KR100316011B1 - 5-디메틸오발리신을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물 및 이를 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신생혈관 형성(angiogenesis)을 저해하는 하기 화학식 1의 5-디메틸오발리신(5-demethylovalicin), 이를 생산하는 균주 크라이소스포리움 루크노엔스(Chrysosporium lucknowense) F80642, 이 균주를 배양하여 5-디메틸오발리신 및 오발리신을 생산하고 배양액으로부터 이들을 정제하는 방법, 및 5-디메틸오발리신을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 5-디메틸오발리신은 신생혈관 형성에 관여하는 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2(MetAP2)에 대해 우수한 선택적 저해활성을 나타내므로 이를 포함하는 약학 조성물은 암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증 또는 혈관종의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

5-디메틸오발리신을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물 및 이를 생산하는 방법{ANTI-ANGIOGENIC COMPOSITION CONTAINING 5-DEMETHYLOVALICIN AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}
본 발명은 신생혈관 형성을 저해하는 신규 화합물 5-디메틸오발리신(5-demethylovalicin), 5-디메틸오발리신 및 오발리신을 생산하는 균주 크라이소스포리움 루크노엔스(Chrysosporium lucknowense), 이 균주를 배양하여 5-디메틸오발리신 또는 오발리신을 생산하고 배양액으로부터 이들을 정제하는 방법, 및 5-디메틸오발리신을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물에 관한 것이다.
암이 치명적으로 인식되는 이유는, 고형암의 경우 의학적 진단이 가능한 크기의 원발암 덩어리보다는 숨어있는 미세한 크기의 전이암의 위협 때문이라 할 수 있다. 혈관을 따라 전이된 암은 원발암이 외과적으로 제거되었다 하더라도 조건만 갖춰지면 언제든지 새로운 기관이나 조직내에 증식하여 새로운 암을 유발할 수 있다. 따라서, 실제로 암의 치료확률이 50%만 넘어도 양호한 것으로 간주되고 있으며, 외과적 수술이나 기타 항암요법이 적용가능한 암은 그 종류나 치료시기, 또는 환자의 상태에 따라 극히 제한적일 수 밖에 없다.
한편, 암조직이 커지기 위해서는 산소 및 영양분의 공급이 요구되며, 이러한 공급통로를 만들기 위해 신생혈관 형성(angiogenesis)이 수반된다. 또한, 이 신생혈관을 통해 암세포가 다른 조직으로 전이되므로, 암의 성장과 전이에 필수적인 신생혈관 형성 과정을 조절하는 것이 새로운 암 치료요법으로 인식되고 있다.
1998년경 엔터메드사(Entremed사, 미국)가 개발권을 가지고 있는 하버드 의대 포크만(Folkman) 박사의 연구결과로서 '신생혈관 형성 저해제인 엔도스태틴(endostatin)과 안지오스태틴(angiostatin)의 동물 실험결과'가 대대적으로 보도된 바 있다. 쥐를 이용한 동물 실험결과, 엔도스태틴과 안지오스태틴이 종양성장 억제능을 보여 새로운 항암제 개발의 가능성에 큰 기대를 갖게 하였다. 이들 약제는 1999년말 인체에 대한 시험이 있을 예정으로, 신생혈관 형성 저해제가 갖는 신규 항암요법으로서의 잠재력은 입증되었으나, 대량 생산방법에 있어서의 난점이 점점 드러나고 있는 실정이다.
