PT98986B - Processo para a preparacao de compostos activos como fungicidas e de composicoes biocidas que os contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS ACTIVOS COMO FUNGICIDAS E DE COMPOSIÇÕES BIOCIDAS QUE OS CONTÊM

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos compostos acti vos como fungicidas, aos métodos para a preparação desses compostos, aos microrganismos capazes de produzir os referidos compostos, ãs composições que contêm esses compostos e a utilização dessas composições para controlar fungos em culturas economicamente valiosas, em animais, incluindo aves e mamíferos, e na conservação de florestas e madeiras, tinta, cosméticos, alimentos e rações alimentares.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Desde há diversos anos que se sabe que alguns micror ganismos produzem metabolitos que exibem actividade biológica, o que os torna utilizáveis como biocidas para combater doenças e pragas.

Em especial, sabe-se que algumas espécies do gênero Curvularia produzem diferentes metabolitos que exibem actividade biológica, em particular como fitotoxinas. Todavia, nenhum desse metabolitos ê conhecido como fungicida. Descobriu-se que a C, lunata (Wakk.) Boed produz pelo menos duas fitotoxinas. Estas provocam manchas necroticas sobre as folhas das plantas, mesmo quando se encontram altamente diluídas. /* F« Macrí e A. Vianello, Physiological Plant Pathology, 8_(1976) 325-331 J. As

-2toxinas são fitotoxinas e constituem hospedeiros não específi

cos. As toxinas hospedeiras específicas foram isoladas a par tir de filtrados de culturas de C. pallescens Boedijn e a par tir de folhas hospedeiras doentes atacadas por esta espécie

Olufolaji, Cryptogamie Mycol, 7 (_4) (1986) 335-342 J,

Essas substâncias toxicas originam manchas cloróticas na planta do milho. Mais tarde tornam-se necroticas simi lares aos sintomas da doença in vivo provocada por C« palles cens.

A curvularina, um metabolito macrocíclico, foi isolada a partir de uma espécie de Curvularia / 0. C. Musgrave, J, Chem. Soc., (1956) 4301J ^e a partir de C. lunata Z Coombe et al, Aust. J. Chem., 21(1968) 783Esse composto possui a formula ^cqg^H2o°5 (^com'° Ρθθο molecular de 292,3) e possui a formula estrutural seguinte:

(D

A curvularina impura foi isolada sob a forma de cris tais incolores ou com uma cor amarelo acastanhado ténue.

Nem a curvularina nem os filtrados impuros de Curvularia demonstraram actividade anti-bacteriana (contra Bacillus subtilis, Escerichia coli e Staphylococcus aureus) ou acti vidade anti-fungica (teste da germinação de esporos com Penicillium digitatum).

Nenhum dos compostos anteriores ê útil para combater doenças e pragas das plantas devido ao facto de serem fortes fototoxinas.

Embora tenham sido feitos progressos no campo da identificação e do desenvolvimento de biocidas biológicos para combater diversas doenças e pragas em plantas e animais de importância agronómica, a maior parte dos biocidas em utilização são ainda compostos de síntese cuja decomposição ê difícil na natureza e que possuem um largo espectro de actividade.

Durante a última década houve uma preocupação continuamente crescente com o impacto desses biocidas no ambiente e nos ecossistemas próximos de explorações agrícolas e, consequen temente, existe uma necessidade manifesta de dispor de biocidas que tenham actividade mais específica e que sejam facilmente degradáveis no ambiente natural.

Diversos compostos associados aos compostos descritos na presente invenção foram revelados na patente de invenção europeia n9 360 760 (Sandoz AG), publicada a 28/3/1990, Es. tes compostos são descritos como sendo produzidos pelo gênero fúngico Septoria e como tendo importantes propriedades farmaco lõgicas, por exemplo, actividade anti-fungica nos animais contra leveduras e espécies do tipo das leveduras que provocam ataques sistémicos. Na memória descritiva apenas existe referência a um teste contra Candida e não existe qualquer referên cia sobre qual dos 82 compostos exemplificados foi testado pa ra confirmação dessa actividade, mas especifica-se que a maior parte dos compostos preferenciais pode ser representada pela fórmula;

ciclo-/Ffec-ffe-Val-rVh.l+íeAsp-Melle-MeIle-Gly-MeVal- TryOMe-D-Lact £ (Exemplo 1, primeiro composto).

SUMÃRIO DA INVENÇÃO

Conforme referido antes, os metabolitos do bolor do gênero Curvularia conhecidos exibem todos uma forte actividade fitotõxica, mas descobriu-se agora surpreendentemente que os fungos pertencentes ao referido gênero também produzem metabolitos que exibem forte actividade anti-fúngica, os quais são praticamente isentos de actividade fitotõxica.

A presente invenção, de acordo com o seu primeiro aspecto, refere-se a um grupo de novos compostos que englobam os compostos que possuem a composição geral

Lactato (1), Glicina (1), Valina (4), Isoleucina (1), ácido pipecolico (1), acido aspãrtico (1)

Tirosina (1) (I) em que cada resíduo aminoãcido pode ocorrer independentemente na configuração L ou D, e em que o número entre parênteses indica o número de ocorrências de cada radical; e aos seus derivados.

Considerando este aspecto, a presente invenção refere-se também aos compostos cuja composição é representada pela formula

e aos seus derivados.

De acordo comum aspecto específico, a presente inven ção refere-se aos compostos de composição geral

Lactato (1), Glicina (1), Valina (1), N-Me-Valina (3),

N-Me-Isoleucina (1), acido pipecolico (1), acido

N-Me-Aspãrtico (1), (II)

O-tMe-Tirosina (1) , em que cada resíduo aminoãcido pode ocorrer independentemente na configuração L ou D; e que o número entre parênteses indica

o numero de ocorrências de cada radical;

e aos seus derivados.

De acordo com um aspecto específico, a presente invenção refere-se a compostos de fórmulas

(III) ciclo-/ Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-Melle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-

(IV) ciclo-/*Pec-MeVal-Val-MeAsp-MeVal-Melle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact / (IV) ,

em que cada resíduo aminoácido e cada residuo lactato pode ocorrer independentemente na configuração L ou D; e aos seus derivados. São mais preferenciais os compostos em que todos os resíduos aminoãcidos se encontram na configuração L e em que o resíduo lactato se encontra na configuração D, Da acordo com o segundo aspecto, a presente invenção refere-se aos processos utilizados para a produção dos novos compostos da invenção. Esses processos consistem em utilizar microrganismos específicos e também processos químicos para a produção total ou semi-sintêtica desses compostos.

De acordo com um seu terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a composições fungicidas que incorporam os novos compostos da invenção em associação com excipientes ade quados, tais como diluentes, veículos, etc,

A presente invenção refere-se também a utilização dos micorganismos que produzem os compostos da invenção, como composições fungicidas.

Neste contexto, a presente invenção contempla também a possibilidade de associar os novos compostos da invenção a biocidas conhecidos para a preparação de novas associações para composições.

Além disso, a presente invenção de acordo com o seu quarto aspecto refere-se a métodos para combater doenças das plantas por aplicação de composições que contêm os novos compostos da invenção, em áreas infestadas.

De acordo com o seu quinto aspecto, a presente inven ção refere-se ã utilização dos novQS compostos da invenção para combater ou para controlar doenças das plantas, especialmen te os ataques fúngicos.

-ΊΑ. presente invenção refere-se também ã utilização dos novos compostos como conservantes e/ou aditivos para controlar fungos em alimentos e rações alimentares_f madeiras e florestas, tintas, meios de crescimento, cosméticos, etc.

Finalmente, a presente invenção refere-se a uma cul tura pura isolada de micorganismos Curvularia sp.(CMI CC N9 337159).

