CN101212907A - 来自“百子莲”的提取物和化合物及其作为生物学植物保护剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物提取物，尤其是基于百子莲属(Agapanthus)物种的植物提取物及其与来源于其它植物的提取物的组合。本发明进一步涉及在这些提取物中的化合物的分离、纯化和鉴定。这些植物提取物和分离的物质在体外和体内施用于其它植物时，包括在田间条件下，表现出显著的抗微生物活性，尤其是抗真菌活性和生物刺激功效。本发明的产品适合于用作许多农作物和经济植物的植物保护剂，作为化学农药的替代品。

Description

来自“百子莲”的提取物和化合物及其作为生物学植物保护剂的应用
本发明的技术领域
本发明涉及植物提取物，尤其是基于百子莲属(Agapanthus)物种的植物提取物及其与来源于其它植物的提取物的组合。本发明进一步涉及在这些提取物中的化合物的分离、纯化和鉴定。这些植物提取物和分离的物质在体外和体内施用于其它植物时，包括在田间条件中，表现出显著的抗微生物活性，尤其是抗真菌活性，和生物刺激功效。本发明的产品适合于用作许多农作物和经济植物的植物保护剂作为化学农药的替代品。
发明背景
全世界的农业，尤其是在发展中国家，诸如在非洲均存在因植物病害导致的每年一度的巨大农作物和其它经济植物损失。超过30％的在农作物生产系统中生产的食物、纤维、饲料和能量被全球范围的每年一度的害虫和病害所破坏。这些产量损失作为低投入生产系统的结果而极高，这是因为在发展中国家的农民买不起合成杀真菌剂所致，而这些国家依赖于通常提供难以确定结果的非常规病害控制实践。
相反，发达国家中的农作物和植物生产者主要依赖于合成农药控制植物病害。确立的事实为，合成化学农药的应用对作物生产者提供了许多益处。这些益处包括对始终增加的世界人口而言较高的农作物产率，改善的农作物质量和增加的食物产量。使用不同的配方研发广泛的化学药品已经能够使人控制广泛的植物病原体并且实质上增加农作物产量。在十年多以前，为控制害虫，全世界农作物生产者一般花费在农药方面的费用近似200亿美元，而花费在其它植物保护技术方面的费用为1亿5千万美元。单杀真菌剂世界市场份额在近年中为20％，而欧洲占该市场的30％。然而，相同水平的病原体控制在发展中国家尚未得到实现，部分是因农药技术无法被大部分资源匮乏的农民获得。在发展中国家的农民无法获得现代化手段、技术和化学药品仅是因与这些农民栽培的农作物价值相关的高成本所致。因此，农作物照常受广谱多样的病原体侵袭并且这些农民不断经历严重的农作物损害。此外，尽管农药的使用大量增加，但是产量损失却增加，甚至在发达国家也是如此。此外，控制植物病害并非使用单次施用杀真菌剂就易于实现，而是需要在农作物生长期过程中频繁施用。然而，合成的农药可能对环境形成成倍的威胁和危害，尤其是在发展中国家中缺乏操作它们的专业技术和难以轻易地适应该技术的农民不适当地使用它们时更是如此。这可能在食物，水和环境中产生不需要的残留物，并且可能对人和动物产生毒性，导致土壤和地下水污染且可能导致农作物害虫群体对使用农药处理发生抗性。尤其是含硫和铜的合成杀真菌剂对哺乳动物，野生生物和许多有益昆虫有毒性。此外，在非洲和近东，废弃的农药已经成为额外巨大的环境忧虑源。某些储存已经超过了30年以上并且因储存设施不足和缺乏保存管理中受过训练的人员而保持在差的条件中。废弃的农药储存是潜在的定时炸弹。涉及农药的泄漏，泄漏和各种事故十分普遍和广泛。另外，频繁施用杀真菌剂已经产生了真菌突变和随后的新抗性株(Khun，1989，PesticideScience 14：272-293)，与其作斗争通常需要更强的农药，并且会再次对环境产生更强的影响。
由于所有这些原因，所以尤其是在发达国家存在由绿色团体在政治上发动的相当大和逐步增加的消费者抵抗，尤其是对合成化学药品/农药的应用，从而为从化学农药施用到应用天然来源的植物保护剂的转换提供基础，以便减少由农药导致的污染和健康危害。
作为结果，已经极为关切对可能利用的生物资源及其在农业中的潜在应用的研究。在这方面有希望的手段为使用天然植物产品作为合成化学药品的有意义的替代品，因为它显然对环境的负面影响较少。
这尤其适用于寻找对环境温和的，具有例如广谱抗微生物活性的天然衍生的生物活性成分和药剂。
预计来自植物的天然产物具有窄靶标范围和高度特异性作用方式，以便展示出有限的田间持久性，具有较短的贮存期限并且不会存在残留的威胁。它们一般对人和环境比常用的合成化学农药安全并且易于被传统上使用植物提取物治疗人体疾病的发展中国家中的农民所采用。
可以在植物自身中发现更广泛地探察植物提取物或天然产物作为生物农药的应用的额外原理。植物已经进化出了高度特异性的化学化合物，它们对由导致病患的生物体侵袭，包括真菌侵袭，微生物侵害和病毒感染提供防御机制(Cowan，1999，Clinical MicrobiologyReviews 12：564-582)。这些生物活性物质作为次生代谢产物出现在植物中并且已经提供了可以用作新的农作物保护剂的生物活性化合物的丰富来源。实际上某些植物具有在极为恶劣的环境条件下存活的潜能。这一结果启动了如下推断：这类植物可以用作人研发应用于农业的天然产物的来源，作为天然除草剂、杀菌剂、杀真菌剂或粗或半纯化形式的产物。次生植物代谢产物不同于初级代谢产物的方面在于它们一般对基础代谢过程，诸如呼吸和光合作用而言是非必需的。它们是大量和分布广泛的，尤其是在高等植物中并且通常以比初级代谢产物(碳水化合物、蛋白质、脂质)少的量存在(1-5％)。次生代谢产物可能在植物系统中需要时产生和在特化细胞类型中合成。从生态学上说，次生代谢产物在吸引传粉者中起主要作用，作为对环境逆境的适应，并且用作抗昆虫和高级捕食者、微生物乃至其它植物的化学防御物(异种化感物)。
认为非生物逆境，诸如营养限制、光强度、水分逆境等引起次生代谢产物形成。植物-病原体相互作用的与生物逆境相关的类型包括代谢物产生作为抗微生物侵害的植物防御的组成部分并且认为是病害的决定因素。具有抗微生物特性的次生代谢产物包括萜类化合物(例如环烯醚萜类、倍半萜类化合物、皂甙类)、含氮和/或硫(例如生物碱类、胺类、酰胺类)、脂族化合物(尤其是长链烷类和脂肪酸类)和芳族化合物(例如酚类化合物、黄酮类、联苄类、咕吨酮类和苯醌类)。
有机耕作系统的另一个相关领域为作为植物生长调节剂或生物刺激剂施用天然植物提取物的潜能。已经鉴定了影响植物生长和发育的许多天然植物化合物。来自植物的次生代谢产物还可以表现出在植物中的生物刺激活性，包括其它植物。可能的情况是已经将提高农作物产量、农作物效能和种子活力的最有效化合物鉴定为油菜素类固醇(Mandava，1988，Plant Physiology Plant Molecular Biology39：23-52)。还将油菜素类固醇鉴定为来自来源于具体Pink物种和具体Alfalfa种的植物提取物混合物的生物刺激物质(EP 1 051 075 B1)。因此，存在对鉴定具有在短期，例如生长季节内操纵植物生长和发育的能力的天然植物化合物的升高的关注。额外的考虑在于可以将例如其提取物表现出抗微生物和/或生物刺激特性的植物作为备选农作物栽培以便用作生产天然农药或植物生长调节剂中的活性化合物的来源。
尽管植物为研发具有用于有机农作物生产系统中的病害控制的潜能的新天然产物的有价值的来源，但是仅研究了少量可能用于农业中植物病害控制的植物。然而，与这一相对少量的研究植物相关，在最近几年中已经进行了相对大量的科学研究活动。其中的某些如下所列：
·证实(Pretorius等，2002，Annals of Applied Biology141：117-124)使用百合亚纲(Liliidae)的两个种，即Aristeaecklonii和Agapanthus inapertus的提取物获得了菌丝体生长抑制作用。A.ecklonii的粗提取物在所有提取物中表现的效果最佳，因为它总体上抑制所有七种植物致病测试生物体的菌丝体生长并且盛过广谱合成杀真菌剂(多菌灵(carbendazim)/difenoconazole)的抑制作用。A.inapertus的粗提取物表现出对四种植物致病真菌的完全抑制作用和对剩余三种植物致病真菌的强抑制作用。
·植物种子也包含具有抗微生物特性的化合物。评价属于不同科的50种植物种子的种子提取物在体外抑制绿色木霉(Trichodermaviride)生长的能力(Bharathimatha等，2002，ActaPhytopathologica et Entomologica Hungarica 37：75-82)。在各种种子提取物中，属于无患子科(Sapindaceae)的假山萝(Harpulliacupanioides(Roxb.))的提取物展示出极高的抗真菌活性。
·提取自虎杖(Reynoutria sacchalinensis)的天然植物产物Milsana可能是已知最佳的(Daayf，1995，Plant Disease79：577-580)。已经报导该产物在温室条件下控制长英国黄瓜中苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)导致的白粉病并且还表现出对番茄、苹果和秋海棠的白粉病以及葡萄藤的霜霉和大豆的锈病的广谱活性。
·测试了来自楝树的叶和种仁的提取物(Ume等.2001，Thescience and application of neem，meeting proceedings，Glasgow.U.K.April-2001.Pp.33-37)对植物致病真菌整齐小核菌(Sclerotium rolfsii)[罗尔氏伏革菌(Corticium rolfsii)]的抗真菌活性。所有提取物均表现出对该真菌的不同生长阶段的一定作用，但这些作用为制真菌的，而非毒真菌的。
-Amadioha(2002，Archives of Phytopathology and PlantProtection 35：37-42)评价了A.indica的不同提取物的抗真菌活性。来自该植物的种子的油提取物和水和乙醇的叶提取物有效地减少培养物中宫部旋孢霉(Cochliobolus miyabeanus)的放射状生长并且控制稻中的褐斑病扩散。
·Cruz等通过用裸花紫珠(Callicarpa acuminate)的水浸出液处理大豆、玉米和番茄根进行了定向于鉴定植物提取物中的生物刺激特性的研究(2002，Acta Horticulturae 569：235-238)。裸花紫珠的水提取物抑制番茄的胚根生长，但对玉米或大豆的根生长无作用。
·按照Singh等所述(2001，Journal of Crop Production 4：121)，分离自某些植物的异种化感物在高浓度下表现出强的生物-除草剂活性，但在低浓度下，这些提取物可以促进农作物种子萌发和幼苗生长，由此表现出适合于作为农业中的生物刺激剂或生长促进物质的潜能。
·来自某些苜蓿栽培品种的提取物在种子萌发以及根和下胚轴生长方面具有刺激作用，而其它的则表现出直接相反的作用，从而证实农作物植物也可以受到目的在于控制杂草生长的植物提取物的影响(Tran和Tsuzuki，2002 Journal of Agronomy and Crop Science188：2-7)。
·Leksomboon等(2001，Kasetsart Journal，Natural Sciences35：392-396)证实了玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、番石榴(Psidiumguajava)、石榴(Punica granatum)、槟榔青(Spondias pinnata)和酸豆(Tamarindus indica)的叶和其它部分的水提取物在实验室和田间条件下对地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)，即柑桔溃疡病原体的抗菌作用。
