PL169773B1 - Kompozycja grzybobójcza i dodatek grzybobójczy PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Kompozycja grzybobójcza do wykorzystania nie-farmaceuty cznego, zwlaszcza do zabiegów na roslinach, do zabezpieczania drewna lub budulca drewnianego, farb, kosmetyków, pasz, pozywek wzrostowych oraz srodków spozywczych, zawierajaca nosnik oraz substancje pomocnicze, stosowne do przeznaczenia kompozycji oraz skladnik aktywny o wlasciwo- sciach grzybobójczych, znamienna tym, ze jako skladnik aktywny zawiera nowy zwiazek obudowie okreslonej wzorem III cyklo-[Pec-MeAsp-Me- Wal-Wal-MeWal-Melle-Gli-MeWa(III) TyrOMe-D-Lakt] i strukturze okreslonej wzorem 2 lub wzorem IV cyklo-[Pec-MeWal-Wal-MeAsp-MeWal-MeIle-Gli-MeWal(IV) TyrOMe-D-Lakt] i strukturze okreslonej wzorem 3, w których kazda z reszt aminokwasowych moze nieznacznie wystepowac w form ie L lub D Iub pochodne tych zwiazków, korzystnie zwiazek o wzorze III lub IV, w których wszystkie reszty ami- nokwasowe wystepuja w formie L, a reszta laktonowa w formie D lub ich pochodne, zwlaszcza wybrane sposród pochodnych alkilowych, acylowych, hydroksylowych, glikozylowych i chlorowcowych, albo tez wskazany zwiazek w postaci zredukowanej, utlenionej, zhydrolizowanej, zestryfiko- wanie lub przeksztalcony w amid, w ilosci od 0,001 µ g/ml do 100 µ g/ml 2 Dodatek grzybobójczy do srodków spozywczych, pozy-w e k wzrostowych, pasz, srodków kosmetycznych, srodków do kon- serwacji drewna lub srodków ochrony roslin, znamienny tym, ze zawiera zwiazek o budowie okreslonej wzorem III. cyklo-[Pec-MeAsp-MeWal-Wal-MeWal-MeIle-Gli-MeWal (III) TyrOMe-D-Lakt] i strukturze okreslonej wzorem 2 lub wzorem IV cyklo-[Pec-MeWal-Wal-MeAsp-MeWal-MeIle-Gli-MeWal(IV) TyrOMe-D-Lakt] i strukturze okreslonej wzorem 3, W ZÓ R 2 W ZÓ R 3 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy kompozycji grzybobójczych zawierających nowe związki o właściwościach grzybobójczych, wytwarzane sposobem opartym na zastosowaniu mikroorganizmów zdolnych do ich wytwarzania, przeznaczonych zwłaszcza do zabiegów na roślinach do zwalczania grzybów w wartościowych uprawach oraz dodatków grzybobójczych zawierających nowe związki o właściwościach grzybobójczych do zabezpieczania drewna, farb, kosmetyków, żywności, pożywek wzrostowych i pasz.

Od wielu lat wiadomo, że różne mikroorganizmy wytwarzają metabolity przejawiające aktywność biologiczną przydatne jako środki biobójcze do zwalczania chorób i chwastów.

169 773

W szczególności wiadomo, że niektóre gatunki z rodzaju Curvularia wytwarzają różne metabolity przejawiające biologiczną aktywność, zwłaszcza jako fitotoksyny. Jednakże, o żadnym z tych metabolitów nie było wiadomym, aby miał działanie grzybobójcze. Stwierdzono, że C. lunata (Wakk.) Boed wytwarza co najmniej dwie fitotoksyny. Powodują one występowanie plamek nekrotycznych na liściach roślin, nawet przy użyciu w dużym rozcieńczeniu. (F. Macri i A. Vianello Physiological Plant Pathology 8:325-331, 1976). Toksyny te są fitotoksynami niespecyficznymi ze względu na gospodarza. Toksyny specyficzne ze względu na gospodarza zostały wyodrębnione z przesączów kultur C. pallescens Boedijn oraz z dotkniętych chorobą liści rośliny gospodarza zaatakowanej przez ten gatunek (Olufolaij, Cryptogamie Mycol. 7(4):335-342, 1986). Wymienione substancje toksyczne powodowały plamy chlorotyczne na roślinach kukurydzy. Z czasem przekształcały się one w plamy nekrotyczne, podobne do obserwowanych in vivo takich, jakie stanowią symptom choroby powodowanej przez C. pallescens.

Wyodrębniono makrocykliczny metabolit o nazwie kurwularyna z gatunków Curvularia (O. C. Musgrave, J. Chem. Soc. 1956,4301) oraz z C. lunata (Coombe et al. Aust. Chem. 21:783, 1968). Wzór ogólny tego związku to C16H20O5 (ciężar cząsteczkowy 291,3 a wzór strukturalny określa wzór 1 na załączonych rysunkach. Związek ten wyodrębniono w stanie surowym w postaci bezbarwnych lub jasno żółto brązowych kryształów.

Ani związek o wzorze 1 (kulwularyna) ani surowe przesącze z kultur Culvularia nie wykazują działania antybakteryjnego (względem Bacillus subtilis, Escerichia coli i Staphylococcus aureus) ani działania przeciw organizmom grzybowym (test kiełkowania sporów z użyciem Penicillium digitatum).

Żaden z wyżej omówionych związków nie jest przydatny do zwalczania chorób roślin i chwastów z powodu silnej fitotoksyczności.

Chociaż osiągnięto już znaczny postęp w dziedzinie identyfikacji i opracowywania biologicznych substancji biobójczych do zwalczania różnych chorób i szkodników roślin 1 zwierząt o dużym znaczeniu agronomicznym, nadal większość stosowanych substancji biobójćzych stanowią związki syntetyczne, ulegające z trudem rozkładowi w środowisku naturalnym i posiadające szerokie spektrum aktywności.

Od blisko dziesięciu lat nasila się niepokój o wpływ takich związków na środowisko naturalne i ekosystemy otaczające pola uprawne co w konsekwencji zadecydowało o tym, że istnieje głośno wyrażane zapotrzebowanie na związki biobójcze bardziej specyficzne pod względem ich aktywności i ulegające łatwej degradacji w środowisku naturalnym.

Celem wynalazku jest zapewnienie nowych kompozycji o działaniu grzybobójczym pozbawionych wad znanych rozwiązań.

Szereg związków podobnych do nowych związków stanowiących aktywne składniki kompozycji objętych niniejszym wynalazkiem zostało ujawnionych w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 360 760 (Sandoz AG) opublikowanym 28. 03. 1990. O związkach tych podano, że są wytwarzane przez grzyby rodzaju Septoria oraz że posiadają ciekawe właściwości farmakologiczne, przykładowo działanie przeciwgrzybowe u zwierząt w stosunku do drożdży i drożdżopodobnych gatunków powodujących ataki układowe. Zgłoszenie to zawiera odniesienie do tylko jednego testu przeciwko Candida bez wskazania, aktywność którego z 82 udokumentowanych związków, była badana. W zgłoszeniu tym wskazano jednakże, że najkorzystniejszy związek ma budowę określoną wzorem:

cyklo-[Pec-MeW al-W al-MeAsp-Melleu-Melleu-Gli-MeW al-T yrOMe-D-mleczan] (Przykład 1, pierwszy związek).

Jak wspomniano wyżej wszystkie znane metabolity pleśni rodzaju Curvularia wykazywały silne działanie fitotoksyczne, lecz obecnie nieoczekiwanie okazało się, że grzyby należące do tego rodzaju wytwarzają także metabolity, które przejawiają silne działanie grzybobójcze, przy równoczesnym braku działania fitotoksycznego.

Wynalazek w ogólnym aspekcie opiera się na grupie związków o ogólnej budowie określonej wzorem I;

169 773

Mleczan (1), Glicyna (1), Walina (4) Izoleucyna (1), kwas pipekolinowy (l) kwas asparaginowy (1) T yrozyna (1) (I) gdzie każda z reszt aminokwasowych może niezależnie występować w formie L lub D i gdzie cyfry w nawiasach wskazują ile razy dana reszta występuje oraz ich pochodnych, a zwłaszcza związku o wzorze C56H 89N9 014 i jego pochodnych, w tym takich związków o ogólnej budowie określonej wzorem II;

Mleczan (1), Glicyna (1), Walina (1), N-Me-Walina (3),

N-Me-Izoleucyna, kwas pipekolinowy (1), kwas N-Me-asparaginowy (1),

O-Me-Tyrozyna (1) (II) gdzie każda z reszt aminokwasowych może niezależnie występować w formie L lub D i gdzie cyfry w nawiasach wskazują ile razy dana reszta występuje oraz ich pochodnych.

