TW200416225A - Pegylated T20 polypeptide - Google Patents

Description

200416225 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於聚乙二醇T20多肽化合物，及使用和製備該 等化合物之相關方法，諸如其在醫藥組合物及治療方法中 之使用。 【先前技術】 某些病毒，特別係HIV，必須經受一稱為融合之複雜過 程，以進入宿主細胞並複製。在融合過程中，病毒之外膜 與宿主細胞膜融合。以HIV為例，HIV病毒之外膜在複製過 程中係與CD4+T細胞膜融合。 T20係一群可抑制病毒/膜融合之新穎抗病毒試劑之成 員，以HIV為例，其可提供兩種有益作用：HIV之複製受到 阻斷，且不會導致CD4+T細胞死亡。 從兩個大型國際所進行之III期臨床實驗中獲得之數據顯 示，使用T-20之聯合治療在第24週時，可使患者血液中HIV 降至無法檢出水平之患者百分比至少為接受未與T-20之聯 合治療患者之兩倍，且具有較佳的免疫反應。另外，接受 丁-20之患者在24週期間較不易出現病毒學上之失敗結果或 復發。 於北美及巴西所進行之第一次III期臨床實驗中，在第24 週時，37%以T-20與最佳基礎療程之聯合治療患者血液中 HIV含量為無法檢出（ 400複製數/毫升以下），而僅接受最 佳基礎療程之患者中的比例則為16% ( p<0.0001 )。與T-20 之聯合治療可進一步使20%患者之HIV病毒性負荷降低至 86595 -6- 200416225 50複製數/毫升以下’而僅接受聯合治療之患者中的比例則 為 7% (Ρ = 0·0002)。 該研究主要效能終點，即該研究中兩組間之Hi ν降低量之 平均差值為0.934 loglO複製數/毫升（ρυοοι)。接受丁_2〇 作為其聯合療程之一部分之患者中HI V含量之降低值為 1 · 6 9 7 1 〇 g 10複製數/毫升’較之對照組患者中數值則為〇 · 7 $ 3 log 10複製數/毫升。除此之外，52%接受L20之患者中降低 了 l.OloglO或更高HIV含量，而未接受T-2〇之患者中之比例 則為29%(Ρ<0·0001 )。Τ-20組患者之平均cD4+細胞增加值為 76個細胞/立方毫米，而對照組患者所增加值則為32個細胞 /立方毫米（ρ<〇.〇〇〇1)。 於歐洲與澳大利亞所進行之第二次出期臨床實驗獲得之 結果與第一次研究結果一致。在第24週時，28%以T-20及最 佳基礎療程治療之患者血液中HIV含量無法檢出（4〇〇複製 數/毫升以下），而僅接受最佳基礎療程患者中的比例則為 14%(ρ<〇·〇〇〇ι)。與T-20之聯合治療可進一步使12〇/。患者之 HIV病毒性負荷降低至50複製數/毫升以下，而僅使用聯合 治療患者中的比例則為5%(Ρ = 0.0099)。 在第24週時’兩組間HIV降低量之平均差值為〇·78 i〇gl〇 複製數/毫升（ρ<0·0001)。接受T_2〇作為其聯合療程之一部 分之患者之HIV含量平均降低值為143 1〇gl〇複製數/毫 升較之對照組患者之平均降低值則為〇 · 6 5 1 〇 g 1 〇複製數/ 毫升。另外，43%接受T-20患者降低了 ：[·〇 1〇§10或更高之 HIV含量，較之未接受T-2〇患者（p<〇•⑼〇1)中的比例則為 86595 200416225 2 1 %。T-20組患者之平均CD4+細胞增加值為65個細胞/立方

毫米，而控制組患者中所增加值則為38個細胞/立方毫米（ =0.023) 。 P 開始時，根據治療史及抗逆轉錄病毒抗性測試，為每位 患者選擇最佳基礎療法（由三至五種藥物組成，若合適，包 含取多兩種新批准的或試驗性藥物）。選定療法後，將患者 以2.1〈比率隨機分組接受使用丁_2〇之聯合療法或單獨療 法。隨機選足接受丁-20聯合療法之患者以皮下自行注射方 式每日投與兩次90毫克T-20。 病毒對當前已核准抗Η〗v藥物之抗性係當今Η χ V臨床管 理中重要問題。許多開始使用當前已核准藥物進行聯合 抗逆轉錄病毒治療之患者經—段時間後會對—或多種藥劑 產生抗性。然而，研究顯示，Τ2〇不受任一當前已核准之抗 逆轉錄病毒類藥物抗性之影響（參見·…月4_8日在亞利 桑那州Sc〇ttsdale舉辦之第五屆國際藥物抗性及治療策略 專題討論會上提交之數據）。另有實驗顯示，T20之活體外 活性不受與逆轉錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑之抗性相關之 突變作用影響。 與許多種多肽治療劑相同，T2〇—般係以注射投藥。各前 之療法通常是每曰多次注射。 田 故，提供具有改良性能及藥物動力學特性之醫藥組合物 及Τ20夕肽疋有益處的，提供較低τ2〇治療 頻率及/或較長之作用時間㈣是有益 本發明之此等目的及其他目的詳細闡釋於下文中。 86595 200416225 【發明内容】 本發明提供一式（I)化合物： 〇

