KR100609869B1 - 스트렙토마이세스 91614에서 분리한 신규한 안사마이신 계화합물 및 그의 제조방법 - Google Patents

스트렙토마이세스 91614에서 분리한 신규한 안사마이신 계화합물 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 안사마이신(ansamycin) 계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 그의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614(Streptomyces sp. 91614), 상기 균주를 이용하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 안사마이신 계 화합물 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그들의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614, 상기 균주의 배양액 또는 균체를 유기용매 및 에틸아세테이트 추출과 크로마토그래피를 수행하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것이다. 본 발명의 일산화질소 생성 저해제는 염증 관련질환, 퇴행성 신경질환 및 자가면역 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112001035643231-pat00001
<화학식 2>
Figure 112001035643231-pat00002

Description

스트렙토마이세스 91614에서 분리한 신규한 안사마이신 계 화합물 및 그의 제조방법{Novel ansamycin compound produced by Streptomyces sp. 91614 and a method for preparation thereof}
도 1은 본 발명의 이소트리에노마이신 A의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 트리에노마이신 A의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성을 나타낸 그래프이고,
●: 이소트리에노마이신 A, □: 트리에노마이신 A,
도 4는 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 세포 생존력에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
●: 이소트리에노마이신 A, □: 트리에노마이신 A
본 발명은 신규한 안사마이신(ansamycin) 계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 그의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614(Streptomyces sp. 91614), 상기 균주를 이용하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 안사마이신 계 화합물 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그들의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614, 상기 균주의 배양액 또는 균체를 유기용매 및 에틸아세테이트 추출과 크로마토그래피를 수행하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것이다.
<화학식 1>
Figure 112001035643231-pat00003
<화학식 2>
Figure 112001035643231-pat00004
일산화질소는 최근에 각종 세포에 의해 생산되어 이들 세포에 작용하며, 염증 및 자가면역-중재된 조직 파괴에 관여하는 다기능 중재자인 것으로 인식되고 있다. 일산화질소 생산은 일산화질소 생성효소(nitric oxide synthase; 이하 "NOS"라 약칭한다)라 불리는 편재하는 효소 군에 의해 촉매된다. NOS는 L-아르기닌(일반적인 아미노산)의 L-시트룰린 및 일산화질소로의 혼합 작용적 산화를 촉매하는, 포유 동물에서 천연적으로 발현되는 효소이다. 이 효소는 L-아르기닌의 구아니디노 질소를 제거하여 일산화질소를 형성시킨다. 몇몇의 동형 NOS 효소가 확인되었으며, 이들은 일반적으로 2개의 유형으로 분리된다: 구성적 NOS(이후 cNOS라고 칭함) 및 유도성 NOS(이후 iNOS라고 칭함). 일부 NOS 효소의 유형 및 작용에 관한 추가의 세부 사항이 예를 들어, 미국 특허 제5,478,946호 및 제5,468,630호에 밝혀 져 있으며, 이들 전체의 기술은 본원에서 참조로 인용된다. 사람 유도성 NOS를 발현시킬 수 있는 cDNA 클론은 미국 특허 제5,468,630호에 기술되어 있다.
NOS 효소의 일산화질소 생성물은 형성시 관련되는 동형 NOS 효소에 따라 신호 분자 또는 유효기 분자로서 작용하는 것으로 여겨진다. 구성적 형태의 NOS는 소량의 일산화질소를 생산하며, 이는 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시켜 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 형성시킨다. 결국, cGMP는 내피-의존성 근육 이완 및 신경 전달을 포함하는 몇가지 특이적 작용을 중재한다. 대조적으로, 일산화질소는 유도성 일산화질소 생성효소(이하 "iNOS"라 약칭한다)로 지명된 유도성의 동형 효소에 의해 다량 생산된다. iNOS에 의해 생산된 NO는 대식구의 세포독성 활성을 중재하는 것으로 여겨진다. iNOS를 생산하는 다른 세포는 내피세포, 신경망, 쿠퍼 세포(Kupffer cell) 및 간 세포, 및 사이토킨에 의해 자극된 뮤린 섬유아세포를 포함한다. 일산화질소는 또한뇌에서의 화학적 전령자(messenger)이며, 별개의 동형 NOS에 의해 생산되는 것으로 여겨진다.
