JP4381301B2

JP4381301B2 - Ｐｅｇ化ｔ２０ポリペプチド

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Publication number: JP4381301B2
Application number: JP2004525219A
Authority: JP
Inventors: バイロン，パスカル・セバスチャン; ウォン，チィ−ヨプ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2009-12-09
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Also published as: US20040049018A1; AR040651A1; IL166038A0; ES2354609T3; CA2493534C; JP2006511455A; CN1671736A; RU2005105577A; BR0312889A; RU2296769C2; CA2493534A1; EP1527088B1; PA8577701A1; PL375254A1; KR100637981B1; AU2003257467B2; KR20050027257A; WO2004013164A1; CN100357317C; AU2003257467A1

Description

本発明は、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチド化合物、ならびに医薬組成物および処置の治療方法などにおける、このような化合物を使用および作成する関連方法に関する。

一部のウィルス、特にＨＩＶは、宿主細胞に侵入して繁殖するためには、融合と呼ばれる複雑なプロセスを被る必要がある。融合の間、ウィルスの外膜は、宿主細胞の膜と融合する。ＨＩＶの場合、ＨＩＶウィルスの外膜は、繁殖の間に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の膜と融合する。

Ｔ２０は、ウィルス／膜融合を阻害する抗ウィルス剤の新しいクラスの一員である。ＨＩＶの場合、これは、２つ有益な効果を与える。ＨＩＶの繁殖は、阻止されることと、ＣＤ４＋Ｔ細胞の結果としての死は起こらないことである。

２つの大規模な、国際的に実施された第三相試験によるデータは、Ｔ−２０による併用治療が、Ｔ−２０を用いない併用治療を受けた患者と比較して、患者の少なくとも２倍のパーセントにおいてＨＩＶを検知不能な血中レベルまで低下させ、２４週には改善された免疫反応を与えたことを示す。加えて、Ｔ−２０を与えられた患者は、２４週間に渡ってウィルス不全または再発をあまり経験しなかった。

北米およびブラジルで実施された最初の第三相試験において、最適化されたバックグラウンド投薬計画のみを与えられた患者の１６パーセントと比較して、最適化されたバックグラウンド投薬計画と併用されたＴ−２０によって処置した患者の３７パーセントは、２４週にてＨＩＶの検知不能な血中レベル（４００コピー／mL未満）を有していた（ｐ＜０．０００１）。Ｔ−２０を用いた併用治療は更に、併用治療のみを与えられた７パーセントと比較して、ＨＩＶウィルス負荷を患者の２０パーセントにおいて５０コピー／mLまで低下させた（Ｐ＝０．０００２）。

研究の主要評価項目、研究における２群間のＨＩＶ低下の程度の平均差は、０．９３４ｌｏｇｌ０コピー／mLであった（ｐ＜０．０００１）。その併用投薬計画の一部としてＴ−２０を与えられた患者は、対照群の患者の０．７６３ｌｏｇ１０コピー／mLと比較して、１．６９７ｌｏｇ１０コピー／mLのＨＩＶレベルの低下を達成した。その上、Ｔ−２０を与えられた患者の５２パーセントは、Ｔ−２０を与えられなかった２９パーセントと比較して、ＨＩＶレベルにおいて１．０ｌｏｇ１０以上の大きい低下を経験した（ｐ＜０．０００１）。Ｔ−２０群の患者は、対照群の３２細胞／mm3と比較して、７６細胞／mm3のＣＤ４＋細胞の平均上昇を経験した（ｐ＜０．０００１）。

欧州およびオーストラリアで実施された第二の第三相臨床試験からの結果は、第一の研究による発見結果と一致していた。最適化されたバックグラウンド投薬計画と併用してＴ−２０によって処置された患者の２８パーセントは、最適化されたバックグラウンド投薬計画のみを与えられた１４パーセントと比較して、２４週にてＨＩＶの検知不能な血中レベル（４００コピー／mL未満）を有していた（ｐ＜０．０００１）。Ｔ−２０を用いた併用治療は更に、併用治療のみを与えられた５パーセントと比較して、ＨＩＶウィルス負荷を患者の１２パーセントにおいて５０コピー／mL未満まで低下させた（Ｐ＝０．００９９）。

