PT794193E

PT794193E - Substancia mk7634 processo para sua producao e antelmintico que contem a referida substancia

Info

Publication number: PT794193E
Application number: PT95937171T
Authority: PT
Inventors: Mina Kanda; Noriko Chiba; Shigenori Kumazawa; Masayuki Takagi; Kenzo Harimaya; Tadaaki Okada
Original assignee: Meiji Seika Kaisha; Mitsubishi Chem Corp
Priority date: 1994-11-24
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2000-08-31
Also published as: EP0794193A1; EP0794193B1; CN1067081C; US6007812A; AU696583B2; DE69515903D1; CN1173180A; WO1996016070A1; DE69515903T2; ES2145932T3; EP0794193A4; JP3335177B2; ATE190980T1; KR100406516B1; DK0794193T3; NZ295747A; AU3935795A

Description

1

Descrição “Substância MK7634, processo para sua produção e antebníntico que contém a referida substância”

Campo Técnico A presente invenção refere-se à substância MK7634 que possui actividade antehníntica, aos processos para a sua produção e à sua utilização numa composição antelmíntica que a contenha. Técnica Congénere

As doenças de natureza parasítica são geralmente provocadas por parasitas que vivem nos hospedeiros e originam graves danos à saúde de seres humanos e animais e à agricultura.

Com a finalidade de se tratar ou evitar tais doenças parasíticas têm vindo a ser pesquisados diversos fármacos. Por exemplo, foram já descritas substâncias activas como antelmintas, obtidas a partir de microrganismos, tais como as substâncias destomicina, higromicina, abel-mectina e não só. No entanto, a variedade destas substâncias é muito pequena. Assim sendo, é sempre interessante a descoberta de uma nova substância activa como antelminta. A presente invenção proporciona um novo composto que possui actividade antel-míntica, descreve processos vantajosos para a sua produção e proporciona uma composição antelmíntica que contém o referido composto, satisfazendo portanto o preceito enunciado supra.

Descrição da Invenção

Para responder à questão anterior, os inventores da presente invenção efectuaram pesquisas no sentido de encontrarem uma substância que tivesse actividade antelmíntica e descobriram que há uma substância com actividade antelmíntica que é produzida numa cultura de uma estirpe pertencente ao grupo dos fungos imperfeitos. Os inventores da presente invenção isolaram o ingrediente activo e determinaram as suas propriedades físico-químicas e assim consumaram a presente invenção.

Posto isto, a presente invenção refere-se a uma substância que revela as propriedades físico-químicas adiante enumeradas (doravante designada por substância MK7634), a um processo para produzir tal substância e a um fármaco, em particular uma composição antelmíntica, que incorpora a substância MK7634 enquanto ingrediente activo. (1) Cor e forma: pó incolor (2) Fórmula molecular: 08Ηι5Ν304 (3) Rotação específica: [a]25o = +32,8° (c = 0,5, H20) (4) Espectro de massa (EM-IS): mIz 240 (MNa)+, 218 (MH)+ (5) Espectro de absorção de ultravioletas: λ^χ (H20) nm = 193 (limite de absorção) (6) Espectro de absorção de infravermelhos: vmáx (KB^cm1 = 3400, 1670, 1630, 1405, 1350, 1090, 970 (7) Ponto de fusão: foi adquirindo cor gradualmente e decompôs-se a partir dos 175°C. (8) Solubilidade: solúvel em água e insolúvel em éter, clorofórmio e acetato de etilo. (9) Alcalinidade, acidez e neutralidade: básico (10) Reacção de cor: reacções positivas em ninidrina, GL e ácido molíbdico 3 (11) Cromatografía de camada fina: o valor do Fr é 0,3 (o solvente de revelação é uma mistura solvente constituída por N-butanol, etanol, clorofórmio e amónia a 17% (proporção em peso dos componentes da mistura = 4:5:2:5)

Descrição abreviada dos desenhos A figura 1 mostra o espectro de UV para a substância MK7634 em solução aquosa. A figura 2 mostra o espectro de IV para a substância MK7634 pelo método da pastilha de KBr. A figura 3 mostra o esperto de RMN'!H (400 MHz) para a substância MK7634 mono-dansilada numa solução mista de óxido de deutério e de metano deuterado (a proporção em peso dos componentes da mistura é de 4:1). A figura 4 mostra o espectro de RMN-13C (100 MHz) para a substância MK7634 monodansilada numa solução mista de óxido de deutério e de metano deuterado (a proporção em peso dos componentes da mistura é de 4:1).