몇몇의 생리학적 활성은 일산화 질소에 기인하고 있다. 히스타민 및 브래디키닌과 같은 혈관 활성제는 일산화질소 생산을 자극한다. 일산화질소는 혈류 및 혈관 투과성을 증가시키는 강력한 혈관확장제이다. 인터루킨-1(IL-1)은 췌장 섬(pancreatic islet)에서 iNOS의발현을 유도한다. 일산화질소는 췌장 섬 작용에 있어 IL-1의 억제 효과의 중재자인 것으로 여겨진다. iNOS의 다른 유도자는 세균 내독소이며, 이는 일산화질소가 내독소 쇼크 또는 패혈성 쇼크의 중재자로서 관여 함을 나타낸다. 효소의 다른 유도자는 감마 인터페론, 종양 괴사 인자 및 기타 염증성 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 종양 괴사 인자는 패혈성 쇼크와 관련된 전신계적 저혈압에 관련되는 것으로 여겨진다.
NOS는 또한 다양한 염증 조직에서 과발현(증가된 양으로 및 종종 비정상적인 양으로 발현)되며, 일산화질소 합성 및 작용의 중재가 염증 및 자가면역 상태의 치료에 있어 새로운 시도를 제공할 수 있다는 가설을 가져왔다(Vane et al. 1994, Schmidt et al. 1994). 반(Vane) 및 공동 연구자는 일산화질소가 동물 모델에서 염증의 중요한 중재자임을 암시하였다(Vane et al. 1994). 시험하는 경우, 일산화질소 형성은 자가면역 질환(즉, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염및 크론 질환)에서 증가되는 것으로 밝혀졌으며, 몇몇의 전통적인 염증 증상(홍반 및 혈관 누출)은 NOS 억제제에 의해 회복된다(Schmidt et al. 1994, Nathan et al. 1994, Marletta 1994). 조직 손상의 중재자로서 일산화질소에 대한 가장 필적된 현상은 이러한 질환의 동물 모델을 수행한 연구(McCartney-Francis et al. 1993, Stefanovic-Racic et al.1994) 및 사람 골관절염의 연구(OA)(Amin et al. 1995a)와 류마티스 관절염(RA)의 연구(Sakurai et al.1995)를 포함하는 관절염 연구에서 밝혀졌다.
상기와 같이 일산화 질소는 일산화질소 생성효소에 의해 생성되어 중추신경계, 혈관계, 면역계에서 신경전달, 기억 및 학습, 혈관 이완, 외부 물질로부터의 방어기능 등 중요한 생리적 기능을 가진다. 그러나 유도성 일산화질소에 의해 일산화질소가 과도하게 생성되면, 과도한 일산화질소는 세포독성을 나타내어 여러 가 지 염증관련질환을 일으킨다. 마크로파지, 모노사이트, 마이클로글리아 등에서 유도성 일산화질소 생성효소에 의해 생성되는 일산화 질소는 패혈증, 류마티즘 관절염, 염증성 대장염을 비롯하여 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등 퇴행성신경질환의 발병에 관련되어 있다. 활성화형 마이크로글리아는 후 허혈성 뇌졸중(post-ischemic stroke), 치매, 파킨슨, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 에이즈성 치매질환에서의 중요한 병리적 현상이며, 활성화형 마이크로글리아 세포는 일산화질소, COX-2, TNF-α, IL-1-β등 염증매개인자를 생산하여 퇴행성 염증질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
이에, 많은 연구자들에 의해 일산화질소 생성효소의 억제제가 개발되었다. 이들 억제제의 대부분은 L-아르기닌의 유도체 및 NOS 효소의 천연기질이다. 예를 들어, NG-메틸-L-아르기닌 및 L-Nω-니트로아르기닌은 일산화질소 합성의 경쟁적 억제제이다. 미국 특허 제5,358,969호는 급성 또는 만성 염증 질환에 있어서의 일산화질소 형성의 억제를 기술하고 있다. 이 방법은 포유 동물에게 일산화질소-억제량의 메틸-, 1,1-디메틸- 또는 아미노-치환된 구아니딘 화합물을 투여함을 포함한다(미국 특허 제5,246,970호 및 제5,246,971호).
