WO2000061591A1

WO2000061591A1 - Activateur de plante, procede de production de cet activateur, procede d'activation, stimulateur d'activite et procede d'application de ce stimulateur

Info

Publication number: WO2000061591A1
Application number: PCT/JP2000/002239
Authority: WO
Inventors: Yasuharu Sasaki
Original assignee: Hokkaido Green Kosan, Incorporated
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2000-10-19
Also published as: EP1180523A1; US6753295B1; AU3671700A; KR100665539B1; JP2001172112A; EP1180523A4; CA2369974A1; CN1350541A; KR20020008829A

Description

明細書植物の活性付与剤、その製造方法と、活性付与方法及び活性促進剤並びにその施用方法

技術分野

この発明は、卜リコデルマハルジァナム S K— 5— 5 (Trichoderuma hur zianum SK- 5-5) 菌の培地から抽出した糸状菌及び細菌に抗菌性を有する物質を得ることを目的とした植物の活性付与剤及びその製造方法に関する。

また、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子の生成する物質によって植物の根、茎、葉等に病原菌に対する抵抗性を付与することを目的とした植物の活性付与方法及び植物の活性促進剤並びにその施用方法に関する。 b J景技俯

トリコデルマ菌は、微生物農薬として病害防除に実用化されている糸状菌であり、 Trichoderuma lignourum がタバコの白絹病の防除用農薬として登録されている（農薬登録 No.7023)。また英国、フランスでも Trichoderuma hur zianum を有効成分とする野菜の立枯病、苗腐病に有効な微生物農薬（F- s top) が登録されている。

近来減農薬 ·生態系保全型の病害防除の必要性が強く唱えられ、特に生物防除方法は環境負荷の影響が少ないと考えられるので、精力的に研究が進められてい。

植物の根や根圏から分離される細菌や、菌類の中には植物の生育を促進するものがあり、それぞれ植物生育促進根圏（plant growth-promoting rhizobacteria ： P G P R )、植物生育促進菌類 (plant growth-promoting fungi： P G P F )と呼ばれている。

前記有用根圏微生物である P G P R、 P G P Fは植物の生育を促進するのみならず、各種の土壌病害を抑制することも知られている。また最近では、土壌病害 W 61 のみならず、地上病害も抑制する事実も明らかにされ、前記 P G P R、 P G P F は、植物の全身抵抗性の誘導が関わっていることが見出されたと紹介されている ( 1 9 9 9年 6月号、「今月の農業」誌)。

またコゥライシバから分離選抜した Phoma, Trichoderma, Fusarium, Penici ll ium, Sterileなどの菌が、キユウリにおける炭そ病に対し、誘導抵抗性を示すことが報告されている（ 1 9 9 9年 6月号、「今月の農業」誌)。

この発明は、植物病原菌に抗菌性を有する物質を得ることを課題として研究しており、北海道十勝地方の土壌から Trichoderuma hurzianum S K— 5— 5 (トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5 )菌を分離した。この菌は、植物病原菌の 8 0 %を占めるとされる土壌伝染性病原糸状菌に対して広く拮抗性を示す菌であり、現在芝のブラウンバッチ、ラージバッチなどの Rhizoctonia類に微生物農薬（生菌製剤）として開発中のものである。前記トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の拮抗作用は、相手菌糸に接触し、コィリングをする事により、細胞質凝集を促し死滅させるものである。その外観的観察経過より見てベニシリアム（Penicil l ium sp) 等が生産する抗生物質のような培地上で阻止円を示すほど活性が高いものではなく、菌糸同志の接触により発現するものと推定される。前記細胞質凝集作用が、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の生産する何らかの物質によってもたらされると考えられ、これを究明することを第一の課題としたものである。

なお、この発明で用いるトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌は、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）（生命研）に受託番号「微ェ研菌寄第 1 3 3 2 7号」として寄託されている（受託の日： 1 9 9 2年 1 2月 9日、受託者：株式会社北海道グリーン興産）。当該原寄託からのブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求は、 1 9 9 2年 1 2月 9日付で行なわれ、受託番号 B P— 4 3 4 6が付与されている。前記従来の P G P R、 P G P Fは、特定植物（例えばキユウリ）に対し、炭そ病についての有効性を示すもので、今後研究の結果、その使用方法の改善などにより、他の植物、病原菌に対して有効なことが判明する可能性はあるとしても、未だ具体的植物、病原菌に対しては今後の課題とされている。然し乍ら単に病原菌を殺菌するという従来の生物農薬の思考形態が、植物の根茎に亘り抵抗性を付与する方向に変りつつあることは、今後の植物栽培上重要な示唆を含むものである。

この発明は、トリコデルマハルジァナム S K - 5— 5菌について、各種実験を重ねている間に、前記生物農薬の将来性と合致することに想到し、更に使用方法、対象植物等を選定、研究の結果、この発明を完成したのである。将来の植物栽培に多大の影響を与えるものとして、この発明はきわめて有望であり、将来の農業等を支える重要な手段の 1つとなることに疑はない。発明の開示

この発明は、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の生産する物質により、細胞凝集作用（抗菌性）がもたらされるものと推定し、前記菌を培養、精製、同定した所、糸状菌又は細菌に抗菌性を有する物質を得たのである。

また、植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を覆土中に共存させて増殖させることにより、その生成物質により、各種植物の根茎活性を付与し、耐菌性を向上させることが判明し、前記従来の問題点を発展的に改善させて、実用性を確立したものである。

即ち活性付与剤の発明は、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固体培地で培養し、抽出した物質であって、糸状菌に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤である。また他の発明は、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を液体培地で培養し、抽出した物質であって、細菌の一種（Stap hylococcus aureus 209p) に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤である。

次に製造方法の発明は、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固体培地に植菌し、 2 5 °C〜3 0 °Cで 7日〜 1 5日間静置培養した後、抽出して、前記の活性付与剤を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法であり、またトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を液体培地に植菌し、 2 5 °C〜 3 0 °Cで 4日〜 1 0日間振盪培養した後、抽出して、前記の活性付与剤を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法である。この発明において、使用する固体培地として、米培地を用いた。米培地は、米

1 00%、大豆かす 3%、滅菌水 1 0%よりなる固定培地であって、培養中に培地の表面が乾燥しないよう、滅菌水を添加した。

この発明において、使用する液体培地は、グルコース 3. 0%〜5. 0%、ポリペプトン 0. 5%、 Na c 10. 8%、酵母エキス 0. 2%、炭酸カルシウム 1. 0%である。

