CN1362966A - 假单孢菌素酰胺和酯类似物 - Google Patents

假单孢菌素酰胺和酯类似物 Download PDF

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S·L·赫尔曼
J·L·克尔斯特南斯基
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孙喜成
A·Y·乌斯亚廷斯基
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Abstract

本发明涉及天然或半合成假单孢菌素化合物的天冬氨酸和/或羟基天冬氨酸单元的酸修饰,以及抗真菌活性治疗的方法。

Description

假单孢菌素酰胺和酯类似物
                     发明领域
本发明涉及假单孢菌素(pseudomycin)化合物，特别是酸修饰的半合成假单孢菌素化合物。
                     发明背景
假单孢菌素是从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae，与植物有关的细菌)的液体培养物中分离出的天然产物，并且已表明有抗真菌活性(参见Harrison，L.等人，“假单孢菌素，一族得自丁香假单胞菌的具有广谱抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)以及美国专利5,576,298和5,837,685)。与以前描述过的得自丁香假单胞菌的抗霉菌剂(例如丁香霉素、丁香毒素和丁香抑制素)不同，假单孢菌素A-C含有羟基天冬氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、脱氢氨基丁酸、赖氨酸和二氨基丁酸。
假单胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相应于具有末端羧基的L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，该羧基在N-末端Ser的OH上将大环闭合。这些类似物的区别在于N-酰基侧链，即假单孢菌素A被3，4-二羟基十四烷酰基N-酰化，假单孢菌素A’被3，4-二羟基十五烷酰基N-酰化，假单孢菌素B被3-羟基十四烷酰基N-酰化，假单孢菌素B’被3-羟基十二烷酰基N-酰化，假单孢菌素C被3，4-二羟基十六烷酰基N-酰化，假单孢菌素C’被3-羟基十六烷酰基N-酰化(参见Ballio，A.，等人，“得自丁香假单胞菌的生物活性脂缩肽：假单孢菌素，”FEBS Letters，355(1)，96-100，(1994)和Coiro，V.M.，等人，“使用得自NMR数据的几何位距和分子动力学通过计算机模拟确定的丁香假单胞菌MSU16H植物毒性脂缩肽假单孢菌素A的溶液构象，”Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456(1998))。
已知假单孢菌素具有一些不利的生物作用。例如，当静脉内施用假单孢菌素时，已观察到了其破坏静脉的内皮、破坏组织、炎症、和对宿主组织的局部毒性。因为假单孢菌素具有得以证实的抗真菌活性和相当多未研究的化学特性，所以需要研究这类化合物以找到可用作具有较少不利副作用的抗真菌剂的其它潜在化合物。
                    发明概述
本发明提供了可用作抗真菌剂或者可用于设计抗真菌剂的下述结构所代表的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，
Figure A0081033000201
其中R是
Figure A0081033000202
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键，或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是
Figure A0081033000212
其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且
m是1、2或3；R是其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1独立地为-NH2或-NHp-Pg，其中p是0或1；R2和R3独立地为-OR2a、或-N(R2b)(R2c)，其中
R2a和R2b独立地为氢、C1-C10烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等)、C3-C6环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、环戊基甲基、甲基环戊基、环己基等)、卤代烷基(例如CF3CH2-)、羟基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基(例如甲氧基乙基)、烯丙基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基(例如苄基)、杂芳基(C1-C10)烷基(例如3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基)、或环杂烷基(C1-C10)烷基(例如N-四氢-1，4-恶嗪基乙基和N-哌嗪基乙基)，或者
R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基(例如-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(对羟基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-或5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2等)，且
R2c是氢或C1-C6烷基，条件是R2和R3都不是-OH。
在另一个本发明实施方案中，提供了具有上述结构I的假单孢菌素化合物的前药，其中R2和R3是-OR2a，其中R2a是C1-C3烷基。
在另一个本发明实施方案中，提供了假单孢菌素化合物的3-酰氨基衍生物，其中该化合物是通过下述步骤制得的：(i)提供其中R1是-NH2、且R2和R3都是-OH的具有上述结构I的化合物；(ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护；(iii)使用邻苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐作为偶联剂在3位形成酰胺键；和(iv)除去所述的氨基保护基。除了使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联剂外，采用上述步骤还可以提供8-酰氨基衍生物。
在另一个本发明实施方案中，提供了药物制剂，其中包含上述结构I所代表的假单孢菌素化合物和可药用载体。
在另一个本发明实施方案中，提供了在动物中治疗抗真菌感染的方法，包括给所述动物施用上述假单孢菌素化合物I。
                          定义
除非另有说明，本文所用术语“烷基”是指含有1-30个碳原子的通式CnH2n+1烃基。烷基可以是直链烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)、支链烷基(例如异丙基、异丁基、叔丁基、新戊基等)、环状烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、甲基环戊基、环己基等)、或多环烷基(例如二环[2.2.1]庚烷、螺[2.2]戊烷等)。所述烷基可以被取代或未取代。类似地，烷氧基、烷酰基或烷酸酯的烷基部分具有与上述相同的定义。
