KR100665539B1

KR100665539B1 - 식물의 활성부여제 및 그 제조방법과, 식물의 활성촉진제 및 그 사용방법

Info

Publication number: KR100665539B1
Application number: KR1020017012856A
Authority: KR
Inventors: 야스하루 사사키
Original assignee: 야스하루 사사키; 가부시키가이샤 홋카이도 그린 고산
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2007-01-09
Also published as: CN1350541A; US6753295B1; KR20020008829A; JP2001172112A; CA2369974A1; EP1180523A1; AU3671700A; EP1180523A4; WO2000061591A1

Abstract

본 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균(Trichoderuma hurzianum SK-5-5)의 생성물에 의한 식물로의 활성부여 및 그 촉진을 목적으로 하는 것이다.

트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체 배지에서 배양하여, 그 생성물을 추출하여 또는 상기 균의 분생포자를 사용함으로써, 식물의 활성부여 및 그 촉진의 목적을 달성할 수 있다.

트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5, 분생포자, 사상균, 항균력, 활성부여제.

Description

식물의 활성부여제 및 그 제조방법과, 식물의 활성촉진제 및 그 사용방법{PLANT ACTIVATOR, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, PLANT ACTIVITY PROMOTER AND METHOD FOR APPLYING THE PROMOTER}

본 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 (Trichoderuma hurzianum SK-5-5)균의 배지에서 추출한 사상균 및 세균에 항균성을 가지는 물질을 얻는 것을 목적으로 하는 식물의 활성부여제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

또, 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자의 생성하는 물질에 의하여 식물의 뿌리, 줄기, 잎 등에 병원균에 대한 저항성을 부여하는 것을 목적으로 하는 식물의 활성부여방법 및 식물의 활성촉진제 및 그 사용방법에 관한 것이다.

트리코데르마균은 미생물 농약으로서 병해방제에 실용화되어 있는 사상균이며, Trichoderuma lignourum이 담배의 백견병의 방제용 농약으로서 등록되어 있다(농약등록 제7023호). 또 영국, 프랑스에서도 Trichoderuma hurzianum을 유효성분으로 하는 채소의 잘록병, 모썩음병에 유효한 미생물 농약(F-stop)이 등록되어 있다.

근래 감농약, 생태계 보존형의 병해방제의 필요성이 강하게 주장되어 특히 생물방제 방법은 환경부하의 영향이 적다고 생각됨으로 정력적으로 연구가 진행되 고 있다.

식물의 뿌리나 근권에서 분리되는 세균이나 균류중에는 식물의 생육을 촉진하는 것이 있으며, 각각 식물 생육촉진근권(plant growth-promoting rhizobacteria: PGPR), 식물생육촉진균류(plant growth-promoting fungi: PGPF)라 불리워지고 있다.

상기 유용 근권 미생물인 PGPR, PGPF는 식물의 생육을 촉진할뿐만 아니라, 각종의 토양병해를 억제하는 것도 알려져 있다. 또 최근에는 토양병해 뿐만아니라, 지상병해도 억제하는 사실도 명백하게되어 상기 PGPR, PGPF는 식물의 전신 저항성의 유도가 관여되고 있는 것이 발견되었다고 소개되어 있다(1999년 6월호「곤게쯔노 노오교오」지).

또 고려잔디에서 분리선발한 Phoma, Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Sterile등의 균이 오이에서의 탄저병에 대하여 유도저항성을 나타낸 것이 보고되어 있다(1999년 6월호「곤게쯔노 노오교오」지).

이 발명은 식물병원균에 항균성을 가지는 물질을 얻는 것을 과제로서 연구하고 있으며, 홋카이도 도가치지방의 토양에서 Trichoderuma hurzianum SK-5-5(트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5) 균을 분리하였다. 이 균은 식물병원균의 80%를 점유한다고 하는 토양 전염성 병원 사상균에 대하여 넓게 길항성을 나타내는 균이며, 현재 잔디의 브라운 배치, 라지 배치 등의 Rhizoctonia류에 미생물 농약(생균제제)로서 개발중의 것이다. 상기 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 길항작용은 상대균사에 접촉하여 코일링(coiling)을 함으로써 세포질 응집을 촉구하여 사멸시키 는 것이다. 그 외관적 관찰 경과로부터 보아서 페니실리엄(Penicillium sp)등이 생산하는 항생물질과 같은 배지상에서 저지원을 표시할 정도로 활성이 높은 것은 아니며, 균사끼리의 접촉에 의해 발현하는 것이라고 추정된다.

상기 세포질 응집작용이 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균의 생산하는 어떤 물질에 의하여 초래되는 것이라고 생각되어, 이것을 구명하는 것을 제1의 과제로 한 것이다.

또한, 이 발명에서 사용하는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균은 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(수신인명: 일본국 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)(세이메이겐)에 수탁번호「비고겐긴기 제13327호」로 하여 기탁되어 있다(수탁일: 1992년 12월 9일, 수탁자: (주) 홋카이도 그린고산). 당해 원기탁으로부터의 부타페스트 조약에 의거한 기탁으로의 이관청구는 1992년 12월 9일부로 행하여져, 수탁번호 BP-4346이 부여되어 있다.

상기 종래의 PGPR, PGPF는 특정식물(예컨대 오이)에 대하여 탄저병에 대해서의 유효성을 나타내는 것으로 금후 연구결과, 그 사용방법의 개선등에 의해 다른 식물, 병원균에 대하여 유효한 것이 판명되는 가능성은 있다고 하여도 아직 구체적 식물, 병원균에 대하여는 금후의 과제로 되어 있다.

그렇지만 단지 병원균을 살균한다는 종래의 생물농약의 사고형태가 식물의 근경에 걸쳐서 저항성을 부여하는 방향으로 변하여 가는 것은 금후의 식물재배상 중요한 시사를 함축하는 것이다.

이 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균에 대하여, 각종 실험을 거듭하 고 있는 동안에 상기 생물 농약의 장래성과 합치하는 것에 생각이 미치고, 다시 사용방법, 대상식물 등을 선정, 연구결과, 본 발명을 완성한 것이다. 장래의 식물재배에 다대한 영향을 주는 것으로서, 본 발명은 극히 유망하며, 장래의 농업을 지탱하는 중요한 수단의 하나로 되는 것은 의심의 여지가 없다.

본 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 생산하는 물질에 의해 세포응집작용(항균성)이 초래하는 것이라고 추정하여, 상기 균을 배양, 정제, 동정한 바, 사상균 또는 세균에 항균성을 가진 물질을 얻는 것이다.

또, 식물재배시에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 복토중에 공존시켜서 증식시킴으로써, 그 생성물질에 의해 각종 식물의 근경활성을 부여하여, 내균성을 향상시키는 것이 판명되어, 상기 종래의 문제점을 발전적으로 개선시켜서 실용성을 확립한 것이다.

즉 활성부여제의 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체 배지에서 배양하여 추출한 물질로서 사상균에 항균력을 가진 것을 특징으로 하는 식물의 활성부여제이다. 또 다른 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 액체배지에서 배양하여, 추출한 물질로서, 세균의 1종(Staphylococcus aureus 209P)에 항균력을 가진 것을 특징으로한 식물의 활성부여제이다.

다음에 제조방법의 발명은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체배지에 식균하여, 25℃ 내지 30℃에서 7일 내지 15일간 정치 배양한후, 추출하여 상기의 활성 부여제를 얻는 것을 특징으로 하는 식물의 활성부여제의 제조방법이며, 또 트 리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 액체배지에 식균하여, 25℃ 내지 30℃에서 4일 내지 10일간 진탕 배양한후, 추출하여 상기의 활성부여제를 얻는 것을 특징으로 하는 식물의 활성 부여제의 제조방법이다.