따라서 생산방법이 어렵고 분해되기 쉬운 엔도스태틴과 안지오스태틴의 한 대안으로서 미생물이 생산하는 저분자 2차 대사산물로부터 신생혈관 형성 저해제가 제시되었는데, 그 대표적인 예가 푸마질린이다. 이를 모핵으로 하는 구조유사체 TNP-470(AGM-1470) 또한 강력한 신생혈관 형성 저해 효과를 보여 임상 3단계로 진입 중이다. TNP-470는 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2(MetAP2)를 작용점으로 가지며(문헌[Griffith, E. C. et al.,Chem. Biology, vol. 4, pp. 461-471(1997); 및 Sin, N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 94, pp. 6099-6103(1997)] 참조), 이를 계기로 신생혈관 형성 저해의 한 작용기작이 규명되어 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2를 작용점으로 갖는 신규의 신생혈관 형성 저해제에 대한 연구가 활발해졌으며, 특히, 1998년 11월에는 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2의 결정구조가 밝혀지면서 분자 수준의 신약 설계가 가능하게 되어 신생혈관 형성 저해기능을 갖는 암치료제의 실현 가능성을 더욱 높이게 되었다(문헌[Liu, S. et al.,Science, 282: 1324-1327(1998)] 참조).
이외에도 그 동안 발견되거나 합성된 신생혈관 형성 저해제로서 카복시아미코트리아졸(carboxyamicotriazole), CM101, 마리마스타트(marimastat), 펜토산 폴리설페이트(pentosan polysulfate), 싸이도마이드(thaidomide) 등을 들 수 있다.
이와 같이, 신생혈관 형성을 억제하는 물질의 발견은 암의 성장기작을 밝히는 단서가 되고, 암의 조기진단 및 예방, 또는 치료에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 신생혈관 형성과 관련된 질병인 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 수 있어, 현재 학계 및 산업계는 이러한 기능을 갖는 신규 물질에 대한 연구개발을 계속적으로 진행시키고 있다.
이에, 본 발명자들은 크라이소스포리움(Chrysosporium) 속의 균주가, 상기한 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2와 결합하여 이의 효소 기능을 효율적으로 저해함으로써 신생혈관 형성을 보다 효과적으로 저해하는 5-디메틸오발리신 및 오발리신을 생산함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 신생혈관 형성을 저해하는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신생혈관 형성을 저해하는 화합물을 생산하는 미생물 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 신생혈관 형성을 저해하는 화합물을 생산하고 이를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물을 제공하는 것이다.
도 1a 내지 1d는 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642(KCTC 0640BP)의 현미경 사진으로, 도 1a는 12.5배, 도 2b는 62.5배, 도 1c는 500배 및 도 1d는 1,000배의 배율로 관찰한 것이고,
도 2는 5-디메틸오발리신의 수소핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 3은 오발리신의 수소핵자기공명 스텍트럼을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 신생혈관 형성 저해활성을 나타내는 하기 화학식 1의 신규 화합물 5-디메틸오발리신을 제공한다:
화학식 1
본 발명에서는 또한 5-디메틸오발리신 및 오발리신(C16H24O5)을 생산하는 균주 크라이소스포리움 루크노엔스(Chrysosporium lucknowense) F80642가 제공된다. PYE(PhytoneTMyeast extract agar; BBL사) 평판배지 상에서 배양된 본 발명의 균주 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 현미경 관찰에 의한 분류학적 특징을 하기 표 1에 나타내었으며, 이 균주는 1999년 6월 17일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 0640BP 호로서 기탁하였다.