Kompozycja grzybobójcza, do wykorzystania nie-farmaceutycznego, zwłaszcza do zabiegów na roślinach, do zabezpieczania drewna lub budulca drewnianego, farb, kosmetyków, pasz, pożywek wzrostowych oraz środków spożywczych, zawierająca nośnik oraz substancje pomocnicze, stosowne do przeznaczenia kompozycji oraz składnik aktywny o właściwościach grzybobójczych, zgodnie z wynalazkiem jako składnik aktywny zawiera nowy związek o budowie określonej wzorem III;

cyklo-[Pec-MeAsp-MeWal-Wal-MeWal-MeIleu-Gli-MeWal

TyrOMe-D-młeczan] (III) którego strukturę określa wzór 2, na załączonych rysunkach, lub związek o wzorze IV; cyklo-[Pec-MeWal-Wal-MeAsp-MeWal-MeIleu-Gli-MeWal

TyrOMe-D-mleczan] (IV) którego strukturę określa wzór 3, na załączonych rysunkach, z zastrzeżeniem, że każda z reszt aminokwasowych we wzorach III i IV może niezależnie występować w formie L lub D, bądź pochodne tych związków, korzystnie związek o wzorze III lub IV i odpowiadających im strukturach określonych wzorami 2 i 3 odpowiednio, w których wszystkie reszty aminokwasowe występują w formie L a reszta laktonowa w formie D lub ich pochodne, zwłaszcza wybrane spośród pochodnych alkilowych, acylowych, hydroksylowych, glikozylowych i chlorowcowych, albo też wskazany związek w postaci zredukowanej, utlenionej, zhydrolizowanej, zestryfikowanej lub przekształcony w amid, w ilości od 0,001 gg/ml do 100 gg/ml.

Szczególną postać kompozycji według wynalazku stanowi dodatek grzybobójczy do środków spożywczych, pożywek wzrostowych, pasz, środków kosmetycznych, środków do konserwacji drewna lub środków ochrony roślin, który zgodnie z wynalazkiem zawiera związek o budowie określonej wzorem III;

cyklo-[Pec-MeAsp-MeWal-Wal-MeWal-Melle-Gli-MeW al (III)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 2 na załączonych rysunkach lub wzorem IV:

cyklo- [Pec-MeW al-W al-MeAsp-MeWal-Melle-Gli-MeWal (IV)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 3 na załączonych rysunkach, gdzie dodatkowo każda z reszt aminokwasowych może niezależnie występować w formie L lub D lub pochodne tych związków, korzystnie związek o wzorze III lub IV i odpowiadających im strukturach określonych wzorami 2 i 3 odpowiednio, w których wszystkie reszty aminokwasowe występują w formie L, a reszta laktonowa w formie D lub ich pochodne, zwłaszcza wybrane spośród pochodnych alkilowych, acylowych, hydroksylowych, glikozylowych i chlorowcowych, albo też wskazany związek w postaci zredukowanej, utlenionej, zhydrolizowanej, zestryfikowanej lub przekształcony w amid w mieszaninie z nośnikiem ciekłym lub stałym, zgodnym z podstawowym środkiem spożywczym, paszą, środkiem kosmetycznym, środkiem do konserwacji drewna lub środkiem ochrony roślin.

Dodatek według wynalazku przeznaczony jest do stosowania w ilości skutecznej grzybobójczo, korzystnie w ilości od 0,001 do 100 gg substancji aktywnej na 1 ml mieszaniny dodatku z podstawowym środkiem spożywczym, paszą, środkiem kosmetycznym, środkiem do konserwacji drewna lub środkiem ochrony roślin.

169 773

5'

Dodatek według wynalazku jest skuteczny grzybobójczo względem grzybów z gatunków należących do klas Ascomycetes lub Deuteromycetes, zwłaszcza rodzajów Venturia, Sclerotina, Monilinia. Aspergillus. Penicillium, Botrytis, Ascochyta, Pyrenophora, Cercospora lub Phoma, w szczególności rodzaju Botrytis - Botrytis cinerea.

Dodatki według wynalazku pozwalają na kontrolowanie rozwoju grzybów w żywności i paszach, drewnie, farbach, pożywkach, kosmetykach i tym podobnych produktach.

Nowe związki o właściwościach grzybobójczych stanowiące nowy aktywny składnik kompozycji według wynalazku wytwarzane są przy wykorzystaniu określonych mikroorganizmówjak i procesów chemicznych do pełnego lub semi-syntetycznego wytwarzania wskazanych związków. W celu wytworzenia związków o wyżej określonych wzorach III i IV o odpowiadających im strukturach określonych wzorami 2 i 3 prowadzi się hodowlę gatunków należących do rodzaju Curvularia na odpowiedniej pożywce w odpowiednich warunkach, a następnie wyodrębnia się składnik aktywny z biomasy i brzeczki fermentacyjnej oraz ewentualnie modyfikuje się wyodrębniony związek aktywny z wytworzeniem pożądanej pochodnej tego związku.

Korzystne okazały się pochodne otrzymane przez modyfikację wyodrębnionego związku aktywnego poddając jedną lub kilka grup tego związku

- glikozylacji, przez co przekształca się je w jedno lub kilka ugrupowań zawierających reszty cukrowe, albo

- acylacji kwasem organicznym o wzorze ogólnym R'-COOH, w którym R' oznacza atom wodoru lub grupę organiczną o 1-5 atomach węgla, i otrzymuje się zmodyfikowane związki zawierające jedną lub kilka grup estrowych o 1-6 atomach węgla, albo

- alkilowaniu i otrzymuje się zmodyfikowane związki zawierające jedną lub kilka grup alkilowych o 1-6 atomach węgla, albo

- chlorowcowaniu i otrzymuje się zmodyfikowane związki zawierające jeden lub kilka atomów chlorowców, albo

- redukcji, utlenianiu bądź hydrolizie.

Korzystnie, w celu wytworzenia nowych związków stosowanych jako nowe składniki aktywne kompozycji według wynalazku, jako mikroorganizm stosuje się Curvularia sp. (CMI CC No. 337159). Szczep grzyba Curvularia sp. (CMI CC No. 337159) został zdeponowany w banku szczepów Instytutu Mykologicznego Wspólnoty Brytyjskiej (Commonwealth Mycological Institute Culture Collection CMI CC) przy Ferry Lane, w Kew, Surrey TW9 3AF, w Anglii, zgodnie z wymogami procedury patentowej, w dacie wskazanej poniżej. CMI CC, będąc międzynarodową kolekcją w rozumieniu układu budapesztańskiego, zapewnia trwałość depozytu zgodnie z zasadą 9 tego układu.

Data zdeponowania znak deponującego oznaczenie CMI CC lutego 199S)O r.

1ΊΊ

CMICC No. 337159

CMI CC 337159 należy do klasy Deuteromycetes, podklasy Hypomycetidae i rodziny Dematiaceae. Grzyb ten jest nowym gatunkiem rodzaju Curvularia.

Wynalazek jest dokładniej opisany w oparciu o załączone rysunki, na których fig. 1 przedstawia graficznie zależność stabilności/aktywności nowych związków stanowiących składnik aktywny kompozycji według wynalazku od temperatury i pH, fig. 2, 3 i 4 przedstawiają widma ¹ H-NMR przy 400MHz takiego wyizolowanego związku w CDCI3, DMSO-d6 i CD3OD, fig. 5 przedstawia widmo ^1JC-NMR przy 100,6MHz takiego wyizolowanego związku w CDCI3, fig. 6 przedstawia widmo w podczerwieni IR takiego wyizolowanego związku w KBr, fig. 7 przedstawia widmo w podczerwieni IR metylowej pochodnej w KBr, a fig. 8,9 i 10 przedstawiają wyniki stosowania kompozycji według wynalazku, zawierającej nowy związek aktywny, odpowiednio w odniesieniu do hodowli truskawek, winogron i pomidorów zaatakowanych przez Botrytis cinerea.

