BRPI0612708A2

BRPI0612708A2 - extratos e compostos de "tulbaghia violacea" e seu uso como agentes biológicos para proteção de plantas

Info

Publication number: BRPI0612708A2
Application number: BRPI0612708-8A
Authority: BR
Inventors: Johannes Christiaan Pretorius
Original assignee: Agrarforum Ag; Agrarforum Sa Pty Ltd
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-24
Publication date: 2010-11-30
Also published as: AU2006265411A1; EP1903876A2; CN101212907B; CN101212908B; WO2007003286A2; AU2006265412B2; CN101212907A; EP1903877B1; BRPI0612708B1; CN101212908A; AU2006265411B2; BRPI0613955A2; US20090275472A1; AU2006265412A1; US8697149B2; US20120015062A1; EP1903876B1; US8435571B2; EP1903877A1; WO2007003286A3

Abstract

EXTRATOS E COMPOSTOS DE "TULBAGMIA VIOLACEA" E SEU USO COMO AGENTES BIOLóGICOS PARA PROTEçãO DE PLANTAS. A presente invenção refere-se a extratos e preparações à base da espécie Tulbaghia violacea (Harv.) (alho selvagem), que provoca uma atividade antimicrobiana, de preferência antifúngica, significativa in vitro e in vivo, mesmo sob condições de campo e de estufa. Além disso, esses extratos derivados de partes do solo, assim como de partes aéreas da planta provocam uma atividade bioestimulante significativa, expressa, acima de tudo, por um metabolismo de crescimento aumentado, que sustenta o crescimento de sementes. Além disso, extratos ou preparações combinadas de Tulbaghia violacea e espécies do gênero Agapanthus mostram maior eficácia antifúngica e bioestimuíante, em comparação com os extratos ou preparações da espécie única, indicando que há participação de sinergia nos processos biológicos envolvidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXTRATOS ECOMPOSTOS DE "TULBAGHIA VIOLACEA" E SEU USO COMO AGEN-TES BIOLÓGICOS PARA PROTEÇÃO DE PLANTAS".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a extratos vegetais, particular-mente à base de Tulbaghia violacea (alho selvagem) e a suas combinaçõescom outros extratos derivados de outras plantas. A invenção também refere-se ao isolamento, purificação e identificação de compostos nesses extratos.

Os extratos vegetais e as substâncias isoladas mostram atividade antimicro-biana significativa, particularmente atividade antifúngica, e eficácia bioesti-mulante, quando aplicados a outras plantas in vitro e in vivo, incluindo sobcondições de campo. Os produtos de acordo com esta invenção são ade-quados para uso como agentes protetores de plantas para muitas colheitas eplantas econômicas, como uma alternativa a pesticidas químicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A agricultura mundial sofre, particularmente em países em de-senvolvimento como na África, grandes perdas anuais de colheitas e outrasplantas econômicas devido a doenças de plantas. Mais de 30% dos alimen-tos, fibras, rações e energia produzidos em sistemas de produção de colhei-tas são destruídos por insetos e doenças anualmente em uma escala global.

Essas perdas de rendimento são altas como resultado de sistemas de pro-dução de baixa entrada, porque fazendeiros em países em desenvolvimentonão podem arcar com fungicidas sintéticos, dependendo de práticas de con-trole de doença não convencionais que freqüentemente proporcionam resul-tados duvidosos.

Em contraste, produtores de colheitas e plantas em países de-senvolvidos se baseiam principalmente em pesticidas sintéticos para contro-lar doenças de plantas. É um fato estabelecido que o uso de pesticidas quí-micos sintéticos proporcionam muitos benefícios para produtores de colhei-tas. Esses benefícios incluem rendimentos de colheitas mais elevados, me-lhor qualidade da colheita e maior produção de alimentos para uma popula-ção mundial cada vez maior.O desenvolvimento de uma ampla gama de substâncias quími-cas com diferentes formulações permitiu o controle de uma ampla gama depatógenos de plantas e rendimentos de colheitas substancialmente aumen-tados. Mais de uma década atrás, os produtores de colheitas gastaram qua-se 20 bilhões de dólares em pesticidas e 150 milhões de dólares em outrastécnicas de proteção de plantas mundialmente para controlar pragas em ge-ral. Apenas a participação de fungicidas no mercado mundial foi de 20% emanos recentes, ao passo que a Europa representou 30% do mercado. Entre-tanto, o mesmo nível de controle de patógenos não foi conseguido em paí-ses em desenvolvimento, parcialmente como resultado de a tecnologia depesticidas não ser acessível à maioria dos fazendeiros probres de recursos.A incapacidade das modernas abordagens, tecnologias e substâncias quími-cas de atingir fazendeiros em países em desenvolvimento é unicamente re-sultado dos altos custos com relação ao valor das colheitas cultivadas poresses fazendeiros. Conseqüentemente, as colheitas são rotineiramentesubmetidas ao ataque de um amplo espectro de uma diversidade de pató-genos, e esses fazendeiros constantemente experimentam graves danos àcolheita. Além disso, as perdas de rendimento estão aumentando, a despeitodo elevado uso de pesticidas, mesmo em países desenvolvidos. Além domais, o controle de doenças de plantas não é facilmente conseguido comuma única aplicação de fungicida, mas requer aplicações freqüentes duranteo período de crescimento da colheita. Entretanto, pesticidas sintéticos po-dem apresentar riscos e perigos para o ambiente, particularmente quandousando inapropriadamente por fazendeiros em países em desenvolvimento,que não possuem a habilidade técnica para manipulá-los, e que são incapa-zes de adotar essa tecnologia facilmente. Isso pode resultar em resíduosindesejáveis deixados no alimento, água e ambiente e pode causar toxicida-de para seres humanos e animais, contaminação de solos e lençóis freáticose pode levar ao desenvolvimento de populações de pragas de colheitas quesejam resistentes ao tratamento com agroquímicos. Particularmente fungici-das sintéticos contendo enxofre e cobre são tóxicos para mamíferos, vidaselvagem e muitos insetos benéficos.Além disso, na África e no Oriente Próximo, pesticidas obsoletosse tornaram uma fonte de grande preocupação ambiental adicional. Algunsestoques têm mais de 30 anos de idade e são mantidos em condições pre-cárias, por causa das instalações de armazenamento inadequadas e falta depessoal treinado no controle de armazenamento. Estoques de pesticidasobsoletos são bombas-relógios em potencial. Vazamento, infiltração e váriosacidentes relacionados a pesticidas são muito comuns e disseminados. Alémdisso, a aplicação freqüente de pesticidas resultou em mutação fúngica e,subseqüentemente, novas cepas resistentes (Khun, 1989, Pesticide Science14:272-293), cujo combate normalmente requer pesticidas mais fortes, comimpactos ainda mais fortes sobre o ambiente.

Por todas essas razões, há uma resistência considerável e cres-cente dos consumidores, particularmente em países desenvolvidos, iniciadapoliticamente pelos partidos verdes, quanto ao uso de substâncias quími-cas/pesticidas sintéticos particularmente, representando uma razão paramudar da aplicação de pesticidas químicos para o uso de agentes protetoresde plantas derivados naturalmente para reduzir a poluição e os riscos à saú-de causados pelos pesticidas.

Como resultado, a pesquisa da possível utilização de recursosbiológicos e sua aplicação em potencial na agricultura se tornou muito rele-vante. Uma abordagem promissora com relação a isso é o uso de produtosvegetais naturais como uma alternativa interessante a substâncias químicassintéticas, devido ao aparente impacto menos negativo sobre o ambiente.

Isso se aplica particularmente à pesquisa de componentes e a -gentes bioativos derivados naturalmente amigáveis para o ambiente com,por exemplo, uma atividade antimicrobiana de amplo espectro.

Espera-se que produtos naturais de plantas tenham uma estreitafaixa de alvos e um modo de ação altamente específico, mostrem limitadapersistência em campo, tenham um prazo de validade mais curto e não a-presentem riscos residuais. Em geral, são mais seguros para seres humanose para o ambiente do que pesticidas químicos sintéticos convencionais epodem ser facilmente adotados por fazendeiros em países em desenvolvi-mento, que tradicionalmente usam extratos de plantas para o tratamento dedoenças humanas.

Uma razão adicional para explorar o uso de extratos vegetais ouprodutos naturais como pesticidas biológicos mais amplamente pode serencontrada na própria planta. Plantas desenvolveram compostos químicosaltamente específicos que proporcionam mecanismos de defesa contra oataque por organismos causadores de doenças, incluindo ataque fúngico,invasão microbiana e infecção viral (Cowan, 1999, Clinicai Microbiology Re-views 12:564-582). Essas substâncias bioativas ocorrem em plantas comometabólitos secundários e proporcionaram uma rica fonte de compostos bio-logicamente ativos que podem ser usados como novos agentes protetoresde colheitas. Na natureza, algumas plantas têm o potencial de sobreviver emcondições ambientais muito adversas. Isso iniciou o postulado de que essasplantas poderiam ser utilizadas como fontes para o desenvolvimento de pro-dutos naturais para aplicação em agricultura pelo homem como herbicidas,bactericidas, fungicidas naturais ou produtos em forma bruta ou semipurifi-cada. Metabólitos secundários de plantas são distintos de metabólitos primá-rios, pelo fato de em geral serem não essenciais para os processos metabó-licos básicos, como respiração e fotossíntese. São numerosos e dissemina-dos, particularmente em plantas superiores, e freqüentemente estão presen-tes em pequenas quantidades (1-5%) em comparação com metabólitos pri-mários (carboidratos, proteínas, lipídios). Metabólitos secundários são pro-vavelmente produzidos quando requerido no sistema de plantas e são sinte-tizados em tipos especializados de células. Ecologicamente, os metabólitossecundários desempenham papéis essenciais na atração de polinizadores,como adaptações a estresses ambientais e servem como defesas químicascontra insetos e predadores superiores, microorganismos e mesmo outrasplantas (aleloquímicos). Estresse abiótico, como limitação de nutrientes, in-tensidade da luz, estresse de água e outros, foi considerado como capaz dedesencadear a formação de metabólitos secundários. Um tipo de interaçãoplanta-patógeno relacionada a estresse biótico envolve a produção de meta-bólitos como parte do arsenal de defesas da planta contra invasão microbia-na e é considerado determinante de doença. Metabólitos secundários compropriedades antimicrobianas incluem terpenóides (por exemplo, iridóides,sesquiterpenóides, saponinas), contendo nitrogênio e/ou enxofre (por exem-plo, alcalóides, aminas, amidas), alifáticos (particularmente alcanos de ca-deia longa e ácidos graxos) e aromáticos (por exemplo, fenólicos, flavonói-des, bibenzilas, xantonas e benzoquinonas).

Outra área relacionada de sistemas de cultivo orgânico é o po-tencial de aplicar extratos vegetais naturais como reguladores do crescimen-to de plantas ou bioestimulantes. Foram identificados muitos compostos ve-getais naturais que afetam o crescimento e o desenvolvimento de plantas.

Metabólitos secundários de plantas também podem mostrar atividades bio-estimulantes em plantas, outras plantas incluídas. Provavelmente, o com-posto mais eficaz para aumentar o rendimento de colheitas, a eficiência decolheitas e o vigor de sementes foi identificado como um brassinoesteróide(Mandava, 1988, Plant Physiology Plant Molecular Biology 39:23-52). Bras-sinoesteróides também foram identificados como substâncias bioestimulan-tes de uma mistura de extratos vegetais derivados de uma espécie de cravoespecífica e uma espécie de alfafa específica (EP 1 051 075 B1). Conse-qüentemente, existe um grande interesse em identificar compostos vegetaisnaturais com a capacidade de manipular o crescimento de plantas e o de-senvolvimento durante um curto período, por exemplo, uma estação decrescimento.

Uma consideração adicional é que plantas cujos extratos, porexemplo, mostrem propriedades antimicrobianas e/ou bioestimulantes pode-riam ser cultivadas como colheitas agrícolas alternativas para servir de fon-tes de compostos ativos na produção de pesticidas naturais ou reguladoresdo crescimento de plantas.

Embora as plantas sejam uma fonte valiosa para o desenvolvi-mento de novos produtos naturais com o potencial de uso para o controle dedoenças em sistemas de produção de colheitas orgânicas, apenas um pe-queno número de plantas foi investigado quanto ao possível uso no controlede doenças de plantas em agricultura. Entretanto, com relação a esse núme-ro relativamente pequeno de plantas investigadas, foi realizado um númerode atividades de pesquisa científica relativamente grande durante os últimosanos. Algumas delas são relacionadas a seguir:

. Demonstrou-se (Pretorius et al., 2002, Annals of Applied Bio-Iogy 141: 117-124) que se obtinha a inibição do crescimento de micélios comextratos de duas espécies da subclasse Liliidae, a saber Aristea ecklonii eAgapanthus inapertus. O extrato bruto de A. ecklonii teve o melhor desem-penho de todos os extratos, pois inibiu totalmente o crescimento de micéliosde todos os sete organismos de teste patogênicos para plantas e teve umdesempenho superior à inibição por um fungicida sintético de amplo espec-tro (carbendazim/difenoconazol). Extratos brutos de A. inapertus mostraraminibição completa de quatro e forte inibição dos três fungos patogênicos paraplantas restantes.

. Sementes de plantas também contêm compostos com proprie-dades antimicrobianas. Extratos de sementes de 50 espécies de plantas,pertencentes a diferentes famílias, foram avaliados quanto à sua capacidadede inibir o crescimento de Trichoderma viride in vitro (Bharathimatha et al.,2002, Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 37:75-82). Dos vá-rios extratos de sementes, o de Harpullia cupanioides (Roxb.), pertencente àfamília Sapindaceae, apresentou atividade antifúngica muito elevada.