형태적 구조 현미경 관찰 특징
PYE 배지 상에서 콜로니 5일 배양 후 직경 20-22 mm, 14일 배양 후 직경 55 mm이하이고, 백색 내지 밝은 올리브색이고, 부드럽고 보플보플하며 조밀하고 3-5 mm의 높이를 가짐. 가장자리는 윤곽이 뚜렷하고 균일하며 술이 달려있음
배면(reverse) 갈색 내지 올리브색
균사(hyphae) 투명하고, 매끈한 얇은 벽을 가지며, 거의 분리되지 않음
기생 균사(aerial hyphae) 존재하고, 대개 번식력이 있고, 빽빽하게 격벽을 가지며, 너비 1-3.5 ㎛임
측면 분생자(lateral conidia) 백색 또는 엷은 황색
분생자 색(conidial color) 풍부
번식 균사(fertile hyphae) 분생자좌(sporodochia)를 형성하지 않음
분생자(conidia) 무병(無炳) 또는 짧은 줄기(stalk)상에 있고, 편자 상태가 수반되지 않고, 동시에 생장하지 않고, 무병의 조금 구형인 분생자, 매끈한 벽을 가지고, 무병이거나 짧은 돌출부상에 있고, 대개 조금 구형임
대분생자(macroconidia) 부재
분생자 엽상체(conidia thallic) 병모양(ampulliform)의 융기부상에 생기지 않음
윤분생자(intercalary conidia) 부재
말단 및 측면 분생자(terminal and lateral conidia) 대개 무병이거나 또는 짧은 원뿔형 돌출부 또는 짧은 분지상에 있고, 단생이지만 서로 아주 근접해 있고, 하나의 균사 세포상에 1-4개의 분생자가 생장함
분생자(conidia subhyaline) 얇고 매끈한 벽을 가지고, 대개 조금구형이고, 또한 방망이 모양이거나 알모양이고, 단세포이고, 2.5-10 x 1.5-6 ㎛, 넓은 기저 엽흔(1-2㎛)을 가짐
원막포자(chlamydospores) 부재
크라이소스포리움 루크노엔스 F80642을 배양하여 5-디메틸오발리신 또는 오발리신을 생산하기 위해서는, 종균배지, 예를 들어, YM 배지(효모 추출물 0.3%, 맥아 추출물 0.3%, 덱스트로즈 1% 및 펩톤 0.5%)에 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 균총을 접종하고 25 내지 27℃에서 2 내지 5일 동안 종균배양한 후, 종균배양액을 생산배지, 예를 들어, 글루코스 0.5-3.0%, 효모 추출물 0.2-0.5%, 펩톤 0.5-1.5%, KH2PO40.1-0.5% 및 MgSO4·7H2O 0.05%로 구성된 배지에 접종하여 25 내지28℃에서 4 내지 6 일 동안 180 내지 240 rpm의 교반속도로 본 배양을 실시한다.
본 발명에서는 또한 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 배양액으로부터 5-디메틸오발리신 또는 오발리신 화합물을 분리정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 구체적으로 다음의 단계들을 포함한다. 우선, 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 배양액을 유기용매, 바람직하게는 아세톤으로 추출하고, 균체 추출여액을 감압농축하여 유기용매를 제거한 후 이를 다시 다른 유기용매, 바람직하게는 에틸아세테이트로 추출하고 감압농축하여 추출물을 얻는다. 이 추출물을 실리카겔에 로딩하여 100% n-헥산으로 충분히 용출시킨 후 에틸 아세테이트를 예를 들어 5%씩 단계적으로 증가시켜 활성분획을 용출시켜 감압농축한다. 이어서, 아세토니트릴:H2O 혼합액으로 조절된 역상 실리카겔 칼럼에 상기 농축된 활성분획을 로딩하고 아세토니트릴을 5%씩 단계적으로 증가시키면서 용출하는 과정을 두 번 반복하여 활성분획을 얻는다. 이 때, 아세토니트릴:H2O의 혼합비율은 20:80 내지 80:20(v/v)이며, 바람직하게는 50:50(v/v)이다. 얻어진 활성분획을 메탄올에 녹여 세파덱스 칼럼에 로딩하고 100% 메탄올로 용출한 후 CHCl3:MeOH의 혼합 전개용매 하에서 정제 박막 크로마토그래피(prep-TLC)를 수행한다. 이 때 CHCl3:MeOH의 혼합비율은 20:0.5 내지 19:1(v/v)이며, 바람직하게는 20:1(v/v)이다. 이어서 CH3CN:H2O 혼합액 조건에서 다시 정제 박막 크로마토그래피를 수행하여 5-디메틸오발리신 및 오발리신을 분리정제한다. 이 때 CH3CN:H2O의 혼합비율은 50:50 내지 60:40(v/v)이며, 바람직하게는 55:45(v/v)이다.
