DE69720101T2 - Makrolid Verbindung 0406 - Google Patents

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    • Y10S435/872Nocardia

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verbindung 0406, ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung, Mikroorganismen, die die Verbindung 0406 produzieren und die Verwendung davon. Verbindung 0406 ist eine neue bisher unbekannte Makrolid-Verbindung und wird aus Mikroorganismenkulturen, insbesondere Aktinomyceten, isoliert und gereinigt. Die Verbindung besitzt ausgezeichnete biologische Aktivitäten, insbesondere immunsuppressive Aktivität.
  • Daher kann die neue Makrolid-Verbindung der vorliegenden Erfindung wirksam als Immunsuppressivum verwendet werden, beispielsweise zur Unterdrückung der Abwehr während Organtransplantationen oder Hauttransplantationen oder als präventives Mittel und/oder als Therapeutikum für Autoimmunerkrankungen.
  • Eine Vielzahl von Immunsuppressiva wurde in den letzten Jahren für eine Reihe von Erkrankungen verwendet, die als allergische Erkrankungen, Erythematosen, Autoimmunerkrankungen oder Bindegewebserkrankungen bezeichnet werden und die Aufmerksamkeit auf deren Auswirkungen gelenkt haben. Derartige Mittel wurden auf ähnliche Weise verwendet, um die Abstoßung bei der Transplantation von Organen wie Leber, Herz und Nieren zu unterdrücken. Deren Bedeutung wurde allmählich über die Jahre größer.
  • Cyclosporin A wurde als Mittel mir höherer Spezifität und größerer Selektivität für eine Gruppe von Immunzellen auf diesem Gebiet entwickelt (A. Rciegger et al., Agents and. Actions, Bd. 6, S. 468–475 (1976)); Cyclosporin A unterdrückt die Erzeugung von Interleukin-2 (IL-2) aus den T-Helferzellen ohne Suppression der T-Suppressorzellen, so dass man zeigen konnte, dass Cyclosporin A die Transplantatstoßung verhindert. Deshalb erzielte das Mittel ein herausragendes Ergebnis bei der Organtransplantation wie bei der Nieren- oder Myelomtransplantation, so dass das Mittel nun klinisch eingesetzt wird.
  • Es ist jedoch anzumerken, dass das Mittel Nebenwirkungen wie akute Nierentoxizität, leichte neurologische Störungen und periodontische Hyperplasie hat, die in einigen Fällen von Nachteil sind.
  • Ein Tacrorim-Makrolidantibiotikum (FK506), das 1984 entdeckt wurde (T. Kino et al., J. Antibiot., Bd. 40, S. 1249 –1255 (1987)), erzielte ein positives Ergebnis als Immunsuppressivum. Jedoch hat Tacrorim Nachteile, wie niedrige Produktivität, da Tacrorim-verwandte Substanzen in Spuren auch als Nebenprodukte bei der Züchtung von Mikroorganismen erzeugt werden, so dass die Produktivität verbessert werden sollte. Deshalb können derartige Nachteile potentiell als regulierende Bedingungen fungieren, so dass dahingehend zukünftig Fortschritte gemacht werden. Ferner ist das Mittel auch schädlich für Pankreas und Niere, und seine Wirkung ähnelt der von Cyclosporin A. Ein neues Makrolidantibiotikum, PC-766B, mir einer Struktur, die sich von der vorliegenden Struktur unterscheidet, wurde aus einem spezifischen Nocardia brasiliensis Stamm isoliert (K. Kumagai et al., The J. of Antibiotics, Bd. 46, S. 1139 – 1144 (1993)).
  • Somit ist ein neues sicheres Mittel mit einer unterschiedlichen Wirkungsweise sehr wünschenswert.
  • Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein weitaus besseres Mittel als die herkömmlich bekannten Substanzen bereitzustellen, um derartige Nachfragen in der Industrie zu befriedigen.
  • Für die Zwecke zur Entwicklung eines neuen Immunsuppressivums mit wirksamerer immunsuppressiver Aktivität führten die hier genannten Erfinder groß angelegte Untersuchungen von natürlichen Substanzen, speziell von mikrobiellen Metaboliten, durch. Daraufhin fanden die Forscher heraus, dass ein neuer Bakterienstamm Nocardia brasiliensis IFM 0406 (FERM BP-5498) eine betreffende Substanz im Kulturmedium produziert. Dann führten die Erfinder ausführliche Untersuchungen der physico-chemischen Eigenschaften der Substanz durch und bestimmten dessen chemische Struktur. Es wurde bestätigt, dass die Substanz eine neuartige Substanz ist, die bisher unbekannt war. Wie in Anspruch 1 beschrieben, ist die Substanz eine neuartige Substanz, die durch die Formel (1) dargestellt wird, wobei eine 32-gliedrige Makrolid-Verbindung mir Epoxiden mit einer Desoxyfucose verbunden ist. Die Erfinder haben die Verbindung 0406 genannt.
  • Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung die neue Verbindung 0406 mit der Formel (1) und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
  • Figure 00030001
  • (wobei R1-COCH2COOH oder H ist; R2 ist -CO(CH2)3CH3 oder -CO(CH2)4CH3 oder H.)
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein neuartiges Immunsuppressivum, das die neuartige Makrolid-Verbindung 0406 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als wirksame Verbindung enthält. Die vorliegende Erfindung wird nun nachstehend beschrieben.
  • 1 zeigt das 1H-NMR-Spektrum (CD3OD) der Verbindung 0406-A und
  • 2 zeigt das 13C-NMR-Spektrum (CD3OD) der Verbindung 0406-A.
  • Verbindung 0406 der vorliegenden Erfindung schließt sechs Verbindungen A, B, C, D, E und F ein, die bisher getrennt wurden.