前記のように固定培地と、液体培地によれば、夫々の特性により、異なる物質を生成することが明らかとなった。このような結果についてのメカニズムは明らかでないが、トリコデルマハルジァナム SK— 5— 5菌に対する刺激その他の作用の相違、かつ培地構成物質に関する特性により、異なる物質を生成するものであって、前記米培地及び液体培地以外の成分の培地であっても同様の物質を生成することは十分考えられ、かつ生成効率向上等今後の研究課題は多大である。次に活性付与方法の発明は、植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム SK- 5一 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させることを特徴とした植物の活性付与方法であり、植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム SK— 5 _ 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させて増殖させ、糸条菌に抗菌力を有する物質の生産を持続させることを特徴とした植物の活性付与方法である。また植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム SK— 5— 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する覆土中に共存させると共に、前記分生胞子の増殖促進条件を付与することを特徴とした植物の活性付与方法であり、分生胞子の施用手段は、植物の種子処理、覆土と分生胞子との混和、分生胞子の散布、灌水又は埋設したものである。更に増殖促進条件は、土壌温度を 1 5°C〜3 0°Cとし、水分を 30%以上としたものであり、他の増殖促進条件は、土壌に増殖可能な通気性又は含気性を付与するものである。

次に他の発明は、多孔性セラミックス粒子その他の担体に、トリコデルマノヽルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を付着させたことを特徴とする植物の活性促進剤であり、無菌処理した無機質粒子に、卜リコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を混合し、又はトリコデルマハルジァナム SK— 5 一 5菌を付着させ、前記無機質粒子と他の粒子とを混合したことを特徴とする植物の活性促進剤である。またトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を培養し、これを培地と共に適量宛分離し、無菌の多孔質粒子に栄養分（例えばキトサン）と共に付着させた後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤であり、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を液体培地で増殖させ、これを無菌の多孔質粒子に栄養分と共に付着させた後、多孔質粒子を所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤である。

また他の発明は、前記記載の植物の活性促進剤を、育苗土壌に混入し、又は育苗時に土壌に散布或いは圃場に散布することを特徴とした植物の活性促進剤の施用方法である。この場合の活性促進剤の使用量は、トリコデルマハルジァナム

S K— 5— 5菌 5 1 0 ⁴/ 〜5 1 0 9 / を 1 111²当り 5 〜 1 0 0 散布又は栽培土 1 m³当り 5 g〜 1 0 0 g混入するものである。

前記発明における植物は、てん菜、メロン、トウモロコシ、水稲、キャベツ及び夕マネギなどであり、根、茎、葉及び実を採取する植物について、何れも有効であることが確認され、その効果も収量増加、糖度増加その他の有為性が明確になった。

前記の発明におけるトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を培養し、その単離精製物を検討した所、 U V吸収スペクトラム、質量分析及び N M R測定結果より、 Aib ( c -Amino isobutyric acid) を含む Polypeptideの、 P eptibols系と判断した。 Peptibols系抗生物質はアミノ酸配列の中にひ- Aminoi sobutyric acid (Aib) を含んでおり、 N末端が Acetyl基で、 C末端が Amino a lcohol結合であることが特徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、 A成分、 B成分、 D成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存の Peptibols のアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。 Eはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。

U V吸収波長： 4成分とも末端吸収

A成分 = 1 9 3 3

B成分 = 1 9 4 9または 1 9 6 4 D成分二 1 8 1 0

E成分二 1 8 2 9

推定構造： A成分： Ac- Aib- Ala- Aib- Aib- Aib- Aib- Gin- Aib- Aib-

B成分： Ac - Aib- Ala- Aib- Aib- Val- Aib- Gin- Aib- Aib-

D成分： Ac- Aib- Ala- Aib- Aib- Aib- 前記のように生成物質は新規配列のアミノ酸と認められるが、植物の根より吸収されて、茎及び葉に至り、ついで消失する。従って収穫時の植物には、根、茎、葉共に残留の有無は不明であるけれども、当初（発芽以後の幼茎等）植物に吸収された段階で、植物の D N Aに何等かの変化を与えるものか、残留するものと推定される。何故ならば、一旦抗菌性を取得した植物は、根茎等の分裂生成に拘らず抗菌性の持続が認められるからである。従って免疫性付与（活性付与）と類似であり、育苗時又は比較的若い植物（実質的に植物の増殖時）に施用すれば、再使用の必要性が認められないのは、一旦活性ができると、その植物の一生に亘り効力が持続されるからである。

この発明のトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子は、植物の苗の時、又は播種時に覆土中に混入すると、前記分生胞子の増殖に伴って生成物質も増加し、これが根から吸収されて茎葉に至り、全体に活性が付与されるので（恰も免疫性付与の如く）、植物が生長して根又は実などを採取する時期（例えば播種後 1ヶ月〜 6ヶ月後）になっても、前記抗菌性は保たれることが確認された。従って多くの植物は、一回の処理（散布その他の手段）によって活性が付与されてその目的を十分達成することができた。

この発明における分生胞子の担体は、多孔質セラミックス粒子（例えば麦飯石の粒子）であって、これをキトサン液に浸漬し、水分を蒸発したものである。前記粒子の大きさについて特定はないが、取扱いの容易性から直径 0 . 5 mm〜 5 mm位が好ましい。前記担体は、多孔質セラミックス粒子（天然又は人工）に限定されることなく、分生胞子に悪影響がない物は使用することができる。

前記セラミックス粒子に予め培養したトリコデルマハルジァナム S K— 5 一 5菌を 5 x 1 0 ⁴/ g〜 5 x 1 0 ⁹/ g宛付着させ、これを l m ²当り 5 g〜 l 0 0 g宛散布する。この場合に、水と共に散布する場合もあるが、灌水するのは、水分付与を目的とする場合と、分生胞子を均等に浸透させて、土壌中に均等に分布させる為に用いる場合とがある。

前記トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の量を 5 X 1 0 4/ g未満にした場合に、前記菌の繁殖が阻害されなければ、増殖されるが、何等かの理由により増殖しない場合があるので、一応の目途とした。然し乍ら菌の増殖は環境によって著しく相違するので、施用後の環境整備によっては更に少量（例えば 5 g未満）の菌でも植物の生育に合せて増殖し、必要量の生産物質を得ることは可能と考えられる。

一方菌量の上限を 5 X 1 0 ⁹/ g以下としたのは、前記生産物質の関係から不必要と考えたからである。菌の増殖条件が悪い場合には、比較的高濃度の施用を要するが、 5 X 1 0 ⁹/ gを越える必要はないと考えられる。

この発明における卜リコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌は通常分生胞子として与えるが、施用時の環境が厳しい場合（例えば高温時、寒冷時）には厚膜胞子として与える方が好ましい場合もある。

前記発明において、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固体培地又は液体培地又はその他の培地で培養し、その生成物を抽出して、これを植物の活性付与剤として施用する場合には、例えば 0 . 1 ~ 1 g/m²必要となる。また分生胞子を散布する場合には、当該分生胞子の増殖下限菌数（例えば 5 x 1 0 ⁹/ g ) が必要である。

この発明の植物の活性付与剤は、菌の時に 1回施用するだけで、爾後収穫まで施用する必要はない。この点は一般農薬と異なり、そのメカニズムは不明であるが、植物の D N Aに何等かの影響を与え、又は生成物質が植物の根、茎、葉に微量残留して、前記特性を発揮するものと推定される。

前記において、分生胞子を施用する場合には、圃場などで、分生胞子が十分増殖し、飽和に達したならば、分生胞子は急速に活力を失い、遂には消滅することが確認された。尤も一部分分生胞子が残留していることも考えられ、増殖条件が良好になれば再び増殖する場合も有り得る。