. O produto vegetal natural Milsana®, extraído de sanguináriagigante (Reynoutria sacchalinensis), é provavelmente o melhor conhecido(Daayf, 1995, Plant Disease 79:577-580). Relatou-se que o produto controlamíldio pulverulento, causado por Sphaerotheca fuliginea, em pepino inglêslongo sob condições de estufa, e também mostrou atividade de amplo es-pectro contra míldio pulverulento de tomate, maçã e begônia, assim comomíldio penugento de vinhas e ferrugem de feijão.

. Amadioha (2002, Arehives of Phytopathology and Plant Protee-tion 35:37-42) avaliou as atividades antifúngicas de diferentes extratos de A.indica. O extrato oleoso de sementes, assim como extratos aquosos e etanó-Iicos de folhas das plantas foram eficazes na redução do crescimento radialde Cochliobolus miyabeanus em cultura e no controle da disseminação dadoença de pontos marrons no arroz.

. Kishore et al. (2002, International Arachis Newsletter 22:46-48)relataram a atividade antimicrobiana de extratos aquosos de folhas de Law-sonia inermis e Datura metei contra Mycosphaerella berkeleyi, que causammanchas em folhas tardias de amendoins (Arachis hypogaea).

. Um estudo direcionado para a identificação de propriedadesbioestimulantes em extratos vegetais foi realizado por Cruz et al. (2002, ActaHorticulturae 569:235-238) por tratamento das raízes de feijão, milho e toma-te com um Iixiviado aquoso de Calliearpa aeuminate. O extrato aquoso de C.aeuminata inibiu o crescimento de radículas de tomate, mas não teve ne-nhum efeito sobre o crescimento de raízes de milho ou feijões.

. Extratos de alguns cultivares de Iuzerna tiveram um efeito esti-mulante em termos de germinação de sementes, assim como crescimentoda raiz e hipocotiledôneo, ao passo que outros mostraram o efeito opostodireto, confirmando que plantas de colheita também podem ser afetadas porextratos vegetais direcionados ao controle do crescimento de ervas daninhas(Tran e Tsuzuki, 2002, Journal of Agronomy and Crop Science 188:2-7).

. Leksomboon et al. (2001, Kasetsart Journal, Natural Sciences 35:392-396)demonstraram o efeito antibacteriano de extratos aquosos de folhas e outrosde Hibiseus sabdariffa, Psidium guajava, Punica granatum, Spondias pinnatae Tamarindus indica contra Xanthomonas axonopodis, o agente causai docancro cítrico tanto sob condições laboratoriais, quanto de campo.

. Os efeitos antibacterianos de 45 plantas medicinais foram ava-liados contra uma ampla gama de bactérias por Morais et al. (2002 Acta Hor-ticulturae 569:87-90). Extratos brutos de cinco dessas plantas inibiram signi-ficativamente o crescimento de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria [X.vesicatoria], Ralstonia solanacearum e Clavibaeter michiganense subsp. mi-chiganense [C. michiganensis subsp. michiganensis], todos patógenos dotomate.

Outro produto natural, carvona, derivado de sementes de endroe cariz, foi desenvolvido para inibir o crescimento de patógenos de armaze-namento e para suprimir o brotamento de batatas no depósito (Moezelaar etal., 1999, em: Modem fungicides and antifungal compounds II; Intercept Limi-ted, p. 453-467). A carvona é atualmente comercializada como Talent® naHolanda.

. No pedido de patente europeu EP 1 051 075, descreve-se umapreparação de uma combinação de espécies da família do cravo e espéciesde alfafa (ComCat®), que revela, dentro de uma razão específica, um efeitobioestimulante sinérgico. ComCat® demonstrou um aumento do crescimentovegetal consistente e eficiência fisiológica na utilização da planta tratada denutrientes disponíveis. ComCat®, que aumenta a saúde de legumes, flores ecolheitas agrícolas, não é um fertilizante, mas, ao invés, é um intensificadorbiológico que estimula a planta a utilizar mais apropriadamente os nutrientesdisponíveis. Além disso, ativa e induz alelopatia e resistência a doenças naplanta tratada e estimula uma maior produção de açúcares, que são os blo-cos de construção para celulose e corpos de frutificação. O resultado é umaplanta mais produtiva e mais saudável, com caules de planta mais fortes,melhor florescimento e maior biomassa de fruta (Agraforum: Alemanha,2002, folha de dados técnicos).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção apresenta extratos e preparações à base da espécieTulbaghia violacea (Harv.) (alho selvagem), que provocam uma atividadeantimicrobiana, de preferência antifúngica, significativa in vitro e in vivo,mesmo sob condições de campo e de estufa. Além disso, esses extratosderivados das partes de solo, assim como das partes aéreas da planta pro-vocam uma atividade bioestimulante significativa, expressa, acima de tudo,por um metabolismo de crescimento aumentado sustentando o crescimentode sementes. Além disso, extratos ou preparações combinadas de Tulbaghiaviolacea e espécies do gênero Agapanthus mostram uma eficácia antifúngi-ca e bioestimulante mais elevada em comparação com extratos ou prepara-ções da espécie única, indicando que uma sinergia participa nos processosbiológicos envolvidos.

A invenção apresenta, além disso, composições de combina-ções de extratos ou preparações de diferentes espécies de plantas. Essascombinações compreendem preparações de Tulbaghia violacea (alho selva-gem) e outras espécies de plantas, como espécies do gênero Agapanthus,de preferência A. africanus. Na combinação preferida, T. violacea e uma es-pécie de Agapanthus, de preferência A. africanus, são misturados a 1:1(p/p). Alternativamente, de acordo com a invenção, uma preparação da es-pécie T. violacea é combinada com uma preparação de uma mistura de es-pécies da família do cravo e espécies de alfafa, de preferência em uma ra-zão específica. Em outra modalidade, a invenção apresenta combinações daespécie T. violacea com espécies do gênero Agapanthus e uma mistura deespécies da família do cravo e espécies de alfafa. Essas combinações pro-vocam uma atividade protetora de plantas aumentada e sinérgica, de prefe-rência uma atividade antifúngica e bioestimulante, em comparação com aspreparações de componente único correspondentes. A invenção apresenta,finalmente, compostos isolados e purificados dos ditos extratos/preparações,que também mostram atividade significativa de proteção de plantas, particu-larmente atividade antifúngica, quando aplicados a outras plantas in vitro e invivo, incluindo o cultivo em campo.

As preparações de acordo com a invenção podem ser apresen-tadas como extratos brutos ou como pó seco, dependendo do processo desua fabricação. As preparações podem compreender, além disso, particu-larmente para uso no cultivo no campo, cargas ou materiais de veículo sóli-dos, de preferência pulverulentos, de acordo com o estado da técnica. Alémdisso, as preparações de acordo com a invenção podem compreender aditi-vos convencionais que aumentam ou modulam o efeito da preparação.

As preparações de acordo com a invenção também podem serapresentadas em uma forma líquida, de preferência aquosa, que pode serusada como uma pulverização e, portanto, ser facilmente atomizada nas á-reas de cultivo. Nessas soluções ou suspensões, os extratos e preparaçõesda invenção revelam sua atividade protetora de plantas total em uma faixade concentração entre 0,2 g (extrato/pó)/1 a 2 g/L, de preferência de 0,5 g/La 1 g/L. Com relação à atividade antifúngica das preparações, o termo "ativi-dade protetora de plantas total" significa 100% de inibição do crescimento demicélios de um patógeno vegetal fúngico típico, em comparação com umpesticida de referência padrão.

A invenção também apresenta processos para a fabricação dosextratos brutos e preparações de pó seco com base na extração das plantasou partes de plantas com solventes polares orgânicos, como metanol ou e-tanol ou suas misturas. A invenção apresenta, por fim, um processo de iso-lamento, purificação e identificação de substâncias dos ditos extratos quemostrem atividade antifúngica e bioestimulante significativa em plantas do-entes in vitro e in vivo.

Em maiores detalhes, a invenção apresenta:

. Uma preparação adequada para proteção biológica de plantasà base de plantas ou partes de plantas de Tulbaghia violacea (alho selva-gem) na forma de um extrato bruto, obtenível pelas seguintes etapas:

(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luzsolar;

(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grãoentre 0,2-2 mm;

(iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgâni-co polar selecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando,assim, uma suspensão/solução;

(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão eseparação do sobrenadante da fase sólida;

(v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez;

(vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e re-moção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se,assim, o resíduo de extrato bruto.

. Uma preparação adequada para proteção biológica de plantasà base de plantas ou partes de plantas de Tulbaghia violacea (alho selva-gem) na forma de um pó seco, obtenível pelas seguintes etapas:

(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luzsolar;

(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grãomenor que 0,1 mm;

(iii) encharcamento do material triturado em metanol, formando,assim, uma suspensão/solução;

(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão;

(v) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólidada fase orgânica solúvel;

(vi) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em eta-nol e repetição das etapas (iv) e (v); e

(vii) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se,assim, um pó seco.

. Uma preparação correspondente, em que se usa uma ou maisdas diferentes partes aéreas das plantas.

. Uma preparação correspondente, em que se usam partes desolo da planta.

. Uma preparação correspondente que compreende um, mais outodos os seguintes compostos:

2,4,5,7-tetratiaoctano;2,4,5,6,8-pentatianonano;2,3,5,7,8-pentatiadecano;

2,4,6-tritiaeptano; e2,4-ditiapentano.

. Uma preparação correspondente também compreendendo ma-teriais de veículo sólidos pulverulentos ou cargas e/ou aditivos que aumen-tem ou regulem o efeito da preparação.

. Uma preparação na forma de uma solução ou suspensão a-quosa à base de uma preparação seca conforme acima especificada.

. Uma preparação correspondente, em que a concentração deextrato bruto ou pó seco está na faixa de 0,2 g/L a 2 g/L, de preferência de0,5-1,0 g/L.

. Uma composição compreendendo uma primeira preparaçãovegetal conforme acima especificada e pelo menos uma segunda prepara-ção vegetal na forma de um extrato bruto, pó seco ou uma suspensão ousolução aquosa dela, a dita segunda preparação vegetal exercendo um efei-to protetor de plantas adicional sobre as plantas ou suas partes tratadas coma composição.

. Uma composição correspondente, em que a dita segunda pre-paração vegetal deriva de uma espécie do gênero Agapanthus, de preferên-cia A. africanuns, e é obtida por etapas de processo análogas às da dita pri-meira preparação vegetal.

. Uma composição correspondente, em que a segunda prepara-ção vegetal deriva de uma mistura de espécies da família do cravo e espé-cies de alfafa, em que a proporção em peso do material de espécies de cra-vo está entre 80 e 99%, a dita segunda preparação vegetal sendo obtida poretapas de processo análogas às da dita primeira preparação vegetal.

. Uma composição de três componentes compreendendo:

(i) uma primeira preparação vegetal conforme acima especificada,

(ii) uma segunda preparação vegetal derivada de uma espéciedo gênero Agapanthus, e

(iii) uma terceira preparação vegetal derivada de uma mistura deespécies da família do cravo e espécies de alfafa, em que a proporção empeso do material seco das espécies de cravo está entre 80 e 99%, cada pre-paração na forma de um extrato bruto, pó seco ou uma suspensão ou solu-ção aquosa dele, as ditas segunda e terceira preparações exercendo umefeito protetor de plantas adicional sobre plantas ou suas partes tratadascom a composição.

. Uso da preparação/composição conforme acima especificadacomo um agente biológico protetor de plantas.

. Uso da dita preparação/composição, em que o agente biológicoprotetor de plantas é um agente antimicrobiano, como um agente antibacte-riano ou um agente antifúngico, de preferência um agente antifúngico.

. Uso da dita preparação, em que o agente antifúngico inibe ocrescimento de micélios de fungos.

. Uso correspondente para a prevenção de infecção de colheitaspor fungos sob condições de campo.

. Uso da dita preparação/composição, em que o agente biológicoprotetor de plantas é um agente bioestimulante, que provoca, de preferência,indução de crescimento e/ou induz resistência adquirida sistêmica em plan-tas ou partes de plantas tratadas com o agente.

. Uso correspondente, em que o agente bioestimulante provocaestimulação do crescimento de mudas.

. Composto isolado da dita preparação conforme acima especifi-cada selecionada do grupo que consiste em:

1Ch3S3CH2SSS7CH2S9CH3 (2,4,5,6,8-pentatianonano)

1Ch3SS4Ch2S6Ch2S8Ch2S10Ch3 (2,3,5,7,8-pentatiadecano)

1CH3S3CH2S5CH2S7CH3 (2,4,6-tritiaeptano)

1CH3S3CH2S5CH3 (2,4-ditiapentano)

. Composição adequada para proteção de plantas, compreen-dendo pelo menos dois, de preferência todos os compostos selecionados dogrupo que consiste em: 2,3,5,7,8-pentatiadecano; 2,4,5,6,8-pentatianonao;2,4,6-tritiaeptano; 2,4-ditiapentano; 2,4,5,7-tetratiaoctano.

. Uso dos ditos compostos/composições como agente biológicoprotetor de plantas.

. Uso dos ditos compostos/composições como agente antifúngi-co, que inibe, de preferência, o crescimento de micélios de fungos.