·已经研发了另一种来源于莳萝和藏茴香籽的天然产物香芹酮，它抑制贮存病原体的生长并且抑制仓库中马铃薯的萌发(Moezelaar等，1999，In：Modern fungicides and antifungal compounds II；Intercept Limited，p.453-467)。香芹酮目前作为Talent在荷兰销售。
·在欧洲专利EP 1 051 075中，描述了Pink科物种和Alfalfa种的联用制剂(ComCat)，它展示出特定比例下的协同生物刺激作用。ComCat已经在可利用营养物在处理的植物利用中显示出一致性的植物生长促进和生理功效。促进蔬菜、花和农作物健康的ComCat并非肥料替代品，而是刺激植物更适当地利用可利用的营养物的生物促进剂。此外，它活化并且诱导处理植物中的异种化感和病害抗性并且刺激更多糖类的产生，而这些糖属于纤维素和子实体的结构单元。结果是产生具有更强植物茎、开花更好且果实生物量更大的更多产的更健康植物(Agraforum：Germany，2002，Technical data sheet)。
发明概述
本发明提供了基于百子莲属物种，优选百子莲(Agapanthusaficanus)的提取物和制剂，它们甚至在田间和温室条件下也可在体外和体内引起显著的抗微生物，优选抗真菌活性。此外，这些提取物引起显著的生物刺激活性，尤其是表现为生长代谢增加。来自植物地上部分的提取物或制剂表现出比植物土壤部分的更高功效。此外，来自植物合并的地上部分(花、叶、茎(stalks))的提取物或制剂表现出比来自地上部分单一成分的提取物或制剂总和更高的抗真菌和生物刺激功效，从而表明协同作用参与了涉及的生物过程。此外，来自百子莲属物种和Tulbaghia violacea种的合并的提取物或制剂表现出比所述单一物种的提取物或制剂更高的抗真菌和生物刺激功效并且做出了存在协同过程的推定。
本发明还提供了不同植物种的提取物或制剂的组合的组合物。这些组合包含来自百子莲属种，优选百子莲，和其它植物种，优选大蒜种，最优选来自Tulbaghia violacea(野生大蒜)的制剂。或者，按照本发明，将来自百子莲属种的制剂与Pink科种和Alfalfa种的混合物制剂，优选以特定比例，合并。在本发明的另一个实施方案中提供了百子莲属种与Tulbaghia violacea以及Pink科种和Alfalfa种的混合物的组合。这些组合引起了比相应单一成分制剂增加的和协同的植物保护活性，优选抗真菌和生物刺激活性。
本发明最后提供了分离和纯化自所述提取物/制剂的至少四种化合物，它们在体外和体内施用于其它植物(包括田间栽培)时也表现出显著的植物保护活性，尤其是抗真菌活性。这四种化合物为：3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元(agapathegenin)；5，7，4′三-O-黄烷酮；5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮；和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。
根据生产方法的不同，可以将本发明的制剂制成粗提取物或干粉。这些制剂还可以包含本领域状态中的固体，优选粉状，填充剂或载体物质，尤其是用于田间栽培的。此外，本发明的制剂可以包含增加或调节该制剂作用的常规添加剂。
还可以将本发明的制剂制成液体，优选含水形式，它可以作为喷雾剂使用且由此可易于在栽培中的区域中喷雾。在这类溶液或混悬液中，本发明的提取物和制剂在0.25g(提取物/粉末)/升-2g/升，优选0.5g/升-1g/升的浓度范围内显示出其完全的植物保护活性。就这些制剂的抗真菌活性而言，术语″完全的植物保护活性″意指与标准参比农药相比100％抑制典型真菌性植物病原体的菌丝体生长。
本发明还提供了基于使用有机极性溶剂，诸如甲醇或乙醇或其混合物，提取植物或植物部分，制备粗提取物和干粉制剂的方法。
本发明最后提供了分离，纯化和鉴定来自所述提取物的物质的方法，所述的物质在体外和体内对患病植物表现出显著的抗真菌和生物刺激活性。
更具体地说，本发明提供了
●适合于生物学植物保护的基于来自百子莲属，优选百子莲(A.africanus)种的植物或植物部分的粗提取物形式的制剂，其中该制剂可通过下列工艺步骤获得：
(i)在优选30-40℃下干燥植物材料，优选避开日光；
(ii)将干燥的植物材料研磨成0.2-2mm粒度大小(gritsize)；
(iii)将研磨的材料浸入选自甲醇和乙醇的极性有机溶剂中，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；
(v)将步骤(iii)和(iv)重复至少额外-次，优选两次；
(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且优选通过在30-40℃下真空蒸发，除去有机溶剂，由此获得粗的提取物残余物。
●或者，干粉形式的相应制剂，可通过下列步骤获得：
(i)在优选30-40℃下干燥植物材料，优选避开日光；
(ii)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；
(iii)将研磨的材料浸入甲醇或乙醇，优选甲醇中，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取；
(v)在不预先将可溶性有机相与固相分离的情况下蒸发溶剂；
(vi)将蒸发后的固相残余物浸入乙醇或甲醇，优选乙醇中并且重复步骤(iv)和(v)；和
(vii)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉。
●相应的制剂，其中使用植物的不同地上部分(花、叶、茎)的一种或多种，优选花。
●相应的制剂，其中使用合并的地上部分(花+叶+茎)；该制剂与百子莲属地上部分中的单一成分的全部作用相比表现出额外的(协同)作用。
●相应的制剂，其中使用土壤植物部分。
●相应的制剂，包含：
3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元；和/或
5，7，4′三-O-黄烷酮和/或5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮和/或反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。
●相应的制剂，包含：
3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元和5，7，4′三-O-黄烷酮和5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。
●相应的制剂，进一步包含固体、粉状的载体物质或填充剂和/或增加或调节该制剂作用的添加剂。
●相应的制剂，为含水溶液或混悬液形式，可易于将其喷雾和分布在栽培条件下的田地和区域上，其中栽培了所保护的植物。
●相应的制剂，其中粗提取物或干粉的浓度在0.25g/升-2g/升，优选0.5g/升-1g/升。
●组合物，包含如上述指定的第一种植物制剂和粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液形式的第二种植物制剂，其中所述的第二种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥额外的，或者乃至协同的植物保护作用。
●相应的组合物，包含来源于大蒜种，优选Tulbaghia violacea的制剂作为第二种植物制剂，其中所述的第二种制剂通过与所述第一种制剂类似的工艺步骤获得。
●相应的组合物，包含来源于Pink科物种和Alfalfa种的混合物的制剂作为第二种植物制剂，其中优选干燥的Pink种材料的重量比为80-99％，并且所述的第二种植物制剂通过与所述第一种植物制剂类似的工艺步骤获得。
●组合物，包含：(i)所述的第一种植物制剂；(ii)所述的第二种植物制剂；和(iii)来源于Pink科物种和Alfalfa种的混合物的第三种植物制剂，其中优选干燥的Pink种材料的重量比为80-99％，其中每种制剂为粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液的形式，并且所述的第二种和第三种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥额外的植物保护作用。
●如上所述的制剂/组合物作为生物学植物保护剂的应用。
●如所述的制剂/组合物的应用，其中所述的生物学植物保护剂为抗微生物剂，优选抗真菌剂，优选抑制或降低真菌的菌丝体生长并且能够预防田间条件中真菌对植物，优选农作物的感染。
●如上所述的制剂/组合物作为发挥生长诱导作用的生物刺激剂的应用。
●如上所述的制剂/组合物作为生物刺激剂的应用，所述的生物刺激剂可诱导用该活性剂处理的植物或植物部分中的系统性获得抗性(SAR)。
●相应的应用，其中所施用的百子莲属制剂来源于百子莲属合并的地上部分。
●相应的应用，其中所述制剂的活性或功效高于基于百子莲属地上部分的相应单一成分的制剂的活性或功效总和。
●由百子莲属制备如上所述的粗提取物或干粉制剂或其含水混悬液或溶液的方法，包含下列步骤：
(i)在30-40℃下干燥来自百子莲属的植物材料，优选避开日光；
(ii)将干燥的植物材料研磨成0.1-3mm粒度大小，优选0.2-2mm；
(iii)将研磨的材料浸入极性有机溶剂，诸如甲醇或乙醇，优选90-10％甲醇或乙醇或其混合物，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；
(v)将步骤(iii)和(iv)重复至少额外一次，优选两次；
(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且通过优选在30-40℃下真空蒸发，除去有机溶剂，由此获得粗的提取物残余物；
并且就含水制剂的制备而言：
(vii)将所得粗提取物以适宜的浓度，优选0.1g/升-2g/升，更优选0.5g/升-1g/升悬浮于水中。
(式I的化合物：
Figure S200680023742XD00111
其中R＝H或乙酰基。
(相应的化合物，分离自如所述的制剂，其中所述的化合物为3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元。
(适合于生物学植物保护的相应组合物，包含式I的化合物，或更具体地说包含3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元和至少一种选自5，7，4′三-O-黄烷酮、5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮的黄酮类化合物。
(所述分离的化合物/组合物作为植物保护剂的应用，其中所述的植物保护剂优选为抑制真菌菌丝体生长的抗真菌剂。
(制备如上所述来源于百子莲属的粗提取物或干粉制剂或其含水混悬液或溶液的备选方法，包含下列步骤：
(ia)在优选30-40℃下干燥来自百子莲属的植物材料，优选避开日光；
(iia)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；