Jak wspomniano powyżej, związki o wzorach III i IV wyodrębniono jako metabolity z nowego gatunku rodzaju Curvularia, Curvularia sp. (CMI CC '37159). Związki należące do tej klasy struktur organicznych, co określone wzorami III i IV są związkami nowymi. Najbliższe im znane związki opisane w zgłoszeniu europejskim nr EP 360 760 omówiono wyżej. Główna różnica w budowie związków według obecnego wynalazku i związków znanych z EP 360 760

169 773 polega na tym, że w znanych związkach zawsze występują dwie sąsiadujące ze sobą reszty izoleucynowe. Chociaż, związki znane z europejskiego zgłoszenia EP 360 760 mają bardzo zbliżoną budowę, nie mogły być one nigdy przeznaczone do zastosowania w rolnictwie. Wynika to z ich wysokiej toksyczności (około 100 mg/kg p.o.) i niskiej aktywności grzybobójczej (dawka 25 do 300 mg/kg, dawki dzienne od 300 do 3000 mg) co ilustrują badania w odniesieniu do Candida opisane na stronach 47-49 zgłoszenia EP 360 760.

Ponadto, w zgłoszeniu EP 360 760 wskazano jedynie farmaceutyczne zastosowanie omawianych związków. W konsekwencji zaskakująca specyficzność i aktywność do celów agronomicznych kompozycji według obecnego wynalazku nie może w żadnej mierze wynikać ze zgłoszenia EP 360 760.

Stanowiące nowy aktywny składnik kompozycji według wynalazku, związki o wzorach III i IV można wytwarzać na drodze aerobowej hodowli w odpowiedniej pożywce i w warunkach opisanych poniżej - szczepu grzyba należącego do rodzaju Curvularia, w szczególności grzyba Curvularia sp. (CMI CC 337159) i następnie wyodrębniania aktywnego składnika z biomasy i brzeczki fermentacyjnej.

Naturalny metabolit ewentualnie poddaje się modyfikacji chemicznej w celu otrzymania jego różnorodnych pochodnych. Pochodne te wytwarza się w celu poprawienia niektórych właściwości metabolitu, takich jak rozpuszczalność w roztworach wodnych, jego hydrofobowości, hydrofilności, stabilności, specyficzności działania i tym podobnych.

Związki stanowiące nowy składnik aktywny kompozycji objętych wynalazkiem można również wytwarzać na drodze znanych procesów syntezy chemicznej przy użyciu dostępnych materiałów wyjściowych.

Pochodne pokrewnych związków i sposoby wytwarzania takich pochodnych opisano w szczegółach w zgłoszeniu europejskim EP 360 760, którego treść włącza się do niniejszego opisu na zasadzie odnośnika literaturowego. Szczególnym typem pochodnych związków o wzorach ΠΙ i IV, stanowiących korzystny składnik kompozycji według wynalazku są związki otrzymane przez otwarcie pierścienia laktonowego. Jedną z grup takich pochodnych związków o wzorach III lub IV, są takie związki, w których jedna lub kilka grup hydroksylowych i/lub aminowych poddana została glikozylacji jedną lub kilkoma resztami cukrowymi. Inną grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach III lub IV, w których jedna lub kilka grup hydroksylowych i/lub aminowych poddana została acylowaniu kwasami organicznymi z wytworzeniem grup estrowych i/lub amidowych. Dalszą grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach III lub IV, w których jedna lub kilka grup hydroksylowych i/lub aminowych poddana została alkilowaniu z wytworzeniem eterów/amin. Dalszą grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach ΙΠ lub IV, w których jedna lub kiika grup z<^^t^^l^^ podstawionych na chlorowcowania, z wytworzeniem związków, w których jedna lub kilka grup stanowią atomy chlorowców. Dalszą grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach DI lub IV, w których jedną lub kilka grup przekształcono na drodze redukcji, otrzymując odpowiednio zredukowany związek. Dalszą grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach III lub IV, w których jedną lub kilka grup przekształcono na drodze utleniania, otrzymując odpowiednio utleniony związek. Dalszą grupę takich pochodnych stanowią związki o wzorach III lub IV, w których jedną lub kilka grup przekształcono na drodze hydrolizy, otrzymując odpowiednio zhydrolizowany związek.

Chociaż, w niniejszym opisie zasadniczo mowa jest o specyficznym szczepie CMI CC 337159, powszechnie wiadomo, że właściwości mikroorganizmów mogą ulegać zmianie w sposób naturalny i sztuczny. Tak więc wszystkie szczepy rodzaju Curvularia, łącznie z wariantami, rekombinantami i mutantami, niezależnie od tego czy otrzymanymi na drodze naturalnej selekcji, czy wytworzonymi przez działanie środkiem powodującym mutację, takimjak promieniowanie jonizujące, naświetlanie nadfioletem, czy też przez działanie chemicznym mutagenem takim jak nitrozoguanidyna, mogą być wykorzystane do produkcji pożądanych związków stanowiących składnik kompozycji według wynalazku.

Powszechnie wiadomo, że grzyby mogą wytwarzać bardzo zbliżone metabolity (porównaj zgłoszenie europejskie EP 360 760, gdzie podano, że trzy podobne związki wytworzone są przez ten sam grzyb) o takim samym lub podobnym działaniu, lecz o pewnych niewielkich różnicach

169 773 w budowie chemicznej. Obecny wynalazek opiera się zatem także na wprowadzeniu w skład kompozycji według wynalazku także takich ściśle zbliżonych związków wytwarzanych przez CMI CC 337159.

W zależności od okoliczności, takich jak rodzaj uprawy, w której grzyby mają być zwalczane, warunków środowiska i innych czynników, kompozycja według wynalazku obok wskazanych związków o działaniu grzybobójczym według wynalazku, może zawierać również jako substancje pomocnicze inne składniki, takie jak inne substancje bioczynne, takie jak fungicydy, herbicydy, insektycydy, nematocydy, akarycydy, bądź środki odżywcze, regulatory wzrostu lub środki użyźniające.

Przykładem innych związków fungicydowych, które mogą stanowić substancję pomocniczą w kompozycji według wynalazku, są zwłaszcza ergosterolowe inhibitory biosyntezy (EBIs). Są nimi, generalnie, pochodne imidazolowe lub triazolowe, takie jak przykładowo niżej wymienione substancje znane pod następującymi nazwami potocznymi: prochloraz, triadimefon, propiconazole, diclobutrazol, triadiminol, flusilazole, flutriafol, myclobutanil, penconazole, quinconazole, imazalil i diniconazole. Przykładowymi nieazolowymi inhibitorów EBIs są nuarimol, fenarimol, fenpropimorph, tridemorph i fenpropidine. Innymi fungicydami, które można łączyć z enzymatycznymi preparatami według wynalazku są anilidy, przykładowo carboxin, metalaxyl, furalaxyl, ofurace, benalaxyl, mepronil, flutolanil, pencycuron i oxadixyl, benzimidazole, przykładowo benomyl i carbendazim, karbaminiany, przykładowo maneb, mancozeb i propamocarb, imidy kwasów dwukarboksylowych, przykładowo iprodione, vinclozolin i procymidone, pochodne fosforowe, przykładowo pyrazophos, tolclofos-methyl i fosetyl aluminum oraz inne różnorakie związki, w tym dwutiokarbaminiany, bis-dwutiokarbaminiany, imidazole, triazole, ftalonitryle, poli-chlorowcoalkilotio-związki, a także iminoctadine, guazatine, dicloran, chlorothalonil, pyrifexox, ethirimol, cymoxanil, fenylopirole, thiocyofenes, pirymidyny i anilazine.

Kompozycje według wynalazku mają nie-farmaceutyczne zastosowanie, jednak gdy stanowią dodatek do pasz lub żywności, przeznaczony do zwalczania grzybów w kompozycjach do spożycia przez ludzi lub zwierzęta, mogą zawierać nowe związki aktywne w połączeniu z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, a w uzasadnionych przypadkach także inne aktywne składniki takiejak antybiotyki, z odpowiednim obojętnym lub zgodnym znanym nośnikiem.

Kompozycje grzybobójcze według wynalazku, przeznaczone do stosowania w rolnictwie i/lub sadownictwie można sporządzić przez zmieszanie aktywnej substancji z odpowiednim obojętnym lub zgodnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, otrzymując kompozycję tego typu co generalnie stosowane w rolnictwie, takie jak. zwilżalne proszki, zemulgowane koncentraty, stężone emulsje, preparaty granulowane, proszki rozpuszczalne w wodzie, alginian, guma ksantanowa i/lub aerozol. Jako przydatne stałe nośniki dla takich kompozycji wymienić można: bentonit, ziemia okrzemkowa, apatyt, gips, talk, pirofilit, wermikulit, zmielone skorupki (muszle) i glina. Zastosować można również dodatek środka powierzchniowo-czynnego w celu otrzymania homogenicznego, stabilnego preparatu.