. Processo para a preparação de um extrato bruto ou uma prepa-ração de pó seco ou suspensões ou soluções aquosas dele, conforme defi-nido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fatode que se realizam as seguintes etapas:

(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar;

(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grãoentre 0,2-2 mm, de preferência 1 mm;

(iii) encharcamento dó material triturado em um solvente orgâni-co polar selecionado, como metanol ou etanol, formando, assim, uma sus-pensão/solução;(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão eseparação do sobrenadante da fase sólida;

(v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez;

(vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e re-moção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se,assim, o resíduo de extrato bruto;

e, no caso da preparação de uma preparação aquosa:

(vii) suspensão do extrato bruto resultante em água a uma con-centração adequada;

ou, alternativamente, as etapas de:

(ia) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luzsolar;

(iia) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grãomenor que 0,1 mm;

(iiia) encharcamento do material triturado em um primeiro sol-vente orgânico polar, como etanol ou metanol, formando, assim, uma sus-pensão/solução;

(iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão;(va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sóli-da da fase orgânica solúvel;

(via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em umsegundo solvente orgânico polar e repetição das etapas (iva) e (va);

(viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se,assim, um pó seco;

e, no caso da preparação de uma preparação aquosa:

(viii) suspensão do pó seco resultante em água a uma concen-tração adequada.

. Um processo correspondente, em que o solvente orgânico po-lar da etapa (iii) é metanol ou etanol a 90-100%.

. Um processo correspondente, em que o dito primeiro solventeorgânico polar da etapa (iiia) é metanol a 90-100%, e o dito segundo solven-te orgânico polar da etapa (via) é etanol a 90-100%.. Um processo correspondente, em que o respectivo solvente éusado para extrações a uma concentração de 1,0-3,0 ml_/g de peso seco domaterial vegetal triturado.

. Um processo correspondente, em que a concentração do extra-to bruto ou do material em pó seco na solução ou suspensão aquosa estáentre 0,2 g/L e 2 g/L, de preferência entre 0,5 g/L e 1 g/L.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

(A) Definições Gerais

Usam-se os termos e expressões acima e abaixo, de acordocom o entendimento desta invenção, com os seguintes significados:

o termo "agente de proteção de planta" ou "agente protetor deplanta" significa, se não especificado de outra forma, qualquer tipo de agen-te, produto, extrato, composição sintética ou natural que seja eficaz em umsentido amplo para a proteção e saúde de uma planta contra infecção e Ie-sões por patógenos in vitro e/ou in vivo. O termo inclui agentes, produtos,extratos, composições ou componentes isolados únicos de extratos quepossam mostrar algumas atividades e/ou propriedades biológicas diferentes,como atividade/eficácia antimicrobiana, antiviral, antifúngica e bioestimulan-te, atividade indutora/promotora de crescimento (com relação à planta a serprotegida), atividade inibidora de crescimento (com relação à(s) planta(s)competitiva(s) com a planta a ser protegida), atividade indutora/promotora deresistência adquirida sistêmica e/ou imunológica e atividade induto-ra/promotora de alelopatia.

O termo "proteção biológica de planta" significa, de acordo coma invenção, se não especificado de outra forma, que a proteção de umaplanta é conseguida por substâncias ou fontes de ocorrência natural ou deri-vadas naturalmente, de preferência de plantas, e não por meios ou agentessintéticos ou químicos, que não ocorram na natureza, de preferência plantasou partes de plantas.

O termo "agente biológico de proteção (protetor) de planta" é,assim, conseqüentemente, um extrato vegetal, uma preparação vegetal,uma composição à base de plantas ou suas partes, ou um agente isolado deum extrato/preparação/composição vegetal, todos mostrando eficácia signifi-cativa contra um patógeno vegetal in vitro e/ou in vivo. Esse termo tambéminclui compostos quimicamente sintetizados que sejam estrutural e funcio-nalmente idênticos ao composto derivado naturalmente isolado, mas excluiexpressamente pesticidas quimicamente sintetizados e compostos relacio-nados sem nenhuma contrapartida derivada naturalmente.

O termo "pesticida" significa, de acordo com a invenção, se nãoespecificado de outra forma, compostos, agentes ou composições sintéticasque não ocorram ou não sejam derivadas naturalmente, que tenham eficáciaprotetora de plantas.

O termo "patógeno de planta" significa um composto ou compo-sição ou material vivo, como um microorganismo (incluindo vírus), que causedoença ou lesão à planta. Em um âmbito mais estreito da invenção, o termofocaliza microorganismos patogênicos, incluindo produtos metabólicos des-ses microorganismos.

O termo "antimicrobiano", de acordo com a invenção englobauma eficácia ou atividade contra microorganismos, incluindo vírus, bactériase fungos, que reduz ou elimina in vitro e/ou in vivo o número (relativo) demicroorganismos ativos que ataquem a planta ou suas partes a serem pro-tegidas. Assim, o termo inclui os termos "antiviral", "antibacteriano" e "anti-fúngico". Um "agente antimicrobiano" de acordo com a invenção é um agen-te biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que previna oureduza infecções ou lesões de uma planta causadas por um microorganismopatogênico.

O termo "antibacteriano" significa, de acordo com a invenção,uma atividade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) quereduza ou elimine o número (relativo) de bactérias ativas. Um "agente anti-bacteriano" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor deplanta, conforme acima especificado, que previna ou reduza infecções oulesões in vitro e/ou in vivo de uma planta causadas por uma bactéria pato-gênica.

O termo "antiviral" significa, de acordo com a invenção, uma ati-vidade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) que reduzaou elimine o número (relativo) de vírus ativos. Um "agente antiviral" de acor-do com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acimaespecificado, que previna ou reduza infecções ou lesões in vitro e/ou in vivode uma planta causadas por um vírus patogênico.

O termo "antifúngico" significa, de acordo com a invenção, umaatividade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) que redu-za ou elimine o número (relativo) de fungos ativos. Um "agente antifúngico"de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, confor-me acima especificado, que previna ou reduza infecções ou lesões in vitroe/ou in vivo de uma planta causadas por um fungo patogênico. A atividadeantifúngica pode levar à inibição do crescimento de micélios, assim como ageraminação de esporos de fungos.

O termo "bioestimulante" significa, de acordo com a invenção, senão especificado de outra forma, uma atividade ou eficácia que estimule,aumente ou melhore muitos processos diferentes na planta ou partes deplantas, como melhor geração de substâncias promotoras de crescimento,como açúcares e aminoácidos, melhor suprimento adequado de células comnutrientes disponíveis e reguladores de crescimento, metabolismo celularintensificado, melhor descontaminação de células, defesa imune intensifica-da, promoção do crescimento e rendimento, indução de resistência adquiridasistêmica (SAR), inibição do crescimento e rendimento de plantas competiti-vas (alelopatia). A atividade bioestimulante pode ser causada por agentes,extratos de plantas e composições, incluindo compostos metabólicos sinteti-zados pela planta a ser protegida após a indução de sua síntese pelo ditoagente bioestimulante. Um "agente bioestimulante" de acordo com a inven-ção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado,que mostre as propriedades bioestimulantes acima especificadas em umaplanta tratada com esse agente in vitro e/ou in vivo.

Um "regulador do crescimento de planta" é um composto ouuma mistura de substâncias naturais ou sintéticas que modifique ou controleum ou mais processos fisiológicos específicos dentro de uma planta. Se ocomposto for produzido dentro da planta é chamado de hormônio vegetal,por exemplo, auxinas, giberelinas, ácido abscísico e etileno.

"SAR" (Resistência Adquirida Sistêmica) ocorre em uma plantaou suas partes, de acordo com a invenção, se mostrar indução ou aumentoda atividade de enzimas relacionadas à defesa ou proteção (proteínas PR).Essas enzimas incluem, por exemplo, peroxidase, p-1,3-glucanase e NAD-PH oxidase.

(B) Descrição da Planta

Tulbaghia violacea é conhecida como alho selvagem, e o nomese origina do fato de que, embora seu sabor seja próximo ao do alho real,supõe-se que não deixa odores desagradáveis no hálito. O nome da espécie"violacea" vem do latim para "violeta". Pertence à família Alliaceae (Lilliacea-e). Tulbaghia violacea se originou na África do Sul. É cultivado como um or-namento em jardins botânicos e em jardins domésticos por todo o sul da Á-frica e é cultivado em alguns países estrangeiros, como EUA e Reino Unido.Tulbaghia violacea é usada em alimentos como substituto do alho. O alhoselvagem é tradicionalmente usado para febre e resfriados, mas tambémpara asma e tuberculose. As folhas são usadas para tratar câncer do esôfa-go. Tulbaghia violacea é uma erva perene, formadora de moitas, vigorosa eque se espalha, com folhagem do tipo grama e rizomas do tipo bulbo. A in-florescência consiste em 3-40 umbelas floridas. Os cimos das flores se loca-lizam em caules longos, finos e solitários, que ficam bem acima da folhagem.As flores nos caules são pequenas e agrupadas em umbelas nas pontas dashastes. A altura madura da planta é de 30 a 60 cm. As flores são de uma corpúrpura lilás ou violeta. Tulbaghia violacea é muito fácil de cultivar e suportanegligências durante muitos anos. As plantas formam moitas que não preci-sam ser divididas, a menos que as flores mostrem sinais de deterioração. Aplanta é capaz sobreviver em solo muito ruim ou em solo de jardim comum,mas cresce com maior sucesso em solo argiloso bom generosamente mistu-rado com composto. A drenagem deve ser boa, particularmente em áreas dechuvas de inverno. As plantas requerem umidade a intervalos regulares du-rante todo o ano, mas mais particularmente durante o verão. São robustas epodem ser cultivadas em locais frios. A propagação é por sementes ou divisões.

(C) Microorganismos

Sete patógenos fúngicos de plantas sul-africanos comuns sãoescolhidos para teste quanto às propriedades fungitóxicas dos extratos deplantas. Esses patógenos fúngicos incluíam Botrytis cinerea Pers.: Fr. (Hifo-micetos), Fusarium oxysporum Schiechtend.: Fr. (Hifomicetos), Sclerotiniarollfisii Saee. (Agonomieetos), Rhizoetonia solani Kühn (Agonomieetos),Brotyosphaeria dothidea (Moug.: Fr.) Ces. & De Not. (Loeuloaseomicetos),Phythium ultimum Trow (Oomieetos) e Mycosphaerella pinodes (Berk. +Blox.).

As bactérias patogênicas para plantas usadas neste estudo in-cluem Agrobaeterium tumefaeiens (Smith e Townsend), Clavibaeter miehiga-nensis (Smith), Erwinia earotovora pv. earotovora (Jones), Xanthomonaseampestris Pammel pv. Phaseoli (Dawson), Ralstonia solanaeearum (Smith)e a bactéria humana Moraxella catarrhalis (Frosch + Kolle).

(D) Triagem de extratos brutos de Tulbaghia violaeea quanto àatividade antimicrobiana e bioestimulante in vitro

1. Geral

Extratos de certas plantas de T. violaeea possuem propriedadesantimicrobiana e bioestimulante e têm o potencial de ser exploradas comoprodutos naturais no controle de doenças de plantas ou para promover ocrescimento de colheitas.

O potencial bioestimulante dos extratos foi avaliado in vitro se-guindo-se seu efeito sobre a taxa de respiração de uma monocultura de cé-lulas de levedura, a germinação de sementes de agrião, assim como o cres-cimento de radícula e coleóptilo de mudas de agrião.

Os extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. viola-eea revelam significativa atividade bioestimulante sobre a taxa de respiraçãode células de levedura, assim como como sobre o crescimento de radícula ecoleóptilo de mudas de agrião, mas não têm nenhum efeito sobre a germi-nação das sementes.Os extratos brutos também mostram alguma atividade antibacte-riana in vitro contra quatro das sete bactérias testadas.

Os extratos brutos provocam uma atividade antifúngica significa-tiva (P < 0,05) contra seis fungos fitopatogênicos economicamente importan-tes. Os extratos brutos têm desempenho melhor que o fungicida padrão u-sado como controle positivo e inibem completamente o crescimento de micé-Iios de cinco dos seis fungos, incluindo o Pythium ultimum altamente resis-tente.

2. Recuperação de Extrato Bruto do Material de Planta Secode secar e triturar, 7,96% (p/p) de material seco de par-tes aéreas e 26,1% (p/p) de material seco de partes abaixo do solo podemser obtidos a partir do material de T. violacea fresco original (Tabela 1). De-pois da extração, 14% (p/p) de material bruto seco podem ser recuperados apartir do material de partes aéreas seco, ao passo que 6,7% (p/p) de materi-al bruto seco podem ser recuperados a partir do material de partes abaixo dosolo seco.

Tabela 1: Recuperação de Extrato Bruto do Material de Planta Seco

<table>table see original document page 21</column></row><table>

3. Atividade antibacteriana in vitro de extratos brutos de T. violacea

Das seis bactérias fitopatogênicas usadas como organismos deteste, o crescimento de três patógenos de plantas (C. michiganensis, R. so-lanacearum, X. campestris) foi significativamente inibido tanto por extratosbrutos de partes abaixo do solo, quanto aéreas, mostrando os resultadospara M. catharrhalis (Tabela 2).<table>table see original document page 22</column></row><table>As outras três bactérias eram muito mais resistentes ao trata-mento com os extratos brutos e não foram afetadas pelos extratos.