(iiia)使用1.0-3.0ml/g干重的研磨植物材料，将研磨的材料浸入第一种极性有机溶剂，优选90-100％甲醇，由此形成混悬液/溶液；
(iva)对所述的混悬液进行搅拌提取；
(va)在不预先将可溶性有机相与固相分离的情况下蒸发溶剂；
(via)使用1.0-3.0ml/g干重的研磨植物材料，将蒸发后的固相残余物浸入第二种极性有机溶剂，优选90-10％乙醇，并且重复步骤(iva)和(va)；
(viia)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉；
并且就含水制剂的制备而言：
(viii)将所得干粉以适宜浓度，优选如上所示的范围，悬浮/溶于水中。
发明详述
(A)一般定义
使用的上述和下述术语和表达方式按照本发明的理解具有如下含义：
除非另作陈述，否则术语″植物保护剂″或″植物防护剂″意指在广泛意义上对于植物防御体外和/或体内病原体感染和损害及植物健康有效的任意类型的合成或天然活性剂，产物，提取物，组合物。该术语包括可以表现出几种不同生物活性和/或特性的活性剂，产物，提取物，组合物或单一分离的提取物成分，所述的不同生物活性和/或特性诸如抗微生物、抗病毒、抗真菌和生物刺激活性/功效，生长诱导/促进活性(对于待被保护的植物而言)；生长抑制剂活性(就与被保护的植物竞争的植物而言)；诱导/促进系统性和/或免疫学获得性抗性的活性；和异种化感诱导/促进活性。
除非另作陈述，否则本发明的术语″生物学植物保护″意指植物的保护通过优选来自植物的天然存在或天然来源的物质或来源实现并且不通过合成或化学方式或活性剂(它们在自然界优选植物或植物部分中不存在)实现。
术语″生物学植物保护(防护)剂″因此为植物提取物、植物制剂、基于植物或其部分的组合物或从植物提取物/制剂/组合物分离的活性剂，它们在体外和/或体内均表现出对植物病原体的显著功效。该术语还包括在结构和功能上与分离的天然来源的化合物相同的化学合成的化合物，但明确不包括不具有天然来源的对应物的化学合成的农药和相关化合物。
除非另作陈述，否则本发明的术语″农药″意指非天然来源或存在的具有植物保护功效的合成化合物，活性剂或组合物。
术语″植物病原体″意指导致植物病害或损害的化合物或组合物或活物质，诸如微生物(包括病毒)。在本发明的一个较窄的范围中，该术语集中在致病微生物，包括这些微生物的代谢产物。
本发明的术语″抗微生物″包括对微生物，包括病毒、细菌和真菌的功效或活性，这种功效或活性可体外和/或体内减少或消除攻击被保护的植物或其部分的活动微生物的(相对)数量。因此，该术语包括术语″抗病毒″、″抗细菌″和″抗真菌″。本发明的″抗微生物剂″为如上述指定的生物学植物保护剂，它防止或减少因致病微生物导致的植物感染或损害。
本发明的术语″抗细菌″意指减少或消除活细菌(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗细菌剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病细菌导致的植物感染或损害。
本发明的术语″抗病毒″意指减少或消除活动病毒(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗病毒剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病病毒导致的植物感染或损害。
本发明的术语″抗真菌″意指减少或消除活动真菌(相对)数量的活性或功效(例如活性剂或提取物等的)。本发明的″抗真菌剂″为如上述说明的生物学植物保护剂，它可体外和/或体内防止或减少因致病真菌导致的植物感染或损害。这种抗真菌活性可以导致菌丝体生长和真菌孢子萌发的抑制。
除非另作陈述，否则本发明的术语″生物刺激″意指刺激，增加或改善植物或植物部分中的许多不同过程的活性或功效，诸如改善的生长促进物质，如糖类和氨基酸的产生，改善的可利用营养物和生长调节剂向细胞的充足供给，强化的细胞代谢，改善的细胞净化，强化的免疫防御，生长和产量的提高，诱导系统性获得性抗性(SAR)，竞争性植物的生长和产量的抑制(异种化感)。生物刺激活性可以由包括植物合成的代谢化合物的活性剂、植物提取物和组合物导致，其中在所述生物刺激剂诱导该代谢化合物合成后所述植物得到保护。本发明的″生物刺激剂″为如上述的生物学植物保护剂，它在用该活性剂在体外和/或体内处理的植物中表现出上述的生物刺激特性。
″植物生长调节剂″为天然或合成的可以改变或控制植物中一种或多种特定生理学过程的化合物或物质混合物。如果该化合物在植物内产生，那么其称作植物激素，例如植物生长激素、赤霉素、脱落酸和乙烯。
″SAR″(系统性获得抗性)可以出现在本发明植物或其部分中，只要它表现出对与防御或保护相关的酶(PR-蛋白)的活性的诱导或促进。这类酶包括：例如过氧化物酶、β-1，3-葡聚糖酶(glucanse)和NADPH氧化酶。
(B)植物描述
百子莲属原产于南非。对其分布的研究表明百子莲属的常绿植物种类野生于从西南Cape向东至Natal和更远的北方。它也生长在欧洲、美国、澳大利亚、新西兰和南美。
百子莲在分类学上的地位为：
门：木兰植物门(Magnoliophyta)
纲：百合纲(Liliopsida)
亚纲：百合亚纲(Lilidae)
科：石蒜科(Amaryllidaceae)
亚科：百合亚科(Lilidaceae)
属：百子莲属(Agapanthus)
种：百子莲(Agapanthus africanus，A.umbelattus)
按照花的类型可以将百子莲属(L.)Hoffmg(葱科(Alliaceae))分成两组，它们为：具有带短花被管及分布得很开的花被片的花的那些；和具有带长花被管及未分布得很开的花被片的花的那些。该属有时也被分成常绿或落叶类型。百子莲(异名A.umbellatus)为具有约60cm长的花梗和深蓝色花且向下至每一花瓣中心有更深色条纹的常绿植物。它生至30-60cm高并且具有比亚种A.praecox(prientalis)短、少且更具革质的叶。它还具有比A.praecox少得多的花，通常约12-18朵，长在较小的花头上而且其花为12月到3月的花。还存在罕有的白色形式A.walshii。
可以栽培百子莲。它是具有大根系的多年生植物，所述的大根系能够使得它在无水的情况下长期生长。由于根的体积可以随季节的改变增加并且自发产生新的植物，故根还可以用于繁殖植物作为一种栽培手段。最终该植物开始过于繁茂。由于这一原因，每隔几年就应将它们形成的簇分开并移栽。百子莲可以在任意类型的土壤中生长。为了在贫瘠的土壤中获得良好的效果，有必要准备约30-45cm深的渠沟并且掺入堆肥和粪肥。尽管植物耐受干旱，但是如果在花形成的高峰期时的春季和夏季中定期浇水，那么花开得更好。
(C)微生物
选择6种常见南非植物真菌病原体测试植物提取物的毒真菌特性。这些真菌病原体包括灰色葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.Fr.)(丝孢纲(Hyphomycetes))、尖孢镰胞(Fusarium oxysporumSchlechtend.Fr.)(丝孢纲)、整齐小核菌(Sclerotinia rollfsiiSacc.)(无孢纲(Agonomycetes))、茄属丝核菌(Rhizoctonia solaniKbhn)(无孢纲)、疖葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.Fr.)Ces.&De Not.)腔菌纲((Loculoascomycetes))和终极腐霉(Pythium ultimum Trow)(卵菌纲(Oцmycetes))。用于本研究的植物致病细菌包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens Smith和Townsend)、Clavibacter michiganense Spieckermann pv.michiganense Smith、Erwinia carotovora pv.carotovora Jones、Xanthomonas campestris Pammel pv.phaseoli Smith、Ralstoniasolanacearum Smith和人细菌粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatharrhalis)。
(D)来自百子莲的粗提取物在体外抗微生物和生物刺激活性中的筛选
(1)一般描述
基于对6种植物致病真菌，6种植物致病细菌和1种人细菌的抵抗作用，体外筛选百子莲的不同植物部分的粗提取物(参见下文。更具体地如实施例中所述，干燥植物部分，研磨并且优选用甲醇提取。在另一种方法中，测试包含来自百子莲的提取物/干粉与分开地由野蒜(Tulbaghia violacea)产生的提取物的制品的植物保护活性。
将标准化学品多菌灵/苯醚甲环唑(Difenoconazole)用作阳性对照。使用平板扩散法进行活性筛选。为了测定粗提取物的生物刺激活性，应用两种方法。首先，使用专门生产的呼吸测定计测定提取物对单一培养的酵母细胞的呼吸速率的作用。第二，将萝卜种子用于确定粗提取物对种子萌发以及幼苗中根和胚芽鞘生长的影响。在两种技术中，将商购生物刺激剂(EP 1051075)ComCat用作阳性对照。
(2)百子莲粗提取物的抗微生物特性
与用作阳性对照的标准杀真菌剂相比，百子莲的所有不同植物部分的粗甲醇提取物在体外均以1mg/ml的浓度显著(P＜0.05)抑制所有测试真菌的菌丝体生长(附图1)。
根提取物在体外完全抑制灰色葡萄孢、整齐小核菌、茄属丝核菌和疖葡萄座腔菌的菌丝体生长并且表现出对尖孢镰胞(77％)和终极腐霉(64％)具有一定程度的控制作用。叶的粗提取物表现出对整齐小核菌、茄属丝核菌(附图1)和疖葡萄座腔菌具有类似抑制作用，对灰色葡萄孢(97％)和尖孢镰胞(73％)具有稍低的抑制作用，而对终极腐霉与根提取物等同有效(附图1)。来自茎的提取物也完全抑制整齐小核菌和疖葡萄座腔菌的菌丝体生长，但对灰色葡萄孢(87％)和尖孢镰胞(73％)的有效性稍降低(附图1)。
概括而言，基于体外结果对来自百子莲的粗提取物的内在潜能的预先评价表明灰色葡萄孢、整齐小核菌和疖葡萄座腔菌对使用来自所有植物部分的提取物进行的处理最为敏感。终极腐霉更耐受使用这些粗提取物进行的处理。(表1)。
表1：来自百子莲不同器官的粗提取物的体外抗真菌活性
植物提取物   植物器官   不同真菌的菌丝体生长抑制％
  灰色葡萄孢   尖孢镰胞   整齐小核菌   茄属丝核菌   疖葡萄座腔菌     终极腐霉
植物X     根     100a±0   75c±4   100a±0   100a±0     100a±0     63d±2
    叶     94ab±2   71c±2   100a±0   94ab±3     100a±0     64d±3
    茎     90b±3   74c±2   100a±0   99a±1     100a±0     63d±2
    花     98a±2   78c±5   100a±0   100a±0     100a±0     60d±4
    *标准品     100a±0   50e±2   51e±3   52e±2     67d±5     7f±2
花和地上部分粗提取物也表现出对所有测试真菌具有几乎相同的抑制作用，对其它粗提取物而言，情况也是如此(附图1)。然而，在分别测试时，地上部分粗提取物比其它植物部分提取物更有效地抑制终极腐霉的菌丝体生长(79％)(附图1)。在所有情况中，这些粗提取物执行的效果超过了标准杀真菌剂。然而，这些提取物中无一种表现出对任何测试的植物致病细菌的抗细菌活性。