DEPOSITO DOS MICRORGANISMOS

Para efeitos de descrição pormenorizada da presente invenção depositou-se uma estirpe do fungo Curvularia sp.(CMI CC N<? 337159) na Commonwealth Mycological Institute Culture Collection (CMI CC), Ferry Lane, Kew, Surrey TW9 3AF, Inglaterra, com o objectivo de proceder ao registo de patente de invenção na data adiante indicada. Sendo a CMI CC um deposita rio internacional ao abrigo do Tratado de Budapeste, faculta a permanência do deposito em conformidade com a regra 9 do re ferido tratado.

Data do deposito 6 de Fevereiro de 1990

Referência do depositante 33 177

Designação da CMI CC CMI CC N9 337 159

A estirpe CMI CC 337 159 pertence ã classe Deuteromicetes, sub-classe Hyphomycetidae e família das Dematiaceae, Este fungo é uma espécie nova do gênero Curvularia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A presente invenção ê descrita com maior pormenor mais adiante tomando como referência os desenhos em que;

A Figura 1 ê uma representação gráfica da relação estabilidade/actividade em função da temperatura e do valor do pH para o novo composto de acordo com a presente invenção.

As Figuras 2_r 3 e 4 mostram os espectros de a 400 MHz do composto isolado da presente invenção, em CDCl^, DMSCRdg e CD^QD, respectivamente.

A Figura 5 mostra um espectro de RMN- c a 100,6 mhz do composto isolada da presente invenção, em CDCl^.

A Figura 6 mostra um espectro de infravermelhos (IV) do composto isolado da presente invenção, em KBr.

A Figura 7 mostra um espectro de IV de um derivado metilado, em KBr.

As Figuras 8, 9 e 10 mostram os resultados da aplicação de um composto da presente invenção a morangueiros, videiras e tomateiros, infectados com Botrytis cinerea, respectivamente .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Conforme se indicou antes, no seu primeiro aspecto a presente invenção refere-se a novos compostos de composição geral

Lactato (1), Glicina (1), Valina (4), Isoleucina (1), ácido pipecõlico (I), ácido Aspãrtico (1), Tirosina (1) (I) em. gue cada resíduo aminoácido pode ocorrer, independentemente, na configuração L ou D e em que o número entre parênteses indica o número de ocorrências de cada radical; e aos seus derivados.

No âmbito deste aspecto, a presente invenção abrange também os compostos que incorporam adicionalmente um anel lactona; e os seus derivados.

-9Alem disso, a presente invenção engloba os compostos que possuem a formula

e seus derivados.

De acordo com este aspecto, os derivados referidos antes englobam particularmente os compostos que foram submeti dos a reacções de alquilação, hidroxilação, glicosilação, halogenação, redução, oxidação, hidrólise ou esterificação.

De acordo com um aspecto específico, a presente invenção refere-se a compostos de composição geral

Lactato (1), Glicina (1), Valina (1), N-Me-valina (3) ,

N-Me-Isoleucina (1), ãcido pipecõlico (1), ãcido (T N-Me-Aspãrtico (1), O-Me-Tirosina (1), em que cada resíduo aminoãcido pode ocorrer, independentemente, na configuração L ou D e em que o numero entre parênteses indica o numero de ocorrências de cada radical; e aos seus de rivados,

Como exemplo específico, a presente invenção refere-se aos compostos de formulas III e IV

ciclo’-/’ Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-Melle-Gly-MeVal-TyrOMe-D(III) (III)

(IV) ciclo-/” Pec-MeVal-Val-MeAsp^MeVal^Meíle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact/ (IV), em que cada resíduo aminoácido e o resíduo lactado podem ocorrer, independentemente, na configuração L ou D; e aos seus derivados. Sao mais preferenciais os compostos em que todos os

resíduos aminoácidos se encontram na configuração L e o resí duo lactato se encontra na configuração D,

Os compostos de formulas III e IV foram isolados co mo metabolitos a partir de novas espécies do gênero Curvula ria, Curvularia sp.(CMI CC N9 337159).

Os compostos desta classe com estruturas orgânicas representadas pelas formulas III e IV são novos, A referência mais próxima ê a patente de invenção europeia N9 360 760 an teriormente referida, A diferença principal entre os compostos da patente de invenção europeia N9 360 760 e os compostos da presente invenção reside no facto de aqueles conterem sempre dois re síduos isoleucina vizinhos.

Embora na patente de invenção europeia N9 360 760 tenham sido descritos compostos afins dos compostos da presente invenção, aqueles compostos não foram considerados para fins agronómicos. Isso deve-se ao facto de possuirem elevada toxicidade (aproximadamente 100 mg/Kg p.o.) e uma fraca actividade anti-fúngica (dosagem de 25 a 300 mg/Kg, dosagem diária de 300 a 3 000 mg), conforme exemplificado em relação a Candida nas paginas 47 a 49 da patente de invenção europeia N9 360 760.

Por outro lado, a patente de invenção europeia

N9 360 760 indica apenas a utilização farmacêutica de compostos afins. Em consequência, a surpreendente especificidade e actividade para utilização agronómica dos compostos da presen te invenção não pode ser inferida a partir da patente de invenção europeia N9 36Q 760, De acordo com o seu segundo aspec to, a presente invenção refere-se aos processos para a preparação de novos compostos com a composição I.

-12Os compostos de fórmulas III e IV podem ser prepara dos por cultura aerobica em meio nutriente adequado sob as condiçoes adiante descritas, com uma estirpe de um fungo pertencente ao gênero Curvularia, especialmente o fungo Curvularia sp, (CMI CC 337159), e recuperando depois o componente acti vo a partir da biomassa e do meio de fermentação.

O metabolito natural pode ser subsequentemente modificado por processos químicos no sentido de se obter os seus diversos derivados. Esses derivados podem ser produzidos com o objectivo de melhorar algumas propriedades do metabolito, tais como a solubilidade em meio aquoso, a hidrofobia, a hidrofilia, a estabilidade, a especificidade, etc.

Faz-se observar também que os compostos de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por processos de síntese química bem conhecidos utilizando compostos iniciais adequados.

Os derivados de compostos afins e os métodos para a produção desses derivados encontram-se descritos na patente de invenção europeia NÇ 360760, a qual se indica aqui a título de referência.

Como o tipo específico dos derivados dos compostos de fórmulas III e IV refere-se os compostos em que o anel da lactona foi aberto.

Existe um grupo de derivados que ê constituído pelos compostos de composição I, II, III ou IV, em que um ou mais grupos hidroxi e/ou amino foram glicosilados com um ou mais radicais açúcar.

Existe outro grupo de compostos de composição I,II,

III ou IV em que um ou mais grupos hidroxi é/ou amino foram

-13acilados com ácidos orgânicos originando grupos êster/amida. *

Hâ ainda outro grupo de derivados constituído por compostos de composição I,II, III ou IV em que um ou mais grupos hidroxi e/ou amino foram alquilados originando éteres alquílicos/aminas.

Existe outro grupo de derivados constituído pelos compostos de composição Ι,ΙΙ, III ou IV em que um ou mais grupos foram substituídos por halogenação originando compostos em que um ou mais grupos são constituídos por átomos de halogêneo.

Existe um outro grupo de derivados constituído por compostos de composição Ι,ΙΙ, III ou IV em que um ou mais grupos foram alterados por redução de um ou mais grupos no compos. to obtido..

Existe um outro grupo de derivados constituído pelos compostos de composição Ι,ΙΙ, III ou IV em que um ou mais grupos foram alterados por oxidação de um ou mais grupos no composto obtido.

Hâ ainda outro grupo de derivados constituído pelos compostos de composição I, II, III ou IV em que um ou mais gru pos foram alterados por hidrólise de um ou mais grupos no composto obtido.