Jakjuż wspomniano, rozcieńczalnik lub nośnik w kompozycjach według wynalazku może być stały lub ciekły, ewentualnie z dodatkiem środka powierzchniowo-czynnego, przykładowo środka dyspergującego, emulsyfikatora lub środka zwilżającego. Do odpowiednich środków powierzchniowo-czynnych zalicza się związki anionowe, takie jak sole kwasów karboksylowych, przykładowo sole metali i kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach węglowych, N-acylowe pochodne kwasu sarkozynowego, mono- i dwuestry kwasu fosforowego i alkoholi tłuszczowych, oksyetylenowane pochodne lub sole takich estrów, estry kwasu siarkowego i alkoholi tłuszczowych, takie jak siarczan sodowo-dodecylowy, siarczan sodowo-oktadecylowy lub siarczan sodowo-cetylowy, oksyetylenowe pochodne siarczanów alkoholi tłuszczowych, oksyetylenowe pochodne siarczanów alkilofenolowych, lignosulfoniany, produkty sulfonowania przy rafinacji ropy naftowej, sulfoniany alkilowoarylowe, takie jak sulfoniany alkilobenzenowe lub sulfoniany niższoalkilonaftalenowe, przykładowo sulfonian butylo-naftalenowy, sole sulfonowanych kondensatów naftalenowo-formaldehydowych, sole sulfonowanych kondensatów fenolowo-formaldehydowych i bardziej skomplikowane sulfoniany takie jak sulfonia8

169 773 ny amidowe, przykładowo sulfonowany produkt kondensacji kwasu oleinowego i N-metylo-tauryny lub sulfobursztyniany dwualkilowe. Niejonowe środki obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych tłuszczowymi grapami alkilowymi lub alkenylowymi oraz tlenku etylenu, tłuszczowych estrów eterów alkoholi polihydroksylowych przykładowo estrów sorbitanowych kwasów tłuszczowych, produkty kondensacji takich estrów z tlenkiem etylenu, blokowe kopolimery tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikoli acetylenowych, takich jak 2,4,7,9-tetraetylo-5decyn-4,7-diol lub oksyetylenowych pochodnych glikoli acetylenowych.

Przykładowymi kationowymi środkami powierzchniowo-czynnymi są alifatyczne mono-, dwu i poliaminy w postaci octanów, naftalenianów i oleinianów, aminy zawierające w cząsteczce atom tlenu, takie jak tlenki amin lub polioksyetylenowe alkiloaminy, aminy w związkach z wiązaniami amidowymi, otrzymane przez kondensację kwasu karboksylowego z dwu lub poliaminą, lub czwartorzędowe sole amoniowe.

Kompozycje według wynalazku mogą mieć dowolną, stosowaną w agrochemii postać, przykładowo postać roztworu, zawiesiny, wodnej emulsji, mączki do rozpylania, zaprawy do nasion, proszku do wytwarzania zawiesin, zemulgowanego koncentratu lub granulek. Ponadto, mogą mieć one postać do bezpośredniego stosowania lub stanowić koncentrat bądź pierwotną kompozycję, która przed użyciem wymaga rozcieńczenia stosowną ilością wody lub innego rozcieńczalnika.

Zemulgowany koncentrat zawiera składnik aktywny rozpuszczony w nie mieszającym się z wodą rozpuszczalniku, z którego sporządza się emulsję z wodą w obecności środka emulgującego.

Mączka do rozpylania zawiera składnik aktywny zmieszany i zmielony ze stałym subtelnie rozdrobnionym nośnikiem rozcieńczalnikiem przykładowo z kaolinem. Stałe granulki zawierają składnik aktywny związany z podobnym rozcieńczalnikiem stałym, jak ten, który wykorzystuje się w mączkach do rozpylania, z tąjedynie różnicą, że mieszaninę granuluje się w znany sposób. Alternatywnie, składnik aktywny jest adsorbowany lub absorbowany na uprzednio zgranulowanym rozcieńczalniku stałym, przykładowo takimj ak ziemia Fullera, atapulgit lub gryz wapienny. Zwilżalne proszki, granulki lub groszki zawierają zwykłe składnik aktywny zmieszany z odpowiednim środkiem powierzchniowo-czynnym oraz obojętnym sproszkowanym stałym rozcieńczalnikiem takim jak kaolin.

Innym odpowiednim koncentratem jest płynny koncentrat w zawiesinie, który otrzymuje się przez zmielenie składnika aktywnego z wodą lub inną cieczą, środkiem zwilżającym i środkiem rozpraszającym do wytworzenia zawiesiny.

Stężenie związków aktywnych w opisanych wyżej kompozycjach według wynalazku, można regulować w szerokich granicach, w zależności od typu preparatu i jego przeznaczenia. Przyjmuje się, że związki aktywne według wynalazku można stosować w stężeniach w zakresie od około 0,001 pg/ml do 10 mg/ml, korzystnie od 0,1 pg/ml do 1 mg/ml, w celu kontrolowania rozwoju grzybów.

Kompozycje według wynalazku przeznaczone mogą również być do zwalczania grzybów na roślinach, polegających na nanoszeniu efektywnej ilości fungicydowo aktywnego związku według wynalazku na obszar, jaki wymaga zabiegu. W związku z tym aspektem wynalazku, kompozycje według wynalazku przeznaczone do użytku agronomicznego lub sadowniczego mogą być nanoszone albo bezpośrednio na glebę, w zabiegach przed wykiełkowaniem jako zaprawy na powierzchnię nasion, albo w zabiegach po wykiełkowaniu na liście lub owoce roślin. W zależności od rodzaju uprawy oraz od warunków, zabiegi można odłożyć do czasu pojawienia się na roślinach nasion lub owoców, na których rozwój grzybów winien być kontrolowany.

Aktywne preparaty lub kompozycje według wynalazku można stosować bezpośrednio na rośliny, przykładowo przez spryskiwanie lub opylenie, albo w momencie pojawienia się grzyba na roślinie lub przed jego wystąpieniem w charakterze zabiegu profilaktycznego, zabezpieczającego. Przy obu sposobach wykorzystania, za korzystny uważa się nanoszenie na listowie przez rozpylanie. Zasadniczo dla dobrych wyników kontrolowania rozwoju grzybów ważne jest stosowanie zabiegów we wczesnej fazie rozwoju roślin, kiedy rośliny mogą być szczególnie silnie uszkodzone. Czasami użytecznym postępowaniem jest zabieg na korzeniach rośliny przed

169 773 lub w czasie sadzenia, polegający przykładowo .na zanurzeniu korzeni w odpowiednio płynnej łub stałej kompozycji. Gdy aktywny preparat według wynalazku stosuje się bezpośrednio na roślinę, odpowiednia dawka wynosi od 0,001 do 50 kg/ha, korzystnie od 0,05 do 5 kg/ha.

Aktywny preparat według wynalazku bez dodatków lub w kombinacji z konwencjonalnymi środkami bioczynnymi można także nanosić na nasiona lub naturalne siedlisko roślin. Tak więc preparaty można nanosić bezpośrednio na glebę przed lub po redleniu, tak aby aktywny składnik mógł w glebie kontrolować rozwój grzybów, jakie mogłyby zaatakować nasiona.

Kompozycje można stosować w ilościach odpowiadających od około 1 g do 100 kg grzybobójczo aktywnego składnika na jeden hektar.

Gdy glebę zadaje się bezpośrednio aktywnymi preparatami (bez dodatków lub w mieszaninie z konwencjonalnymi związkami bioczynnymi) można je nanosić w dowolny sposób zapewniający dokładne wymieszanie z glebą, taki jak rozpylania, rozsiewanie stałych granulek lub też wysiewanie składnika aktywnego w tym samym czasie co wysiew nasion do redlinek. Odpowiednie dawki mieszczą się w granicach od 0,01 do 50 kg/ha, korzystnie od 0,05 do 5 kg/ha.