본 발명에 있어서, 사용하는 고체배지로서, 쌀 배지를 사용하였다. 쌀배지는 쌀 100%, 대두박 3%, 멸균수 10% 로 이루어진 고정 배지로서, 배양중에 배지의 표면이 건조하지 않도록 멸균수를 첨가하였다.

본 발명에 있어서, 사용하는 액체배지는 글루코오스 3.0% ∼ 5.0%, 폴리펩톤 0.5%, NaCl 0.8%, 효모엑스 0.2%, 탄산칼슘 1.0%이다.

상기와 같이 고정배지와, 액체배지에 의하면, 각각의 특성에 의해 다른 물질을 생성하는 것이 명백하게 되었다. 이와같은 결과에 대한 메카니즘은 명백하지 않으나, 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균에 대한 자극 그밖의 작용의 상이함, 또한 배지 구성물질에 관한 특성에 의해 다른 물질을 생성하는 것으로 상기 쌀 배지 및 액체배지 이외의 성분의 배지라도 마찬가지의 물질을 생성하는 것은 충분히 생각되어 또한 생성효율향상 등 금후의 연구과제는 다대하다.

다음에 활성부여방법의 발명은 식물재배시에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자에 사용수단을 부가하여 상기 식물에 활성을 부여하는 복토중에 공존시키는 것을 특징으로한 식물의 활성부여방법이며, 식물재배시에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자에 사용수단을 부가하여 상기 식물에 활성을 부여하는 복토중에 공존시켜서 증식시켜 사조균에 항균력을 가지는 물질의 생산을 지속시키는 것을 특징으로 하는 식물의 활성부여방법이다. 또 식물재배시에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자에 사용수단을 부가하여 상기 식물에 활성을 부여하는 복토중에 공존시키는 동시에 상기 분생포자의 증식촉진조건을 부여하는 것을 특징으로 하는 식물의 활성부여방법이며, 분생포자의 사용수단은, 식물의 종자처리, 복토와 분생포자와의 혼화, 분생포자의 산포, 관수 또는 매설한 것이다. 더욱 증식촉진조건은 토양온도를 15℃ 내지 30℃로 하여 수분을 30% 이상으로한 것이며, 다른 증식촉진조건은 토양에 증식가능한 통기성 또는 함기성을 부여하는 것이다.

다음에 다른 발명은 다공성 세라믹스 입자 그외의 담체에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균의 분생포자를 부착시킨 것을 특징으로 하는 식물의 활성촉진제이며, 무균처리한 무기질 입자에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 혼합하여 또는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 부착시켜, 상기 무기질 입자와 다른 입자를 혼합한 것을 특징으로 하는 식물의 활성촉진제이다. 또 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 배양하여 이것을 배지와 함께 적량씩 분리하여 무균의 다공질 입자에 영양분(예컨대 키토산)과 함께 부착시킨후, 소정량씩 포장한 것을 특징으로 하는 식물의 활성 촉진제이며, 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 액체 배지에서 증식시켜, 이것을 무균의 다공질 입자에 영양분과 함께 부착시킨후, 다공질 입자를 소정량씩으로 포장한 것을 특징으로 하는 식물의 활성 촉진제이다.

또 다른 발명은 상기 기재의 식물의 활성촉진제를 육묘 토양에 혼입하여 또는 육모시에 토양에 산포 혹은 포장에 산포하는 것을 특징으로 하는 식물의 활성촉진제의 사용방법이다. 이 경우의 활성촉진제의 사용량은 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균 5×10⁴/g ∼ 5×10⁹/g를 1m²당 5g 내지 100g 산포 또는 재배토 1m³당 5g 내지 100g 혼입하는 것이다.

상기 발명에 있어서 식물은 사탕무, 멜론, 옥수수, 수도, 양배추 및 양파 등이며, 뿌리, 줄기, 잎 및 과실을 채취하는 식물에 대하여 어느것도 유효한 것이 확인되어 그 효과도 수량 증가, 당도 증가 그 밖의 유의성이 명확하게 되었다.

상기 발명에 있어서 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 배양하여 그 단리정제물을 검토한바, UV흡수스펙트럼, 질량분석 및 NMR측정결과로부터 Aib (α-Aminoisobutyric acid)를 함유한 Polypeptide의, Peptibols계 라고 판단하였다. Peptibols계 항생물질은 아미노산 배열중에 α-Aminoisobutyric acid (Aib)를 함유하고 있으며, N말단이 Acetyl기로 C말단이 Amino alcohol 결합인 것이 특징이다(많게는 Phenylalaniol기로 끝난다). 또한 금회의 정제물, A성분, B성분, D성분은 질량분석에서 일부의 아미노산 배열을 하기와 같이 추정하여 그 부분 구조를 기존의 Peptibols의 아미노산 배열과 검색한 결과, 일치하는 것이 없고 신규 Peptibols 계인 것이라 추정하였다. E는 아미노산 배열의 추정이 곤란하기 때문에 판단할 수 없었다.

UV흡수파장: 4성분 모두 말단흡수

A성분: 1933

B성분: 1949 또는 1964

D성분: 1810

E성분: 1829

추정구조: A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-.....

상기와 같이 생성물질은 신규배열의 아미노산이라 인정되나, 식물의 뿌리로부터 흡수되어서 줄기 및 잎에 이르고, 이어서 소실한다. 따라서 수확시의 식물에는 뿌리, 줄기, 잎 모두에 잔류의 유무는 불명하여도 당초(발아 이후의 어린 줄기 등) 식물에 흡수된 단계에서, 식물의 DNA에 무엇인가의 변화를 주는 것이든지, 잔류하는 것으로 추정된다. 왜냐하면 일단 항균성을 취득한 식물은 근경 등의 분열생성에 구애되지 않고 항균성의 지속이 인정되기 때문이다. 따라서 면역성부여(활성부여)와 유사하며, 육묘시 또는 비교적 어린식물(실질적으로 식물의 증식시)에 사용하면, 재사용의 필요성이 인정되지 않는 것은 일단 활성이 되면 그 식물의 일생에 걸쳐서 효력이 지속되기 때문이다.

본 발명의 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균의 분생포자는 식물의 묘때 또는 파종시에 복토중에 혼입하면, 상기 분생포자의 증식에 따라서 생성물질도 증가하여 이것이 뿌리에서 흡수되어 경엽에 이르고 전체로 활성이 부여됨으로(마치 면역성 부여와 같이) 식물이 생장하여 뿌리 또는 과실 등을 채취하는 시기(예컨대 파종후 1개월 내지 6개월후)에 이르러도 상기 항균성은 유지되는 것이 확인되었다. 따라서 많은 식물은 1회의 처리(산포 그외의 수단)에 의하여 활성이 부여되어서 그 목적을 충분히 달성할수가 있다.

본 발명에 있어서 분생포자의 담체는 다공질 세라믹스입자(예컨대 맥반석의 입자)로서 이것을 키토산액에 침지하여 수분을 증발한 것이다. 상기 입자의 크기에 대하여는 특정은 없으나, 취급의 용이성에서 직경 0.5mm 내지 5mm 정도가 바람직하다. 상기 담체는 다공질 세라믹스입자(천연 또는 인공)에 한정됨이 없이 분생포자에 악영향이 없는 것을 사용할수가 있다.

상기 세라믹스입자에 미리 배양한 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 5×10⁴/g ∼ 5×10⁹/g 씩 부착시켜, 이것을 1m²당 5g 내지 100g씩 산포한다. 이 경우에 물과 같이 산포하는 경우도 있으나 관수하는 것은 수분 부여를 목적으로 하는 경우와, 분생포자를 균등하게 침투시켜서 토양중에 균등하게 분포시키기 위해 사용하는 경우가 있다.