Embora a invenção aqui descrita se refira essencialmente a uma estirpe específica CMI CC 337159, sabe-se na especialidade que as propriedades dos microrganismos podem ser alteradas natural e artificialmente. Em consequência, consideram-se englobadas na presente invenção todas as estirpes pertencentes ao gênero Curvularia, incluindo variantes, recombinantes e mutantes, quer tenham sido obtidos por selecção natu

ral, produzidos pela acção de agentes que induzam mutação, tais como a radiaçao ionizante ou a radiação ultravioleta, quer ainda pela acção de mutagenes químicos, tais como a ni^ trosoguanidina.

Sabe-se que um fungo ê capaz de produzir metaboli” tos estreitamente relacionados (ver a patente de invenção eu ropeia N9 36Q 760, segundo a qual três compostos afins são produzidos pelo mesmo fungo) com actividade igual ou semelhan te, mas com diferenças menores na estrutura química. Em consequência, a presente invenção engloba também todos os composs tos estreitamente relacionados produzidos pelo CMI CC 337 159.

Dependendo de circunstâncias, tais como a cultura onde se pretende combater os fungos, as condições ambientais e outros factores, uma composição de acordo com a presente in venção pode conter também, além dos referidos compostos activos como fungicidas, outros ingredientes activos, tais como biocidas, por exemplo, fungicidas, pesticidas, herbicidas, insecticidas, nematocidas, acaricidas ou nutrientes das plantas, reguladores do crescimento das plantas ou fertilizantes.

Como exemplo de outros fungicidas que podem ser asso ciados aos compostos activos da presente invenção refere-se especialmente os inibidores da biossíntese do ergosterol (IBE). Estes compostos são geralmente derivados de imidazol ou triazol e como exemplos ê possível referir os que são conhecidos pelas designações vulgares de prochloraz, triadimefon, propiconazole, diclobutrazol, triadiminol, flusilazole, flutriafol, myclobutanil, penconazole, quinconazol, imazalil e diniconazol. Como exemplos de compostos de tipo IBE sem grupo azol refere-se o nuarimol, o fenarimol, o fenpropimorph, o tridemorph e a fenpropidine. Outros fungicidas que podem ser associados ã

-15preparação enzimãtica da presente invenção englobam as anili das, por exemplo, carboxina, metalaxyl, furalaxyl, ofurace, benalaxyl, mepronil, flutolanil, pencycuron e oxadixyl; os ben zimidazóis, por exemplo, benomyl e carbendazim; os carbamatos, por exemplo, maneb, mancozeb e propamocarb; as dicarboximidas, por exemplo, iprodiona, vinclozolina e procimidona; os derivados do fósforo, por exemplo, pvrazaphos, tolclofos-methyl e fo setyl-aluminum; e compostos variados, incluindo os ditiocarbamatos, bisditiocarbamatos, imidazõis, triazóis, fatalonitrilos, compostos poli-halogeno-alquiltio, iminoctadine, guazatine, dicloran, chlorothalonil, pyrifexox, ethirimol, cymoxanil, fenil-pirróis, tiociofenos, pirimidinas e anilazina.

Para combater fungos em animais incluindo os seres hu manos, as composições da presente invenção incorporarão normalmente os referidos compostos activos da presente invenção apenas em conjunto com um veículo ou diluente fisiologicamente com patível, mas também podem conter outros ingredientes activos, tais como um antibiótico.

Uma composição fungicida de acordo com a presente invenção contendo um composto activo fungicida da presente invenção, como o ingrediente activo, para efeitos de aplicação agronómica e/ou hortícola pode ser formulada misturando o princípio activo com veículos ou diluentes inertes adequados e compatíveis, de modo a obter uma composição de tipo geralmente utiliza do em composições agrícolas, tais como os pós molháveis, os con centrados emulsionáveis, as emulsões concentradas, as formulações granulares, os pós solúveis em água, os alginatos, as gomas da xantano e/ou os aerossóis. Como veículos sólidos é possí vel referir e bentonite, as terras de diatomâceas, a apatite, o gesso, o talco, a pirofilite, a. vermiculite, as conchas trituradas e as argilas. Também ê possível adicionar um agente tensioactivo com o objectivo de produzir uma formulação homogénea e estãvel, diluente ou veículo da composição de acordo com a presente invenção, conforme indicado antes, pode ser um sólido ou um líquido facultativamente em associação com um agente ten sioactivo, por exemplo, um agente dispersante, um agente emulsionante ou um agente humectante. Os agentes tensioactivos ade quados englobam os compostos aniónicos, tais como os carbaxila tos, por exemplo, um carboxilato de ãcido gordo de cadeia longa de um metal: um N-acil-sarcosinato; mono- ou diêsteres de ãcido fosfórico com etoxilatos de álcoois gordos ou sais desses ésteres; sulfatos de álcoois gordos, tais como o dodecil-sulfato de sódio, o octadecil-sulfato de sódio ou o cetil-sul fato de sódio; sulfatos de álcoois gordos etoxilados; sulfatos de alquil-fenóis etoxilados; lignino-sulfonatos, sulfonatos do petróleo; alquil-aril-sulfonatos, tais como os alquil-benzeno-sulfonatos ou os alquil(inferior)-naftaleno-sulfonatos, por exemplo, o butil-naftaleno-sulfonato; sais de condensados de formaldeído/naftaleno sulfonados; sais de condensados de formaldeído/fenol sulfonados; ou sulfonatos mais complexos, tais como os sulfonatos de amidas, por exemplo, o produto de conden sação sulfonado de ãcido oleico e de N-metil-taurina ou os dialquil-sulfossuccinatos, por exemplo, o dioctil-sulfossuccinato de sódio. Os agentes não iónicos englobam os produtos de condensação de ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, amidas de ácidos gordos ou alquil- ou alcenil-fenõis substituídos gordos com óxido de etileno, ésteres gordos de éteres de ãl-

coois poli-hídricos, por exemplo, os ésteres de ácidos gordos com sorbitano, os produtos de condensação desses ésteres com oxido de etileno, por exemplo, os ésteres de ácidos gordos com polioxietileno-sorbitano, os copolímeros de bloco de oxido de etileno e de oxido de propileno, os glicóis acetilênicos, tais como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, ou os glicois acetilê nicos etoxilados.

Como exemplos de agentes tensioactivos catiõnicos é possível referir, por exemplo, uma mono-, di- ou poliamina ali fática tal como um acetato, naftenato ou oleato; uma amina con tendo oxigénio, tal como um oxido de amina ou polioxietileno-alquilamina; ou uma amina ligada a uma amina preparada median te condensação de um ácido carboxílico com uma di- ou poliamina ; ou um sal de amónio quaternário.

As composições da presente invenção podem assumir qualquer forma conhecida na especialidade de formulação de pro dutos agroquimicos, por exemplo, uma solução, uma dispersão, uma emulsão aquosa, um pó para polvilhar, revestimento para se mentes, um pó dispersável, um concentrado emulsionável ou grânulos. Além disso, podem ser apresentadas numa forma adequada para aplicação directa ou sob a forma de concentrados ou de composições primárias que necessitem de ser diluídas com uma quantidade adequada de água ou com qualquer outro diluente antes da sua aplicação.

Um concentrado emulsionável incorpora o ingrediente activo dissolvido num dissolvente imiscível com a água formando uma emulsão com agua na presença de um agente emulsionante.

Ura pó para polvilhar incorpora o ingrediente activo tritu rado e misturado intimamente com um diluente sólido pulverulen

-ç to, por exemplo, o caulino.