前記発明においては、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5を固体培地又は液体培地で培養し、その生成物質中 A、 B、 C、 D、 E成分について単離精製したが、活性物質は、新規アミノ酸配列をもつ新規物質で、その分子量は、

A成分 = 1 9 2 , B成分 = 2 0 6， C成分 = 1 6 8， 0 ^ 1 5 4 , D ₂ = 2 2 0 であって、当該アミノ酸又はその周辺物が植物の活性化に有効であろうと推定される。

そこでトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を所定濃度 (例えば 1 g中 5 X 1 0 5以上）以上で施用（土壌に混用、又は根物の根圏に散布）することにより、所期の目的を達成することが確認されている。恐らく、植物により最適の成分又は混用比があるに違いない。

そこで前記トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を従来法によって多量培養し、その生成物質を抽出精製して植物の活性付与剤を得ることができる。前記生成物質は、前記 A成分、 B成分、 C成分、 D成分及び E成分が判明している。

前記発明は、各種植物について有効であるが、実験の結果（実験中も含む）によれば、水稲、トウモロコシ、てん菜、メロン、馬鈴薯、さつまいも、いちご、玉ねぎ、キャベツなどに有効なことが確認された。この発明によれば、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固形培地に培養した場合には、表 2のように、糸状菌について抗菌性を示すことが認められた。

またトリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を液体培地で培養した場合には表 2のようにバクテリアに有効であるものと認められた。

この発明によれば、植物の生育初期に、床土等にトリコデルマハルジァナム S K - 5— 5菌を適量宛混入することにより、又は生育時の散布など根圏に施用することにより、植物を活性化してその根 ·茎 ·葉を改善し、罹病防止、病原菌に対する耐性を付与することができる。これにより生育時の発病を激減させるのみならず、植物の生育を促進し、増収を図り、糖度を向上させるなどの諸効果がある。

然して前記効果は、前記トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子の生成物質（例えば新規アミノ酸）によるものと推定されるが、前記分生胞子は増殖後、また前記生成物質は、植物の成長終期には何れも消失するものと認められるので、如何なる意味の影響もなく、かつ連続使用についても何等の悪影響も見られない効果がある。更に前記生成物質は新規アミノ酸及びその周辺物質と認められるから、植物の葉、茎などに微量残留しても無害である。

またこの発明のトリコデルマハルジァナム S K— 5 _ 5菌は、土壌中で増殖するので、環境条件が増殖に適する場合には、当初の散布濃度が不十分の場合であっても、増殖により必要量の生成物質を補給し、所期の目的を達成した後、自然消滅する特性が認められ、人体への影響はもとより、土壌、植物その他環境破壊などのおそれは皆無である。更に連作不良の作物についても、連作の不利は解消されるものと推定された。図面の簡単な説明

【図 1】

この発明の菌の A培地培養における H P L C分析グラフ。

【図 2】

図 1の拡大グラフ。

【図 3】

A成分の U V吸収波長を示すグラフ。

【図 4】

A成分の¹ H— NMR (CD3OD) を示すグラフ。

【図 5】

(a)、 (b) A成分の質量分析測定のグラフ。

【図 6】

B成分の U V吸収波長を示すグラフ。

【図 7】

B成分の — NMRを示すグラフ。

【図 8】

(a)、 (b) B成分の質量分析測定のグラフ。

【図 9】 D成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 10】

D成分の iH— NMRを示すグラフ。

【図 11】

(a)、（b) D成分の質量分析測定のグラフ。【図 12】

E成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 13】

E成分の iH— NMRを示すグラフ。

【図 14】

(a)、 (b) E成分の質量分析測定のグラフ。【図 15】

A成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 16】

A成分の HP L Cを示すグラフ。

【図 17】

図 16の検出された Aピークの質量分析のグラフ。

【図 18】

B成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 19】

B成分の HP L Cを示すグラフ。

【図 20】

図 19の検出された Aビークの質量分析のグラフ。

【図 21】

C成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 22】

C成分の HP L Cを示すグラフ。

【図 23】

図 22の検出された Aビークの質量分析のグラフ。【図 24】

C成分の質量分析グラフ。

【図 25】

C成分のピークの¹ H— NMR (CD3OD) を示すグラフ。

【図 26】

C成分の構造図。

【図 27】

D成分の UV吸収波長を示すグラフ。

【図 28】

D成分の H PLCを示すグラフ。

【図 29】

(a) UV人 23 Onmで検出された D 1成分を示すグラフ。

(b) UVが末端吸収で D 1成分と RT 0. 6差で検出された D 2成分を示すグラフ。

【図 30】

(a) 図 29で検出された D 1成分の質量分析を示すグラフ。

(b) 図 29で検出された D 2成分の質量分析を示すグラフ。

【図 31】

米培地の培養抽出物精製経過の系統図。

【図 32】

B培地 Iの培養抽出物精製経過の系統図。

【図 33】

新規物質（MW : 198) 1、 2、 3の誘導体の構造図。

【図 34】

たまねぎに施用した際、越冬前の生育調査部の説明図。

【図 35】

たまねぎのバルブ径と葉面積の相関図。発明を実施するための最良の形態【実施例 1】

(供試菌名称）

Trichoderuma hurzianum SK-5-5 (トリ： ιΐ、、ルマハルシ、、ァナム SK- 5- 5)

供試菌は 97年 1月北海道グリーン興産より寒天培地のスラント 1本を受領した, 供試菌は下記の斜面培地に植菌し、 28°Cで 5日間培養後、冷蔵にて保存した。

寒天斜面培地組成

オートミール 5. 0%

シュクロ一ス 5. 0%

1. 0%

28°C、 5日間培養後冷蔵保存

(培養）

培養は 500ml三角フラスコを用い、米培地（A培地）と液体培地（B培地 I) の 2種類で行った。 A培地の条件は、 28°Cで静置培養（培養途中に滅菌水 10mlを添加）とし、 B培地 Iの培養は、 28°Cで 270rpmの振盪培養をした。

培地組成： A培地

米 100%

大豆かす 3%

滅菌水 10 %

培地組成： B培地 I

グルコース 5. 0%

ポリペプトン 0. 5%

NaC 1 0. 8%

酵母エキス 0. 2%

炭酸カルシウム 1. 0%

(検定法）

検定は、すべてべ一パ一ディスク平板法による in vitroで行い、供試菌には下記の菌を用いた。 ( 1 ) Rhizoctonia solani (AG-1 IA)

検定用培地には P D A (Nissui ) 1.3%、 Chloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。 Rhizoctonia の菌糸の先端をコルクボーラ一で抜いたものを平板培地の中央にのせ、ブロスを染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。

(2) Botrytis cinerea

検定用培地には Potato-extract 20.0%、 Sucrose 2.0%、寒天 1.5%の組成からなる培地を用いた。検定はペーパーディスクに試料をのせ風乾後シャーレにのせたシャーレをィンキュベ一夕一に入れて培養し、ペーパーディスクの周りに阻止円が形成されているか否かを観察した。