Melhor forma de executar a invenção

Seguidamente descrever-se-á a presente invenção minuciosamente. A substância MK7634 da presente invenção pode ser obtida, por exemplo, criando em cultura um microrganismo pertencente ao grupo dos fungos imperfeitos e que seja capaz de produzir a substância MK7634, recolhendo-se depois a substância MK7634 a partir dessa cultura. Como exemplo de um tal microrganismo, embora este não esteja limitado a nenhuns casos específicos, conquanto possuam a propriedade referida supra, indica-se um fungo produtor de tal substância e pertencente ao género Curvularia. Mais concretamente, considera-se que o

4 microrganismo Curvularia pallescens D2479 (por vezes designado, por razões de simplicidade, “estirpe”, ou abreviadamente doravante designado por “D2479”), o qual foi isolado pelos inventores da presente invenção a partir de tecidos de plantas mortas, é um fungo preferido para a produção da referida substância.

As características micológicas da estirpe são as enumeradas adiante. Esta estirpe foi depositada no Departamento de Ciência e Tecnologia Industrial do Instituto Nacional de Biociência e de Tecnologia Humana (Agency of Industrial Science and Technology, the National Institute of Bioscience and Human Technology) (NIBH, código postal: 305, 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) em 17 de Novembro de 1994, tendo recebido o número de acesso ‘FERM P-14645’ e foi depois transferida para depósito internacional, ao abrigo do tratado de Budapeste, em 30 de Outubro de 1995, tendo recebido então o número de acesso ‘FERM BP-5276’. 1. Características micológicas da estirpe (D2479) (1) Características morfológicas

No que diz respeito à formação de colónias refere-se que a estirpe forma activamente colónias com o aspecto de uma penugem de algodão em cultura a 27°C durante 2 semanas num meio de cultua de gelose com dextrose de batata [GDB: é um meio de cultura que contém 4,0 g de extracto de batata em pó, 20,0 g de glicose e 15,0 g de gelose (NISSUI Pharmaceutical) em 1 litro de água (pH 6,0 ± 0,1), NISSUI Pharmaceutical Co., Ltd., Product Summary I, p 92], apresentando as colónias uma cor cinzenta acastanhada clara no início e castanha escura depois.

As bifas basais ramificam-se, subdividem-se muitas vezes e distribuem-se por uma largura entre 3,0 mm e 16 mm, apresentando uma cor variável entre castanho pálido e castanho escuro. 5 Não se formam clamidosporos. O desenvolvimento das hifas aéreas é abundante.

Os conidióforos são mononematosos, manifestam acrogénese e pleurogénese nas hifas vegetativas, normalmente não se ramificam, mas ramificam-se algumas vezes, mantêm-se rectilíneos ou encurvados, apresentam frequentemente uma forma em ziguezague nas partes superiores, a sua cor varia entre castanho pálido e castanho avermelhado escuro, possuem diversas subdivisões, têm um comprimento compreendido entre 70 mm e 450 mm, uma largura entre 3,8 mm e 5,0 mm, os seus pedúnculos são finos e aumentam de volume no sentido das extremidades.

Formam-se poloconídeos e as marcas de separação (cicatrizes) são indistintas.

Os conídeos assumem um aspecto fiísiforme ou de bastonetes fusiformes e apresentam três subdivisões, a terceira célula da partir do fundo aumenta de volume, a terceira célula encurva-se em forma de vírgula ou não se encurva e cada célula dos conídeos apresenta-se com uma cor castanho pálido uniforme, é lisa e tem um tamanho correspondente a dimensões entre 17,8 a 31,2 mm por 5,3 a 12,0 mm, não possuindo os conídeos nenhum hilo saliente nas suas partes basais. (2) Características em cultura nos diversos meios de cultura Φ A estirpe forma activamente colónias em cultura a 27°C durante 2 semanas num meio de cultura de gelose com extracto de malte [GM (gelose com exíracto de malte): é um meio de cultura que contém 20,0 g de extracto de malte, 1,0 g de peptona, 20,0 g de glicose e 20,0 g de gelose em 1 litro de água (pH não modificado), Toshikazu Udagawa, Keisuke Tsubaki et ai, Illustrated Book of Fungi, Vol. 2, Kodansha, p. 1281], assumindo as colónias uma forma 6 variável entre uma penugem de algodão e uma superfície aveludada, apresentando inicialmente uma cor cinzenta acastanhada clara e depois negra acinzentada.