4. Atividade Antifúnqica de Extratos Brutos de T. violacea

O extrato da parte abaixo do solo de T. violacea inibiu comple-tamente (100%) o crescimento de micélios de B. cinerea, S, rolfsii e P. ulti-mum e mostrou uma inibição muito grande (> 95%) tanto de F. oxysporum,quanto de fí. solani. A menor inibição observada (90%) foi contra B. dothidea(Figura 1). A inibição do crescimento de micélios pelo extrato de partes aé-reas também foi muito elevada (> 95%) para B. cinerea, S. rolfsii e P. ulti-mum e > 80% para R. solani e B. dothidea. Fusarium oxysporum (75% deinibição) foi o mais resistente contra o tratamento com extrato de partes aé-reas. Estatisticamente, tanto os extratos brutos de partes aéreas, quantoabaixo do solo de T. violacea tiveram desempenho melhor que o fungicida,padrão (P < 0,05) em termos de inibição do crescimento de micélios de qua-tro dos seis fungos testados. Entretanto, ambos os extratos se compararamfavoravelmente com o fungicida padrão em termos de inibição do crescimen-to de micélios.

A figura 2 ilustra a atividade antifúngica in vitro dos mesmos doisextratos brutos de T. violacea após armazenamento a -20°C durante um a-no. Em comparação com o fungicida padrão, observou-se uma diminuiçãona atividade antifúngica de > 30% tanto para os extratos brutos de partesaéreas, quanto abaixo do solo armazenados em um congelador a -20°C du-rante um ano.

A Tabela 3 mostra a atividade antifúngica média in vitro de extra-tos de diferentes órgãos de plantas de T. violacea (1 mg/mL) in vitro, emcomparação com o fungicida Eria® padrão.

Tabela 3: Atividade antifúngica in vitro de extratos brutos de diferentes ór-gãos de T. violacea

<table>table see original document page 23</column></row><table>Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/dife-noconazol (Eria®)

Diferentes letras após os valores indicam diferenças estatistica-mente significativas

5. Atividade Bioestimulante de Extratos Brutos de T. violacea

Tanto extratos brutos de partes aéreas, quanto abaixo do solode T. violacea aumentaram a taxa de respiração de uma monocultura decélulas de levedura acentuadamente nos primeiros 90 minutos de incubação(figura 3), em comparação tanto com controles de água, quanto de Com-Cat®. Entretanto, após 120 minutos de incubação, as diferenças na taxa derespiração eram menos pronunciadas, pois a taxa máxima provavelmente foiatingida. Embora o bioestimulante comercial ComCat® também tivesse umefeito crescente sobre a taxa de respiração de células de levedura, essa nãofoi tão acentuada como o efeito de ambos os extratos brutos de T. violacea.

Não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significa-tiva (P < 0,05) na porcentagem de germinação de sementes de agrião entresementes tratadas e não tratadas (Tabela 4).

Tabela 4: Porcentagem média (%) de germinação de sementes de agrião,tratadas com extratos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea, a25°C durante um período de incubação de 96 horas. ComCat® e água desti-lada serviram de controles.

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Entretanto, tanto os extratos brutos de partes aéreas, quantoabaixo do solo de T. violacea tiveram um efeito estimulante significativo tantosobre o crescimento de coleóptilos, quanto de raízes de mudas de agrião,quando comparados ao controle de água. Não houve nenhuma diferençasignificativa na atividade bioestimulante entre os extratos e o bioestimulantecomercial ComCat® (figura 4 e 5).

(6) Propriedades Antifúnaicas de Extratos Brutos de A. africanus Combina-dos com Extratos de Tulbaghia violaceaUm extrato bruto ou um pó seco de uma espécie do gênero A-gapanthus, como A. africanus, é preparado de maneira análoga aos méto-dos aqui descritos para T. violacea. Os extratos ou pós secos são mistura-dos em uma razão de 1:1, e se aplicam soluções aquosas em diferentesconcentrações variando de 0,25 mg/mL a 2 mg/mL.

É interessante notar que uma mistura a 50:50 dos dois extratos,aplicada a 0,5 mg/mL, mostra um controle total dos seis fungos de teste (Ta-bela 5), ao passo que, em comparação, com a aplicação separada da con-centração de duas vezes (1 mg/mL) da preparação de A. africanus ou dapreparação de T. violacea, a inibição do crescimento de micélios dos fungosde teste não é completa. Mesmo a uma concentração de 0,25 mg/mL deuma preparação combinada de extrato/pó seco (1:1) leva a uma inibiçãoglobal do mesmo sistema de fungo de mais de 90%, indicando que uma si-nergia significativa é eficaz no sistema de combinação. O mesmo efeito éobservável com outros agentes protetores de plantas.<table>table see original document page 26</column></row><table>Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/difenoconazol (Eria®)Diferentes letras após os valores indicam diferenças estatisticamente signifi-cativas

(7) Sumário dos Resultados

Os efeitos fungitóxicos in vitro tanto dos extratos brutos de par-tes aéreas, quanto acima do solo de T. violacea são significativamente maiselevados do que os do fungicida sintético. Todos os fungos de teste sãosensíveis aos extratos, enfatizando seu potencial de amplo espectro. À luzdo fato de que T. violacea é fácil de cultivar e pode suportar negligênciasdurante muitos anos, é um forte candidato a cultivo em grande escala comouma planta doadora no caso de a produção de um fungicida natural ser con-siderada. O declínio da fungitoxicidade de extratos de T. violacea de um anode idade a -20°C é ambientalmente desejável para uso sob condições decampo. À luz da atual ênfase no cultivo orgânico, o desenvolvimento de umfungicida natural a partir de extratos de T. violacea deve ser fortemente con-siderado. O fato de que o extrato de parte aérea é tão potente quanto o ex-trato de parte abaixo do solo na inibição do crescimento de micélios de umamplo espectro de patógenos de plantas indica que plantas cultivadas pode-riam ser colhidas de maneira não destrutível. Partes abaixo do solo podem,então, permanecer no solo para a produção da colheita da próxima estaçãode maneira sustentável.

Além disso, tanto extratos brutos de partes aéreas e abaixo dosolo de T. violacea, quanto o bioestimulante comercial ComCat® aumentamsignificativamente a taxa de respiração de uma monocultura de células delevedura nos primeiros 90 minutos e reduzem o ritmo após 120 minutos deincubação, indicando um efeito bioestimulante significativo. Isso significa quetanto os extratos, quanto ComCat® estimulam a produção de dióxido de car-bono mais do que a água, isto é, aumentam a taxa de respiração, tornandomais energia disponível para a germinação e crescimento de mudas. Con-seqüentemente, parece existir uma correlação positiva entre uma alta taxade respiração e o crescimento de mudas, pois extratos brutos de ambos osórgãos estimulam significativamente o crescimento de radículas e coleóptilosde mudas de agrião durante um período de 96 horas, em comparação com ocontrole de água. Nesse estudo, não se pode observar nenhuma diferençasignificativa entre os extratos brutos e ComCat® na estimulação do cresci-mento de mudas, colocando os extratos de T. violacea em igualdade com obioestimulante comercial. Estatisticamente (P < 0,05), a germinação de se-mentes de agrião não mostra nenhuma resposta significativa a extratos deambos os órgãos, em comparação com os controles tanto de ComCat®,quanto de água. Esse estudo revela que os extratos de T. violacea de fatopossuem propriedades bioestimulantes, particularmente com relação à in-tensificação do crescimento de mudas. Isto representa um desafio para apesquina em grande escala dessa questão para avaliar, além disso, o po-tencial de aplicação sob condições de campo. Em sumário, a atividade anti-fúngica de amplo espectro média acima de extratos brutos de T. violacea,assim como a menor atividade antibacteriana e as propriedades bioestimu-lantes significativas levam à conclusão de que o extrato bruto de T. violaceaé favorável para o uso dessas plantas na proteção biológica de plantas.

Extratos/pós secos combinados à base de preparações de duasou mais plantas com propriedades protetoras de plantas, em que pelo me-nos uma é T. violacea, mostram uma eficácia antifúngica e bioestimulante deampla gama pelo menos in vitro, com base em efeitos sinérgicos.

(E) Controle in vivo de Mvcosphaerella pinodes em Folhas de Ervilha (Pisumsativum) por Extratos de Tulbaghia violacea

1. Geral

• A ferrugem Ascochyta de ervilhas (Pisum sativum) causada porMycosphaerella pinodes (Berk & Blox.) Vesterger ocorre no mundo todo ecausa perdas de rendimento de até 30%. É uma doença de importância e-conômica e pode causar será redução de rendimento de ervilhas cultivadastanto para consumo humano, quanto animal. É uma grande restrição à pro-dução de ervilhas no campo, e é o patógeno foliar mais destrutivo da ervilhaem muitos países. O fungo infecta mudas de ervilha ao emergirem, causan-do lesões em cinta no caule. A infecção dos caules resulta em pequenasraias marrons que depois ficam de cor azul-preta, que reduzem as popula-ções de ervilhas no campo e aumentam o alastramento. As lesões necróti-cas se desenvolvem em todas as partes aéreas da planta de ervilha, incluin-do as vagens, cultivada a partir de sementes contaminadas.

Mycosphaerella pinodes se dissemina mediante picnidiosporosdurante toda a estação. Depois da germinação dos esporos, o fungo crescesobre a superfície da planta antes de formar um aspersório e penetrar nacutícula. Os sintomas podem aparecer até 24 horas após a infecção sobcondições ótimas e se caracterizam por lesões marrons a púrpura coales-centes no tecido aéreo. Esporos não germinados permanecem viáveis du-rante até 21 dias sob condições secas. A infecção e o desenvolvimento dadoença são altamente dependentes da temperatura e da umidade da folha.

Um extrato bruto em metanol de partes aéreas de T. violacea étestado contra Mycosphaerella pinodes, a causa de manchas pretas ou fer-rugem Ascochyta em ervilhas (Pisum sativum). O extrato bruto previne a in-fecção por esporos de M. pinodes das folhas de ervilha, quando as folhassão inoculadas com esporos tanto antes, quanto depois do tratamento com oextrato, confirmando a inibição completa da germinação de esporos. O extra-to bruto não mostra nenhuma reação fitotóxica sobre as folhas, mesmo àmaior concentração aplicada.

2. Atividade Antifúnqica in vivo de Preparações de T. violacea sob Condi-ções de Estufa

O tratamento de folhas de ervilha destacadas com o extrato bru-to primeiro, seguido por inoculação com esporos 30 minutos depois, suprimetotalmente a formação de lesões nas folhas (Tabela 6) a todas as concentra-ções testadas. Esse também é o caso para o tratamento com fungicida pa-drão antes da inoculação. Entretanto, quando as folhas são inoculadas comos esporos primeiro, seguido pelo tratamento com diferentes concentraçõesdo extrato bruto, formam-se lesões nas folhas tratadas com as baixas con-centrações de extrato de 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL (2,38 e 1,88 mm, respec-tivamente; Tabela 6). A inoculação com esporos seguida por tratamento comextrato bruto de partes aéreas às mesmas duas baixas concentrações mos-trou uma supressão significativamente melhor (P < 0,05) do desenvolvimen-to da lesão do que a inoculação com esporos seguida por tratamento com ofungicida padrão (3,63 mm), mas este inibiu significativamente a formaçãode lesões, quando comparado com o controle (apenas inoculação de espo-ros, 9,44 mm). A concentrações de 1,0 e 2,0 mg/mL, o extrato de partes aé-reas de T. violacea inibiu totalmente a infecção de folhas de ervilha por es-poros de M. pinodes (Tabela 6).

No ensaio de triagem in vivo usando folhas de ervilha inoculadascom esporos de M. pinodes antes ou depois do tratamento com os extratosde plantas, o extrato bruto de T. violacea pode inibir a germinação de espo-ros de M. pinodes 100% à menor concentração usada (0,25 mg/mL), quandoo extrato foi aplicado antes da inoculação com esporos. Esse é um valormuito favorável em comparação com outras plantas, como extratos de Aga-panthus africanus, que mostra uma inibição de 100% a uma concentraçãode no mínimo 1 mg/mL.

Tabela 6: Atividade in vivo de Extratos Brutos das Partes Acima do Solo deT. violacea Contra Mycospaerella pinodes Sobre Folhas de Ervilha

<table>table see original document page 30</column></row><table>

*Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/difenoconazol (Eria®)(3) Efeitos Fitotóxicos de Preparações de 7". violacea Sobre Fo-lhas de Ervilhas sob Condições de Estufa

A classificação de fitotoxicidade in vivo do extrato bruto das par-tes aéreas de T. violacea em termos de sua interação com e potencial parainduzir necrose em folhas de ervilha revelou que o extrato bruto não era fito-tóxico, mesmo à maior concentração testada (Tabela 7), e que o efeito semsintomas do extrato era similar ao da água e controles de fungicida padrão.Tabela 7: Classificação de Sintomas de Fitotoxicidade Foliar Média em umaEscala de Seis Categorias após Inoculação Direta de Folhas de Ervilha noQuarto Nó com Diferentes Concentrações de um Extrato Bruto de PartesAéreas de Tulbaghia violacea

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Os valores designados com diferentes letras diferiram significati-vamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de DiferençaMenos Significativa (LSD).(4) Discussão Geral

Nenhuma das quatro concentrações (0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL)de um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea é fitotóxico para folhasde ervilha (Pisum sativum). Quando as folhas de ervilha são tratadas com oextrato primeiro e seguido por inoculação com esporos 30 minutos depois, oextrato suprime a germinação de M. pinodes totalmente, mesmo à menorconcentração de 0,25 mg/mL. Isso indica que o extrato bruto de partes aé-reas de T. violacea mostram potencial para ser usado como uma medidapreventiva contra ferrugem Ascochyta causada por M. pinodes em folhas deervilha, sem causar lesões à planta. De acordo com Benner (1993, PesticideScience 39:95-102), a fitotoxicidade é um fator decisivo na avaliação de ex-tratos de plantas quanto à sua aplicação em potencial como pesticidas natu-rais em agricultura.

