicional, en el ejemplo 16 se describe una prueba in vivo apropiada para determinar la actividad antiviral. Como un patrón de referencia para comparación, la CI50 de T-1249 per se es 0.003 pg/ml; su CI90 es 0.023 g/ml. De manera adicional, T-20, cuando se administra como una dosis subcutánea individual de 90 mg (N=12) , presenta un tiempo de vida media de eliminación promedio 3.8 ± 0.6 horas y una depuración aparente promedio ± SD de 24.8 + 4.1 ml/h//kg (inserto del material de empaque de Fuzeon™. La actividad antiviral de los conjugados o composiciones de los anticuerpos monoclonales anti-CCR5 de múrido ??8, ??9, PA10, PA11, PA12, y PA 14 (PRO 140) se evalúa, por ejemplo, utilizando la prueba de unión de gpl20-sCD4 y pruebas RET (para detectar la inhibición de fusión a membrana mediada por la envoltura y el ingreso de VIH-1) descritas en Olson, W., et al., J. of Virology, Mayo de 1999, 73(5), 4145-4155, o evaluando la inhibición de replicación de VIH-1 en cultivos de PBMC o en cultivos de macrófago como se describe en Trkola, A., et al., J of Virology, 2001, 75(2), 579-588. Los conjugados y composiciones de polímero de péptidos de CCR5 sulfatados se evalúa respecto a actividad antiviral utilizando una ELISA en fase sólida para detectar la unión a péptido complejo como se describe en la publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2003/0139571. Los conjugados y composiciones poliméricas de quimeras de CD4-IgG2 se examinan respecto a actividad antiviral utilizando, por ejemplo, un método de ELISA para evaluar la afinidad de unión para gpl20 monomérica, y/o una prueba de sincitio libre de virus para examinar la inhibición de formación de sincitio mediada por la envoltura de VIH-1, y/o estudios de neutralización utilizando cepas adaptadas de laboratorio y aislados primarios de VIH-1, como se provee en la patente E.U.A. No. 6,451, 313.

Composiciones farmacéuticas De manera opcional, las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para proveer una composición farmacéutica. Los excipientes de ejemplo incluyen, sin limitación, carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tensoactivos, soluciones amortiguadoras, ácidos, bases, y combinaciones de los mismos. Los excipientes apropiados para composiciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina, aceites vegetales, fosfolípidos, y agentes tensoactivos. Puede estar presente como un excipiente un carbohidrato tal como un azúcar, un derivado de azúcar tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado, y/o un polímero de azúcar. Los excipientes tipo carbohidrato específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos , tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos , tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas , dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol) , piranosil-sorbitol, mioinositol, y similares. El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o regulador de pH tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, y combinaciones de los mismos. La composición también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o detener el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitativos de agentes antimicrobianos apropiados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y combinaciones de los mismos. También puede estar presente un antioxidante en la composición. Los antioxidantes se utilizan para evitar la oxidación, con lo cual se evita la deterioración del conjugado o de otros componentes de la preparación. Los antioxidantes apropiados para ser utilizados en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito de sodio, sulfoxilato sódico de formaldehido, metabisulfito de sodio, y combinaciones de los mismos. Puede estar presente un agente tensoactivo como un excipiente. Los agentes tensoactivos de ejemplo incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80", y plurónicos tales como F68 y F88 (de los cuales ambos se pueden conseguir a partir de BASF, Mount Olive, New Jersey) ; ésteres de sorbitán; lipidos, tales como fosfolipidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanol-aminas (aunque de preferencia no en forma liposómica) , ácidos grasos y ésteres de ácido graso; esferoides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, zinc y otros cationes apropiados. En la composición pueden estar presentes como un excipiente ácidos o bases. Los ejemplos no limitativos de ácidos que se pueden utilizar incluyen aquellos ácidos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido mélico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases apropiadas incluyen, sin limitación, bases que se seleccionan a partir del grupo que consiste de hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, cit ato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumarato de potasio, y combinaciones de los mismos. La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el El y el reactivo polimérico) en la composición varia en función de un número de factores, pero de manera óptima es una dosis terapéuticamente efectiva cuando la composición se almacena en un contenedor de dosis unitaria (por ejemplo, un frasco) . Además, la preparación farmacéutica se puede alojar en una jeringa. Se puede determinar experimentalmente una dosis terapéuticamente efectiva mediante administración repetida de cantidades cada vez mayores del conjugado o composición con el fin de determinar cuál cantidad produce un punto final clínicamente deseado. La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición puede variar dependiendo de la actividad del excipiente y de las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contengan cantidades variables del excipiente (que varían de bajas a altas), examinando la estabilidad y otros parámetros, y determinando después el intervalo en el cual se logra el desempeño óptimo sin efectos adversos significativos. Sin embargo, en términos generales, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de 1% aproximadamente hasta 99% en peso aproximadamente, de preferencia de 5% aproximadamente hasta 98% en peso aproximadamente, más preferido desde 15% aproximadamente hasta 95% en peso aproximadamente del excipiente, siendo más preferidas las concentraciones menores de 30% en peso. Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed. , Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Ed. , American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000. Las composiciones abarcan todo los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilizados que se pueden reconstituir asi como líquidos. Los ejemplos de diluyentes apropiados para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección incluyen agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, solución salina regulada con fosfatos, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada, y combinaciones de las mismas. Con respecto a composiciones farmacéuticas líquidas se contemplan soluciones y suspensiones. De preferencia, las composiciones de El descritas en la presente invención están en forma de dosificación unitaria, lo que significa una cantidad de un conjugado o composición de la invención apropiada para una sola dosis, en una forma pre-medida o pre-empacada .