As hifas basais ramificam-se, têm muitas subdivisões e atingem uma largura de 14,7 mm, apresentando uma cor variável entre castanho pálido e castanho avermelhado. Não se formam clamidosporos. 0 desenvolvimento das hifas aéreas é abundante.

Os conídeos formam-se abundantemente e as características dos anamorfos dos coni-dióforos e dos conídeos são semelhantes às observadas no meio de cultura constituído por GDB. Φ A estirpe forma moderadamente colónias em cultura a 27°C durante 2 semanas em meio de ‘Miura’ [LCA: é um meio de cultura que contém 1,0 g de glicose, 1,0 g de KH2PO4, 0,2 g de MgS04»7H20, 0,2 g de KC1, 2,0 g de NaN03, 0,2 g de extracto de levedura e 15,0 g de gelose em 1 litro de água (pH 6,5-7,0); ver a obra 'Dlustrated Book of Fungus’, Vol. 2, supra, p. 1277], espalhando-se as colónias na horizontal e apresentando uma forma semelhante a uma penugem de algodão e com uma cor cinzenta acastanhada inicialmente e castanha amarelada com tons acinzentados depois.

As hifas basais ramificam-se, têm muitas subdivisões e apresentam uma largura entre 2,2 mm e 10 mm, com uma cor variável entre descorado a castanho pálido. 1 Não se formam clamidosporos. O desenvolvimento das hifas aéreas é abundante.

Os conídeos formam-se abundantemente, em particular nas periferias das colónias, e as características dos anamorfos dos conidióforos e dos conídeos são semelhantes às observadas no meio de cultura de GDB.

7 (3) Características fisiológicas

Temperatura de crescimento (em meio de GDB, cultura de 5 dias): 15 a 35°C.

Temperatura óptima: 25 a 30°C. pH durante o crescimento (meio de ‘Miura’, cultura de 7 dias): 3 a 9.

Valor óptimo do pH: 5 a 7. (4) Aspectos taxonómicos

Esta estirpe (D2479) pertence ao género Curvularia, que é um grupo formador de polo-conídeos da classe dos fungos filamentosos imperfeitos, da subdivisão dos fungos imperfeitos, na medida em que se caracteriza por 1) apresentar formação de poloconídeos, 2) os conidióforos serem rectilíneos ou encurvados ou assumirem frequentemente a forma de zigue-zague, formando-se os conídeos acropetalamente e 3) os conídeos possuírem três subdivisões, havendo sempre presentes células intermédias de grande volume e havendo alguns conídeos encurvados em forma de vírgula. Este género distingue-se de um género análogo Drechslera devido às características dos conídeos, isto é, possuem subdivisões genuínas, têm 3 ou 4 subdivisões e possuem células intermédias de grande volume. São já conhecias 40 ou mais espécies pertencentes ao género Curvularia. De acordo com a obra ‘Dematiaceous Hyphomycetes’ de autoria de Μ. B. Ellis (1971), estas 40 espécies distinguem-se pela diferença entre plantas hospedeiras e pela configuração dos conídeos (presença de hilo dos componentes da base dos conídeos, número de subdivisões e tamanho, forma, presença de inflexões nos conídeos, etc.). De acordo com um catálogo das espécies mencionadas na obra ‘Dematiaceous Hyphomycetes’ de M.B. Ellis, p.452-459 81971), realizou-se uma pesquisa desta estirpe (D2479) ao nível da espécie. Como resultado concluiu--se que as características da estirpe se ajustavam perfeitamente bem às do microrganismo

Curvularia pallescem, pelo que a estiipe (D2479) foi identificada como sendo Curvularia pallescens. Os microrganismos Curvularia lunata e Curvularia leonensis são mencionados como espécies análogas, sendo todavia o microrganismo Curvularia pallescens diferente destas espécies pelas características indicadas no quadro 1.

Quadro 1

Características dos ccnídeos D2479 C. pallescem C. leonemis C. lunata Número de subdivisões 3 Subdivisões 3 3 3 Células tumefactas A terceira célula 3 3 3 Encurvados/ /recdlíneos Encurvados ou rectilíneos Encurvados ou rectilíneos Encurvados ou rectilíneos Encurvados Cor Todas as células apresentam uma cor uniforme castanho pálido Todas as células apresentam uma cor uniforme castanho pálido Todas as células apresariam uma cor uniforme castanho pálido As células intermédias são de cor castanho escuro; a cor das células polares varia entre incolor e castanho pálido Tamanho 17,8-31,2x5,3--12,0 mm 17-32x7-12 mm 20-32 x 9-13 mm 20-32x9-15 mm É provável que as características desta estirpe variem, tal como sucede com outros fungos. Por exemplo, é possível utilizar todos os mutantes (que ocorram naturalmente ou que sejam induzidos), os zigotos fenotípicos e os recombinantes genéticos desta estirpe ou obtidos a partir desta estirpe, na prática da presente invenção, desde que produzam a substância MK7634. 2. Método para criar em cultura os fungos produtores da substância MK7634