(3)百子莲粗提取物的生物刺激特性
为了确立百子莲植物部分的粗提取物是否具有内在生物刺激活性，首先在3小时期限内在体外测定其对单一培养的酵母细胞的呼吸速率的作用。与水和阳性对照相比(ComCat)，当分开测试不同植物部分的提取物时，观察到了类似的呼吸速率(附图2)。然而，地上部分的粗提取物在前2小时显著增加了酵母细胞的呼吸速率(附图2)。
随后测定粗提取物对萝卜种子萌发与幼苗生长的体内作用。与水对照品相比，花、花柄、叶的粗提取物和地上部分粗提取物使种子萌发显著(P＜0.05)增加，分别为21％、18％、16％和6％(表2)。尽管大部分提取物看起来在体外对萝卜种子萌发具有刺激作用，但是仅叶和花提取物表现出对幼苗根生长的显著刺激作用。另一方面，根、花柄和地上部分粗提取物比水对照品显著抑制根生长(表2)。
表2来自百子莲不同植物部分的粗提取物对萝卜种子萌发和幼苗生长的作用
    植物提取物     萌发(％)     根长(mm)     胚芽鞘长(mm)
    根     62.67±10c     30.62±15.50d     24.01±7.69bc
    叶     71.33±11.5ab     43.14±13.61a     24.64±4.12abc
    花柄     72.67±5.78a     38.40±8.78bc     26.40±4.05ab
    花     74.78±5.96a     43.09±9.5a     26.71±3.07a
    地上部分     65.22±4.56bc     35.81±7.29c     23.07±2.37c
    Comcat     63.11±3.45c     40.31±7.96ab     22.12±2.37c
    水(蒸馏)     61.67±2.37c     41.06±7.46ab     23.10±2.33c
栏内使用不同字母命名的值表示按照邓肯氏复极差程序在5％水平(P＜0.05)下的显著性差异。
花柄和花提取物比水对照品显著增加了萝卜幼苗的胚芽鞘生长。用作阳性对照的商购生物刺激剂GomCat对种子萌发或幼苗生长没有显著作用。
(4)百子莲粗提取物与来自Tulbaghia violacea的提取物联用的抗 真菌特性
按照与本文对百子莲属种类所述类似的方法制备野生蒜(Tulbaghia violacea)的粗提取物或干粉。按照1∶1的比例混合提取物或干粉并且以0.25mg/ml至2mg/ml的不同浓度施用水溶液。
有意义的是注意到以0.5mg/ml施用的两种提取物的50∶50混合物表现出对6种测试真菌的完全控制作用(表3)，而迄今为止与之相比，单独施用2-倍浓度(1mg/ml)的百子莲制品或Tulbaghiaviolacea制品对测试真菌的菌丝体生长的抑制作用并不完全。甚至0.25mg/ml浓度的联合提取物/干粉制品(1∶1)也可以导致对相同真菌系统的全面抑制作用，高于90％，从而表明了在该联用系统中实际存在着显著的协同作用。使用其它植物保护剂可观察到相同的作用。表3：以0.5mg/ml施用的、按1∶1的比率共同使用的来自百子莲(X)和Tulbaghia violacea(Y)的地上部分的粗提取物的体外抗真菌活性
  提取物混合物(50∶50) 植物材料 不同真菌的菌丝体生长抑制％
  真菌 灰色葡萄孢 尖孢镰胞 整齐小核菌 茄属丝核菌 疖葡萄座腔菌   终极腐霉
  植物X+植物Y(50∶50) 地上部分 100a±0 100a±0 100a±0 100a±0 100a±0   100a±2
标准品 100a±0 70c±3 68c±4 38±2  87bc±3   4f±1
标准广谱杀真菌剂；多菌灵/苯醚甲环唑(Eria)
数值后的不同字母表示统计学显著性差异
(5)概述结果
结果表明来自百子莲的植物提取物中无一表现出任何抗细菌活性。然而，百子莲的所有不同植物部分的粗提取物或干粉显著(P＜0.05)抑制所有测试真菌中的菌丝体生长和孢子萌发，从而说明了本发明制剂的强抗真菌活性。根和花提取物和地上部分粗提取物的提取物表现出显著高于来自叶和茎的提取物的抗真菌活性。在测试真菌中，终极腐霉和尖孢镰胞(程度较低)表现出对所有提取物具有一定程度的耐受性。鉴于经验认为杀真菌剂的菌丝体生长抑制作用比抑制孢子萌发更难以实现，故这一结果尤其是有意义的。植物提取物对测试真菌的平均抑制作用在59-100％的范围。其中地上部分粗提取物(合并叶、茎和花)最高(92％)，从而强调了该提取物的广谱杀真菌潜能。此外，这种合并的提取物所显示的有效抗真菌活性表明了不同活性物质的协同作用并且支持了生物活性化合物在不同植物器官中差别蓄积的推定。来自百子莲的地上部分粗提取物的提取物和花的提取物显著提高了单一培养的酵母细胞的呼吸速率，并且所有植物部分的提取物均促进了萝卜种子萌发，由此表明体外生物刺激活性是有效的。地上部分粗提取物与单独的植物部分提取物以及水对照品和阳性对照ComCat相比实质性地增加了单一培养的酵母细胞的呼吸速率。在分开测试不同的植物部分提取物时，未观察到相同的作用。百子莲的所有不同植物部分的粗提取物以及地上部分的粗提取物均增加了萝卜种子的萌发百分比，从而表明了刺激作用。可能的情况是，粗提取物中包含的一种或多种活性物质可以对呼吸酶中的一种或多种，最可能的是调节酶，或乃至对储存物质的动员具有刺激作用。基于来自具有植物保护特性的两种或多种植物的制剂的合并的提取物/干粉(其中至少一种植物为百子莲属的物种)表现出至少体外基于协同作用的超广谱抗真菌功效和生物刺激功效。
(E)来自百子莲属的制剂的体内抗微生物作用和生物刺激作用
(I)概述
豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes(Berk& Blox.)Vesterger.)为紫花豌豆(豌豆(Pisum sativum L))产量的主要束缚并且在全世界中的紫花豌豆生长区中是最具毁坏性的和广泛的病害。豌豆植物的所有地上部分都易受感染，而生长、产量和种子质量均受到不良影响。该真菌在豌豆幼苗出现时感染幼苗，导致环绕茎的损伤，从而削减紫花豌豆群体和增加倒伏。随后，它还导致小叶和托叶上的坏死性损害和在罕见情况下造成小叶脱落。豌豆球腔菌在整个季节中通过器孢子扩散。在孢子萌发后，真菌生长超过了植物表面一定距离，此后形成apersorium并且穿透角质膜。症状的特征在于在地上组织上的棕色至紫色融合性损伤。随后在温室条件下针对豌豆球腔菌，即豌豆中的黑斑病(black spot或Ascochyta blight)的病因，测试花、根、叶和地上植物部分的粗提取物。从4周龄的豌豆植物中取下第四节间叶。放在培养皿中的湿润滤纸上并且在使用所述提取物处理之前和之后30分钟接种豌豆球腔菌孢子混悬液。基于20℃下人工生长箱内6天期的损伤大小，测量来自百子莲不同植物部分的不同浓度的粗提取物对黑斑病的控制作用。
(2)在温室条件下百子莲属制剂的体内抗真菌活性
在使用在植物提取物处理之前或之后接种了豌豆球腔菌孢子的豌豆叶进行的体内筛选抗真菌试验中，在孢子接种前施用百子莲提取物时，该提取物以接近1mg/ml的浓度完全抑制了豌豆球腔菌的孢子萌发。这表明对农作物施用百子莲作为预防措施在农业中具有潜能。
表4：来自百子莲地上部分的粗提取物对豌豆叶上的豌豆球腔菌的体内抗真菌活性
 处理     提取物浓度     平均损伤大小(mm)     抑制％
 首先在叶上 喷雾提取物并且在30分钟后接种孢子     2mg ml-11mg ml-10.5mg ml-10.25mg ml-1*杀真菌剂标准品仅孢子     002.374.07012.8     100％100％81％68％100％-
 首先给叶接种孢子并且在30分钟后将提取物喷雾在叶上     2mg ml-11mg ml-10.5mg ml-10.25mg ml-1*杀真菌剂标准品仅孢子     00.263.85.29012.8     100％98％70％59％100％-
*标准广谱杀真菌剂多菌灵/苯醚甲环唑(Eria)
在接种豌豆球腔菌孢子前和之后，使用百子莲不同植物部分的粗提取物处理离脱的豌豆叶均导致提取物、提取物浓度和接种方法之间在抑制损伤发展方面存在显著性差异(表4)。在提取物中，地上植物部分提取物最有效地抑制在离脱的豌豆叶上由豌豆球腔菌导致的损害发展，尤其是在孢子接种前施用时。地上植物部分提取物也比其它提取物以最低浓度(MIC＝0.5mg/ml)有效。当在孢子接种后施用该提取物时，对豌豆叶上损害发展的抑制与其它提取物相比也具有统计学显著性，不过，仅使用2mg/ml最高浓度时观察到完全抑制(表4)。
比较而言，花提取物在接种前或之后施用时在抑制损害发展方面为第二最佳(MIC为1-2mg/ml)。根提取物在接种前施用时仅在2mg/ml浓度下完全抑制损害发展。尽管在孢子接种后施用时使用2mg/ml浓度未观察到对损害发展的完全抑制，但是除在0.25mg/ml下外，抑制程度与未处理的对照组相比均具有统计学显著性(表4)。在孢子接种前和之后施用时，叶提取物均无法完全抑制损害发展，但在两种情况中，除在0.25mg/mg下外，获得的抑制程度均比未处理的对照组显著(表4)。
百子莲不同植物部分的粗提取物在体内对离脱的豌豆叶上的损害发展抑制到根据施用浓度和接种时间的不同而改变的可变程度。其中在给离脱的豌豆叶接种豌豆球腔菌孢子前和之后施用时，与其它植物部分提取物相比，地上部分粗提取物在所有测试浓度水平下均最有效。花提取物在相对低浓度下也表现出对损害发展的显著抑制作用。当地上植物部分提取物包含来自花、花柄和叶的化合物时，不排除包含在不同部分中的不同活性物质在抑制孢子萌发或菌丝体感染或它们两者中表现出的协同作用的可能性。考虑到标准杀真菌剂不能做到，在给离脱的豌豆叶接种后施用时地上植物提取物和花提取物完全抑制损害发展的能力尤其有意义。
使用根和叶提取物处理离脱的豌豆叶在孢子接种前和之后施用时在较低浓度下对预防豌豆球腔菌感染的有效性低于地上植物部分和花的提取物。使用低于1.0mg/ml的浓度的根和叶提取物处理的豌豆叶上测量的坏死损害与在仅接种孢子的对照组叶上测量的坏死损害类似。然而，当在孢子接种前施用于离脱的豌豆叶时，两种提取物仍然表现出对损害发展的显著抑制作用。有意义的是，叶构成其最大部分的地上植物部分提取物自始至终表现得最佳。花、花柄和叶中包含的化合物之间在提高百子莲杀真菌特性中可能的协同作用再次得以推定。就由百子莲研发天然产物的可能性而言，根提取物的有效性低于地上植物部分提取物这一事实强调了其排他作用并且意味着无毁坏性的收获。本研究证实，尤其是百子莲地上植物部分的合并的粗提取物在0.5mg/ml和0.5mg/ml以下浓度下具有作为对豌豆球腔菌孢子感染豌豆植物的预防或矫正措施应用的潜能。强烈指示，该提取物具有作为矫正性广谱抗真菌剂的显著潜能。结论为，百子莲的不同植物部分提取物在抑制体内由豌豆球腔菌导致的离脱豌豆叶上损害发展中的功效可变。尤其是在孢子接种前施用和0.5mg/ml的相对低浓度下，地上植物部分提取物最为有效。然而，在接种豌豆球腔菌后以较高浓度施用表现出对孢子萌发或感染或它们两者的完全抑制。重要的是，这些提取物甚至在最高施用浓度下也无一在离脱的豌豆叶上产生毒害植物的黄化或坏死。
(3)在温室条件下来自百子莲的制剂对豌豆叶的毒害植物作用
百子莲的地上植物部分、花、根和叶的粗提取物在其与豌豆叶相互作用和诱导豌豆叶坏死的潜能方面的体内植物毒性等级揭示出粗提取物甚至在最高测试浓度下也无毒害植物作用(表5a，b)，并且所述提取物的无症状作用与水和标准杀真菌剂对照品的无症状作用类似。百子莲的所有植物部分提取物以及标准杀真菌剂对照品与豌豆球腔菌孢子混悬液诱导的叶坏死明显不同。