  • Unter diesen Verbindungen ist die Verbindung 0406-A eine Verbindung, die durch die Formel (1) dargestellt ist, wobei R1-COCH2COOH und R2 -CO(CH2)3CH3 ist. Die physicochemischen Eigenschaften davon sind so wie in Tabelle 1 und 2 dargestellt.
  • Tabelle 1
  • Physico-chemischen Eigenschaften der Verbindung 0406-A
  • (1) Farbe und Zustand der Substanz; weißes Pulver.
  • (2) Spezifische Rotation: [α]28 D: –27,4(1% Methanol).
  • (3) Infrarot-Absorptionsspekwm: signifikante Signale, wie nachstehend dargestellt; v KBr / max = 3400, 1740, 1700, 1640, 1580 cm–1. (4) Ultraviolettes Absorptionsspektrum, wie nachstehend dargestellt; λ = McOH / max 214 (ε 14900) nm (E) 1% / 1 cm
  • 5) Molekulare Formel und FAB-MS:
    Molekulare Formel: C57H98O24
    FAB-MS m/z: 1189 (M + Na)
    HR-FAB-MS m/z 11890,6403 (M + N)+.
  • 6) 1H-NMR-Spektrum (1):
    signifikante Signale, wie in Tabelle 2 dargestellt.
  • (7) 3C-NMR-Spektrum (2): signifikante Signale, wie in Tabelle 2 dargestellt.
  • (8) Löslichkeit:
    Löslich in Wasser, Methanol, Ethanol und DMSO.
    Unlöslich in Chloroform, Ethylacetat und Ether.
  • Tabelle 2 1H-NMR und 1 3C-NMR (CD3OD) Daten von 0406-A
    Figure 00050001
  • Durch FAB-MS und HR-FAB-MS werden die Verbindungen B, C, D, E und F auf ihre Molekulargewichten analysiert, um die molekularen Formeln einzeln abzuleiten. Somit werden die möglichen Strukturformeln in den nachstehenden Ergebnissen dargestellt, wie in den Ansprüchen beschrieben.
  • 0406-B: C52H90O23(1082)
    0406-C: C54H96O21(1080)
    0406-D: C49H88O20(996)
    0406-E: C58H100O2 4(1180)
    0406-F: C55H98O21(1094) Die Verbindung 0406 der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise durch einen neuen Stamm Nocardia brasiliensis IFM 0406 (FERM BP-5498) produziert.
  • Die mikrobiologischen Merkmale des Stammes Nocardia brasiliensis IFM 0406 sind wie folgt: Morphologisch gesehen, besitzt der Stamm lange, verzweigte Hyphen und Lufthyphen, wie diejenigen, die man bei einer Actinomyceten-Spezies bei der Züchtung in einem Hafermehl-Medium (ISP Nr. 3) beobachtet. Durch Verlängern der Züchtungsdauer wurden eine Anzahl von Sporen auf der Spitze der Lufthyphen beobachtet. Ferner wurde die Fragmentierung der vegetativen Hyphen beobachtet. Morphologisch gesehen, wird daraus geschlossen, dass der Stamm zur Gattung Nocardia aufgrund der beobachteten Fragmentierung der Hyphen gehört.
  • Die Züchtungs- und physiologischen Merkmale des Stammes Nocardia brasiliensis IFM 0406 werden in einer Vielzahl von Kulturmedien in den Tabellen 3 bzw. 4 nachstehend dargestellt. Tabelle 3 Züchtungsmerkmale von Nocardia brasiliensis IFM 0406
    Kulturmedium Eigenschaften
    ISP-2(Hefe-Malz-Agar) Starkes Wachstum, faltige Oberfläche, schwach-gelb erdfarben
    ISP-3 (Hafermehl-Agar) mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, weißgelb, starke Lufthyphen in weiß
    ISP-4 (Stärke/anorganischer Salzagar) fast kein Wachstum
    ISP-5 (Glycerin-Asparagin-Agar) mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, grau, Spuren von Lufthyphen
    ISP-6 (Pepton-Hefe-Agar) starkes Wachstum, faltige Oberfläche, blassbraun
    BHI (Gehirn-Herz-Infusions-Agarar) starkes Wachstum, faltige Oberfläche, blassgelb erdfarben
    SDA (Sabouraud-Agar) starkes Wachstum, faltige Oberfläche, Spuren von Lufthyphen
    Tabelle 4 Physiologische Merkmale von Nocardia brasiliensis IFM 0406
    Abbau
    Adenin positiv
    Casein positiv
    Hypoxanthin positiv
    Tyrosin positiv
    Xanthin negativ
    Säurebildung aus Zucker
    Galaktose negativ
    Glucose positiv
    Inosit positiv
    Ramnose negativ
    Maltose negativ
    Adonit negativ
    Arabinose negativ
    Erythrit positiv
    Mannose negativ
    Sorbit negativ
    Cirtatverwertung positiv
    Sensitivität gegen Antibiotika
    Imipenem negativ
    Tobramycin positiv
    Kanamycin negativ
    5-FU negativ
    ß-Lactamase-Bildung positiv
    Grenze der Wachstumstemperatur kein Wachstum bei 45°C
  • Der Stamm wurde 72 Stunden in einem Kulturmedium (Gehirn-Herz-Infusion, enthaltend 2% Glucose) bei 30°C unter Schütteln bei 250 UpM gezüchtet, und die Zellen, die in dem Medium gezüchtet wurden, wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 3000 UpM gesammelt. Die Zellen wurden dann zweimal in destilliertem Wasser gewaschen. Ferner wurden die Zellen in Ethanol gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, so dass sich trockene Zellen ergaben. Nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 9. Auflage, Williams & Willkins, Baltimore, 1993, wurden die Aminosäurezusammensetzung, Zuckerzusammensetzung und Lipidzusammensetzung der trockenen Zellen bestimmt. Durch die Aminosäureanalyse wurde meso-Diaminopimelinsäure nachgewiesen, während Arabinose und Galactose durch die Zuckeranalyse nachgewiesen wurden. Durch die Lipidanalyse wurde auch das Vorhandensein von Mycolsäure bestimmt und der Säuretyp war Nocardia-artig. Als Hauptkomponente des Isoprenoidchinons wurde der MK-8 (H4)-Ring als Bestandteil des bakteriellen Lipids bestätigt, während als Spurenelemente, MK-8 (H4), MK-8 (H) und MK-9 (H2) bestätigt wurden. Basierend auf dem Abbau von Adenin, Casein, Hypoxanthin und Tyrosin und zusätzlich auf den Säurebildungsmustern aus Zucker und den antimikrobiellen Sensitivitätsmustern, die in Tabelle 4 dargestellt werden (Mikami & Yazawa, Susceptibility pattern of pathogenic Nocardia to some selected antimicrobial agents and their usefulness in the identification work in a clinical laboratory: BULL.JFCC, 5: 89, 1989), wurde der Bakterienstamm als die Spezies N. brasiliensis identifiziert. Die Ergebnisse der Analyse des G+C-Gehalts und der DNA-Homologie unterstützen sehr, dass der Stamm N. brasiliensis ist. Tabelle 5 G+C-Gehalt und DNA-Homologie von Nocardia brasiliensis IFM 0406