Um solido granular contêm o ingrediente activo associado a diluentes similares aos que podem ser utilizados nos põs para polvilhar, mas a mistura ê granulada por métodos conhecidos, Em alternativa, contêm o ingrediente activo absorvido ou adsorvido num diluente prê^-granular, por exemplo, terras de Fuller, atapulgite ou areias calcarias.

Os pos molháveis, os grânulos ou os grãos contêm nor malmente o ingrediente activo misturado com um agente tensioac tivo adequado e um diluente inerte em pó, tal como o caulino.

Outro concentrado adequado é um concentrado em suspensão com características fluidas preparado mediante trituração do ingrediente activo com água ou com outro líquido, um agente humectante' e um agente de suspensão.

Deve notar-se que os compostos activos da presente invenção podem ser aplicados a concentrações compreendidas apro ximadamente entre 0,001 jig/ml e 750 mg/ml, de preferência entre 1 jig/ml e 10 mg/ml, para utilização no controlo de fungos nas plantas.

Para utilização no combate aos fungos em animais, in eluindo os mamíferos, os compostos activos da presente invenção podem ser formulados misturando um composto da invenção com veículos compatíveis e inertes adequados conhecidos na especialidade para utilização em formulações tópicas ou para utilização como agentes sistémicos, conforme for o caso.

A concentração dos compostos activos da presente inven ção aqui descritos, nas composições de acordo com a invenção, po de variar dentro de um grande intervalo, consoante o tipo de for mulação e o domínio de aplicação.

-¹⁹- c

Deve notar-se que os compostos activos da presente invenção podem ser aplicados em concentrações variáveis aproximadamente entre 0,001 jig/ml e 10 mg/ml, de preferência entre

0,1^/ml e 1 mg/ml, para utili.ação no controlo de fungos em animais.

De acordo com o seu quarto aspecto, a presente inven ção refere-se aos métodos para combater fungos nas plantas ou em animais, incluindo os mamíferos, que consiste em aplicar uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, activo como fungicida, na região que se pretende tratar.

Em associação com este aspecto, as composições da presente invenção destinadas utilização agronómica ou hortícola, podem ser aplicadas a uma região que se pretende tratar, quer directamente por aplicação ao solo sob a forma de um tratamento em prê-emergência ã superfície das sementes com as características de um revestimento para sementes, quer à folhagem ou aos frutos das plantas sob a forma de um tratamento em põs-emergência. Consoante a cultura e as circunstâncias, ê pos sível adiar o tratamento até as sementes ou os frutos aparecerem nas plantas onde se pretende controlar os fungos.

A preparação activa ou as composições da presente in venção podem ser aplicadas directamente às plantas, por exemplo, pulverizando ou polvilhando no momento em que o fungo começa a aparecer na planta ou antes do aparecimento desse fungo, como medida de protecção. Em ambos os casos o modo preferencial de aplicação ê por pulverização foliar. Geralmente, é importante obter um bom controlo dos fungos nas fases iniciais do crescimento da planta pois ê nessas fases que a planta pode ser mais severamente danificada. A pulverização ou o po podem

-20-( conter convenientemente um herbicida de pré- ou pós-emergência, uma mistura de outros pesticidas, reguladores do crescimento das plantas ou fertilizantes, se assim se considerar necessário,

Frequentemente ê praticável tratar as raízes das plan tas antes ou durante a sua plantação, por exemplo, mergulhando as raízes numa composição solida ou líquida adequada. No caso da preparação activa da presente invenção ser aplicada directamente ãs plantas, considera-se adequada uma taxa de aplicação compreendida entre 0,001 e 50 kg por hectare, de preferência en tre 0,05 e 5 kg por hectare.

De acordo com o método da presente invenção, a preparação activa da invenção também pode ser aplicada às sementes ou ao habitat, isoladamente ou em associação com um biocida con vencional. Deste modo, a preparação pode ser aplicada directamente ao solo antes, durante ou após a sementeira de tal modo que a presença do ingrediente activo no solo possa controlar o crescimento dos fungos que possam atacar as sementes.

As composições podem ser aplicadas em quantidades cor respondentes a valores compreendidos entre cerca de Ig e cerca de 100 kg de composto activo fungicida por hectare.

No caso de o solo ser tratado directamente, a prepara ção activa (isoladamente ou misturada com um biocida convencional) pode ser aplicada por qualquer processo que lhe permita mis turar-rse infimamente com o solo, tal como pulverização, espalha mento de grânulos no estado solido ou aplicando o ingrediente activo no momento da sementeira inserindo-o no mesmo rego das sementes. Considera—se adequada uma taxa de aplicação compreendida entre 0,01 e 50 kg por hectare, mais preferencialmente en/

-21-/

tre 0,05 e 5 kg por hectare.

A concentração dos compostos activos dos fungicidas da presente invenção nas composições da invenção, quando utilizados isoladamente ou em associação com um fungicida conven cional, ao serem aplicados âs plantas, esta vantajosamente com preendida entre cerca de 0,001 e cerca de 30% em peso, especial mente entre 0,01 e 3,0% em peso. Numa composição primaria a quantidade de composto activo pode variar muito e pode constituir, por exemplo, 5 a 95% em peso da composição.

A concentração do outro ingrediente activo fungicida na composição mista da presente invenção, ao ser aplicada ãs plantas, está preferencialmente compreendida entre 0,001 e 50% em peso, especialmente entre 0,01 e 10% em peso. Numa composição primaria a quantidade do outro ingrediente activo pode variar entre limites afastados e pode constituir, por exemplo, 5 a 80% em peso da composição.

Embora a presente invenção tenha sido descrita porme norizadamente no que diz respeito ao controlo de fungos em ani mais e plantas, deve notar-se desde jã que os compostos activos fungicidas da presente invenção podem ser utilizados para a conservação de madeiras adicionando esses compostos ãs compo sições de impregnação e/ou conservação de madeiras. Por outro lado, os compostos activos da presente invenção podem ser úteis como fungicidas e conservantes de tintas, tanto para evitar o desenvolvimento de fungos nas tintas durante o seu armazenamento como para evitar o desenvolvimento de fungos em objectos pin tados, tais como as superfícies estucadas de uma casa.

Alem disso, os compostos activos fungicidas da presen te invenção, devido â sua fraca toxicidade, podem ser utiliza-22dos para a conservação, de cosméticos alimentos e rações ali mentares, ou em outros produtos deste tipo aos quais os com postos podem ser adicionados apôs qualquer processo de cozedu ra.

Adicionalmente os compostos activos fungicidas da presente invenção podem ser utilizados como aditivos fungicidas nos meios de desenvolvimento de diversos microrganismos, tais como E. coli, Pseudomonas aeroginosa, Serpula lacrymans e Cladosporium sp.

Descrição da estirpe

Colónias: cinzentas, macias e frequentemente do tipo zonado.

Conidioforos; entre singulares e agregados, vulgares, lineares ou sinuosos, geniculados por cima.

Canídeos: acropleurogenosos, 2-4 septos quando maduros, lisos, mas tornando-se verrugosos na grande célula central, essencial mente curvados, concolores ou com a célula central mais pigmen tada do que as outras células, essencialmente com 20-39 pm de comprimento e com 11-14 pm de espessura na parte mais larga.

A estirpe CMI CC 337 159 possui quatro septos tal co mo C. verruciformis, mas difere desta pelas dimensões dos coní deos. Os conídeos de C. yerrucif ormis possuem as dimensões de 16^26 pm x 8-12 pm, A estirpe CMI CC 337 159 ê uma espécie nova do gênero Curvularia. Pertence ã classe Deuteromycetes, sub -classe Hyphomycetidae e família Dematiaceae.