表5a.在6个等级的评分法中，使用最高浓度的百子莲粗的地上植物部分、花、根和叶直接接种第四结节豌豆小叶后的平均叶植物毒性症状等级。平均叶植物毒性症状
    作为叶处理施用的植物提取物     2mg/ml的浓度
    地上植物部分     0.0b
    花     0.0b
    根     0.0b
    叶     0.0b
    标准杀真菌剂     0.0b
    孢子混悬液     4.2±0.8a
表5b：来自百子莲植物的粗提取物对豌豆叶的毒害植物作用
    处理     提取物浓度   表示植物毒性的平均损害大小(mm)
    仅粗提取物     2mg ml-11mg ml-10.5mg ml-10.25mg ml-1   0000
百子莲的不同植物部分提取物中甚至在最高施用浓度下也无一表现出对离脱的豌豆叶的任何毒害植物作用。
(4)在田间条件下百子莲的地上部分粗提取物对高梁坚黑穗病和散黑 粉病的控制
高梁(两色蜀黍(Sorghum bicolor L.Moench))是许多非发达国家中的重要食物来源并且用作大部分人的主食。它在广泛环境条件下主要生长在小规模生产系统中。然而，由于各种原因，高梁的产率低于1.0吨/ha。高梁坚黑穗病(covered kernel smuts)(Sporisoriumsorghi Link，G.P.Clinton)和散黑穗病(loose kernel smuts)(Sporisorium cruenta Kuhn，A.A.Potter)为引起产量低的主要因素。在高梁在未对这两种病原体处理种子情况下生长的地方两种病害频繁发生。在种植前，使用百子莲的地上部分粗提取物处理高梁种子比相应未处理的对照组完全(100％)(P＜0.05)减少了坚黑穗病(表6a)和散黑粉病(表6b)发病率，并且在两种情况中均比合成杀真菌剂塞仑(Thiram)有利。
表6a：百子莲的地上部分粗提取物对田间条件下坚黑穗病发病百分比的作用
处理     平均植物群体   平均坚黑穗病发病率％   产量(吨ha-1)
地上植物提取物     171±？a   0b   3.0a
塞仑     175a   0b   2.6ab
对照品     173a   5a   1.6b
表6b：百子莲的地上部分粗提取物对田间条件下散黑穗病发病百分比的作用
  处理     平均植物群体   平均散黑穗病发病率％   产率(吨ha-1)
  地上植物提取物     175±？a   0b   2.9a
  塞仑     175a   0b   2.1ab
  对照品     175a   18a   1.3b
按照邓肯氏最小显著性差异(LSD)统计学程序，使用不同字母命名的值显著不同(P＜0.05)。
使用坚黑穗病或散黑粉病孢子接种预种植的高梁种子，但还不使用塞仑或百子莲粗提取物处理种子(未处理的对照组)显著降低了最终的产率(表6a，b)。就坚黑穗病而言，产率损失为46.7％，而就散黑粉病而言为55.2％。然而，在两种情况中，在使用塞仑或百子莲粗提取物处理的地块之间在产率方面无显著性差异。可能因高标准偏差而导致在两种情况中，在塞仑处理的与未处理的对照组之间在产率方面未观察到显著性差异。
坚黑穗病和散黑粉病发病百分比与高梁谷粒产率成负相关(分别为R2＝-0.92和-75)，表明两种黑粉病对产率具有负面影响。
(5)百子莲对植物防御机制的作用(SAR)
在使用本发明的百子莲和另一种参比植物(Tulbaghia violacea)的提取物处理时，植物(例如小麦和向日葵)引起PR-蛋白，诸如NADPH氧化酶、过氧化物酶和β-1，3-葡聚糖酶显著活化。使用百子莲处理的小麦植物6小时后表现出NADPH氧化酶活性的强诱导，在先前采样期内在9小时时达到最高活性(112％)。保持高活性达48小时(附图4)。向日葵对使用百子莲提取物处理起反应，其含义是可以观察到NADPH氧化酶活性的两个峰。在处理后6小时达到第一个峰，活性在先前采样期内增加61％，而在处理后48小时达到第二个活性峰，在先前采样期内活性增加333％(附图5)。从这些结果中可以看出在C4植物小麦中，使用百子莲提取物处理的活性诱导比C3植物向日葵更为显著。使用百子莲提取物处理的小麦在处理后24小时表现出过氧化物酶活性的显著诱导(100％)并且这一活性在测试期得以维持(附图6)。就向日葵而言，百子莲提取物尤其是在48小时和96小时后显著诱导过氧化物酶活性(附图7)。就百子莲而言，48小时后诱导为212％并且在96小时后诱导为230％。然而，向日葵对照品在96小时期限内表现出过氧化物酶活性的轻度增加，表明存在一定的天然抗性。百子莲属提取物诱导了小麦和向日葵植物中的防御机制。这些提取物诱导局限性获得性抗性，通过基因活化蓄积PR-蛋白和最终的系统性获得性抗性。该提取物在小麦和向日葵样品中都诱导防御反应这一事实表明所述的提取物导致诱导一般性广谱防御反应。提取物诱导的与防御相关的酶活性增加程度较低，但与使用抗性栽培品种感染过程中获得的增加相当。
(F)从百子莲的根和地上植物部分提取物中分离、纯化和鉴定抗真菌 化合物
(1)一般说明
尽管有关百子莲不同植物部分的化学分析的信息极少，但是Takeda等进行了初步尝试(1955，Chemistry Abstract 50)，他们从根中分离并且鉴定了化合物丝兰皂甙元(yuccagenin)。使用几种未指定的百子莲属种类进行工作的其他人(Stephen，1956 JournalChemistry Society 1167.Mathew等，1957 Journal ChemistrySociety 262)报导了新的螺甾烷皂苷元，即百莲子皂甙元(agapanthagenin)。随后，除上述报导的化合物外，Gonzalez等(1973Phytochemistry 13：627-631)从百子莲的根系中分离并且鉴定了两种新的螺甾烷皂苷元。大部分先前的研究集中在从百子莲的根部分中分离和鉴定天然化合物上，但这些化合物与抗微生物活性之间的相关性尚未得到确立。此外，实际上对有关地上植物部分的化学组成及其杀真菌特性并无了解。
(2)根和地上植物部分的液-固提取物的抗微生物活性
通过液-固提取获得的百子莲不同植物部分的半纯化的级分在抑制尖孢镰胞(F.oxysporum)的菌丝体生长方面明显不同(表8)。乙醚中包含的根的半纯化提取物以及地上植物部分的乙酸乙酯和二氯甲烷提取物显著(P＜0.05)比己烷提取物抑制尖孢镰胞的菌丝体生长(表8)。与表现出类似抑制作用(51％)的乙酸乙酯和二氯甲烷级分相比，乙醚的根级分表现出最高抑制作用(62％)。就合并的地上植物部分提取物而言，乙酸乙酯和二氯甲烷半纯化液-固提取物最具活性并且完全抑制尖孢镰胞的菌丝体生长(表7)。这一结果与己烷和乙醚级分的抗真菌活性相比具有统计学显著性并且比标准杀真菌剂多菌灵/苯醚甲环唑有利。地上植物部分的半纯化级分对尖孢镰胞的菌丝体生长抑制作用也显著(P＜0.05)高于根的半纯化级分(表7)。
表7：百子莲的根和地上部分的半纯化液-固提取物对尖孢镰胞的抗真菌活性
    溶剂     菌丝体生长抑制(％)
    植物部分
    根     地上部分
    己烷     24.3d     5.4c
    乙醚     62.3b     13.7b
    乙酸乙酯     51.1c     100a
    二氯甲烷     51.3c     100a
    杀真菌剂     100a     100a
栏内使用不同字母命名的值表示按照邓肯氏复极差程序在5％水平(P＜0,05)下的统计学显著性差异。
表8中展示了根和地上植物部分液-固提取的收率。尽管其活性低，但是己烷溶剂系统提供了高量的根和地上植物部分的半纯化残余物，范围在约4.3-5.4％，而乙醚溶剂系统提供的来自根和地上植物部分的半纯化残余物分别约为3％和2％。乙酸乙酯溶剂系统在根和地上部分提取物中均产生了约为1％的残余物，而从二氯甲烷溶剂系统得到的收率在两种情况中均低于约1％。
表8：在35℃下干燥后通过使用一系列溶剂进行液-固提取从百子莲根和地上植物部分提取物中回收的残余物的产率。粗提取物的原始干质量如括号中所示。
    溶剂     粗的根提取物(268.5g)     粗的地上部分提取物(368.83g)
    己烷     14.5g     15.89g
    乙醚     7.6g     5.96g
    乙酸乙酯     3.09g     4.33g
    二氯甲烷     0.36g     0.45g
根的乙醚提取物以及地上部分的乙酸乙酯和二氯甲烷级分表现出对尖孢镰胞的最高(＞50％)抗真菌活性。然而，因为二氯甲烷级分中的化合物收率极低(表8)，仅为进一步活性定向的柱色谱分级分离选择地上部分的乙酸乙酯级分与根的乙醚级分。
(3)最具活性的液-固提取物的活性定向的柱色谱分级分离
在采集300个乙醚根提取物的柱色谱级分后，将每一第三个级分点在Q-TLC板上并且使用丁醇∶丙酮∶甲醇(7∶2∶1；v/v)展开以便获得用作合并具有类似特性的级分的指针的TLC分布。按照这种方式，可以从根提取物获得17个合并的柱级分其中9个对尖孢镰胞表现出高度菌丝体生长抑制作用(65-97％)(表9)。按照相同方式处理乙酸乙酯地上部分级分后，获得20个合并的柱色谱级分，其中6个在抑制尖孢镰胞菌丝体生长中具有超过50％的活性(表9)。
尽管9个合并的柱色谱根级分以625ug/ml(w/v)的相对低浓度表现出对尖孢镰胞的高度菌丝体生长抑制作用，但是仅级分13用于进一步通过制备型薄层色谱法(PTLC)纯化，这是因其它级分的收率极低所致。就地上植物部分而言，仅进一步纯化级分14，它以125 ug/ml(w/v)的低浓度表现出对测试生物体的完全菌丝体生长抑制作用(表9)。
表9：柱色谱后获自最具活性的根和地上植物部分液-固提取物的合并的级分对尖孢镰胞的抗真菌活性。仅显示最具活性的合并的柱色谱级分。
    植物部分     合并的柱级分编号   尖孢镰胞的菌丝体生长抑制％
    根     8     76
    9     67
    10     93
    11     97
    12     83
    13     83
    14     74
    16     65
    17     71
    地上植物部分     7     58
    8     60
    14     100
    17     57
    18     55
    19     53
(4)来自柱色谱级分通过制备型薄层色谱(PTLC)纯化活性化合物
在制备型薄层色谱法对获自根的编号第13的活性柱级分纯化后，可以回收12个纯化的P-TLC级分，其中级分9对尖孢镰胞最具活性(95％)(表10)。就获自地上部分的编号第14的活性柱级分而言，在使用丙酮洗涤后回收3个纯化的P-TLC级分，其中编号为1的级分表现出对尖孢镰胞的完全菌丝体生长抑制作用(表10)。
表10：获自根和地上植物部分的P-TLC级分对尖孢镰胞的抗真菌活性。
    P-TLC级分     对尖孢镰胞的菌丝体生长抑制(％)
    根的级分9     95
    地上植物部分的级分1     100
在通过在使这些分子乙酰化并且使用1N HCl酸化流动相后获得Q-TLC谱控制根和地上部分的最具活性的P-TLC级分的纯度后，根级分由4种化合物组成(表11)。通过酸化的P-TLC分离，纯化这4种化合物并且测试其抗真菌活性。所有4种化合物均为高度活性的。地上部分的活性P-TLC级分被证实仅包含1种纯的活性化合物(表11)。使所有5种纯化合物随后进行核磁共振(NMR)光谱测定以便阐明其分子结构。