Administración Las composiciones de la presente invención típicamente, aunque no necesariamente, se administran mediante inyección y por lo tanto por lo general son soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede tomar otras formas tales como jarabes, cremas, ungüentos, tabletas, polvos, y similares. También se incluyen otros modos de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, trans-mucosas, oral, intratecal, subcutánea, intra-arterial, etcétera. La invención también provee un método para administrar un conjugado como el que se provee en la presente invención a un paciente que padece de una condición que responda al tratamiento con conjugado. El método comprende administrar, por lo general mediante inyección, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (de preferencia provista como parte de una composición farmacéutica) . Como se describió previamente, los conjugados se pueden administrar inyectados por vía parenteral mediante inyección intravenosa, o de manera menos preferida mediante inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación apropiados para administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos que se combinan con un solvente antes del uso, suspensiones listas para inyección, composiciones insolubles secas que se combinan con un vehículo antes del uso, y emulsiones y concentrados líquidos que se diluyen antes de la administración, entre otros . Se puede utilizar el método de administración para tratar cualquier condición que se pueda aliviar o prevenir mediante administración de un conjugado de El. Los expertos en la técnica aprecian cuáles condiciones puede tratar de manera efectiva un conjugado específico. Por ejemplo, los conjugados se pueden utilizar para tratar individuos infectados con VIH. La dosis real que se va a administrar puede variar en función de la edad, peso, y condición general del individuo asi como de la gravedad de la condición que esta siendo tratada, el juicio del profesional para cuidado de la salud, y del conjugado que está siendo administrado. Los expertos en la técnica puede determinar las cantidades terapéuticamente efectivas y se pueden ajusfar a los requerimientos particulares de cada caso particular. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva varia desde 0.001 mg hasta 300 mg de El aproximadamente, de preferencia en dosis de 0.01 mg/dia hasta 200 mg/dos veces por dia, de preferencia en dosis de 0.01 mg/dia hasta 200 mg/dia, y de manera más preferida en dosis de 0.10 mg/dia hasta 100 mg/dia. La dosis unitaria de cualquier conjugado determinado (de nuevo, de preferencia suministrado como parte de una preparación farmacéutica) se puede administrar en una variedad de programas de dosificación que dependen de el juicio del médico, las necesidades del paciente, etcétera. El programa de dosificación especifico puede ser conocido por los expertos en la técnica o se puede determinar en forma experimental utilizando métodos de rutina. Los programas de dosificación de ejemplo incluyen, sin limitación, administración cinco veces por dia, cuatro veces por día, tres veces por día, dos veces por día, una vez por día, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquier combinación de los mismos. El conjugado y las composiciones preferidas son aquellas que requieren dosificación menos frecuente de una vez por día. Es decir, de preferencia, la composición de la invención se administra dos veces por día, una vez por día, una vez cada tercer día, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes. Son incluso más preferidos los conjugados y composiciones que se administran con una frecuencia no mayor de una vez por semana, incluso más preferido con una frecuencia no mayor de dos veces por mes (cada dos semanas) . Una ventaja de administrar ciertos conjugados de la presente invención es que se pueden cortar porciones individuales del polímero soluble en agua incluyendo el polímero completo. Dicho resultado es conveniente cuando la depuración desde el cuerpo es potencialmente un problema debido al tamaño del polímero. De manera óptima, el corte de cada porción de polímero soluble en agua se facilita mediante el uso de enlaces fisiológicamente disociables y/o enzimáticamente degradables tales como enlaces que contengan uretano, carbonato o éster. De esta manera, se puede modular la depuración del conjugado (mediante corte de porciones individuales del polímero soluble en agua) seleccionando el tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que provean las propiedades de depuración deseadas. El experto en la técnica puede determinar el tamaño molecular óptimo del polímero así como el grupo funcional disociable. Por ejemplo, se puede determinar un tamaño molecular, estructura, y/o grupo funcional disociable preferidos del polímero preparando una variedad de derivados de polímero con pesos de polímero y grupos funcionales disociables diferentes, y efectuando después pruebas in vitro o in vivo como las descritas en la presente invención para evaluar la eficacia. De manera alternativa, se pueden obtener los perfiles de depuración (por ejemplo, a través de muestreo periódico de sangre u orina) utilizando modelos in vivo apropiados . Los conjugados y composiciones de El de la invención se pueden co-administrar con uno o más agentes anti-virales o anti-retrovirales adicionales en una estrategia típicamente conocida como terapia de combinación. Otros agentes antivirales que pueden estar presentes en las composiciones de la invención, o de manera alternativa que se pueden coadministrar, incluyen DP107, rIFNa, rIFN , r!FNy, AZT, 3TC, d4T, ddl, adefovir, abacavir, mesilato de delaviridina, nevirapina, efavirenz, ribavirina, ritonavir, mesilato de nelfinavir, amprenavir, saquinavir, indinavir, ABT538, amfotericina B, y castanospermina, o cualquiera de los El descritos en la presente invención. Se debe entender que aunque la invención se ha descrito en conjunto con modalidades específicas preferidas, la descripción anterior así como los ejemplos que siguen pretenden ilustrar y no limitar el campo de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del campo de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todos los artículos, libros, patentes y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente invención quedan incorporadas para referencia en la presente invención en sus totalidades.

Abreviaturas El inhibidor de ingreso SIDA síndrome de inmunodeficiencia adquirido VIH virus de inmunodeficiencia humano NRTT inhibidor de transcriptasa inversa de tipo nucleósido PI inhibidor de proteasa NNRTI inhibidor de transcriptasa inversa de tipo no nucleósido AZT azidotimidina (también conocido como zidovudina o 3' -azido-3' -desoxitimidina) PEG polietilenglicol trt tritilo Boc t-butiloxicarbonilo PBS solución regulada con fosfato Troc 2,2, 2-tricloroetilcarbamato Teoc carbamato de 2-trimetilsililetilo TEA trietilamina DMAP 4-dimetilaminopiridina DIC 1, 3-Di-isopropilcarbodi-imida DCC diciclohexilcarbodi-imida DCM diclorometano TFA ácido tri luoroacético PTSA ácido p-toluensulfónico PEG-SCM de cuatro brazos PG Acido poliglutámico IPA Alcohol isopropílico EJEMPLOS Materiales Todos los reactivos químicos a los que se hace referencia en los ejemplos anexos se pueden conseguir comercialmente o se pueden preparar tomando como base la información disponible en la técnica. Todos los reactivos de PEG a los que se hace referencia en los ejemplos anexos se pueden conseguir a partir de Nektar, Huntsville, AL, a menos que se indique de otra manera. Todos los datos de 1H RMN se generan en un espectrómetro de RMN a 300 o 400 MHz fabricado por Bruker.

EJEMPLO 1 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil benzamida de 20 KDA (mPEG-SBC 20KDA) en una reacción en medio acuoso Reactivo polimérico mPEG-SBC Se calienta hasta temperatura ambiente mPEG-SBC 20 kDa, disponible de Nektar Therapeutics (Huntsville, Alabama) , almacenado a -20 °C bajo argón. La reacción se efectúa a temperatura ambiente. Se pesa la cantidad calculada del mPEG-SBC 20 kDa (414 mg, para obtener un exceso molar de 8 veces de mPEG-SBC 20kDa tomando como base el contenido absoluto de péptido) en un frasco de vidrio de 5 mi que contiene una barra agitadora magnética. Se agrega una alicuota de 2.0 mi de una solución 4.5 mg/ml del péptido T1249 (extremo N-terminal acetilado; extremo C-terminal modificado con un grupo amida; preparado en solución regulada con fosfato, PBS, pH 7.4) y el volumen se lleva a 4.5 mi con PBS adicional. La mezcla se agita a máxima velocidad utilizando un agitador magnético hasta que el PEG se disuelva completamente. Se reduce la velocidad de agitación a 50% y se deja que la reacción avance durante 2 1/2 horas lo que da como resultado una solución de conjugado. El pH de la solución de conjugado al final de la reacción es de 6.1 y se reduce adicionalmente hasta 5.5 con HC1 0.1 M. La solución de conjugado se analiza mediante SDS- PAGE (figura 1, carril 4) y RP-HPLC (C18) . Como se puede observar en la figura 1, la reacción en medio acuoso no se completa debido a que está presente péptido libre, material visible mono-sustituido, disustituido y tri-sustituido con PEG.

EJEMPLO 2 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil benzamida, 20 KDA en una mezcla de reacción con DMSO Se calienta carbonato de mPEG-succinimidil benzamida, 20 kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, se hasta temperatura ambiente. La reacción se efectúa a temperatura ambiente. Se utilizan tres diferentes relaciones molares (1:1, 1:2, y 1:4 de péptido :mPEG-SBC 20kDa) . Se pesan las cantidades calculadas del mPEG-SBC 20 kDa caliente (29 mg, 58 mg, y 1 16 mg para las relaciones 1:1, 1:2 y 1:4 respectivamente) en frascos de vidrio en el ejemplo 1 anterior. En cada frasco el PEG-SBC 20kDa se disuelve (mediante agitación) en 1 mi de DMSO antes de agregar una alícuota de 1 mi de una solución de 5 mg/ml de péptido T1249 también disuelto en DMSO. Se deja que la reacción continúe durante 3 horas lo que da como resultado una solución de conjugado. La solución de conjugado se analiza mediante SDS- PAGE (figura 1, carril 3, relación molar 4:1) y RP-HPLC. Como se puede observar en la figura 1, carril 3, que la reacción de conjugación llega a su terminación debido a que no está presente péptido libre remanente, y principalmente tri-PEG-meros y superiores visibles (por encima del marcador de 66.3 kDa) .