术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的无环烃。烯基可以呈直链、支链、环状、或多环。烯基可以被取代或未取代。烯氧基、烯酰基或烯酸酯的烯基部分具有与上述相同的定义。
术语“炔基”是指含有至少一个碳碳三键的无环烃。炔基可以呈直链或支链。炔基可以被取代或未取代。炔氧基、炔酰基或炔酸酯的炔基部分具有与上述相同的定义。
术语“芳基”是指具有单环(例如苯基)或稠合环系(例如萘、蒽、菲等)的芳族基团。所述芳基可被取代或未取代。
术语“杂芳基”是指在芳环系内含有至少一个杂原子的芳族基团(例如吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、噁嗪、嘧啶、嘌呤、苯并咪唑、喹啉等)。该芳族基团可由单环或稠合环系构成。杂芳基可以被取代或未取代。
“NHp-Pg”和“氨基保护基”是指当化合物上的其它官能团反应时通常用来阻断或保护氨基官能团的氨基取代基(Pg)。当p是0时，氨基保护基可以与其所连接的氮形成环亚酰胺例如邻苯二甲酰亚胺和四氯邻苯二甲酰亚氨基。当p是1时，保护基可以与其所连接的氮形成氨基甲酸酯，例如甲基、乙基和9-芴基甲基氨基甲酸酯；或酰胺，例如N-甲酰基和N-乙酰基酰胺。
在有机化学领域内，特别是在有机生物化学领域内，众所周知有效取代的化合物是可耐受或甚至有用的。在本发明中，例如，术语烷基包括作为标准烷基的取代基例如甲基、乙基、丙基、己基、异辛基、十二烷基、十八烷基等。术语“基团”特定涉及并包括烷基上的本领域常用取代基，例如羟基、卤素、烷氧基、羰基、酮基、酯、氨基甲酸酯等，并包括未取代的烷基。然而，本领域技术人员通常知道，应当选择取代基以不给化合物的药理特征带来不利影响或者不有害地干扰药物的应用。对于任意上文定义的基团，合适的取代基包括烷基、烯基、炔基、芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、一-和二烷基氨基、季铵盐、氨基烷氧基、羟基烷基氨基、氨基烷硫基、氨基甲酰基、羰基、羧基、羟乙酰基、甘氨酰基、肼基、脒基、和它们的组合。
术语“溶剂化物”是指包含一个或多个溶质分子例如结构I化合物分子和一个或多个可药用溶剂分子例如水、乙醇等分子的聚集体。
术语“可药用盐”是指在施用剂量下对接受者基本上无毒的结构I化合物的有机或无机盐。
术语“前药”是指在体内由于被代谢过程(例如生物转化)转化而产生药理作用的一类药物。在本发明中，假单孢菌素前药化合物包含可被血浆中的酯酶裂解而生成活性药物的酯官能团。
术语“动物”是指人、宠物(例如狗、猫和马)、食物供应动物(例如牛、猪、绵羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类以及其它类似种属动物。
                             发明详述
本申请人已经发现，通过修饰连接在假单孢菌素天然产物或半合成衍生物的羟基天冬氨酸和/或天冬氨酸单元上的酸官能团，体外实验表明新化合物可有效地抗白色念珠菌(C.albican)、新型隐球酵母(C.neoformans)和/或烟曲霉(A.fumigatus)。已经发现，某些二酯能起前药的作用；因此，这些特定化合物具有降低的体外活性，但是表现出体内效力。
下述合成方案I表示的是从任一种天然假单孢菌素或N-酰基修饰的衍生物合成化合物I的一般方法。通常使用三个合成步骤来制备化合物I：(1)选择性地氨基保护；(2)与适当醇或胺缩合以分别生成酯或酰胺；和(3)将氨基脱保护。
Figure A0081033000251
                      合成方案I
可使用本领域技术人员已知的保护氨基的标准方法将在残基2、4和5上的侧链氨基保护。所用的氨基保护基的特定种类不是至关重要的，只要是在随后于中间体分子的其它位点上进行反应的条件下其保持稳定，并且可在适当位点选择性地除去、同时又不断裂包括其它氨基保护基在内的分子的其余部分即可。优选的氨基保护基是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙氧基羰基、邻苯二甲酰亚氨基、和苄氧基羰基(CBZ)。最优选的是烯丙氧基羰基(Alloc)和苄氧基羰基(CBZ)。合适的保护基的其它实例描述在T.W.Greene，“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)”John Wiley andSons，New York，N.Y.，(2nd ed.，1991)，第7章。
可使用本领域技术人员众所周知的标准酯化方法形成酯基。在酸性条件下酯化一般包括在质子酸(例如HCl、TFA、对甲苯磺酸等)存在下将假单孢菌素化合物溶于或悬浮在适当醇中。在碱性条件下，一般是在弱碱(例如无水条件下的碳酸氢钠)存在下将假单孢菌素化合物与适当的烷基卤反应。
酰氨基的形成可使用本领域技术人员众所周知的标准酰胺化方法来实现。然而，要选择偶联剂来选择性地修饰酸基团。例如，使用苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)作为偶联剂使得能够同时分离出纯的在残基8的单酰胺和(在有些情况下)纯的二酰胺。然而，偶联剂例如邻苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)有利于形成在残基3的单酰胺。
本申请人还发现，加入庞大的胺能提高在残基3的单酰胺的比例。通过加入庞大的胺，在残基3上酰胺化与在残基8上酰胺化的比例从约1∶1提高至约6∶1，并且降低了二酰胺的量。术语“庞大的胺”是指在氮原子上具有多个和/或大取代基的胺。可使用与反应条件相容的任何叔胺。优选的庞大的胺包括N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)和N-乙基二环己基胺。庞大的胺的加入量一般为约1-10当量、优选3-8当量、更优选5-6当量。该反应一般在约室温(25℃)-约-20℃进行。然而，本申请人发现，低温(约0℃-约-20℃)能进一步提高在残基3上形成单酰胺。通过加入庞大的胺并降低反应温度，在残基3上酰胺化与在残基8上酰胺化的比例提高至20∶1。然而，本领域技术人员应该知道，低温限度将取决于反应组分的溶解度。
一旦酸基团被修饰，即可以使用适于所用的特定保护基的标准方法除去所述的氨基保护基(在2、4和5位)。例如，CBZ基团可通过在氢化催化剂(例如10％Pd/C)存在下氢化来除去。当氨基保护基是烯丙氧基羰基时，该保护基可通过使用氢化三丁基锡和二氯化三苯基膦钯来除去。该特定保护/脱保护方案的优点在于降低了假单孢菌素结构的Z-Dhb单元的乙烯基被氢化的可能性。
如上所述，假单孢菌素是从丁香假单胞菌分离出的天然产物，并且其特征在于，它是含有被内酯键闭合的环肽部分，并包含特殊氨基酸例如4-氯苏氨酸(ClThr)、3-羟基天冬氨酸(HOAsp)、2，3-去氢-2-氨基丁酸(Dhb)、和2，4-二氨基丁酸(Dab)的脂缩肽。下文描述了生长不同丁香假单胞菌的菌株以制备不同假单孢菌素类似物(A、A’、B、B’、C、和C’)的方法，并且在Hilton等人于2000年4月14日提交的名称为“由丁香假单胞菌制备假单孢菌素”的第PCT/US00/08728号PCT专利申请、Kulanthaivel等人于2000年4月14日提交的名称为“假单孢菌素天然产物”的第PCT/US00/08727号PCT专利申请、以及美国专利5,576,298和5,837,685中对此作了更详细的描述，这4篇专利文献都引入本发明以作参考。
产生一种或多种假单孢菌素的分离出的丁香假单胞菌菌株是本领域内已知的。下述文献中描述了野生型菌株MSU 174和通过转座子诱变生成的该菌株的突变型MSU 16H：美国专利5,576,298和5,837,685；Harrison，等人，“假单孢菌素，一族得自丁香假单胞菌的具有广谱抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-2865(1991)；和Lamb等人，“转座子诱变和荧光假单胞菌标记：抗真菌生成是控制Dutch elm疾病所必需的，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6447-6451(1987)。