２４週における２群間のＨＩＶ低下の規模の平均差は、０．７８ｌｏｇ１０コピー／mLであった（ｐ＜０．０００１）。その併用投薬計画の一部としてＴ−２０を与えられた患者は、対照群の患者の０．６５ｌｏｇ１０コピー／mLと比較して、１．４３ｌｏｇ１０コピー／mLのＨＩＶレベルの平均低下を達成した。その上、Ｔ−２０を与えられた患者の４３パーセントは、Ｔ−２０を与えられなかった２１パーセントと比較して、ＨＩＶレベルにおいて１．０ｌｏｇ１０以上の大きい低下を経験した（ｐ＜０．０００１）。Ｔ−２０群の患者は、対照群の３８細胞／mm3と比較して、６５細胞／mm3のＣＤ４＋細胞の平均上昇を経験した（ｐ＝０．０２３）。

開始時に各患者のために、最適化されたバックグラウンド投薬計画（適切な場合、新たに承認された薬または治験薬を２つまで含む、３〜５つの薬物からなる）を、処置履歴および抗レトロウィルス耐性試験に基づいて選択した。投薬計画の選択後、患者は、Ｔ−２０と併用された投薬計画または投薬計画のみのどちらかを与えるために、２：１に無作為抻出した。Ｔ−２０に無作為抻出された患者は、１日２回、１回の９０mg皮下自己注射として投与されるＴ−２０を与えられた。

最近承認された抗ＨＩＶ薬に対するウィルス耐性は、今日、ＨＩＶの臨床管理での重大な問題である。現在承認されている薬物との併用抗レトロウィルス薬処置を始める多くの患者は、時間と共にこれらの薬剤の１つ以上への耐性を発現するであろう。しかしながら研究は、Ｔ２０が、現在承認されている抗ウィルス薬のどのクラスに対する耐性によっても影響を受けないことを示唆している（２００１年６月４〜８日に、アリゾナ州スコッツデールでの5th International Workshop on Drug Resistance and Treatment Strategiesで紹介されたデータ）。追加の実験は、Ｔ２０のインビトロ活性が逆転写酵素インヒビターおよびプロテアーゼインヒビターへの耐性に関連する変異によって影響を受けないことを示している。

多くのポリペプチド治療剤と同様に、Ｔ２０は、一般に注射により投与する。現在の治療プロトコルはしばしば、１日１回を超える注射を包含する。

したがって、改善された性能および薬物動態特性を有するＴ２０ポリペプチドおよび医薬組成物を提供することは好都合である。Ｔ２０のより少ない治療用量、より少ない投与頻度、および／または延長された作用期間を与えることは、特に好都合である。

本発明のこれらおよび他の目的は、以下で更に詳細に説明する。

本発明は、式Ｉ：

（式中、
Ｒ₁は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）の化合物を提供する。
本発明の化合物の一実施態様において、Ｒ₁はメトキシであり、ｍは１であり、ｎは１００〜７５０であり、そしてｐは３である。

医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ２０が先に定義されたとおりである式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物も提供される。

本発明の医薬組成物の一実施態様において、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、ｎは、１００〜７５０であり、そしてｐは、３である。

本発明は更に、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ２０が先に定義されたとおりである式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も提供する。

ＨＩＶ感染を抑制する方法の一実施態様において、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、ｎは、１００〜７５０であり、そしてｐは、３である。

本発明が「作成するための方法」に関する場合、「作成するためのプロセス」を意味する。

ポリエチレングリコールアルデヒド分子がＴ２０ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合している、式（Ｉ）の化合物を生成するために、Ｔ２０ポリペプチドを、式中、Ｒ₁、ｍ、ｎ、およびｐが先に定義されたとおりである、式：

のポリエチレングリコールアルデヒドと反応させることを含む、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドを作成する方法も更に提供する。

本発明が「化合物を含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法」に関する場合、「ＨＩＶの抑制のための薬剤の調製のための化合物の使用」を意味する。

本発明により、式：ＣＨ₃−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨＴ２０（III）（式中、ｎは１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ２０ポリペプチドである）の化合物も提供される。

本発明により、医薬的に許容される賦形剤と混合して、式（III）（式中、ｎは、１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ２０ポリペプチドである）の化合物を含む医薬組成物も提供される。

医薬的に許容される賦形剤と混合して、式（III）（式中、ｎは１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ２０ポリペプチドである）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も提供される。

先に示したように、Ｔ２０は「融合インヒビター」ポリペプチドである。Ｔ２０は、３６個のアミノ酸からなる。Ｔ２０のポリペプチド配列は、
ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ［配列番号：１］である。

Ｎ末端（またはアミノ末端）アミノ酸は、チロシン（Ｙ）である。Ｃ末端（またはカルボキシ末端）アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）である。