II

Rr(CH2CH2〇)rrCH2CH2-O-(CH2)rTrC-NH-(CH2)p-CH2，NHT20 (1) 其中： 1係一封端基團， m為1至17之間， η為10至1，000之間， ρ為1至3之間，及 ΝΗΤ20係藉由其末端α -胺基共價鍵結之Τ20多肽。 本發明化合物一個具體實施例中，Ri係甲氧基，m係1，η 介於100至75 0之間，且ρ係3。 本發明亦提供一醫藥組合物，其包含混與醫藥上可接受 賦形劑之式（I)化合物（其中I、m、η、ρ及ΝΗΤ20係如上文 之定義）。 本發明醫藥組合物一個具體實施例中，Ri係甲氧基，m 係1，η介於100至75 0之間，且ρ係3。 本發明進一步提供一種抑制HIV感染之方法，其包括投與 包含與醫藥上可接受賦形劑混合之式（I)化合物（其中I、 m、η、ρ及ΝΗΤ2〇係如上文之定義）之醫藥組合物。 抑制HIV感染方法一個具體實施例中，R!係甲氧基，m係 1，η介於100至75 0之間，且ρ係3。 若本發明論及「製備方法」，其意指「製備過程」。 本發明進一步提供一種用於製備聚乙二醇Τ20多肽之方 86595 200416225 法，其包括將T20多肽與式（Π)聚乙f醇酸反^

Rr(CH2CH20)rrCH2CH2<HCH2)m-C-NH-(CH2)P-CH0 (II) 其中l、m、η及p係如上文之定義， 以產生式⑴之化合物： 、 其中聚乙二醇醛分子鍵結至T20多肽之N-场胺基上 若本發明論及「抑制HIV感染之方法，其包括一化合物」， 則其意指「使用一化合物以製備抑制HIV之藥物」。 本發明亦提供一式（IH)化合物· CH3-〇-(CHrCH2-O)n-CHrCHr〇-CH2-CHrCH2-NHT20 (III) 其中η介於10至1，⑻0之間，且1^11720係藉由其末端胺基 共價键結之τ20多肽。 本發明亦提供一醫藥組合物，其包含與醫藥上可接受賦 形劑混合之式（III)化合物（其中η介於10至丨，000之間，且 ΝΗΤ20係藉由其末端《 -胺基共價键結之丁20多肤）° 本發明亦提供一抑制HIV感染之方法’其包括投與包含與 醫藥上可接受賦形劑混合之式（III)化合物（其中η介於10至 1，000之間，且ΝΗΤ20係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ20 多肽）之醫藥組合物。 如上所述，Τ20係一「融合抑制劑」多肽。Τ20由3 6個胺 基酸組成。Τ20之多肽序列係：

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

[SEQ.ID.NO:l] 其N-端（或胺基端）胺基酸為酪胺酸（Y)。其C-端（或羧基端） 86595 -10- 200416225 胺基酸為苯丙胺酸（F)。 如美國專利案第5,464,933號圖1(SEQ ID:1)所述（其全文 以引用的方式併入本文參考），可阻斷/衍生化T20多肽序列 的胺基端及羧基端之一或兩端。如美國專利案第5,464,933 號中所述，用醯基可阻斷/衍生化酪胺酸胺基端，而用胺基 可阻斷/衍生化苯丙胺酸羧基端（後者產生-C〇OH + -C〇NH2 之轉化）。 應瞭解，本文所用「T20」意指[SEQ.ID.NO: 1]，其視情 況可用胺基阻斷苯丙胺酸C-端。換言之，當提及「T20」時， 苯丙月安酸的C-端不是-COOH就是C〇NH2。 本發明提供下式之聚乙二醇T20化合物： 0