미국 특허 제5,216,025호는 특정의 저혈압 환자에 있어서 승압제를 효능화시키기 위한 일산화질소 억제제로서의 용도를 기술하고있다. 이들 억제제는 NG-치환된 아르기닌을 포함하며, 여기서, 아르기닌의 구아니디노 아미노 그룹상의 수소는 다른 원자 또는 분자종에 의해 대체된다.
미국 특허 제5,478,946호는 일산화질소 신타제를 조절함으로써 cGMP의 수준을 간접적으로 조절하는 것으로 언급되는 불포화된 구아니디노 화합물을 기술하고 있다. 이들 화합물은 불포화된 구아니디노 골격내 다양한 부위에서 C6-C12 아릴 그룹을 포함하는 각종 치환체를 포함할 수 있다.
상기와 같이 최근에 일산화질소 억제제에 대한 많은 연구가 진행되어 오고 있으며 일산화질소를 특이적으로 억제할 수 있는 화합물을 찾아내어 이를 이용하여 일산화질소에 의해 발병되는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하는 것이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 미생물, 식물 등 천연물로부터 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성 물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 일산화질소 생성을 강하게 억제하는 물질을 생산하는 방선균을 발견하고 상기균주의 미생물학적 특성을 규명함과 동시에 그 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 물질을 순수하게 분리 정제한 후 화학구조를 결정하고 상기 화합물이 일산화질소 생성 저해 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트 렙토마이세스 91614를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614(Streptomyces sp. 91614)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
상기 신규한 안사마이신 계 유도체는 하기 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는 하기 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A이다.
Figure 112001035643231-pat00005
Figure 112001035643231-pat00006
상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 본 발명의 신규한 화합물에 대하여 수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는다.
이상과 같이 정제된 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A 의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다.
1. 이소트리에노마이신 A(화학식 1)
1) 물질의 성상 : 흰색 분말, 2) 분자량 : 622,
3) 분자식 : C36H50N2O7,
4) 자외선흡수스펙트럼 [UVλmax nm(logε)] : 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13),
5) 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,
6) 핵자기 공명(NMR) 흡수스펙트럼 : 클로로포름 (CDCl3)을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 도 1에 나타내었다.
2. 트리에노마이신 A(화학식 2)
1) 물질의 성상 : 흰색 분말, 2) 분자량 : 622
3) 분자식 : C36H50N2O7,
4) 자외선흡수스펙트럼 [UVλmax nm(logε)] : 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13),
5) 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,
6) 핵자기 공명 흡수스펙트럼 : 클로로포름(CDCl3)을 용매로 하고, 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 도 2에 나타내었다.
본 발명은 상기의 이화학적 특성을 갖는 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 물론 이들의 무기 또는 유기염, 에스테르, 수화물 및 용매화물과 이성질체를 포함한 모든 유도체까지도 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614를 제공한다.
본 발명에서는 토양으로부터 분리한 균주들에 대하여 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성 물질을 스크리닝하는 과정에서 일산화질소 생성 저해활성을 신규한 안사마이신 계 물질을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 균주를 분리하였다.
상기 안사마이신 계 물질을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 균주는 아이 ·에스·피(ISP, International Streptomyces Project) 규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄상은 곡선형태(retinacultiaperti) 또는 나선(spiral) 형태의 전형적인 스트렙토마이세스 형태를 나타내었다. 상기 균주의 포자는 보통 50개 정도의 연쇄상으로 되어 있었고, 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색이었으며 배지 뒷면의 색상은 엷은 노란색을 나타내었고 수용성 색소는 모든 배지에서 무색을 나타내었다. 상기 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(B. Becker et al., Applied Microbiology, 1964, 12,421-423)에 의해 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L(levorotatory).L(levorotatory)형 이었다.