Cultura da estirpe fungo pode desenvolver-se em superfícies inclinadas de gelose contendo os seguintes ingredientes em gramas/litro:

extracto de levedura 4,0 di-hidrogenofosfato de potássio1,0 hepta-hidrato de sulfato de magnésio0,1 glucose15

Bacto (Difco Laboratories, Detroit,

USA) gelose,20

Este substrato ê tratado em autoclave à temperatura de 121° C durante 20 ou 40 minutos, sendo daqui em diante refe rido por gelose YPG. As superfícies inclinadas contêm 12 ml de gelose YPG e apõs a inoculação foram incubadas a uma tempe ratura compreendida entre 20° e 25°C durante 7 dias ou mais.

Produção fungicida

Preparou^se- um substrato para balões para centrifugação utilizando agua desmineralizada com os seguintes ingredientes em gramas por litro:

extracto de levedura4,0 di-hidrogenofosfato de potássio1,0 hepta-hidrato de sulfato de magnésio0,1 glucose15

Plurónic® L61 (BASF, República Federal da Alemanha)0,1

A esterilização foi efectuada a temperatura de 121 C durante 20 minutos. Inoculou-se um balão de Erlenmeyer com a capacidade de 500 ml contendo 100 ml de substrato utilizando θ

cerca de 10 esporos provenientes de um plano inclinado de gelose YPG previamente inoculado com CMI CC 337 159, Os balões foram centrifugados a 230 rpm, ã temperatura de 25°C durante

3-7 dias, após o que se procedeu ã centrifugação do caldo de fermentação. Depois separou-se do micêlio o sobrenadante contendo o fungicida. Tanto o micêlio como o sobrenadante foram analisados para pesquisa da.sua actividade fungicida, fungicida também pode ser produzido em culturas de superfície de acordo com procedimentos bem conhecidos.

A fermentação também pode ser efectuada em meio que contenha outras fontes de carbono e de azoto assimiláveis pelos microrganismos e que possuam geralmente baixos teores de sais inorgânicos. Além disso, o meio pode ser enriquecido com oligoelementos, embora no caso de se utilizar fontes complexas de carbono e de azoto estas contenham normalmente aqueles elementos .

Extracção do composto

Filtrou-se o caldo de cultura em tambor utilizando como pré-revestimento High Flow Supercel '-í Adicionou-se ao filtrado XAD-8 na proporção de 20g/litro e depois agitou-se a mistura durante 16 horas ã temperatura de 5°C.

Depois filtrou-se a resina XAD-8, lavou-se com uma quantidade de etanol a 25% (v/v) correspondente a 10 vezes o volume do leito, com agitação durante 30 minutos. A fracção activa foi eluída primeiro com 2x3 volumes de etanol a 60% em tampão fosfato 10 mM, pH 7,0, sob agitação durante 60 minutos, Depois fez-se a eluição das restantes fracções com activi dade utilizando 2x3 volumes de etanol a 80% (v/v) em tampão de fosfato 10 mM, pH 7,0, e manteve-se a agitação durante 60 minutos. Reuniram-se as fracções eluídas e concentrou-se até 1/5 do volume por evaporação sob vazio a uma temperatura ^40°C,

Concentrou-se ate 750 ml uma quantidade de 3,6 li tros de produtos de eluição já concentrados. Depois submeteu—se o concentrado a centrifugação e eliminou-se o precipitado. Extraiu-se o sobrenadante 2 vezes com 765 ml de acetato de eti.

lo. Reuniram-se as fases de acetato de etilo e congelou-se para remoção da ãgua.

Concentrou-se o extracto isento de ãgua por evaporação sob vazio até ao volume de 20 ml e depois adicionou-se-lhe 120 ml de acetonitrilo, Efectuou-se nova concentração por evaporação sob vazio atê ao volume de 25 ml e depois adicionou-se -lhe 70 ml de ãgua desionizada e 70 ml de etanol e evaporou-se novamente sob vazio atê ficar ligeiramente turvo. Depois colocou-se esta solução no frigorífico para cristalização. Decorri dos 4 dias procedeu-se ã lavagem dos cristais com ãgua desioni zada e efectuou-se a sua liofilização.

Obteve-se deste modo lg de cristais.

Por razões de simplicidade, o composto de fórmula IV serã designado daqui em diante por BK202.

Estabilidade em função de Temperatura/pH

Procedimento: Com o composto BK202 preparou-se uma so lução em tampão para os valores de pH indicados na Figura 1 e depois manteve-se a uma temperatura compreendida entre 25° e 55°C durante 16 horas. Os tampões utilizados foram fosfato/citrato /* T.C. Mcllvaine, J. Bjol. Chem., 49 (1921) 183 _7, para valores de pH compreendidos entre 2,5 e 7, e para valores de pH compreen didos entre 7 e 9,5 utilizou-se TRIS 0,05 M, Decorridas 16 horas procedeu-se ã filtração das amostras sobre um filtro de membrana de 0,45 um e efectuou-se a análise pelo método HPLC,

A Figura 1 mostra a relação existente entre a acti-

vidade residual e o valor do pH para diversos valores de temperatura, A partir da Figura conclui-se que o composto de for mula IV da presente invenção exibe uma estabilidade óptima pa ra valores próximos de pH 7, em que a estabilidade parece ser dependente da temperatura, ao passo que a estabilidade para valores de pH superiores a 8 diminui rapidamente. Para valores de pH inferiores a 7 a estabilidade diminui lentamente, excepto para a temperatura de 25°C, ponto em que a diminuição parece ser rápida. Todavia, admite-se que isto possa ser um erro experimental,

Análise - método HPLC

Coluna:	Spherisorb Hexyl 5 |im, 140 mm x 4,6 mm
Fluxo:	1,5 ml/min
Detecção:	220 nm e 210 nm
Eluente:	55% de Acetonitrilo + 0,1% de ácido tri- fluoro-acético

Amostra:

Tempo de Retenção:

ca. 6,3 minutos

Propriedades físicas e químicas

A cristalização do produto, obtido pelo procedimento de isolamento anteriormente descrito, a partir de uma solução aquosa de etanol, proporciona cristais brancos com as propriedades físico-químicas adiante descritas (estufa seca ã tempera tura de 80°C durante 2 horas e armazenamento durante a noite num exsicador sob vazio, sobre sílica anidra).

1. Propriedades físicas

Natureza cristais incolores

P.f.	194	°-195(
/(c = 0,4, MeOH)	205	o
Analise
Encontrado	C:	59,44
	H;	8,14
	N;	10,89
Calculado para C^gHggNgO^^.H^O	C;	59,50
	H;	8,11
	N;	11,15

A cristalização do produto em metanol proporciona cristais brancos anidros com as propriedades físico-químicas adiante descritas (estufa seca ã temperatura de 80°C durante

2 horas e armazenamento durante	a noite num exsicador sob va·
zio, sobre sílica anidra).
1. Propriedades físicas
Natureza	cristais incolores
P.f.	210°-212°C
(C =0,4, MeOH)	-227°
Analise
Encontrado	C: 60,11
	H: 8,00
	N: 11,28
Calculado para C55H89N9^14	C. 60,48
	H; 8,06
	N: 11,33
Espectro de massa (BAR)	MH+ 1112,6

2. Propriedades guxmicas

A hidrólise acida total CHC1 6N, 18-24 h, 110°C) pro porcionou os seguintes ^(-amino e hidroxi-ãcidos (conforme determinado por Cromatografia em Fase Gasosa/Anãlise do espectro de massa dos derivados do ester trifluoro-acetil-n-butílico, indicando os numeros entre parênteses, o numero de ocorrências de cada aminoãcido).