    Figure 00090001
  • A: Nocardia brasiliensis IFM 0236TB
  • B: Nocardia transvalensis IFM 0333T
  • C: N. brasiliensis IFM 0406
  • Wie vorstehend dargestellt, wurde der Stamm, da er als Nocardia brasiliensis klassifiziert wurde und charakteristischerweise die Verbindung IFM 0406 produziert, als neuer Stamm Nocardia brasiliensis IFM 0406 bezeichnet, der dann international im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Nr. FERM BP-5498 am 3.April 1996 hinterlegt wurde..
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen Stamm Nocardia brasiliensis IFM 0406, der die neue Verbindung 0406 produziert, die durch die Formel (1) dargestellt wird. Verbindung 0406 der vorliegenden Erfindung wird von dem neuen Bakterienstamm N.
  • brasiliensis IFM 0406 (FERM BP-5498) produziert. Es wurde auch bestätigt, dass die Verbindung von anderen Stämmen produziert werden kann, die zur Gattung Nocardia gehören, beispielsweise Nocardia transvalensis. Die Produktion der Verbindung 0406 ist nicht auf diese Mikroorganismen begrenzt.
  • Ferner umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vielzahl aller Varianten, die die Verbindung 0406 produzieren können, einschließlich künstlicher Varianten, die aus diesen Mikroorganismen durch Röntgenstrahlung, ultraviolette Strahlung, Gamma-Strahlung und andere Mutagenesebehandlungen nur Stickstoffsenf, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Aminopurin und Ethylmethansulfonat erzeugt werden, sowie spontane Varianten.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Formel (1) dargestellte neue Verbindung kann, wie vorstehend beschrieben, von Organismen anders als durch chemische Synthese produziert werden.
  • Im vorhergehenden Fall kann die neue Verbindung, dargestellt durch die Formel (1), gemäß der vorliegenden Endung von Bakterien der Gattung Nocardia produziert werden, die die Verbindung produzieren können; beispielsweise kann die Verbindung produziert werden, indem Nocardia brasiliensis IFM 0406 in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, die von IFM 0406 abbaubar sind, bevorzugt unter aeroben Kulturbedingungen mit Eintauchen der Kultur (beispielsweise Schüttelkultur und Züchtung unter Belüftung und Rühren durch einen Fermenter und dergleichen).
  • Als Kohlenstoffquellen können vorzugsweise Glucose, Glycerin, Saccharose, Stärke, Dextrin und andere Kohlenhydrate verwendet werden.
  • Als Stickstoffquellen können vorzugsweise Hafermehl, Hefeextrakt, Rinderextrakt, Thunfischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwohlsamenpulver, Sojamehl, Sprituosen auf Getreidebasis, Trockenhefe, Weizenkeim, Erdnusspulver, Hühnermehl und dergleichen verwendet werden; zusätzlich können anorganische und organische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsalze (beispielsweise Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dergleichen), Harnstoff und Aminosäuren vorteilhaft verwendet werden. Vorteilhafterweise können diese Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen in Kombination verwendet werden, aber es ist nicht notwendig, dass die Produkte in Reinform verwendet werden. Derartige Produkte können unrein sein und können Wachstumsfaktoren und Spurenelemente enthalten, die vorzugsweise verwendet werden können.
  • Gegebenfalls können dem Kulturmedium anorganische Salze zugesetzt werden, wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumjodid, Kaliumjodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Cobaltsalze und dergleichen.
  • Gegebenenfalls und insbesondere dann, wenn das Kulturmedium schäumt, kann ein Antischaummittel einschließlich flüssiges Parafin, Tieröl, Gemüseöl, Mineralöl, Silikon und dergleichen zugesetzt werden.
  • Was die industrielle Produktion im Großmaßstab der betreffenden Substanz anbelangt, kann vorzugsweise eine Züchtung unter Rühren und Luftzufuhr wie bei anderen Fermentationsprodukten durchgeführt werden. Im kleinen Maßstab kann die Züchtung in Kolben mit Schütteln bevorzugt werden.
  • Damit die Verzögerung des Bakterienwachstums beim Herstellungsverfahren von Verbindung 0406 verhinderi wird, wird das Bakterium für die Züchtung in einem großen Behälter, zuerst angeimpft und in relativ kleinem Volumen mir Kulturmedium gezüchtet, und die Kultur wird dann in ein großes Produktionsgefäß überführt, damit es darin zur Produktion der Verbindung gezüchtet wird.