상기 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 양을 5×10⁴/g 미만으로한 경우에 상기의 균의 번식이 저해되지 않으면 증식되나 어떤 이유에 의해 증식하지 않는 경우가 있음으로 일단 눈여겨 보았다. 그러나 균의 증식은 환경에 의하여 현저하게 상이함으로 사용후의 환경 정비에 의하여는 다시 소량(예컨대 5g미만)의 균이라도 식물의 생육에 맞추어 증식하여 필요량의 생산물질을 얻는 것은 가능하다고 생각된다.

한편 균량의 상한을 5×10⁹/g 이하로 한 것은 상기 생산물질의 관계에서 불필요하다고 생각하였기 때문이다. 균의 증식조건이 나쁜 경우에는 비교적 고농도의 사용을 요하나 5×10⁹/g를 넘을 필요는 없다고 생각된다.

본 발명에 있어서 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균은 통상 분생포자로서 주어지나, 사용시의 환경이 혹독한 경우(예컨대 고온시, 한냉시)에는 후막포자로서 주어지는 쪽이 바람직하다.

상기 발명에 있어서 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체 배지 또는 액체배지 또는 그외의 배지에서 배양하여 그 생성물을 추출하여, 이것을 식물의 활성부여제로서 사용하는 경우에는 예컨대 0.1 내지 1g/m² 을 필요로 하게 된다.

또 분생포자를 산포하는 경우에는 당해 분생포자의 증식하한균수(예컨대 5×10⁹/g)가 필요하다.

본 발명의 식물의 활성부여제는 균의 때에는 1회 사용하는 것만으로 이후 수확까지 사용할 필요는 없다. 이점은 일반 농약과 다르며, 그 메카니즘은 불명하나 식물의 DNA에 어떤 영향을 주어 또는 생성물질이 식물의 뿌리, 줄기, 잎에 미량 잔류하여 상기 특성을 발휘하는 것이라 추정된다.

상기에 있어서, 분생포자를 사용하는 경우에는 포장등에서 분생포자가 충분히 증식하여, 포화에 달하면 분생포자는 급속하게 활력을 상실하고 나중에는 소멸하는 것이 확인되었다. 다만 일부분 분생포자가 잔류하여 있는 것도 생각되어 증식 조건이 양호하게되면 다시 증식하는 경우도 있을 수 있다.

상기 본 발명에 있어서는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5를 고체 배지 또는 액체 배지에서 배양하여 그 생성물질중 A,B,C,D,E 성분에 대하여 단리 정제하였으 나, 활성물질은 신규아미노산 배열을 갖는 신규물질로, 그 분자량은 A성분 = 192, B성분= 206, C성분 = 168, D₁= 154, D₂= 220 이며, 당해 아미노산 또는 그 주변물이 식물의 활성화에 유효하다고 추정된다.

그래서 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 소정농도(예컨대 1g중 5×10⁵이상) 이상에서 사용(토양에 혼용, 또는 근물의 근권에 산포)함으로써, 소기의 목적을 달성하는 것이 확인되어 있다. 아마도 식물에 의해 최적의 성분 또는 혼용비가 있음에 틀림이 있다.

그래서 상기 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 종래법에 의하여 다량 배양하여 그 생성물질을 추출정제하여 식물의 활성부여제를 얻을 수가 있다.

상기 생성물질은 상기 A성분, B성분, C성분, D성분 및 E성분이 판명되어 있다.

상기 발명은 각종 식물에 대하여 유효하나, 실험결과(실험중도 포함)에 의하면, 수도, 옥수수, 사탕무, 멜론, 감자, 고구마, 딸기, 양파, 양배추 등에 유효한 것이 확인되었다.

본 발명에 의하면 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고형 배지에 배양한 경우에는 표 2와 같이 사상균에 대하여 항균성을 나타낸 것이 인정되었다.

또 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 액체 배지에서 배양한 경우에는 표 2와 같이 박테리아에 유효한 것이라고 인정되었다.

본 발명에 의하면, 식물의 생육초기에 상토등에 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 적당량씩 혼입함으로써, 또는 생육시의 산포등 근권에 사용함으로써, 식물을 활성화하여 뿌리, 줄기, 잎을 개선하고, 이병방지, 병원균에 대한 내성을 부여할수가 있다. 이것에 의하여 생육시의 발병을 격감시킬수 있을 뿐만아니라 식물의 생육을 촉진하여 증수를 꾀하고, 당도를 향상시키는 등의 제효과가 있다.

그러나 상기 효과는 상기 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5 균의 분생포자의 생성물질(예컨대 신규아미노산)에 의한 것으로 추정되나, 상기 분생포자는 증식후, 또는 상기 생성물질은 식물의 성장 종기에는 어느것도 소실하는 것으로 인정됨으로 여하한 의미의 영향도 없고, 또한 연속 사용에 대하여도 아무런 악영향도 볼수없는 효과가 있다. 더욱 상기 생성물질은 신규아미노산 및 그 주변물질이라 인정됨으로 식물의 잎, 줄기 등에 미량 잔류하여도 무해하다.

또 본 발명의 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균은 토양중에서 증식함으로 환경 조건이 증식에 적합하는 경우에는 당초의 산포농도가 불충분한 경우라도 증식에 의해 필요량의 생성물질을 보급하여 소기의 목적을 달성한 후, 자연소멸하는 특성이 인정되어 인체에의 영향은 물론, 토양, 식물 그외의 환경 파괴 등의 염려는 거의 없다. 더욱이 연작 불량의 작물에 대하여도 연작의 불리함은 해소되는 것으로 추정되었다.

도 1은 본 발명의 균의 A배지 배양에 있어서 HPLC의 분석그래프,

도 2는 도 1의 확대 그래프,

도 3은 A성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 4는 A성분의 ¹H-NMR(CD₃OD)를 도시한 그래프,

도 5a 및 도 5b는 A성분의 질량분석 측정의 그래프,

도 6은 B성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 7은 B성분의 ¹H-NMR을 도시한 그래프,

도 8a 및 도 8b는 B성분의 질량분석 측정의 그래프,

도 9는 D성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 10은 D성분의 ¹H-NMR을 도시한 그래프,

도 11a 및 도 11b는 D성분의 질량분석 측정의 그래프,

도 12는 E성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 13은 E성분의 ¹H-NMR을 도시한 그래프,

도 14a 및 도 14b는 E성분의 질량분석 측정의 그래프,

도 15는 A성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 16는 A성분의 HPLC를 도시한 그래프,

도 17은 도 16의 검출된 A피크의 질량분석의 그래프,

도 18은 B성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 19는 B성분의 HPLC를 도시한 그래프,

도 20은 도 19의 검출된 A피크의 질량분석의 그래프,

도 21은 C성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 22는 C성분의 HPLC를 도시한 그래프,

도 23은 도 22의 검출된 A피크의 질량분석의 그래프,

도 24는 C성분의 질량 분석 그래프,

도 25는 C성분의 피크의 ¹H-NMR(CD₃OD)를 도시한 그래프,

도 26은 C성분의 구조도,

도 27은 D성분의 UV흡수파장을 도시한 그래프,

도 28은 D성분의 HPLC를 도시한 그래프,

도 29a는 UVλ 230nm 에서 검출된 D1성분을 도시한 그래프,

도 29b는 UV가 말단 흡수에서 D1성분과 RT 0.6차로 검출된 D2성분을 도시한 그래프,

도 30a는 도 29에서 검출된 D1성분의 질량분석을 도시한 그래프,

도 30b는 도 29에서 검출된 D2성분의 질량분석을 도시한 그래프,

도 31은 쌀배지의 배양추출물 정제 경과의 계통도,

도 32는 B배지 I의 배양 추출물 정제 경과의 계통도,

도 33은 신규물질(MW: 198) 1,2,3의 유도체의 구조도,

도 34는 양파에 사용할때, 월동전의 생육 조사부의 설명도,

도 35는 양파의 벌브지름과 잎면적의 상관도.