II

Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-〇-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CHrNHT20 (!) 其中： 1係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；及 ΝΗΤ20係藉由其末端cc -胺基共價鍵結之Τ20多肽。 本文所用之Κ「封端基團」係任何合適之化學基團，端 視優先順序，其一般不與其他化學部分反應或一般可發生 反應。在上述化合物中，聚乙二醇係共價鍵結至T20之α -胺基。選用I封端基團以允許或避免雙官能性，例如，共 價結合至另一種感興趣之化學部分。 86595 -11 - 200416225 以封端基團一般不易與其他化學部分反應之為例，Ri相 當惰性’且因此不會與另一化學部分共價鍵結。通常合適 之不易反應之心封端基團包括：氫、羥基、低碳數烷基、 低碳數燒氧基、低碳數環烷基、低碳數烯基、低碳數環缔 基、芳基及雜芳基。 本文所用術語「低碳數烷基」意指含有1至7個（較佳為1 至4個）碳原子之經取代或未經取代之直鏈或具支鏈烷基， 例如甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、第二丁基、 第三丁基、正-戊基、正-己基、正-庚基及其類似物。 術語「低碳數燒氧基」意指藉由氧原子鍵結之上述低碳 數垸基，低碳數烷氧基之實例係甲氧基、乙氧基、正-丙氧 基、異丙氧基、正-丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正 -戊氧基及其類似物。 術語「低碳數環烷基」意指含有3至7個（較佳為4至6個） 碳原子之經取代或未經取代之環烷基，即環丙基、環丁基、 環戊基、環己基或環庚基。 本文所用術語「低碳數烯基」意指含有2至7個（較佳為2 至5個）碳原子之經取代或未經取代之直鏈或具支鏈烯基， 例如乙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及其類似物。 術語「低碳數環烯基」意指含有4至7個碳原子之經取代 或未經取代之環晞基，其包含，例如環丁缔基、環戊婦基、 環己烯基及其類似物。 術語「芳基」意指未經取代或視情況經單-或多個函素、 低碳數烷基、低碳數烷氧基、三氟甲基、幾基、複酸、羧 86595 -12- 200416225 酸酯、硝基、胺基或苯基取代之苯基或莕基，尤其經_素、 低碳數燒基、低碳數烷氧基、三氟甲基、羥基、硝基、胺 基或苯基之單取代或多取代。 術語「雜芳基」意指5-員或6-員雜芳基，其含有一或多個 選自氮、硫及氧之雜原子，且其可為苯并融合及/或以與上 述「芳基」相同之方式取代。 較佳之一般不易反應之1封端基團包括甲氧基、輕基或 爷氧基。特佳之心封端基團係甲氧基。當Ri係甲氧基時， 本文中有時將邵分聚乙二醇多肽化合物稱為r mPEG」化合 物，其中「m」代表甲氧基。 若K封端基團一般會與其他化學部分發生反應，則&係 可與某些官能基（諸如肽及/或蛋白中之胺基及/或巯基）反 應之官能基。在此情況下，與彼等需要強催化劑或極難實 現之反應條件以發生反應之基團相反的是，Ri可係易與其 他分子上之親電子或親質子基團反應之官能基。若R!相對 而言易發生反應，則聚乙二醇醛可與另一化學部分共價鍵 結。 合適之一般易於反應之1^封端基團之實例包括：自素、 環氧化物、馬來醯亞胺、鄰吡啶基二硫化物、甲基續酸基、 異氰酸基、水合肼、氰尿醯鹵、N-琥珀醯亞胺基氧基、硫 代-破ίό疏亞胺基氧基、1-苯并三吐基氧基、1-咪吐基氧 基、對-硝基苯基氧基及 〇

II -CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH〇. 86595 -13- 200416225 ^ _素」意指氟、氣、溴或破。一般較佳之反應性 〇 "

II 之 R1封端基團係-CH2CH2<>(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH〇·。木六 。备存在 ^R1封端基團時，應瞭解，在本發明之化合物中第一個❿、 n及/或P可與該式中之第二個m、η及/或p相同或不同。然 而車又佳狀況係，兩個m具有相同值，兩個η具有相同值及 兩個Ρ具有相同值。 在本發明中，m介於1至17之間。在一較佳具體實施例中， m介於1至14之間，更佳者m介於1至7之間，且尤佳者㈤介於 1至4之間。m最佳為1。 在本發明中，n介於10至1，〇〇〇之間。在本發明之一較佳 具體實施例中，η介於20至1，000之間。η較佳介於5〇至1，〇〇〇 之間，η更佳介於75至ι，000之間。^最佳介於100至750之間。 在本發明中，ρ介於1至3之間。ρ較佳為3。 在較佳具體實施例中，ρ係3 , Rl係曱氧基，111係1，且η 介於100至750之間；或ρ係2，I係甲氧基，m係1，且η介於 100至750之間·，或ρ係1，Ri係甲氧基，m係1，且η介於100 至7 5 0之間。 本發明所提供具體實施例之式（I)中， 其中I係甲氧基，m係1，η介於100至750之間，ρ係3，且 ΝΗΤ20係藉由其末端α -胺基共價键結之Τ20多肽。 如上所述，本發明之聚乙二醇Τ20化合物係將Τ20之α -胺基以共價方式键結至具有特殊結構之聚乙二醇衍生物 上。可以任何所需要的方式製造聚乙二醇化合物，但一般 86595 -14- 200416225 係將T20與個別製備之聚乙二醇衍生物反應而得。 可以任何合適之方式製備T20多肽。舉例而言，以採用

Boc-胺基酸之固相法（Chem· s〇c.，85, 2149，1963)相關之經 典梅裏菲爾德（Merrifield)固相合成技術合成該合成物，其 藉由使用手動或自動作業、使用Fm0C-胺基酸之固相法 (Sheppard，R.C·等人，J· Chem· Soc· Chem· Comm·，ρρ· 165- 166(1985))、使用自 Advanced Chemtech·，Louisville，Ky.獲 得之 Advanced Chemtech模型 200、使用自 Millipore，Bedford