  • In diesem Fall können die Zusammensetzungen der Kulturmedien für die Vorkultur und die Produktionskultur dieselben sein oder sich gegebenenfalls unterscheiden.
  • Die Züchtung kann bevorzugt mit Luftzufuhr und Rühren durchgeführt werden. Es können geeignete bekannte Verfahren verwendet werden, beispielsweise Rühren mittels eines Propellers oder anderer Maschinen, Rotation oder Schütteln des Fermenters, Verwendung von Pumpen, Luftzufuhr und dergleichen. Vorzugsweise wird die Luft für die Luftzufuhr vorher sterilisiert.
  • Die Züchtungstemperatur kann innerhalb eines Bereichs, bei dem die Bakterien, welche die Verbindung 0406 produzieren können, die Verbindung produzieren, geeignet modifiziert werden; im allgemeinen beträgt die Temperatur 10 bis 40°C, vorzugsweise 25 bis 35°C.
  • Die Züchtungszeit hängt von den Züchtungsbedingungen und dem Züchtungsvolumen ab, aber im allgemeinen beträgt die Zeit etwa einen Tag bis eine Woche.
  • Nach Beendigung der Fermentation wird die betreffende Verbindung 0406 aus der Kultur gewonnen. Genauer gesagt, werden die Zellen einer direkten Extraktion mit Wasser und/oder einem organischen Lösungsmittel oder einer mechanischen Pulverisierung oder Pulverisierung durch bekannte Mittel wie Ultraschall unterzogen, gefolgt von einer Extraktion mir Wasser und/oder einem organischen Lösungsmittel und anschließender Gewinnung und Reinigung durch bekannte Verfahren. Das Kulturmedium kann direkt mit einem Lösungsmittel extrahiert werden oder kann einer Filtration oder Zentrifugation, anschließender Konzentration unter reduziertem Druck, Gefriertrocknung, pH-Wert Einstellung und Adsorption der Verbindung 0406 durch in Kontaktbringen mit Trägern wie einem Anionen- oder Kationenaustauschharz, Aktivkohle, Cellulose in Pulverform, Kieselgel, Tonerde und einem Adsorptionsharz unterzogen werden, um die Verbindung von Träger zu eluieren.
  • Für die Reinigungsverfahren können geeigneterweise nur Routineverfahren oder in Kombination mit anderen Verfahren eingesetzt werden, wie diejenigen für Antibiotika, beispielsweise Lösungsmittelextraktion mit Wasser, mir einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch davon, Chromatographie, Rekristallisierung in einem einzigen Lösungsmittel oder einem gemischten Lösungsmittel.
  • Wie vorstehend beschrieben, erfolgt die Reinigung der Verbindung 0406 durch bekannte Verfahren, beispielsweise wie folgt.
  • Zuerst werden die Zellen durch Behandlung der Kultur durch Zentrifugation oder durch eine MF-Membran entfernt, um die Verbindungsfraktion auf ein hydrophobes Adsorptionsharz zu adsorbieren, wobei die adsorbierte Fraktion mit Methanol eluiert, die eluierte Fraktion unter reduziertem Druck konzentriert und ferner die Fraktion einer Kieselgelchromatographie unterzogen wird, um die Fraktion auf Kieselgel zu adsorbieren, das dann einem schrittweisen Elutionsvorgang mir einer Chloroform-Methanol-Lösung zur Fraktionierung unterzogen wird, wobei danach weiteres Fraktionieren und Reinigen der Fraktion durch Reverse-Phasen-Chromatographie erfolgt und die sich ergebende Fraktion gegebenenfalls gefriergetrocknet wird.
  • Zur Verabreichung der Verbindung 0406 als Arzneimittel ist es von Vorteil, wenn die Verbindung 0406 formuliert wird, da die Verbindung wasserlöslich ist. Deshalb wird die Verbindung so wie sie ist oder als Arzneimittel verabreicht, das 0,1 bis 99,5%, vorzugsweise 0,5 bis 90% der Verbindung in einem pharmazeutisch akzeptablen inaktiven Träger ohne Toxizität enthält.
  • Als derartiger Träger kann ein festes, halbfestes oder flüssiges Verdünnungsmittel, ein Füllstoff und ein oder mehrere Hilfsstoffe verwendet werden. Vorzugsweise kann das Arzneimittel in Form einer Dosierungseinheit verwendet werden. Das Arzneimittel der vorliegenden Verbindung kann oral, parenteral, zwischen Gewebe, lokal (transdermale Verabreichung etc.) oder transrektal verabreicht werden oder das Arzneimittel kann als äußerlich anwendbare Zubereitung angewendet werden.
  • Das Arzneimittel sollte in Dosierungsformen verwendet werden, die für diese Verabreichung geeignet sind.
  • Die Dosis als Immunsuppressivum wird vorzugsweise eingestellt, wobei der Zustand eines Patienten wie Alter, Körpergewicht, Verabreichungsweg und die Art und Schwere der Krankheit berücksichtigt wird, aber im allgemeinen liegt die Dosis für Erwachsene gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 10 bis 200 mg der wirksamen Komponente pro Tag. In einigen Fällen kann es ausreichend sein, wenn die Dosis höher oder niedriger ist. Für eine höhere Dosierung sollte die Dosis vorzugsweise aufgeteilt werden.
  • Die orale Verabreichung kann bei einer Dosierungseinheit als Feststoff oder Flüssigkeit, beispielsweise als pulvrige Zubereitungsform, als pulvriges Formulierungsgemisch, als Tablette, als mir Zucker überzogene Zubereitungsform, als Kapsel, als Tropfen, als sublinguale Tablette sowie als andere Zubereitungsformen erfolgen.