(실시예 1)

공시균명칭

Trichoderuma hurzianum SK-5-5(트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5)

공시균은 97년 1월 북해도 그린 고산에서 한천배지의 슬랜트(사면배양) 1개를 수령하였다. 공시균은 하기의 사면배지에 식균하여, 28℃에서 5일간 배양후, 냉장으로 보전하였다.

한천 사면 배지조성

오트밀 5.0%

수크로오스 5.0%

한천 1.0%

28℃, 5일간 배양후 냉장보존

배양

배양은 500ml 3각 플라스크를 사용, 쌀배지(A배지)와 액체배지(B배지 I)의 2종류로 행하였다. A배지의 조건은 28℃에서 정치배양(배양 도중에 멸균수 10ml를 첨가)하고 B배지 I의배양은 28℃에서 270rpm의 진탕배양을 하였다.

배지조성: A배지

쌀 100%

대두박 3%

멸균수 10%

배지조성: B배지 I

글루코오스 5.0%

폴리펩톤 0.5%

NaCl 0.8%

효모엑스 0.2%

탄산칼슘 1.0%

검정법

검정은 모든 페이퍼 디스크 평판법에 의한 in vitro 에서 행하고, 공시균에는 하기의 균을 사용하였다.

(1) Rhizoctonia solani (AG-1IA)

검정용 배지에는 PDA (Nissui) 1.3%, Chloramphenicol 0.002%의 조성으로 이루어진 배지를 사용하였다. Rhizoctonia의 균사의 선단을 코르크볼라로 뺀것을 평판 배지의 중앙에 올려놓고, 브로스를 스며들게할 페이퍼 디스크를 놓고 균사의 신장의 상태를 관찰하였다.

(2) Botrytis cinerea

검정용 배지에는 감자추출물 20.0%, 수크로오스 2.0%, 한천 1.5%의 조성으로 이루어진 배지를 사용하였다. 검정은 페이퍼 디스크에 시료를 놓고 풍건후 샬레에 올려 놓았다. 샬레를 인큐베이터에 넣어서 배양하여 페이퍼 디스크의 주위에 저지원이 형성되어 있는지 아닌지를 관찰하였다.

(3) 항균 스펙트럼 검정균

항균 스펙트럼을 하기의 검정균을 사용하여 측정하였다.

배양법

(1) A배지 배양법

Rhizoctonia solani (AG-1IA) 활성성분

사상균 Rhizoctonia solani (AG-1IA)에 대한 A배지의 배양추출액 활성물의 단리정제.

A배지(쌀배지 1kg) 500ml의 3각 플라스크 1개에 쌀 100g와 대두박 3g를 가하여, 같은 조건의 것의 10개분의 배지를 조제하였다. 멸균후 에제로 식균하여, 28℃ 10일간(균이 잘 증식하도록 도중에 몇번인가 플라스크를 흔든다. 또 배지의 표면이 건조해지면 멸균수를 첨가한다.) 정치 배양후, 50% 아세톤 수를 2리터 가하여 추출하였다. 여기서 배양물 50% 아세톤 추출액 2리터를 얻었다.

(2) B배지 배양법

Staphylococcus aureus 209P 활성성분

세균 Staphylococcus aureus 209P에 대한 B배지 배양 추출액중 활성성분의 단리 정제.

액체 배지인 B배지 I의 항세균 활성성분을 보다 많이 생산하는 목적으로 배지 조성의 질소원과 탄소원의 비율이 다른 I-IV의 4종을 비교 검토하였다. 각 배지 500ml 3각 플라스크 2부를 사용하여, 배양 5일간후 배양액을 5배 농축으로 조제하여 검정에 사용하였다.

(3) B배지 I 배양법

배지 검토의 결과에서 B배지 I로 정제용 배양을 행하였다.

B배지(글루코오스 5.0%, 폴리펩톤 0.5%, NaCl 0.8%, 호모엑스 0.2%, 탄산칼슘 1.0%) 500ml 3각 플라스크에 100ml의 배지를 조제하였다. 멸균후 식균하여 28 ℃, 5일간, 진탕 배양을 행하였다. 계 1.5리터의 배양액과 등량의 아세톤을 가하여 50% 아세톤 추출액 3리터를 얻었다.

정제법

(1) A배지 배양추출물 정제법

A배지 배양 50% 아세톤 추출액 2리터의 아세톤 유거후, 1리터를 HP-20-Sephadex 컬럼(60.0cm×4.5cmø)에 전량을 통과 흡착시켰다. 등량의 물로 세정후, 등량의 50% 아세톤, 이어서 등량의 100% 아세톤으로 용리시켰다. 각각의 분획을 검정균 Rhizoctonia solani (AG-1IA)에서 검정후 활성물질이 100% 아세톤 용리부에 용리되어 있는 것을 확인하였다. 이어서 100% 아세톤 용리부 1리터를 농축하여, 1098mg의 조정제물을 얻고, 그중의 100mg를 전개용매 메탄올계의 LH-20컬럼에 걸었다(100.0cm×2.0cmø). 분획을 분석(assay)하여 활성분획을 확인하였다. 이는 활성분획을 회수후 실리카겔 TLC(아세트산 에틸: 아세트산: 물 = 5:1:1)로 전개하여 몰리브덴 황산정색반응을 한 곳, Rf=0.3 부근에 스폿트가 검출되었다. 동시에 불활성 분획의 전개부에는 이들의 스폿트는 검출되지 않았다. 이 사실에서 활성물은 Rf=0.3 부근에 검출되는 스폿트로 추정하여 다시 정제를 진행시켰다. 실리카겔 PTLC전개(아세트산 에틸: 아세트산:물 = 5:1:1), 받아 취하여 메탄올 추출후, HPLC를 사용하여 단리 정제하였다. 단리 정제물은 기기 분석을 실시하여 동정을 하였다(도 31).

(2) B배지 I배양 추출물 정제법

B배지 배양 50% 아세톤 추출액 3리터의 아세톤 유거후(1.5리터), 활성탄 흡 착컬럼(60.0cm×2.0cmø)에 전량 1.5리터를 통과 흡착시켰다. 등량의 물로 세정후, 등량의 50% 아세톤, 이어서 등량의 100% 아세톤으로 용리시켰다. 각 분획을 검정균 Staphylococcus aureus 209P를 사용하여 검정한 결과, 100% 아세톤 용리부에 활성물질이 용리되어 있는 것이 확인되었다. 100% 아세톤 용리부 1.5리터를 농축하여 아세트산 에틸로 분배 추출을 행하고, 이어서 메탄올을 전개 용매로 하는 LH-20을 실시하여 HPLC로 단리 정제를 행하였다. 단리 정제물은 기기 분석을 실시하여 동정을 하였다(도 32).

단리 정제물 생물활성법

(1) A배지 단리 정제물 평가법

4성분의 생물 평가법

검정용 배지에는 PDA (Nissui) 1.3%, Chloramphenicol 0.002%의 조성으로 이루어진 배지를 사용하였다. Rhizoctonia solani (AG-1IA)의 균사의 선단을 크로크폴라로 뺀 것을 평판 배지의 중앙에 올려놓고, 사이드에 조제한 단리 물질을 스며들게한 페이퍼 디스크를 놓고 균사의 신장의 상태를 관찰하였다.

(2) B배지 I 단리정제물 평가물

C성분의 생물평가(MW 168)

단리정제한 C성분 (MW: 168)은 신규물이며, 극히 단순한 구조를 유지하고 있다. 모핵으로서의 흥미를 갖기 때문에 생물 평가를 확대하여 실시하였다.