适于制备一种或多种假单孢菌素的丁香假单胞菌菌株可从环境来源包括植物(例如大麦作物、柑橘作物、和丁香植物)以及来源例如土壤、水、空气和灰尘中分离得到。优选的菌株是从植物分离的。从环境来源中分离的丁香假单胞菌菌株可称为野生型。本文所用的“野生型”是指天然存在于标准丁香假单胞菌群体中的显性遗传型(例如天然发现并且不是由实验室操作制得的的丁香假单胞菌菌株或分离物)。象大多数生物体一样，所用的假单孢菌素制备培养物(丁香假单胞菌菌株例如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的特征可发生变异。因此，可通过本领域已知方法获得这些菌株的后代(例如重组物、突变体和变种)。
丁香假单胞菌MSU 16H可以以保藏号ATCC 67028从AmericanType Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA公众获得。丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1、和67 H1是在2000年3月23日由American Type Culture Collection保藏的，并且指定了下述保藏号：
25-B1    保藏号PTA-1622
7H9-1    保藏号PTA-1623
67H1     保藏号PTA-1621
丁香假单胞菌的突变体菌株也适于制备一种或多种假单孢菌素。本文所用的“突变体”是指在菌株表型中的突然可遗传的变化，这种变化可以是自发的，或者是通过已知的诱变剂例如放射(例如紫外放射或X-射线)、化学诱变剂(例如甲磺酸乙酯(EMS)、二环氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基鸟嘌呤(NTG)、和亚硝酸)、位点特异性诱变和转座子介导的诱变引起的。制备假单孢菌素的丁香假单胞菌突变体可通过用一定量能有效地产生下述突变体的诱变剂处理细菌而制得：即能过度地产生一种或多种假单孢菌素、相对于其它假单孢菌素过量产生一种假单孢菌素(例如假单孢菌素B)、或在有利的生长条件下产生一种或多种假单孢菌素。虽然所用的诱变剂的类型和量可以改变，但是优选的方法是将NTG系列稀释至1-100μg/ml的水平。优选的突变体是能过度产生假单孢菌素B、并在基本培养基中生长的突变体。
可选择环境分离物、突变体菌株、和其它所需的丁香假单胞菌菌株以获得所需的生长习性、生长培养基营养来源、碳来源、生长条件、氨基酸需求等的特征。优选地，选择制备假单孢菌素的丁香假单胞菌菌株以使其能在基本培养基例如N21培养基中生长和/或能产生水平大于约10μg/ml的一种或多种假单孢菌素。优选的菌株表现出这样的特征：当在包含3种或3种以下的氨基酸和任选的脂质、马铃薯产品或其组合的培养基中生长时，能产生一种或多种假单孢菌素。
重组菌株可通过使用本领域已知的方法转化丁香假单胞菌菌株而制得。通过使用重组DNA技术，可将丁香假单胞菌菌株转化以表达出除了这些菌株产生的抗生素以外的多种不同基因产物。例如，可修饰菌株以引入多个内源性假单孢菌素生物合成基因的拷贝，来获得更高的假单孢菌素产率。
为了从野生型或丁香假单胞菌的突变体菌株中产生一种或多种假单孢菌素，在搅拌下将生物体在包含有效量的3种或3种以下氨基酸，优选谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、或其组合的含水营养培养基中培养。或者，将甘氨酸与一种或多种马铃薯产品和脂质混合。在能有效地使丁香假单胞菌生长并且生成所需假单孢菌素的条件下进行培养。有效条件包括约22℃-约27℃的温度、和约36小时-约96小时的培养时间。在丁香假单胞菌的培养期间控制培养基中氧的浓度对于生成假单孢菌素是有利的。优选地，将氧水平保持在约5-50％饱和、更优选约30％饱和。用空气、纯氧、或包含氧的气体混合物吹扫可控制培养基中氧的浓度。
在丁香假单胞菌的培养期间控制培养基的pH也是有利的。假单孢菌素在碱性pH下不稳定，并且如果培养基的pH在大于约6的水平保持约12小时，则可发生显著的降解。优选将培养基的pH维持在6-4。当在分批培养物中生长时，丁香假单胞菌可产生一种或多种假单孢菌素。然而，分批补入或半连续补入葡萄糖和任选补入酸或碱(例如氢氧化铵)以控制pH能提高产量。通过使用其中自动补入葡萄糖和氢氧化铵的连续培养方法可进一步提高假单孢菌素产量。
选择丁香假单胞菌可影响所生成的假单孢菌素的量和分布。例如，菌株MSU 16H和67 H1分别主要生成假单孢菌素A，但是也生成假单孢菌素B和C，三者的比例通常为4∶2∶1。通常情况下，菌株67H1生成的假单孢菌素的水平比菌株MSU 16H生成的水平高约3-5倍。与菌株MSU 16H和67 H1相比，菌株25-B1生成更多的假单孢菌素B和更少的假单孢菌素C。菌株7H9-1的与众不同之处在于，其主要生成假单孢菌素B，并且假单孢菌素B的产量大于其它菌株。例如，该菌株生成的假单孢菌素B的量可比假单孢菌素A或C大至少10倍。
可通过本领域技术人员已知的任何不同方法检测、测定、分离和/或纯化各种假单孢菌素、假单孢菌素中间体和混合物。例如，肉汤或分离物或纯化的组合物中假单孢菌素活性水平可通过抗真菌例如假丝酵母属的抗真菌作用来确定，并且可通过高效液相色谱法分离和纯化。
或者，可由N-酰基半合成化合物形成酰氨基或酯衍生物。半合成假单孢菌素化合物可通过交换L-丝氨酸单元上的N-酰基来合成。各种N-酰基衍生物的实例描述在Belvo，等人于同一日期提交的名称为“假单孢菌素N-酰基侧链类似物”的第___号PCT专利申请中，该专利申请引入本发明以作参考。通常使用4个合成步骤来从天然假单孢菌素化合物制备半合成化合物：(1)选择性地保护氨基；(2)用化学或酶法将N-酰基侧链脱酰；(3)用不同侧链再酰化；和(4)将所述的氨基脱保护。在将氨基脱保护之前，可将天冬氨酸和/或羟基天冬氨酸单元修饰。
具有γ或δ羟基化侧链的N-酰基(例如3，4-二羟基十四烷酸酯)的脱酰可通过在含水溶剂中用酸处理氨基保护的假单孢菌素化合物来实现。合适的酸包括乙酸和三氟乙酸。优选的酸是三氟乙酸。如果使用三氟乙酸，该反应可在室温或接近室温的温度下完成。然而，当使用乙酸时，该反应通常在约40℃进行。合适的含水溶剂系统包括乙腈、水、及其混合物。有机溶剂能促进该反应；然而，加入有机溶剂可导致生成其它副产物。在侧链上没有δ或γ羟基的假单孢菌素化合物(例如假单孢菌素B和C’)可用酶方法脱酰。合适的脱酰酶包括多粘菌素酰基转移酶(164-16081 Fatty Acylase(粗产物)或161-16091 Fatty Acylase(纯)，得自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、或ECB脱酰酶。酶法脱酰可使用本领域技术人员众所周知的标准脱酰方法来完成。例如，使用多粘菌素酰基转移酶的一般方法可参见Yasuda，N.，等人，Agric.Biol.Chem.，53，3245(1989)和Kimura，Y.，等人，Agric.Biol.Chem.，53，497(1989)。
在羰基活化剂存在下，使用所需酰基的相应酸将脱酰产物(也称为假单孢菌素核)再酰化。“羰基活化基团”是指能促进在该羰基上进行的亲核加成反应的取代基。合适的活化取代基是对羰基有净吸电子作用的基团。这样的基团包括但不限于烷氧基、芳氧基、含氮芳香杂环、或氨基(例如羟苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯苯氧基、N-氧基琥珀酰亚胺、N，N’-二环己基异脲-O-基、和N-羟基-N-甲氧基氨基)；乙酸酯；甲酸酯；磺酸酯(例如甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、和对甲苯磺酸酯)；卤化物(例如氯化物、溴化物、和碘化物)。