  • Derartige pulvrige Zubereitungsformen können durch Pulverisieren der aktiven Substanz mit der geeigneten Feinheit hergestellt werden. Derartige pulvrige Formulierungsgemische können hergestellt werden, indem die aktive Substanz mit geeigneter Feinheit pulversisieri wird und danach die sich ergebende pulverisierte Substanz mit einem ähnlich pulversierten pharmazeutischen Träger wie Stärke, essbare Kohlenhydrate wie Mannit und dergleichen gemischt wird. Gegebenenfalls kann mit diesen Zubereitungsformen ein Geschmacksstoff, ein Konservierungsstoff, ein Dispersionsmittel, ein Farbstoff, ein Duftstoff und dergleichen gemischt werden.
  • Eine derartige Kapsel kann hergestellt werden, indem die Substanz in eine pulvrige Zubereitungsform oder ein pulvriges Formulierungsgemisch oder eine Granulaformulierung pul verisiert oder granuliert wird und diese Zubereitungsform in einen umhüllenden Überzug wie eine Gelatinekapsel gefüllt wird. Ein Schmiermittel oder ein Verflüssigungsmittel, beispielsweise colloidales Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat und festes Polyethylenglycol können damit in pulvrige Formen gemischt werden, gefolgt von einem Füllverfahren. Die Zugabe eines Desintegrators oder eines Lösungsvermittlers, beispielsweise Carboxymethylcellulose, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat kann die pharmazeutische Wirksamkeit der sich ergebenden Kapsel bei der Verabreichung verbessern.
  • Das mikrofeine Pulver des Produkts wird in Gemüseöl, Polyethylenglycol, Glycerin oder einem grenzflächenaktiven Mittel (Surfactant) suspendiert und dispergiert, das dann mit einer Gelatineschicht überzogen wird, um eine weiche Kapsel herzustellen.
  • Derartige Tabletten können hergestellt werden, indem ein Pulvergemisch hergestellt, das Gemisch granuliert oder perliert wird und dem Gemisch anschließend ein Desintegrator oder ein Schmiermittel zugesetzt wird, gefolgt von der Herstellung einer Tablette.
  • Was ein derartiges Pulvergemisch anbelangt, kann die geeignet pulverisiene Substanz zufriedenstellend mir einem vorstehend beschriebenen Verdünnungsmittel oder Grundlage gemischt werden. Gegebenenfalls kann das Pulvergemisch in Kombination mit einem Bindemittel (beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Alginatsalz, Gelatine, Polyvinylpynolidon, Polyvinylalkohol), einem die Dauerfreisetzung förderndes Mittel (beispielsweise Parafin), einem Reabsorptionsmittel (beispielsweise quarternäres Salz) und/oder einem Absorptionsmittel (beispielsweise Bentonit, Kaolin, Dicalciumphosphat) verwendet werden. Zuerst kann das Pulvergemisch mit einem Bindemittel wie Sirup, Stärkepaste, Gummi arabicus, einer Celluloselösung oder einer Polymerlösung befeuchtet werden und anschließend kann das sich ergebende Gemisch durch ein Sieb zur Granulation gedrückt werden. Anstatt das Pulver auf diese Weise zu granulieren, wird das Pulver zuerst in ein Gerät gegeben, das Tabletten herstellt und der sich ergebende Block in unvollständiger Form wird in Granula pulverisiert.
  • Den so hergestellten Granula kann ein Schmiermittel wie Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum, Mineralöl und sonstiges zugefügt werden, um das Zusammenkleben der Granula zu verhindern. Das so geschmierte Gemisch wird dann in Tablettenform gebracht. Das Arzneimittel kann an einen interaktiven flüssigen Träger gebunden werden, ohne einen Granulationsvorgang oder Perlieren durchzumachen, gefolgt von der direkten Tablettenherstellung. Ein transparenter oder undurchsichtiger Überzug, der einen versiegelten Schellack-Überzug, einen Überzug aus Zucker oder einem Polymermaterial und einen polierten Wachsüberzug umfasst, kann zufriedenstellend verwendet werden.
  • Andere orale Dosierungsformen beispielsweise Flüssigkeiten, Sirup und Elexir können in einer Dosierungseinheit hergestellt werden, die eine gegebene Menge der Verbindung enthält. Ein derartiger Sirup kann durch Solubilisierung der Verbindung in eine wässrige Lösung mit geeignetem Geschmack formuliert werden. Ein derartiges Elexir wird durch Dispergieren der Verbindung in einem alkoholischen Träger ohne Toxizität formuliert. Gegebenenfalls kann ein Lösungsvermittler oder ein Emulgator (beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitester), Konservierungsmittel, ein Geschmacksstoff (beispielsweise) Pfefferminzöl und Saccharin) ebenfalls zugesetzt werden.
  • Gegebenenfalls kann die Zubereitungsform für die Dosierungseinheit für die orale Verabreichung in einer Mikrokapsel hergestellt werden. Durch Überziehen der Zubereitungsform oder Einbetten der Zubereitungsform in ein Polymer oder Wachs, kann die Wirkungsdauer verlängert oder die Dauerfreisetzung realisiert werden.