Mass獲得之Millipore 9050+或其它合適之儀器完成。 將編碼本發明之CDNA合成物結合至具有功能性之病毒 或環狀，體DNA載體中可製備T20。載體或質體用來轉染或 轉化經選擇之微生物，該等經轉化或轉染之微生物在有助 於表現經載體媒介的DNA序列之條件下培養，並自生長培 養基中分離所需之肽即可完成（參見，舉例而言，美國專利 案弟5,955,422號’该案之全文以引用的方式併入本文參 考）。 亦可使用技藝中所熟知之方法以標準重組DNA技術製備 丁20。舉例而言’該等方法闡釋於Sambrook等人之「分子選 殖·貫驗立手冊」（Molecular Cloning: A Laboratory Manual， 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·)或Ausubel等人之「分子生物學之當前方案」（Current

Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New

York (1995))中，二者均以引用的方式併入本文參考。 製備T20之一特定方法揭示於美國專利案第6,〇15,881號 86595 -15 - 200416225 中，該案以引用的方式併入本文參考。 在切除及去保護後，可以任何合適方式純化T20。舉例而 言，離子交換、凝膠過濾層析及/或反相管拄/HPLC系統均 可用於透過丁20片段純化全長之T20。在首先製備T20前驅 體的情況下，可利用已知的技術將結合至其N-端（例如醯基） 及/或C-端（例如胺基）的阻斷/保護基團之一或二者去除。 使用標準胺基酸分析及手動及自動埃德曼（Edman)分解 與測定每一胺基酸來驗證及鑑定T20之胺基酸序列。HPLC 分析及質譜法亦可用於驗證T20之產生。 亦可以任何所要的方法製備與T20反應之聚乙二醇醛化 合物。然而，較佳者係根據於2002年7月24日以「聚乙二醇 醛」之名稱同時申請之美國專利申請案第60/398,196號之方 法製造聚乙二醇，該專利案全文以引用的方式併入本文參 考。 一般而言，式（II)之聚乙二醇醛可將T20聚乙二醇化： 〇

II

Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-CKCH2)m-C-NhHCH2)p-CH〇（N) 其中Ri、m、η及p係如上文定義。將T20聚乙二醇化所用之

I 聚乙二醇醛可藉由任何合適方式製備。一個較佳聚乙二醇 醛係如下製備： 86595 -16- 200416225 mPEGioK -丁鮮酸之反應示意圖

4-胺基丁醛二乙基縮醛

1-羥基苯并三峻/ 二環己基碳二亞胺 ⑷

h3c

(OChtCK3)2

10% CF3COOH

(5)

H3c

第三丁醇鉀 〇Λ π 溴乙酸第三丁酯 不同大小（例如，不同η值）之聚乙二醇醛皆可根據上述通 用反應示意圖製備。 本發明之聚乙二醇Τ20化合物可藉由任何合適之方式製 備。然而，本發明進一步提供將Τ20多肽聚乙二醇化之方

I 法，其包含將Τ20多肽（ΝΗΤ20)與式（II)之聚乙二醇醛反應， 〇

II

Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH^(CH2)p-CHO (II) 其中Ri、m、η及p係如上文之定義； 以生成式（I)化合物：