在酰化方法中可使用多种不同的酸。合适的酸包括含有一个或多个侧链的芳基、烷基、氨基(包括伯胺、仲胺和叔胺)、羟基、烷氧基、和酰氨基的脂族酸；在脂族链内含有氮或氧的脂族酸；被烷基、羟基、烷氧基和/或烷基氨基取代的芳族酸；和被烷基、羟基、烷氧基和/或烷基氨基取代的杂芳族酸。
或者，可使用固相合成，其中是使用羟基苯并三唑-树脂(HOBt-树脂)作为酰化反应的偶联剂。
然后如下所述进行保护的N-酰基半合成化合物的酸修饰：将至少一个连接在N-酰基修饰的半合成假单孢菌素化合物的天冬氨酸或羟基天冬氨酸肽单元上的侧链羧基反应以形成所需的酰氨基或酯键。然后如上所述除去保护基。
可分离出假单孢菌素化合物，并以其自身的形式或其可药用盐或溶剂化物的形式使用。术语“可药用盐”是指用无机酸和有机酸形成的无毒酸加成盐。合适的盐衍生物包括卤化物、硫氰酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、芳基磺酸盐、烷基磺酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、链烷酸盐、环烷基链烷酸盐、芳基链烷酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、富马酸盐、葡萄庚糖酸盐、甘油磷酸盐、乳酸盐、马来酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、三氟乙酸盐等。
术语“溶剂化物”是指包含一个或多个溶质分子(即假单孢菌素化合物)和一个或多个可药用溶剂分子例如水、乙醇等分子的聚集体。当溶剂是水时，该聚集体称为水合物。溶剂化物一般是通过在加热条件下将化合物溶于适当溶剂中，并缓慢地冷却以生成无定形或结晶溶剂化物形式。
一般是将活性组分(即假单孢菌素化合物)配制成药物剂型以提供易于控制的药物剂量和给患者、医师或兽医提供雅致且易于使用的产品。制剂可含有0.1％-99.9％重量的活性组分、更通常约10％-约30％重量的活性组分。
本文所用的术语“单位剂量”或“剂量单位”是指含有经计算能产生所需疗效的预定量活性组分的物理不连续单位。当剂量单位经口服或非胃肠道途径施用时，其一般以片剂、胶囊、丸剂、粉末小包、局部施用的组合物、栓剂、糯米纸囊剂、在安瓿或多剂量容器中的测定量单位等形式提供。或者，剂量单位可以以干燥或液体气雾剂的形式施用，这样的气雾剂可吸入或喷雾给药。
给药剂量可根据动物的身体状况、动物症状的严重程度、施用药物的方式以及动物种类而变。对于给定动物，具体剂量通常由负责医生或兽医决定。
合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括材料例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可水膨胀的聚合物、亲水或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等。所用的特定载体、稀释剂或赋形剂将取决于施用活性组分的手段和目的。制剂还可以包含润湿剂、润滑剂、表面活性剂、缓冲剂、增强剂、增量剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜料、香料、矫味剂和它们的组合。
可使用不同方法施用药物组合物。合适的方法包括局部施用(例如膏剂或喷雾剂)、口服、注射和吸入。特定治疗方法将取决于所治疗的感染类型。
在非胃肠道静脉内施用中，通常是将制剂稀释或重新配制(如果是冷冻干燥的话)并且如果需要的话在给药前进一步稀释。对于冷冻干燥产品的重新配制规程的实例是将10ml注射用水(WFI)加到小瓶中，并轻微搅拌以溶解。重新配制时间一般少于1分钟。然后在给药前将所得溶液在输注溶液例如5％葡萄糖水溶液(D5W)中进一步稀释。
已表明假单孢菌素化合物表现出抗真菌活性，例如抑制各种传染性真菌的生长，所述真菌包括假丝酵母属各种(即白色念珠菌(C.albicans)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、克鲁丝氏假丝酵母(C.krusei)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵母(C.tropicalis)或葡萄牙假丝酵母(C.lusitania))；球拟酵母属各种(即光滑球拟酵母(T.glabrata))；曲霉属各种(即烟曲霉(A.fumigatus))；组织胞浆菌属各种(即荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum))；隐球酵母属各种(即新型隐球酵母(C.neoformans))；芽生菌属各种(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis))；镰孢属各种；发癣菌属各种、Pseudallescheria boydii、粗球孢子菌、申克氏孢子丝菌等。
因此，本发明化合物和制剂可用于制备用于抗全身真菌感染或真菌皮肤感染的药物。所以本发明提供了用于抑制真菌活性的方法，包括将本发明假单孢菌素化合物与真菌接触。优选的方法包括抑制白色念珠菌或烟曲霉的活性。术语“接触”包括本发明化合物与真菌的结合或接合或明显的接触或相互接触。该术语不意味着对本发明方法进一步限制，例如通过抑制机理限制。所述方法定义为包括通过本发明化合物的作用或其固有的抗真菌特性抑制真菌活性。
本发明还提供了治疗真菌感染的方法，包括给需要这种治疗的宿主动物施用有效量的本发明药物制剂。优选的方法包括治疗白色念珠菌或烟曲霉感染。术语“有效量”是指能抑制真菌活性的活性化合物的量。给药剂量将随诸如感染的性质和严重程度、宿主的年龄和一般健康状况、宿主对抗真菌剂的耐受性和宿主种类这样的因素而变。特定给药方案同样可根据这些因素而变。药物可以以单次日剂量或者在一天期间多次剂量的方式施用。给药治疗可持续约2-3天到约2-3周或更长。日剂量(以单剂量或均分剂量施用)一般含有约0.01mg/kg-100mg/kg体重活性化合物的剂量水平。优选的日剂量一般为约0.1mg/kg-60mg/kg、更优选为约2.5mg/kg-40mg/kg。宿主可以是任何动物，包括人、宠物(例如狗、猫和马)、食物供应动物(例如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类以及其它类似种属动物。
                      实施例
除非另有说明，所有化学药品均得自Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)。在整个实施例中使用下述缩写以代表各物质：ACN-乙腈TFA-三氟乙酸DMF-二甲基甲酰胺EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐BOC＝叔丁氧基羰基，(CH3)3C-O-C(O)-CBZ＝苄氧基羰基，C6H5CH2-O-C(O)-PyBOP＝苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐TBTU＝邻苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐DIEA＝N，N-二异丙基乙基胺
                   HPLC条件
除非另有说明，分析反相HPLC操作是用装配着WatersμBondapak(C18，3.9×300mm)柱的Waters 600E系统进行的。所用的洗脱剂是65∶35乙腈/0.1％TFA水溶剂体系-100％乙腈(用20分钟)，流速是1.5ml/分钟，并在230nm使用UV检测。
制备HPLC处理是用采用Dynamax 60埃C18柱的Waters Prep2000系统进行的，其中使用与分析HPLC系统相同的溶剂体系，但是流速为40ml/分钟。
                    生物分析抗真菌活性的检测和定量测定：