상기 화학식 1의 화합물 5-디메틸오발리신은 분자식 C15H22O5로 나타내어지고, 신생혈관 형성에 관여하는 메티오닌 아미노펩티다아제-2를 작용점으로 가져 이와 공유결합함으로써 이의 효소활성을 저해하여 신생혈관 형성 저해제로 작용한다.
본 발명에서는 메티오닌 아미노펩티다아제-2의 저해활성으로부터 신생혈관 형성 저해활성을 측정하며, 예를 들어 5-디메틸오발리신의 사람 메티오닌 아미노펩티다아제-2에 대한 저해활성의 IC50은 약 5.0 ng/㎖(17.7 nM)이고, HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)에 대해서는 IC50= 100nM의 활성을 보였다. 이에 비해 효모의 메티오닌 펩티다제-1에 대해서는 IC50= 10 mg/ml (35mM)의 저해활성을 나타내므로, 5-디메틸오발리신이 메치오닌 펩티다제-2에 선택적으로 작용함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 5-디메틸오발리신을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합하여 신생혈관 형성 저해 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 신생혈관 형성 저해 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명의 5-디메틸오발리신을 유효성분으로 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구투여하거나 경구투여할 수 있으며, 5-디메틸오발리신으로서 하루에 체중 1㎏당 1 내지 50mg, 바람직하게는 10 내지 15mg, 더욱 바람직하게는 12 내지 13mg의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 동정
대한민국 대전 유성구 일원의 대나무 숲으로부터 하야카와 등의 방법[Hayakawa, M. and H. Nonomura, Humic acid-vitamine agar, a new medium for the seletive isolation of soil actinomycetes,J. Ferment. Technol.,65, 501-509(1987)]으로 추출된, 상기 표 1에 나타낸 균학적 특성을 갖는 곰팡이 균주를 분류학적 기준에 의해 크라이소스포리움 루크노엔스(Chrysosporium lucknowense)로 동정하였으며, 이를 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642로 명명하고 균주번호 KCTC 0640BP로 유전자 은행(KCTC)에 기탁하였다. 도 1a 내지 1d는 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642(KCTC 0640BP)의 12.5배, 62.5배, 500배 및 1,000배 현미경 사진으로, 도 1a는 12.5배의 배율로 본 측면 분생자이고, 도 1b는 62.5배의 배율로 관찰된 균사의 성장으로 부드러운 벽을 관찰할 수 있다.
실시예 2: 크라이소스포리움 루크노엔스로부터 5-디메틸오발리신 및 오발리신의 분리 및 정제
(단계 1) 균주의 배양
PDA 배지(potato dextrose agar; 감자 혼화물 20%, 덱스트로즈 2% 및 아가 1.5%)에서 활성화된 균총을 YM 배지(효모 추출물 0.3%, 맥아 추출물 0.3%, 덱스트로즈 1% 및 펩톤 0.5%)에 접종하고 26℃, 130rpm의 진탕배양 조건에서 3일간 종균 배양하였다. 이어서 5ℓ 플라스크에 1.5ℓ의 생산배지(글루코스 0.5∼3.0%, 효모 추출물 0.2∼0.5%, 펩톤 0.5∼1.5%, KH2PO40.1∼0.5%, MgSO4·7H2O 0.05%)를 넣고 종균 배양액을 2 내지 3%(v/v)의 농도로 접종한 후 25 내지 28℃, 250rpm의 진탕배양 조건에서 5일간 본 배양한 다음, 8ℓ 배양액을 14ℓ의 발효기에 담아 0.5vvm, 180 내지 240rpm의 교반속도로 4 내지 6 일간 발효하였다.