Além disso, quando as folhas de ervilha foram inoculadas comesporos de M. pinodes 30 min. antes do tratamento com o extrato bruto departes aéreas de T. violacea, a concentração de 1 mg/mL inibiu totalmente agerminação de esporos e a subseqüente formação de lesão, indicando que oextrato bruto também possui o potencial para ser usado como uma medidacorretiva contra ferrugem Ascochyta.

Os resultados obtidos nesse estudo confirmam o potencial deum extrato bruto de T. violacea para controlar infecções fúngicas de colhei-tas, pelo menos sob condições controladas. Mesmo a concentração quatrovezes maior que era necessária para inibir corretivamente a germinação deesporos de M. pinodes, em comparação com a menor concentração que eranecessária como medida preventiva, ainda se encontra dentro de uma faixaeconomicamente viável de 1 g/L. Considerando-se que uma média de 400litros de solução de fungicida normalmente são aplicados por hectare sobcondições agrícolas, essa concentração está em linha com os fungicidasatuais comercialmente disponíveis. Uma concentração inibitória mínima(MIC) de 1 g/L também é muito menor que a MIC relatada para um extratobruto de bulbo de Eucomis autumnalis (Pretorius et al., 2002, Annals of Ap-plied Biology 141:125-131).

• Esses achados são valiosos para avaliar a aplicação em poten-ciai do extrato bruto de partes aéreas de T. violacea em um sistema de con-trole de pragas integrado (IPM) em termos de minimização das perdas decolheitas causadas pela ferrugem Ascochyta.

(5) Controle de Carvão Coberto e Solto de Sorgo por um Extrato Bruto dePartes Aéreas de Tulbaghia violacea sob Condições de Campo

O sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) é uma importante fonte dealimentos em muitos países não desenvolvidos e sen/e de principal alimentopara a maioria das pessoas. É predominantemente cultivado em sistemas deprodução de pequena escala sob uma ampla gama de condições ambien-tais. Entretanto, a produção de sorgo é de menos de 1,0 toneladas/ha devidoa várias razões. O carvão de semente coberta de sorgo (Sporisoriium sorghiLink, G. P. Ciinton) e de semente solta (Sporisorium cruenta Kuhn, A. A. Pot-tef) são os principais fatores responsáveis pelos baixos rendimentos. Ambasas doenças ocorrem freqüentemente quando o sorgo é cultivado sem trata-mento das sementes contra esses dois patógenos. Um extrato bruto de par-tes aéreas de TuIbaghia violacea pode ser avaliado contra carvão de semen-te coberta (Sporisoriium sorghi) e solta (Sporisoriium cruentum) sob condi-ções de campo. O extrato bruto é aplicado à taxa de 2,0 mg/mL em lotes de90,0 g de sementes de sorgo por inoculação artificial de conjuntos separa-dos de sementes de sorgo com esporos de carvão a uma taxa de 0,5% (p/p).

Um fungicida padrão, Thiram (65 W), é aplicado como um tratamento desementes a uma taxa de 0,25%/kg de sementes de sorgo e serve de contro-Ie positivo. A incidência de doença observada durante a colheita é expressacomo uma porcentagem das plantas infectadas. Ambos os tratamentos re-duzem significativamente (P < 0,05) a incidência tanto de carvão de sementesolta, quanto coberta e resultam em aumentos de rendimento significativosem comparação com o controle não tratado. A incidência de carvão cobertoe solto e o rendimento podem ser significativamente correlacionados (R2-0,92, P < 0,05) e (R2 = 0,75, P = 75). Desses resultados, considera-se que oextrato bruto de partes aéreas de T. violacea tem o potencial de ser desen-volvido em um biofungicida ambientalmente amigável para aplicação em sis-temas de cultivo em pequena escala, em que substâncias químicas sintéti-cas estão fora do alcance do fazendeiro de subsistência médio.

O tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto departes aéreas de T. violacea antes do plantio reduziu completamente (100%)(P < 0,05) a incidência de carvão coberto (Tabela 8a) e reduziu significati-vamente a incidência de carvão solto (Tabela 8b), em comparação com oscontroles não tratados correspondentes, e se comparou favoravelmente como fungicida sintético, Thiram, no controle de carvão de semente coberta.

Tabela 8a: Efeito de um Extrato Bruto de Partes Aéreas de T. violacea sobrea Porcentagem de Incidência da Doença de Carvão de Semente Coberta noSorgo sob Condições de Campo

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Tabela 8b: Efeito de um Extrato Bruto de Partes Aéreas de T. violacea sobrea Porcentagem de Incidência da Doença de Carvão de Semente Solta noSorgo sob Condições de Campo

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Os valores designados com diferentes letras diferiram significati-vamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Menor Di-ferença Significativa (LSD) de Duncan.

A inoculação de sementes de sorgo pré-plantadas com esporosde carvão coberto e solto, sem tratar também as sementes com Thiram ouextrato bruto de A. violacea (controles não tratados), diminuiu significativa-mente os rendimentos finais (Tabelas 7a e 7b). No caso do carvão coberto, aperda de rèndimento foi de 46,7% e, no caso do carvão solto, 55,2%. Entre-tanto, em ambos os casos, não houve nenhuma diferença significativa derendimento entre os gráficos traçados com Thiram ou extrato bruto de T. vio-lacea. Uma diferença significativa no rendimento entre os controles tratadoscom Thiram e não tratados também foi observada em ambos os casos.

A porcentagem de incidências de carvão coberto e solto estavanegativamente correlacionada (R2 = -0,92 e -75, respectivamente) com orendimento de grãos de sorgo, indicando o impacto negativo que ambas asdoenças de carvão tinham no rendimento.O pré-tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto departes aéreas de T. violacea a uma taxa de 2 g/L previne completamente ainfecção de semente coberta e reduz significativamente a incidência de car-vão de semente solta sob condições de campo. Isso é favoravelmente com-parável com a diminuição na incidência de doença pelo fungicida sintéticopadrão, Thiram, e confirma a eficácia do extrato bruto. Embora a incidênciade carvão de semente coberta seja relativamente baixa (9%) em compara-ção com a incidência de carvão solto (25%) nos controles não tratados, to-das as plantas (100%) cultivadas a partir de sementes inoculadas podem sertotalmente protegidas contra a infecção por carvão de semente coberta, aopasso que a incidência de carvão solto é significativamente reduzida após otratamento das sementes com o extrato bruto de partes aéreas de T. viola-cea. As diferenças significativas nos rendimentos de grãos obtidas entreplantas cultivadas a partir de sementes tratadas e não tratadas confirma oimpacto que ambas as doenças têm sobre o rendimento, assim como a efi-cácia do extrato bruto no controle de ambas as doenças.

O tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto departes aéreas de T. violacea não tem nenhum efeito inibitório aparente sobrea germinação de sementes ou o crescimento de mudas. Isto, juntamentecom as atividades antifúngicas in vitro e in vivo significativas demonstradasnesse estudo para um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea contraum amplo espectro de patógenos fúngicos, confirma tanto seu potencial deaplicação, quanto a confiabilidade.

Em geral, embora o fungicida sintético Thiram seja muito eficazno controle de infecção por carvão de semente coberta e solta no sorgo, aaplicação de extratos brutos de plantas, incluindo T. violacea, parece umaalternativa conveniente, eficaz e econômica para a maioria dos fazendeirosde subsistência que não podem arcar com substâncias químicas sintéticas.

(6) Efeito de Tulbaghia sobre o Mecanismo de Defesa de Plantas (SAR)

As plantas (por exemplo, trigo e girassol) provocam, quando tra-tadas com um extrato de Tulbaghia violacea e outra planta de referência (Aafricanus) de acordo com a invenção, uma ativação significativa de proteínasPR, como NADPH oxidase, peroxidase e β-1,3-glucanase. Plantas de trigotratadas com o extrato de T. violacea exibem dois picos na atividade deNADPH oxidase. O primeiro pico é atingido 6 h após o tratamento com umaumento induzido na atividade de 36% com relação ao tempo de amostra-gem precedente, em comparação com o controle não tratado. O segundopico muito mais elevado é atingido 12 h após o tratamento com um aumentoinduzido na atividade de 100% com relação ao tempo de amostragem pre-cedente (figura 8), após o que a atividade declina. Girassol tratado com oextrato de T. violacea exibe um aumento na atividade de NADPH oxidase de88,5% durante as primeiras 6 h após o tratamento. Esse nível elevado deatividade é mantido durante 48 h após o tratamento, seguido por um declínioabrupto até 96 h após o tratamento (figura 9). O tratamento de trigo com oextrato de T. violacea resulta em uma enorme indução na atividade da pero-xidase de 460% após 24 h. Essa atividade também permanece elevada du-rante o período de teste (figura 10). No caso de girassol, os extratos de T.violacea induzem significativamente a atividade de peroxidase, particular-mente após 48 h e 96 h (figura 11). Para T. violacea, a indução foi de 112%após 48 h e 150% após 96 h. O controle de girassol, entretanto, mostrou umleve aumento na atividade de peroxidase durante o período de 96 h, indi-cando alguma resistência natural. Extratos de Tulbaghia induzem mecanis-mos de defesa em plantas de trigo e girassol. Esses extratos induzem resis-tência adquirida localizada, a acumulação de proteínas PR por ativação degene e, finalmente, resistência adquirida sistemática. O fato de que os extra-tos induzem uma resposta de defesa tanto em amostras de trigo, quanto gi-rassol indicam que os extratos são responsáveis pela indução de uma res-posta de defesa de amplo espectro genérica. O aumento induzido pelo extra-to nas atividades de enzimas relacionadas a defesa foi menor, mas compa-rável ao aumento obtido durante a infecção com cultivares resistentes.(F) Isolamento, Purificação e Identificação de Compostos Antifúngicos deExtratos de Partes do Solo e Áreas de Tulbaghia violacea(1) Recuperação de extratos semipurificados líquido-líquido do extrato brutoem metanolA maioria dos compostos tanto nos extratos de partes aéreas,quanto abaixo do solo são mais solúveis em hexano do que nos solventesmais polares usados. Até 9,20 g (14,6%) de compostos de partes aéreas e7,43 g (8,4%) de partes abaixo do solo podem ser recuperados em hexano,em comparação com a recuperação muito menor nos solventes mais polares(Tabela 9).

Tabela 9: Recuperação de compostos de Tulbaghia violacea por solventespara aumentar os valores de DC usando um procedimento de extração Ifqui-do-líquido

<table>table see original document page 37</column></row><table>

(2) Propriedades Antimicrobianas dos Extratos Líquido-líquido de Partes Aé-reas e Abaixo do Solo de T. violacea

Embora todas as extrações líquido-líquido das partes aéreas deT. violacea mostrem atividade antifúngica contra a maioria dos organismosde teste em maior ou menor medida, a dos extratos em hexano e éter dietíli-co são significativamente (P < 0,05) maiores (Figura 6). A inibição do cres-cimento de micélios de todos os fungos de teste por um ou por ambos osextratos em hexano e éter dietílico é maior que 80%, exceto no caso de P.ultimum, bem-conhecido por sua resistência contra fungicidas, assim comoR. solani {61%). Ambos esses extratos se comparam favoravelmente com ofungicida padrão usado como um controle positivo. Compostos antifúngicosnas partes abaixo do solo (Figura 7) de T. violacea mostram a mesma ten-dência a se acumularem nas frações de hexano e éter dietílico após a extra-ção líquido-líquido, como foi o caso com as partes aéreas (Figura 6). Entre-tanto, no caso de B. dothidea, todos os extratos mostram atividade antifúngi-ca excepcionalmente elevada.(3) Fracionamento por Cromatografia em Coluan (CCF) dos Extratos em He-xano mais Ativos

Apenas compostos na extração ativa líquido-líquido em hexanopodem ser adicionalmente purificados por meio de cromatografia em colunano caso tanto das partes aéreas, quanto abaixo do solo de T. violacea. Arazão para essa decisão é o fato de que seis vezes mais compostos podemser recuperados do extrato em hexano, em comparação com o extrato ativoem éter dietílico, no caso de partes aéreas, e quatro vezes mais no caso departes abaixo do solo. Mais de 1.500 frações de cromatografia em colunapodem ser obtidas dos extratos em hexano para cada uma das partes aé-reas e abaixo do solo. Depois de poderem ser submetidas a Q-TLC, as fra-ções com perfis similares são combinadas. Vinte e oito frações de colunacombinadas podem ser obtidas para as partes aéreas e 20 para as partesabaixo do solo dessa maneira. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Apenas quatro frações de coluna combinadas (A5, A6, A7 e A8) das partesaéreas apresentam atividade antifúngica acima da média (100, 95, 52,6 e60,5%), respectivamente, ao passo que apenas duas frações combinadas(B2 e B3) de partes acima do solo são ativas (87 e 97%, respectivamente). Orestante das frações é incapaz de suprimir o crescimento de micélios de F.oxysporum eficazmente (Tabela 10). Apenas frações de coluna combinadasque mostram mais de 50% de inibição do crescimento de micélios do fungode teste em média podem ser adicionalmente purificadas por meio de cro-matografia de camada fina preparatória (P-TLC). A razão para tomar 50% deinibição como critério é para compensar a possibilidade de que substânciasativas possam agir sinergicamente e de que, na separação, a atividade pos-sa declinar.Tabela 10: Porcentagem (%) de Inibição do Crescimento de Micélios do Or-ganismo de Teste, Fusarium oxyporum, por Frações Combinadas de Croma-tografía em Coluna de Extrações de Partes Aéreas e Abaixo do Solo de T.violacea (B = Partes Abaixo do Solo e A = Partes Aéreas)

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Valores com valores negativos (-) indicam estimulação do cres-cimento de micélios.Apenas as seis frações ativas combinadas de cromatografia decoluna mostradas na Tabela 10 (A5, A6, A7, A8, B2 e B3) são submetidas apurificação adicional por meio de P-TLC.