(3) 박테리아 속의 평가

Bioassay

시험균을 가한 한천 배지를 샬레에 넣어 굳힌다. 그위에 시료를 함유한 페이퍼 디스크를 올려놓고, 37℃에서 18시간 배양한 후, 발육 저지원의 형성을 확인한다.

(a) 사용균주

Staphylococcus aureus 209P, Pseudomonas syringal (담배 야화병), Xanthomonoas Campestris pv. citri (감귤궤양병), Erwinia sp (매실궤양병)의 4균주를 사용하였다.

(b) 사용배지

전 배양에는 부이욘배지(DIFCO)를 사용, 하룻밤 배양후, ×10²으로 희석하여 이것을 상층의 배지 0.5% 에 혼합, 균측정 배지에는 MYCIN AGAR(미쿠니 가가쿠)를 사용하였다.

상층- MYCIN AGAR 1.5% (미쿠니 가가쿠) ＋ 부이욘 2% 배지(DIFCO)로 하룻밤 배양한 배양액 ×10²로 희석한 것을 0.5% 가한다.

하층- MYCIN AGAR 2.0% (미쿠니 가가쿠)

(c) 항균측정

페이퍼 디스크에 1000ppm, 500ppm, 250ppm 으로 조제한 단리 정제물을 스며들게하고, 풍건후 샬레에 올려놓고, 37℃에서 18시간 배양하여, 발육 저지원의 형성의 유무를 관찰하였다.

(4) 포도구균에 대한 항균력(MIC)의 측정

(a) 사용균주

S.aureusu 209P JC-1, 제1G 보존의 임상분리 황색 포도구균 20주(MSSA, MRSA 각 10주) 및 기준 균주인 E.coli NIHJ JC-2의 계 22주를 사용하였다.

(b) 사용항균약

MW: 168, methicllin (DMPPC, 주사용 스타프시린, Lot. No. FSB 19,900㎍/mg, 만유세이야쿠), vancomycin (VCM, Lot. No. 41HO457, 10750SIGMA)

(c) 사용배지

항균력 측정에는 Mueller-Hinton agar (MIA: Difco)를 사용전 배양에는, Mueller Hinton broth (MHB: Difco)를 사용하였다.

(d) 항균력 측정

사용균주에 대한 각 약제의 최소 발육저지농도(MIC)는 일본 화학요법학회 표준법에 준거하여 한천 평판 희석법으로 측정하였다. 균주는 MHA에 도말하여, 37℃에서 하룻밤 배양하여 생육한 콜로니를 MHB로 37℃에서 하룻밤 배양하여 그 균액을 100배 희석(E.coli만 1000배 희석)한 것을 접종균액으로 하였다.

결과

(1) 검정균의 결과

A배지와 B배지 I의 배양액 활성은 표 2와 같다.

항균 스텍트럼을 하기의 검정균을 사용하여 측정하였다.

A배지의 배양추출액중의 검정의 결과, Rhizoctonia solani (AG-1IA)의 균사가 A배지 배양 추출물의 페이퍼 디스크를 피해 있는 상태가 관찰되었다. 본 균이 생산하는 A배지 배양액중의 활성물이 균사의 성장을 방해하는 물질을 생산하고 있다고 추찰되었다. 이 때문에 A배지 배양액중에서, Rhizoctonia solani (AG-1IA)에 저해 활성을 나타내는 물질을 지표로 단리 정제를 시도하였다.

또 B 배지 I의 배양 추출액중의 검정결과, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani에의 활성은 확인되지 않고, 박테리아만 발육 저지원의 형성이 확인되었다.

이 사실은 본 균은 길항작용이외의 항균력이 있다고 보여지며, 항생물질을 생산하고 있는 가능성이 생각되었다. 특히 Staphylococcus aureus 209P에 형성된 발육 저지원은 클리어하였기때문에 B배지 I에서는 박테리아 Staphylococcus aureus 209P에 대한 활성물질을 지표로 단리 정제를 실시하는 것으로 하였다. A배지 배양 물과 B배지 I 배양물의 항균 스펙트럼은 다르며, 각각 계통의 다른 것을 생산하고 있다고 생각되었다. 각각의 활성물을 단리 정제하는 것으로 하였다.

(2) 배양의 결과

(a) A배지 배양결과

A배지(쌀 배지 1kg) 500ml의 3각 플라스크 10개분을 28℃에서 10일간, 정치배양하여, 배양물 50% 아세톤 추출액 2리터를 얻었다.

(b) B배지 검토와 배양결과

표 1에 도시한 B배지 I와 B배지 II에의 활성이 인정되어 B배지 I에 의해 강한 활성이 인정된 본균은 질소원이 적은 조건에서 활성물을 생산하는 것이 확인되었다. 이 결과로부터 B배지 I을 사용하여 28℃에서 5일간 진탕배양을 하였다.

(3) 정제결과

(a) A배지 배양정제결과

실리카겔 PTLC 처리후의 활성분획을 조 정제물로서, HPLC (0.05% TFA 함유 MeOH/H₂O)로 순도의 확인을 행하였다. 분석에서는 0분에서 30분에 걸쳐서 메탄올 0%에서 100%의 그레디언트를 걸어, 다시 30분에서 100% 메탄올로 유속 1 ml/min에서 분석한바 RT(리테션 타임) 32.5분(Fr65)에서 검출되었다(도 1). 언듯보기에 단일물질의 피크가 검출된 것이라 생각되었으나 확대함으로써 복수 피크의 존재가 명백하게 되었다(도 2). RT가 빠른쪽으로부터 A, B, C, D, E라 칭하며(도 2), 그중의 4성분을 단리 정제하였다. 단리 정제물의 성분과 양은 A성분 7.2mg, B성분 12.1mg, D성분3.5mg, E성분 4.5mg이었다. 피크 C는 양이 소량이며, 정제는 단념하였다.

(b) B배지 I 배양정제결과

각각의 분획의 분석으로부터 활성 Fr41 내지 54에 활성이 있는 것을 확인하여 회수하였다. HPLC (0.05% TFA함유 MeOH/H₂O) 분취하여 분석을 행하여 검출된 피크의 RT의 빠른쪽으로부터 A, B, C, D, E로 세고, 5성분의 존재를 확인하였다. 이중 c성분 8.1mg 단리 정제할 수가 있었다.

(4) 기기분석의 결과

(a) A배지 단리정제물

UV흡수 스펙트럼, 질량분석 및 NMR 측정결과(도 3 내지 도 14)로부터, Aib (α-Aminoisobutyric acid)를 함유한 Polypeptide의, Peptibols계 라고 판단하였다. Peptibols계 항생물질은 아미노산 배열중에 α-Aminoisobutyric acid (Aib)를 함유하고 있으며, N말단이 Acetyl기로 C말단이 Amino alcohol 결합인 것이 특징이다(많게는 Phenylalaniol기로 끝난다). 또한 금회의 정제물, A성분, B성분, D성분은 질량분석에서 일부의 아미노산 배열을 하기와 같이 추정하여 그 부분 구조를 기존의 Peptibols의 아미노산 배열과 검색한 결과, 일치하는 것이 없고 신규 Peptibols 계인 것이라 추정하였다. E는 아미노산 배열의 추정이 곤란하기 때문에 판단할 수 없었다.

UV흡수파장: 4성분 모두 말단흡수(도 3, 도 6, 도 9, 도 12)

A성분: 1933 (도 5)

B성분: 1949 또는 1964 (도 8)

D성분: 1810 (도 11)

E성분: 1829 (도 14)

추정구조: A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-.....