Zawartość związków o działaniu grzybobójczym w kompozycjach według wynalazku stosowanych na rośliny bez dodatków lub w mieszaninie substancjami pomocniczymi takimi jak konwencjonalne fungicydy, wynosi od około 0,001 do 30% wagowych, korzystnie od 0,01 do 3,0% wagowych. W kompozycjach pierwotnych (do późniejszego rozcieńczania) stężenie składników aktywnych może zmieniać się w szerokim zakresie i może wynosić od 5 do 95% wagowych w przeliczeniu na masę kompozycji.

Zawartość substancji pomocniczych w postaci innych fungicydowo aktywnych składników w kompozycjach według wynalazku przeznaczonych do stosowania w stosunku do roślin, korzystnie wynosi od 0,001 do 50% wagowych, zwłaszcza 0,01 do 10% wagowych. W kompozycjach pierwotnych (do późniejszego rozcieńczania) ilość innych składników aktywnych może zmieniać się w szerokim zakresie i wynosić od 5 do 80% wagowych w przeliczeniu na masę kompozycji.

Chociaż kompozycje według wynalazku szczegółowo opisano w odniesieniu do metod zwalczania grzybów na roślinach, wynalazek obejmuje także wykorzystanie nowych fungicydowo aktywnych związków otrzymywanych wyżej opisanym sposobem do konserwowania drewna przez dodawanie tych związków do kompozycji do konserwowania i/lub impregnacji drewna. Dodatkowo, te same aktywne związki są dogodnym dodatkiem przydatnym jako fungicyd i konserwant do farb, zapewniającym zabezpieczenie przed rozwojem grzybów w farbie podczas składowania, jak również zabezpieczenie przed rozwojem grzybów na przedmiotach pokrywanych takimi farbami, takich jak powierzchniowe gipsowane warstwy elewacji i tynki budynków.

Dodatkowo, z uwagi na niską toksyczność wskazane nowe grzybobójczo aktywne związki, zgodnie z wynalazkiem są składnikiem aktywnym dodatku do kosmetyków, żywności i pasz lub innych tego typu produktów, do których można dodawać te związki po procesach gotowania.

Ponadto, zgodnie z wynalazkiem takie dodatki fungicydowe zawierające wskazane związki aktywne grzybobójczo, nadają się do pożywek wzrostowych dla różnych mikroorganizmów takich jak E. coli, Pseudomonas aeroginosa, Serpula lacrymans i Cladosporium sp.

Wynalazek bliżej objaśniają przykłady poświęcone wytworzeniu nowych związków stanowiących składnik aktywny kompozycji i dodatków według wynalazku, jak również określeniu ich właściwości decydujących o właściwościach kompozycji według wynalazku.

Przykład I. Związki aktywne otrzymuje się prowadząc hodowlę określonego mikroorganizmu:

Opis szczepu

Kolonie: szare, bawełniste, czasami strefowe.

Konidiofory: pojedyncze lub w skupiskach, pojedyncze, proste lub zagięte, kolankowate.

Konidia: akno-pleurokątne, z 2-4 przegrodami gdy osiągną dojrzałość, gładkie lecz z dużą centralną komórką przechodzącą w postać brodawkowatą, na ogół wygięte, równomiernie

169 773 zabarwione lub z centralną komórką silniej pigmentowaną niż inne komórki, zazwyczaj o długości 20-39 gm i grubości 11-14 gm w najszerszym miejscu.

CMICC 337159 jest 4-przegrodowy jak C.verrucifornis, lecz odmienny pod względem wielkości konidiów. Konidia C.verrucifornis mają wymiary 16-26 gm x 8-12 gm. CMI CC 337159jest nowym gatunkiem rodzaju Curvularia. Należy do klasy Deauteromycetes, pod-klasy Hypomycetidae, rodziny Dematiaceae.

Hodowla szczepu

Grzyb można hodować na skosach agarowych zawierających następujące składniki w gramach/litr:

ekstrakt z drożdży 4,0 dwukwaśny fosforan potasu 1,0 siedmiowodny siarczan magnezu 0,1 glukoza 15 agar Bacto (Difco Laboratories, Detroit, USA) 20

Taki substrat poddaje się autoklawizacji w temperaturze 121°C przez 20-40 minut. Taki sterylny materiał określa się w dalszej części opisu jako agar YPG. Skosy zawierają 12 ml agaru YPG i po zaszczepieniu poddawane są inkubacji w temperaturze 20-25°C przez 7 dni lub dłużej.

Wytwarzanie substancji grzybobójczej

Substrat do kolb do wytrząsania przygotowano stosując wodę zdemineralizowaną z dodatkiem następujących składników w g/l:

ekstrakt z drożdży 4,0 dwukwaśny fosforan potasu 1,0 siedmiowodny siarczan magnezu OJ glukoza 15

PLURONIC® L61 (BASF, RFN) 0,1

Sterylizację prowadzono w temperaturze 121°C przez 20 minut. W kolbach E^lenmeyera o pojemności 500 ml porcje po 100 ml sterylnego substratu zaszczepiono około 10⁶ sporów ze skosów agarowych YPG uprzednio zaszczepionych CMI CC 33715. Kolby wytrząsano przy 230 obrotach na minutę w temperaturze 25°C przez 3-7 dni, po czym brzeczkę fermentacyjną odwirowano. Płyn znad osadu zawierający substancję o własnościach grzybobójczych oddzielono w ten sposób od grzybni. Zarówno płyn znad osadu jak i grzybnię poddano analizie na własności fungicydowe.

Substancje grzybobójcze wytwarzać można także prowadząc hodowle powierzchniowe, generalnie w znany sposób.

Fermentację prowadzić można także w innych pożywkach zawierających źródła asymilowalnego przez mikroorganizmy węgla i azotu i sole nieorganiczne generalnie w niskim stężeniu. Dodatkowo pożywki wzbogacić można w mikroelementy (metale), chociaż gdy wykorzystuje się kompleksowe źródła węgla i azotu zwykle zawierają one także metale śladowe.

Ekstrakcja pożądanych związków

Brzeczka hodowlana poddana została filtracji z użyciem filtru bębnowego z preparatem High Flow Supercel® jako wstępną powłoką. Do przesączu dodano 20 g/l preparatu XAD-8 i całość mieszano przez 16 godzin w temperaturze 5°C. Żywicę XAD-8 następnie odfiltrowano i przepłukano 10 krotną (w stosunku do objętości złoża) objętością roztworu etanolu o stężeniu 25% obj./obj. z mieszaniem przez 30 minut. Pierwszy aktywny eluat otrzymano przy użyciu 2x3 objętości 60% etanolu w 10 mM buforze fosforanowym o pH 7,0 z mieszaniem przez 60 minut. Resztę substancji aktywnych wyeluowano stosując 2x3 objętości 80% obj./obj. etanolu w 10 mM buforze fosforanowym o pH 7,0 z mieszaniem przez 60 minut. Eluaty połączono i zatężono do 1/5 objętości na drodze odparowania pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze poniżej 40°C. 3,6 l zatężonego eluatu poddano dalszemu zatężaniu do objętości 750 ml. Koncentrat następnie odwirowano i odrzucono oddzielony osad. Roztwór znad osadu ekstrahowano dwukrotnie 765 ml octanu etylu. Połączone fazy octanu etylu zamrożono w celu usunięcia wody. Wolny od wody ekstrakt zatężono pod obniżonym ciśnieniem do objętości 20 ml i następnie dodano 120 ml acetonitrylu. Dalsze zatężanie przeprowadzono na drodze odparowania pod obniżonym ciśnieniem do objętości 25 ml. Tak zatężony roztwór dodano do

169 773 ml zdejonizowanej wody i 70 ml etanolu, po czym odparowywano mieszaninę pod obniżonym ciśnieniem, aż do uzyskania roztworu lekko mętnego. Taki roztwór umieszczono w lodówce do wykrystalizowania. Po 4 dniach kryształy przemyto zdejonizowaną wodą i zliofilizowano. Otrzymano 1 g krystalicznej substancji. Dla uproszczenia otrzymany w powyższy sposób związek o wzorze IV, podanym wyżej, oznaczono symbolem BK202.