Criou-se em cultura um fungo produtor da substância MK7634, pertencente ao grupo dos fungos filamentosos imperfeitos, num meio de cultura que continha nutrientes do tipo 9 utilizado pelos microrganismos habituais. Como nutrientes é possível utilizar todos aqueles que são conhecidos para efeitos de criação de fungos em culturas convencionais. Por exemplo, como fonte de carbono é possível utilizar arroz; glicose, infusão de amido, dextrina, amido, melaços, óleos de origem animal e vegetal e não só. Como fonte de azoto é possível utilizar farinha de soja, germe de trigo, concentrado de infusão de milho, farinha de sementes de algodão, extracto de carne, peptona, extracto de levedura, sulfato de amónio, nitrato de sódio, ureia e não só. Também é conveniente acrescentar um sal inorgânico capaz de proporcionar iões, tais como os iões sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobalto, cloro, fosfato e sulfato, conforme necessário. Também é possível acrescentar uma substância orgânica ou inorgânica que melhore o crescimento dos fungos e a produção da substância MK7634.

Como métodos de cultura são preferíveis os métodos de cultura aeróbia, em particular os métodos de cultura sobre um suporte sólido e os métodos de cultura em imersão. A temperatura preferível para a cultura está compreendida entre 15°C e 35°; mas a cultura realiza-se mais preferencialmente a uma temperatura compreendida aproximadamente entre 20° C e 30°C. Embora a produção da substância MK7634 decorra diferenciadamente, consoante o meio de cultura e as condições de cultura, a acumulação desta substância atinge normalmente um máximo num período de 2 a 14 dias em qualquer cultura em substrato sólido, em cultura agitada e em cultura num depósito. No momento em que a quantidade da substância MK7634 acumulada atinge um máximo na cultura, interrompe-se esta e depois isola-se e purifica-se a substância pretendida, separando-a do meio de cultura. 3, Método de purificação das substância MK7634 A substância MK7634, obtida em conformidade com a presente invenção, pode ser recolhida e purificada a partir de uma cultura de fungos produtores da substância MK7634, 756 ίο recorrendo a meios de separação, utilizando para tal as propriedades da substância, por exemplo, efectuando a extracção com um solvente, recorrendo à técnica da resina de permuta iónica, por cromatografia em coluna de adsorção ou de distribuição, por filtração através de gel, diálise, precipitação e todas as combinações destas técnicas. Por exemplo, extrai-se a substância MK7634 a partir dos fungos criados em cultura, utilizando misturas de acetona/água, metanol/ /água e outras. Após a evaporação da acetona ou do metano contidos no extracto, lava-se a camada aquosa sucessivamente com acetato de etilo, N-butanol e outras substancias que tais. Ajustando o pH da camada aquosa para valores próximos da neutralidade e fazendo adsorver a substância numa resina de permuta iónica (por exemplo, ‘Diaion PK-208 (H+)\ Mitsubishi Chemical Corporation, “Diaion” é uma marca comercial registada), é possível realizar a eluição do ingrediente com amónia aquosa ou quejandos. É possível purificar a substância MK7634 submetendo uma amostra obtida por neutralização e liofilização a um procedimento de cromatografia de filtração através de gel, utilizando uma resina de crivos moleculares (designação comercial; Sephadex G-10, Pharmacia), e repetindo depois a cromatografia de filtração através de gel, utilizando outra resina de crivos moleculares (Toyopearl HW-40S, Tosoh, ou semelhantes). A substância MK7634 pode ser utilizada como um ingrediente activo para a preparação de composições farmacêuticas, em particular composições antelmínticas. Como exemplos de criaturas às quais é possível administrar a substância MK7634, enquanto agente antelmíntico, refere-se os seres humano se os animais domésticos, as aves domésticas, os animais laboratoriais e os animais de estimação, por exemplo, porcos, vacas, cavalos, coelhos, ovelhas, cabras, galinhas, patos, perus, ratos domésticos, ratos albinos, cobaias, macacos, cães, gatos e aves pequenas. Como exemplos de parasitas destes animais refere-se o verme Haemonchus,