상기와 같이 형태학적, 배양학적 특성을 분석한 결과, 상기 균주를 스트렙토마이세스 속 균주로 동정하였고 이를 스트렙토마이세스 91614(Streptomyces sp. 91614)로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 2001년 12월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10133BP).
또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은
1) 스트렙토마이세스 91614 또는 그의 돌연변이주를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1의 균체 또는 배양액을 유기용매로 추출한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;
3) 상기 단계 2의 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
4) 상기 단계 3의 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및
5) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 목적 화합물을 얻는 단계로 구성된다.
상기 단계 1을 구체적으로 설명하면, 곰팡이의 제반성질은 일정한 것이 아니라 자연적으로 혹은 인공적으로 용이하게 변화되는 것이 일반적인 성질이며, 본 발명의 스트렙토마이세스 91614 균주도 그 성상이 변화하기 쉽다. 따라서, 상기의 균주는 스트렙토마이세스 91614는 물론, 상기 균주에서 유래하는 돌연변이주(자연돌연변이 또는 인공돌연변이주), 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어진 균주도 포함한다.
상기 스트렙토마이세스 91614 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 방선균의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산암모니움, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서는, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨 가하면 매우 효과적이다. 또한, 균의 생육을 촉진하며 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A 물질의 생산을 촉진시키기 위하여, 유기물 및 무기물을 적당히 첨가하면 효과가 있다. 배양 방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 통기교반 배양하는 것이 좋다. 배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 대부분의 경우에는 26-30℃에서 배양한다. 또한, 배양기간은 진탕배양, 탱크배양의 경우 모두 통상 4 일 내지 7일간 배양할 때 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질의 생산이 최고에 달하였다.
상기 단계 2를 구체적으로 설명하면, 상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 배양하면 안사마이신 계 물질을 얻을 수 있는데, 본 물질은 배양액 뿐만 아니라 균체 부분에도 존재하므로 다음의 방법에 따라 효율적으로 추출, 정제를 실시할 수 있다. 즉, 배양액 및 균사체에 아세톤등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로 추출한다.
상기 단계 3을 구체적으로 설명하면, 상기 단계 2의 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 클로로포름:메탄올를 50:1-10:1인 용매를 사용한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 상기 과정에서 얻은 활성분획을 농축한다.
상기 단계 4를 구체적으로 설명하면, 상기 단계 3의 농축액을 메탄올을 용매로 한 세파덱스 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모은다.
상기 단계 5를 구체적으로 설명하면, 상기 단계 4의 활성분획을 물-아세토나 이트릴 용출 용매를 이용하는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 활성분획을 분리하여 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는다.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공한다.
상기에서 안사마이신 계 유도체는 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A이다.
본 발명의 화학식 1 및 화학식 2으로 표시되는 화합의 일산화 질소 생성에 대한 저해활성은 면역자극제(immustimulant)로서 LPS(lipopolysaccharide)를 마이크로글리아 세포주에 처리하여 생성된 일산화 질소를 측정하여 조사해 보면, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 LPS에 의해 활성화된 세포가 생성하는 아질산염(nitrite)의 생성을 농도 의존적으로 저해하고, 50%의 저해활성을 나타낸는 유효농도(IC50)는 0.29 및 0.025 uM이었다. 한편, 이소트리에노 마이신 A 및 트리에노마이신 A는 세포 생존력에 대한 영향을 조사한 결과 50% 생존력 저해활성을 나타내는 유효농도(IC50)는 각각 6.2 및 1.2 uM로 나타났다. 따라서 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성은 세포 독성에 의한 것이 아닌 것을 나타낸다.