表11：酸化后获自最具活性的P-TLC根和地上植物部分级分获得的纯化合物对尖孢镰胞的抗真菌活性。
    植物部分     化合物编号   对尖孢镰胞的菌丝体生长抑制(％)
    根     1     100
    7     87
    8     93
    9     97
    地上植物部分     1     100
(5)通过核磁共振(NMR)光谱对纯化自百子莲根和地上部分的活性化 合物的鉴定
基于1H NMR光谱，来源于百子莲合并的地上植物部分的单一抗真菌物质提供了新的化合物皂苷(1)。可以将完全相同的皂苷(1)鉴定为来源于百子莲根的4种活性化合物之一，另3种是已知的黄酮类化合物5，7，4′-三羟基黄烷酮(7)、5，7，3′4′-四-O-乙酰基黄烷酮(8)和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮(9)。可以通过光谱测定法(1D NMR和2D NMR)FAB和EI-MS光谱测定法和化学方法，诸如水解进行结构阐明。
(6)分离自百子莲的根和地上部分的皂苷(1)
来自百子莲的根和地上植物部分的甲醇提取物产生了相对大量的为淡棕色沉淀的化合物(1)。为了获得可接受水平的纯度，使用丙酮反复洗涤该级分。化合物(1)的这种性质和高度不溶性质(附图3A)总是导致大量损耗，从而限制了可靠的定量。由于非衍生的皂苷的1H NMR光谱的复杂性，所以将过乙酸酯衍生物(2)(附图3B)用于结构阐明。FAB-MS显示在m/z 448处的[M+H]+离子，这与具有448分子量的糖苷配基的分子式C27H44O5一致。
(7)黄酮类的分离和鉴定
此外，可以在乙酰化乙醚提取物的P-TLC色谱法第9个级分后从根中分离黄烷酮类(化合物7)和(化合物8)。这些化合物的特征为在其1H NMR光谱中存在3-CH2[(双峰中的两个双峰，д(3.00-3.15)和(2.70-2.85)]和2-H[(双峰中的双峰，д(5.00-6.00)]。
除分离自百子莲的根部分的皂苷配基化合物外，还鉴定了最频繁遇到的黄烷酮柚苷配基(5，7，4′-三羟基黄烷酮)。
Figure S200680023742XD00311
它通常为游离酚，以各种糖基化模式出现，已经分离了其所有可能的O-甲基化形式并且易于进行各种C-烷基化过程(Batterham等1964)。在乙酰化和P-TLC分离后可以将柚苷配基分离为5，7，4′-三-O-乙酰基衍生物(7)。
另外，可以在乙酰化和P-TLC分离后从根部分的第9号级分中分离5，7，3′4′-四-O-乙酰基黄烷酮(8)。
Figure S200680023742XD00312
此外，可以在乙酰化和P-TLC分离后从根的第9号级分中将另一种化合物反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮，即异甘草素分离为过乙酸酯衍生物(9)。在许多豆科植物中发现了该化合物(Roux等，1962，Biochemical Journal，82：324)。
Figure S200680023742XD00321
(8)讨论
随后使用柱和制备型薄层色谱法，随后通过核磁共振(NMR)光谱法和快速原子轰击(FAB-MS)仅对最具活性的级分进行的活性定向纯化揭示出普遍存在新的在约125ug/ml(100-150ug/ml)浓度下具有强抗真菌活性的皂苷(1)。另外，可以从百子莲根中纯化3种黄酮类化合物5，7，4′-三-O-黄烷酮(7)、5，7，3′4′-四-O-乙酰基黄烷酮(8)和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮(9)，它们在约625ug/ml(570-650ug/ml)浓度下表现出强的抗真菌活性。
通过使用己烷、乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷溶剂系统按照该逐步增加极性的顺序的固-液提取获得的百子莲根和地上部分的半纯化提取物在抗真菌活性方面可变。根的乙醚提取物在抑制用作活性定向纯化方案中的测试生物体的尖孢镰胞菌丝体生长方面最具活性，而地上部分的乙酸乙酯提取物最具活性。尽管己烷提取从根和地上部分中除去了大部分化合物，但是它在两种情况中的活性相差无几。
在有活性液-固提取物的柱分级分离后，Q-TLC谱显示在百子莲的根和地上植物部分中的化学成分不同，而后者提取物包含比较多的化合物。然而，可以从乙醚根提取物中分离4种活性化合物，而在乙酸乙酯地上部分提取物中仅可以检测到1种活性化合物。尽管在不同提取程序后地上部分中的活性物质数量较少，但是该级分在抑制测试真菌尖孢镰胞菌丝体生长方面更具活性。
可以通过1H-NMR和13C-NMR光谱法鉴定纯化自百子莲根和地上植物部分的化合物。主要分离自根和地上植物部分的主要化合物为带有在糖苷配基部分中环A的C3位置上连接的3个糖链的新类固醇皂苷。可以将该化合物鉴定为3-[O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元(agapanthegenin)。在先Stephen(1956)和Gonzalez等(1974)从百子莲的根系中分离了具有相同糖苷配基的C-3一糖基化皂苷。然而，在本研究中鉴定的皂苷在额外连接的3个糖链方面不同。带有3个连接的糖链的皂苷配基以散发性出现。另外，可以从百子莲的根中分离具有显著杀真菌活性的3种黄酮类化合物5，7，4′-三-O-黄烷酮、5，7，3′4′-四-O-乙酰基黄烷酮和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。每种纯化的黄酮类化合物各自对尖孢镰胞表现出显著的体外菌丝体生长抑制作用。
使用百子莲的不同植物部分的粗和半纯化提取物观察到的体外和体内抗真菌活性看起来与存在的主要化合物，即在所有植物部分中的类固醇皂苷，以及根系中存在的3种黄酮类化合物5，7，4′-三-O-黄烷酮、5，7，3′4′-四-O-乙酰基黄烷酮和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮相关。
总之，纯形式的所有4种化合物在体外抑制测试真菌菌丝体生长方面提供了可接受水平的功效并且具有用作体内整合的病害控制系统中的一种或多种天然产物的巨大希望。然而，由于联用的化合物可能的协同作用，所以可以考虑施用粗或半纯化提取物。重要的是，鉴于百子莲为多年生植物这一事实，合并的地上部分的提取物可能具有研发成天然产物的最大潜能，因为采集土壤上部部分是无害性的。这意味着尤其是对无法获得合成化学品的小规模生产的农民而言，百子莲存在作为新的农作物栽培和用作天然杀真菌剂的来源的潜能，所述的天然杀真菌剂对经济上重要的植物病原体具有广谱控制作用。
附图说明
附图1：来自百子莲的不同植物部分的粗提取物对各种真菌菌丝体生长的体外抑制作用。竖直线条表示标准偏差。使用不同字母命名的条表示按照邓肯氏复极差程序平均值之间的显著性(p＜0.05)差异。Y-轴：菌丝体生长抑制(％)。(1)＝根；(2)＝叶，(3)＝花柄；(4)＝花；(5)＝地上植物部分；(6)＝参比物fungizide
附图2：来自百子莲的不同植物部分的粗提取物时单一培养的酵母细胞呼吸速率的作用。竖直线条表示标准偏差。X-轴：时间(分钟)；Y-轴：呼吸速率(cm3 CO2释放)。
1＝根，2＝花柄，3＝地上植物部分，4＝水，5＝叶，6＝花，7＝ComCat
附图3A：新皂苷(1)的结构：
3-[{O-3-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元(agapanthegenin)。
1：R＝H；2：R＝Ac
附图3B：糖苷配基(3；百莲子皂苷元)、糖基化皂苷配基(5)及其各自的O-乙酰基衍生物(4和6)的结构。
3：R＝H；4：R＝Ac；5：R＝葡萄糖；6：R＝乙酰基葡萄糖
附图4：根据本发明用百子莲属提取物和Tulbaghia提取物(作为参比物)处理的小麦中依赖于处理后的时间的NADPH氧化酶活性模式。
附图5：根据本发明用百子莲属提取物和Tulbaghia提取物(作为参比物)处理的向日葵中依赖于处理后的时间的NADPH氧化酶活性模式。
附图6：根据本发明用百子莲属提取物和Tulbaghia提取物(作为参比物)处理的小麦中依赖于处理后的时间的过氧化物酶活性模式。
附图7：根据本发明用百子莲属提取物和Tulbaghia提取物(作为参比物)处理的向日葵中依赖于处理后的时间的过氧化物酶活性模式。
实施例
实施例1粗提取物的制备
使用Retsch SM2000切割粉碎机粉碎干燥的植物材料并且在辊式磨碎机上将其以2ml g-1干重的比例浸入100％甲醇(v/g)过夜且随后滗析上清液。将该步骤重复5次。将合并的混悬液过滤两次，第一次在真空中通过双层Whatman滤纸(No.3和No.1)过滤，且然后通过单张Whatman No.1滤纸经重力过滤。通过在30-35℃下使用Bbchi旋转蒸发器进行真空蒸馏从澄清的上清液中除去甲醇。将剩余的水溶液称作粗提取物。
实施例2干粉的制各
制备干粉代替按照实施例1制备的粗提取物也是适合的。其含义在于可以在生产成本上实现相当程度的降低并且可以使用这种形式的产品处理更多公顷的栽培土地。实施例1和实施例2的制剂在其植物保护活性/功效方面表现出几乎相同的定性和定量结果。在35℃下，优选在干燥箱内干燥植物材料。首先使用Retsch SM2000切割粉碎机将干燥的植物材料粉碎成粗粉(course power)，且随后使用专用粉碎机粉碎成细粉，该粉碎机可以粉碎成小于100微米的颗粒以防止阻塞喷嘴喷雾系统。在辊式磨碎机上以优选2ml/g干重的比例将粉末浸入100％甲醇或乙醇(v/g)48小时并且滗析大量甲醇，此后使剩余的甲醇在大表面上蒸发。随后用与使用甲醇完全相同的方式用100％乙醇将粉末处理24小时。终产品为可湿润的粉末形式，将其优选以1g/l和约300-600升/公顷的比例施用。
实施例3抗真菌特性的筛选
将改进的琼脂稀释方法(Rios等.1988，Journal ofEthnopharmacology 23：127-149)用于测定植物提取物对测试生物体菌丝体放射状生长的抑制作用。所有植物致病测试真菌在按照制造商的说明书制备并且在121℃下高压灭菌20分钟的2％(m/v)麦芽琼脂上培养20分钟。在水浴中冷却至45℃时，将300ul 33％(m/v)的链霉素溶液加入到基础培养基中以便控制细菌生长。将每种植物提取物的干燥材料溶于100ml无菌蒸馏水并且在琼脂中修正以产生1mg/ml的终浓度。在层流箱内操作，将培养基倾入90mm无菌塑料培养皿至厚度为2-3mm，并且将其放置。随后给每一测试平板的中心分别对每个病原体接种5mm大小的7-10日龄旧培养物塞。仅包含基础培养基的平板用作对照组。另外，将包含1ug/ml标准杀真菌剂多菌灵/difenococnazole(Eria-187.5g/l EC)的平板用作分别对每种测试生物体的阳性对照，以便通过比较确定提取物的有效性。将平板在25±2℃下的生长箱内孵育4天。每次测定均按照一式三份进行。对每一重复测定而言，通过计算两个垂直的菌落直径的平均值确定4天后的放射状菌丝体生长。测量包括测定孔(March等，1991，Zentralbladt fur Mikrobiologie 146：291-295；Pfaller等，1992，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36：1805-1809)并且通过按照Pandey等的如下公式(1982，Zeitschrift Pflanzenkrankheitund Pflanzenschutz 89：344-349)进行计算将测量结果表示为菌丝体生长抑制百分比：(dc-di)/dc×100，其中dc＝阴性对照的真菌菌落平均直径，且dt＝使用提取物处理的真菌菌落的平均直径。从两次实验中汇集报导的数据。