  • Die parenterale Verabreichung kann unter Verwendung einer flüssigen Dosierungseinheit für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektionen erfolgen, beispielsweise eine Flüssigkeits- oder Suspensionsformulierung. Diese Formulierungen werden durch Suspendieren oder Solubilisieren einer gegebenen Menge der Verbindung in einem flüssigen Träger ohne Toxizität, geeignet für Injektionszwecke, herstellt. Beispielsweise können diese Formulierungen durch Suspendieren oder Solubilisieren der Verbindung in einem wässrigen oder ölhaltigem Medium und anschließendem Sterilisieren der Suspension oder Lösung hergestellt werden. Ansonsten wird eine gegebene Menge der Verbindung in ein Gefäß gegeben, worauf das Sterilisieren des Inhalts zusammen mit dem Gefäß folgt, das dann versiegelt wird. Zum Lösen oder unmittelbaren Mischen vor der Verabreichung, kann ein Ersatzgefäß oder Ersatzträger vorher zusammen mit der pulvrigen oder gefriergetrockneten wirksamen Komponente hergestellt werden. Zur Herstellung isotonischer Injektionen können nicht toxische Salze oder Salzlösungen zufriedenstellend zugegeben werden. Zusätzlich kann in Kombination damit ein Stabilisator, ein Konservierungsmittel oder ein Emulgator und dergleichen verwendet werden.
  • Die rektale Verabreichung kann unter Verwendung eines Suppositoriums erfolgen, das durch Mischen der Komponente mit einem bei niedriger Temperatur schmelzenden Feststoff, beispielsweise Polyethylenglycol, Kakaofett, höhere Ester (beispielsweise Myristylpalmitat) und Gemischen davon hergestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben, aber die Erfindung ist nicht auf diese Beispiele begrenzt.
  • Beispiel 1
  • (1) Fermentation
  • Ein Grundmedium (10 ml), umfassend 2% Glycerin, 1% Polypepton (hergestellt von Nippon Seiyaku Co., Ltd.) und 0,5% Thunfischfleischextrakt, pH 7,0 wurde in 50 ml Erlenmeyerkolben gegossen, in den Nocardia brasiliensis IFM 0406 (FERM BP-5498) für eine 72-stündige Schüttelkultur bei 32°C angeimpft wurde. Ferner wurde die Ausgangskultur dann bei 1 Vol.-% in 1,5 Liter desselben Mediums in einen 5 Liter Kolben gegossen. Auf dieselbe Weise erfolgte die Vorkultur. Das Vorkulturmedium wurde dann in einem 200-Liter-Behälter angeimpft, das 150 Liter desselben Mediums enthielt, um die Züchtung in einem 150 Liter Belüftungsvolumen pro Minute durchzuführen und 90 Stunden bei 30°C und 200 UpM zu rühren.
  • (2) Gewinnen und Reinigung
  • Zum Sterilisieren wurde die sich ergebende Kultur von 150 Litern dann durch eine Membran mir einer Porengröße von 0,45 μm (Pericon Cassettensystem, hergestellt von Millipore, Co. Lid.) filtriert. Die Filtratfraktion wurde auf eine Dia-ion HP 20-Säule (hergestellt von Mitsubishi Plastics Industries, Ltd.) mir 15 × 100 cm adsorbiert und ausreichend in 50% Methanol gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von einer Eluierung mit 20 Litern Methanol. Da Verbindung 0406 eine spezifische Hemmwirkung auf Aspergillus niger ausübte (maximale Hemmkonzentration von 25 μg/ml), wurde die Verbindung in der eluierten Fraktion als Marker mittels der Wachstumshemmaktivität gegen einen betreffenden Pilz A. niger auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar-Medium durch ein Papierscheiben-Verfahren nachgewiesen.
  • Die eluierte Fraktion wurde zu einem Liter im Vakuum konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (5 cm × 50 cm) adsorbiert, die dann mir jeweils 4 Litern eines Gemisches aus Chloroform : Methanol: Wasser (= (a) 4 : 1: 0, (b) 1 : 1 : 0 und (c) 1,5 : 1 : 0,1) eluiert wurde.
  • Einzelfraktionen von (a), (b) und (c) wurden weiter fraktioniert und mittels HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) gereinigt. Für die HPLC-Fraktionierung und Reinigung wurde eine Capcell-Pack-C 18-SG 120-Säule (hergestellt von Shiseido Co., Ltd.) mit 5 × 250 mm verwendet. Die Einzelfraktionen wurden auf der Säule adsorbiert, gefolgt von einer Gradienteneluierung mit 20-50% Acetonitril. Als eine Fraktion pro Röhrchen wurden 10 Milliliter gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, indem als Marker die wachstumshemmende Aktivität gegen A. niger verwendet wurde.
  • Durch Gefriertrocknen und Sammeln einzelner aktiver Fraktionen, wurden die gereinigten Produkte als 0406-A (2g), B (150 mg), C (300 mg), D (200 mg), E (25 mg) und F (15 mg) gewonnen. Beispielsweise war 0406-A ein weißes Pulver, das die Strukturformel und physico-chemischen Eigenschaften besaß, wie vorstehend dargestellt, und auch eine Immunsuppressive Wirkung hatte. Beim Vergleich von 0406-A mit bekannten Substanzen und bekannten Antibiotika, die alle immunsuppressive Wirkung besaßen, wurde 0406-A als neue Substanz identifiziert, da keine dieser anderen Substanzen die gleiche Strukturformel besaß.
  • Beispiel 2
  • Die in vitro immunsuppressive Aktivität bei der gemischten Maus-Lymphocytenreaktion wird als inhibitorische Aktivität des T-Zellwachstums gemessen.
  • (1) Probenherstellung
  • Das HPLC-gereinigte 0406-A wurde bei einer Konzentration von 1 mg/ml in sterilisiertem Wasser gereinigt.
  • (2) Test
  • Die gemischte Maus-Lymphocytenreaktion (MLR) erfolgte, indem T-Zellen aus C57BL/6 (H-2b)-Splenocyten als Responderzellen und Mitomycin C-behandelte BALB/C (H-2d)-Splenoccyten als Stimulatorzellen verwendet wurden, indem sie gemischt und gemeinsame gezüchtet wurden.
