JP5907540B2 - 綿を含む固定相を用いるクロマトグラフィーによりグリカン及び/又は複合糖質を精製するための方法 - Google Patents
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Description
(a)綿を含む固定相を提供し;
(b)グリカン及び/又は複合糖質を含有するサンプルを固定相にアプライし;
(c)第一溶媒で固定相を洗浄し;及び
(d)第二溶媒で固定相からグリカン及び/又は複合糖質を溶出する
工程を含むグリカン及び/又は複合糖質を精製する方法が提供される。
IgGの精製
ポリクローナルヒトIgGを、固定化されたタンパク質による親和性クロマトグラフィーにより、血漿から精製した(Wuhrer et al., Proteomics 2007, 7, 4070-4081に開示される技術に従い、若干の改変を伴って)。
トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)で処理されたトリプシン(Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)を氷冷した20mMの酢酸(Merck,Darmstadt,Germany)に対してμlあたり0.05μgのトリプシンの最終濃度まで溶解し、使用するまで−80℃で一定分量で保存した。中和したIgGサンプルの各々に対して、8μlのトリプシンストック(合計で400μg)及び12μlの水が添加された。サンプルを3分間振盪し、37℃で一晩インキュベートした。トリプシン性IgG消化物は、HILIC SPEマイクロチップの脱塩・精製まで−20℃で貯蔵した。
プロテインAで精製したIgG由来のN−グリカンが(Ruhaak et al., Anal.Chem. 2008, 80, 6119-6126に記載されるように)放出された。簡潔には、乾燥したIgGのサンプルを60℃で10分間、2μlのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(2%)で変性した。続いて、2%のTergitol−型NP−40(NP−40)、2.5×PBS及び0.05mUのPNGase F(Roche,Mannheim,Germany)を含有する放出混合物の2μlが与えられた。サンプルは、N−グリカンの放出のため、37℃で一晩インキュベートした。
3つの異なるブランドのカット綿(Da,Dynaretail,Leusden,The Netherlands;Etos,Etos bv,Beverwijk,the Netherlands;Bella,Groupe Lemoine;Paris,France)は、地元の小売店で購入し、HILIC SPEのマイクロチップの調製のために使用した。製造業者によると、カット綿は100%純粋な綿から作られた。脱脂綿の小片は平均重量が500μgであり、カット綿から採取され、鈍針を使用して10μlのピペットチップ(Rainin,Tiel,The Netherlands)の終端に押し込まれた。マイクロチップは、使用するまで密閉された箱に保存された。
綿HILIC SPEマイクロチップを10μlの水で5回洗浄し、83%のアセトニトリル(Biosolve BV,Valkenswaard,The Netherlands)で3回、その溶液を吸引し分配することによって調整した。調製されたチップの10%未満で、溶媒吸引時の流れが遅く、不十分であることが見いだされ、従ってそのようなチップは廃棄された。綿HILIC SPEマイクロチップに対するサンプルの適用に対して、39μlのアセトニトリルが8μlのトリプシン性IgG消化物又はN−グリカン放出サンプルに添加され、混合物を上下にピペット操作して、糖ペプチドの吸着させた。吸着されたグリカン又は糖ペプチドを、0.1%TFAを含有する83%アセトニトリルを10μlで3回洗浄し、水2μlでMALDIプレート上に直接溶出した。
リフレクトロン陽性モードにおけるMALDI−TOF−MSによるIgGのFcのN−グリコペプチドプロファイリングのために、糖ペプチドを研磨したステンレス鋼MALDIプレート(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)上に綿HILIC SPEのマイクロチップから水2μlを使用して直接溶出し、空気乾燥させた。サンプルは2μLのα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA、5mg/mlの50%のアセトニトリル;Bruker Daltonics)が重ねられ、空気乾燥させた。
IgGの精製およびトリプシン性切断
IgGは、プロテインA−セファロースビーズを5μlを含む96ウェルフィルタープレート中でヒト血漿の2μl(約20μgのIgG抗体)からアフィニティー捕獲され、続いて100mMギ酸40μlによりIgGを溶出させた。プロトコルの以前に記載されたバージョンは、真空遠心分離によるサンプルの乾燥を含むが(Wuhrer et al., Proteomics 2007, 7, 4070-4081)、この手順は、現在のプロトコルにおいては重炭酸アンモニウムによる中和工程によって置き換えられた。
綿はIgG糖ペプチドのHILIC SPEにおける固定相としての可能性について評価を行った。この目的のために、カット綿の小片(約500μg)をピペットチップの末端に充填した(図1)。カット綿(A)から、およそ500μgを採取し(B)、鈍金属針(C)を用いて10μlのピペットチップ内に押し込む。綿は、チップ(D)の末端部に押し下げられる;
一つの綿HILIC SPEマイクロチップは、トリプシンのIgG消化物のプールから糖ペプチド精製のため8回使用され、続いて溶出した糖ペプチドのリフレクトロンモードのMALDI−TOF−MSを行った(図4Aおよび図4Bに示されるように)。