Przykład II. Związek otrzymany jak w przykładzie I, poddano badaniom mającym na celu określenie jego aktywności i przydatności w kompozycjach według wynalazku:

Zależność trwałości od temperatury I pH

Postępowanie: Związek oznaczony symbolem BK202 rozpuszczono w buforach o wskazanym na rysunku fig. 1 pH i otrzymaną serię roztworów umieszczono w temperaturze od 16 do 55°C na 16 godzin. Użyto buforów fosforanowo-cytrynianowych (T. C. McIWaine, J. Biol. Chem. 49, 183 [1921]) dla zakresu pH od 2,5 do 7 a dla zakresu pH od 7 do 9,5 0,05M buforów TRIS. Po 16 godzinach, próbki przesączono przez filtr membranowy 0,45 gm, a następnie poddano analizie chromatograficznej metodą HPLC. Na rysunku fig. 1, przedstawiona jest zależność pomiędzy resztkową aktywnością a wartością pH dla różnych temperatur. Z przedstawionego wykresu wynika, że związek według wynalazku, o wzorze IV posiada optimum stabilności przy pH 7, a przy tym stabilność wydaje się być niezależna od temperatury, podczas gdy trwałość przy pH powyżej 8 gwałtownie maleje. Przy wartościach pH poniżej 7 stabilność obniża się powoli, z wyjątkiem temperatury 25°C, w której to temperaturze spadek trwałości zdaje się być gwałtowny. Tę jednakże obserwację można przypisać błędowi doświadczalnemu.

Analiza metodą HPLC

Spherisorb Hexyl 5 gm, 140 mm x 4,6 mm

1,5 πιΕπύη 220 nm 5 210 nm

55% acetonttry5 + 0,1% kwas trójfluorooctowy 10μ1 okoto 6,3 min.

kolumna: szybkość przepływu: detekcja: eluent:

próbka:

czas retencji:

Własności fizyczne i chemiczne

Na drodze krystalizacji materiału otrzymanego w wyniku rozdzielania opisanego powyżej, z wodnego roztworu etanolu otrzymuje się białe kryształy o własnościach fizyko-chemicznych podanych poniżej (suszenie w suszarce w temperaturze 80°C przez 2 godziny i przechowywanie przez noc w próżniowym eksykatorze nad bezwodną krzemionką):

1. Własności fizyczne:

bezbarwne kryształy 205° charakter temperatura topnienia [c2²¹d (C=0,4, MeOH) Analiza elementarna znaleziono:

obliczono dla C56H89N9 014· H2O:

C: 59,44 H: 8,14 N: 10,89

C: 59,50 H: 8,11 N: 11,15

Na drodze krystalizacji z metanolu otrzymano bezwodne białe kryształy o własnościach fizyko-chemicznych podanych poniżej (suszenie w suszarce w temperaturze 80°C przez 2 godziny i przechowywanie przez noc w próżniowym eksykatorze nad bezwodną krzemionką):

1. Własności fizyczne:

bezbarwne kryształy 200-212°C -27°° charakter temperatura topnienia [af ^Jd (C=0,4, MeOH) Analiza elementarna znaleziono:

C : 60,11 H: 8,00 N: 11,28

169 773 obliczono dla C56H89N9014: C· 60,48

H: 8,06 N: 11,33

Spektroskopia masowa (FAB) MH+ 1112,6

2. Własności chemiczne

Całkowita hydroliza w środowisku kwaśnym (6N HCl, 18-24 h, 110°C) uwolniła następujące α-amino i hydroksykwasy (zidentyfikowane metodą chromatografii gazowej/spektIcgrafii masowej pochodnych trójflucrccctowych estrów n-butylowych; cyfry w nawiasach wskazują ile razy dany aminokwas występuje):

mleczan (1)	C3H4O2
Glicyna (1)	C2H3NO
Walina (1)	C5H9NO
N-Me-Walina (3)	CeHnNO
N-Me-Izoleucyna (1)	C7H13NO
kwas pipekolinowy (1)	C6N9NO
kwas N-Me-asparaginowy (1)	C5H7NO3
O-Me-Tyrozyna (1)	C10H11NO2

C56H89N9014

Związek oznaczony symbolem BK202 daje negatywny wynik w próbie z ninhydryną, nie zawiera żadnego ugrupowania -XH, które mogłoby ulec acetylowaniu (bezwodnik kwasu octowego/pirydyna, 24 godziny, temperatura pokojowa) i ma jedną wolną grupę karboksylową, którą można zestryfikować działając dwuazometanem otrzymując odpowiedni monoester metylowy BK202-Me (Cf-PDMS, MH+ 1126,5).

Związek oznaczony symbolem BK202 zawiera wiązanie laktonowe (IR 1735 cm’¹), który może ulec otwarciu na drodze łagodnej hydrolizy alkalicznej (0,1 N NaOH, 0,5 godziny, temperatura pokojowa) z wytworzeniem odpowiedniej pochodnej z otwartym pierścieniem BK202-OH. W reakcji z dwuazometanem BK202-OH może być przekształcone w odpowiedni ester dwumetylowy BK202-Mc2 (Cf-PDMS, MH+ 1158,4).

Dane spektrograficzne

BK202 ¹H-NMR: Z uwagi na złożoność widma wywołaną współ-występowaniem wielu konformerów sporządzono jedynie częściowe przyporządkowanie przedstawione w tabeli 1:

Tabela 1

Częściowe przyporządkowanie w widmie 14-NMR (rysunek fig. 2)

Przesunięcia chemiczne głównych konformerów w stosunku do TMS [wielokrotności (d=dublet, t=tryplet, dd=podwójny dublet, q=kwartet, m=multiplet, br=szerokie pasmo) i wartości J wyrażone w Hz]

Reszta	NH	α-H	β-H	γ-H	inne
O-MeTyr	7,50 (d,10)	5,20 (m)	3,25 (2H,m)	-	7,00(2H,d,8) 6,70(2H,d,8)
Wal	7,0 (d,10)	4,55 (t,10)	2,10 (m)	0,80;0,89 (2Me,d,7)	-
Gli	7,08 (br)	4,02 (dd,6/18)	-
N-MeWal	-	5,19 (d, 11)	2,37 (m)	0,88;0,98 (2Me,d,7)	-
N-MeWal	-	4,31 (d,10)	2,43 (m)	0,89;1,06 (2Me,d,7)	-
N-MeWal		4,74 (d, 10)	2,13 (m)	0,68;? (Me,d,7)	-
Mleczas		5,47 (q.7)	1,40 (Me,d,7)

169 773

Dane ¹H-NMR przedstawione są jako surowe widma na rysunkach fig. 2-4. (Fig. 2, fig. 3 i fig. 4: 400 MHz widma w CDCI3, DMsO-d6 i CD3OD, odpowiednio).

1³C-NMR: 100,6MHzw CDCb (fig- 55)

IR: KBr <fig - i))

Pochodne BK202

BK202-Me

IR: KBr ffig- 77)

Przykład III. Przeprowadzono szereg prób w celu potwierdzenia aktywności biologicznej su aktywnych:

Próby biologiczne

Spory Botrytis cinerea w ilości zawierającego:

jednokwaśny fosforan amonowy dwukwaśny fosforan potasowy jednokwaśny fosforan potasowy dwuwodny chlorek wapnia sześciowodny chlorek magnezu

10” wprowadzono do 50 ml roztworu różnych soli, mg 68 mg 87 mg 7,4 mg 10 mg

Przed zaszczepieniem roztworu tych soli, dopełniono jego objętość dwukrotnie destylowanąwodądo 1 litra i sterylizowano w temperaturze 121°C przez 20 minut. Następnie zmieszano to z 50 ml agaru YPG w temperaturze korzystnej dla rozwoju sporów Botrytis, w temperaturze od 30°C do około 45°C, w której agar jest w stanie płynnym bez szkody dla sporów. Porcje po 12 ml tej mieszaniny wylano na szalki Petriego o średnicy 9 cm i pozostawiono do zestalenia. W agarze wykonano po 1-5 dziur o średnicy 4 mm i w każdej z nich umieszczono brzeczkę hodowlaną w ilości 15 gl. Szalki Petriego inkubowano w temperaturze 20-25°C przez 2 dni. Obecność fungicydu objawiała się w ten sposób, że wokół zagłębień obserwowano wyraźne strefy braku wzrostu tym szersza strefa im silniejszy fungicyd. Przesącz z CMI CC 337159, w wyżej opisanych warunkach dawał efekt w postaci raczej rozmytej strefy braku wzrostu o średnicy 40 mm. Pod stereomikroskopem obserwowano, że grzyb jest obecny lecz zatrzymany został jego normalny wzrost. W świetle pod mikroskopem grzybnia ukazuje się jako duże pęcherzyki, co sugeruje szczególny rodzaj oddziaływania.