EJEMPLO 3 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil benzamida, 20 KDA en una reacción acuosa/DMSO 1:1 Se callenta hasta temperatura ambiente carbonato de mPEG-succinimidil benzamida, 20 kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. La reacción se efectúa a temperatura ambiente como se describe en el ejemplo 2 anterior, excepto que el péptido se disuelve en 1 X PBS . Para resumir los experimentos descritos en los ejemplos 1-3 anteriores, las reacciones se efectúan utilizando relaciones molares de 1:1, 2:1 y 4:1, utilizando las condiciones de reacción tanto de reacción mixta acuosa/DMSO (ejemplo 3) como la de reacción en DMSO puro (ejemplo 2); los resultados son similares para ambos métodos. Los resultados típicos se muestran en la figura 2. el rendimiento más alto del péptido mono-sustituido con PEG se obtiene con la relación 1:1 (carril 3) en la cual >50% del producto está mono-sustituido con PEG. En la figura 2 se pueden observar rastros de conjugado tetra-sustituido con PEG encima del material tri-sustituido con PEG. La figura 3 ilustra un cromatograma de HPLC para la mezcla de conjugado proveniente del ejemplo 3, relación molar 1:1. Un cálculo de las áreas bajo la curva indica un rendimiento de 51% de monoPEG-T1249, 17% de di- y triPEG-T1249 y 32% de péptido libre, antes de cualquier purificación adicional. La mezcla inyectada es una relación molar 1:1 en una reacción acuosa/DMSO y muestra una distribución de péptido y producto similar a la del carril 3 de la figura 2.

EJEMPLO 4 Análisis de mezclas de conjugado Las soluciones de conjugado preparadas en los ejemplos 1, 2 y 3 se analizan mediante SDS PAGE.

SDS-PAGE Los péptidos y conjugados se resuelven en geles de 4-12% de Novex Bis-Tris (Invitrogen) utilizando solución reguladora MES buffer. El tiempo de corrida de electroforesis es de 35 minutos. Los geles se tiñen con tinción en gel Simply Blue (Invitrogen) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. En todos los geles se utiliza el patrón de referencia de proteina MARK 12 (Invitrogen) .

EJEMPLO 5 Purificación de mezclas de conjugado PEG-EI ilustrativas Se efectúa la purificación adicional en la composición de conjugado proveniente del ejemplo 3 (reacción mixta acuosa/DMSO, relación molar 1:1).

A. Cromatografía de intercambio aniónico Las formas sustituidas con PEG de T1249 provenientes del ejemplo 3 se purifican utilizando una columna Q-HP de 5 mi (Pharmacia) . Se utilizan dos soluciones reguladoras en la purificación: la solución reguladora A es MES 20 mM, pH 6.0 y la solución reguladora es MES 20 mM, pH 6.0 y 0.5 M de NaCl . Se utiliza un purificador Akta (Pharmacia) para la purificación. Se equilibra una columna Q-HP de 5 mi (Pharmacia) en 14% de B (en todos los casos, la concentración de la solución reguladora A es 100-%B) . Se inyecta una muestra y se permite que la fracción no unida se eluya bombeando 5 volúmenes de columna de 14% de B a través de la columna. T1249 sustituido con PEG que contiene 2 o más porciones de ("con número elevado de unidades monoméricas (himers)") se eluyen de la columna incrementando el contenido de solución reguladora B hasta 17% (5 volúmenes de columna) . La forma monosustituida con PEG se eluye incrementando el contenido de solución reguladora B hasta 45% (5 volúmenes de columna) . Por último, el contenido de solución reguladora B se incrementa hasta 70% (5 volúmenes de columna) para eluir a T1249 non-sustituido con PEG. Las reacciones se recolectan y analizan mediante SDS PAGE. Un resultado de SDS PAGE de la combinación mono-sustituida con PEG se muestra en la figura 4. En el material combinado está presente un nivel bajo (<10%) de material di~y tri-sustituido con PEG. Se efectúa la purificación adicional para eliminar el resto de material di- y tri-sustituido con PEG.

B . Concentración utilizando AMICON Las fracciones cromatográficas que contiene monoPEG-T12 9 se combinan y concentran mediante filtración Amicon (membrana YM 10, 10,000 MWCO) (Millipore) .

C. Método de HPLC Se utiliza una columna Zorbax 80A Extend-Cl8 (Agilent) de 4.6 X 250 mm con un sistema HPLC Agilent 1100. La fase móvil es 0.1% de TFA en agua milli-Q y la fase móvil B es 0.1% de TFA en acetonitrilo . La columna se mantiene a una temperatura de 58 °C. La tabla de tiempo es como sigue: Tiempo, minutos % de A % de B 0 55 45 4 55 45 24 45 55 25 0 100 26 0 100 27 55 45 El método incluye un tiempo posterior de 4 minutos . Bajo las condiciones descritas, el péptido libre T1249 tiene un tiempo de retención de 4.5 ± 0.1 minutos. El PEG libre tiene un tiempo de retención de 18.0 ± 0.1 minutos. La preparación monosustituida con PEG purificada muestra dos picos principales a 19.8 y 20.6 minutos. Estos picos corresponden posiblemente a dos isómeros de posición de material monosustituido con PEG. El material di- y tri-sustituido con PEG eluye en dos picos con tiempos de retención de 21.6 y 22.6 minutos, respectivamente.

D . Degradación de T1249 monosustituido con PEG Se combina una muestra (450 µ?) de T1249 monosustituido con PEG con 1/10 del volumen (50 µ?) de 10 X PBS. El pH se incrementa hasta 7.4 y la muestra se incuba a 37 °C durante la noche. Las muestras se analizan mediante HPLC.

El análisis de HPLC confirma la hidrólisis de la mezcla de conjugado in vitro. En la figura 5 se provee una gráfica que ilustra la hidrólisis de un modelo de conjugado de péptido-SPC mono-PEG in vitro, es decir, en PBS a pH 7.4 y 37 °C. Como se puede observar a partir de la figura, a medida que el conjugado mono-PEG se hidroliza, aparece péptido libre según se determina mediante análisis de HPLC. A las 38;4 horas (es decir, 16 dias), se hidroliza aproximadamente 50% del conjugado para liberar péptido libre, lo que demuestra un perfil de liberación sostenida representativo de los conjugados suministrados en la presente invención. En los ejemplos ilustrativos anteriores, parece ser que únicamente 3 de las 4 Usinas están fácilmente disponibles para sustitución con PEG -las reacciones con relación 4:1 ya sea en reacciones con DMSO sólo o mixtas (acuosa/DMSO) producen principalmente material tri-sustituido con PEG cuando se llevan hasta terminación, aunque se observan rastros de material tetra-sustituido con PEG. Dos lisinas (Lys 28 y 31) en T-1249 están separadas solamente por 2 aminoácidos, y la sustitución con PEG en cualquiera de éstas puede afectar potencialmente la sustitución con PEG en el otro sitio, por ejemplo, debido a impedimento esférico. En el método de purificación por intercambio aniónico utilizado, se combinan en forma deliberada en uno solo por lo menos tres picos monosustituidos con PEG. Estos picos individuales representan isómeros de posición, los cuales se pueden purificar y caracterizar adicionalmente utilizando mapeo de péptido si se desea.