全体を引用例として本明細書に取り込む、米国特許第５，４６４，９３３号の図１で述べられているように（配列番号：１）、Ｔ２０ポリペプチド配列は、そのアミノおよびカルボキシ末端の一方または両方にて封鎖／誘導体化できる。米国特許第５，４６４，９３３号で述べられているように、チロシンのアミノ末端は、アシル基によって封鎖／誘導体化され、フェニルアラニンのカルボキシ末端は、アミノ基によって封鎖／誘導体化される（後者は、−ＣＯＯＨ→−ＣＯＮＨ₂の変換を生じる）。

本明細書で使用されるように、「Ｔ２０」は、アミノ基によりフェニルアラニンＣ末端にて場合により遮断された［配列番号：１］を意味することが理解されるものとする。言い換えれば、「Ｔ２０」に言及する場合、フェニルアラニンＣ末端は、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＮＨ₂のどちらかである。

本発明は、以下の式：

（式中、
Ｒ₁は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）のＰＥＧ化Ｔ２０化合物を提供する。

本明細書で使用されるように、Ｒ₁「キャッピング基」は、好みに応じて他の化学部分と一般に非反応性または一般に反応性である、どの適切な化学基でもよい。上記の化合物では、ポリエチレングリコールはＴ２０のα−アミノ基と共有結合する。Ｒ₁キャッピング基は、二官能性、すなわち興味のある第二の化学部分への共有結合を許容または防止するように選択される。

一般に、キャッピング基が、他の化学部分と非反応性である場合、Ｒ₁は、比較的不活性であり、したがって別の化学部分と共有結合しないであろう。適切な、一般に非反応性のＲ₁キャッピング基は、水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールを含む。

本明細書で使用されるように、「低級アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルなどの１〜７個の、好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する、置換または非置換の直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。

「低級アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して結合された、前に定義した低級アルキル基を意味し、低級アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどである。

「低級シクロアルキル」という用語は、３〜７個の、好ましくは４〜６個の炭素原子を含有する置換または非置換のシクロアルキル基、すなわちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチルを意味する。

本明細書で使用されるように、「低級アルケニル」という用語は、２〜７個の、好ましくは２〜５個の炭素原子を含有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖アルケニル基、例えばエテニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどを意味する。

「低級シクロアルケニル」という用語は、４〜７個の炭素原子を含有する置換または非置換のシクロアルケニル基、例えばシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどを含む。

「アリール」という用語は、非置換であるか、あるいはハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、ニトロ、アミノ、またはフェニルによって、特にハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、およびフェニルによって場合により一置換または多置換される、フェニルまたはナフチル基を意味する。

「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｓ、およびＯから選択された１個以上のヘテロ原子を含有し、前に定義した「アリール」と同じ方法でベンズ融合および／または置換された、５または６員へテロ芳香族基を意味する。

好ましい一般に非反応性のＲ₁キャッピング基は、メトキシ、ヒドロキシ、またはベンジルオキシを含む。特に好ましいＲ₁キャッピング基は、メトキシである。Ｒ₁がメトキシである場合、ＰＥＧ化ポリペプチド化合物は本明細書では一部、「ｍＰＥＧ」化合物と呼ばれ、ここで「ｍ」はメトキシを表す。

一般に、Ｒ₁キャッピング基が、他の化学部分と反応性である場合、Ｒ₁は、ペプチドおよび／またはタンパク質中のアミンおよび／またはスルフヒドリル基などの、一部の官能基と反応することが可能である官能基である。このような場合、反応するために強力な触媒または非常に非実際的な反応条件を必要とする基とは対照的に、Ｒ₁は、他の分子上の求電子または求核基とただちに反応することができる官能基でもよい。Ｒ₁が、比較的反応性である場合、ポリエチレングリコールアルデヒドは別の化学部分と共有結合できる。

適切な一般に反応性のＲ₁キャッピング基の例は、ハロゲン、エポキシド、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、トシラート、イソシアナート、ヒドラジンヒドレート、シアヌル酸ハライド、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリルオキシ、ｐ−ニトロフェニルオキシ、および

を含む。

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。好ましい一般に反応性のＲ₁キャッピング基は、

である。このＲ₁キャッピング基が存在する場合、本発明の化合物において、第一のｍ、ｎ、および／またはｐが、式中の第二のｍ、ｎ、および／またはｐと同じでも異なっていてもよいことが認識されるであろう。しかしながら両方のｍが同じ値を持ち、両方のｎが同じ値を持ち、そして両方のｐが同じ値を持つことが好ましい。