(b) B배지 I (액체 배지) 활성물

기기분석의 결과 C성분은 분자량 168 (C₈H₈O₄)의 신규물질인 것이 추정되었다. 다른 성분에 대하여는 단리정제는 대단히 곤란하여 불가능이라고 판단하였으나, LC/MS를 실시하였다. A성분의 UV흡수 파장은 말단이었다(도 15). HPLC의 조건은 컬럼 Capcel pac C18 UG120 (2×150mm)를 사용하여, 1% 아세트산: 아세토니트릴 = 98:2, 유속 0.2ml/min, 온실의 조건에서 분석하였다. A성분은 RT 7.48분에 검출되었다(도 16). A성분이 검출된 분획의 질량분석결과, 분자량은 192 인 것을 추정하였다(도 17). 이와 같이 B성분에 대하여도 마찬가지의 분석을 한바 B성분도 UV 흡수파장이 말단(도 18)에서 HPLC의 RT12.45분에 검출되었다(도 19). 질량분석의 결과, 분자량은 206인 것을 추정하였다(도 20). C성분은 단리 정제가 가능한 분획이다. C성분의 UV 흡수파장은 270nm(도 21)로, HPLC 의 RT는 15.92분에서 검출되었다(도 22). 질량분석의 결과, 분자량은 168인 것을 추정하였다(도 23, 도 24).

또 용매 CD₃ OD로 용해하여 NMR를 측정(도 25), 해석한 바, 5원 고리를 함유하고, 공액결합을 갖는 신규물질인 것이 추정되었다. 추정구조를 도 26에 도시하였다. D성분은 UV 흡수파장이 230nm 부근에 있으며(도 27), HPLC의 RT는 30.28분에 검출되었다(도 28). 그러나 재차 HPLC를 실시하여, UV 스펙트럼 검출기의 파장을 말단과 230nm에서 분석한 결과, RT 0.6 분의 차로 2 성분(D1, D2)이 존재하고 있는 것이 확인되었다(도 29). 각각의 질량분석의 결과, RT의 빠른 UV 흡수가 230nm의 것은 분자량 154였다(D1). 또 RT가 0.6분 지연되어 검출되는 성분의 분자량은 220 인 것을 추정하였다(D2)(도 30). 이 분자량의 명백한 성분을 분자량이 적은 순으로 나란히하면 154(D1), 168(C), 192(A), 206(B), 220(D2)인 것이 확인되었다.

(5) 생물평가결과

(a) A배지 배양 단리 정제물 생물평가결과

4성분의 생물평가결과

A, B, C, D, E성분에 대하여 5000ppm 에서 희석하여 5000ppm, 2500ppm, 1250ppm, 625ppm에서 검정하였다. 결과 A성분, E성분은 1250ppm까지 Rhizoctonia solani의 균사의 신장을 저해하고 있으며, B성분, D성분은 625ppm까지 Rhizoctonia solani의 균사의 신장을 저해하고 있는 것이 확인되었다.

(b) B배지 I 배양 단리정제물 생물평가결과

(가) 박테리아속의 평가결과

B배양물 (MW168)의 박테리아에 대한 생물활성은 발육 저지원이 형성되어 있지않음으로서 항균력은 없으나 약한 것으로 생각되었다.

(나) 포도구균에 대한 항균력 (MIC)의 측정결과는 표 3에 도시한 바와같다.

표 3에 도시한 바와같이 B배양물(MW 168)은 금회 측정한 농도에 있어서 항균력을 표시하지 않고, 포도구균에 대한 항균력은 없든가 극히 약한 것이라고 생각되었다.

고찰

A배지 배양물에서 단리정제한 성분에서는 Aib (α-Aminoisobutyric acid)를 함유한 Peptibols계의 것의 4성분을 단리할 수가 있었다. Trichoderma가 생산하는 Peptibols계의 것은 몇가지가 이미 보고되어있으나, 금회 단리정제한 것은, 그것들과는 일치하지 않았다. 또, 각각의 성분의 아미노산 배열의 결과, 3성분이 신규의 배열인 것이 추정되었다(E성분만 배열을 측정하는 것이 불가능하였다). in vitro시험에서는 Rhizoctonia solani (AG-1IA)의 균사를 저해하여 있는 모양이 관찰되었다. 이 결과에서 본 균의 쌀 배양추출물중에 Rhizoctonia solani (AG-1IA)에 대한 균사 신장 저해물질이 생산되어 있는 것이 명백하게 되었다. 본 균의 길항작용인 상대 균사와의 접촉에 의해 발현하는 세포질 응집을 촉진 사멸시키는 물질 그것이라고 단언은 아직 할수 없으나, 본 균의 쌀 배양추출물중에 균사성장 신장억제물이 생산되어 있는 것은 명백하다.

또 B배지 I 배양에서 단리 정제한 성분은 MW: 168의 신규물(3(3-히드록시-시클로프로펜 5-온-2일)2-프로펜산)이며, Bioassay를 몇가지 실시하였으나 활성은 없든가 극히 약한 것으로 판단하였다. 아마도 활성 본체는 MW: 168 주변화합물이며, MW: 168은 활성물의 부산물이라고 추측하고 있다. 또 MW: 168 주변 화합물의 분자량은 MW: 154, MW: 192, MW: 206, MW: 220이며, 분자량의 차가 각각 14인 것을 알수 있다. 이것은 메틸기 1개 분과 동량이며, 메틸기의 증감에 의한 활성의 상이함도 생각된다. 또 MW: 168은 신규한 구조를 유지하고 있으나, 구조검색에서 유사한 화합물이 몇가지가 보고되어 있다. 그 중에서 MW: 168에 제일 가까운 구조였던 것(도 33)은 돗도리 대학의 PGR활성 스크리닝에서 발견된 것이며, 사상균 Penicillium valiabile SOPP에서 대사되어 단리 정제되었다고 보고되어, C₈H₈O₅(MW: 168)의 조성식으로 표시되는 신규물질이나 활성은 약한 것으로 보고되어 있다.

(실시예 2)

본 발명의 식물의 활성촉진제를 깅가 멜론에 대하여 농지에서 사용한바, 다음의 결과를 얻었다.

실시장소 홋카이도 도쿄로군 군넷프쵸야요이

다가와 농원

실시기간 1999년 4월 23일 ∼ 동년 7월 29일

실시조건 아그로믹 SK-10 (트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 상표 이하 같음)을 50g/m²의 비율로 멜론 상토(床土)에 산포하였다.

직경 1 또는 2mm의 맥반석에 5×10⁷/g의 분생포자를 부착시켰다.

시험구, 대조구 모두에 200m²로, 양구의 상위함은 아그로믹 SK-10의 산포의 유무만이었다. 농약, 추비는 일절하지 않았다.

상기 아그로믹 SK-10을 1999년 4월 23일 산포, 1999년 4월 26일 정식, 1999년 7월 29일 수획을 개시하였다. 깅가 멜론의 평균중량과 당도는 표 4와 같다.

조사경과의 특징

(1) 초기단계의 특징으로서, 뿌리의 활착이 현저하며 잎 형이 크고 줄기가 굵은 위에 꽃눈이 크다.

(2) 중간 계단의 특징은 덩굴(꽃받침)의 상태가 튼튼하여 대조구와 큰 격차가 있고, 물론 농약의 사용은 일체없고 모의 잘록병, 덩굴쪼갬병, 덩굴마름병의 징후도 없었다.

(3) 수확시의 특징으로서는 과실이 크고 형체가 고르고, 네트(그물)은 굵고, 팽팽함은 발군이였다.

(4) 식미검사에 대하여 과실 전체에 당도가 고르고, 외피가 빠듯하게까지 과육이 연하고, 당분이 높고, 그리고 매끈하여 상품인 미각이다(대조구의 멜론과는 확실하게 격차가 생겼다).