EJEMPLO 6 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil benzamida 30 KDA (MPEG-SBC 30KDA) T-1249 se sustituye con PEG como se describe en los ejemplos 1-3 anteriores utilizando varios sistemas de solvente (acuoso, DMSO, DMSO acuoso) , excepto que el reactivo de PEG utilizado tiene un peso molecular de 30 kDa. La mezcla de conjugado resultante se analiza y se purifica adicionalmente como se describe en los ejemplos 4 y 5 anteriores.

EJEMPLO 7 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil benzamida 40 KDA (MPEG- SBC 40KDA) T-1249 se sustituye con PEG como se describe en los ejemplos 1-3 anteriores utilizando varios sistemas de solvente (acuoso, DMSO, DMSO acuoso) , excepto que el reactivo de PEG utilizado tiene un peso molecular de 40 kDa . La mezcla de conjugado resultante se analiza y se purifica adicionalmente como se describe en los ejemplos 4 y 5 anteriores.

EJEMPLO 8 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil fenilo 20 KDA (MPEG- SPC 20KDA) en una reacción en medio acuoso O -(OCH2CH2)n-0 O-C-O— N + EI(T-1249) O Reactivo polimérico "SPC" Se calienta hasta temperatura ambiente mPEG-SPC 20 kDa, disponible de Nektar Therapeutics (Huntsville, Alabama) , almacenado a -20 °C bajo argón. La reacción se efectúa a temperatura ambiente. Se utiliza un exceso molar absoluto de 8 veces de reactivo mPEG-SPC, tomando como base el contenido absoluto de péptido) . El reactivo de PEG se pesa en un frasco de vidrio de 5 mi que contiene una barra agitadora magnética. Se agrega una alícuota de 2.0 mi de una solución 4.5 mg/ml del péptido T1249 (extremo N- terminal acetilado; extremo C-terminal modificado con un grupo amida; preparado en solución regulada con fosfato, PBS, pH 7.4) y el volumen se lleva a 4.5 mi con PBS adicional. La mezcla se agita a máxima velocidad utilizando un agitador magnético hasta que el PEG se disuelve completamente. Se reduce la velocidad de agitación hasta 50% y se deja que la reacción proceda durante aproximadamente 2 1/2 hasta 3 horas lo que da como resultado la formación del producto conjugado. Se mide el pH de la solución de conjugado al final de la reacción y se acidula adicionalmente mediante adición de HCl 0.1 M si fuera necesario para llevar el pH de la solución final hasta 5.5 aproximadamente. La solución de conjugado se analiza después mediante SDS-PAGE y RP-HPLC (C18) para determinar el grado de reacción (es decir, si la reacción se completa o no) . Se efectúan reacciones adicionales, las cuales efectúan como se describió anteriormente, con (i) mPEG-SPC 30 kDa, y (ii) mPEG-SPC 40 kDa, disponibles de Nektar Therapeutics, Huntsville, Alabama.

EJEMPLO 9 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG-succinimidil fenilo 20 KDA (MPEG- SPC 20KDA) en una mezcla de reacción con DMSO Se calienta hasta temperatura ambiente carbonato de mPEG-succinimidil fenilo, 20 kDa, almacenado a -20 °C bajo argón. La reacción se efectúa a temperatura ambiente. Se utilizan tres diferentes relaciones molares (1:1, 1:2, y 1:4 de péptido: mPEG-SPC 20kDa) . Las cantidades calculadas correspondientes del mPEG-SPC 20 kDa caliente (para las relaciones 1:1, 1:2 y 1:4 respectivamente) se pesan en frascos de vidrio como en el ejemplo 7 anterior. En cada frasco el PEG-SPC 20kDa se disuelve (mediante agitación) en 1 mi de DMSO antes de agregar una alícuota de 1 mi de una solución 5 mg/ml de péptido de T1249 también disuelta en DMSO. Se deja que la reacción continúe durante aproximadamente 3-5 horas lo que da como resultado una solución de conjugado. La solución de conjugado resultante para cada reacción se analiza después mediante SDS-PAGE y RP-HPLC para determinar el grado de reacción.

EJEMPLO 10 Modificación con PEG de T1249 con carbonato de mPEG- succinimidil fenilo, 20 KDA en una reacción 1:1 en medio acuoso/DMSO Se calienta hasta temperatura ambiente carbonato de mPEG-succinimidil fenilo, 20 kDa, almacenado a -20°C bajo argón. La reacción se efectúa a temperatura ambiente como se describe en el ejemplo 9 anterior, excepto que el péptido se disuelve en 1 X PBS. El análisis, purificación e hidrólisis adicional de las composiciones de producto provenientes de los ejemplos 8-10 se efectúa como se describe en los ejemplos 4 y 5 anteriores. Los ejemplos 11-15 se refieren al siguiente esquema de reacción generalizado. En esta estrategia se introduce una enlace degradable en la estructura de conjugado final mediante unión de un enlazador, en este caso, un aminoácido de ejemplo, glicina, unida al fármaco peptidico a través de un enlace tipo éster degradable. Los siguientes ejemplos describen los pasos de síntesis APRA producir los conjugados de inhibidor de ingreso de conformidad con este aspecto de la invención.

ESQUEMA DE REACCION ILUSTRATIVO El esquema de reacción anterior, especifico para T-1249, se puede aplicar a otros inhibidores de ingreso como los descritos en la presente invención, de modo tal que la designación "T-1249" en el esquema de reacción anterior se puede reemplazar por el término generalizado ??", inhibidor de ingreso.

EJEMPLO 11 Protección inicial de los grupos amino primarios de T-1249 Ns-Troc-T-1249 ? una solución agitada del péptido, T-1249, en agua (30 ml/g de fármaco peptidico) y tetrahidrofurano (THF, 12 ml/g de péptido) se agrega trietilamina (TEA, 20 eq.) y carbonato de 2 , 2 , 2-tricloroetilsuccinimidilo (Troc-OSu, 20 eq. ) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. Después que la solución se acidula con ácido clorhídrico (HCl) hasta pH 4-6, el solvente se elimina a presión reducida, y la capa acuosa se liofiliza hasta sequedad. El residuo se precipita después con éter dietilico (300 ml/g de péptido). El éter se decanta después de centrifugar el péptido durante 5 minutos a 12,000 rpm y el precipitado se lava con éter dietilico frió (2 x 100 ml/g de péptido) . De manera alternativa, el producto se recolecta mediante filtración por succión y se lava con éter dietilico frió (2 x 100 ml/g de péptido) . La purificación adicional se efectúa según se requiera tomando como base el análisis inicial, por ejemplo, mediante HPLKC preparativa. El producto de fármaco Ns-Troc-T-1249 se seca al vacio durante la noche. La caracterización mediante espectrometría de masas (MS) y la pureza de determinan mediante HPLC.