本発明において、ｍは、１〜１７である。好ましい実施態様において、ｍは、１〜１４である。更に好ましくは、ｍは、１〜７であり、なお更に好ましくは、ｍは、１〜４である。最も好ましくは、ｍは、１である。

本発明において、ｎは、１０〜１０００である。本発明の好ましい実施態様において、ｎは、２０〜１，０００である。好ましくは、ｎは、５０〜１，０００であり、なお更に好ましくは、ｎは、７５〜１，０００である。最も好ましくは、ｎは、１００〜７５０である。

本発明において、ｐは、１〜３である。好ましくは、ｐは、３である。

好ましい実施態様において、ｐは、３であり、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。あるいはｐは、２であり、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。あるいはｐは、１であり、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。

本発明は、Ｒ₁が、メトキシであり、ｍが、１であり、ｎが、１００〜７５０であり、ｐが、３であり、ＮＨＴ２０が、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである、式（Ｉ）の実施態様を提供する。

先に示したように、本発明のＰＥＧ化Ｔ２０化合物は、Ｔ２０のα−アミノ基を、特定の構造を有するポリエチレングリコール誘導体に共有結合させる。これらのＰＥＧ化化合物は、所望のどの方法でも作成できるが、一般にＴ２０に、個別に調製したポリエチレングリコール誘導体を反応させることによって調製する。

Ｔ２０ポリペプチドは、どの適切な方法でも調製できる。例えば化合物は、Ｂｏｃ−アミノ酸を利用した固相法を包含する古典的なメリフィールド固相合成技法を使用して（Chem.Soc., 85, 2149, 1963）、手動または自動手法を使用して、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を利用した固相方法を使用して（Sheppard, R.C.ら、J.Chem.Soc.Chem.Comm., 165〜166頁(1985)）を使用して、ケンタッキー州ルイビルのAdvanced ChemtechによるAdvanced Chemtech model 200を使用して、マサチューセッツ州ベッドフォードのMilliporeより入手可能なMillipore 9050+を使用して、又は他の入手可能な機器を使用して合成できる。

Ｔ２０は、本発明の化合物をコードしているｃＤＮＡを機能性ウィルス性または環状プラスミドｃＤＮＡベクター内に組み込むことによって生成される。ベクターまたはプラスミドは、選択した微生物を形質移入または形質転換するために使用できる。形質転換または形質移入微生物は、ベクターが持つＤＮＡ配列の発現に対して誘発性である条件下で培養可能であり、増殖培地からの所望のペプチドの分離が実施できる（例えば、まるで全体が引用されたように、その全体を引用例として本明細書に取り込む、米国特許第５，９５５，４２２号を参照）。

Ｔ２０は、当技術分野において周知の標準組換えＤＮＡ技法によっても調製できる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York(1995）で概説されている手法のどちらも引用例として本明細書に取り込む。

Ｔ２０を作成する詳細な方法は、米国特許第６，０１５，８８１号に述べられており、本明細書に取り込む。

開裂および脱保護の後、Ｔ２０は、どの適切な手段によっても精製できる。例えば、イオン交換、ゲル濾過クロマトグラフィー、および／または逆相カラム／ＨＰＬＣシステムを用いて、全長Ｔ２０をその断片から精製することができる。Ｎ末端（例えばアシル基）および／またはＣ末端（例えばアミノ基）に結合した封鎖／保護基を備えたＴ２０前駆物質が最初に調製される場合、これらの基の一方または両方を、既知の技法で除去することができる。

Ｔ２０のアミノ酸配列は、標準アミノ酸分析はもちろんのこと、各アミノ酸の手動および自動エドマン分解および決定を用いても確認および同定できる。ＨＰＬＣ分析および質量分析法も、Ｔ２０の生成を確認するために使用できる。

Ｔ２０と反応できるポリエチレングリコールアルデヒド化合物は、どの所望の方法でも作成できる。しかしながら、ポリエチレングリコールは、全体を引用例として本明細書に取り込む、「Polyethylene Glycol Aldehydes」という題の、２００２年６月２４日に出願された米国特許出願第６０／３９８，１９６号に述べた方法に従って作成できる。

一般に、式：

（式中、Ｒ₁、ｍ、ｎ、およびｐは先に定義したとおりである）のポリエチレングリコールアルデヒドを用いて、Ｔ２０をＰＥＧ化する。Ｔ２０をＰＥＧ化するのに使用されるポリエチレングリコールアルデヒドは、どの適切な手段によっても調製できる。１つの好ましいポリエチレングリコールアルデヒドは、以下：