Rr(CH2CH2O)n^CH2CH2.〇-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CH2-NHT20 (I) 86595 -17 - 200416225 其中聚乙二醇醛分子键結至T20多肽之N-端胺基。 加入1:1至1:1 00莫耳比範圍之T20及PEG試劑以製備聚乙 二醇T20。如上所述，T20有一游離α-胺基（任何醯基已被去 除）及一游離羧基或一胺基保護之羧基。在室溫或4°C及介 於5.5至7.4間之pH值下，將該反應混合物置於硼酸、磷酸 或tri緩衝液中約0.5至24小時。PEG試劑與肽/蛋白之莫耳比 介於1:1至100:1之間。肽/蛋白之濃度介於1至10毫克/毫升 之間。緩衝液之濃度通常為10至500 mM。 藉由提取聚乙二醇T20之反應化合物並用平衡緩衝液（20 mM Tris，pH 7.5)將其稀釋，以純化聚乙二醇T20。然後將 所得混合物施於Q-瓊脂糖凝膠（Q-Sepharose)管柱上。在將 該混合物施加至QA管柱上後，分別用經75 mM NaCl沖堤之 平衡緩衝液、經200 mM NaCl沖堤之平衡緩衝液、經1 Μ NaCl沖堤之平衡緩衝液洗滌；並用1 M HOAC+l M NaCl及 0·5 M Na〇H再生。 使用反相HPLC，可輕易地使混合物中之N-端單聚乙二醇 產物與其他副產物分開及分離。 在本發明聚乙二醇T20多肽之較佳具體實施例中，p係3， R!係甲氧基，m係1，且η介於100至750之間；或p係2，R! 係甲氧基，m係1，且η介於100至75 0之間；或ρ係1，R!係甲 氧基，m係1，且η介於100至750之間。 本發明亦提供具有下式之聚乙二醇Τ20多肽： CH3-〇-(CH2-CH2-〇)n-CHrCH2-O-CHrCHrCH2-NHT20 (II!) 其中η介於10至1，000之間，及NHT20係藉由其末端α -胺基 86595 -18- 200416225 η約為225，舉 饧鍵結< 丁2〇多肽。在一個具體實施例中 例而言，η為227。 孩禾乙二醇丁2〇多肽 何所需要之方式製造，較佳 地’其係以實例3中所述之方法製造。 式=::=合:包含與醫藥上可 ^ ^ ν ^ > Τ -Κ ] ΠΊ、Π 、Γ)另 » Ρ及ΝΗΤ20係如上文之定 ::聚乙二醇Τ20多肽或其鹽類之本發明醫藥組 =何所需要之方式製造，例如，藉由慣用之混合法、包 兮等醫=法、顆粒化法、乳化法、包埋法或冷東乾燥法。 =醫樂製劑可與醫療學上為惰性之無機或有機賦形劑及 載_配之。適合注射用之賦形劑包括水、乙醇、多元醇、 甘油、植物油、磷脂及表面活性劑。 Μ :醫藥製劑斫可含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕 、礼化』甜味劑、著色劑、墙味劑、用於改變滲透壓 〈鹽類、緩衝劑、塗布劑或抗氧化劑。其亦可含有其他治 療上有價值之物質，包括另外之活性成分。 〔用於非、L腸(包括皮下、肌肉、靜脈内、皮内、氣管内 ^請外）投藥之調配物可方便地以單位劑量形式呈現，且 。由熱知之醫藥技術製備。該等技術包括使聚乙二醇Τ]。 多醫藥載劑或賦形劑結合之步驟。一般而t，該調配 :可藉由使聚乙二醇T2〇多肽與液體載劑均勻及充分結合 =備。適用於非經腸投與之調配物包括：含水及無水之 、菌/王射液’其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑及可使 ㉝配物與預期接受者之血液等渗之溶解物；及含水和無水 86595 -19- 200416225 之懸浮液’其可包括懸浮劑及增稠劑。該調配物可以單位 劑量或多劑量容器形式呈現，舉例而言，密封之安瓿及小 瓶’且其可儲存於冷凍乾燥（凍乾）之條件下且僅需要在使用 則加入用於注射之無菌液體載劑，舉例而言，水。 車乂佳單位劑量調配物係彼等含有投與成份之日劑量或單 位、日分次劑量（如上文所述）或其一適宜部分者。 車乂佳地，遠聚乙二醇T2〇多肽為單位劑量形式。本文所用 「單位劑量形式」意指適於單劑之聚乙二醇Τ20多肽之含 量，係以預先量測及/或預先包裝之形式呈現，此可方便地 製備適於投與之聚乙二醇Τ2〇多肽，且甚至可允許患者自行 投藥。眾單位劑量含量顯然端視欲傳送之聚乙二醇τ2〇多肽 之含量及投與頻率而定。 、聚乙一醇Τ20夕肽亦可為單位劑量之冷凍乾燥粉末形 式，其適用於在投藥前與醫藥上可接受賦形劑進行復水作 用。 本發明《一特殊醫藥組合物包含與醫藥上可接受賦形劑 混合之式⑴化合物（其中Ri係甲氧基，111係ι，η介於丨〇〇至 之間，且ρ係3)。 .本發明之另-醫藥組合物係包含與醫藥上可接受之賦形 劑混合之式（III)化合物（其中η介於⑺至丨力⑻之間，且 ΝΗΤ20係藉由其末端α _胺基共價鍵結之丁2〇多肽）。在一個 具體實施例中，η約為225,舉例而言，ηΛ 227。 本發㈣一步提供抑制HIV感染之方法，其包含投與患者 包含與醫藥上可接受賦形劑混合之式⑴化合物（其中Κι、 86595 -20- 200416225