Ns-Teoc-T-1249 La protección de los grupos amina se efectúan como se describió anteriormente para Ns-Troc-T-1249 excepto que se utiliza un grupo protector diferente, l-[(2-trimetilsilil) etoxicarboniloxi] pirrolidin-2 , 5-diona (Teoc-OSu) .

EJEMPLO 12 Adición de un espaciador tipo aminoácido protegido a T-1249 amino-protegido De entre los tres grupos hidroxilo diferentes (serina, treonina, y tirosina) presentes en la estructura base de T-1249, se espera que el grupo hidroxilo primario de serina presente la reactividad más alta, aunque se pueden ajusfar las condiciones de reacción para favorecer la sustitución en los otros sitios antes mencionados.

Na-Boc-Gly-NE-Troc-T-1249 Se disuelve Ne-Troc-T-1249 en diclorometano (DC , 35 ml/g de péptido) y se agrega una pequeña cantidad de sulfóxido de dimetilo (DMSO, <3 ml/g de péptido) para incrementar la solubilidad del péptido. Se agregan Na-ter-butoxicarbonilglicina (Na-Boc~glicina-OH, 1.2 eq. ) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 1.2 eq. ) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se agrega 1 , 3-Di-isopropilcarbodi-imida (DIC, 2 eq.) y se deja que la reacción continúe a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. La solución de DCM se concentra a presión reducida y el residuo se precipita utilizando éter dietilico que se enfria en un baño de hielo (300 ml/g de péptido) . La fase orgánica se decanta después de centrifugar el péptido durante 5 minutos a 12,000 rpm y el precipitado se lava con éter dietilico frió (2 x 80 ml/g de péptido) . Como alternativa a la centrifugación, el producto se recolecta mediante filtración por succión y se lava con éter dietilico frió (2 x 100 ml/g de fármaco) , seguido por purificación adicional opcional mediante HPLC preparativa, según se justifica tomando como base el análisis del producto. El producto peptidico Na-Boc-Gly-NE-Troc-T-1249 se seca al vacio durante la noche. La caracterización se efectúa mediante espectrometría de masas (MS) , mientras que la pureza del producto se determina mediante HPLC.

EJEMPLO 13 Desprotección del espaciador en Na-Boc-Gly-Ne-Troc-T-1249 A. Gly-NE-Troc-T-1249 Se disuelve Na-Boc-Gly-N6-Troc-T-1249 en DCM (30 ml/g de péptido) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de péptido) para incrementar la solubilidad del péptido. Se agrega ácido trifluoroacético anhidro (TFA, 4 ml/g de péptido) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Los solventes TFA/DCM se eliminan a presión reducida y el residuo se lava con éter dietilico (2 x 80 ml/g de péptido) y se evapora hasta sequedad cada vez antes que se precipite en éter dietilico (300 ml/g de péptido) . La fase orgánica se decanta después de centrifugar el péptido durante 5 minutos a 12,000 rpm y el precipitado se lava con éter dietilico frió (2 x 100 ml/g de péptido) . Como alternativa a la centrifugación, el producto se recolecta mediante filtración por succión y se lava con éter dietilico frió (2 x 100 ml/g de péptido) . Se puede efectuar la purificación adicional, por ejemplo, mediante HPLC preparativa, si fuera necesario. El producto sal TFA de Gly-Ns-Troc-T-1249 se seca al vacio durante la noche. La caracterización se efectúa mediante espectrometría de masas (MS) y la pureza se determina mediante HPLC.

B. Gly~Ns-Troc-T-1249 Se disuelve Na~Boc-Gly-Ns-Troc-T-1249 en una mezcla de THF (40 ml/g) y DMSO (5 ml/g de péptido) . Se agregan una solución de ácido p-toluensulfónico (PTSA, 1.0 eq.) en etanol (6 ml/g de fármaco). La solución se coloca en un evaporador giratorio y se elimina la mezcla de solventes. La temperatura del baño se incrementa hasta 60- 65°C y la temperatura se mantiene durante 20 minutos adicionales. Después que se enfría hasta temperatura ambiente, el residuo se precipita con éter dietílico (300 ml/g de fármaco) . La fase orgánica se decanta después de centrifugar el péptido durante 5 minutos a 12,000 rpm y el precipitado se lava con éter dietílico frío (2 x 100 ml/g de fármaco) . Como alternativa a la centrifugación, el producto se recolecta mediante filtración por succión y se lava con éter dietílico frío (2 x 100 ml/g de fármaco) . La purificación adicional se efectúa opcionalmente, por ejemplo, mediante HPLC preparativa. El producto, sal PTSA de Gly-Ne-Troc-T-1249, se seca al vacío durante la noche. La caracterización se efectúa mediante espectrometría de masas (MS) y la pureza se determina mediante HPLC.