(3) 抗菌スぺクトラム検定菌

抗菌スぺク卜ラムを下記の検定菌を用いて測定した。

Bacillus subtil is ATCC6633

Micrococcus luters ATCC6633

Staphylococcus aureus 209P

Escherichia col i NIHJ

Saccharomyces cerevisiae SHY3

Candida albicans M9001

Candida pseudotropicalis M9035

Cryptococcus neoformans M9010

Debaryomyces hansenn M9011

Trigonopsis variabilis M9031

Schizosaccharomyces pombe M9025

Hansenula schneggi IAM4269

(培養法）

( 1 ) A培地培養法

Rhizoctonia solani (AG-1 IA) 活性成物

糸状菌 Rhizoctonia solani (AG-1 IA) に対する A培地の培養抽出液活性物の単離精製。

A培地（米培地 lkg) 5 0 0mlの三角フラスコ 1本に米 1 ◦ 0 gと大豆かす 3 gを加え、同じ条件のもの 1 0本分の培地を調製した。滅菌後エーゼで植菌して、 2 8°C 1 0日間（菌がよく増殖するように途中何度かフラスコを振る。また培地の表面が乾いてきたら滅菌水を添加する。）静置培養後、 5 0%アセトン水を 2リツトル加え抽出をした。ここで培養物 5 0%ァセトン抽出液 2リットルを得た。

(2) B培地培養法

Staphylococcus aureus 209P 活性成物

細菌 Staphylococcus aureus 209Pに対する B培地培養抽出液中活性物の単離精 m

液体培地である B培地 Iの抗細菌活性成分をより多く生産する目的で培地組成の窒素源と炭素源の割合が異なる I〜 I Vの 4種を比較検討した。各培地 5 00 ml三角フラスコ 2本を用い、培養 5日間後培養液を 5倍濃縮に調製し、検定に用いた。

(3) B培地 I培養法培地検討の結果より B培地 Iで精製用培養を行った。

B培地（グルコース 5. 0%、ポリペプトン 0. 5%、 NaC 1 0. 8%、酵母エキス 0. 2%、炭酸カルシウム 1. 0%) 500ml三角フラスコに、 100mlの培地を調製した。滅菌後植菌し、 28°C、 5日間、振盪培養を行った。計 1. 5リットルの培養液と等量のアセトンを加え、 50%ァセトン抽出液 3リットルを得た。

(精製法）

(1) A培地培養抽出物精製法

A培地培養 50 %ァセトン抽出液 2リットルのァセトン留去後、 1リットルを HP - 20 -Sephadex カラム（60.0cmx4.5cm ) に全量を通過吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の 50 %ァセトン、次いで等量の 100 %ァセトンで溶離させた。それぞれの分画を検定菌 Rhizoctonia solani (AG-1IA) で検定後、活性物質が 100%ァセトン溶離部に溶離されていることを確認した。続いて 10 0%アセトン溶離部 1リットルを濃縮し、 1098m の粗精製物を得て、その中の 1 0 Omgを展開溶媒メタノール系の LH— 20カラムにかけた（100.0cmx2.0cm Φ)ο 分画をアツセィし、活性分画を確認した。これら活性分画を回収後シリカゲル TLC (酢酸ェチル：酢酸：水 =5 : 1 : 1) で展開し、モリブデン硫酸呈色反応をしたところ、 Rf = 0. 3付近にスポットが検出された。同時に不活性分画の展開部にはこれらのスポットは検出されなかった。このことから活性物は Rf = 0. 3付近に検出されるスポットと推定し、さらに精製を進めた。シリカゲル P T L C展閧（酢酸ェチル：酢酸：水 = 5 ： 1 ： 1 )、かき取りメタノール抽出後、 HP LCを用いて単離精製をした。単離精製物は器機分析を実施し同定をした（図 3 l)o

(2) B培地 I培養抽出物精製法

B培地培養 50 %ァセトン抽出液 3リットルのァセトン留去後（ 1. 5リットル）、活性炭吸着カラム（60.0cmx2.0cm ) に全量 1. 5リットルを通過、吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の 50 %ァセトン、続いて等量の 100 %ァセトンで溶離させた。各分画を検定菌 Staphylococcus aureus 209Pを用いて検定した結果、 100%ァセトン溶離部に活性物質が溶離されていることが確認された。 100%アセトン溶離部 1. 5リットルを濃縮し、酢酸ェチルで分配抽出を行い、次いでメタノールを展開溶媒とする LH— 20を実施し、 HPLCで単離精製を行った。単離精製物は機器分析を実施し同定をした（図 32)。

(単離精製物生物活性法）

(1) A培地単離精製物評価法

4成分の生物評価法

検定用培地には PDA (Nissui) 1.3%、 Choloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。 Rhizoctonia solani (AG-1IA) の菌糸の先端をコルクボーラ一で抜いたものを平板培地の中央に乗せ、サイドに調製した単離物質を染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。

(2) B培地 I単離精製物評価物

C成分の生物評価（MW168)

単離精製した C成分（MW:168) は新規物であり、きわめて単純な構造を保持している。母核としての興味が持たれた為生物評価を拡大して実施した。

(3) バクテリア属の評価

Bioassay

試験菌を加えた寒天培地をシャーレに入れ固める。その上に試料を含むぺ一パ一ディスクをのせ、 37°Cで 18時間培養した後、発育阻止円の形成を確認する。

(a) 使用菌株

Staphylococcus aureus 209P、 Pseudomonas syringal (タノ、'コ野火病菌 Xan thomonoas Campestris pv.citri (カンキッかレヽ J; )、 Erwinia sp (ウメかヽよう病）の 4菌株を用いた。

(b) 使用培地

前培養にはブイヨン培地（DIFC0) を用い、一晩培養後、 xl02 に希釈し、これを上層の培地 0. 5%に混ぜ、菌測定培地には MYCIN AGAR (ミクニ化学）を用いた。

上層一 YCIN AGAR 1.5% (ミクニ化学） +ブイヨン 2%培地（DIFC0)

にて一晩培養した培養液に希釈したものを 0. 5%加える。下層一 MYCIN AGAR 2.0% (ミクニ化学） (c) 抗菌測定

ペーパーディスクに 1000ppm，500ppm，250ppmに調製した単離精製物を染み込ませ、風乾後シャーレに乗せ、 37°Cで 18時間培養し、発育阻止円の形成の有無を観察した。

(4) ブドウ球菌に対する抗菌力（MI C) の測定

(a) 使用菌株

S.au eusu 209P JC-1, 第 1 G保存の臨床分離黄色ブドウ球菌 20株（MSS A， MRS A 各 10株）及び基準菌株である E.coli NIHJ JC— 2の計 22株を用いた。

(b) 使用抗菌薬

MW:168、 methicllin (DMPPC, 注射用ス夕フシリン、 Lot.No.FSB 19, 900//g/mg, 萬有製薬)、 vancomycin (VCM,Lot.No.41H0457,10750SIGMA)

(c) 使用培地

抗菌力測定には Mueller-Hinton agar (MIA:Difco) を用い前培養には、 Muell er Hinton broth (MHB:Difco) を用いた。