(단계 2) 5-디메틸오발리신 및 오발리신의 분리 및 정제
상기 (단계 1)에서 얻은 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 발효액 16ℓ에 동량의 아세톤을 넣고 4 내지 6 시간 동안 추출하여 다음과 같은 방법으로 활성물질을 분리하였다. 추출여액을 모아서 감압농축하여 아세톤을 제거한 후 얻어진 수용액에 수용액과 동량의 에틸아세테이트를 가하고 2 내지 3 시간 동안 2차 추출하였으며 추출물을 감압농축하여 3.8g의 추출물을 얻었다. 이를 건식-충전(dry-packing)에 의해 실리카겔(Merck, Kieselgel60, 230∼400 메쉬)에 로딩(loading)하고 100% n-헥산으로 충분히 용출시킨 후 에틸 아세테이트를 5%씩 단계적으로 증가시켜 활성분획을 용출시켜 감압 농축하였다. 각 분획의 분리정도는 박막 크로마토그래피(TLC)를 수행하여 관찰하였고, 전개용매로는 순상(normal phase)에서는 n-헥산:에틸 아세테이트(60:40)을 사용하였고, 역상에서는 아세토니트릴:H2O(55:45)를 사용하였다. 각 물질의 검색은 아니스알데하이드 염색 용매(5% H2SO4, 2.5% 아세트산, 5% 아니스알데하이드, 87.5% 에탄올)로, TLC 플레이트를 전열기에서 가열하여 발색시켰다. 각 분획의 저해활성은 Griffith 등의 방법(Griffith, E. C. et al.,Chem. Biol., 4, 461-471(1997))으로 확인하였다.
이어, 역상 실리카 겔(Merck, LichroprepRRP-18, 40∼63 ㎛)을 아세토니트릴(CH3CN)로 칼럼(4×25 cm)에 충진시켜 CH3CN:H2O(20:80)으로 조건을 맞춘 다음, 농축된 활성분획을 로딩한 후 아세토니트릴을 5%씩 단계적으로 증가시켜 용출하여 200㎖씩 분획을 모아 감압 농축하여 활성분획을 얻었다. 이 과정을 두 번 반복하여 얻어진 시료를 메탄올에 녹여 세파덱스 LH-20(입수처: 시그마사)에 로딩하고 100% 메탄올로 용출시켰다. CHCl3:MeOH(20:1) 전개용매 하에서 정제 박막 크로마토그래피(Prep-TLC)를 수행한 후, CH3CN:H2O(55:45) 조건에서 다시 Prep-TLC를 수행하여 두 종류의 화합물을 정제하였다.
실시예 3: 5-디메틸오발리신의 구조분석
상기 실시예 2에서 분리정제된 두가지 활성 화합물의 구조를 결정하기 위하여, 다양한 기기분석을 실시하였다. 그 결과, 두 화합물을 신규 화합물인 5-디메틸오발리신과 공지 화합물인 오발리신(Sigg, H. P. & Weber, H. P.,Helv. Chim. Acta., 51, 1395-1408(1968))으로 밝혀졌다. 신규 화합물인 5-디메틸오발리신의 물리화학적 성질은 하기 표 2에 나타낸 것과 같다.
항 목 특 성
외양 노란색을 띤 겔
분자식 C15H22O5
FAB-MS 282(M+H)+
UV 272nm(메탄올 중에서 logε= 2.34)
TLC실리카 플레이트(순상)상의 RfODS 플레이트(역상)상의 Rf 0.59; n-헥산/EtOAc(60:40)0.47; CH3CN/H2O(55:45)
용해성 MeOH, EtOH, CHCl3, EtOAc
불용성 H2O, n-헥산
또한, 5-디메틸오발리신과 오발리신의 핵자기공명(NMR) 분석을 다음과 같이 실시하였다: 5-디메틸오발리신 및 오발리신을 각각 0.5 ㎖의 CDCl3에 녹여, 브루커(Bruker) AMX-400 기종으로 NMR 분석을 행하였으며,1H-NMR은 400 MHz로,13C-NMR은 100 MHz로, DEPT 스펙트럼은 100 MHz로 측정하였다. 그 결과를 도 2 및 3에 도시하였으며, 이로부터 5-디메틸오발리신 및 오발리신이 각각 화학식 1 및 2의 구조를 가진 것으로 판명되었다.