(4) Purificação por Cromatografia de Camada Fina Preparatória (P-TLC) Di-recionada a Atividade de Frações Ativas Combinadas de Cromatografia em Coluna

A purificação direcionada a atividade de compostos nas seis fra-ções de coluna combinadas feita por meio de P-TLC produziu quatro com-postos (A5.2, A6.i, A7.1 e A72) de frações de partes aéreas que mostram ativi-dade antifúngica maior que 50% (100, 85, 87 e 50%, respectivamente) e dois(B22 e B32) de frações da parte abaixo do solo (87 e 72%, respectivamente;Tabela 11). Esses seis compostos são identificados, e suas estruturas quí-micas podem ser elucidadas por meio de espectroscopia de ressonânciamagnética nuclear (RMN). Interessantemente, na separação, compostos nafração de cromatografia de coluna 8 (A8) das partes aéreas que mostraram60,5% de inibição do crescimento de micélios (Tabela 10), quando juntos emforma semipurificada, perdem sua atividade antifúngica após a separaçãopor P-TLC (Tabela 11).

Tabela 11: Porcentagem (%) da Inibição do Crescimento de Micélios de F.oxysporum por Diferentes Compostos de T. violacea após Separação por P-TLC

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

(5) Identificação de Compostos Ativos Purificados dos Extratos de PartesAéreas e Abaixo do Solo de T. violacea por Espectroscopia de RessonânciaMagnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa

Para se obter um nível aceitável de pureza, os extratos comple-xos em hexano semipurificados de partes aéreas e abaixo do solo de T. vio-lacea são submetidos a fracionamento cromatográfico, que é seguido porseparação por P-TLC. O fracionamento do extrato em hexano por cromato-grafia em coluna de sílica com hexano-acetona (95:5) como eluente a umataxa de fluxo de 30 mL/h, seguido por várias purificações por P-TLC em he-xano-acetona (9,5:0,5), resulta em 6 frações razoavelmente puras (vide aci-ma). O bioensaio das frações revela que apenas duas frações das partesabaixo do solo e quatro das partes aéreas mostram resultados promissoresrelevantes a essa investigação.

A presença de trilinoleato de glicerol em todas as frações preju-dica a separação e torna a elucidação estrutural difícil. Uma purificação adi-cional das frações por P-TLC fornece compostos razoavelmente puros (B2.2e B32 das partes abaixo do solo e A52, A61, A71 e A7.2 das partes aéreas),cujas estruturas podem ser determinadas por métodos espectroscópicos deRMN padronizados e espectrometria de massa. Um forte aroma de alho su-gere que os compostos pertencem à classe do tiol (mercaptano). A ausênciade prótons aromáticos e alcenóides (entre δ 5-8) nos espectros de 1H RMNde todos os compostos elimina o caráter aromático em suas estruturas. En-tretanto, espectros de 1H RMN simples de todos os compostos apresentamapenas picos de singletos ressonando entre α 2,0 e 4,5. Nenhum dos espec-tros de 13C RMN correspondentes de todos os compostos mostra ressonân-cia acima de 45 ppm, eliminando ainda mais os caracteres de ligação C=S eC=O nas estruturas. Esses achados estreitam as possibilidades dos com-postos para pertencerem à classe tio ou oxo alifática. Uma avaliação adicio-nal dos espectros de 13C RMN mostra que o sinal mais desprotegido apare-ce em -45 ppm, o que é característico da ligação tio (C-S).

Os seis compostos a seguir com atividade antifúngica foram en-contrados e identificados de acordo com esta invenção:

Composto (1):

<formula>formula see original document page 42</formula>

Fórmula empírica: 1CH3S3CH2SS6CH2S8CH32,4,5,7-tetratiaoctano

O composto (1) ou B22 pode ser isolado da fração de coluna im-pura B2 por meio de purificação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5) comoum óleo amarelo. O espectro 1H RMN do composto (1) mostra um singletoem δΗ 4,00 (ôc 45,2 ppm), integrando para 4 prótons, e um singleto em δΗ2,21 (ôc 17,3 ppm), integrando para 6 prótons, o que sugere um grupo tio-metileno e dois tiometila. Os prótons de metileno em Ôh 4,00 e os prótons demetila em δΗ 2,11 são consistentes com a presença dos grupos CH2-S eCH3-S, respectivamente. A espectroscopia de massa por ionização de elé-trons (EIMS) de (1) mostra o pico de base a m/z 186, consistente com a fór-mula molecular C4H10S4, e isso concorda com a estrutura (1) sugerida, umcomposto anteriormente isolado por Burton e Kaye (1992).

Composto (2)

<formula>formula see original document page 42</formula>

Fórmula empírica: 1Ch3S3CH2SSS7CH2S9CH32,4,5,6,8-pentatianonano

Após a separação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5), o com-posto (2) ou B32 pode ser isolado como um óleo amarelo das frações de co-luna combinadas B3. No espectro de 1H RMN do composto (2) (Placa 6.3),apenas dois singletos em ôh 4,15 e δΗ 2,29, integrando para 2 prótons e 6prótons, respectivamente, podem ser observados. Os dados de 1H RMN de(2) são muito similares aos de (1), sugerindo uma estrutura muito similar. Asintegrais dos picos sugeriu a presença de dois grupos tiometileno e dois tio-metila. A atribuição da estrutura (2) se baseia na comparação dos desloca-mentos químicos dos prótons nos espectros de 1H RMN dos compostos (1 e2). Os prótons mais desprotegidos no espectro de 1H RMN de (2) requeremátomos de enxofre na estrutura.

Composto (3)

<formula>formula see original document page 43</formula>

Fórmula empírica: 1Ch3SS4Ch2S6Ch2S8Ch2S10Ch32,3,5,7,8-pentatiadecano

A purificação da fração A5 por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5)fornece o composto (3) ou A52 como um óleo amarelo, que mostra similari-dade aos compostos (1 e 2). O espectro de 1H RMN do composto (3) exibetrês prótons de metileno em torno de δΗ 4,00 e dois prótons de metila emtorno de δΗ 2,00, consistente com a presença de grupos CH2-S e CH3-S,respectivamente. As ressonâncias dos picos no espectro de 13C RMN con-cordam com os picos correspondentes do espectro de 1H RMN. Os singletosem ôh 3,8 (ôc 37,2 ppm), δΗ 3,95 (ôc 40,9 ppm) e δΗ 4,11 (ôc 45,5 ppm) sãoatribuídos a H-8, H-6 e H-4, respectivamente. Os prótons de metila foramobservados em δΗ 2,18 (δ0 15,0 ppm), H-10 e 2,25 (δ0 15,6 ppm), H-1. Aespectroscopia de massa por ionização de elétrons (EIMS) mostra [M+] emm/z 232, consistente com a fórmula molecular C5Hi2S5, e isso concorda coma estrutura sugerida do composto (3).

Composto (4)

<formula>formula see original document page 43</formula>

Fórmula estrutural: 1CH3S3CH2S5CH2S7CH32,4,6-tritiaeptano

Tentativas de purificar o composto A6.i para fornecer composto(4) não foram bem-sucedidas. O espectro de 1H RMN do composto (4) mos-tra dois singletos de metileno e um singleto de metila, correspondendo aoespectro de 13C RMN. Em comparação com o espectro de 1H RMN do com-posto (1), este indica uma mistura de compostos (4) e (1) em quantidadesquase iguais. Além disso, observa-se que no espectro de 1H RMN do com-posto (4), o próton de metileno (ôh 4,5) é desprotegido em comparação como do composto (1), devido a um átomo de enxofre extra na estrutura de (1).

Quando os prótons de metileno (Ôh 4,00) e os prótons de metila (ôh 2,21) docomposto (1) são eliminados do espectro, os prótons restantes podem seralocados ao composto (4).

Composto (5)

<formula>formula see original document page 44</formula>

Fórmula empírica: 1CH3S3CH2S5CH32,4-ditiapentano

O isolamento por P-TLC do composto A71 da fração A7 (hexa-no:acetona: 9,5:0,5) fornece o composto (5) como um óleo amarelo. Os pró-tons de metileno e metila ressonando como singletos em Ôh 3,67 e 2,18,respectivamente, são observados no espectro de 1H RMN. O metileno CH2-Smenos desprotegido (δ 3,67), em comparação com o CH2-SS integrandopara 2 prótons, e os prótons de metila CH3-S característicos integrando paraseis prótons, podem ser atribuídos a H-2 e H-1, respectivamente.

Composto (6)

<formula>formula see original document page 44</formula>

Fórmula empírica: CH3SO2CH3

Tiossulfonato de metila

A separação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5) do composto6 (A7.2) da fração A7 também é um óleo amarelo. Embora o espectro de 1HRMN do composto (6) mostre picos que pertençam a ácido linoléico, um sin-gleto proeminente em δ 3,7 que não é parte desses picos foi observado. De-vido à impureza do composto isolado, a massa precisa não pôde ser deter-minada. A atribuição da estrutura (6) tentativa se baseia inteiramente na po-sição ressonante dos prótons de metila no espectro de 1H RMN. Os átomosde enxofre e oxigênio eletronegativos desprotegeram os prótons de -CH3,deslocando-os para o deslocamento químico δ 3,7, em oposição aos prótonsde CH3S, que ressonam em torno de δ 2,10.

(6) Discussão

Nesse estudo, o procedimento de extração líquido-líquido departes aéreas e abaixo do solo de T. violacea mostra que hexano extraisubstancialmente mais compostos do que os outros solventes orgânicos éterdietílico, acetato de etila e diclorometano, indicando que a planta contémuma grande quantidade de substâncias razoavelmente não polares. Issopode ser confirmado tanto por medição da recuperação de massa, quantopor perfis de cromatografia de camada fina qualitativa (Q-TLC) dos extratoslíquido-líquido. Embora seis vezes menos compostos possam ser recupera-dos do extrato em éter dietílico das partes aéreas e quatro vezes menos doextrato de partes abaixo do solo, em comparação com o hexano, o éter dietí-lico extrai a segunda maior quantidade de compostos. Muito menos compos-tos podem ser recuperados dos solventes mais polares restantes, acetato deetila e diclorometano.

O bioteste subseqüente de atividade antifúngica confirma que amaioria das substâncias ativas estão contidas nos extratos em hexano e éterdietílico, pois ambos mostram maior atividade contra todos os seis fungos deteste. Entretanto, embora muito menor, os extratos líquido-líquido em aceta-to de etila e diclorometano também mostram atividade antifúngica em algu-ma medida, indicando que os princípios ativos parecem ter sido finamentedistribuídos entre solventes orgânicos ou que outras substâncias, mais pola-res, também sejam ativas. Para alguns fungos (por exemplo, B. cinerea, S.rolfsii e B. dothidea), não há nenhuma diferença significativa na inibição docrescimento de micélios entre os extratos em hexano e éter dietílico dos ex-tratos tanto de partes áreas, quanto abaixo do solo. Como substancialmentemais compostos podem ser recuperados do extrato em hexano, e o éter die-tílico também sendo razoavelmente não polar, especula-se que os princípiosativos contidos nesses dois solventes sejam provavelmente os mesmos. Aseparação por cromatografia de coluna direcionada para atividade de com-postos nos extratos em hexano fornece quatro frações ativas combinadasdos extratos de partes aéreas e duas das partes abaixo do solo. A purifica-ção direcionada para atividade subseqüente de compostos dessas fraçõesde coluna por meio de P-TLC resulta no isolamento de seis compostos purosque mostram todos atividade antifúngica acima da média. Por meio de es-pectroscopia de RMN, suas estruturas químicas podem ser elucidadas, e oscompostos identificados. Das partes abaixo do solo de T. violacea, doiscompostos antifúngicos podem ser identificados como o conhecido 2,4,5,7-tetraiaoctano e o novo 2,4,5,6,8-pentatianonano. Das partes aéreas, quatrocompostos antifúngicos podem ser identificados. Desses, apenas o tiossul-fonato de metila é conhecido, ao passo que 2,3,5,7,8-pentatiadecano, 2,4,6-tritiaeptano e 2,4-ditiapentano são mais provavelmente compostos novos. Oque é surpreendente é o fato de que todos os compostos antifúngicos purifi-cados dos extratos em hexano de partes aéreas e abaixo do solo de T. vio-lacea, exceto o tiossulfonato de metila, são alcanos alifáticos contendo enxo-fre razoavelmente simples.

Finalmente, um aspecto que precisa de consideração especial éo fato de que o extrato bruto metanólico de T. violacea mostra maior ativida-de antifúngica de amplo espectro contra todos os fungos de teste do que osextratos líquido-líquido e as frações de cromatografia de coluna semipurifi-cadas. Além disso, uma das frações de cromatografia de coluna semipurifi-cadas ativas (A8 das partes aéreas) mostra alta atividade antifúngica, masna separação dos compostos contidos nessa fração, a atividade foi perdida.