Lactato (1)	C3H4°2
Glicina (1)	NO
Valina (1)	c5h9nq
N-Me-Valina (3)	C6H11NO
N-Me-Isoleucina (1)	c7h13no
acido pipecélico (1)	c6h9no
N-Me-acido Aspartico (1)	C5H7NO3
O-Me-Tirosina (1)	C10H11NO

56^H89^N9°14 composto BK202 da presente invenção ê negativo quando submetido ao teste com a ninidrina, não contêm qualquer função XH que possa ser acetilada (anidrido acêtico/piridina, 24 horas, temperatura ambiente) e possui um grupo carboxilo livre, o qual pode ser esterifiçado por tratamento com diazome tano para proporcionar o correspondente éster monometílico BK202-Me (Cf-PDMS, MH⁺ 1126,5).

composto BK202 da presente invenção contém uma ligação lactona (IV 1736 cm que pode ser aberta por hidrólise alcalina suave (NaOH 0,1 N; 0,5 hora, temperatura ambiente) pa /

ra proporcionar um derivado de anel aberto BK202-OH, Por tra tamento com diazometano o composto BK202-OH pode ser transfor mado no correspondente ester dimetílico BK202Me₂(Cf-PDMS,MH⁺ 1158,4).

Dados espectrais do BK2Q2

RMN- H: Devido ã complexidade dos espectros induzidos pela coexistência de mais conformeros apenas se efectuou atê agora uma determinação parcial representada no Quadro I.

]

Determinação parcial do espectro de FMN- H (Figura 2)

QUADRO I

Valores dos desvios químicos para, o conformero principal em relação ao TMS (multiplicidade(d=dupleto, t=tripleto, dd=dupleto dupleto, q=quarteto, m=multipleto, br=largo), J-valores em Hz)

Resíduo	NH	tf-H	β-Ά		outros.
O-MeTyr	7,50 (d, 10)	5,20 (m)	3,25 (2H,m)	——	7,00(2H,d,8) 6,70(2H,d,8)
Vai	7,00 (d, 10)	4,55 (t,10)	2,10 (m)	0,80,089 (2Me,d, 7)
Gly	7,08 (br)	4,02 (dd,6/18)	—	——	—
NMe-Val	•-----	5,19 (d,11)	2,37 (m)	0,88,0,98 (2Me,d, 7)	—
NMe-Val	—	4,31 (d, 10)	2,43 (m)	0,89,1,06 (2Me, d, 7)	—
NMe-Val	————	4,74	2,13	0,68,?	____

Lac (d, 10) (m) (Me, d, 7)

5,47 1,40 —'— (q, 7) (Me,d, 7)

Os resultados de RMN^ H encontrasse apresentados sob a forma de dados espectrais não corrigidos, nas Figuras 2 a 4.

(Fig.2, Fig. 3, e Fig. 4: espectros a 400 MHz em CDCl^, DMSO-dg e CD^OD, respectivamente)

RMN-¹³C: 100.6MHz em CDC1₃ (Fig,5)

IV: KBr (Fig.6)

Derivados de BK202

BK202*-Me

IV: KBr (Fig.7)

Bioensaio

Adicionou^se 10⁶ esporos de Botrytis cinerea a 50 ml de sais diluídos contendo:

hidrogenofosfato de amónio 66mg di-hidrogenofosfato de potássio 68hidrogenofosfato de dipotássio87 di-hidrato de cloreto de cálcio7,4 hexa-hidrato de cloreto de magnésio10

Antes da inoculação ajustou-se o volume da solução salina até 1 litro e esterilizou-se à temperatura de 121°C du rante 20 minutos.

Misturou-se esta solução com 50 ml de gelose YPG a uma temperatura que favorecia a viabilidade dos esporos de

Q O

Botrytis, compreendida no intervalo entre 30 C e 45 C, corres

-32- j pondente ao domínio de temperaturas em que a gelose se mantém fluida sem qualquer prejuízo para os esporos. Verteu-se uma quantidade de 12 ml em placas de Petri de 9 cm e deixou-se so lidificar. Efectuou-se a perfuração de 1-5 furos com 4 mm de diâmetro sobre a gelose e em cada perfuração introduziu-se 15 de caldo de cultura.

Incubaram-se as placas de Petri a uma temperatura compreendida entre 20° e 25°C durante 2 dias. A presença de um fungicida ê auto-revelada por uma zona nítida de não cre£ cimento em torno das perfurações - quanto maior for a zona mais forte é o fungicida. O sobrenadante da CMI CC 337159, sob as condições anteriormente descritas, proporcionou uma zona bastante difusa com um diâmetro de 40 mm. Utilizando um estereomicroscõpio foi possível observar que os fungos se en contravam presentes mas que o seu crescimento normal tinha sido evitado. Utilizando um microscópio õptico verificou-se que o micélio aparece sob a forma de vesículas grandes sugerindo um tipo particular de modo de acção,

Patogenicidade nos mamíferos caldo de cultura contendo um fungicida, os esporos viáveis e o micélio demonstrou não exercer qualquer efeito sob os murganhos, quando aplicado intraperitonialmente na proporção de 20 ml por Kg de peso do corpo. 0 caldo de cultu-

Procedeu-se â investigação da toxicidade do BK202 nos testes seguintes utilizando um composto de fórmula IV no estado cristalino:

Toxicidade oral aguda e intravenosa nos murganhos e

Teste da mancha de Ames e ensaios in vitro de irritação dermal (Skinte

Administrou-se aos animais um ingrediente activo em doses variáveis atê 1600 mg/kg por via oral utilizando uma sus pensão e atê 13 mg/kg utilizando uma solução aplicada intravenosamente na zona da cauda.

Tomando como base os testes avaliou-se os valores

CI₅₀ para

BK202 conforme se indica:

ATP >10 jig/ml;

Quimioluminecência >10 yig/ml

Em consequência, ê possível concluir que ο BK202 não demonstra nos testes efectuados e também que ο BK202 produz efeitos que dem à mais correspon(r) baixa possível irritação no teste com Skintex

Actividade Fungicida

Foram efectuados experiências para determinar a potência de um composto de fórmula IV contra diversos fungos. Dissolveu-se o ingrediente activo numa solução de etanol a 60% e adicionou-se a uma gelose arrefecida de dextrose de batata para se obter concentrações finais de 25, 5, 1, 0,2, 0,04 e 0,0016 yig i.a. por ml de gelose. As placas do controlo não con tinham qualquer ingrediente activo.

Verteu-se uma quantidade de 10 ml de gelose em placas de Petri de 9 cm e para cada concentração fez-se uma inocu lação com os micêlios activamente crescentes dos isolados fúngicos que se pretendia testar. Incubaram-se as placas ã temperatura óptima para permitir o crescimento desses isolados du-34-

rante 3 a 6 dias, apos o que se mediu q crescimento em milíme tros efectuando-se a comparação com os controlos.

Os isolados dos testes abrangeram uma ampla variedade de fungos, tais como os' Oomycetes, os Asccmycetes, os Basidiomycetes, os Deuteromyce tes e os Zygomycetes.

Verificou-se que ο BK202 era mais activo contra os fungos pertencentes ãs espécies Ascomycetes e Deuteromycetes. Verificou-se que era particularmente potente contra;

Classe Ascomycetes, género Venturia, v.g. V. inequalis género Sclerotinia. v.g, S. sclerotiorum género Monilinia, v.g. M. fructigena, forma-género Aspergillus, v.g. A. fumigatus forma-género Penicillium, v.g. P. digita tum

Classe Deuteromycetes, género Botrytis, v.g. B. cinerea género Ascochyta, v.g. A. pisi género Pyrenophora, v.g. P teres género Cercospora, v.g. C. beticola (mais fraco) género Phoma, v.g. P. sorghina (mais fraco) gênero Alternaria, v.g. A. alternata (mais fraco) género Fusarium, v.g. F. lycopersici (mais fraco)

Para os fungos indicados anteriormente a inibição foi muito forte com concentrações tão baixas como 0,0016 jig/ml, excepto para C, beticola, P. sorghina., A.' alternata e F« lyco-35persici, em que se verificou uma inibição mais fraca, .