Ostertagia parasitem, filarias, nemátodos de Cooper, esofagostomas, estronguilóides, afistomas, cestoda de Benedeen, vermes pulmonares, hirudinea hepática e outros no caso dos bovinos e dos ovídeos, nemátodos, helmintas, esofagostomas do porco, nemátodos, ancilostomas, helmintas, Filarioidea e outros no caso dos canídeos, nemátodos, Diphyllobothrium erinacei e outros no caso dos gatos, nemátodos, filárias, nemátodos do cego e outros no caso das galinhas. Na presente exemplificação estão também abrangidos os nemátodos, Enterobius, ancilostomas {Ancylostoma duodenale, Aneylostoma ceylanicim, ancilostoma americano), Trichostrongylus orientalis, estronguilóides, helmintas e outros, típicos dos seres humanos. A substância MK7634 pode ser utilizada para o tratamento e para a prevenção de diversas doenças, em particular para o tratamento e para a prevenção de infecções parasíticas. A administração para efeitos de tratamento pode ser efectuada por via oral ou por via parentérica. Ao ser administrada por via oral, por exemplo, a substância pode ser administrada forçadamente através de um catéter gástrico, ou dispositivo semelhante, sob a forma de um fármaco no estado líquido, ou pode ser administrada misturando-a com os alimentos habituais ou com a água de beber ou pode ser administrada segundo uma fornia habitual que seja conveniente para administração oral, por exemplo, sob a forma de comprimidos, cápsulas, grânulos, pastilhas, pós e cápsulas moles. Quando a administração se efectua por via parentérica, então esta pode ser percutânea, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitonial ou idêntica, sob a forma de uma formulação insolúvel em água que contenha óleo de amendoim, óleo de soja ou de tipo semelhante, ou sob a forma de uma fonnulação solúvel em água que contenha glicerol ou polietileno-glicol, administrável por injecção ou de modo similar. Para evitar as infecções parasíticas, administra-se a substância normalmente por via oral, misturando-a com os alimentos habituais ou com produtos idênticos, ou então pode ser administrada por

injecção. Para evitar infecções parasiticas, o período de administração não está particularmente limitado e são normalmente suficientes, por exemplo, cerca de 2 meses para os galináceos de abate e cerca de 5 meses para os porcos. A dose de administração da substância MK7634 varia em função das espécies relevantes de animais e dos parasitas em causa, ou em função do método de administração. Por exemplo, no caso da administração oral, são vulgares doses de 3 mg/kg ou superiores, de preferência 6 mg/kg ou superiores, quando a substância for administrada sob a forma de uma composição no estado líquido, através de um catéter gástrico, com a finalidade de libertar os galináceos de infestações de nemátodos. Para efeitos de prevenção, administra-se a substância de forma contínua, com uma concentração de 1 ppm ou superior, de preferência compreendida entre 5 ppm e 10 ppm, incorporada nos alimentos.

Dissolvendo ou colocando em suspensão a substância MK7634 num veículo líquido, é possível administrá-la por via parentérica mediante injecção subcutânea ou intramuscular ou de tipo idêntico nos animais. Para efeitos de administração parentérica é possível utilizar uma formulação insolúvel em água que contenha óleo de amendoim, óleo de soja ou de tipo idêntico, e também é possível utilizar uma formulação solúvel em água que contenha glicerol, polietileno-glicol ou uma substância similar. Estas formulações contêm geralmente a substância MK7634 com uma concentração compreendida entre 0,1% e 10% em peso. A dose diária de administração, no caso de se recorrer à via parentérica, é de 0,5 mg/kg ou superior e de preferência está compreendida entre 1 e 20 mg/kg.

Os galináceos tratados por via oral com a substância MK7634 apresentam um ganho normal de peso e não foram detectados nenhuns efeitos secundários. Isto indica que a substância em causa tem uma toxicidade extremamente fraca. 13'

Seguidamente proceder-se-á à descrição de exemplos práticos da presente invenção. Tendo em conta que há diversas características da substância MK7634 que são explicadas pela presente invenção, há pois diversos métodos para a produção da substância MK7634 que podem ser definidos em função dessas características. Assim sendo, a presente invenção não fica limitada aos exemplos adiante descritos e desde já se afirma que não só todas as modificações desses exemplos mas também todos os métodos para a produção, a concentração, a extracção e a purificação da substância MK7634, obtida com base nas características que a substância MK7634 manifestou no contexto da presente invenção e bem assim a utilização de meios convencionais para o efeito, irão estar abrangidos no âmbito da presente invenção.