のように調製される。

様々なサイズ（例えばｎ値を変える）のポリエチレングリコールアルデヒドは、上の一般反応スキームに従って調製できる。

本発明のＰＥＧ化Ｔ２０化合物は、どの適切な手段によっても調製できる。しかしながら、本発明によって、式：Ｒ₁−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ₂）_p−ＣＨ₂−ＮＨＴ２０（Ｉ）（式中、ポリエチレングリコールアルデヒド分子は、Ｔ２０ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合されている）の化合物を生成するために、Ｔ２０ポリペプチド、ＮＨＴ２０を、式：

（式中、Ｒ₁、ｍ、ｎ、およびｐは先に定義したとおりである）のポリエチレングリコールアルデヒドと反応させることを含む、Ｔ２０ポリペプチドをＰＥＧ化するための方法が更に提供される。

ＰＥＧ化Ｔ２０は、Ｔ２０およびＰＥＧ試薬を１：１〜１：１００のモル比範囲で添加することによって調製される。Ｔ２０は、先に論じたように、遊離α−アミノ基（いずれかのアシル基が除去される）および遊離カルボキシ基またはアミノ保護基のどちらかを有する。反応混合物は、室温または４℃、pH範囲５．５〜７．４のホウ酸、リン酸又はＴｒｉｓ緩衝液に約０．５〜２４時間入れる。ＰＥＧ試薬のペプチド／タンパク質に対するモル比は、１：１〜１００：１である。ペプチド／タンパク質の濃度は、１〜１０mg／mlである。通例、緩衝液の濃度は、１０〜５００mMである。

ＰＥＧ化Ｔ２０は、ＰＥＧ化Ｔ２０の反応混合物を取って、それを平衡緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、pH７．５）で希釈することによって精製する。得られた混合物を次に、Ｑ−セファロースカラムに加える。混合物をＱＡカラムに加えた後、それを平衡緩衝液で洗浄し、７５ＭＮａＣｌで溶離、２００mM ＮａＣｌで溶離、１ＭＮａＣｌで溶離させ、および１ＭＨＯＡＣ＋１ＭＮａＣｌおよび０．５ＮａＯＨによって再生する。

逆相ＨＰＬＣを使用することによって、Ｎ末端、モノＰＥＧ化生成物を混合物中の他の副生成物からただちに分離および単離することが可能である。

本発明のＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドの好ましい実施態様において、ｐは、３であり、Ｒ₁は、メチルであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。ｐは、２であり、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。またはｐは、１であり、Ｒ₁は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。

本発明は、式：
ＣＨ₃−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨＴ２０（III）（式中、ｎは、１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ２０ポリペプチドである）のＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドも提供する。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。

このＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、いずれかの所望の方法で作成でき、好ましくは実施例３で述べる方法により作成される。

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ２０が上で定義された、式（Ｉ）の化合物を含む。

ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチド、またはその塩を含む本発明の医薬組成物は、いずれかの所望の方法、例えば従来の混合、カプセル化、溶解、粒状化、乳化、取り込み（entrapping）、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。これらの医薬的調製物は、治療的に不活性な無機または有機賦形剤および担体を用いて調合できる。注射用の適切な賦形剤は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および表面活性剤を含む。

医薬的調製物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤も含有できる。それらは、追加の活性成分を含む、他の治療的に価値のある物質も含有できる。

非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適した調合物は、単位投薬形態で好都合に与えられるか、従来の医薬的技法によって調製できる。このような技法は、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドおよび医薬的担体または賦形剤を結合させるステップを含む。一般に調合物は、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドを液体担体を均一および密接に結合させることによって調製する。非経口の投与に適した調合物は、調合物を抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および対象となるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有する、水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含む水性および非水性滅菌懸濁物を含む。調合物は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで与えられ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管できる。

好ましい単位投薬調合物は、本明細書の上で引用したように、１日用量または単位、１日サブ用量、あるいは投与成分の適切な分割を含有する調合物である。

好ましくは、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、単位投薬形態である。本明細書で使用されるように、「単位投薬形態」は、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドが予め測定されたおよび／または予め包装された形態である単回用量に適した量を意味する。これは投与のためのＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドの好都合な調製を可能にし、患者による自己投与すら可能にする。単位投薬量は明らかに、送達されるＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドの量および投与頻度に依存する。

ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、投与の直前に医薬的に許容される賦形剤による再構成に適した、単位投薬量の凍結乾燥粉末形態で提供することもできる。

本発明の特定の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁が、メトキシであり、ｍが、１であり、ｎが、１００〜７５０であり、そしてｐが、３である、式（Ｉ）の化合物を含む。

本発明の別の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、ｎが、１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ２０が、その末端α−アミノ基に共有結合したＴ２０ポリペプチドである式（III）の化合物を含む医薬組成物である。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。

更に、本発明は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ２０が先に定義したとおりである式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法を提供する。

一般に、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、（非ＰＥＧ化）Ｔ２０ポリペプチドが現在投与されている方法で投与される。しかしながら、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドの改善された薬物動態特性を利用するために、変更を行うことができる。

ＨＩＶを抑制する本発明の方法において、医薬組成物は、いずれかの適切な方法および経路で投与できる。好ましい方法において、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、注射用溶液または懸濁物の形態で投与される。好ましくは注射用溶液または懸濁物は、皮下注射によって、または静脈内に投与される。

別の好ましい方法において、ＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、経皮送達デバイス、例えば経皮パッチを通じて投与される。

ＨＩＶを抑制する本発明の方法において、医薬組成物は、いずれかの適切な投薬量およびスケジュールで投与できる。本発明の医薬組成物は、所望の、いずれかの形態およびいずれかの経路で投与できる。一般に、しかしながら、本発明のＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチドは、非経口的に、例えば注射溶液の形態で投与される。

治療的有効量の決定は、当技術分野の範囲内であり、本発明によるＰＥＧ化Ｔ２０ポリペプチド治療的有効量または投薬量は、変化することがあり、特定の各症例における個別の要件に調整されるであろう。一般に、体重約７０ｋｇの成人男性への非経口投与の場合、約５mg〜約３００mg、好ましくは約５０mg〜約２００mgの１日投薬量が適切であるが、指示される場合は上限を超えてもよい。投薬量は、単回用量として、分割用量で、または持続注入によって投与できる。毎日、更に好ましくは毎週の投与が利用できる。

本発明は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ₁が、メトキシであり、ｍが、１であり、ｎが、１００〜７５０であり、そしてｐが、３である式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も提供する。

医薬的に許容される賦形剤と混合して、ｎが、１０〜１，０００であり、ＮＨＴ２０が、その末端α−アミノ基に共有結合されたＴ２０ポリペプチドである式（III）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も、本発明の範囲内で考慮される。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。

以下の実施例は、本発明の化合物、組成物、および方法を更に説明するために提供される。これらの実施例は、例示のみであり、本発明の範囲を決して制限するものではない。

ＰＥＧ_10K−ブタノアルデヒドの調製
トルエン２４０ml中の分子量１０，０００のｍＰＥＧ（３０．０ｇ、３mmol）を２時間還流し、それに続くトルエン１２０mlの除去によって共沸乾燥させた。得られた溶液は室温まで冷却し、次に無水ｔｅｒｔ−ブタノール２０mlおよびトルエン２０ml中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．６８ｇ、６mmol）を、ＰＥＧ溶液に添加した。得られた混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて２時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタート（１．００mL、６．７５mmol）を注射器で反応物に添加し、反応物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。次に反応溶液を回転蒸発により濃縮した。ジエチルエーテルへの添加により残留物を沈殿させた。沈殿したｍＰＥＧ_10Kｔ−ブチルカルボキシメチルエステル生成物を濾過して、真空中で乾燥させた。収量：２８ｇ。

次に、ｍＰＥＧ_10Kｔ−ブチルカルボキシメチルエステル（２６．５ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム３５０ml中に溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。６Ｎ塩酸の添加により混合物のpHを２．５に調整して、混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮させて、そしてジエチルエーテル中で沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_10K−カルボキシメチル酸を濾過により収集して、真空中で乾燥させた。収量：２４ｇ。

次にｍＰＥＧ_10K−カルボキシメチル酸（６ｇ、０．６mmol）を無水ジクロロメタン（３０mL）に溶解させ、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（１４０ml、０．９mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８０mg、０．６mmol）、およびジクロロヘキシルカルボジイミド（１６０mg、０．７８mmol）の添加が続いた。混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を濾過、濃縮し、そして、２−プロパノールおよびジエチルエーテル（１：１）の混合物によって沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_10K−ブタノアセタールを真空中で一晩乾燥させた。収量：５．４ｇ。