Up及NHT20係如上文之定義）之醫藥組合物。 (未聚乙二醇化之）T20多肽之當 與方式投與1而’可加以修飾以利用聚乙二醇咖 夕肽之改良藥物動力學特性。 在本發明之抑細V之方法中，該醫藥组合物可以任何合 投與n佳方法中’聚乙二醇τ对肤以 :射液或懸浮液之形式投與。該注射液或懸浮液較佳藉由 皮下注射或經靜脈投與。 ^ 較佳方法中，永乙二醇Τ20多肽係藉經皮傳遞裝置 投與’例如，經皮貼片。 在本發月抑制HI V之方法中，該醫藥組合物可以任何合適 之劑量及療程投與。本發明之醫藥組合物可以所需要之任 :形式及藉由任何途徑投與。然而，一般而言，本發明之 聚乙二醇T2G多肽以非經腸方式投與，舉例而言，以注射液 形式投與。 ’口療有效I m、為熟習此項技藝者所熟知，且根據 發月之永乙一醇T20多&之治療有效量或劑量可變化，且 其在每一特定案例中可根據個體需求調整。一般而言，约 70 a斤重成人以非經腸方式投藥狀況而言，日劑量約$毫克 =約3〇〇毫克為宜，較佳約5。毫克至約200毫克為宜，：當 而要時可超出該上限。可以單劑、分次劑量或連續輪注形 式投與劑量，可採每日投藥，較佳地為每週投藥方式。 ^發明亦提供—抑制HIV感染之方法，其包含投與包含與 醫樂上可接受賦形劑混合之式⑴化合物(其中R,係曱氧 86595 -21 - 200416225 基、’ "t1、，n介於100至750之間，且P係3)之醫藥組合物。 亦Λ皿於本發明（範圍中者為抑制贈感染之方法，其勺 含投與包含與醫藥上可接受賦形劑混合之式_之化合: (其中η介於1〇至1，_之間，_^ΝΗτ2()係藉由其末端“ _胺其 共價鍵結之Τ20多肽)之醫藥組合物。在一個具體實施： 中’ η約為225 ’舉例而言，ng 227。 【實施方式] 下述實例係用以進一步閣釋本發明之化合物、組合物及 方法。該等實例僅用於舉例說明之目的，而非以任何方式 限定本發明之範圍。 實例1 EI.Q.10K- 丁醇醛夕率備 將溶於240毫升甲苯分子量為1〇,〇〇〇之mpEG(3〇〇克，3毫 莫耳）加熱回流2小時共沸乾燥，隨後去除丨2〇毫升甲苯。將 所得溶液冷卻至室溫，然後在該PEG溶液中加入溶於2〇毫 升無水第三-丁醇及20毫升甲苯中之第三·丁醇鉀（0·68克，6 毫莫耳）。在氬氣中於室溫下，攪拌2小時所得混合物。溴 代醋酸第三-丁酯（1·〇〇毫升，6.75毫莫耳）藉由注射器加入該 反應液中，並在氬氣中於室溫下隔夜攪拌該反應液。然後， 以旋轉蒸發濃縮該反應液，加入二乙醚沈澱殘餘物，過濾 出所沉殿的mPEG10K叛甲基醚第三丁酯並真空乾燥。產率： 28 克。NMR (d6-DMS〇）： 1.40 ppm (t，9H，-CH3); 3·21 ppm (s， -〇CH3); 3·50 ppm (s，-〇-CH2CH2-〇-); 3 96 ppm (s，2H， -0-CH2-C〇〇-)。 86595 -22- 200416225 然後將mPEG10k羧甲基醚第三丁酯（265克）溶解於35〇毫 升1 N氫氧化鈉中，並在室溫下隔夜攪拌該溶液。加入6 n 鹽酸調節該混合物之pH至2·5，並用二氯甲烷萃取該混合 物。有機層經硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮並在二乙醚中沈澱。 過滤收集產物m-PEG1QK-羧甲基酸並真空乾燥。產率：24 克。NMR (d6-DMS〇）： 3.21 ppm (s，-〇Ch3); 3.5 ppm (s， -〇-CH2CH2-〇-); 3.99 ppm (s，2H，-〇-CH2-COOH)。 然後將mPEG1GK-羧甲基酸（6克，〇·6毫莫耳）溶解於無水二 氯甲烷（30毫升）中，隨後加入心胺基丁醛二乙基縮醛（14〇毫 升，0.9¾莫耳）、1-羥基苯并三唑（8〇毫克，〇·6毫莫耳）及二 環己基碳二亞胺（160毫克，〇·78毫莫耳），在氬氣中於室溫 下隔夜攪拌該混合物，將反應混合物過濾、濃縮，並用2_ 丙醇與二乙醚（1:1)之混合物沈澱。mPEGiGK-丁醇縮醛產物 隔也真空乾燥。產率· 5.4克。NMR (d6-DMSO): 1.07-1.12 PPm (t，6H，（-0-CH2-CH3)2); 1.46 ppm (m，4H，-NHCH2CH2 CH2-CH_); 3.08-3.11 ppm (q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-); 3.21 ppm (s，-〇CH3); 3.5 ppm (s，-0-CH2CH2-〇-); 3.85 ppm (s，2H，-〇-CH2-CO-NH-);4.44ppm(t，lH，-NHCH2CH2CH2- CH-); 7.67 ppm (-NH-)。 然後將mPEG1GK - 丁醇縮酸（2克，〇·2毫莫耳）溶解於2〇毫升 80。/。之CFWOOH中，且於室溫下隔夜攪拌該溶液。加入1 N Na〇H溶液將混合物之pH值調節至6.0，加入氯化鈉（i〇%重 量比），然後加入1 N NaOH將溶液之pH值調節至7.〇。以二 氣甲烷萃取該混合物。有機層經硫酸鈉乾燥、過遽、濃縮， 86595 -23- 200416225 並在二乙醚中沈澱。過濾收集產物mPEG!〇K-丁醇醛，並在 真空中乾燥。產率：1·7 克。NMR (d6-DMS〇）： 3.21 ppm (s5 -OCH3)； 3.5 ppm (s? -0-CH2CH2-0-); 3.85 ppm (s, 2H5 -0-CH2-CO-NH-); 7.67 ppm (-NH-); 9.66 ppm (-CHO-)。 實例2 使用PEGmk-丁醇醛使T20聚乙二醇化 以每一莫耳T20比5莫耳試劑之莫耳比例，將分子量為1 0 kDa之丁醇醛PEG(得自實例1)加至溶於3.0毫升缓衝液（50 mM磷酸鉀，pH值6.5)之15毫克T20(純度93.7%)中。T20多 肽的α-胺基端脫去醯基，但其羧基端以-ΝΗ2保護。將10%(體 積比）之0.5 Μ氰基硼氫化鈉之水溶液加至反應混合物中， 並在室溫下攪拌4小時。利用離子交換層析法（QA)純化反應 混合物中的聚乙二醇Τ20。以溶於20 mM Tris，pH 7.5之150 mM至1 M NaCl之漸增鹽濃度線性梯度將聚乙二醇T20與未 經修飾之T20分離。 實例3 使用mPEGi〇K-丙醛使T20聚乙二醇化 使用具有分子量為10 kDa之下列結構PEG之丙醛。