Patogeniczność u ssaków

Brzeczka hodowlana zawierająca fungicyd, zdolne do życia spory i grzybnia nie wykazują żadnego efektu na myszach, przy podawaniu dootrzewnowym w dawce 20 ml/kg masy ciała. Brzeczka zawierała około 4,5 x 10 żywych form/ml.

Toksykologia

Toksyczność związku BK202 badana była w niżej opisany sposób przy wykorzystaniu związku o wzorze IV określonym powyżej, w formie krystalicznej:

- ostra toksyczność u myszy przy podawaniu doustnym i dożylnym

- analiza kroplowa w próbie Ames oraz badanie in vitro podrażnień skóry (Skintex®).

Zwierzętom doświadczalnym podawano składnik aktywny doustnie w dawkach do 1600 m/kg masy ciała w zawiesinie oraz dożylnie wstrzykując roztwór w ogon w dawkach do 13 mg/kg masy ciała.

W oparciu o te próby ustalono wartości IC50 dla związku BK202 i wynosiły one:

ATP > 10 gg/ml z wskaźnikiem chemiluminescencyjnym > 10 gg/ml

Tak więc można stwierdzić, że związek BK202 nie wykazuje toksyczności w przeprowadzonych próbach, a także iż związek BK202 w teście in vitro Skintex® dawał wynik najniższy mierzalny.

Aktywność grzybobójcza

Przeprowadzono badania mające na celu ustalenie skuteczności związku o wzorze IV określonym powyżej, w stosunku do różnych grzybów. Składnik aktywny rozpuszczono w 60% etanolu i dodano do oziębionego agaru ziemniaczano dekstrozowego w takich ilościach, że otrzymano preparaty zawierające ostatecznie 25,5,1,0,2,0,04,0,0016 gg substancji aktywnej/l ml agaru. Płytki kontrolne nie zawierały dodatku substancji aktywnej.

169 773

Na szalki Petriego o średnicy 9 cm wylano po 10 ml przygotowanego agaru. Wszystkie preparaty (we wszystkich stężeniach) zostały zaszczepione aktywnie rozwijającymi się grzybniami wyizolowanych grzybów, wybranych do prób. Płytki inkubowano w optymalnych warunkach dla rozwoju każdego z użytych wyizolowanych grzybów, przez 3 do 6 dni, a następnie po tym czasie oceniano rozwój grzybów dokonując pomiaru kolonii w mm i uzyskany wynik porównywano ze ślepą próbą.

Wyizolowane do prób grzyby należały do szerokiego zakresu grzybów z klas Oomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes i Zygomycetes. Stwierdzono, że związek BK202 najwyższą aktywność przejawiał w stosunku do gatunków grzybów z klasy Ascomycetes i Deauteromycetes. Szczególnie aktywny okazał s.i^ w stosunku do:

Klasa Ascomycetes: rotteaj νεηΡιηϋ. np. V . m^uahs rodzaj Sclerotinia, np. S. Sclerotiorum rodzaj Monilinia, np. M. fructigena forma-rodzaj Aspergillus, np. A. fumigatus forma-rodzaj Penicillium, np. P. Diditatum

Klasa Deuteromycetes: rodzjj Botrytis . np. B . cineeea rodzaj Ascochyta, np. A. pisi rodzaj Pyrenophora, np. P. teres rodzaj Cercrspotas np. C. beticol (słabszy) rodzaj Phoma, np. P. sorghina (słabszy) rodzaj Altemaria, np. A. altemata (słabszy) rodzaj Fusarium, np. F. lycopersici (słabszy)

W stosunku do wyżej wymienionych grzybów inhibitowanie było bardzo silne przy tak niskim stężeniu jak 0,0016 pg/ml, za wyjątkiem gatunków C. beticola, P. sorghina, A. altemata i F. lycopersici, w stosunku do których obserwowano słabsze inhibitowanie. Słabą jedynie aktywność stwierdzono w stosunku do gatunków z klasy Zygomycetes, zaś praktycznie brak aktywności stwierdzono względem gatunków z klas Oomycetes i Basidiomycetes.

Biologiczna aktywność w stosunku do roślin

Stosując badany związek w stężeniach podanych w poniższych przykładach nie zaobserwowano, aby występował efekt fitotoksyczności.

Przykład IV. Aktywność w stosunku do Botrytis cinerea rozwijającego się na roślinach pomidora

Sadzonki pomidora (odmiana First in Field, wiek trzy tygodnie) potraktowano ciekłą zawiesiną zawierającą 0,035 mg substancji aktywnej/ml. Rośliny przechowywano przez 24 godz. w cieplarni aby wyschły przed zainfekowaniem ich zawiesiną sporów, zawierającą 1 x 10⁵ sporów Botrytis cinerea /1 ml w 25% roztworze soku grapefruitowego. Rośliny inkubowano przez 6 dni (16 godzin światła/1000 luksów) i 6 godzin ciemności przy temperaturze 15° do 20°C) w przezroczystych workach polietylenowych w celu zwiększenia wilgotności względnej do 95-100%. Po tym okresie nie zaobserwowano żadnego ataku grzyba. Rośliny kontrolne poddawano takim samym zabiegom, z tym jedynie wyjątkiem, że nie były zabezpieczone zawiesiną substancji aktywnej. Rośliny kontrolne były całe obrośnięte grzybem Botrytis cinerea.

Przykład V. Aktywność w stosunku do Botrytis cinerea rozwijającego się na jabłkach (Golden Delicious)

Sztucznie uszkodzone jabłka opryskano zawiesiną zawierającą 9,8 pg substancji aktywnej/ml. Następnego dnia tak przygotowane owoce zostały zaszczepione zawiesiną sporów grzyba, zawierającą 1 x Kr sporów/ml i poddano inkubacji przez tydzień w atmosferze o wysokiej wilgotności i w temperaturze 18 do 20°C. Oceniając wyniki zliczano ilość zainfekowanych uszkodzeń i na tej podstawie dokonano oceny efektu fungicydowego badanej substancji. Badany związek aktywny hamował rozwój grzyba całkowicie. Owoce niezabezpieczone były w 100% zainfekowane Botrytis cinerea.

Przykład VI. Aktywność w stosunku do Botrytis cinerea rozwijającego się na truskawkach (Senga-Sengano)

Przeprowadzono próby w polu w Funen w Danii, zgodnie ze wskazaniami EPPO (Przewodnik do biologicznych badań fungicydów. Botrytis cinerea na truskawkach). Pólko doświad169 773 czalne miało wielkość 20 m² zastosowano trzy dodatkowe pólka. Związek aktywny stosowany był w postaci preparatu do prób zawierającego około 10% substancji aktywnej. Badano trzy różne dawki substancji aktywnej: 100, 300 i 900 g/ha. Objętość płynu rozpylanego wynosiła 1200 l/ha. Truskawki były opryskiwane w następujących stadiach rozwojowych: T1 początek kwitnienia, T2 10% rozkwitu, T3 50% rozkwitu i T4 80% rozkwitu. Jako standard porównawczy stosowano handlowy fungicyd ROVRAL .

Ocenę wyników prowadzono dokonując zliczenia i zważenia zdrowych i zainfekowanych truskawek. Uzyskane rezultaty przedstawiono na załączonym rysunku fig. 8, na którym pokazano stopień zainfekowania dla każdej z przeprowadzonych prób. Z rysunku tego widać, że związek BK202 wykazuje znacznie lepsze działanie fungicydowe w porównaniu z preparatem ROVRAL®.

Przykład VII. Aktywność w stosunku do Botrytis cinerea rozwijającego się na winogronach (Ugni Blanc)

Próby w polu przeprowadzano w Bordeaux we Francji, zgonie z CEB Metoda nr. 37. Pólko doświadczalne obejmowało 15 roślin w jednym rzędzie. W badaniach korzystano z sześciu dalszych identycznych obszarów. Substancja aktywna stosowana była w postaci preparatu do prób, zawierającego około 10% składnika aktywnego. Stosowano trzy dawki składnika aktywnego: 100, 300 i 900 g/ha. Objętość wody wynosiła 300 l/ha. Winogrona poddawano zabiegom w następujących fazach rozwojowych: T1 koniec kształtowania gron, T2 początek dojrzewania winogron, T3 3-4 tygodni przed zbiorami. Handlowe fungicydy RONILAN® i BASULTRA® stosowano jako standardy porównawcze. Skuteczność oceniano przez określenie intensywności i częstotliwości ataku Botrytis cinerea po pojawieniu się choroby. Wyniki przedstawiono na załączonym rysunku fig. 9, na którym wskazano intensywność infekcji (zdefiniowaną jako % zaatakowanych winogron w stu gronach) w każdym z przeprowadzonych badań. Z fig. 9 wynika, że związek BK202 przejawia lepsze własności fungicydowe w porównaniu z preparatami RONILAN® i BASULTRA®.