次にｍＰＥＧ_10K−ブタノアセタール（２ｇ、０．２mmol）を８０％ＣＦ₃ＣＯＯＨ２０mlに溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、混合物のpHを６．０に調整し、塩化ナトリウム（１０重量％）を添加して、次に１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のpHを７．０に調整した。混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮して、そしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_10K−ブタノアルデヒドを濾過により収集し、真空中で乾燥させた。収量：１．７ｇ。

ＰＥＧ_10K−ブタノアルデヒドによるＴ２０のＰＥＧ化
ＰＥＧ１０ｋＤａのブタノアルデヒド（実施例１より）を、緩衝液（５０mM リン酸カリウム、pH６．５）３．０ml中のＴ２０（純度９３．７％）１５mgに、Ｔ２０１モルあたり試薬５モルのモル比で添加した。Ｔ２０ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ₂により保護した。反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加し、室温にて４時間攪拌した。ＰＥＧ化Ｔ２０は、イオン交換クロマトグラフィー（ＱＡ）を使用して、反応混合物から精製した。２０mM Ｔｒｉｓ、pH７．５中の、１５０mM〜１ＭＮａＣｌの上昇する塩濃度による線形勾配を用いて、ＰＥＧ化Ｔ２０および未修飾Ｔ２０を分離した。

ｍＰＥＧ_10ｋ−プロピオンアルデヒドによるＴ２０のＰＥＧ化
以下の構造を有する、ＰＥＧ１０ｋＤａのプロピオンアルデヒドを使用した。
ＣＨ₃−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）₂₂₇−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨＯ
ｍＰＥＧ１０ｋ−プロピオンアルデヒド１５０mgを、緩衝液（５０mM リン酸カリウム、pH６．５）３．０ml中のＴ２０（純度９３．７％）１５mgに、Ｔ２０１モルあたり試薬５モルのモル比で添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ₂により保護した。

反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加し、室温にて４時間攪拌した。ＰＥＧ化Ｔ２０は、イオン交換クロマトグラフィー（ＱＡ）を使用して反応混合物から精製した。ＰＥＧ化Ｔ２０の構造は以下：
ＣＨ₃−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨＴ２０（III）
のとおりである。

２０mM Ｔｒｉｓ、pH７．５中の１５０mM〜１ＭＮａＣｌの上昇する塩濃度による直線勾配を使用して、ＰＥＧ化Ｔ２０および非修飾Ｔ２０を分離した。

ＰＥＧ化Ｔ２０のインヒビター濃度
通例、表現型感受性は、ウィルス増殖の５０％または９０％をそれぞれ抑制するために必要な薬物濃度の基準である、ＩＣ５０またはＩＣ９０によって定量される。

ＰＥＧ_10K−プロピオンアルデヒドを備えたＰＥＧ化Ｔ２０（実施例３）およびｍＰＥＧ_10K−ブタノアルデヒドを備えたＰＥＧ化Ｔ２０（実施例２）のインヒビター濃度５０およびインヒビター濃度９０の結果は、下の表１に再現する。

表１：インヒビター濃度５０およびインヒビター濃度９０の結果

ＩＣ５０およびＩＣ９０の値は、実施例５に従って決定した。

ｃＭＡＧＩ／ＭＡＧＩ抗ウィルスアッセイ
これらのアッセイは、インジケータ細胞株ＭＡＧＩ（ガラクトシダーゼインジケータの多核活性化）またはＣＣＲ５発現誘導体ｃＭＡＧＩを利用した、感染性ウィルス力価の低下について評価した。ＭＡＧＩ細胞株は、アンホトロピック・レトロウィルス・ベクターによってＣＤ４およびＨＩＶ−１ＬＴＲ駆動ｂ−ｇａｌレポーターの遺伝子を導入することによって、親ＨｅＬａ細胞から得た（Kimpton J, Emerman M, J Virol 66: 2232-9, 1992）。ｃＭＡＧＩ細胞株は、アンホトロピック・レトロウィルス・ベクター、ＰＡ３１７を用いたＣＣＲ５遺伝子の導入によって、ＭＡＧＩ細胞株から得た（Chackerian B, Long EM, Luciw PA, Overbaugh J, J Virol 71: 3932-9, 1997）。ｃＭＡＧＩ細胞細胞は、初代ＮＳＩ（Ｒ５）アイソレートおよび実験室適合Ｘ４ウィルスの複製を助けるが、これに対してＭＡＧＩ細胞は、Ｘ４ウィルスのみの複製を助ける。どちらの細胞株も、ＨＩＶ−ＬＴＲによって駆動されるｂ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子の発現をトランス活性化するために、ＨＩＶ−１ｔａｔの能力を利用する。ｂ−ｇａｌリポーターは、核に局在するように修飾されており、Ｘ−ｇａｌ基質によって、感染の２、３日以内の強力な核染色として検出できる。それゆえ染色核の数は、染色前に１回の感染のみがある場合、チャレンジ接種での感染性ビリオンの数と等しいとして解釈できる。