通过使用标准琼脂稀释测试或圆盘展开测试获得化合物的最小抑制浓度(MIC)来在体外测定抗真菌活性。在抗真菌活性测试中使用的典型真菌是白色念珠菌。当测试样本(50μl)对接种到琼脂板上的白色念珠菌的抑制引起10-12mm直径区域时认为有显著抗真菌活性。尾静脉毒性：
在第0、24、48和72小时，用0.1ml测试化合物(20mg/kg)经由侧尾静脉静脉内(IV)给药来治疗小鼠。每组包括2只小鼠。将化合物配制在0.5％葡萄糖和无菌注射用水中。首次治疗后监测小鼠7天，并仔细观察包括红斑、肿胀、变色、坏死、尾损失在内的刺激征状以及表明毒性的其它副作用征状。
在该实验中使用的小鼠是远系繁殖的，雄性ICR小鼠的平均体重为18-20g(得自Harlan Sprangue Dawley，Indianapolis，IN)。
                        一般方法CBZ保护的假单孢菌素：用CBZ保护假单孢菌素A、A’、B、B’、C或C’的2、4和5位侧链氨基的一般方法
将假单孢菌素化合物(R1＝H)溶解/悬浮在DMF(20mg/ml，AldrichSure Seal)中。在室温搅拌下加入N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(6当量)。在室温下搅拌32小时。通过HPLC(4.6×50mm，3.5μm，300-SB，C8，Zorbax柱)监测反应。用高度真空旋转蒸发仪将反应浓缩至10ml。将材料置于冰箱中直至用于通过色谱法制备。通过反相制备HPLC纯化，冷冻干燥后获得了无定形白色固体(在下述结构II中R1＝CBZ)。Alloc保护的假单孢菌素：用Alloc保护假单孢菌素A、A’、B、B’、C或C’的2、4和5位侧链氨基的一般方法
将焦碳酸二烯丙酯(diallyl pyrocarbonate)(558mg，3.0mmol)加到假单孢菌素A(1.22g，1.0mmol)在600ml DMF内的溶液中。将该反应在室温搅拌过夜。真空除去溶剂，获得了油状残余物，用乙醚将其洗涤3次。将油状残余物再溶于水与ACN(约1∶1)的混合物中，冷冻干燥，以90％的产率获得了Alloc保护的假单孢菌素A。
使用相同方法，以90％的产率制得了Alloc保护的假单孢菌素B(在下述结构II中R1＝alloc)。通过氢化除去2、4和5位的CBZ保护基的一般方法
将CBZ保护的酰化衍生物溶于冷的1％-10％乙酸/甲醇溶液(5mg/ml)中，并加入等量10％Pd/C。通过脱气反应并用H2替换体积4-7次来给反应装载氢气。让反应在室温进行。每隔1小时用HPLC检测反应直至原料消耗完毕。当反应完全时，除去氢气囊，并经由0.45μm滤器板(Acrodisk GHP，GF by Gelman)过滤该反应。浓缩至约1/10体积，并通过HPLC纯化。将含有产物的级分冷冻干燥。用氢化三丁基锡和二氯化三苯基膦钯除去2、4和5位的Alloc保护基的一般方法
将乙酸(1ml)加到Alloc保护的假单孢菌素B(0.05mmol)在5ml二氯甲烷内的悬浮液中。真空脱气后，将溶液用6.0mg PdCl2(PPH3)2(0.008mmol)和0.40ml氢化三正丁基锡(1.5mmol)于室温处理2小时。将溶剂在真空下蒸发，把残余物溶于水/ACN(约1∶1)中并过滤。通过制备HPLC纯化所得溶液，以93％的产率获得了所需假单孢菌素B化合物。或者，可使用5ml四氢呋喃和0.1ml乙酸作为溶剂来替代5ml二氯甲烷和1.0ml乙酸。
使用下述结构II来描述在实施例1-27中观察的产物。虽然在下述实施例中使用的是特定假单孢菌素天然产物(假单孢菌素B)，但是本领域技术人员应当理解，可以使用其它假单孢菌素天然产物或半合成衍生物作为原料。
Figure A0081033000361
实施例1-3举例说明了在残基3和8的二酯的形成。
                      实施例1合成二乙酯1-1：
                      R1＝H
                      R2＝-OCH2CH3
                      R3＝-OCH2CH3
                      1-1
向50ml园底烧瓶中加入10ml绝对乙醇和CBZ保护的假单孢菌素B(251.7mg，0.156mmol)。向该混合物中加入约1ml酸化的乙醇(预先用HCl气体酸化)，并将该反应在室温搅拌过夜。然后在真空下除去溶剂，残余物不用进一步纯化即用于下一步反应，将残余物溶于10ml MeOH/1.5ml冰醋酸的溶液中。使用249.7mg 10％Pd/C进行30分钟的标准氢化，经过滤除去催化剂，并通过制备HPLC纯化，冷冻干燥后获得了化合物1-1(120.9mg)。MS(离子喷雾)C55H96ClN12O19(M+H)+的计算值1264.89，实测值1264.3。
在反应之后通过HPLC小心地进行分离可得到单酯。在适当时间，即当原料：单酯∶二酯的比例最大时停止该反应。操作保持相同。分离所得单酯混合物，其中一些酯是在天冬氨酸残基上形成的，一些是在是在羟基天冬氨酸残基上形成的。使用标准方法将该CBZ保护的单酯的混合物氢化，获得了假单孢菌素B单乙酯的混合物。
使用与上述相同的方法合成化合物1-2和1-3。
                      R＝-H          R＝-H
                      R2＝-OCH3    R2＝-OCH(CH3)2
                      R3＝-OCH3    R3＝-OCH(CH3)2
                      1-2             1-3
实施例2举例说明了使用碱性条件合成二酯。
                      实施例2合成二丙酯2-1：
                      R＝-H
                      R2＝-OCH2CH2CH3
                      R3＝-OCH2CH2CH3
                      2-1
将CBZ保护的假单孢菌素B(247.3mg，0.154mmol)溶于5mlDMF中。然后加入大大过量的丙基碘和过量NaHCO3。将该反应在室温下搅拌10小时。通过制备HPLC进行纯化，然后冷冻干燥，获得了147.6mg保护的二酯。使用149.3mg 10％Pd/C在标准条件下将该化合物氢解，给HPLC纯化和冷冻干燥后，获得了78.9mg化合物2-1。
                          实施例3
                      R＝-H                  R＝-H
                      R2＝-O(CH2)4CH3    R2＝-OH
                      R3＝-OH               R3＝-O(CH2)4CH3
                      3-1                      3-2
将CBZ保护的假单孢菌素B(282.3mg，0.175mmol)溶于5mlDMF中。然后加入大大过量的正戊基碘和过量NaHCO3。将该反应在室温下搅拌10小时。通过制备HPLC进行纯化，然后冷冻干燥，获得了49.1mg保护的单戊酯的混合物。使用47.3mg 10％Pd/C在标准条件下将该混合物氢解，经HPLC纯化和冷冻干燥后，获得了30.6mg化合物3-1和3-2。
R＝-H                  R＝-H                   R＝-H
R2＝-O(CH2)3CH3    R2＝-O(CH2)3CH3    R2＝-OH
R3＝-O(CH2)3CH3    R3＝-OH               R3＝-O(CH2)3CH3
3-3                      3-4                       3-5
用正丁基碘代替丙基碘，获得了二丁基酯(3-3)，单酯混合物(3-4+3-5)和单酯+下述环亚酰胺化合物3-6的混合物：
                      实施例4合成环戊基甲基酯4-1：