CH3-〇"(CH2-CH2"0)227"CH2*CH2"〇"CH2~CH2"CHO 以每一莫耳T20比5莫耳試劑之莫耳比例，將150毫克 mPEG 10k-丙酸加至溶於3.0毫升緩衝液（50 mM稱酸卸， pH6.5)中之15毫克T20(純度93.7%)中。T20多肽的α-胺基端 脫去醯基，但其羧基端以-νη2保護。 將10%(體積比）之0.5 Μ氰基硼氫化鈉水溶液加至該反應 86595 -24- 200416225 混合物中，益在室溫下攪拌4小時。利用離子交換層析法（QA) a 取，-岭T 9。。該聚乙'一鮮T2 0多月太之 純化反應混合物中的水乙一知丁Μ 結構如下： CHr〇-(CH2-CH2-〇)n-CHrCH2^CHrCHrCH2-NHT20 (III) 以溶於2〇mMTds，pH值7_5之15〇mM至1 MNaCl之漸增 鹽濃度線性梯度將聚乙二醇T20與未經修飾之720分離。 實例4 聚乙二醇Τ20之抑制劑濃-度- 通常分別以抑制50%或90%之病毒生長所需藥物濃度之 IC5 0或IC90量度來定量測定外表型易感性。 使用PEG10K-丙醛之聚乙二醇丁2〇(實例3)及使用 mPEG1QK-丁醇醛之聚乙二醇丁20(實例2)之抑制劑濃度50及 抑制劑濃度90結果重述於下表1中。_ ___ 聚乙二醇T20 IC50 (μβ/ηιΐ) IC90 (pg/ml) 使用PEG10K-丙醛之聚乙二醇丁 20(實例3) 0.261 3.074 使用mPEG1()K-丁醇醛之聚乙二醇T20(實例2) 0.266 2.536 表1 ··抑制劑濃度50及抑制劑濃度90結果。 IC50及IC90數值係根據實例5確定。 實例5 cMAGI/MAGI抗病复分析 該等分析係使用指標細胞株MAGI(半乳糖苷酶指標劑之 多核活化作用）或CCR5-表現衍生物cMAGI來評價感染性病 毒效價之降低量。MAGI細胞株衍生自親代HeLa細胞，其係 86595 -25- ^00416225 以兼嗜性逆轉錄病毒載體引入CD4基因及HIV-1 LTR-驅動 之 b-gal報告基因後獲得（Kimpton J，Emerman M，J Virol 66: 2232-9, 1992)，cMAGI細胞株衍生自MAGI細胞株，其係以 兼嗜性逆轉錄病毒載體（PA317)引入CCR5基因後獲得 (Chackerian B，Long EM, Luciw PA，Overbaugh J，J Virol 71:3 93 2-9, 1 997)。cMAGI細胞可輔助原始NSI(R5)分離株及 實驗室用X4病毒之複製作用，而MAGI細胞則僅輔助X4病 毒之複製作用。兩種細胞株均利用HIV-1 tat的能力以反向 激活由HIV-LTR驅動之b-半乳糖苷酶報告基因之表現。 b-gal報告基因已經修飾定位於核中，且在感染幾天内，可 利用X-gal底物作為強化核染色予以偵測。若在染色前僅有 一輪感染，則經染色之核之數量可解釋為等於激發接種物 中感染性病毒顆粒之數量。 感染後24小時加入感染及細胞-細胞融合抑制劑，例如， T20或 T1249(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 9:1 05 1 - 3，1 993)，藉以獲得確切代表單獨 一輪感染之讀數。使用CCD-圖像儀計數感染的細胞，且原 始分離株及實驗室用分離株兩者在病毒輸入量及圖像儀上 所見之感染細胞數量之間均呈現線性關係。在MAGI及 cMAGI分析中，感染效價明顯降低50%(Vn/Vo = 0.5)，且其 可提供用於評價抗病毒活性之原始截距值。感染效價降低 90%(Vn/Vo)可用作評價抗病毒活性之另一截距值。 48孔微量滴定盤中的病毒接種物調節至約1500-2000感 染細胞/孔，每一測試化合物稀釋液均針對一病毒接種物檢 86595 -26- 200416225 測兩次。將測試化合物加至cMAGI或MAGI細胞中，隨後加 入病毒接種物，24小時後，加入感染及細胞-細胞融合抑制 劑（Wild C，Greenwell T，Matthews T5 AIDS Res Hum Retroviruses 9:105卜3，1993)，以阻止繼發性感染及細胞· 細胞病毒擴散。將細胞再培養2天、固定並用X_gai受質染 色以檢測感染細胞。用CCD-圖像儀測定每一對照組及測試 化合物稀釋液之感染細胞之數量。IC5〇定義為減少5〇%感 染性病毒效價之測試化合物之稀釋量。IC90定義為減少 90%感染性病毒效價之測試化合物之稀釋量。 很明顯，經闡釋之本發明具有多種變化，該等變化不應 視為偏離本發明之主旨及範圍，且所有該等變化皆欲包括 於下述申請專利範圍之範圍内。 86595 27- 200416225 序列表 <11〇>派司克赛巴司登貝隆 王棲佑 <120〉 聚乙二醇T20多肽