EJEMPLO 14 Unión covalente de Gly-Ne-Troc-T-1249 a los reactivos PEG de ejemplo para proveer conjugados de PEG-T-1249 degradables a.l) Conjugado de PEG lineal (CH30-CH2CH20) 2okD-CH2C (0) -NH-Gly-NE-Troc-T-1249, en el cual "NH-Gly"-indica la unión covalente al grupo amino de glicina) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de D SO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq.) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregan PEG20kD-SCM (1 eq. ) , CH30- (CH2CH20) 20kD-CH2C (0) -succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietilico (300 ml/g de fármaco) . El producto deseado, abreviado como PEG2okD-Gly-Ns-Troc-T~1249 (en el cual la estructura real se mostró anteriormente) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacio durante la noche. a.2) Conjugado de PEG lineal (CH30- (CH2CH20) 3okD~ CH2C (O) -NH-Gly-Ns-Troc-T-1249) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq.) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos . Se agrega PEG30kD-SCM (1 eq.), CH30- (CH2CH20) 30kD-CH2C (O) -0-succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietílico (300 ml/g de fármaco) . El producto deseado, abreviado como PEG3okD-Gly-Ns-Troc-T-1249 (en el cual la estructura real se mostró anteriormente) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacio durante la noche. a.3. Conjugado de PEG lineal, CH30- (CH2CH20) 30kD-CH2CH2-C (O) -NH-Gly-Ns-Troc-T-1249) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq. ) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregan PEG30kD~SPA (1 eq. ) , propionato de PEG- succinimidilo, CH30- (CH2CH20) 3okD_CH2CH2C (0) -O-succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietilico (300 ml/g de fármaco). El producto, CH30- (CH2CH20) 3okD-CH2CH2-C (0) -NH-Gly-NE-Troc-T-1249) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacio durante la noche. a.4.. Conjugado de PEG lineal, CH30- (CH2CH20) 2okD-CH2CH2-C (0) -NH-Gly-N8-Troc-T-1249) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq. ) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregan PEG20kD_SPA (1 eq.-) , propionato de PEG-succinimidilo, CH30- (CH2CH20) 2okD~CH2CH2C (0) -O-succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietilico (300 ml/g de fármaco). El producto, CH30- (CH2CH20) 20kD-CH2CH2-C (0) -NH-Gly- N6-Troc-T-1249 ) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacio durante la noche. a.5. Conjugado de PEG lineal, CH30- (CH2CH20) 30JcD-CH2CH2 -CH2-C (0) ~NH-Gly-Ne-Troc-T-1249) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq. ) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregan PEG30kD-SBA (1 eq. ) , butanoato de PEG-succinimidilo, CH3O- (CH2CH20) 30kD-CH2CH2CH2C (0) -O-succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietílico (300 ml/g de fármaco). El producto, CH30- (CH2CH20) 3okD-CH2CH2CH2~C (0) -NH-Gly-NE-Troc-T-1249) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacío durante la noche. a.6. Conjugado de PEG lineal, CH30- (CH2CH20) 30kD-CH2CH2-CH (CH3) -C (0) -NH-Gly-NE-Troc-T-1249) Se disuelve la sal de Gly-Ns-Troc-T-1249 proveniente del ejemplo 13 anterior en DCM (30 ml/g de fármaco) y se agrega una pequeña cantidad de DMSO (<3 ml/g de fármaco) para incrementar la solubilidad del fármaco. Se agrega trietilamina (TEA, 10 eq. ) y la solución de reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. mPEG30kD~ SMB (1 eq. ) , a-metilbutanoato de mPEG-succinimidilo, CH30- (CH2CH20) 3okD-CH2CH2CH (CH3) C (O) -O-succinimida) en DCM (10 ml/g de fármaco) y la reacción se deja avanzar a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El solvente se elimina a presión reducida y el residuo se precipita mediante adición de éter dietilico (300 ml/g de fármaco). El producto, CH30- (CH2CH20) 3okD-CH2CH2CH (CH3) -C (O) -NH-Gly-Ns-Troc-T-1249) , se recolecta después de filtración por succión y se seca al vacio durante la noche. b) PEG de brazos múltiples (PEG2Qk-Gly-N8-Troc-T- 1249 de 4 brazos) Se disuelve PEG20k-SCM de 4 brazos (véase estructura en la sección de abreviaturas anterior) en cloruro de metileno anhidro. En un matraz de fondo redondo separado, se disuelve la sal de Gly-N8-Troc-T-1249 (1.0 equiv) en DCM y se trata con TEA, se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después se agrega la solución de T-1249 a la solución de PEG2ok_SCM de 4 brazos en cloruro de metileno y la reacción se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 horas. El producto, PEG2ok_Gly-Ns-Troc-T-1249 de 4 brazos, se precipita en éter dietilico y se recolecta mediante filtración por succión. La pureza y grado de carga de fármaco peptidico se determina mediante análisis de HPLC. c) "Enlace central" (enlace central-Gly-Ne-Troc-T-1249) El término "enlace central" corresponde a la estructura siguiente, un sistema de polímero PEG-PGA-PEG de 4 brazos como se describe en la publicación de patente internacional No. O 04/060967, también conocido en la presente invención como PEG2K-PG-PEG10k de 4 brazos (PM ca. 47k) . 1. Síntesis de PEG-NH2 de 4 brazos Se somete a destilación azeotrópica PEG de 4 brazos (20 g, P = 2,000 Da) (Nektar Therapeutics , Huntsville Alabama) en tolueno (100 mi) hasta que se obtiene una consistencia oleosa. El aceite crudo se disuelve en tolueno (100 mi) junto con trietilamina (12.9 mi) y se agita durante cinco minutos. Después se agrega a la solución cloruro de metansulfonilo (6.5 mi) y la solución resultante se agita durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de la adición de etanol, el solvente se elimina mediante evaporación giratoria y el PEG-mesilato se seca durante la noche. Se disuelve cloruro de amonio (6 gramos por cada gramo de PEG) en hidróxido de amonio (40 mi por cada gramo de PEG) , al cual se agrega el mesilato de PEG y la solución resultante se agita a temperatura ambiente durante 48 horas. A la solución se agrega cloruro de sodio (solución al 10%) , seguido por extracción con diclorometano . Se elimina el solvente y el PEG-NH2 de 4 brazos se seca al vacio. El rendimiento de producto es de aproximadamente 85-90 por ciento. 2. Síntesis de Glu-NCA (BLG-NCA) Se disuelve L-glutamato de bencilo, BLG (1.0 equiv.) en tetrahidrofurano (10 ml/g) junto con trifosgeno (1.2 equiv.). La solución se agita durante 3 horas a 60°C.

Después se agregan hexanos a la solución para precipitar el sólido, el cual se filtra después. El material precipitado recuperado se disuelve en cloroformo y se precipita una vez más como hexanos. El precipitado se filtra después y se seca al vacio. Rendimiento: 90% de rendimiento. 3. Síntesis de PEG-PBLG Se somete a destilación azeotrópica PEG2K-NH2 de 4 brazos (700 mg) en tolueno (50 mi) dos veces y después se seca al vacío durante la noche. Se disuelve PEG2K-NH2 de 4 brazos (700 mg) en dimetilformamida (7 mi) . Después se agrega BLG-NCA (3.68 g) proveniente del paso anterior a la solución. La solución se agita durante 3 horas bajo nitrógeno. Después se retira una muestra de la solución y se precipita. El producto se caracteriza a través de métodos D y RMN mixtos para asegurar la formación del núcleo, seguido por sustitución con PEG del polímero con un reactivo de PEG activado, PEG-SCM, CH30- (CH2CH20) i0kD-CH2C (O) -O-succinimida. Se disuelve m-PEG10K-SCM (14 g) en diclorometano, que contiene adicionalmente diciclohexil-carbodi-imida (335 mg) y 4- (dimetilamino) -piridina (20 mg) , a la cual se agrega la solución de BLG-NCA proveniente del paso anterior. La solución resultante se agita durante la noche a temperatura ambiente. 4. Eliminación del bencilo a partir de PEG-PBLG para formar "enlace central", PEG2K-PG-PEGi0k de 4 brazos (PM ca. 47k) Se disuelve PEG-PBLG (16 g) en ácido acético (16 mi) , agua desionizada (16 mi) , y dimetilformamida (80 mi) . A esta solución se añade formiato de amonio (16 gramos) y paladio/carbono (1.6 gramos). La solución se agita a temperatura ambiente durante 48 horas, seguido por filtración sobre un lecho de celita para eliminar la mayoría de las partículas de carbón. La solución se somete después a diálisis en agua para eliminar el solvente de la solución. Después de ultra-filtración con un filtro de PM 30, 000, se remueve de la solución el PEG no unido. La solución se centrifuga después a 20,000 rpm durante 3 horas para remover el remanente de las partículas de carbón. El rendimiento de producto está entre 45 y 55 por ciento. 5. Enlace central-Gly-Ne-Troc-T~12 9 Se disuelve PEG2K-PG-PEGiok de 4 brazos (PM ca. 47k) én DMF, a la cual se agregan N-hidroxisuccimida y DCC a temperatura ambiente. La reacción se agita durante la noche. Se disuelve la sal de Gly-NE~Troc-T-1249 en DMF y se trata con TEA, después se agrega a la solución de reactivo de PEG de brazos múltiples ("enlace central") . La reacción se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 36 horas y después se precipita en éter dietilico. El producto sólido resultante se recolecta mediante filtración por succión. La pureza y grado de carga del fármaco se determina mediante análisis de HPLC.