화학식 1
실시예 4: 5-디메틸오발리신의 신생혈관 형성 저해활성 검정(저해환)
분리정제된 5-디메틸오발리신의 신생혈관 형성 저해활성은 MetAP2(methionine aminopeptidase-2) 저해제 검색을 위한 재조합 효모의 성장 저해 효능을 통해서 확인하였다(문헌[Griffith, E. C. et al.,Chem. Biology, vol. 4, pp. 461-471(1997); 및 Sin, N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 94, pp. 6099-6103(1997)] 참조).
5-디메틸오발리신을 에탄올에 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.01㎎/㎖, 0.1㎎/㎖ 및 1㎎/㎖의 농도로 녹여서 이중 10㎕를 살균된 페이퍼 디스크(8mm)에 떨어뜨린 후, 공기 중에서 유기용매가 완전히 증발할 때까지 방치하였다. 한편, 냉동고에 보관된 효모 균주를 시험관에서 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 덱스트로즈) 2㎖를 넣고 30℃에서 180rpm으로 진탕배양한 다음, 진탕배양된 효모 균주를 A600에서 OD 값이 0.15가 되도록 액체 YPD 배지로 희석하였다. 지름이 150 mm인 페트리디쉬에 기저(basal) 배지(1.5% 아가) 25㎖를 넣고, 그 위에 A600에서 OD 값이 0.15가 되도록 희석해 둔 효모를 탑(top) 배지(1.2% 아가)와 섞은 용액 10㎖를 도말하여 생분석 플레이트를 제조하고 4℃에 보관하였다. 5-디메틸오발리신이 스며있는 건조 페이퍼 디스크를 생분석 플레이트에 얹어 30℃ 인큐베이터에서 4일 동안 효모를 키운 다음, 페이퍼 디스크 주위에 형성된 저해환(inhibition zone)의 크기를 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 본 실험에서 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) W303(MATa/MATαade2-1/ade2-1his3-11,15/his3-11,15leu2-3,112/leu2-3,112ura3-1/ura3-1trp1-1/trp1-1can1-100/can1-100)을 MetAP1과 MetAP2의 야생형으로 사용하였고, 재조합 null MetAP1(Δmap1)(map1::HIS3)과 null MetAP2(Δmap2)(map2::URA3) 균주를 사용하였다(상기 세 효모 균주는 세이트 루이스 대학(St. Louis Univ.)의 Dr. Yie-Hwa Chang으로부터 제공받음).
디메틸오발리신의 농도 MetAP2 저해환 직경
1㎎/㎖ 70.5±0.7
0.1㎎/㎖ 61.8±1.2
0.01㎎/㎖ 43.7±8.3
1㎍/㎖ 25.1±0.7
0.1㎍/㎖ 14.9±0.1
실시예 5: 5-디메틸오발리신의 신생혈관 형성 저해활성 검정(IC 50 )
5-디메틸오발리신을 사용하여 다음과 같이 인간 MetAP2, HUVEC 및 효모 MetAP1의 저해 활성을 측정하였다(문헌: Eric C. Griffith et al,Chemistry & Biology, 4, 461-471(1997); Songlan Zuo, Qi Guo and Yie-Hwa Chang,Analytical Biochemistry,222, 514-516(1994)). 그 결과는 하기 표 4와 같다.
실험 화합물 IC50측정치
인간 MetAP2 효모 MetAP1 HUVEC
5-디메틸오발리신 5.0ng/㎖ (17.7nM) 10mg/㎖ (35mM) 100nM
실시예 6: 5-디메틸오발리신의 급성독성시험
5-디메틸오발리신에 대해서 체중 25g 정도의 5주령 ddy 마우스(대한실험동물협회)를 대상으로 급성독성 시험을 수행하였다. 먼저 5-디메틸오발리신을 멸균증류수와 혼합하여 투여직전에 조제하였으며, 대조군으로는 멸균증류수를 사용하였다. 약 3시간 절식시킨 시험계에 대하여 경구 투여용 존데를 이용하여 5-디메틸오발리신 용액을 강제 투여하였다. 투여 당일은 투여 후 1시간에서 6시간까지 매시간, 투여 익일부터 14일까지는 매일 1회씩 일반 상태의 변화, 중독 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 관찰기간 종료후, CO2마취하에 방열치사시켜 내부 장기의 육안적 이상 유무를 상세히 관찰하였다. 그 결과 이 화합물을 1회 100mg까지 투여하고 14일 동안 지속적으로 관찰하여도 커다란 독성이 없음을 확인하였다.