Apenas foi observada fraca actividade contra a espê cie Zygomycetes e não foi observada praticamente qualquer actividade nas espécies Oomycetes e Basidiomycetes

Actividade biológica sobre as plantas

Para os valores de concentração utilizados nos Exem pios seguintes não foi observada qualquer actividade fitotõxi ca.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Aotividade contra Botrytis cinerea nos tomateiros

Efectuou-se o tratamento de tomateiros (variedade First in Field, com 3 semanas de idade) com uma suspensão líquida contendo 0,035 mg de ingrediente activo por ml. As plantas foram mantidas durante 24 horas em estufa para secagem antes de serem inoculadas com uma suspensão de esporos conten5 do 10 esporos de Botrytis cinerea por ml em sumo de toranja diluído a 25%. As plantas foram depois incubadas durante 6 dias (período de exposição ã luz correspondente a 16 horas (1000 lux) e 8 horas de escuridão a uma temperatura compreendida entre 15°C e 20°C) em sacos de polietileno transparentes, de modo a aumentar a humidade relativa até um valor compreendido en tre 95% e 100%. Nao foi observado qualquer ataque pelos fungos. As plantas de controlo, que foram tratadas conforme descrito anteriormente com excepção da aplicação do ingrediente activo em suspensão, foram todas invadidas por Botrytis cinerea.

-36Exemplo 2

Actividade contra Botrytis cinerea nas maçãs (Golden Delicious)

Utilizou-se maçãs lesionadas artificialmente que foram pulverizadas com uma suspensão contendo 9,8 de ingredien te activo por ml. No dia seguinte os frutos tratados foram ino~ 5 culados com uma suspensão de esporos dos fungos contendo 1 x 10 /ml e fez—se a incubação durante uma semana a valores elevados da hu midade do ar e a uma temperatura compreendida entre 18° e 20°C. No momento da avaliação procedeu-se ã contagem dos locais de lesões infectados e a partir daí estimou-se o efeito fungicida da substância testada. O composto activo impediu totalmente o desen volvimento dos fungos. Os frutos não tratados ficaram infectados a 100% com Botrytis cinerea.

Exemplo 3

Actividade contra Botrytis cinerea nos morangueiros (Senga-Sengana)

A experiência de campo efectuada em Funen, Dinamarca, em conformidade com as normas EPPO ( Guideline for Biological Evaluation of Fungicides. Botrytis cinerea on Strawberries ).

A dimensão do canteiro foi de 20 m e utilizou-se três réplicas. Utilizou-se o composto activo numa formulação de ensaio contendo aproximadamente 10% de ingrediente activo (i.a.). Efectuou-se a aplicação de três concentrações de composto activo: 100, 300 e 900 i.a/ha. O volume de pulverização foi de 1200 litros/ha.

Os morangueiros foram pulverizados nos seguintes estã dios de desenvolvimento: T^, início da floração.; T₂, 10% de fio

-37-, ração; T₃, 50% de floração; T₄, 80% de floração.

Como referência padrão utilizou-se o fungicida comer ciai ROVRAL ®.

Efectuou-se a avaliação contando e pesando os morangueiros saudáveis e infectados, respectivamente.

Os resultados encontram-se representados na Figura 8 onde se indica o grau de infecção para cada um dos ensaios. A partir de Figura 8 conclui-se que ο BK202 exibiu um efeito fun gicida superior quando comparado com o ROVRAL

Exemplo 4

Actividade contra Botrytis cinerea nas videiras (Ugni Blanc)

Experiência de campo efectuada em Bordéus, França, em conformidade com o método n9 37 do CEB.

Utilizaram-se um canteiro de ensaio, constituído por plantas numa fileira, e 6 réplicas. Utilizou-se o composto activo numa formulação de ensaio contendo aproximadamente 10% de ingrediente activo (i.a.). Foram aplicadas três concentrações de composto activo: 100, 300 e 900 g i.a./ha. O volume de água foi de 300 litros/ha.

As videiras foram pulverizadas nos seguintes estádios de desenvolvimento: fim da formação de cachos de uvas; T₂, início do amadurecimento das uvas e T^, 3 a 4 semanas antes da vindima.

Como referências padrão foram utilizados os fungicidas comerciais RONILAN ®e BASULTRA ®.

A avaliação foi efectuada estimando a intensidade e a frequência dos ataques de Botrytis cinerea após o aparecimen to da doença.

Os resultados encontram-se representados na Figura 9 onde se indica a intensidade da infecção (definida pela percen tagem de uvas atacadas em 100 cachos) para cada um dos ensaios.

A partir da Figura 9 conclui-se que ο BK202 exibe um efeito fun gicida superior quando comparado com os fungicidas RONILAN ® e BASULTRA ®.

Exemplo 5

Actividade contra Botrytis cinerea nos tomateiros (Matador)

Experiência em estufa efectuada em Lyngby, Dinamarca. Utilizaram-se um canteiro, de ensaio constituído por plantas (aproximadamente com 12 semanas de idade, 1 metro de altura), e 3 replicas. As plantas foram mantidas numa tenda de plástico para permitir a manutenção de uma humidade elevada. Antes da pulverização das plantas lesionou-se mecanicamente 20 folhas em cada planta para permitir um melhor ataque de Botrytis cinerea. O composto activo foi utilizado numa formulação de ensaio contendo aproximadamente 10% de ingrediente activo (i.a.) foram aplicadas três concentrações de composto activo: 0,01%, 0,03% e 0,09% i.a.. O volume de água foi de 770 ml/canteiro.

Os tomateiros foram pulverizados imediatamente apõs o lesionamento das folhas. Decorridas 24 horas apõs o tratamento com fungicida efectuou-se uma inoculação artificial pulverizando sobre as plantas esporos de B. cinerea em suspensão em sumo de laranja diluído a 30%.

Utilizou-se como referencia padrão o fungicida comercial RONILAN

Efectuou-se a avaliação contando o numero de ataques ãs folhas, caules, frutos e botões de flores.

Os resultados encontram-se representados na Figura em que se indica o grau de infecção para cada um dos ensaios^

A partir da Figura 10 conclui-se que ο BK202 exibiu, para todas as concentrações testadas, um efeito fungicida superior ao

Exemplo 6

Actividade contra isolados de Botrytis cinerea resistentes aos fungicidas;

/£)

Foram obtidos isolados resistentes ao BENLATE (iso lado A) e um isolado resistente a BENLATE ROVRAL ® e SUMISCLEX'-'' (isolado B) a partir de plantas que haviam sido pulveri zadas com os pesticidas anteriormente referidos. Determinou-se o efeito do BK202 num ensaio in vitro e comparou-se com os resultados dos três pesticidas comerciais. Adicionou-se os fungi. cidas ã gelose e fez-se uma distribuição por placas de Petri para diversas concentrações e depois procedeu-se à inoculação com uma estirpe sensível (normal (isolado C)) e com duas estir pes resistentes. Decorridos 3 dias ã temperatura de 25°C mediu -se o crescimento em mm.

Os resultados encontram-se indicados no Quadro II se guinte:

< · ·J · * ·.

QUADRO II

Pesticida	concentração ppm	Isolado A	Isolado B	Isolado C
Bk 202	10	0	0	0
	2	0	0	0
ROVRAL®	0,125	Q	0	0
10	0	13	0
	2	Q	46	0
BENLATE®	10	50	50	0
SUMISCLE3®	2	65	62	0
10	0	35	0
	2	0	46	0
Controlo	—	76	80	74

Exemplo 7

Actividade cious) contra Monilinia fructigena nas maças (Golden deli rse cada uma delas 5 vezes com um perfurador de 2,1 mm de diâ metro, mergulharam-se em suspensões contendo 0, 0,5,

500 mg i.a. por litro. Os ingredientes activos foram (ii) benomilo (BENLATE®! , (iii) iprodiona (ROVRAL^ .