  • Die Responderzellen wurden wie folgt hergestellt. Die Milz wurde aus C57BL/6-Mäusen (5 bis 6 Wochen alr) reseziert, die in einem eiskalten RMPI-1640 Medium inaktiviert wurde, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthielt und durch ein Gazetuch gefiltert wurde, um die Einzelzellsuspension zu gewinnen.
  • Nach der Gewinnung mir einer Zentrifuge wurde die Suspension mit einer Ammoni- umchloridlösung 1 Minute bei 4°C behandelt, um die Erythrocyten zu entfernen, die sich darin als Kontaminanten befanden.
  • Nach der Zentrifugation zur Gewinnung einer Splenocyten-Suspension erfolgte die nachfolgende Trennung der T-Zellen unter Verwendung einer großen Säule zur Anreicherung von Mäuse-T-Zellen (hergestellt von Funakoshi, Co. Ltd.). Nach dem Zentrifugieren und Waschen im RPMI 1640-Medium wurden die Zellen auf 5,6 × 106 Zellen/ml in RMPI 1640-Medium eingestellt, das 50 μM 2-Mercaptoethanol und 10% FCS enthielt, um eine Responderzellen-Suspension herzustellen.
  • Die Stimulatorzellen wurden durch Resektion der Milz aus BALB/C-Mäusen (5 bis 6 Wochen alt) hergestellt, indem eine Splenocyten-Suspension auf diesselbe Weise hergestellt wurde und die Suspension mit 50 μg/ml Mitomycin C 30 Minuten bei 37°C behandelt wurde. Nach dreimaligem Waschen durch Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert und auf 5,6 × 106 Zellen/ml in RMPI 1640-Medium eingestellt, das 50 μM 2-Mercaptoethanol und 10% FCS enthielt, um eine Stimulatorzellsuspension herzustellen.
  • Die Responderzellen (90 μl), die Stimulatorzellen (90 μl) und eine Probenlösung (20 μl) wurden in einer 96-er Mikrotiterplatte mit Kavitäten mir rundem Boden gegeben, um sie 96 Stunden bei 37°C und 5%o CO2–95% Luft zu züchten. Die Blastenbildung der T-Zellen wurde auf der Basis von Tritium-markiertem Thymidin bestimmt. Nach 96-ständiger Züchtung wurden die Zellen mit 0,5 μCi/Kavität durch Zugabe von Tritium-markiertem Thymidin pulsmarkiert. Nach einer zusätzlichen 7-st[ndigen Inkubation wurde die Kultur auf einem Glasfaser-Filterpapier unter Verwendung eines Mehrfachprobensammlers gesammelt. Die Radioaktivität auf der Filterscheibe, die jeder Kavität entsprach, wurde durch einen Flüssigscintillationstest (Beta-Zähler) gemessen. Der Ausschlag in jeder Kavität wurde wiederholt gemessen und dann gemittelt, um einen Ausschlag pro Minute (cpm) zu berechnen.
  • Das Ausmaß der Hemmung der Tritium-markiertem Thymidin-Aufnahme (Blastenbildung) wurde folglich in Form von IC50 in Tabelle 6 dargestellt. Als Kontrollen werden die IC50 von Ascomycin, Cyclosporin A und Rapamycin zusammen dargestellt. Tabelle 6 Auswirkungen der Immunsuppressiva auf MLR
    Verbindung IC50 (μg/ml)
    0406-A 0,16
    Ascomycin 0,008
    Cyclosporin A 0,01
    Rabamycin < 0,001
  • Beispiel 3
  • (1) Der Toxizitätstest der Verbindung 0406-A, dargestellt in Beispiel 1, wurde gegen gezüchtete Zelllinien durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
  • Tabelle 7 Cytotoxizitätstest
    Figure 00190001
  • Es wurden Zellsuspensionen (5,6 × 104 Zellen/ml) hergestellt, indem das Minimale Essentielle Medium (MEM)-Dulbecco-Medium für HEK-297, Cos-1 und Helazellen und das RPMI 1640-Medium für YAC-1-Zellen verwendet wurde (alle Medien enthaltend 10% Rinderserum). Die Proben (0406A, Cyclosporin und Ascomycin) wurden durch zweifache Reihenverdünnungen ausgehend von 1 mg/ml unter Verwendung der einzelnen Medien hergestellt. In jede Kavität einer 96-er Mikrotiterplatte wurden eine Zellsuspension (180 μl) und eine Probenlösung (20 μl) zur Züchtung bei 37°C in einer feuchten Umgebung mir 5% CO2-95% Luft gegeben. Nach 96-ständiger Züchtung wurde jeder Kavität 3N-Thymidin (0,5 μCi/Kavität) zugegeben. Die Mikrotiterplatte wurde 4 Stunden inkubiert, gefolgt von einer Trypsinbehandlung der Zelllinien außer von YAC-1, und die sich ergebenden Zellen wurden auf Glasfaserfiltern gewonnen, um die in die Zellen eingebaute Radioaktivität mittels eines Flüssigscintillationszählers zu messen. Die Wachstumshemmrate wurde anhand der Radioaktivität (c) einer Kavität ohne Zugabe einer Probe und die Radioaktivität (t) jeder der Kavitäten mit Zugabe der einzelnen Proben mittels der Formel (100 – t)/c × 100(%) bestimmt. Der IC50 wurde anhand der Ergebnisse berechnet.
  • Es wurde bestätigt, dass der Cytotoxizitätsgrad der Verbindung 0406-A der vorliegenden Erfindung niedriger als der im Handel erhältlichen Immunsuppressiva war.
  • (2) In vitro cytotoxische Zellaktivität (CTL: cytotoxische T-Zelle) (Inhibitorische Wirkung auf die CTL-Generation, induziert durch gemischte Maus-Lymphocytenreaktion).