Przykład VIII. Aktywność w stosunku do Botrytis cinerea rozwijającego się na pomidorach (Matador)

Próby w cieplarni przeprowadzono w Lyngby w Danii. Pólko doświadczalne obejmowało 7 roślin (w wieku około 12 tygodni, 1 m wysokości) a w badaniach korzystano z trzech dalszych takich samych obszarów. Rośliny przebywały w plastikowym namiocie w celu zapewnienia wysokiej wilgotności. Przed rozpyleniem badanego środka, 20 liści na każdej roślinie mechanicznie uszkodzono w celu ułatwienia ataku Botrytis cinerea. Aktywną substancję stosowano w postaci preparatu do prób, zawierającego około 10% składnika aktywnego. Stosowano trzy dawki substancji aktywnej: 0,01%, 0,03% i 0,09%. Objętość zużywanej wody wynosiła770mł/l pólko.

Rośliny opryskano bezpośrednio po naruszeniu liści. 24 godziny po oprysku fungicydem dokonano sztucznego zakażenia przez zaszczepienie rozpylając na rośliny spory B. cinerea w postaci zawiesiny w 30% soku pomarańczowym. Handlowy fungicyd RONILAN® stosowano jako standard porównawczy. Wyniki prób oceniano przez zliczenie zaatakowanych liści, łodyg, owoców i pąków kwiatowych. Uzyskane rezultaty przedstawiono na załączonym rysunku fig. 10, na którym wskazano stopień infekcji w każdej próbie. Z analizy rysunku fig. 10 wynika, że związek badany BK202 we wszystkich badanych dawkach daje wyniki lepsze w porównaniu z preparatem RONILAN .

Przykład IX. Aktywność w stosunku do linii Botrytis cinerea uodpornionych na-, fungicydy

Jedna linia uodporniona na preparat BENLATE ®.(linia A) oraz jedna linia uodporniona na preparaty BENLATE®, ROVRAL® i SUMISCLEX® (linia B) zostały wyizolowane z roślin, które traktowane były tymi pestycydami. Działanie badanego związku BK202 na te linie sprawdzono w próbach in vitro i porównano z działaniem trzech handlowych pestycydów. Badane fungicydy dodano do agaru i umieszczono na szalkach Petriego próbki podłoża o różnym stężeniu poszczególnych fungicydów. Na te podłoża zaszczepiono linię wrażliwą (normalna linia C) i dwie linie uodpornione. Po trzech dniach w temperaturze 25 °C dokonano pomiaru wyhodowanych kolonii w milimetrach. Wyniki przedstawiono w tabeli 2 poniżej.

169 773

Tabela 2

Pestycyd	Stężenie	Linia A	Linia B	Linia C
BK202	10	0	0	0
	2	0	0	0
	0,125	0	0	0
ROVRAL®	10	0	13	0
	2	0	46	0
BENLATE®	10	50	50	0
	2	65	62	0
SUM1SCLEX®	10	0	35	0
	2	0	46	0
bez pestycydu (ślepa próba)	-	76	80	74

Przykład X. Aktywność w stosunku do Monilinia fructigena rozwijającego się na jabłkach (Golden Delicious)

Jabłka wysterylizowano na powierzchni, następnie każde nakłuto pięć razy gwoździem o średnicy 2,1 mm, zanurzono w zawiesinie zawierającej 0,0,5, 5, 50 i 500 mg substancji aktywnej/litr. Jako substancję aktywną zastosowano: 1. BK202, 2. benomyl (BENLATE®) i 3. iprodione (ROVRAL®). Zawiesinę o danym stężeniu traktowano cztery nakłute jabłka, co dawało próbkę 20 nakłuć na każde stężenie każdej badanej substancji. Owoce ułożono w plastikowych pojemnikach w rzędach, tak, że nakłucia skierowane były do góry. Po 24 godzinach na uprzednio nakłute powierzchnie rozpylono zawiesinę Monilinia fructigena w stężeniu 1x 10⁵ sporów/ml. Pojemniki umieszczono w plastikowych workach i przechowywano w temperaturze pokojowej (około 22°C). Po 5 dniach oceniono wyniki dokonując zliczenia liczby zakażonych nakłuć (maksimum 20 zainfekowanych nakłuć na każdy zabieg). Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Stężenie mg s.a.*/l	BK202	BENLATE®	ROVRAL®
0	20	20	20
0,5	18	18	20
5,0	14	19	19
50	7	12	15
500	1	3	4

* .....

/ skrót s.a. oznacza substancja aktywna

Z danych zawartych w tabeli 3 wynika, że związek BK202 jest skuteczniejszy przeciwko M.fructigena niż badane w tych samych warunkach handlowe fungicydy.

Przykładami dalszych upraw, które można chronić sposobem według wynalazku przed atakiem grzybów są: gruszki, śliwki, brzoskwinie, wiśnie, maliny, fasola, groszek, soja, uprawy oleiste takie jak rzepak, gorczyca, oliwki, słoneczniki itp., zboża, ogórki, melony, owoce cytrusowe takie jak: pomarańcze, cytryny, mandarynki itp., szpinak, sałata, ziemniaki, papryka, avocado, oberżyny, banany, rośliny złożone takie jak gerbera i inne rośliny ozdobne itd.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja grzybobójcza do wykorzystania nie-farmaceutycznego, zwłaszcza do zabiegów na roślinach, do zabezpieczania drewna lub budulca drewnianego, farb, kosmetyków, pasz, pożywek wzrostowych oraz środków spożywczych, zawierająca nośnik oraz substancje pomocnicze, stosowne do przeznaczenia kompozycji oraz składnik aktywny o właściwościach grzybobójczych, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera nowy związek o budowie określonej wzorem III:

cyklo-[Pec-MeAsp-MeWal-W al-MeW al-Melle-Gli-MeW al (III)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 2 lub wzorem IV:

cykl o-[Pec-MeWal-Wal-MeAsp-MeWal-MeDe-Gli-MeWal (IV)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 3, w których każda z reszt aminokwasowych może niezależnie występować w formie L lub D lub pochodne tych związków, korzystnie związek o wzorze III lub IV, w których wszystkie reszty aminokwasowe występują w formie L, a reszta laktonowa w formie D lub ich pochodne, zwłaszcza wybrane spośród pochodnych alkilowych, acylowych, hydroksylowych, glikozylowych i chlorowcowych, albo też wskazany związek w postaci zredukowanej, utlenionej, zhydrolizowanej, zestryfikowanej lub przekształcony w amid, w ilości od 0,001 pg/ml do 100 pg/ml.

2. Dodatek grzybobójczy do środków spożywczych, pożywek wzrostowych, pasz, środków kosmetycznych, środków do konserwacji drewna lub środków ochrony roślin, znamienny tym, że zawiera związek o budowie określonej wzorem III:

cyklo-[Pec-MeAsp-MeWal-Wal-MeWal-MeIle-Gh-MeWal (III)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 2 lub wzorem IV:

cyklo-[Pec-MeW al-W al-MeAsp-MeW al-Melle-Gli-MeW al (IV)

TyrOMe-D-Lakt] i strukturze określonej wzorem 3, w których każda z reszt aminokwasowych może niezależnie występować w formie L lub D lub pochodne tych związków, korzystnie związek o wzorze III lub IV, w których wszystkie reszty aminokwasowe występują w formie L, a reszta laktonowa w formie D lub ich pochodne, zwłaszcza wybrane spośród pochodnych alkilowych, acylowych, hydroksylowych, glikozylowych i chlorowcowych, albo też wskazany związek w postaci zredukowanej, utlenionej, zhydrolizowanej, zestryfikowanej lub przekształcony w amid, w mieszaninie z nośnikiem ciekłym lub stałym, zgodnym z podstawowym środkiem spożywczym, paszą, środkiem kosmetycznym, środkiem do konserwacji drewna lub środkiem ochrony roślin.