实施例4：抗细菌特性的筛选
使用改进的琼脂扩散方法(Caceres等，1993，Journal ofEthnopharmacology 38：31-38)。按照与用于抗真菌测试的麦芽琼脂相同的方式制备平板计数琼脂(PCA，Biolab)，但不将植物提取物悬浮于琼脂中。将所有植物致病细菌的母培养物维持在营养琼脂上(Caceres等.1991，Journal of Ethnopharmacology 31：193-208.Rasoanaivo等，1993)。首先在30℃下分别在无菌1％(w/v)营养肉汤(Biolab)溶液中制备测试细菌的过夜汤培养物(Meyer等，1995)。随后将100ul这些细菌混悬液各自单独转入包含无菌PCA琼脂的90mm培养皿并且使用无菌拭子在表面上均匀划线。将培养皿分成四个四分之一区域并且通过无菌木制钻孔器在每一四分之一琼脂上钻入6mm直径的孔。将50ul 1mg/ml粗的储备溶液提取物转入琼脂中的孔。使平板在4℃下平衡1小时以使提取物扩散入琼脂，此后开始孵育。在这种方式中，澄清的抑制区的出现得以最优化。对所有植物致病细菌而言，将平板在25℃下孵育3天，但粘膜炎莫拉氏菌在35℃下孵育。按照一式两份进行每次测定。使用数字测径器测量抑制区。
实施例5：粗提取物的生物刺激特性的体外筛选
将两种方法应用于测定百子莲的器官粗提取物的生物刺激潜能。
方法1：测定粗提取物对单一培养的酵母细胞呼吸速率的作用的测压法
将具有用来包含酵母细胞的短凸出部件(贮器)和在上端封闭以收集CO2气体的长刻度管的专门建造的玻璃呼吸测定计用于测定百子莲粗提取物对单一培养的酵母细胞呼吸速率的作用。将干面包酵母(0.8g)放入呼吸测定计贮器。随后将预先以0.5mg/ml浓度制备并且包含用作酵母细胞呼吸底物的5mg/ml葡萄糖的70ml每种植物提取物加入到呼吸测定计中。将该仪器向侧面倾斜以便释放留在干面包酵母中的气泡并且放入预加热至29℃的水浴中。将0.5mg/ml商购生物刺激剂ComCat用作阳性对照(按照制造商的最佳浓度；Agraforum，Germany，2002)并且将蒸馏水用作第二种对照品。在3小时孵育期内，通过从刻度管中读取释放的气体体积以30分钟间隔测量以cm3计的酵母细胞释放的CO2。按照一式三份进行测试。
方法2：百子莲的不同器官粗提取物对萝卜种子萌发百分比和随后的幼苗生长的作用
将2片专用萌发纸(30×30cm)用于测试百子莲的每种植物粗提取物对萝卜种子萌发以及随后的幼苗生长的作用。在1张纸上画距上部10cm的线并且使20粒萝卜种子均匀间隔排列在该线上。将第二张萌发纸放在第一张的上部并且用0.5mg/ml粗提取物溶液，蒸馏水(阴性对照)或0.5mg/l ComCat溶液(阳性对照)湿润。将两张纸纵向卷起并且直立放入包含粗提取物溶液，蒸馏水或ComCat溶液的锥形瓶并且避光保持在25℃下的生长室内。在96小时孵育期内以24小时间隔测定种子萌发以及胚芽鞘和根长。按照一式三份进行测试。
实施例6：数据的统计学分析
使用SAS(1999；SAS/IML软件；Version 6；SAS Institute)程序对数据进行方差分析(ANOVA)，以便鉴定处理之间的差异。将用于比较平均值的邓肯氏复极差(Duncan′s multiple range，DMR)程序(Steele&Torrie，1980，Principles and procedures of statistics，2th Edition.New York：McGraw-Hill)适用于各平均值(P＜0.05)。
实施例7：豌豆球腔菌的分离
从衰老时的紫花豌豆(field pea)的各种冬季栽培品种的患病叶和茎中分离豌豆球腔菌。感染植物材料从埃塞俄比亚中部和东南部豌豆种植地区收集。将患病组织片在96％(v/v)乙醇中1分钟，在3.5％(v/v)NaCl溶液中3分钟(Moussart等，1998，European Journalof Plant Pathology 104：93-102)和在96％(v/v)乙醇中30秒进行表面无菌化。随后将组织以无菌方式转入使用链霉素(0.3ml/l)改变的9cm培养皿中的玉米粉琼脂中并且在20±1℃下的生长室内孵育。然后使最初获自植物材料的分离物生长在由4g麦芽糖，2g KNO3，1.2g MgSO4，2.7g KH2PO4和20g琼脂组成的Coon′s培养基(AH等，1978，Australian Journal of Agricultural Research 29：841-849)中。将培养基孵育14天以便获得器孢子。为了获得来源于单一单核细胞的分离物，将器孢子的混悬液在15％水琼脂上划线，在20±1℃下孵育过夜并且在解剖显微镜(80x放大倍数)下检验。切开从器孢子的一个细胞产生的芽管并且转入Coon′s琼脂(Clulow&Lewis，1992，Plant Pathology 41：362-369)。获得6种豌豆球腔菌分离物。将所有来自单孢子和培养物的分离物维持在Coon′s琼脂斜面上并且储存在5℃下的黑暗中。
实施例8：豌豆球腔菌孢子混悬液的制备
通过将30g燕麦在1升蒸馏水中温和加热1小时，频繁搅拌且随后通过细筛过滤，此时将体积重调至1升，制备燕麦粉琼脂。向滤液中加入20g工业级琼脂和0.1g三氯杀螨醇(Keltane)AP而得到2％(m/v)琼脂浓度。将琼脂高压灭菌15分钟，倾入培养皿并且使其冷却下来，此后使用豌豆球腔菌菌丝体接种3个燕麦粉平板。将平板在20℃下和12小时光周期保温箱内孵育14天，以确保产生器孢子。为了制备接种物(孢子混悬液)，将无菌蒸馏水加入到14日龄的培养物中，使用无菌玻璃棒缓慢取出孢子。随后将该混悬液通过4层粗平布过滤以便除去菌丝体并且通过血细胞计数器测定器孢子的浓度。使用无菌蒸馏水将器孢子浓度调整至1×105个孢子/ml(Nasir&Hoppe，1997，Annals of Applied Biology 18：32-33)，此后接种豌豆叶。
实施例9：粗提取物植物毒性的体内评价
将豌豆种子种植在塑料罐中的Bainsvlei土壤中并且使其生长在温室中(最低温度18℃)。种植后4周，当第三和第四节上的小叶完全展开时，每个重复从植物中取下3个第四节小叶，放在Schleicher和Schull No.595滤纸上并且在9cm培养皿中使用4ml无菌蒸馏水湿润。将30ul 0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml粗提取物溶液各自分开放在每一3片叶/培养皿上并且重复3次。用水和标准杀真菌剂(多菌灵/苯醚甲环唑)处理叶用作对照组。将包含处理的小叶的培养皿在20℃下16小时白天周期的日/夜程序的保温箱中孵育，同时每日加入2ml无菌蒸馏水以保持滤纸湿润。处理后6天，使用基于立体显微镜观察结果使用6等级评分法[0＝无症状；1＝＜5％坏死斑点；2＝＞5％坏死斑点；3＝＜50％接种区坏死；4＝50-100％接种区坏死；5＝扩散出接种区的坏死]对叶评价植物毒性症状(Clulow等，1991，MycologicalResearch 95：817-820)。
实施例10在温室条件下粗提取物抗真菌特性的体内评价
如植物毒性评价测试中所述获得第四节豌豆小叶并且维持在培养皿中的湿润滤纸上。遵循两种方式，即通过在分别施用不同浓度的粗提取物前30分钟使用15ul孢子混悬液(1×105个孢子/ml；Nasir&Hoppe，1997，Annals of Applied Biology 18：32-33)接种叶，和以相反的方式，用不同浓度(0.25，0.5，1.0和2.0mg/ml)的百子莲地上植物部分、根、叶和花体内控制豌豆球腔菌孢子的叶感染。将目前用来抗豌豆壳二孢属枯萎病的标准杀真菌剂多菌灵/苯醚甲环唑以及仅用孢子混悬液接种的叶用作对照品。每个培养皿中的3片叶代表重复试验并且按照一式三份进行实验。在20℃(豌豆球腔菌孢子萌发的最佳温度)下在日/夜保温箱中孵育包含不同处理的叶的培养皿，因为光照对孢子萌发而言是必需的(Roger & Tivoli，1996，Mycological Research 100：304-306)。在孵育6天后，测量叶的损害并且将叶损害与对照品的叶损害进行比较。
实施例11：种子处理
以5％(w/w)的比例人工给不同批高梁种子接种坚黑穗病(Sporisorium sorghi)或散黑穗病(Sporisorium cruentum)孢子，此后实施种子处理。以2.0g/l的比例将百子莲的地上粗提取物悬浮于水中。通过在种植前在小塑料袋中充分混合24小时用15ml粗提取物处理每批90g的各批高梁种子。按照相同方式，以每Kg种子0.25％(w/w)的比例施用标准合成拌种杀真菌剂塞仑(65W)并且用作阳性对照。将用散黑穗病或坚黑穗病孢子人工接种，但未用提取物或的合成杀真菌剂处理的高梁种子用作第二对照。
实施例12：田间试验
在2003年中在埃塞俄比亚的Melkassa Research Centre进行田间试验。以随机化完全区组设计安排小块土地并且重复处理3次。在18.75m2的小块土地中用手种植5排处理的高梁种子，保持0.75cm的行距。施用标准肥料并且通过沟灌保持小块土地的田间持水量。将病患发生率记录为感染植物的百分比。对整个小块土地测定谷物产率。
实施例13：活性定向的液-固提取
通过使用己烷(DC＝2.0)、乙醚(DC＝4.3)、乙酸乙酯(DC＝6.0)和二氯甲烷(DC＝8.6)作为溶剂以2ml/g粗提取物的比例进行液-固提取，对百子莲根(268.5g)和地上部分(368.83g)的干燥的甲醇粗提取物进行分级分离。使用用于每一步骤的新鲜溶剂通过在机械振荡器上剧烈振荡10分钟将提取重复20次以上。分别采集4种级分并且在35℃下通过Bьchi旋转蒸发器蒸发至干。对每一级分测定回收的干物质的质量。为了确立分级分离过程成功，使用0.5mm Silica Gel 60板，应用氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶10)作为流动相获得每一级分的薄层色谱(TLC)图。随后使用尖孢链孢作为测试生物体确立每一半纯化提取物的菌丝体生长抑制活性潜能。
实施例14：活性定向的柱色谱分级分离
使用柱色谱法进一步对获自液-固提取操作过程的最具活性的提取物分级分离。对根提取物使用Sephadex LH20(Pharmacia)填充柱(2.6×46cm)或对地上部分使用硅胶(0.25；Merck，Darmstadt，Germany)填充柱(2.6×46cm)。使用乙醇(100％)，随后使用甲醇(100％)和甲醇∶水(50∶50 v/v)混合物依次洗脱根(7g)的残余物。使用甲醇∶氯仿的梯度溶剂系统(15∶85，20∶80，25∶75，30∶70和40∶60 v/v)洗脱地上植物部分(5g)的柱色谱残余物。以3ml/分钟的流速调整洗脱。收集约120ml的根和地上部分洗脱液。分别合并表现出类似Q-TLC分布模式的那些柱色谱级分。将尖孢链孢的菌丝体生长抑制用于鉴定活性柱色谱级分，用于通过制备型薄层色谱法进一步纯化活性化合物。
实施例15：制备型薄层色谱法(PTLC)