Isso complica o isolamento e a identificação de todas as substâncias ativasdas plantas e indica fortemente que a resistência natural de plantas contracondições de estresse biótico depende grandemente do efeito sinérgico oucombinado de diferentes compostos ativos. A presença conhecida de sapo-ninas e flavonóides polares em T. violacea que são agentes antiinfecciosos(Pretorius, 2003, Current Medicinal Chemistry: Anti-infective Agents 2:335-353), em combinação com a presença de compostos contendo enxofre ativoidentificados de acordo com esta invenção, pode explicar a atividade anti-fúngica mais elevada detectada nos extratos brutos e semipurificados, emcomparação com a de compostos purificados.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: porcentagem (%) de inibição do crescimento in vitro de fungospatogênicos para plantas por extratos frescos brutos em metanolde T. violacea a uma concentração de 1 g/L. As barras designa-das com diferentes letras para cada fungo diferiram significati-vamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico deDiferença Significativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibi-ção de crescimento de micélios (%). 1 = parte aérea; 2 = parteabaixo do solo; 3 = fungicida.

Figura 2: porcentagem (%) de inibição do crescimento in vitro de fungospatogênicos para plantas por extratos frescos brutos em metanolde T. violacea a uma concentração de 1 g/L, após armazena-mento a -20°C durante um ano. As barras designadas com dife-rentes letras para cada fungo diferiram significativamente (P <0,05) de acordo com o procedimento estatístico de DiferençaSignificativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibição de cres-cimento de micélios (%). 1 = parte aérea; 2 = parte abaixo do so-lo; 3 = fungicida.

Figura 3: efeito dos extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo deT. violacea sobre a taxa de respiração de uma monocultura decélulas de levedura a intervalos de 30 minutos durante um perí-odo de três horas. ComCat® e água destilada serviram de con-troles. Eixo dos x: tempo (min); eixo dos y: liberação de CO2 (cm3).

Figura 4: efeito de extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T.violacea sobre o crescimento de radículas de mudas de agrião aintervalos de 24 horas durante um período de incubação de 96horas. ComCat® e água destilada serviram de controles. Eixodos x: tempo (h); eixo dos y: crescimento da radícula (mm).

Figura 5: efeito de extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T.violacea sobre o crescimento de coleóptilos de mudas de agriãoa intervalos de 24 horas durante um período de incubação de 96horas. ComCat® e água destilada serviram de controles. Eixodos x: tempo (h); eixo dos y: crescimento do coleóptilo (mm).

Figura 6: porcentagem (%) de inibição do crescimento de micélios in vitrode fungos patogênicos para plantas por extratos semipurifiçadosde partes aéreas de T. violacea a uma concentração de 1 g/L.

As barras designadas com diferentes letras para cada fungo di-feriram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedi-mento estatístico de Diferença Significativa Média de Tukey(MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%). 1 =hexano; 2 = éter dietílico; 3 = acetato de etila; 4 = diclorometano;= fungicida.

Figura 7: porcentagem (%) de inibição do crescimento de micélios in vitrode fungos patogênicos para plantas por extratos semipurificadosde partes abaixo do solo de T. violacea a uma concentração de1 g/L. As barras designadas com diferentes letras para cadafungo diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com oprocedimento estatístico de Diferença Significativa Média de Tu-key (MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%).1 = hexano; 2 = éter dietílico; 3 = acetato de etila; 4 = diclorome-tano; 5 = fungicida.

Figura 8: padrão de atividade da NADPH oxidase em trigo tratado com umextrato de Tuibaghia e um extrato de Agapanthus (como refe-rência), de acordo com a invenção na dependência do tempoapós o tratamento.

Figura 9: padrão de atividade da NADPH oxidase em girassol tratado comum extrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como re-ferência), de acordo com a invenção na dependência do tempoapós o tratamento.

Figura 10: padrão de atividade da peroxidase em trigo tratado com um ex-trato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como referên-cia), de acordo com a invenção na dependência do tempo apóso tratamento.

Figura 11: padrão de atividade da peroxidase em girassol tratado com umextrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como refe-rência), de acordo com a invenção na dependência do tempoapós o tratamento.

EXEMPLOS

Realizou-se uma análise de variância (ANOVA) nos dados dosexemplos delineados abaixo, usando-se o programa estatístico NCSS 2000,para identificar diferenças entre os tratamentos. O procedimento de diferen-ça significativa média de Tukey (MSD) para comparação de médias (Steelee Torrie, 1980, Principies and procedures of statistics, 2- edição, Nova Ior-que: McGraw-HiII) foi aplicado para separar médias (P < 0,05).

Exemplo 1: Material Vegetal

Plantas de Tulbaghia vialacea inteiras foram inicialmente coleta-das na Reserva Natural de Blyde River Canyon (BRC) na África do Sul. Aidentificação taxonômica da espécie foi realizada por um taxonomista doMuseu Nacional, Bloemfontein, África do Sul. Um espécime de comprovantefoi processado de acordo com procedimentos padronizados e depositado noherbário do museu. Amostras a granel das espécies foram posteriormentecoletadas nos Jardins Botânicos, Bloemfontein, entre janeiro e março de2001, 2002 e 2003.

Exemplo 2: Preparação do Material Vegetal

Padrões de segurança sanitária e laboratorial foram seguidos namanipulação do material desconhecido, pois era considerado perigoso. Omaterial vegetal foi previamente examinado quanto a qualquer forma de in-fecção ou lesão por insetos, e esse material infectado não foi usado. Asplantas foram divididas em (a) partes aéreas (caules e folhas) e (b) partesabaixo do solo (rizoma e raízes). Depois de se determinar a massa frescadas diferentes partes de plantas, o material vegetal foi secado em um fornodurante duas semanas a 35°C, e a massa seca foi determinada. Subseqüen-temente, o material vegetal seco foi triturado, usando-se um moinho de corteRetsch SM 2000, e a massa seca foi novamente determinada. Depois datrituração, pequenas quantidades representativas de cada amostra foramtransferidas para bolsas Ziploc de plástico, fechadas e armazenadas em umcongelador a -20°C até que os extratos brutos fossem preparados. A porcen-tagem de perda durante a trituração foi calculada da seguinte maneira:

Porcentagem de perda na trituração = [(massa líquida da amos-tra seca)-(massa líquida da amostra triturada χ 100]/(massa líquida da amos-tra seca)

Exemplo 3: Preparação de Extratos Brutos

As duas amostras trituradas (partes aéreas e abaixo do solo)foram transferidas para jarros Qorpak de 5 litros separados, marcadas e co-bertas com metanol a 100% a uma razão de dois mL g"1 de peso seco. Astampas foram firmemente fechadas, Iacaradas com parafina para evitar va-zamentos e colocadas em um moinho rolos durante 24 horas. A extração foirealizada duas vezes por substituiçãodo metanol. Subseqüentemente, cadaamostra foi filtrada duas vezes, primeiro sob vácuo através de uma camadadupla de papel de filtro Whatman (N5 3 e N9 1), usando-se um funil Buchner1e, então, por gravidade através de uma única folha de papel de filtro What-man N- 1. A maior parte do metanol foi removida dos extratos por meio dedestilação a vácuo a 35-40°C, usando-se um Evaporador Rotativo Büchi. Nodia seguinte, o mesmo procedimento foi seguido com o material vegetal re-extraído. Filtrados finais do material vegetal extraído duas vezes foram com-binados e concentrados até secar sob vácuo por meio de um ConcentradorSpeedvac a -140°C durante 24 horas. Depois de determinar os rendimentosde matéria seca, as partes aéreas e abaixo do solo brutas foram armazena-das separadamente a -20°C para uso posterior.

Exemplo 4: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto àatividade antibacteriana

(a) Preparação de culturas-mãe de Bactérias

A atividade antibacteriana foi qualitativamente avaliada por meioda técnica de ensaio de difusão em placa de ágar (Rios et al., 1988, Journalof Ethnopharmacology 23: 127-149). Usou-se ágar de contagem de placa(PCA) para preparar culturas-mãe dos seis patógenos de plantas e uma bac-téria humana a seguir antecipadamente: Clavibacter michiganense pv. mi-chiganense, Pseudomonas syringae pv syringae, Erwinia carotovora subspcarotovora, Agrobacterium tumefaciens, Raistonia soianacearum, Xantho-monas campestris pvphaseoii, todos patógenos de plantas, assim como Mo-raxella catharrhaiis (MC), um patógeno humano. Foram preparadas duasculturas de estoque para cada bactéria, das quais uma era uma cultulra detrabalho, e a outra uma cultura de reserva. As culturas foram armazenadas a5-15°C, exceto a de Moraxella, que foi armazenada a 4°C.

Das culturas-mãe de bactérias, sete placas de ágar nutriente(NA) foram separadamente inoculadas com as sete bactérias dois dias antesdo bioensaio antibacteriano. Essas foram incubadas a 25°C, exceto a placade Moraxella, que foi incubada a 35°C um dia antes do bioensaio, para obtercolônias de linhagem pura.

Todas as culturas foram verificadas quanto à contaminação. De-pois de dois dias, as colônias puras não contaminadas das culturas de bac-térias de 2 dias de idade foram transferidas das placas de ágar para setetubos de ensaio marcados contendo água destilada esterilizada, no caso dospatógenos de plantas, e água salina esterilizada, no caso de Moraxella.

Suspensões de bactérias diluídas foram comparadas com o padrão McFar-Iand para se obter a concentração requerida de 1 χ 106 UFC (unidades for-madoras de colônia) por ml.

(b) Bioensaio Antibacteriano

Cinco gramas de ágar nutriente foram dissolvidos em 200 ml deágua destilada, autoclavados a 1210C durante 20 minutos e transferidos pa-ra sete placas de Petri para resfriar e endurecer. Os extratos brutos foramensaiados como suspensões aquosas em DMSO (sulfóxido de dimetila) a10% (v/v) a uma concentração de 50 mg mL"1 por transferência de um má-ximo de 40 μΙ_ em furos de 5 mm feitos no ágar com um saca-rolhas estéril.

Todas as atividades foram realizada em uma cabine de fluxo laminar pré-esterilizada para evitar contaminação. Cada placa de teste foi dividida emcinco partes, e os extratos, assim como a solução em DMSO a 10% (v/v)(controle positivo), foram transferidos para os furos no ágar. As placas foramdeixadas durante 20 minutos para permitir que os extratos e o DMSO se di-fundissem no ágar e foram subseqüentemente incubadas a 25°C (patógenosde plantas) ou 35°C (Moraxella) durante três dias. Cada placa foi inoculadacom as diferentes suspensões bacterianas usando-se suabes estéreis, espa-Ihadas uniformemente sobre a placa. Depois de três dias, as zonas de inibi-ção foram medidas usando-se um calibre digital, excluindo-se o furo (Heiseye Gorham, 1992), e usadas como um indicador de atividade antibacteriana.

Exemplo 5: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto àatividade antifúngica

Usou-se um método de diluição de ágar modificado (Rios et al.,1988, 1 .c.) para a determinação da inibição do crescimento de micélios dosorganismos de teste pelos extratos brutos,

(a) Preparação de Culturas-mãe de Fungos

Ágar de extrato de malte a dois por cento (4 g de extrato de mal-to; Difco, 2,8 g de ágar Técnico; Difco) foi preparado em 200 mL de águadestilada e autoclavado durante 20 minutos a 1210C. Subseqüentemente, omeio foi resfriado em um banho de água a 45°C, e 60 μΙ_ de uma solução deestreptomicina a 33% (m/v) foram adicionados ao meio basal para controledo crescimento bacteriano. O meio de ágar foi, então, transferido para pla-cas de Petri e deixado endurecer. Duas culturas-mãe para cada fungo forampreparadas para os seis fungos patogênicos para plantas a seguir: Botrytiscinerea, Fusarium oxyporum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Botrys-phaeria dothidea e Pythium ultimum. Um inóculo de cada fungo foi colocadovoltado para baixo sobre o meio de ágar em placas de Petri (duas replica-ções) e incubado a 25°C durante 8 a 10 dias. Subseqüentemente, 12 garra-fas de cultura de vidro foram enchidas até a metade com água destilada eautoclavadas durante 20 minutos a 121 °C. Pedaços de ágar contendo osorganismos de um par de placas de Petri (duas replicações por fungo) fo-ram, então, transferidos para as garrafas de cultura autoclavadas, lacradascom parafina e armazenadas a 4°C, exceto o Rhizoctonia solani e o Pythiumultimum, que foram armazenados a 25°C.(b) Bioensaio

Ágar de extrato de malte a dois porcento (MEA) foi preparadoconforme descrito para a preparação das culturas-mãe. Cada extrato foi dis-solvido em 100 ml_ de água destilada estéril e acrescentadas ao ágar parafornecer uma concentração final de 1 mg/mL (1 g/L). O meio, também con-tendo estreptomicina a 33%, foi transferido para placas de Petri de plásticoestéreis de 90 mm e deixado endurecer. O centro de cada placa de teste foisubseqüentemente inoculado com um tampão de 5 mm de tampão, paracada um dos patógenos separadamente, e incubado durante três dias a 25 ±2°C em uma cabine de crescimento. O crescimento de micélios radiais foideterminado após três dias por cálculo da média de dois diâmetros de colô-nia perpendiculares em cada replicata (três replicatas por organismo). Umaplaca inoculada para patógeno, contendo apenas o meio basal, serviu decontrole. As médias de duas medições foram usadas para calcular a porcen-tagem (%) de inibição:

<formula>formula see original document page 53</formula>

Além disso, uma placa contendo 1 μg/mL de carbenda-zim/difenoconazol (Eria® - 187,5 g L1 EC) foi usada como um fungicida pa-drão contra cada organismo de teste separadamente, para determinar a efi-cácia (expressa como % de inibição) dos extratos por comparação. Cadatratamento foi realizado em triplicata.