(d) 抗菌力測定

使用菌株に対する各薬剤の最小発育阻止濃度（MI C) は日本化学療法学会標準法に準拠し、寒天平板希釈法にて測定した。菌株は MHAに塗抹し、 37°Cで一晩培養して生育したコロニーを MHBにて 37 °Cで一晩培養し、その菌液を 1 00倍希釈（E.Coliのみ 1000倍希釈）したものを接種菌液とした。

(結果）

(1)検定菌の結果

A培地と B培地 Iの培養液活性は表 2の通りである。

抗菌スぺクトラムを下記の検定菌を用いて測定した。

Α培地の培養抽出液中の検定の結果、 Rhizoctonia solani (AG-1IA) の菌糸が A培地培養抽出物のペーパーディスクを避けている様子が観察された。本菌が生産する A培地培養液中の活性物が、菌糸の成長を妨げる物質を生産していると推察した。このため A培地培養液中より、 Rhizoctonia solani (AG-1IA) に阻害活性を示す物質を指標に単離精製を試みた。

また B培地 Iの培養抽出液中の検定の結果、 Botrytis cinerea_s Rhizoctonia solaniに活性は確認されず、パクテリァにのみ発育阻止円の形成が確認された。このことは、本菌は拮抗作用以外の抗菌力があると見られ、抗生物質を生産している可能性が考えられた。特に Staphylococcus aureus 209Pに形成された発育阻止円はクリア一であった為、 B培地 Iではバクテリア Staphylococcus aureus 20 9Pに対する活性物質を指標に単離精製を実施することにした。 A培地培養物と B 培地 I培養物の抗菌スぺクトラムは異なっており、それぞれ系統の異なるものを生産していると思われた。それぞれの活性物を単離精製することとした。

(2) 培養の結果 (a) A培地培養結果

A培地（米培地 1kg) 500mlの三角フラスコ 10本分を 28°Cで 10日間、静置培養し、培養物 50%アセトン抽出液 2リットルを得た。

(b) B培地検討と培養結果

表 1に表した B培地 Iと B培地 I Iに活性が認められ、 B培地 Iにより強い活性が認められた本菌は、窒素源が少ない条件で活性物を生産することが確認された。この結果より B培地 Iを用いて 28 °Cで 5日間、振盪培養をした。

(3) 精製結果

(a) A培地培養精製結果

シリカゲル PTLC処理後の活性分画を粗精製物として、 HPLC (0.05%TFA 含 MeOH/ 0) で純度の確認を行った。分析では 0分から 30分にかけてメ夕ノ —ル 0%から 100%のグラジェントをかけ、さらに 30分から 100%メ夕ノ —ルで流速 lml/minで分析したところ、 R T (リテシヨンタイム） 32.5分（Fr6 5) で検出された（図 1)。一見、単一物質のピークが検出されたかのように思われたが、拡大することにより複数ピークの存在が明らかとなった（図 2)。 RT の速い方から A、 B、 C、 D、 Eと称し（図 2)、そのうちの 4成分を単離精製した。単離精製物の成分と量は、 A成分 7.2mg, B成分 12.1mg， D成分 3.5mg, E成分 4.5mであった。ピーク Cは量が少量であり、精製は断念した。

(b) B培地 I培養精製結果

それぞれの分画のアツセィより活性 Fr41〜54に活性があることを確認し回収した。 HPLC (0.05%TFA含 MeOH/H₂0) 分取、分析を行い検出されたピークの R Tの速い方から A、 B、 C、 D、 Eと数え、 5成分の存在を確認した。このうち C成分 8. lm単離精製することが出来た。

(4)機器分析の結果

(a) A培地単離精製物

UV吸収スペクトラム、質量分析及び NMR測定結果（図 3〜14) より、 Ai b (ひ -Aminoisobutyric acid) を含む Polypeptideの、 Peptibols系と判断した ₀ Peptibols系抗生物質はアミノ酸配列の中にひ- Aminoisobutyric acid (Aib) を含んでおり、 N末端が Acetyl基で、 C末端が Amino alcohol結合であることが特 W 00/615 徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、 A成分、 B 成分、 D成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存の Peptibolsのアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。 Eはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。

UV吸収波長： 4成分とも末端吸収（図 3、図 6、図 9、図 12)

A成分二 1933 (図 5)

B成分 = 1949または 1964 (図 8)

D成分二 1810 (図 11)

E成分二 1829 (図 14)

推定構造

A成分： Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-...

B成分： Ac-Aib-Ala- Aib- Aib-Val-Aib- Gln-Aib-Aib-,..

D成分： Ac-Aib- Ala-Aib- Aib-Aib-...

(b) B培地 I (液体培地）活性物

機器分析の結果 C成分は、分子量 168 (C₈H₈0₄) の新規物質であることが推定された。他の成分について単離精製は非常に困難であり、不可能と判断したが、 LC/MS を実施した。 A成分の UV吸収波長は末端であった（図 15)。 HPLC の条件はカラム Capcel pac C18 UG120 (2x150画）を用い、 1 %酢酸：ァセトニトリル =98 ： 2、流速 0.2ml/min、温室の条件で分析した。 A成分は、 RT7. 48分に検出された（図 16)。 A成分が検出された分画の質量分析の結果、分子量は 192であることを推定した（図 17)。同じく B成分についても同様の分析をしたところ B成分も UV吸収波長が末端（図 18) で、 11?1^( の1 丁 12、 45分に検出された（図 19)。質量分析の結果、分子量は 206であることを推定した（図 20)。 C成分は単離精製が可能であった分画である。 C成分の UV吸収波長は 270 nm (図 21) で、 HPLCの RTは 15. 92分に検出された（図 22)。質量分析の結果、分子量は 168であることを推定した (図 23、 24)。また溶媒 CD₃0Dで溶解し、 NMRを測定（図 25)、解析したところ五員環を含み、共役結合をもつ新規物質であることが推定された。推定構造を図 26に示した。 D成分は UV吸収波長が 230 nm付近にあり（図 27)、 HPLCの RTは 30. 28分に検出された（図 28)。しかし再度 HPLCを実施し、 UVスペクトラム検出器の波長を末端と 23 Onmで分析した結果、 R TO. 6分の差で 2成分（D 1 , D 2) 存在していることが確認された（図 2 9)。それそれの質量分析の結果、 RTの速い UV吸収が 230 nmのものは分子量 154であった（D l)。また RTが 0. 6分遅れて検出される成分の分子量は 220であることを推定した（D2) (図 30)。これらの分子量の明らかとなった成分を分子量の少ない順にならベると 154 (D l)、 168 (C)、 19 2 (A)、 206 (B)、 220 (D 2 ) であることが確認された。

(5)生物評価結果

(a) A培地培養単離精製物生物評価結果

4成分の生物評価結果

A、 B、 C、 D成分について 5000ppmから希釈し、 5000ppm、 2500ppm、 1250ppm、 625ppmで検定した。結果 A成分、 E成分は 1250ppmまで Rhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しており、 B成分、 D成分は 625ppmまで Rhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しているのが確認された。