<130> 21328US <140〉 092119716 <141〉2003-07-18 <150> US 60/398,195 <151〉2002-07-24 <160〉 1 < 170> Patentln Version 3.1 <210〉 1 <211> 36 <212〉PRT <213〉人工 <220〉 <223> 多肽序列經合成方法衍生 <220〉 <221〉MOD—RES <222> (36)..(36) <223〉36號殘基視情況可用胺基修飾 <400> 1 jyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn 1,5 10 Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35

Gin 15 Ser

Gin

Leu 86595

Claims (1)

1. 0 0 200416225 拾、申請專利範圍： 1. 一種式（I)化合物： Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-〇-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT20 (I) 其中： R1係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，〇〇〇之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ20係藉由其末端α -胺基共價鍵結之丁20多肽。 2·如申請專利範圍第i項之化合物，其中心係選自由卣素、 環氧化物、馬來酿亞胺、鄰说淀基二硫化物、甲基績酿 基、異散酸基、水合耕、氰尿醯鹵化物、N-琥拍酸亞胺 基氧基、硫代-N-琥ϊ自疏亞胺基氧基、1-苯并三吨基氧基、 咪嗤基氧基、對-硝基苯基氧基及 Ο 〇 II -CH2CHr〇-(CH2)m-C-NH-(CH2VCHO 所组成之群。 3.如申請專利範圍第1項之化合物，其中ρ係3。 4·如申請專利範圍第1項之化合物，其中ρ係3，&係甲氧 基，m係1，且η介於100至750之間。 5· —種式（III)化合物： CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-〇-CH2-CH2-CH2-NHT20 (111) 其中η介於10至1，〇〇〇之間，且NHT20係藉由其末端^胺 基共價键結之Τ20多肽。 86595 200416225 6. —種醫藥組合物，其包含與一醫藥上可接受賦形劑混合 之式（I)化合物： 0 II R1-(CH2CH2O)n^CH2CH2-O-(CH2)m-C-NH^(CH2)p-CH2-NHT20 (I) 其中： RHf、一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ20係藉由其末端α -胺基共價鍵結之Τ20多肽。 7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中ρ係3，Ri係甲 氧基，m係1，且η介於100至750之間。 8. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其形式為冷凍乾燥 粉末。 9. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其形式為注射液或 懸浮液。 10. —種包含與一醫藥上可接受賦形劑混合之式（I)化合物之 醫藥組合物之用途， 0 II Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT20 (I) 其係用以製備抑制HIV感染之藥物， 其中： 心係一封端基團； m介於1至17之間； 86595 -2- 200416225 η介於10至1，000之間； p介於1至3之間；且 NHT20係藉由其末端α -胺基共價键結之T20多肽。 11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該醫藥組合物每曰 投藥含量約50毫克至約200毫克。 12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該醫藥組合物每週 單劑投藥含量約300毫克至約1500毫克。 13· —種包含與一醫藥上可接受賦形劑混合之式（I)化合物之 醫藥組合物之用途： 0 II Rr(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT20 (I) 其係用以製備抑制HIV感染之藥物， 其中： I係甲氧基； m係1 ; η介於100至750之間； ρ係3 ;且 ΝΗΤ20係藉由其末端α -胺基共價键結之Τ20多肽。 14· 一種將聚乙二醇分子結合至Τ20多肽之方法，其包括將 Τ20多肽與下式之聚乙二醇醛反應： 〇 II Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CHO 其中： Ri係一封端基團； 86595 200416225 m介於1至17之間； η介於10至1,000之間；且 ρ介於1至3之間； 藉以生成式（I)化合物： Rr(CH2CH2〇)n"CH2CH2O^(CH2)m-CO^NH^(CH2)p-CH2-NHT20 其中聚乙二醇醛分子係键結至T20多肽之N-端胺基。 86595 4- 200416225 柒、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   〇 丨丨 Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT20 (I)

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