5, 50 e (i) BK202

Quatro ma çãs foram perfuradas e tratadas para cada concentração dos três pesticidas totalizando lesões por cada concentração. Os fru tos foram colocados em recipientes de plástico em diversas f ileiras com as lesões voltadas para cima. Decorridas 24 horas as áreas lesionadas foram pulverizadas com uma suspensão de Moni......... 5

Unia fructigena contendo 1 x 10 esporos por ml. Os recipien-

tes foram depois cobertos com sacos de polietileno e mantidos â temperatura ambiente (aproximadamente 22°C).

Decorridos 5 dias foram avaliados os efeitos por con tagem do numero de lesões infectadas (máximo de 20 lesões in fectadas por cada tratamento).

Os resultados encontram-se indicados no Quadro III.

QUADRO III

Concentração	BK 202	BENLATE®	ROVRAL®
0	mg	ia/1	20	20	20
0,5	mg	ia/1	18	18	20
5,0	mg	ia/1	14	19	19
50	mg	ia/1	7	12	15
500	mg	ia/1	1	3	4

A partir do Quadro III ê possível concluir que a actividade do BK202 contra M. fructigena é superior quando compa rada com a actividade dos dois fungicidas comerciais testados.

Como exemplos de diversas culturas que ê possível proteger contra ataques fúngicos refere-se: peras, ameixas, pes segos, cerejas, framboesas, feijões, ervilhas, soja, culturas de oleaginosas tais como a colza, mostarda, oliveiras, girassol, etc., cereais, pepinos, melões, citrinos, tais como as la ranjas, limões, tangerinas, etc., espinafres, alfaces, batatas, pimenta, abacates, beringelas, bananas, compósitos, tais como gerbera e outras plantas ornamentais, etc..

ÍNDICE

ÂMBITO DA INVENÇÃO 1 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO ....................... 1 SUMÁRIO DA INVENÇÃO 4 DEPÓSITO DOS MICRORGANISMOS 7 BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 7 DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO ............ 8

Descrição da estirpe ..... 22

Cultura da estirpe .......... 22

Produção Fungicida ............ 23

Extracção do composto ............... 24

Estabilidade em função de Temperatura/pH ..................... 25

Analise-mêtodo HPLC ................ 26

Bioensaio ..

Patogenicidade nos mamíferos

Toxicologia

Actividade Fungicida

Actividade biológica sobre as plantas .... 35

EXEMPLOS

Exemplo 1

Exemplo 2

Exemplo 3

Exemplo 4

Exemplo 5

Exemplo 6

Exemplo 7

	...... 35
	.......... 36
	......................... 36
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	^«(w«··· «♦'**'··♦♦***♦*·♦*·· 33
	39 *·***«····· —s ·>
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REIVINDICAÇÕES

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de compostos que possuem a composição geral:

   Acido láctico (1), Glicina (1), Valina (4), isoleucina (1), ácido pipecólico (1) , ácido aspártico (1) , Tirosina (1) (I) em que cada resíduo aminoácido pode ocorrer independentemente na configuração L ou D e em que os números entre parenteses in dicam o número de ocorrências de cada radical, e seus derivados , caracterizado pelo facto de:

   a) se fazer a cultura em meio nutriente adequado, sob condições adequadas, de uma espécie pertencente ao género Curvularia;

   b) se recuperar subsequentemente o componente activo a partir da biomassa e do meio de fermentação; e

   c) se modificar, facultativamente, o composto activo para se obter o composto desejado.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obterem compostos e seus derivados que incorporam também um anel lactona.
3. 3. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obterem compostos cuja composição é Ο₅θΗθ NgO^, e seus derivados.
4. 4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de se submeter os com postos a reacções de alquilação, acilação, h-idroxilação, glicosilação, halogenação, redução, oxidação, hidrólise, esterificação ou amidação.
5. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, para a preparação de compostos de composição geral:

   Lactato (1) , Glicina (1), Valina (1), N-Me-Valina (3), N-Me-Isoleucina (1), ácido pipecólico (1), ácido

   N-Me-Aspártico (1) (II)

   O-Me-Tirosina (1) caracterizado pelo facto de cada resíduo aminoácido poder ocorrer independentemente na configuração. L ou D, indicando o número entre parenteses o número de ocorrências de cada radical, e correspondentes derivados.
6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmulas >- (III)

   OU (IV) ciclo-pec-MeVal-Val-Me.Asp-MeVal-Melle-C-ly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] caracterizado pelo facto de cada resíduo aminoacido e o resíduo lactato poderem ocorrer independentemente na configuração L ou D, e correspondentes derivados, preferencialmente os compostos de fórmulas III ou IV, em que os resíduos aminoácidos se encontram na configuração L e o resíduo lactato se encontra na confi guração D.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o composto activo possuir a fórmula III ou IV e por a sua obtenção se fazer directamente no passo (b).
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na glicosilação de um ou mais grupos no composto obtido no passo (b), para se obter um ou mais radicais que contêm açúcar.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na acilação de um ou mais grupos no composto obtido no passo (b) com um ácido orgânico de fórmula geral R-COOH, na qual R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo orgânico com 1 a 5 átomos de carbono, para se obterem compostos em que um ou mais grupos são grupos éster com 1 a 6 ãtomos de carbono.
10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na alquilação de um ou mais grupos no composto obtido no passo (b) para se obterem compostos em que um ou mais grupos são gru pos alquilo com 1 a 6 átomos de carbono.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na halogenaçãode umoumais grupos no composto obtido no passo (b) para se obterem compostos em que um ou mais grupos são átomos de halogéneo.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na redução de um ou mais grupos no composto obtido no passo (b) .
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na oxidação de -um ou mais grupos no composto obtido no passo (b) .
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a modificação do passo (c) consistir na hidrólise de um ou mais grupos no composto obtido no passo (b) .
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 1 e as reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser Curvularia sp. (CMI CC N2 337159).
16. 16. - Processo para a preparação de composições fungicidas, caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo um composto preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o referido composto se encontrar presente 'numa quantidade compreendida entre 0,001^ig/ml e lOO^ug/ /ml.
18. 18. - Processo para a preparação de composições fungicidas, caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo um fungo de uma espécie pertencente ao género Curvularia.
19. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o fungo ser Curvularia sp.

    (CMI CC No 337159).
20. 20. - Processo para a preparação de composições fungicidas, caracterizado pelo facto de se incorporar como ingre-r diente activo um composto preparado peio processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 em associação com outros agentes biocidas.
21. 21. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de os outros agentes biocidas serem seleccionados no grupo constituído por pesticidas, tais como fungicidas, herbicidas, insecticidas, nematocidas, acaricidas ou nutrientes das plantas, reguladores do crescimento das plantas e fertilizantes.
22. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o outro agente biocida ser um funcida seleccionado no grupo constituído por inibidores da biossíntese do ergosterol (EBIs, azóis ou não azóis), anilidas, benzimidazóis, carbamatos, dicarboximidas, ditiocarbamatos, bisditiocarbamatos, imidazõis, triazóis, ftalonitrilos, compostos poli-halogeno-alquil-tio e derivados fosforosos.
23. 23. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 20 a 72, caracterizado pelo facto de o outro agente activo se encontrar presente numa quantidade compreendida entre 0,001 e 50% em peso, e de preferência entre 0,01 e 10% em peso.
24. 24.- Cultura pura isolada de um microrganismo, ca- racterizada pelo facto de o microrganismo ser Curvularia sp.