Exemplo 1

Introduziu-se 40 mL de cada meio de cultura contendo 2,0% de xarope de amido, 1,0% de farinha de soja, 0,15% de óleo de soja, 0,25% de ‘Sungrain’ (Suntory), 0,15% de farinha de sementes de algodão, 0,0005% de FeS04«7H20, 0,00005% de NiCl2«6H20, 0,00005% de CoCl2»6H20 e 0,1% de CaC03 (pH 6,0) em 120 balões de Erlenmeyer com a capacidade de 200 mL e realizou-se a sua esterilização por tratamento em autoclave à temperatura de 121°C durante 20 minutos. Inoculou-se cada um destes balões com a estirpe em causa, utilizando para tal a quantidade transportada por uma ansa de platina, tendo depois sido efectuada a criação em cultura sob agitação à temperatura de 27°C durante 2 dias numa revolvedora rotativa a trabalhar a 210 revoluções por minuto.

De fornia separada, introduziu-se em cada um de 60 balões de Erlenmeyer, com a capacidade de 500 mL, uma quantidade de 60 g de arroz e 20 mL de água potável, tendo tais balões sido esterilizados por tratamento em autoclave à temperatura de 121°C durante 20

minutos. Inoculou-se cada um destes meios de cultura principais com 4 mL de cada um dos meios de culturas inoculantes referidas supra, tendo os procedimentos de criação em cultura prosseguido deixando os balões em repouso à temperatura de 27°C durante 14 dias.

Acrescentou-se 90 litros de uma solução aquosa de acetona a 50% às culturas sólidas obtidas que continham as fungos, agitou-se durante 1 hora e efectuou-se o isolamento dos fungos por filtração para se obter um extracto. Os fungos obtidos por filtração foram misturados com igual quantidade de água e a mistura obtida foi agitada durante l hora, tendo depois os fungos sido separados por filtração para se obter um extracto aquoso. Combinou-se a solução de acetona aquosa e o extracto aquoso referidos supra, concentrou-se sob pressão reduzida e depois evaporou-se a acetona para se obter 50,1 litros de um extracto. A seguir acrescentou-se a este extracto 50 litros de acetato de etilo e lavou-se durante l hora sob agitação. Os 50 litros da camada aquosa foram então concentrados até ao volume de 18 litros sob pressão reduzida, acrescentou-se a esta porção igual quantidade de N-butanol e depois lavou-se durante 1 hora sob agitação. Os 18 litros desta camada aquosa foram então concentrados até ao volume de 13,8 litros sob pressão reduzida e ajustou-se o valor do pH para 7,0. Fez-se adsorver este concentrado numa coluna carregada com 2 litros de uma resina de permuta tónica (Diaion PK-208(H+), Mitsubishi Chemical Corporation). O ingrediente activo foi obtido a partir das fracções eluídas com uma solução de amónia aquosa 0,5 N. Depois de se ter ajustado o valor do pH para 7,0, fez-se adsorver numa coluna carregada com 1 litro de uma resina de permuta tónica (Diaion PK-208(H+), Mitsubishi Chemical Corporation) 450 mL deste produto eluído e efectuou-se a correspondente cromatografia com um gradiente de concentração obtido com 1 litro de água purificada e 1 litro de solução de amónia aquosa 0,5N, tendo sido recolhidas fracções de 15 mL. A partir das fracções n° 46 até à n° 129 foram obtidos 8,5 g de fracção 15 activa. Dissolveu-se este produto em 250 mL de água purificada, ajustou-se o valor do pH para 7,0 e fez-se adsorver o produto numa coluna carregada com 330 mL de uma resina de permuta iónica (Diaion PK.-208(H+), Mitsubishi Chemical Corporation). Efectuou-se a cromatografia utilizando um gradiente de concentração obtido com 700 mL de água purificada e 700 mL de uma solução de amónia aquosa 0,5 N, para se recolher fracções de 5 mL. Efectuou-se a colheita das fracções n° 169 até à n° 240 para se obter 5,5 g de fracção activa. A seguir dissolveu-se 2 g da fracção activa, referida supra, em 50 mL de água purificada, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 830 mL de uma resina de crivos moleculares (Sephadex G-10, Pharmacia) e com água purificada a pH 7,9, tendo sido efectuado um fraccionamento em fracções de 3 mL. Efectuou-se a colheita das fracções n° 49 até à n° 53 para se obter 124 mg de uma fracção activa. De igual modo, dissolveu-se 1,0 g, da totalidade dos 5,5 g da fracção activa anteriormente referida, em 20 mL de água purificada, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 470 mL de uma resina de crivos moleculares (Sephadex G-10, Pharmacia) e com água purificada a pH 7,9, tendo sido efectuado um fraccionamento em fracções de 2 mL. Efectuou-se a colheita das fracções n° 19 até à n° 30 para se obter 145 mg de uma fracção activa. Combinou-se esta quantidade de 145 mg de fracção activa com a quantidade previamente obtida de 124 mg de fracção activa, dissolveu-se em 10 mL de água purificada, ajustou-se o valor do pH para 7,3, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 480 mL de uma resina de crivos moleculares (Sephadex G-10, Pharmacia) e com água purificada, e realizou-se um fraccionamento em fracções de 2 mL. Procedeu-se à colheita das fracções n° 49 até à n° 55 para se obter 84 mg de uma fracção activa.