본 발명의 일산화질소 생성 저해제는 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 또는 그들의 염을 유효성분으로 함유한다. 상기 유도체는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 상기 유도체는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 혼합 생약재 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 유도체의 유효용량은 0.005 내지 0.05 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.01 내지 0.03 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 이소트리에노마이신 A 또는 트리에노마이신 A 유도체를 랫트에 경구 투여, 복강 내 투여시 및 피하 주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 5 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 스트렙토마이세스 91614 균주의 분리
본 발명자들은 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 전국 토양으로부터 곰팡이를 분리한 후 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 균주를 분리하였다.
본 발명자들은 상기에서 분리한 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 균주를 아이·에스·피(ISP, International Streptomyces Project)규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 형태적 특성을 조사하였다.
그 결과, 포자의 연쇄상은 곡선형태(retinacultiaperti) 또는 나선형 형태의 전형적인 스트렙토마이세스 형태를 나타내었다. 기균사의 생육은 양호하였으며, 착생 포자의 형성정도도 매우 풍부하였다. 상기 균주의 포자는 보통 50개 정도의 연쇄상으로 되어있었고, 생육정도는 양호하였으며, 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색이었으며 배지 뒷면의 색상은 엷은 노란색을 나타내었고 수용성색소는 모든 배지에서 무색을 나타내었다. 상기 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(B. Becker et al., Applied Microbiology, 1964, 12:421-423)에 의해 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L.L 형 이었다.
상기와 같이 형태학적, 배양학적 특성을 분석한 결과, 본 발명자들은 상기 균주를 스트렙토마이세스 속으로 동정하였고, 이를 스트렙토마이세스 91614(Streptomyces sp. 91614)로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 2001년 12월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10133BP).
<실시예 2> 스트렙토마이세스 91614 균주로부터 일산화질소 생성 저해물질의 분리 및 정제
<2-1> 스트렙토마이세스 91614 균주의 배양
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 스트렙토마이세스 91614 균주를 이 용하여 일산화질소 생성 저해물질을 분리하기 위하여, 우선 상기 균주를 배양하였다. 상기 균주를 배양하기 위하여, 종 배지 및 생산배지로는 가용성 전분 1%, 글루코스 2%., 대두박 2.5% 육즙 0.1% 효모추출액 0.4% 소금 0.2% 인산 제 2 칼리 극소량을 함유한 배지를 멸균전에 pH를 7.3 으로 조절한 후 사용하여 배양하였다.
상기의 종배지 20 ㎖가 담긴 100 ㎖ 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 스트렙토마이세스 91614 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금이를 접종하여 28℃에서 3 일간 진탕배양하여 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 멸균된 종배지 100 ㎖가 들어 있는 500 ㎖ 용량의 삼각플라스크에 상기 1 차 종배양액 5 ㎖를 접종하여 28℃에서 3일간 배양하여서 이것을 2차 종배양액으로 하였다. 이어서, 18 ℓ의 생산배지가 들어있는 30 ℓ용량의 발효조를 미리 멸균시킨 후 제 2차 종배양액 800 ㎖를 접종하여 28℃ 에서 7일간 배양하였다. 이때 배양조건으로는 통기 18 ℓ/분, 각반은 초기 200 rpm, 후기 300 rpm 으로 하였다.
<2-2> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 분리 및 정제
본 발명자들은 상기의 실시예 <2-1>에서 배양한 배양액 5 ℓ에 5 ℓ 아세톤를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 1 ℓ의 에틸아세테이트로 3번 용매 추출하였다. 상기에서 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매를 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 클로로포름:메탄올를 15:1인 용매를 사용한 전개용매로 하여 실리카젤 컬럼크로마토그래피 를 실시하였다. 상기에서 얻어진 활성분획으로부터 감압농축하여 오일성 조유효성분을 얻은 뒤 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에서 정제하였고, 재차 아세토나이트닐:물 = 60:40인 용매조건에서 고압액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 순수한 활성분획 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A를 얻었다.