                      R＝-H
                      R2＝-OCH2(环戊基)
                      R3＝-OH
                      4-1
将CBZ保护的假单孢菌素B、大大过量的对甲苯磺酸和环戊烷甲醇混合，并搅拌过夜。在第二天加入另外10当量的醇。通过制备HPLC分离该CBZ保护的酯，然后使用标准方法进行氢化以制得化合物4-1。
在实施例1-4中合成的各化合物表现出可测得的抗白色念珠菌、新型隐球酵母、烟曲霉、Candida Parapsilosis、或荚膜组织胞浆菌的活性。然而，基于所合成的化合物观察到了下述在活性方面的基本趋势。简单的酯(二甲酯、二乙酯和单乙酯)有活性并且有效力；而较大的酯表现出较小效力(例如丙酯和更大的酯)。ADME已表明化合物1-1和2-1迅速裂解成假单孢菌素B母化合物。
实施例5-11举例说明了在残基3的酰胺衍生物。
                      实施例5合成化合物5-1：
                      R＝-H
                      R2＝-NH2
                      R3＝-OH
                      5-1
将CBZ保护的假单孢菌素B(1.12g)和224mg TBTU、0.56mlDIEA和1.0g脱保护的rink酰胺树脂(4-(2’，4’-二甲氧基苯基氨基甲基)苯氧基树脂，得自Advance ChemTech，Inc.，Louisville，KY)混合3天。将该混合物过滤，并将树脂用DMF洗涤3次，用二氯甲烷洗涤3次。将树脂用5％水在1∶1 TFA/CH2Cl2中的混合物处理3小时。将该混合物过滤，并用TFA将树脂洗涤3次。收集滤液并在真空下浓缩。通过HPLC纯化，分离得到了60mg(5.3％)CBZ保护的酰氨基产物。
将该保护的酰氨基化合物(60mg)溶于6ml 1％AcOH的甲醇溶液，并加入60mg 10％Pd/C。将该混合物在氢气氛下于室温搅拌30分钟。过滤后，将该溶液在真空下浓缩。把残余物溶于50％ACN/水中，并冷冻干燥，获得了45mg(90％)化合物5-1。
                      实施例6合成化合物6-1：
                      R＝-H
                      R2＝-NH(环丙基)
                      R3＝-OH
                      6-1
将CBZ保护的假单孢菌素B(400mg，0.25mmol)溶于4ml无水DMF中。依次加入TBTU(79mg，0.25mmol)、DIEA(200μl，6当量)和环丙基胺(14.2mg，0.25mmol)。将该反应在室温下于氮气氛下搅拌，同时通过HPLC监测反应。在反应结束时，将该反应在真空下浓缩。通过制备HPLC纯化粗产物。冷冻干燥，获得了209.2mg(51.1％)无色粉末。
将该3-酰氨基化合物(279.1mg，0.169mmol)在10％Pd/C的催化下于1％HOAc/MeOH中在氢气下氢化45分钟。将该反应过滤，并在真空下浓缩。将残余物置于1∶1的水∶ACN混合物中，然后冷冻干燥，获得了208.3mg(98.6％)无色粉末。H1-NMR证实了该结构。
也可以使用下述方法由Alloc保护的假单孢菌素B制备化合物6-1。
将1-羟基苯并三唑水合物(136mg，1.0mmol)和EDCI(211mg，1.1mmol)加到Alloc保护的假单孢菌素B(730mg，0.50mmol)在7ml DMF内的溶液中。搅拌过夜后，加入环丙基胺(85.6mg，1.5mmol)。通过HPLC监测该反应的进程。反应完全后，通过制备HPLC和冷冻干燥分离到了Alloc保护的假单孢菌素衍生物(334mg，产率为50％)。
将该Alloc保护的中间体(117mg，0.078mmol)溶于15ml二氯甲烷和1ml乙酸中。用干燥氮气将该反应混合物脱气后，向该混合物中加入30mg(PPH3)2PdCl2和1ml氢化三丁基锡。通过HPLC监测该反应的进程。反应完全后，通过反相制备HPLC纯化该反应混合物，获得了88mg(产率为91％)化合物6-1。
下表I列出了使用与上述相同的一般方法用适当的相应胺原料合成的其它3-酰氨基衍生物。
                                表I
Figure A0081033000411
                      实施例7合成3-酰氨基化合物7-1：
Figure A0081033000421
在烘箱干燥过的500mL园底烧瓶中，将CBZ保护的假单孢菌素B(0.5g，0.311mmol)溶于25mL DMF中。向该溶液中加入TBTU(0.2g，0.622mmol)、3-(氨基甲基)吡啶(0.067g，0.622mmol)、和N-乙基二环己基胺(0.391g，1.87mmol)。将该溶液搅拌3小时，然后浓缩。通过反相制备HPLC分离产物，并冷冻干燥，获得了(96mg，产率为18％)CBZ保护的酰胺。通过将等量的10％Pd/C缓慢地加到CBZ保护的酰胺在1％乙酸/甲醇内的冷溶液中来将CBZ基团脱保护。将该溶液温至室温，并在1atm H2下迅速搅拌3.5小时。经由过滤除去催化剂后，通过反相HPLC纯化，并冷冻干燥，获得了40mg(产率为55％)化合物7-1。MS数据C57H93ClN14O18分子量计算值＝1296.6
实测值ES+1297.15，ES-1294.95
                      实施例8合成3-酰氨基化合物8-1：
Figure A0081033000422
可使用与实施例7中所述相同的一般方法。当不加入任何碱时，观察到了8和3酰氨基取代的化合物的混合物。
                      实施例9合成3-酰氨基化合物9-1：
                  R＝-H             R＝-H
                  R2＝-NH(苄基)    R2＝-NH(苄基)
                  R3＝-OH          R3＝-NH(苄基)
                  9-1                 9-2
可使用与实施例7中所述相同的一般方法。当不加入任何碱时，观察到了化合物9-1和9-2的混合物。
                      实施例10合成3-酰氨基化合物10-1：
使用与实施例7中所述相同的一般方法，用适当的相应胺原料合成化合物10-1。
                      实施例11合成3-酰氨基化合物11-1：
Figure A0081033000432
使用与实施例7中所述相同的一般方法，用4-(氨基甲基)吡啶作为胺原料合成化合物11-1。
                      实施例12合成3-酰氨基化合物12-1：
                  R＝-H
                  R2＝-N(CH3)2
                  R3＝-OH
                    12-1
将CBZ保护的假单孢菌素B(260mg，0.16mmol)、51.8mg TBTU和152μl DIEA溶于3ml DMF和320ml二甲基胺(0.16mmol)的THF溶液(2M溶液)中。将该反应在室温下搅拌20分钟，然后经由HPLC纯化。将产物冷冻干燥，获得了172mg(产率为66％)所需的CBZ保护的酰胺。
使用上述一般方法将该CBZ保护的酰胺氢化，获得了化合物12-1。
实施例13举例说明了其中将羧酸基团与各种氨基酸烷基酯反应的假单孢菌素化合物的合成。
                      实施例13合成3-酰氨基化合物13-1：
             R＝-H
             R2＝-NHCH(CO2CH3)CH2CH2CH2CH2NH2
             R3＝-OH