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Dissolveu-se esta quantidade de 84 mg de fracção activa em 5 mL de água purificada, ajustou-se o valor do pH para 7,25, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 340 mL de uma resina de crivos moleculares (TOYOPEARL HW-40S, Tosoh) e com água purificada, e efectuou-se um fraccionamento em fracções de 2 mL.

Procedeu-se à colheita das fracções n° 38 até à n° 52 e liofilizou-se para se obter 7,2 mg da substância MK7634 com o aspecto de um pó incolor.

De igual modo, dissolveu-se 2,5 g, da totalidade dos 5,5 g da fracção activa referida supra, obtida por cromatografia utilizando a resina de permuta iónica anteriormente indicada (Diaion PK-208(H+), Mitsubishi Chemical Corporation), em 60 mL de água purificada, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 830 mL de uma resina de crivos moleculares (Sephadex G-10, Pharmacia) e com água purificada pH 7,4, e efectuou-se um fraccionamento em fracções de 3 mL. Procedeu-se à colheita das fracções n° 24 até à n° 36 para se obter 203 mg de uma fracção activa. Dissolveu-se esta quantidade de 230 mg da fracção activa em 10 mL de água purificada, ajustou-se para pH 7,3, submeteu-se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 600 mL de uma resina de crivos moleculares (Sephadex G-10, Pharmacia) e com água purificada e efectuou-se um fraccionamento em fracções de 2 mL. Procedeu-se à colheita das fracções n° 37 até à n° 47 para se obter 74,7 mg de uma fracção activa. Esta quantidade de 74,7 mg de fracção activa foi dissolvida em 6 mL de água purificada, com o valor de pH ajustado para 7,3 submeteu--se a cromatografia em coluna, utilizando para tal uma coluna carregada com 340 mL de uma resina de crivos moleculares (TOYOPEARL HW-40S, Tosoh) e com água purificada, e efectuou-se um fraccionamento em fracções de 2 mL. Procedeu-se à colheita das fracções n° 56 até à n° 67 e liofilizou-se para proporcionar 4,0 mg da substancia MK7634 com o aspecto de um pó incolor. 17

As características físico-químicas da substância MK7634 correspondem às descritas supra. O peso molecular e a fórmula molecular foram obtidos determinando o espectro de massa de alta resolução de um composto monodansilado da substância, o qual foi obtido efectuando a dansilação da substância. Seguidamente são apresentados os valores dos desvios químicos e das constantes de associação em conformidade com o espectro de RMN-'H (figura 3) e os valores dos desvios químicos em conformidade com o espectro de RMN-13C (figura 4) para a substância MK7634 num solvente misto constituído por óxido de deutério e metanol deuterado (proporção em peso na mistura = 4:1): RMN^H ô(ppm): 8,63 d(lH, J - 8Hz), 8,45 d(lH, J = 8Hz), 8,33 d(lH, J = 8Hz), 7,75 m(2H), 7,46 d(lH, J = 8Hz), 4,26 m(3H), 3,80 t(lH, J = 3Hz), 2,90 s(6H), 2,28 m(2H), 1,97 m(lH), 1,56 m(lH). RMN-l3C ô(ppm): 175,7, 175,1, 151,7, 133,0, 132,7, 131,6, 130,3, 130,2, 129,9, 125,1, 120,1, 117,3, 70,5, 64,5, 59,6, 54,5, 45,9, 33,0, 21,5.