제제예
다음의 제제예는 본 발명에 따른 5-디메틸오발리신이 유효성분으로 함유된 항암제의 제제화를 위한 일례이다. 본 발명에 따른 항암제가 다음의 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제제예 1: 경구투여용 정제의 제조
5-디메틸오발리신을 유효약물로 하여 다음과 같은 조성물을 만든 후 통상의 방법으로 경구투여용 정제를 제조하였다.
성 분 함 량
5-디메틸오발리신 100 mg
경질 무수규산 10 mg
미세결정 셀룰로오즈 190 mg
스테아르산마그네슘 5 mg
전분글리콘산나트륨 60 mg
무수인산일수소칼슘 135 mg
제제예 2: 주사제의 제조
5-디메틸오발리신을 유효약물로 하여 다음과 같은 조성물을 만든 후 통상의 방법으로 주사제를 제조하였다.
성 분 함 량
5-디메틸오발리신 100 mg
만니톨 80 mg
Na2HPO4·12H2O 26 mg
증류수 2974 ㎖
본 발명의 5-디메틸오발리신 화합물은 메티오닌 아미노펩티다아제 타입-2(MetAP2)에 대한 선택적 저해활성이 우수하고, 이로 인해 신생혈관 형성에 대한 저해활성이 우수하므로 이를 포함하는 약학 조성물은 암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증 및 혈관종 등의 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1의 5-디메틸오발리신(demethylovalicin):
    화학식 1
  2. 하기 화학식 1의 5-디메틸오발리신 또는 하기 화학식 2의 오발리신을 생산하는 크라이소스포리움 루크노엔스(Chrysosporium lucknowense) F80642 균주(KCTC 0640BP).
    화학식 1
    화학식 2
  3. 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642를 적절한 배지에서 배양한 후 배지로부터 5-디메틸오발리신 또는 오발리신을 분리하는 것을 포함하는 5-디메틸오발리신 또는 오발리신의 생산방법.
  4. (a) 크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 배양액을 유기용매로 추출한 후 감압농축하고 건조시켜 조추출물을 얻는 단계;
    (b) 상기 조추출물을 실리카겔 칼럼에 로딩하고 100% n-헥산으로 용출시킨 후 에틸 아세테이트 농도를 단계적으로 증가시키면서 용출시켜 활성분획을 얻는 단계;
    (c) 아세토니트릴:H2O로 조절된 역상 실리카겔 칼럼에 상기 활성분획을 로딩하고 아세토니트릴 농도를 단계적으로 증가시키면서 용출시켜 활성분획을 얻는 단계;
    (d) 상기 활성분획을 유기용매에 용해시키고 메탄올을 용출액으로 사용하는 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 분석하여 활성분획을 얻는 단계;
    (e) 상기 활성분획을 CHCl3:MeOH 혼합액을 전개용매로 하는 정제 박막 크로마토그래피(prep-TLC)로 분석하여 활성분획을 얻는 단계; 및
    (f) 상기 활성분획을 CH3CN:H2O 혼합액을 전개용매로 하는 정제 박막 크로마토그래피로 분석하는 단계를 포함하는,
    크라이소스포리움 루크노엔스 F80642의 배양액으로부터 5-디메틸오발리신 또는 오발리신 화합물을 분리정제하는 방법.
  5. 활성성분으로서 하기 화학식 1의 5-디메틸오발리신(demethylovalicin) 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 신생혈관 형성 저해 조성물:
    화학식 1
  6. 제 5 항에 있어서,
    암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증 또는 혈관종의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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