                      13-1
将CBZ保护的赖氨酸甲酯(164mg，0.49mmol)加到CBZ保护的假单孢菌素B(800mg，0.49mmol)、TBTU(158mg，0.49mmol)和400ml DIEA(2.51mmol)在8ml DMF内的溶液中。将该反应在室温搅拌20分钟，然后经由HPLC纯化，获得了260mg(产率为32％)CBZ保护的酰胺。
使用上述一般方法将该CBZ保护的酰胺氢化，获得了化合物13-1。
在表II列出的化合物13-2-13-4是使用与上述相同的一般方法用适当的相应氨基酸酯合成的。
                                表II
实施例14-16举例说明了在残基8上的酰胺衍生物的合成。
                      实施例14合成8-酰氨基化合物14-1：
                      R＝-H
                      R2＝-OH
                      R3＝-NH2
                        14-1
化合物14-1是用与上述使用rink酰胺树脂制备化合物6-1的方法相同的方法合成的，只是使用PyBOP作为偶联剂以代替TBTU。
                      实施例15合成8-酰氨基化合物15-1：
                      R＝-H
                      R2＝-OH
                      R3＝-NH(CH2)3CH3
                      15-1
将正丁基胺(45.4mg，0.62mmol)加到CBZ保护的假单孢菌素B(1000mg，0.62mmol)和PyBop(323mg，0.62mmol)溶解在10ml DMF内的溶液中。将该反应在室温下搅拌1小时，然后经由HPLC纯化。将产物冷冻干燥，获得了280mg(产率为27％)CBZ保护的酰胺。
将该CBZ保护的酰胺(280mg，0.17mmol)在10％Pd/C的催化下于1％乙酸/甲醇中在氢气下氢化45分钟。将该反应混合物过滤，并在真空下浓缩。将残余物溶于50％ACN在水中的混合物，并冷冻干燥，获得了189mg(产率为89％)化合物15-1。
在表III中列出的8-酰氨基化合物是使用与上述相同的一般方法用适当的相应胺原料合成的。
                               表III
    实施例  #     R1     R2     R3
    15-2     -H     -OH -NHCH3
    15-3     -H     -OH -NHCH2CH3
    15-4     -H     -OH -NH(CH2)2CH3
    15-5     -H     -OH -NH(环丙基)
    15-6     -H     -OH -NH(环丁基)
    15-7     -H     -OH -NHCH2CH2OH
    15-8     -H     -OH -NHCH2CH2N(CH3)2
    15-9     -H     -OH -NHCH2CH2CH2N(CH3)2
                      实施例16合成8-酰氨基化合物16-1：
在100ml园底烧瓶中，将Alloc保护的假单孢菌素B(0.25g，0.171mmol)溶于25ml DMF中。向该溶液中加入Pybop(0.089g，0.171mmol)和4-(2-氨基乙基)吗啉(0.022g，0.171mmol)。将该溶液在1atm N2下迅速搅拌过夜。将该溶液浓缩，通过反相HPLC分离出产物，并冷冻干燥，获得了(140mg，0.089mmol，52％)Alloc保护的假单孢菌素B吗啉衍生物。通过向Alloc保护的假单孢菌素B吗啉衍生物在1％乙酸/二氯甲烷内的溶液(10mg/mL)中加入Bu3SnH(0.648g，2.23mmol)、和(PH3P)2PdCl2(0.009g，0.013mmol)来将Alloc基团脱保护。反应时间为30分钟。通过HPLC监测反应。将该溶液浓缩，通过反相制备HPLC分离出产物，并冷冻干燥，获得了38mg(32％)化合物16-1。MS数据：C57H99ClN14O19分子量计算值为1318.7，实测值ES+1320.0，ES-1318.0。
在表IV中列出的8-酰氨基化合物是使用与上述相同的一般方法用适当相应的胺原料合成的。
                         表IV
在实施例5-16中合成的各化合物表现出可测得的抗白色念珠菌、新型隐球酵母、烟曲霉、Candida Parapsilosis、或荚膜组织胞浆菌的活性。然而，基于所合成的化合物观察到了下述在活性方面的基本趋势。
当测定8-酰氨基衍生物抗白色念珠菌的作用时，从数据中显然看见几个趋势。体外效力沿着下述R3取代基顺序下降：-NH2＞-NHCH3＞-NHCH2CH3＞-NH(CH2)2CH3＞-NH(CH2)3CH3；-NHCH2CH2N(CH3)2＞-NH(CH2)3N(CH3)2；和-NH(GlyOMe)＞-NH(PheOMe)。通常用具有较小烷基的酰氨基能实现更好的活性。发现具有游离酰胺基团的化合物是该系列中活性最高的。此外，经证实，环烷基酰胺的活性比相应的直链烷基强。在烷基链末端具有极性取代的烷基表现出的活性比相应的天然产物低。与母体天然产物不同，没有任何8-酰氨基衍生物表现出尾静脉刺激。
与母体天然产物比较，经证实3-酰氨基衍生物具有与8-酰氨基衍生物类似的趋势(例如在R2具有较短烷基链的酰胺取代基比具有较长烷基链的酰胺取代基的活性强)。与8-酰氨基衍生物不同，3-酰氨基衍生物在抗白色念珠菌的活性方面没有表现出任何显著下降直至达到7个碳原子或更长(其中R2＝-NH(CH2)6CH3的3-酰氨基PSB化合物具有MIC＝20μg/ml)，而对于8-酰氨基衍生物是直至4个碳原子或更长(其中R3＝-NH(CH2)3CH3的8-酰氨基PSB化合物具有MIC＝20μg/ml)。大多数测试的3-酰氨基衍生物在尾静脉刺激方面表现出改善。例外的是R2＝-NH(异戊基)、-NH(正己基)、-NH(CH2)2N(CH2CH3)2、和-NH(CH2)3N(CH3)2。
虽然经证实与相应的天然产物(假单孢菌素B)相比，在残基3和8都形成酰胺键使毒性得到改善，但是体内效力通常会下降。

Claims (13)

1.具有下述结构I的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，
Figure A0081033000021
其中R是
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C8-C18烷基或C5-C11烷氧基；R是
Figure A0081033000031
其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是
Figure A0081033000032
其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且
m是1、2或3；R是其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1独立地为-NH2或-NHp-Pg，其中p是0或1；R2和R3独立地为-OR2a、或-N(R2b)(R2c)，其中
R2a和R2b独立地为氢、C1-C10烷基、C3-C6环烷基、羟基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、杂芳基(C1-C10)烷基、或环杂烷基(C1-C10)烷基，或者
R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基，且
R2c是氢或C1-C6烷基，条件是R2和R3都不是-OH。
2.具有下述结构的假单孢菌素前药、及其可药用盐和溶剂化物，