EJEMPLO 15 Desprotección final de conjugados de Gly-Ne-Troc-T-1249-PEG degradables Para cada uno de los conjugados en el ejemplo 14 (a.l a a.6 hasta c anteriores): Se disuelve el PEGn-Gly-Ns-Troc-T-1249 correspondiente en una mezcla de ácido acético-agua-tetrahidrofurano (3:1:1) a temperatura ambiente y se agita durante 24 horas. El solvente orgánico se elimina a presión reducida y el agua se elimina mediante liofilización seguido el residuo resultante se precipita primero en éter dietilico y se purifica posteriormente con metanol (10 ml/g de fármaco) e IPA (30 ml/g de fármaco) . La pureza y las velocidades de hidrólisis se determinan mediante análisis de HPLC. Para cada uno de los conjugados en el ejemplo 14 (a.l a a.6 hasta c anteriores): Se disuelve PEGn~Gly-NE-Teoc-T-1249 en una mezcla de THF (30 ml/g de fármaco) y dihidrogenofosfato de potasio (1.0 M, 30 mi) . Se agrega polvo de zinc nuevo (60 eq. ) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 horas antes que ésta se diluya con agua (100 ml/g de fármaco) . Los sólidos de Zn se filtran y se lavan con THF. El solvente orgánico se elimina a presión reducida y la fase acuosa se extrae con DCM (3 x 25 ml/g) . Las fases orgánicas combinadas se lavan con NaOH al 5% helada (20 mi) y salmuera (20 mi) , se seca con MgS04, y el solvente se elimina a presión reducida. El residuo resultante se precipita primero en éter; la purificación adicional se efectúa en metanol (10 ml/g de fármaco) e IPA (30 ml/g de fármaco) . La pureza y las velocidades de hidrólisis se determinan mediante análisis de HPLC.

EJEMPLO 16 Prueba in vitro para evaluar la actividad anti iral Se utiliza pruebas que califican respecto a la reducción de titulo de virus infeccioso que utilizan las lineas de célula indicadoras, MAGI (Activación Multi-nuclear de un Indicador de Galactosidasa) , o el derivado que expresa a CCR5, cMAGI, para proveer una indicación de actividad antiviral de los conjugados/composiciones de la invención. La linea celular MAGI se obtiene a partir de células HeLa progenitoras introduciendo genes para CD4 y un reportero ß-gal controlado por LTR de VIH-1 con un vector de retrovirus anfotrópico (como se describe en Kimpton J, Emerman M, J Virol 66: 2232-9,1992). La linea celular cMAGI se obtiene a partir de la linea celular MAGI mediante introducción del gen para CCR5 utilizando el vector retroviral anfotrópico, PA317 (como se describe en Chackerian B, et al., J Virol 71:3932-9,1997). Las células cMAGI sopórtanla replicación de aislados NSI(R5) primarios y virus X4 adaptados a laboratorio, mientras que las células MAGI soportan únicamente la replicación de virus X4. Ambas lineas celulares aprovechan la capacidad de tat de VIH-1 para trans-activar la expresión de un gen reportero de ß-galactosidasa controlado por VIH-LTR. El reportero ß-gal se modifica para que se ubique en el núcleo y se pueda detectar con el substrato X-gal como una tinción nuclear intensa dentro de unos cuantos dias de la infección. El número de núcleos teñidos se interpreta como igual al número de viriones infecciosos en el inoculo para desafio si únicamente existe una ronda de infección antes de la tinción. Se agrega un inhibidor de infección y fusión célula-célula, por ejemplo, T-1249 o T-20 (Wild C, et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 9:1051-3,1993), u otro El como los descritos en la presente invención, 24 horas después de la infección para permitir una lectura que represente una sola ronda de infección. Las células infectadas se enumeran utilizando un formador de imagen CCD. En las pruebas con MAGI y cMAGI, una reducción del 50% en el titulo infeccioso (Vn/N0= 0.5) es significativa y provee el valor de corte primario para evaluar la actividad antiviral. Se utiliza una reducción del 90% en el titulo infeccioso (Vn/N0) como un valor de corte adicional en la evaluación de la actividad antiviral. Cada dilución del compuesto de prueba se analiza por duplicado contra un inoculo de virus ajustado para rendir aproximadamente 1500-2000 células infectadas/cavidad de una placa de micro-titulación de 48 cavidades. El compuesto de prueba se agrega a las células cMAGI o MAGI, seguido por los inóculos virales, y 24 horas más tarde, se agrega un inhibidor conocido de infección y fusión célula-célula (Wild C, et al. AIDS Res Husn Retrovíruses 9:1051-3,1993) para evitar rondas secundarias de infección y diseminación viral célula-célula. Las células se cultivan típicamente en durante 2 días más, se fijan y tiñen con el substrato X-gal para detectar células infectadas . Después se determina el número de células infectadas para cada dilución de control y el compuesto de prueba utilizando el formador de imagen CCD, y después se determinan los valores de CI5o y CI90 y se comparan con, por ejemplo, el inhibidor de ingreso per se, carente del polímero. Los valores típicamente se reportan en pg/ml. CI50 se define como la dilución de un compuesto de prueba que da como resultado un 50% de reducción en un título de virus infeccioso, y CI90 se define como la dilución que da como resultado un 90% de reducción en el título infeccioso.