感染および細胞−細胞融合のインヒビター、例えばＴ２０またはＴ１２４９（Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retrovirus 9: 1051-3, 1993）を、１回の感染を確実に示す計測値を可能にするために、感染２４時間後に添加した。感染細胞は、ＣＣＤ撮影機を用いて数え、初代および実験室適合アイソレートの両方が、ウィルス投入と撮影機によって描出された感染細胞数との直線関係を示した。ＭＡＧＩおよびｃＭＡＧＩアッセイにおいて、感染力価の５０％低下（Ｖ_n／Ｖ₀＝０．５）は重大であり、抗ウィルス活性を評価するための一次カットオフ値を提供する。感染力価の９０％低下（Ｖ_n／Ｖ₀）を、抗ウィルス活性の評価での追加のカットオフ値として使用する。

各試験化合物の希釈物は、４８ウェルマイクロタイタープレートの約１５００〜２０００感染細胞／ウェルを与えるように調整されたウィルス接種に対して２回試験した。試験化合物をｃＭＡＧＩまたはＭＡＧＩ細胞に添加し、ウィルス接種が続き、２４時間後に感染および細胞−細胞融合のインヒビター（Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retrovirus 9: 1051-3, 1993）を添加して、第２回の感染および細胞−細胞ウィルス蔓延を防止した。細胞を更に２日間培養し、固定して、Ｘ−ｇａｌ基質によって染色し、感染細胞を検知した。各対照および試験化合物希釈物の感染細胞の数は、ＣＣＤ撮影機によって決定した。ＩＣ５０は、感染性ウィルス力価の５０％低下を生じる試験化合物の希釈度として定義される。ＩＣ９０は、感染力価の９０％低下を生じる希釈度として定義される。

それゆえ本発明を説明したが、同じ方法が多くの方法で変更できることが明らかになるであろう。このような変更は、本発明の精神および範囲からの逸脱とは見なされず、このような改変すべては、以下の請求項の範囲内に含まれるものとする。

Claims

式（Ｉ）

（式中
Ｒ₁は、低級アルコキシであり、
ｍは、１であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）の化合物。
Ｒ₁が、メトキシであり、そしてｎが、１００〜７５０である、請求項１記載の化合物。
式：

（式中
Ｒ₁は、低級アルコキシであり、
ｍは、１であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）の化合物を、医薬的に許容される賦形剤と混合して含む、医薬組成物。
Ｒ₁が、メトキシであり、そしてｎが、１００〜７５０である、請求項３記載の医薬組成物。
凍結乾燥粉末の形態である、請求項３記載の医薬組成物。
注射用溶液または懸濁物の形態である、請求項３記載の医薬組成物。
ＨＩＶ感染抑制用の医薬の調製のための、式Ｉ：

（式中
Ｒ₁は、低級アルコキシであり、
ｍは、１であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）の化合物を、医薬的に許容される賦形剤と混合して含む医薬組成物の使用。
医薬組成物が、１日あたり５０mg〜２００mgの量で投与される、請求項７記載の使用。
医薬組成物が、単回用量で週あたり３００mg〜１５００mgの量で投与される、請求項７記載の使用。
ＨＩＶ感染抑制用の医薬の調製のための、式Ｉ：

（式中
Ｒ₁は、メトキシであり、
ｍは、１であり、
ｎは、１００〜７５０であり、
ｐは、３であり、そして
ＮＨＴ２０は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ２０ポリペプチドである）の化合物を、医薬的に許容される賦形剤と混合して含む医薬組成物の使用。
式：Ｒ₁−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ₂）_p−ＣＨ₂−ＮＨＴ２０（Ｉ）（式中、ポリエチレングリコールアルデヒド分子は、Ｔ２０ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合されている）の化合物を生産する方法であって、Ｔ２０ポリペプチドを式：

（式中
Ｒ₁は、低級アルコキシであり、
ｍは、１であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、３である）
のポリエチレングリコールアルデヒドと反応させて、ポリエチレングリコール分子をＴ２０ポリペプチドに結合させることを含む、方法。