(b) B培地 I培養単離精製物生物評価結果

(ィ）バクテリア属の評価結果

B培養物（MW168) のバクテリアに対する生物活性は発育阻止円が形成されていなかったことから抗菌力は無いか、弱いものと考えられた。

(口）ブドウ球菌に対する抗菌力（MI C) の測定結果は表 3の通りである。表 3に示したように B培養物（MW168) は今回測定した濃度において抗菌力を示さず、ブドウ球菌に対する抗菌力は無いか極めて弱いものと考えられた。表 3

測定濃度 MW:168 50〜0.10/ig/ml

DMPP(methicillin) 12.5〜0.10/ig/ml

VCM(vancomycin) 6.25〜0.10//g/ml

A培地培養物より単離精製した成分からは、 A i b ( ひ- Aminoisobutyr ic acid) を含む Peptibols系のもの 4成分を単離することが出来た。 Trichoderm aが生産する Peptibols系のものは幾つかすでに報告されているが、今回単離精製したものは、それらのものとは一致しなかった。また、それぞれの成分のアミノ酸配列の結果、 3成分が新規の配列であることが推定された（E成分のみ配列を測定するのが不可能だった）。さらに in vitro試験では Rhizoctonia solani (A G-1 IA) の菌糸を阻害している様子が観察された。この結果から本菌の米培養抽出物中に Rhizoctonia solani (AG-1 IA) に対する菌糸伸長阻害物質が生産されていることが明らかとなった。本菌の拮抗作用である相手菌糸との接触により発現する細胞質凝集を促し死滅させる物質そのものであるという断言はまだ出来ないが、本菌の米培養抽出物中に菌糸成長伸長抑制物が生産されていることは明らかである。

また B培地 I培養より単離精製した成分は MW: 168の新規物（3( 3- hydroxy- eye 1 opropene 5 - one - 2yl )2 - propenoic asid) であり、 Bioassay を幾つか実施したが活性は無いか、きわめて弱いものと判断した。おそらく活性本体は MW: 168周辺化合物であり、 MW: 168は活性物の副成物であると推測している。また MW: 168周辺化合物の分子量は MW: 154、 MW: 192、 MW:206、 MW:220であり、分子量の差がそれぞれ 1 4であることがわかる。これはメチル基一個分と同量であり、メチル基の増減による活性の違いも考えられる。また MW: 168は新規な構造を保持しているが、構造検索より類似していた化合物が幾つか報告されていた。その中で MW: 168に一番近い構造であったもの（図 3 3 ) は、鳥取大学の P G R活性スクリーニングで見出されたものであり、糸状菌 Penici llium valiabi le S0PPより代謝され単離精製されたと報告され、 C8Hs 0₅ (MW: 198) の組成式で表されている新規物質であるが、活性は弱いものと報告されている。

【実施例 2】

この発明の植物の活性促進剤をぎんがメロンについて農地で施用した所、次の結果を得た。

実施場所北海道常呂郡訓子府町弥生

田川農園

実施期間平成 1 1年 4月 2 3日〜同年 7月 2 9日実施条件ァグロミック S K— 1 0 (トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の商標、以下同じ）を 5 0 g/m²の割合でメロン床土に散布した。直径 1〜2 mmの麦飯石に、 5 x 1 0 ⁷/ gの分生胞子を付着させてあった。試験区、対照区共に 2 0 0 m ²で、両区の相違は、ァグロミック S K— 1 0の散布の有無だけであった。農薬、追肥は一切しなかった。

前記ァグロミック S K— 1 0を平成 1 1年 4月 2 3日散布、平成 1 1年 4月 2 6日定植、平成 1 1年 7月 2 9日収穫を開始した。ぎんがメロンの平均重量と糖度は表 4の通りである。

表 4 糖度

( ) 内採取 1 0日後の糖度調査経過の特徴

(1) 初期段階の特徴として、根の活着が顕著で葉形が大きく茎が太い上に花めが大きい。

(2) 中間階段の特徴は、つる（へ夕）の状態がガッチリして対照区と大きな格差があり、勿論農薬の使用は一切無く苗の立枯れ、つる割れ病、つる枯れ病の兆候も無かった。

(3) 収穫時の特徴としては、果実が大きく形が揃っており、ネットは太くて、張りは抜群であった。

(4) 食味検査について、果実全体に糖度が等しく、外皮ぎりぎりまで果肉が柔らかく、糖分が高く、しかもさらつとして上品な味覚である（対照区のメロンとは確実に格差を生じた）。

(5) 果実がしまっており、収穫後相当長期（対照区の 1 . 5倍以上）の保存が可能であった。

【実施例 3】

実施場所明治製菓株式会社生物科学研究所

実施期間平成 1 1年 4月〜同年 8月

実施条件 4月 6日播種

4月 8曰〜 22曰発芽、育苗

5月 7日定植、ァグロミック SK— 10の散布

2 X 10⁷/gヽ 30〜40 g/m²

6月 4日〜 7日交配

7月 12日〜 23日収穫

前記中適宜施肥、濯水した。前記実施により、表 5の結果を得た。表 5 糖度

結果

糖度は施用区の方が 1. 5%高かった。 SK_ 10施用によりショ糖量が上昇し、ブドウ糖、果糖が抑制された。 SK— 10の一度の施用により糖度が向上したことは、根圏における相互作用により光合成産物の転流その他活性が付与された結果である。

【実施例 4】

この発明の植物の活性促進剤をてん菜について施用した所、次の結果を得た。実施場所北海道斜里町朱丹

実施期間平成 1 1年 3月 12日〜同年 10月 7日

実施条件ポット上部土約 30kgに対し、ァグロミック SK— 55 トリコデルマハルジァナム SK— 5— 5菌の商標）相当量を混和処理した。分生胞子 W 0 は 2 x 1 0 «/ g以上であった。覆土に対し殺菌処理なし。菌定着の為に 3月下旬〜 4月中旬、週一回程度濯水を実施した。 7月 3 0日ァグロミック S K— 5 5 の 1 0 0倍液を株元と葉面に 2 リットル/ m ²噴霧散布した。処理区と対照区との相違は、殺菌処理しないことと、ァグロミック S K— 5 5の処理をしないことであり、施肥量、施肥方法その他一切同一とした。

結果上記実施について、平成 1 0年 7月 2 9日収穫した所、表 6の実数、表 7の比率の結果を得た。表 6 実数

前記実施例によれば、根重が 3 2 %増加し、糖量が 4 0 %増加している。従つて同一面積で 4 0 %増収したことになり、大変な成果である。

前記実施例によれば、発芽時の混和と、 7月 3 0日にァグロミック S K— 5 5の散布で、収量の著しい増加が認められたことは、ァグロミック S K— 5 5 により、てん菜の根茎を活性化し、これにより養分吸収その他が合理的、かつ強力になり、細胞分裂も順調になったものと推定される。