  • Eine Suspensionslösung (5,5 × 106 Zellen/ml; 0,9 ml) mit BALB/C (H-2b) Splenocyten, die auf dieselbe Weise hergestellt wurden wie in Beispiel 2, eine Suspensionslösung (5,5 × 106 Zellen/ml; 0,9 ml) mir C57BL/6 (N-2d) Splenocyten, die zuvor mit Mitomycin behandelt wurden, und eine Probenlösung (0,2 ml) wurden in eine 24-er Mehrfachpetrischale gegeben, um sie 5 Tage bei 37°C und 5%o CO2–95% Luft zu züchten. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen, die dann in RMPI 1640-Medium, enthaltend 10% Rinderserum, zur Verwendung als Effektorzellen suspendiert wurde.
  • Als Zielzellen wurden EL-4-Zellen (H-2b) verwendet. Die 3-stündige Inkubation der EL-4-Zellen (106) mit 0,1 μCi Na2 51CrO4 bei 37°C förderte die 51Cr-Aufnahme in die Zellen und anschließend wurden die Zellen gewaschen und die Konzentration wurde auf 2 × 105 Zellen/ml zur Verwendung als Zielzellen eingestellt.
  • Die Bestimmung der cytotoxischen T-Zellengeneration wurde wie folgt durchgeführt. Die Effektozellensuspension (100 μl) und die Zielzellensuspension (100 μl) wurden in eine 96-er Mikrotiterplatte mit rundem Boden zur 4-stündigen Züchtung bei 37°C gegeben, um die SCr-Freisetzung im Überstand zu messen. Dann wurde die cytotoxische T-Zellenaktivität mittels der nachstehend dargestellten Formel berechnet.
    Cytotoxische T-Zellenaktivität = [Radioaktivität der (Effektorzelle + Zielzelle)] – (Radioaktivität der Zielzelle allein) / (Radioaktivität der Zielzelle behandelt mir 0,1 N HCl) – (Radioaktivität der Zielzelle allein) × 100
  • Die Aktivität der cytotoxischen T-Zelle wird in der lytischen Einheit (LU) dargestellt.
  • Die Aktivität in LU wird pro 107 Effektorzellen dargestellt, wenn 1 LU als die Anzahl der Effektorzellen bezeichnet wird, die für 20% Lyse der 2 × 104 Zielzellen erforderlich ist. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 8 dargestellt. Wie offensichtlich in den Ergebnissen gezeigt wird, wurde bestätigt, dass Verbindung 0406-A die Induktion von CTL in einer dosisabhängigen Weise herabsetzte.
  • Figure 00210001
  • Beispiel 4
  • Unter Verwendung der nachstehend angeführten Ausgangsmaterialien, wurde eine Tablette hergestellt;
    (1) Die Substanz hergestellt in Beispiel A, nämlich 0406-A; 20 g
    (2) Lactose; 80 g
    (3) Kornstärke; 30 g
    (4) Magnesiumstearat; 2 g.
  • Genauer gesagt, 15 g der Substanzen (1), (2) und (3) wurden zusammengemischt und zusammen mit einer Paste granuliert, die aus 10 g (3) hergestellt wurde. Dem sich ergebenden Granulat wurden 5 g der Substanzen (3) und (4) zugefügt und gründlich gemischt und das sich ergebende Gemisch wurde dann mittels eines Komprimierungstablettenherstellungsgeräts komprimiert, um 800 Tabletten herzustellen, die jeweils 25 mg des wirksamen Bestandteils (1) pro Tablette enthielten.
  • Wirkungen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung soll die Verbindung 0406 bereitstellen, eine neue Verbindung, die eine ausgezeichnete biologische Aktivität zur Verwendung in einer Reihe pharmazeutischer Produkte als Immunsuppressivum und dergleichen besitzt.

Claims (11)

  1. Verbindung 0406, dargestellt in Formel (1 ), und pharmazeutisch verträgliche Salze davon
    Figure 00220001
    (wobei R, ein Rest der Formel –OCH2COOH oder ein Wasserstoffatom ist, R2 ein Rest der Formel -CO(CH2)3CH3 oder -CO(CH2)4CH3 oder ein Wasserstoffatom ist).
  2. Verbindung 0406-A nach Anspruch 1, wobei R ein Rest der Formel -COCH2COOH und R2 ein Rest der Formel -CO(CH2)3CH3 ist.
  3. Verbindung 0406-B nach Anspruch 1, wobei R ein Rest der Formel -COCH2COOH und R2 ein Wasserstoffatom ist.
  4. Verbindung 0406-C nach Anspruch 1, wobei R ein Wasserstoffatom und R2 ein Rest der Formel -C0(CH2)3CH3 ist.
  5. Verbindung 0406-D nach Anspruch 1, wobei R und R2 ein Wasserstoffatom sind.
  6. Verbindung 0406-E nach Anspruch 1, wobei R ein Rest der Formel -COCH2COOH und R2 ein Rest der Formel -CO(CH2)4CH3 ist.
  7. Verbindung 0406-F nach Anspruch 1, wobei R ein Wasserstoffatom und R2 ein Rest der Formel -CO(CH2)4CH3 ist.
  8. Immunsuppressivum, das die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als Wirkstoff enthält.
  9. Immunsuppressivum nach Anspruch 8, zur Verwendung für die Hemmung der Abstoßung bei Organ- oder Hauttransplantationen oder für die therapeutische Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
  10. Nocardia brasiliensis-IFM 0406 (FERM BP-5498), das mindestens eine oder mehrere Verbindungen) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 herstellen kann.
  11. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Salzes davon, umfassend das Züchten eines Bakteriums der Gattung Nocardia, das die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 herstellen kann, und Gewinnen der Verbindung aus der Kultur.
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