Figure A0081033000051
其中R是
Figure A0081033000052
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C8-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是
Figure A0081033000062
其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且
m是1、2或3；R是
Figure A0081033000063
其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是
Figure A0081033000071
其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1独立地为-NH2或-NHp-Pg，其中p是0或1；R2和R3是-OR2a，其中R2a是C1-C3烷基。
3.通过下述步骤制得的假单孢菌素化合物的3-酰氨基衍生物
(i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，其中R是
Figure A0081033000081
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基、或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢、或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是
Figure A0081033000082
其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且
m是1、2或3；R是
Figure A0081033000092
其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1是-NH2；R2和R3是-OH；(ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护；(iii)使用邻苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐作为偶联剂在3位形成酰胺键；(iv)除去所述的氨基保护基。
4.权利要求3的3-酰氨基衍生物，其中形成酰胺键的步骤(iii)是在庞大的胺存在下进行的。
5.权利要求3的3-酰氨基衍生物，其中形成酰胺键的步骤(iii)是在庞大的胺存在下于约0℃--20℃温度下进行的。
6.通过下述步骤制得的假单孢菌素化合物的8-酰氨基衍生物
(i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，
Figure A0081033000101
其中R是
Figure A0081033000102
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是
Figure A0081033000111
其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且m是1、2或3；R是
Figure A0081033000121
其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1是-NH2；R2和R3是-OH；(ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护；(iii)使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联剂在8位形成酰胺键；(iv)除去所述的氨基保护基。
7.前述权利要求任一项的化合物在制备用于抗全身性真菌感染或真菌皮肤感染的药物中的应用。
8.制备假单孢菌素化合物的3-酰氨基衍生物的方法，包括下述步骤
(i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，
其中
R是
Figure A0081033000132
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键，或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且
m是1、2或3；R是
Figure A0081033000143
其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是
Figure A0081033000151
其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1是-NH2；R2和R3是-OH；(ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护；(iii)使用邻苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐作为偶联剂在3位形成酰胺键；(iv)除去所述的氨基保护基。
9.制备假单孢菌素化合物的8-酰氨基衍生物的方法，包括下述步骤
(i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物，
Figure A0081033000152
其中R是
Figure A0081033000161
其中
Ra和Ra′独立地为氢或甲基，或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键，或者与Rc一起形成6-元芳环；
Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基；
Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基，或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环；
Re是氢，或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环，且
Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基；R是其中
Rg是氢、或C1-C13烷基，且
Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基)，其中n＝1或2；或者R是其中
Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基，且m是1、2或3；R是
Figure A0081033000172
其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是其中
Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1是-NH2；R2和R3是-OH；(ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基保护；(iii)使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联剂在8位形成酰胺键；(iv)除去所述的氨基保护基。
10.一种药物制剂，它包含权利要求1的化合物和可药用载体。
11.一种药物制剂，它包含权利要求2的前药和可药用载体。
12.治疗动物中抗真菌感染的方法，包括给所述动物施用权利要求1的假单孢菌素化合物。
13.治疗动物中抗真菌感染的方法，包括给所述动物施用权利要求2的前药。
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