(5) 과실이 단단하고, 수확후 상당 장기간(대조구의 1.5배 이상)의 보존이 가능하였다.

(실시예 3)

실시장소 메이지 세이카(주) 생물과학 연구소

실시기간 1999년 4월 ∼ 동년 8월

실시조건 4월 6일 파종

4월 8일 ∼ 22일 발아, 육묘

5월 7일 정식, 아그로믹 SK-10의 산포 2×10⁷/g, 30∼40g/m²

6월 4일 ∼ 7일 교배

7월 12일 ∼ 23일 수확

상기중 적절히 시비, 관수하였다. 상기 실시에 의해 표 5의 결과를 얻었다.

결과

당도는 사용구의 쪽이 1.5% 높았다. SK-10사용에 의해 자당량이 상승하여 포도당, 과당이 억제되었다. SK-10의 한번의 사용에 의해 당도가 향상한 것은 근권에 있어서 상호 작용에 의해 광합성산물의 전류(轉流) 그밖의 활성이 부여된 결과이다.

(실시예 4)

본 발명의 식물의 활성촉진제를 사탕무에 대하여 사용한 바, 다음의 결과를 얻었다.

실시장소 홋카이도 샤리쵸 슈단

실시기간 1999년 3월 12일 ∼ 동년 10월 7일

실시조건 폿토 상부토 약 30kg에 대하여 아그로믹 SK-55 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 상표) 상당량을 혼화처리하였다. 분생포자는 2×10⁸/g이상이 었다. 복토에 대하여 살균처리는 없었다. 균 정착을 위해 3월 하순∼ 4월 중순, 주 1회 정도 관수를 실시하였다. 7월 30일 아그로믹 SK-55의 100 배액을 그루터기와 잎면에 2리터/m²분무 산포하였다. 처리구와 대조구와의 상이함은, 살균처리를 하지 않는것과, 아그로믹 SK-55의 처리를 하지 않는 것이며, 시비량 시비방법 그밖에 일체는 동일하게 하였다.

결과 상기 실시에 대하여 1998년 7월 29일 수확을 한 바, 표 6의 과실 수, 표 7의 비율의 결과를 얻었다.

상기 실시예에 의하면, 근 중량의 32% 증가하여, 당의 양이 40% 증가하고 있다. 따라서 동일 면적에서 40% 증수한 것이 되어 대단한 성과이다.

상기 실시예에 의하면, 발아시의 혼화와, 7월 30일에 아그로믹 SK-55의 산포로 수량의 현저한 증가가 인정된 것은 아그로믹 SK-55에 의해 사탕무의 근경을 활성화하여 이것에 의하여 양분 흡수, 기타가 합리적 또한 강력하게 되어, 세포분열도 순조로이 이루어진 것이라고 추정된다.

사탕무의 경우에도 종자의 처리, 토양혼화, 중간산포등 금후는 사용량과 시기를 연구함으로써 더 한층 이점이 부상하는 가능성이 있다.

(실시예 5)

본 발명의 식물의 활성촉진제를 수도에 대하여 사용한바, 다음의 결과를 얻었다.

실시장소 홋카이도 삿포로시 기요다(사사키 농원)

홋카이도 유바리군 다니쵸 (도야마 농원)

홋카이도 우류군 호쿠류쵸 (다카하시 농원)

실시기간 1999년 5월 6일 ∼ 동년 9월 16일

실시조건 품종명 호시노유메, 키라라 397

아그로믹 SK-10(트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 상표) 산포량

A… 50g/m², 분생자 2×10⁸/g

B… 100g/m², 분생자 2×10⁸/g

대조구에는 다치카렌 에스액을 산포하여, 추비한(종래법) 이외 는 동일하다.

상기의 조건에서 수도재배한 바, 표 8(사사키 농원), 표 9 (도야마 농원), 표 16 (다카하시 농원)의 결과를 얻었다.

상기 실시예에 의하면, 키라라 397의 경우에 단백질에서 관행구에 비하여 4∼6 포인트 내려가, 아밀로스에서 1∼3 포인트의 차가 확인되었다(1포인트는 0.5로 된다).

그래서 맛도를 측정한바, 평균 91.0이였다.

한편 시판의 맛이 좋다고 말하는 쌀에 대하여 측정한바, 88.0이 최고였음으로 현시점에서 최고의 맛도를 나타낸 것이라고 할수 있다.

상기 결과로부터 판단함에 수도의 활성화에 의해 병원균, 해충을 기피한 저농약 유기농법이며 식물 본래의 힘을 끌어 내어서 미각을 개선할 뿐만아니라 수확량도 증가(20 내지 50%) 하는 등의 특징이 확인되었다.

(실시예 6)

본 발명의 식물의 활성촉진제를 옥수수에 대하여 사용한바, 다음의 결과를 얻었다.

실시장소 메이지 세이카(주) 생물과학 연구소

실시기간 1999년 4월 ∼ 동년 8월 30일

사용균: 아그로믹 SK-10 (2 × 10⁷/g)

사용법: 발아 제2주째에 토양산포, 관수 150ml/pot

사용설명: 상기 조건하에 표 11의 사용설계에 의거하여 사용하였다.

상기에 의해 재배하여 수확한 바, 표 12의 결과를 얻었다.

상기와 같이 과실의 비대효과와 당도의 향상이 인정되었다. 사용량의 다소에 의한 유의차는 거의 인정되지 않았다. 즉 20g/m²의 사용량과, 200g/m²의 사용량과의 사이에 차가 없다는 것이 되며, 옥수수의 경우에는 발아후 1회의 사용에서 활성부여가 행하여 짐으로써 수확까지 계속하는 것으로 추정된다.

따라서 아그로믹 SK-10에 의해 생성되는 신 아미노산의 양이 활성을 부여하는데 충분하다면, 사용량은 20g/m²이하에서도 충분한 효력을 발휘할수 있는 것이 된다.

상기 이유에 의해 토양이 아그로믹 SK-10의 증식에 필요한 조건을 가지는 경우에는 20g/m²이하에서도 충분한 효력을 가진 것이라고 인정된다. 어쩌면 증식 가능한 조건의 하한에 의하여 정해질 것이다. 그래서 발아후 일정기간 아그로믹 SK-10의 증식 조건하에 옥수수를 육성하는 방법도 생각된다.

(실시예 7)

아그로믹 SK-10 (트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5의 상표)를 양파 육모상토에 사용하여, 그 묘 및 정식후의 생육촉진 효과를 이하와 같이 조사하였다.

(1) 시험 재료:

(a) 공시종자: 스퍼하이골드의 약제 처리하지 않은 종자.

(b) 공시자재: 아그로믹 SK-10(Trichoderma harzianum SK-5-5의 5×10⁸CFU의 생균제, 홋카이도 그린 고산(주) 제공)

(c) 공시장소: 지바켄 기사라즈시 시모군 이마마

(2) 시험방법:

(a) 묘상의 준비: 육묘상은 지바켄하의 산사토(山砂土)에서, 전작은 스위트콘을 재배한 포장을 사용하였다.

pH는 6.0 전후의 약산성 토양임으로, pH의 조정을 겸하여 소석회 1m² 당 50g, 완숙퇴비(우분(牛糞)주체의 왕겨들이 퇴비) 1kg, CDU 20g를 아그로믹 SK-10 산포사용 15일 전에 시비하여 경운하였다.