EJEMPLO 17 Fa-rmacocinética 9 ratas Wistar de género masculino (Charles River Laboratories, Wilmington, Del. ) (n = 3/punto de tiempo) reciben una dosis individual por vía subcutánea de un conjugado/composición de polímero de cualquiera de T1249 o T-20 como los descritos en la presente invención, por ejemplo, en los ejemplos 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, y 11-15. El conjugado de mPEG de prueba se mezcla con solución salina normal o inyección al 5% de dextrosa. Los ajustes de pH se efectúan con soluciones de NaOH o HC1 diluidas para preparar soluciones de fármaco con valores de pH que varían desde 6.2 a 7.4 aproximadamente y osmolalidad de 290 mOsm/kg aproximadamente. La cantidad de conjugado utilizada es suficiente para proveer una concentración de aproximadamente 50-250 mg de conjugado por mi en la formulación final. Las ratas se dosifican a 8 mg de ingrediente activo/kg de peso corporal. Después de la administración de la dosis, se recolectan aproximadamente 0.2 a 0.5 mi de sangre a partir del seno retro-orbital en cada punto de tiempo. Los puntos de tiempo son 0.5, 1, 3, 6, 8, 16, 24, 32, 48, 72, 96, y 120 horas después de la administración de la dosis. Cada muestra se procese inmediatamente para recolectar plasma un suero y se almacenan a -70 C hasta el análisis. Cada muestra se analiza mediante cromatografía líquida utilizando métodos de fase inversa que permiten que se puedan detectar los analitos y metabolitos principales mediante detección de absorbancia (280 nm) o mediante espectrometría de masas (cuadrupolo individual o triple) . Las concentraciones se extrapolan a partir de una gráfica utilizando extractos de suero sembrados con conjugado y El per se como patrones de calibración. Después se obtienen los parámetros farmacocinéticos a partir de los perfiles de concentración contra tiempo utilizando la concentración en suero combinada de conjugado, El liberado, metabolitos detectables, y combinaciones de los mismos. Los parámetros del análisis farmacocinéticos se reportan a partir de análisis no compartimental utilizando un paquete de software para análisis farmacocinético comercial, tal como WIN-NONLIN disponible de Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. - Un conjugado que comprende un inhibidor de ingreso unido covalentemente a un polímero soluble en agua mediante un enlace degradable. 2. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho enlace degradable se puede hidrolizar. 3.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho enlace hidrolizable comprende una porción que se selecciona a partir del grupo que consiste de éster carboxilato, éster fosfato, carbamato, anhídrido, acetal, cetal, éter aciloxialquílico, imina, ortoéster, tioéster, tioléster, y carbonato . 4.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha porción se selecciona a partir del grupo que consiste de carbamato hidrolizable, éster y carbonato. 5.- El conjugado de conformidad reivindicación 1, que comprende la estructura: i en la cual POLY es un polímero soluble en agua, LD es un enlace degradable, El es un inhibidor de ingreso, y k corresponde al número de sitios reactivos en el El a los cuales se une en forma covalente un segmento de polímero independiente (POLY-LD) 6. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el valor de k varía de 1 a 8. 7. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el valor de k se selecciona a partir del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5 , y 6. 8. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque k se selecciona a partir del grupo que consiste de 1, 2, 3, y 4. 9. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque LD comprende una porción que se selecciona a partir del grupo que consiste de éster carboxilato, éster fosfato, carbamato, anhídrido, acetal, cetal, éter aciloxialquílico, imina, ortoéster, tioéster, tioléster, y carbonato. 10. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque POLY se selecciona a partir del grupo que consiste de un poli (óxido de 5 alquileno) , poli (vinilpirrolidonas) , poli (alcohol vinilico) , polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) . 11. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque POLY es ¦ un poli (óxido de alquileno) . 10 12.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el poli (óxido de alquileno) es un poli (etilenglicol) . 13. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el 15 poli (etilenglicol) está bloqueado en sus extremos s_. terminales con una porción bloqueadora de extremo que se selecciona a partir del grupo que consiste de hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi 20 sustituido. 14. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 13, . caracterizado porque el poli (etilenglicol) está bloqueado sus extremos terminales con metoxi . 25 15.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular en el intervalo que se selecciona a partir del grupo que consiste de: desde aproximadamente 500 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons, desde aproximadamente 2,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons, desde aproximadamente 5,000 Daltons hasta aproximadamente 60,000 Daltons, desde aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 50,000 Daltons, y desde aproximadamente 15,000 Daltons hasta aproximadamente 40,000 Daltons. 16.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque POLY posee una arquitectura que se selecciona a partir del grupo que consiste de lineal, ramificado y en horquilla. 17.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho El se selecciona a partir del grupo que consiste de T-20, T-1249, PRO 542 (también conocido como CD4-IgG2) , PRO-140, PRO-367, SCH-417690, TXN-355, ÜK-427, ÜK-857, GSK-873, GSK-140, PA9, PA10, PA11, y PA12. 18.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el El se selecciona a partir del grupo que consiste de T-20, T-1249, PRO 542, y PRO-140. 19.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el sitio reactivo del El al cual se une el segmento de polímero se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, un grupo amino, un grupo hidroxilo, y un tiol. 20. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el sitio reactivo del El al cual se une el segmento de polímero es cualquiera de un amino o un hidroxilo. 21. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el LD posee una longitud que se selecciona a partir del grupo que consiste de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 átomos, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 15 átomos, y desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 átomos. 22. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, que comprende una estructura que se selecciona a partir de O POLY—L—Ar—O—C—NH-|-EI k II O POLY—NH—P—Z—C—O--EI k III en las cuales L es cualquiera de -O- o -NH-C(O), Ar es un grupo aromático, -NH- en la estructura II es un residuo amino proveniente del El, P es un espaciador, Z es -0-, -NH-, o -CH2- y 0 en la estructura III es un residuo hidroxilo proveniente del El . 23.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque en la estructura III, P, cuando se toma junto con -NH-P-Z-C (0) -, es el residuo de un aminoácido presente o no presente en la naturaleza . 24.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque Ar es un fenilo sustituido en la posición orto, meta, o para. 25. - El conjugado de la estructura III, caracterizado porque "P0LY-NH-" se selecciona a partir del grupo que consiste de los polímeros 1-1 a 1-40 en la tabla 1, carentes de la porción El. 26. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 22, que corresponde a la estructura: CH30—(CH2CH20)nCH2CH2 IV O en las cuales n varia desde 2 hasta 3400 aproximadamente 27. El conjugado de conformidad con reivindicación 5, que comprende una estructura: O O II II (OCH2CH2)n- O - CH2 — C- O - CHCH2 — C— NH -El CH, VI en la cual n varía desde 2 hasta 3400 aproximadamente. 28.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque k es igual a 1. 29.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero soluble en agua tiene brazos múltiples. 30. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque dicho polímero de brazos múltiples comprende un núcleo central a partir del cual se extienden tres o más brazos poliméricos. 31. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque dicho brazos poliméricos son homo-poliméricos o co-poliméricos . 32.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque cada brazo polimérico comprende un copolímero que comprende un segmento de polipéptido interior unido forma covalente al dicho núcleo central y un segmento de polímero hidrofílico unido en forma covalente a dicho segmento de polipéptido. 33.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 31, que comprende la estructura: VII en la cual R es una molécula central, POLY es un polímero soluble en agua, LD es un enlace degradable, El es un inhibidor de ingreso, y "y" varía desde 3 a 15 aproximadamente. 34.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 33, que comprende la estructura: VIII en la cual m se selecciona a partir de 3, 4, 5, 6, 7, y 8. 35.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque dicho El está unido en forma covalente a través de un enlace degradable al segmento de polipéptido interior. 36.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 33, que comprende la estructura IX en la cual P es un espaciador, Z es -0-,-NH-, o -CH2-, y O es un residuo hidroxilo proveniente del El. 37.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque P, cuando se toma junto con -NH-P-Z-C (O) - es el residuo de un aminoácido presente o no presente en la naturaleza. 38. - Una composición que comprende una pluralidad de conjugados de El mono-poliméricos . 39. - Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de conformidad con la reivindicación 1. 40. - Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, que comprende también un excipiente farmacéuticamente aceptable. 41. - Un hidrogel de gelificacion no invertida que comprende un inhibidor de ingreso, y como uno de los componentes del gel, un poli (óxido de alquileno) . 42. - Un hidrogel de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porgue dicho hidrogel está entrelazado. 43. - El hidrogel de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque dicho hidrogel no está entrelazado. 44.- El hidrogel de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque dicho inhibidor de ingreso está en forma de un conjugado de polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 1. 45.- El hidrogel de conformidad con la reivindicación 41, que se puede degradar bajo condiciones fisiológicas . 46.- El hidrogel de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque dicho inhibidor de ingreso opcionalmente está unido en forma covalente a uno o más componentes del gel. 47.- Un método para elaborar conjugado de polímero de conformidad con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto, bajo condiciones de conjugación, un inhibidor de ingreso con un reactivo polimérico soluble en agua para formar un conjugado de inhibidor de ingreso polimérico que comprende un enlace degradable. 48. - Un método para preparar un hidrogel de gelificación no invertida que comprende un inhibidor de ingreso, dicho método comprende: poner en contacto reactivos precursores del hidrogel apropiados uno con el otro y con dicho inhibidor de ingreso bajo condiciones efectivas para promover la gelificación de dichos reactivos precursores, para de esta manera formar un hidrogel de gelificación no invertida que comprende al dicho inhibidor de ingreso atrapado en el mismo, caracterizado porque dicho inhibidor de ingreso puede estar en forma conjugada o no conjugada y dichos reactivos precursores de hidrogel no presentan propiedades de gelificación invertida. 49. - Un método para inhibir la infección por VIH, que comprende administrar una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de conformidad con la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 50. - El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque dicho conjugado se administra en combinación con uno o más agentes antivirales adicionales.