<실시예 3> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 이화학적 성질 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 얻어진 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 이화학적 특성을 분석하기 위하여, 수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. 수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼은 클로로포름을 용매로하여 600MHz 및 125 MHz에서 각각 측정하였다.
그 결과, 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A의 물질성상은 흰색 분말이고, 분자량은 622이며, 분자식은 C36H50N2O7로 확인되었다. 상기 이소트리에노마이신 A의 자외선흡수스펙트럼 [UVλmax nm(logε)]은 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13)이었고, 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096이었다. 또한, 클로로포름 (CDCl3)을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵 자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 도 1에 나타내었다.
또한, 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A의 물질성상은 흰색분말이고, 분자량은 622이고, 분자식은 C36H50N2O7로 확인되었다. 상기 트리에노마이신 A의 자외선흡수스펙트럼 [UVλmax nm(logε)]은 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13)이고, 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096이었다. 또한, 클로로포름을 용매로 하고, 테트라메칠실란을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 도 2에 나타내었다.
<실험예 1> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해 분석
본 발명자들은 상기에서 분리한 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성을 알아보기 위하여, 면역자극제(immunostimulant)로서 LPS를 마이크로글리아 세포주인 BV-2세포에 처리하여 생성된 일산화질소를 측정하였다. 일산화질소의 생성은 배지에 축적된 일산화질소의 안정된 형태인 아질산염(nitrite)을 그리스(Griess) 방법을 사용하여 측정하였다(Anal Chem 126:131-138, 1982).
그 결과, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 LPS에 의해 활성화된 BV-2세포가 생성하는 아질산염의 생성을 농도 의존적으로 저해하였으며, 50%의 저해활성을 나타내는 농도는(IC50) 각각 0.29 uM, 0.025 uM 이었다. 한편, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질은 세포 생존력에 대한 영향을 조사한 결과, 50%의 생존력 저해활성을 나타내는 농도는(IC50) 각각 6.2 uM, 1.2 uM로 나타났다. 따라서 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질의 일산화 질소 생성 저해활성은 세포 독성에 의한 것이 아닌 것으로 나타났다(도 3 및 도 4).
<실험예 2> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 이소트리에노마이신 A 또는 트리에노마이신 A를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 모두 랫트에서 2 mg/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 5 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제는 세포독성 없이 일산화질소 생성을 저해함으로써 염증 관련질환, 퇴행성 신경질환 및 자가면역 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A(isotrienomycin A) 및 하기 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A(trienomycin A)를 생산하는 스트렙토마이세스 91614 (Streptomyces sp. 91614)(수탁번호 : KCTC 10133 BP).
    <화학식 1>
    Figure 712005000383245-pat00014
    <화학식 2>
    Figure 712005000383245-pat00015
  5. 1) 제 4항의 스트렙토마이세스 91614 균주 또는 그의 돌연변이주를 배양하는 단계;
    2) 상기 단계 1의 균체 또는 배양액을 유기용매로 추출한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;
    3) 상기 단계 2의 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
    4) 상기 단계 3의 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및
    5) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 목적 화합물을 얻는 단계로 구성되는 이소트리에노마이신 A 또는 트리에노마이신 A의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 단계 1의 돌연변이주는 자연돌연변이주, 인공돌연변이주, 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어진 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 단계 2의 유기용매는 아세톤이고, 상기 단계 3의 혼합용매는 클로로포름:메탄올을 50:1 내지 10:1로 혼합한 용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 단계 3의 크로마토그래피는 실리카 젤 컬럼 흡착 크로마토그래피이고, 단계 4의 크로마토그래피는 세파덱스 LH-20 젤 컬럼 크로마토그래피이며, 단계 5의 크로마토그래피는 고압액체 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A(isotrienomycin A) 또는 하기 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A(trienomycin A)를 유효성분으로 함유하는 염증 질환, 퇴행성 신경질환 및 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 712005000383245-pat00016
    <화학식 2>
    Figure 712005000383245-pat00017
  10. 제 9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염 또는 크론 질환인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물.
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