IgGのFcのN−グリコシル化プロファイリングは対照の個体の血漿の8つの一定分量と並行して行われた。これには、プロテインA捕捉、溶出液の中和、TPCKトリプシンを用いた切断、綿HILIC SPE及びMALDI−TOF−MS解析が含まれる。この実験は、異なる3日において反復された。質量分光分析は、リフレクトロンモード及びリニアモードで実施され、IgG1(図3Aおよび図3Bに示されている)とIgG2(図5A、5B、6Aおよび6Bに示されている)のFcのN−グリコシル化プロファイルの両方が、一日のうちで及び日によっての変動性が低く記録することができたことを実証している。
別の分野の適用として、綿HILIC SPEマイクロチップは、PNGase F放出後に、グリカンのMALDI−TOF−MSサンプル調製用に試験された。N−グリカンは、界面活性剤(SDS、NP−40)と塩(PBS)を含むヒトIgGサンプル及びヒトトランスフェリンサンプルから酵素的に放出された。中性と酸性(シアル化)N−グリカンの両方が、綿HILICマイクロSPE精製後にMALDI−TOF−MSにより検出されたが、一方SPE精製をしていないグリカン放出サンプルの直接MALDI−TOF−MS解析はN−グリカンの記録を認めなかったが、界面活性剤のクラスタにより占められていた(図6、図7、図8および図9)。
Claims (15)
- グリカン及び/又は複合糖質を精製する方法であって、
(a)グリカン及び/又は複合糖質を含有するサンプルを、脱脂綿を含む固定相にアプライし;
(b)第一溶媒で固定相を洗浄し;及び
(c)第二溶媒で固定相からグリカン及び/又は複合糖質を溶出する
ことを含む方法。 - 工程(a)において、グリカン及び/又は複合糖質を含有するサンプルは有機溶媒を含み;該有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はテトラヒドロフランを含み;好ましくは、有機溶媒は70%v/vから88%v/vの間のアセトニトリル水溶液であり;より好ましくは、有機溶媒は75%v/vから85%v/vの間のアセトニトリル水溶液であり;より好ましくは、有機溶媒は83%v/vのアセトニトリル水溶液である、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、第一溶媒は、水、有機溶媒及び酸を含む溶媒混合物であり;好ましくは、有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はテトラヒドロフランであり、酸は、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、又はヘプタフルオロ酪酸であり;より好ましくは該溶媒混合物は、75%v/vから90%v/vの有機溶媒と、0.1%v/vから1%v/vの酸の水溶液;又は70%v/vから95%v/vの有機溶媒と、0.1%v/vから3%v/vの酸の水溶液;より好ましくは溶媒混合物は83%v/vのアセトニトリルと0.1%v/vのトリフルオロ酢酸水溶液を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)において、第二溶媒は極性溶媒を含み;好ましくは極性溶媒は水、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムアミドである、請求項1に記載の方法。
- 第二溶媒は、第一溶媒よりも多く極性溶媒を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 複合糖質は、糖タンパク質、糖ペプチド又は糖脂質であり;好ましくは糖ペプチドは、IgG糖ペプチドであり;より好ましくはIgGの糖ペプチドは、トリプシンIgGのFcのN−糖ペプチドである、請求項1に記載の方法。
- グリカンがN−グリカンである、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 固定相は再使用可能である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 固定相は脱脂綿を含み;好ましくは固定相は脱脂綿からなる、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- 固定相は約500μgの脱脂綿を含む、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 方法が溶出グリカン及び/又は複合糖質に関する質量分光分析を行う工程を更に含み;好ましくは質量分光分析はMALDI−TOF MS検出である、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 方法が溶出した糖ペプチドの糖ペプチドレベルでのグリコシル化プロファイリングの工程を更に含む、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 固定相は開口した容器内に保持されており;好ましくは開口型容器は、ピペット、マルチチャンネルピペット又はピペットチップである、請求項1から12の何れか一項に記載の方法。
- 精製工程は、糖タンパク質のPNGase F処理後にグリカンを除去し、還元的アミノ化により蛍光標識した後でグリカンを除去し、又はタンパク質分解消化物からN−糖ペプチドを濃縮するために使用することができる、請求項1から13の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から14の何れか一項に記載の方法を実施するためのグリカン及び/又は複合糖質を精製するためのキットであって、該キットが、
脱脂綿を含む固定相を含有するキット。
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