てん菜の場合にも種子の処理、土壌混和、中間散布など、今後は施用量と時機を研究することにより、更なる利点が浮上する可能性がある。

【実施例 5】 T この発明の植物の活性促進剤を水稲について施用した所、次の結果を得た。実施場所北海道札幌巿清田（佐々木農園）

北海道夕張郡田仁町（樋山農園）

北海道雨竜郡北竜町（高橋農園）

実施期間平成 1 1年 5月 6日〜同年 9月 1 6日

実施条件品種名ほしのゆめ、きらら 3 9 7

ァグロミック S K— 1 0 (トリコデルマハルジァナム S K—

5— 5菌の商標）散布量

Α ··· 5 0 gZm²、分生子 2 X 1 0 8/ g

B〜 1 0 0 g/m²、分生子 2 x 1 0 ⁸/ g

対照区には、夕チガレンエース液を散布し、追肥した（従来法）以外は同一である。

前記の条件で、水稲栽培した所、表 8 (佐々木農園)、表 9 (樋山農園）、表 1 (高橋農園）の結果を得た。

品種名：ほしのゆめ、マツ卜：坪 7 7株、収穫日：平成 1 1年 9月 2日

表 9 樋山農園

品種名：きらら 3 9 7、ポット：坪 Z 8 0株、収穫日：平成 1 1年 9月 3日蛋白含有量は少ない程美味とされている。 W 00/ 1 P T/JP00/ 2239

表 1 o 高橋農園

品種名：きらら 397、マット：坪 780株、収穫日：平成 1 1年 9月 16日前記実施例によれば、きらら 397の場合に、蛋白質で、慣行区に比べて 4〜 6ポイント下がり、アミロースで 1〜3ポイントの差が確認された（ 1ポイントは 0. 5とされる）。

そこで味度を測定した所、平均 9 1. 0であった。一方市販の味が良いと言われる米について測定した所、 88. 0が最高であったから、現時点で最高の味度を示したものということができる。

前記結果より判断するに、水稲の活性化により、病原菌、害虫を忌避した低農薬有機農法であり、植物本来の力を引出して味覚を改善するのみならず収穫量も増加（20〜50%) するなどの特徴が確認された。

【実施例 6】

この発明の植物の活性促進剤をトウモロコシについて施用した所、次の結果を得た。

実施場所明治製菓株式会社生物科学研究所

実施期間平成 1 1年 4月〜同年 8月 30日

使用菌：ァグロミック SK— 10 (2 X 10?/g)

施用法：発芽第 2週目に、土壌散布、灌水 150ml/po t

施用説明前記条件のもとに、表 1 1の施用設計に基づき施用した。

環境：自然光（屋外）、昼間 25〜38° 夜間 25〜28° 地温 25〜34°C

前記により栽培し、収穫した所、表 1 2の結果を得た。表 1 2

前記のように、果実の肥大効果と、糖度の向上が認められた。施用量の多少による有為差は殆ど認められなかった。即ち 2 0 g/m²の施用量と、 2 0 0 g/ m²の施用量との間に差がないということになり、トウモロコシの場合には、発芽後 1回の施用で活性付与が行われることにより収穫まで継続するものと推定される。

従ってァグロミック S K— 1 ◦により、生成される新アミノ酸の量が活性を付与するのに十分であるならば、施用量は 2 0 g/m²以下でも十分効力を発揮し得ることになる。

前記理由により、土壌がァグロミック S K— 1 0の増殖に必要な条件を有する場合には、 2 0 g/m²以下でも十分効力を有するものと認められる。恐らく増殖可能な条件の下限によって定まるであろう。そこで発芽後一定期間、ァグロミック S K— 1 0の増殖条件のもとにトウモロコシを育成する方法も考えられる。【実施例 7】

ァグロミック SK— 10 (トリコデルマハルジァナム SK— 5— 5の商標 ) をたまねぎ育苗床土に施用し、その苗及び定植後の生育促進効果を以下のように調査した。

(1) 試験材料：

(a) 供試種子：スーパ一ハイゴールドの薬剤処理していない種子

(b) 供試資材：ァグロミック SK— 10 (Trichoderma harzianum SK— 5— 5の 5 x 10«CFUの生菌剤、北海道グリーン興産株式会社提供）

(c) 供試場所：千葉県木更津巿下郡今間

(2) 試験方法：

(a) 苗床の準備：育苗床は千葉県下の山砂土で、前作はスイートコーンを栽培した圃場を用いた。 pHは 6. 0前後の弱酸性土壌であったので、 pHの調整を兼ねて消石灰 1 m²あたり 50 g、完熟堆肥（牛糞主体のモミガラ入り堆肥） l k g CDU20 gをァグロミック SK— 10散布施用 15日前に施肥し、耕耘した。

(b) ァグロミック SK— 10施用および方法：

施用日：平成 1 1年 9月 1 1日

準備した育苗床に、供試資材ァグロミック SK— 10粒剤を播種 4日前に lm ²あたり 50 g散布し、表層 3— 5 cmの深さによく混和し、水道水を用いて、土壌水分が多湿にならないように（手で握りしめて団子になる程度の湿り程度、即ち糸状菌を増殖培養のための最適湿度条件）に留意して散水を行なった。

(c) 播種およびァグロミック SK— 10の施用後の管理：

播種日：平成 1 1年 9月 15日

残暑の厳しい、高温 ·乾燥であるので、トリコデルマ菌が育苗床土に増殖 '定着を良くし、たまねぎの出芽を良くするために、できるだけ地温を 20° (：〜 25 °C程度に保ち、且つ水分条件の安定を図るように、両区ともライ麦ワラを 2〜3 cmの厚さに敷き、その上に寒冷紗をかけた。

たまねぎの種子は、すじまきで 50 cm間に 70粒程度を播種し、覆土後、適度の散水を行なって、出芽が始まるまで、上記方法で被覆した。出芽後は敷きワラを除去し、寒冷紗トンネル被覆を 1ヶ月程度行なった。定植に備えるために、前記トンネル被覆を取り除き、堆肥と混合した CDU化成肥料を lm²あたり 20 g程度、条間に浅く中耕して施肥した。苗の大きさは径 0. 5〜0. 6 cmx葉丈 5〜6 cm程度の充熟した苗を作ることを目標にして育苗した。

(d)定植：

定植日：平成 11年 11月 7日（播種後 53日目）

本圃の土壌は沖積土、 pHは 6. 0程度の弱酸性土壌で、さつまいもの後作。消石灰 10 aあたり 60kg, 完熟堆肥 500 kg, 骨粉 60 kg、米粕 60 k gを堆肥とよく混和して施用し、耕耘した。一週間後に畦幅 1πι· 3条植の畦を作り、 CDU20kgと過燐酸石灰 10kgを完熟堆肥 300 kgによく混和して、溝施肥した。苗は大きさの順に株間 15 cmに施肥溝に定植した。

(3)調査結果：

(a) 出芽および生育状況：出芽では無処理区、処理区とも、ほとんど差は無かつたが、一週間後にわずかながら無処理区で苗立ち枯れが発生した。その後の生育では、 25日目ごろまで差は認められなかったが、トンネル除去 '追肥後（播種後 35日目）より、処理区で葉色が濃くなり、目視でも生育が旺盛となり、差が認められるようになった。