(b) 아그로믹 SK-10 사용 및 방법:

사용일 : 1999년 9월 11일

준비된 육묘상에 공시자재와 아그로믹 SK-10 입제를 파종 4일전에 1m² 당 50g 산포하여 표층 3-5cm의 깊이에 잘 혼화하여 수도물을 사용하여, 토양수분이 다습하게 되지 않도록(손으로 쥐어서 단자로 될 정도의 축축한 정도, 즉 사상균을 증식 배양을 위해 최적 습도조건)에 유의하여 살수를 행하였다.

(c) 파종 및 아그로믹 SK-10의 사용후의 관리:

파종일: 1999년 9월 15일

늦더위가 혹독한 고온, 건조 함으로 트리코데르마균이 육묘상토에 증식·정착을 좋게하고, 양파의 출아를 좋게하기 때문에 될수록 지온을 20℃ 내지 25℃ 정도를 유지, 또한 수분 조건의 안정을 도모하도록 양 구 모두 호밀 짚을 2 또는 3cm의 두께로 깔고 그위에 한냉 사(紗)로 덮었다.

양파의 종자는 조파로 50cm사이에 70알 정도를 파종하여 복토후 적당한 살수를 하여 출아가 시작될때까지 상기 방법으로 피복하였다.

출아후는 깐짚을 제거하고 한냉 사 터널 피복을 1개월 정도 행하였다. 정식에 대비하기 위해 상기 터널 피복을 제거, 퇴비와 혼합한 CDU 화성비료를 1m² 당 20g정도 조간(條間)에 얕게 중경(中耕)하여 시비하였다. 묘의 크기는 지름 0.5 내지 0.6cm×잎길이 5 또는 6cm 정도의 충분히 자란 묘를 만드는 것을 목표로 하여 육묘하였다.

(d) 정식:

정식일: 1999년 11월 7일 (파종후 53일째)

본 포장의 토양은 충적토, pH는 6.0 정도의 약산성 토양에서 고구마의 후작.

소석회 10a당 60kg, 완숙퇴비 500kg, 골분 60kg, 미박 60kg를 퇴비와 잘 혼화하여 사용하고 경운하였다.

일주간후에 두렁 폭 1m·3조식의 두렁을 만들고, CDU 20kg와 과린산석회 10kg를 완숙퇴비 300kg에 잘 혼화하여 도랑에 시비하였다. 묘는 크기의 순으로 포기사이 15cm에 시비도랑에 정식하였다.

(3) 조사결과

(a) 출아 및 생육상황: 출아에서는 무처리구, 처리구 모두 거의 차가 없었으나, 1주간후에 약간이나마 무처리구에서 모잘록이 발생하였다. 그후의 생육에서는 25일째까지의 차는 인정되지 않았다. 터널 제거·추비후(파종후 35일째)부터 처리구에서 잎색이 진하게 되어 눈으로 보아도 생육이 왕성하게 되고, 차를 인정하게 되었다.

(b) 묘의 생육조사:

(가) 정식전의 묘의 생육상황: 조사일 1999년 11월 7일 (파종후 53일째)

상세한 데이터는 표 3에 도시하였다.

양묘(크기 및 중묘개수)는 처리구 78%로, 무처리구에서는 65% 였다.

아그로믹 SK-10의 사용에 의하여 양묘비율이 13% 증가하였다. 묘지름이 0.7mm이상의 묘는 없었다. 촉진효과에 대하여, 표 13에서 도시한 바와같이 아그로믹 SK-10 처리구에서는 생육지수가 크게되어 생육이 왕성하며, 근 중량도 많게 되었다. 생육촉진율을 비교하면 SK-10 처리구는 무처리구 보다 27% 의 생육증가가 인정되었다.

(나) 정식후의 생육조사: 월동전의 생육상황에 대하여 조사하였다.

조사방법: 도 34의 방법으로 조사하였다.

결과: 상세한 결과는 표 14와 같다.

아그로믹 SK-10 처리구는 무처리구와 비교하여 출엽 매수에서 0.4매 많고, 생육촉진율은 152.5%, 벌브지름 154.7%의 증가율로 되었다. 눈으로 본 관찰에서도 명백하게 생육촉진효과가 인정되었다. 아그로믹 SK-10 처리구는 무처리구와 비교하여 근 중량이 많고 뿌리 길이도 좋고, 뿌리에 잘 흙이 부착하여 근모도 많았다. 또 아그로믹 SK-10 처리구에 있어서, 잎 면적과 벌브지름은 상관관계가 인정되었다(도 35, 표 15, 표 16).

(실시예 8)

아그로믹 SK-10을 양배추 육묘상토에 사용하여, 그 묘 및 정식후의 생육촉진효과를 이하와 같이 조사하였다.

(1) 사용재료:

(a) 공시종자: 약제처리하지 않은 종자

(b) 공시자재: 아그로믹 SK-10(트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5의 5×10⁸CFU, 홋카이도 그린 고산(주) 제공)

(2) 실시장소: 치바켄 마리다시 요시다 농원

(3) 사용개요

(a) 사용일: 1999년 9월 15일

(b) 파종일: 1999년 9월 19일

(c) 상토: pH 6.0 전후의 사양토를 중성으로 조정하기 위해, 소석회를 1m²당 50g 정도 산포하였다. 이것에 완숙퇴비를 1m²당 1kg, 2주간전에 시비하여 경운하였다.

파종전에 아그로믹 SK-10을, 1m²당 50g 정도 산포하였다. 이어서 표층 5cm정도를 토양 혼화시켜, 1m²당 3리터 정도 살수하였으나, 토양수분은 다습으로 되지 않는 정도로 하였다(손으로 쥐어서 단자로 될 정도).

(2) 조사일: 1999년 12월 23일 (파종후 94일)

상기 조사일에 있어서, 처리구는 잎색이 진하고, 두꺼운 잎으로 견실하고 결구성이 빠른것이 인정되었다.

Claims

트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체 배지에서 배양하여 추출한 물질로서, 이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하고, 사상균에 항균력을 가지며, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진하는 식물의 활성부여제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 액체 배지에서 배양하여 추출한 물질로서, 이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하고, 세균(Staphylococcus aureus 209P)에 항균력을 가지며, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성부여제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 고체 배지에 식균하여, 25℃ 내지 30℃에서 7일 내지 15일간 정치 배양한후, 추출하여 제 1 항 기재의 물질을 얻는 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성부여제의 제조방법.
트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균을 액체 배지에 식균하여, 25℃ 내지 30℃에서 4일 내지 10일간 진탕 배양한후, 추출하여 제 2 항 기재의 물질을 얻는 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성부여제의 제조방법.
무균 처리한 담체 입자에, 이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 부착시킨 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성촉진제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
무균 처리한 무기질 입자에, 이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 혼합하여, 또는 이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하는 SK-5-5균을 부착시킨 무기질 입자와, 상기 무기질 입자 이외의 다른 입자를 혼합한 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성촉진제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 배양하여 이것을 배지와 동시에 미리 정해져 있는 양씩 분리하여 무균의 다공질 입자 및 영양분으로 이루어진 증량재와 혼합한 후, 미리 정해져 있는 양씩 포장한 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성촉진제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
이하의 A성분, B성분, C성분 및 D성분을 포함하는 트리코데르마 하르지아넘 SK-5-5균의 분생포자를 액체 배지에서 증식시킨후, 미리 정해져 있는 양씩 포장한 것을 특징으로 하는, 식물을 활성화시켜 그 생육을 촉진시키는 식물의 활성촉진제:

A성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 192

B성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib- … 으로서 분자량 206

C성분:

… 으로서 분자량 168

D성분: Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib- … 으로서 분자량 154 또는 220
제 5 항 내지 제 8 항중 어느 한 항 기재의 식물의 활성촉진제를, 육묘 토양에 혼입하여 또는 육묘시에 토양에 산포, 혹은 포장에 산포하는 것을 특징으로 하는 식물의 활성촉진제의 사용방법.
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