使用硅胶F 1500/LS(1mm)板，通过制备型薄层色谱法(PTLC)进一步纯化最具活性的合并的柱色谱级分。将15mg每种活性柱级分溶于50ul甲醇(100％)并且通过借助于玻璃毛细管在基线上均匀划线上样至板上。在10个不同平板上将该步骤重复10次以便从总计150mg各活性级分中分离化合物。在划线之间在风扇前干燥板且然后使用氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶10 v/v)溶剂系统作为流动相在饱和室内展开。在254和365nm处的UV-光下对化合物进行检测(Wagner和Bladt，1996，Plant Drug Analysis.A thin layer chromatography atlas.Secondedition.Springer，Berlin)。通过使用刮刀从板上刮取下吸收层的检测区分离各化合物并且转入Eppendorff小瓶。通过用甲醇(100％)洗脱从硅胶中回收化合物，随后以12000r.p.m.离心5分钟并且在通过在35℃下的烘箱内干燥除去甲醇后测试抗真菌活性。
实施例16：定性薄层色谱法(Q-TLC)
使用硅胶60 F254-铝支持和预涂敷的板在原分析型薄层色谱(TLC)系统(Mikes和Chalmers，1979，Laboratory handbook ofchromatographic and allied methods.Ellis HorwoodLtd.London)中再次仅测试最具活性的分离的化合物。将10-15mg各样品上样至板的基线上并且使用氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶10 v/v)或甲苯∶丙酮∶乙酸乙酯(7∶2∶1 v/v；Wagner和Bladt，1996)作为溶剂系统在饱和室内展开。在气流中干燥板后，在254和365nm处的UV-光下检测化合物或用5％(v/v)乙醇H2SO4或1％(m/v)香草醛(在100ml H2SO4中1g；Wagner和Bladt，1996)染色板。使不纯的化合物再次进行用1％(v/v)HCL酸化的制备型TLC，直到获得纯的化合物为止。使仅表现出最高抗真菌活性的纯的化合物进行核磁共振(NMR)光谱测定以便鉴定它们并且阐明其分子结构。
实施例17：核磁共振(NMR)光谱测定
为了鉴定纯化自根和地上植物部分的最具生物活性的化合物并且阐明其分子结构，使用丙酮反复洗涤分离的化合物以便获得可接受水平的纯度。随后对化合物进行核磁共振光谱测定(1H NMR)。使用Bruker300MHz DRX 300光谱仪在296K(23℃)处以四甲基硅烷(Si(CH3)4；TMS)作为内标进行NMR-光谱测定。所用的溶剂为如所示的氘氯仿(CDCl3)或氘丙酮(deuterioactetone)[(CD3)2CO]。使用д-标度以百万分之份数(ppm)报导化学位移并且以Hz给出偶合常数。使用如下缩写：s＝单峰，d＝双峰，dd＝双峰中的双峰，m＝多重峰，br＝加宽峰，t＝三重峰。在VG 70-70E双聚焦质谱仪上记录所有的FAB质谱。在JascoJ-710旋光分光计上使用甲醇作为溶剂记录圆二(CD)色谱。通过分光光度法(1D NMR和2D NMR光谱法)、FAB和EI-MS以及化学方法，例如水解进行结构阐明。由于非衍生的皂苷配基的1H NMR光谱的复杂性，所以将过乙酸酯衍生物(2；附图3A)用于结构阐明。通过分光镜法(NMR)和光谱测定(MS)法以及水解实施这一过程。

Claims (38)

1.适合于生物学植物保护的、基于来自百子莲属(Agapanthus)的植物或植物部分的、粗提取物形式的制剂，其能通过下列步骤获得：
(i)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；
(ii)将干燥的植物材料研磨成0.2-2mm粒度大小；
(iii)将研磨的材料浸入选自甲醇和乙醇的极性有机溶剂中，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；
(v)将步骤(iii)和(iv)重复另外至少一次；
(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且通过在30-40℃下真空蒸发除去有机溶剂，由此获得粗提取物残渣。
2.适合于生物学植物保护的、基于来自百子莲属的植物或植物部分的、干粉形式的制剂，其能通过下列步骤获得：
(i)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；
(ii)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；
(iii)将研磨的材料浸入甲醇中，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取；
(v)在不预先将固相与可溶性有机相分离的情况下蒸发溶剂；
(vi)将蒸发后的固相残余物浸入乙醇中并且重复步骤(iv)和(v)；
(vii)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉。
3.权利要求1或2的制剂，其中使用百子莲(Agapanthusafricanus)。
4.权利要求1-3中任意项的制剂，其中使用植物的不同地上部分中的一种或多种。
5.权利要求4的制剂，其中使用合并的地上部分。
6.权利要求4的制剂，其中使用花。
7.权利要求1-3中任意项的制剂，其中使用土壤植物部分。
8.权利要求1-7中任意项的制剂，其特征在于它包含：3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元(agapanthegenin)。
9.权利要求7的制剂，其特征在于它包含：5，7，4′三-O-黄烷酮和/或5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮和/或反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。
10.权利要求1-3中任意项的制剂，其特征在于它包含：3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元(agapanthegenin)；5，7，4′三-O-黄烷酮；5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮；和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮。
11.权利要求1-10中任意项的制剂，进一步包含固体、粉状的载体物质或填充剂。
12.权利要求1-11中任意项的制剂，进一步包含增加或调节该制剂作用的添加剂。
13.基于权利要求1-12中任意项的制剂的、含水溶液或混悬液形式的制剂。
14.权利要求13的制剂，其中粗提取物或干粉的浓度在0.25g/l-2g/l。
15.权利要求14的制剂，其中粗提取物或干粉的浓度在0.5g/l-1g/l。
16.组合物，包含权利要求1-15中任意项的第一种植物制剂和粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液形式的第二种植物制剂，所述的第二种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥外加的植物保护作用。
17.权利要求16的组合物，其特征在于第二种植物制剂来源于Tulbaghia violacea并且通过与所述第一种植物制剂类似的工艺步骤获得。
18.权利要求16或17的组合物，其特征在于第二种植物制剂来源于Pink科物种和Alfalfa种的混合物，其中干燥的Pink物种材料的重量比为80-99％，所述的第二种植物制剂通过与所述第一种植物制剂类似的工艺步骤获得。
19.组合物，包含：
(i)权利要求1-15中任意项的第一种植物制剂；
(ii)来源于Tulbaghia violacea的第二种植物制剂；和
(iii)来源于Pink科物种和Alfalfa种的混合物的第三种植物制剂，其中干燥的Pink物种材料的重量比为80-99％，
每种制剂为粗提取物、干粉或其含水混悬液或溶液的形式，所述的第二种和第三种植物制剂对使用该组合物处理的植物或其部分发挥外加的植物保护作用。
20.权利要求1-19中任意项的制剂/组合物作为生物学植物保护剂的应用。
21.权利要求20的应用，其中所述的生物学植物保护剂为抗微生物剂。
22.权利要求21的应用，其中所述的抗微生物剂为抗真菌剂。
23.权利要求22的应用，其中所述的抗真菌剂抑制真菌的菌丝体生长。
24.权利要求22或23的应用，用于预防田间条件下真菌对农作物的感染。
25.权利要求20的应用，其中所述的生物学植物保护剂为生物刺激剂。
26.权利要求25的应用，其中所述的生物刺激剂诱导系统性获得性抗性(SAR)并且对使用该活性剂处理的植物或植物部分发挥生长诱导作用。
27.权利要求22-26中任意项的应用，其中所施用的制剂基于百子莲属合并的地上部分。
28.权利要求27的应用，其中所述制剂的活性或功效高于基于百子莲属地上部分各单个成分的制剂的活性或功效的总和。
29.式I的化合物：
Figure S200680023742XC00041
其中R＝H或乙酰基。
30.权利要求29的化合物，分离自权利要求1-14中任意项的制剂，所述的化合物为3-[{O-β-D-吡喃葡糖基-(1″-3′)-α-L-鼠李糖基-(1″-2′)}-β-D-吡喃葡糖基氧基]百莲子皂苷元.
31.适合于生物学植物保护的组合物，包含权利要求29或30的化合物和至少一种选自5，7，4′三-O-黄烷酮、5，7，3′，4′-四-O-乙酰基黄烷酮和反式-4，2′，4′-三-O-乙酰基查耳酮的黄酮类化合物。
32.权利要求29-31中任意项的化合物/组合物作为植物保护剂的应用。
33.权利要求32的应用，其中所述的植物保护剂为抑制真菌菌丝体生长的抗真菌剂。
34.制备如权利要求1-15中任意项所定义的粗提取物或干粉制剂或其含水混悬液或溶液的方法，其特征在于进行下列步骤：
(i)在30-40℃下干燥植物材料；
(ii)将干燥的植物材料研磨成0.2-2mm粒度大小；
(iii)将研磨的材料浸入极性有机溶剂中，由此形成混悬液/溶液；
(iv)对所述的混悬液进行搅拌提取并且将上清液与固相分离；
(v)将步骤(iii)和(iv)重复另外至少一次；
(vi)合并步骤(iv)的可溶性有机相并且通过在30-40℃下真空蒸发除去有机溶剂，由此获得粗提取物残渣；
并且就含水制剂的制备而言：
(vii)将所得粗提取物以适宜的浓度悬浮于水中；
或者作为替代方案，采取下列步骤：
(ia)避开日光在30-40℃下干燥植物材料；
(iia)将干燥的植物材料研磨成低于0.1mm粒度大小；
(iiia)将研磨的材料浸入第一极性有机溶剂中，由此形成混悬液/溶液；
(iva)对所述的混悬液进行搅拌提取；
(va)在不预先将固相与可溶性有机相分离的情况下蒸发溶剂；
(via)将蒸发后的固相残余物浸入第二极性有机溶剂中并且重复步骤(iva)和(va)；
(viia)干燥蒸发后的固相残余物，由此获得干粉；
并且就含水制剂的制备而言：
(viii)将所得干粉以适宜浓度悬浮于水中。
35.权利要求34的方法，其特征在于步骤(iii)中的极性有机溶剂为90-100％甲醇或乙醇。
36.权利要求34的方法，其特征在于所述的第一极性有机溶剂为90-100％甲醇并且所述的第二极性有机溶剂为90-100％乙醇。
37.权利要求34-36中任意项的方法，其特征在于将各溶剂以1.0-3.0ml/g干重研磨植物材料的浓度用于提取。
38.权利要求34-37中任意项的方法，其特征在于所述的粗提取物或干粉材料在步骤(vii)或(viii)的含水溶液或混悬液中的浓度为0.25g/l-1g/l。
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