(b) 苗の生育調査：

(ィ）定植前の苗の生育状況：調査日平成 1 1年 11月 7日（播種後 53日目）詳細なデータは表 13に示した。

良苗（大および中苗本数）は処理区 78%で、無処理区では 65%であった。ァグロミック SK— 10の施用によって良苗比率が 13%増加した。苗径が 0. 7mm以上の苗はなかった。促進効果について、表 13で示すとおり、ァグロミック SK— 10処理区では生育指数が大きくなり、生育が旺盛で、根量も多くなつた。生育促進率を比較すると、 SK— 10処理区は、無処理区より 2 7 %の生育増加が認められた。

(口）定植後の生育調査：越冬前の生育状況について調査した。

調査方法：図 34の方法で調査した。結果：詳細な結果は表 14のとおりである。

ァグロミック SK— 1 0処理区は、無処理区と比較して、出葉枚数で 0. 4 枚多く、生育促進率は 1 52. 5%、ノレブ径 1 54. 7%の増加率となった, 目視による観察でも、明らかに生育促進効果が認められた。ァグロミック SK — 1 0処理区は、無処理区と比較して、根量が多く、根張りも良く、根に良く土が付着し、根毛も多かった。またァグロミック SK— 1 0処理区において、葉面積とバルブ径は相関関係が認められた（図 35、表 1 5、表 1 6)。表 13 定植前の苗の生育状況（播種後 53日目、 50cm株間内の株数）

a) 平均生育指数は苗本数 χ指数の合計/合計本数

b ) 平均促進率は平均生育指数/無処理区平均生育指数 χΙΟΟ

表 14 越冬前の生育調査（調査日：平成 11年 12月 23曰）

分

無処理区処理区生育促進率（％) 備考

項目

平均生葉枚数 (枚） 3.7 4.1 110.0 葉面積-最大生葉の葉長平均面積 (cm²) 9.66 14.94 152.5 X最大葉幅平均バルブ径（cm) 1.16 1.77 154.7 表 1 5 処理区におけるバルブ径と葉面積の相関係数

相関係数は 5%水準で有意（両側）。

表 16 無処理区におけるバルブ径と葉面積の相関係数

【実施例 8】

ァグロミック S K— 10をキャベツ育苗床土に施用し、その苗及び定植後の生育促進効果を以下のように調査した。

(1) 使用材料：

(a) 供試種子：薬剤処理していない種子

(b) 供試資材：ァグロミック SK— 10 (トリコデルマハルジァナム SK — 5— 5の 5 x l 08CFU、北海道グリーン興産株式会社提供）

(2) 実施場所：千葉県成田巿吉田農園

(3)施用概要：

(a) 施用日：平成 1 1年 9月 15日

(b) 播種日：平成 1 1年 9月 19日 (c) 床土： pH6. 0前後の砂壌土を中性に調整する為、消石灰を lm²あたり 50 g位散布した。これに完熟堆肥を lm²当り l kg、 2週間前に施肥し、耕耘した。

播種前にァグロミック SK— 10を、 1 m²あたり 50 g位散布した。ついで表層 5 c m位を土壌混和させ、 1 m ²あたり 3リットル位散水したが、土壌水分は多湿にならない程度とした（手で握りしめて団子になる程度）。

(2) 調査日：平成 1 1年 12月 23日（播種後 94日）

前記調査日において、処理区は葉色濃く、厚葉でしまりがよく、結球性が速いことが認められた。

Claims

請求の範囲

【請求項 1】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固体培地で培養して抽出した物質であって、糸状菌に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤。

【請求項 2】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を液体培地で培養して抽出した物質であって、細菌の一種（Staphylococcus aureus 209p) に抗菌力を有することを特徴とした植物の活性付与剤。

【請求項 3】抽出した物質は、下記 A成分、 B成分、 C成分及び D成分としたことを特徴とする請求項 1又は 2記載の植物の活性付与剤。

A成分： Ac- Aib-Ala- Aib-Aib- Aib- Aib-Gln- Aib-Aib-. . .であって分子量 1 9 2 B成分： Ac- Aib-Ala- Aib-Aib-Val- Aib-Gln- Aib- Aib- . . .であって分子量 2 0 6 C成分：

. . .であって分子量 1 6 8

D成分： Ac- Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-.. . であって分子量 1 5 4又は 2 2 0

【請求項 4】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を固体培地に植菌し、 2 5 ° (〜 3 0 °Cで 7日〜 1 5日間静置培養した後、抽出して請求項 1記載の物質を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法。

【請求項 5】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌を液体培地に植菌し、 2 5 °C〜3 0 °Cで 4日〜 1 0日間振盪培養した後、抽出して請求項 2記載の物質を得ることを特徴とした植物の活性付与剤の製造方法。

【請求項 6】植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与することを特徴とした植物の活性付与方法。

【請求項 7】植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する物質を生産させることを特徴とした植物の活性付与方法。

【請求項 8】植物栽培に際し、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子に施用手段を付加し、前記植物に活性を付与する物質を生産させると共に、前記分生胞子の増殖促進条件を付加することを特徴とした植物の活性付与方法。

【請求項 9】分生胞子の施用手段は、分生胞子を植物の種子へ付着処理し、覆土と分生胞子とを混和し、又は分生胞子の適量を散布して、灌水又は埋設することを特徴とした請求項 6、 7、 8の何れか 1項記載の植物の活性付与方法。

【請求項 1 0】増殖促進条件は、土壌温度を 1 5 °C〜 3 0 °Cとし、水分を 3 0 %以上としたことを特徴とする請求項 8記載の植物の活性付与方法。

【請求項 1 1】増殖促進条件は、土壌に増殖可能な通気性又は含気性を付与することを特徴とした請求項 7記載の植物の活性付与方法。

【請求項 1 2】無菌処理した多孔性セラミックス粒子その他の担体粒子に、トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を付着させたことを特徴とする植物の活性促進剤。

【請求項 1 3】無菌処理した無機質粒子に、トリコデルマハルジァナム S K - 5 - 5菌の分生胞子を混合し、又は S K— 5— 5菌を付着させた無機質粒子と、他の粒子とを混合したことを特徴とする植物の活性促進剤。

【請求項 1 4】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を培養し、これを培地と共に適量宛分離し、無菌の多孔質粒子及び栄養分よりなる増量材と混合した後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤。

【請求項 1 5】トリコデルマハルジァナム S K— 5— 5菌の分生胞子を液体培地で増殖させた後、所定量宛包装したことを特徴とする植物の活性促進剤。

【請求項 16】請求項 11、 12、 13の何れか 1項記載の植物の活性促進剤を、育苗土壌に混入し、又は育苗時に、土壌に散布、或いは圃場に散布することを特徴とした植物の活性促進剤の施用方法。

【請求項 17】活性促進剤の使用量は、卜リコデルマハルジァナム S K一 5— 5菌の 5x 10⁴/g〜5x 10⁹/ を1111²当り 5g〜l 00g散布し、又は栽培土 1 m³当り 5 g〜 100 g混入することを特徴とした請求項 16 記載の植物の活性促進剤の施用方法。