Exemplo 2

Neste exemplo foram utilizados galináceos infectados com nemátodos dos galináceos, tendo tal infecção com nemátodos sido confirmada por exame de esfregaços fecais, constituindo cada animal um grupo para cada um dos quatro graus de concentração. Examinou-se um total de cinco galináceos, incluindo um grupo sem medicação.

Administrou-se a substância MK7634 por via oral de uma só vez através de um tubo para alimentação forçada, estando a dose da substância contida numa cápsula de gelatina e tendo sido rigorosamente calculada com base no peso de cada galináceo. A seguir à 18 c administração, efectuou-se uma contagem do número de nemátodos defecados diariamente por cada animal e decorridos sete dias dissecou-se cada dos animais para se efectuar uma contagem do número residual de vermes existentes nos intestinos e para se calcular a razão de defecação de vermes.

Razão de defecação de vermes = [número de vermes defecados em 7 dias/(número de vermes defecados em 7 dias + o número residual de vermes no intestino)] x 100

Determinou-se o peso do corpo de cada galináceo imediatamente antes da administração e também 7 dias após a administração e calculou-se a taxa de aumento de peso do corpo.

Taxa de aumento de peso do corpo =[(peso do corpo 7 dias após a administração - peso do corpo no início da administração)/peso do corpo no início da administração] x 100

Os resultados do estudo anterior estão indicados no quadro 2. Comprovou-se que para a substância MK7634 a razão de defecação de vermes era de 97,4% para o valor de 6,06 mg/kg. A taxa de aumento do peso do corpo foi quase igual à verificada com o grupo de contraprova que não recebeu nenhuma medicação, mesmo nos casos em que a substância referida foi administrada segundo uma dose de 31,9 mg/kg, o que permite confirmar que a substância MK7634 é um fármaco relativamente seguro. 19

Quadro 2

Experiência de defecação de nemátodos dos galináceos mediante a administração da substância MK7634

Galináceo n° Dose administrada (m/kg) Razão de defecação de vermes (%) Taxa de aumento de peso do corpo (%) 1 Sem medicação 0 18,0 2 2,89 61,3 49,3 3 6,06 97,4 16,4 4 15,3 100 23,4 5 31,9 100 25,0

Aplicabilidade industrial

Prevê-se que a substância MK7634 da presente invenção venha a ser utilizada como agente antelmíntico contra parasitas dos seres humanos e/ou dos animais domésticos e das aves de criação e não só.

Lisboa, 1 de Junho de 2000 7 to O Ansn :s OS·;

Λ .Ο.*'1.!.. Rua (íc SaÊiírc, 195, r/c-Ork 1250 LISBOA

Claims

ί 1 Reivindicações 1. Substância MK7634 que é alcalina e solúvel em água e que possui as seguintes propriedades físico-químicas: (1) Cor e forma: pó incolor (2) Fórmula molecular: C8H15N3O4 (3) Rotação específica: [cx]25d - +32,8° (c = 0,5, H20) (4) Espectro de massa (EM-IS): m/z 240 (MNa)+, 218 (MH)+ (5) Espectro de absorção de ultravioletas: (H2O) nm = 193 (limite de absorção) (6) Espectro de absorção de infravermelhos: vmáx (KB^cm'1 = 3400, 1670, 1630, 1405, 1350, 1090, 970 (7) Ponto de fusão: foi adquirindo cor gradualmente e decompôs-se a partir dos 175°C. (8) Solubilidade: solúvel em água e insolúvel em éter, clorofórmio e acetato de etilo. (9) Alcalinidade, acidez e neutralidade: básico (10) Reacção de cor: reacções positivas em ninidrina, GL e ácido molíbdico (11) Cromatografia de camada fina: 0 valor do Fr é 0,3 (o solvente de revelação é uma mistura solvente constituída por N-butanol, etanol, clorofórmio e amónia a 17% (proporção em peso dos componentes da mistura = 4:5:2:5)
2. Processo para a produção da substância MK7634, o qual consiste em criar em cultura um microrganismo pertencente à classe dos fungos imperfeitos e que seja capaz de produzir a substância MK7634 da reivindicação 1, sendo então a substância MK7634 colhida a partir do meio de cultura. 4 2
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o fungo imperfeito é um microrganismo pertencente ao género Curvularía.
4. Fánnaco que incorpora a substância MK7634 da reivindicação 1 como ingrediente activo.
5. Fánnaco de acordo com a reivindicação 4, o qual é um agente antelmíntico. Lisboa, 1 de Junho de 2000