Exemplo 6: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto àatividade bioestimulante

Foram aplicados dois métodos para determinar o potencial bio-estimulante dos extratos brutos de órgãos de T. violacea:

Método 1: método manométrico para determinar o efeito dos extratos brutossobre a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura.

Um respirômetro de vidro especialmente construído com umaseção abaulada curta (reservatório) para conter as células de levedura e umtubo calibrado longo, fechado na extremidade superior para coletar gás CO2,foi usado para determinar o efeito dos extratos brutos de órgãos (partes aé-reas e abaixo do solo) de T. violacea sobre a taxa de respiração de célulasde levedura. Levedo de padeiro seco (0,8 g) foi colocado no reservatório dorespirômetro. Subseqüentemente, 70 ml_ de cada um dos extratos de órgãosanteriormente preparados a uma concentração de 0,5 mg mL"1 e contendo 5mg mL"1 de glicose para sen/ir de substrato respiratório para as células delevedura foram adicionados ao respirômetro. O aparelho foi inclinado para oslados para liberar bolhas de ar aprisionadas no Ievedo de padeiro seco ecolocado em um banho de água preaquecido a 29°C. ComCat®, um bioesti-mulante comercial (EP 1 051 075), foi usado como um controle positivo a 0,5mg/L (concentração ótima de acordo com os fabricantes; Agraforum, Alema-nha), e água destilada foi usada como um segundo controle. O dióxido decarbono liberado pelas células de levedura foi medido em cm3 a intervalosde 30 minutos durante um período de incubação de três horas, por leitura dovolume de gás liberado do tubo calibrado. Os testes foram realizados emtriplicata.

Método 2: Efeito de diferentes extratos de órgãos sobre a porcentagem degerminação de sementes de agrião e subseqüente crescimento das mudas

Duas folhas de papel de germinação especial (30 χ 30 cm) foramusadas para testar o efeito dos extratos brutos de órgãos de T. violacea so-bre a germinação de sementes de agrião, assim como o crescimento subse-qüente das mudas. Uma linha a 10 cm da parte superior foi traçada em umafolha, e 20 sementes de agrião foram uniformemente espaçadas na linha.Uma segunda folha de papel de germinação foi colocada sobre a primeira eumectada com soluções a 0,5 mg mL"1 dos extratos brutos, água destilada(controle negativo) ou uma solução a 0,5 mg L'1 de ComCat® (controle posi-tivo). Ambas as folhas de papel foram enroladas longitudinalmente e coloca-das em pé em frascos Erlenmeyer contendo os extratos brutos de partesaéreas ou abaixo do solo, água destilada ou a solução de ComCat® e manti-das a 25°C em uma câmara de crescimento no escuro. A germinação desementes, assim como os comprimentos dos coleóptilos e raízes foram de-terminados a intervalos de 24 horas durante um período de incubação dequatro dias. Os testes foram realizados em triplicata.

Exemplo 7: Cultivo de plantas de ervilha (Pisum sativum)

Cem sementes de Pisum sativum cv. Mohanderfer, obtidas emum mercado de sementes local, foram semeadas a 2 cm da superfície em 20potes a cinco sementes por pote, usando-se solo Bainsvlei e aplicando-seuma mistura de fertilizante NPK padrão. As plantas foram deixadas crescerdurante quatro semanas em uma estufa, enquanto se mantinha o solo emcapacidade de campo. Depois de quatro semanas, duas folhas completa-mente expandidas da mesma idade foram cuidadosamente removidas dosquartos nós de cada planta e usadas para monitorização do potencial deextratos de partes aéreas de T. violacea para controlar ferrugem Ascochytain vivo.

Exemplo 8: Isolamento de Mycosphaerella pinodes

Mycosphaerella pinodes foi isolada de folhas e caules doentesde vários cultivares de inverno de ervilha do campo no momento da senes-cência. As coletas de material de plantas infectadas foram feitas nas áreasde crescimentos de ervilhas central e do sudeste da Etiópia. Pedaços dotecido doente foram superficialmente esterilizados durante 1 minuto em eta-nol a 96% (v/v), 3 minutos em uma solução de hipocloreto de sódio a 3,5%(v/v) (Moussart et al., 1998, European Journal of Plant Pathology 104:93-102) e 30 segundos em etanol a 96% (v/v). Os tecidos foram subseqüente-mente transferidos assepticamente para ágar farelo de milho acrescentadode estreptomicina (0,3 mL/L) em placas de Petri de 9 cm e incubados a 20 ±1°C em uma câmara de crescimento. Os isolados inicialmente obtidos domaterial de plantas foram, então, cultivados em meio de Coon (Ali et al.,1978, Australian Journal of Agricultura! Research 29:841-849), consistindoem 4 g de maltose, 2 g de KNO3, 1,2 g de MgSO4, 2,7 g de KH2PO4 e 20 gde ágar. As culturas foram incubadas durante 14 dias para se obterem picni-diosporos. Para se obter um isolado derivado de uma única célula uninucle-ada, uma suspensão de picnidiosporos foi espalhada em ágar água a 15%,incubada durante uma noite a 20 ± 1°C e examinada sob um microscópio dedissecção (ampliação de 80x). Um tubo germinativo de um picnidiosporo foicortado e transferido para ágar de Coon (Clulow & Lewis, 1992, Plant Patho-Iogy 41:362-369). Seis isolados de M. pinodes foram obtidos. Todos os iso-lados de esporo único e culturas foram mantidos em placas de ágar de Coone armazenados no escuro a 5°C.

Exemplo 9: Preparação de uma suspensão de esporos de M. pinodes

Ágar farelo de aveia foi preparado por aquecimento suave de 30g de aveia em 1 litro de água destilada durante uma hora, agitando-se fre-qüentemente e, subseqüentemente, filtrando-se através de uma peneira fina,após o que o volume foi reajustado a um litro. Vinte gramas de ágar técnicoe 0,1 g de Keltane AP foram adicionados ao filtrado para fornecer uma con-centração de ágar de 2% (m/v). O ágar foi autoclavado durante 15 min, ver-tido em placas de Petri e deixado resfriar antes da inoculação de três placasde farelo de aveia com micélios de M. pinodes. As placas foram incubadasem um incubador com fotoperíodo de 12 horas a 20°C durante 14 dias, paraassegurar a produção de picnidiosporos. Para preparar o inóculo (suspensãode esporos), adicionou-se água destilada estéril às culturas de 14 dias deidade, desalojando suavemente os esporos com uma barra de vidro estéril.

A suspensão foi subseqüentemente filtrada através de quatro camadas degaze grosseira para remover os micélios, e a concentração de picnidiospo-ros foi determinada por meio de um hemocitômetro. A concentração de pic-nidiosporos foi ajustada a 1 χ 105 esporos por mL (Nasir & Hoppe, 1997, An-nals of Applied Biology 18:32-33) com água destilada estéril antes da inocu-lação das folhas de ervilhas.

Exemplo 10: Avaliação in vivo da fitotoxicidade do extrato bruto

Sementes de ervilhas foram plantadas em potes de plástico emsolo Bainsvlei e cultivadas em uma estufa (temperatura mínima de 18°C).

Quatro semanas após o plantio, quando as folhas nos terceiro e quarto nósestavam completamente expandidas, três folhas do quarto nó por replicataforam removidas das plantas, colocadas sobre papel de filtro Schleicher eSchull n9 595 e molhadas com 4 mL de água destilada estéril em placas dePetri de 9 cm. Trinta μι de cada solução a 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/ml_ de ex-trato bruto foram colocados separadamente em cada uma das três folhas porplaca de Petri e replicados três vezes. O tratamento das folhas com água eum fungicida padrão (carbendazim/difenoconazol) serviu de controle. Placasde Petri contendo as folhas tratadas foram incubadas a 20°C em um incuba-dor de dia/noite, programado para um ciclo de 16 horas de dia, enquanto 2mL de água destilada estéril foram adicionados diariamente para manter opapel de filtro úmido. Seis dias após o tratamento, os sintomas de fitotoxici-dade foram avaliados nas folhas usando-se uma escala de seis categorias [0= sem sintomas; 1 = < 5% de manchas necróticas; 2 = > 5% de manchasnecróticas; 3 = < 50% de área inoculada necrótica; 4 = 50-100% de área i-noculada necrótica; 5 = necrose espalhando-se além das áreas inoculadas]baseada em observações estereomicroscópicas (Clulow et al., 1991b, Jour-nal of Phytopathology 131:322-332).

Exemplo 11: Avaliação in vivo de propriedades antifúngicas do extrato bruto

Folhas de ervilha do quarto nó foram obtidas e mantidas sobrepapel de filtro úmido em placas de Petri conforme descrito para o teste deavaliação de fitotoxicidade. O controle in vivo da infecção por esporos de M.pinodes das folhas por diferentes concentrações (0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL)do extrato de partes aéreas de T. violacea foi seguido de duas maneiras, asaber, por inoculação das folhas com 15 μΐ_ de uma suspensão de esporos(1 χ 105 esporos por mL; Nasir e Hoppe, 1997, 1.c.) 30 minutos antes da a-plicação das diferentes concentrações do extrato bruto separadamente, e damaneira contrária. Um fungicida padrão, carbendazim/difenoconazol, atual-mente usado contra ferrugem Ascochyta em ervilhas (Bretag et al., 1995,Australian Journal of Experimental Agriculture 35:525-530; Moussart et al.,1998, European Journal of Plant Pathology 104:93-102), assim como folhasinoculadas apenas com a suspensão de esporos, serviram de controles.Três folhas por placa de Petri representaram uma replicata, e o experimentofoi realizado em triplicata. Placas de Petri contendo as folhas diferentementetratadas foram incubadas a 20°C, a temperatura ótima para geraminação deesporos de M. pinodes, em um incubador de dia/noite, pois a iluminação énecessária para a germinação de esporos (Roger e Tivoli, 1996, MycologicalResearch 100:304-306). Após incubação d urante seis dias, as lesões folia-res foram medidas e os danos às folhas comparados aos dos controles.

Exemplo 12: Análise estatística dos dados

Realizou-se uma análise de variância (ANOVA) dos dados, u-sando-se o programa de análise estatística SAS (SAS Institute Inc., 1999,SAS Institute software: Usage and reference. Versão 6. SAS lnstitute). Oprocedimento LSD (menor diferença significativa) de Duncan para compara-ção de médias foi aplicado para separar as médias (P < 0,05). Tratamentosdiferindo significativamente foram indicados nas tabelas por designação dediferentes conjuntos de letras.

Exemplo 13: Tratamento das sementes

Diferentes lotes de sementes de sorgo foram artificialmente ino-culadas separadamente tanto com esporos de carvão de semente coberta(Sporisorium sorghi), quanto solta (Sporisorium cruentum) a taxa de 5% (p/p)antes da aplicação dos tratamentos de sementes. Um extrato bruto aéreo deT. vioiacea foi posto em suspensão em água a uma taxa de 2,0 g/L. Lotes desementes de sorgo de 90 g cada foram tratados com 15 mL do extrato brutopor misturação completa em uma pequena bolsa de plástico 24 h antes doplantio. Um fungicida de revestimento de sementes sintético padrão, Thiram(65 W), foi aplicado da mesma maneira à taxa de 0,25% (p/p) por kg de se-mente e serviu de controle positivo. Sementes de sorgo também foram artifi-cial e separadamente inoculadas tanto com esporos de carvão solto, quantocoberto, mas não foram tratadas com o extrato ou fungicida sintético, paraservirem de segundo controle.

Exemplo 14: Ensaio de campo

Conduziu-se um ensaio de campo sob irrigação no Centro dePesquisas de Melkassa, Etiópia, em 2003. Os lotes foram dispostos em umdesenho de bolos completos aleatórios, e os tratamentos foram aplicadostrês vezes. Sementes de sorgo tratadas foram plantadas manualmente emcinco fileiras, deixando 0,75 cm entre as fileiras, em lotes de 18,75 m2. Apli-cou-se fertilizante padrão, e os lotes foram mantidos em capacidade decampo por meio de irrigação por sulcos. A incidência de doença foi registra-da como porcentagem de plantas infectadas. O rendimento de grãos foi de-terminado no lote inteiro.

Exemplo 15: Extração líquido-líquido direcionada para atividade

Os seguintes solventes orgânicos, dispostos em ordem de pola-ridade crescente (constantes dielétricas) foram usados para semi-purificação(extração líquido-líquido) dos extratos brutos de partes aéreas e abaixo dosolo separadamente: hexano (DC = 2,0), éter dietílico (DC = 4,3), acetato deetila (DC = 6,0), cloreto de metileno (DC = 8,9). A extração foi feita tanto pa-ra partes aéreas, quanto abaixo do solo. Cerca de 63,30 g do extrato de par-tes aéreas e 88,24 g do extrato de partes abaixo do solo, em metanol, foramdissolvidos em 50 mL de água destilada e misturados com 50 mL de hexano(razão de 1:1). Cada mistura foi agitada vigorosamente durante 20 minutosem um agitador mecânico e subseqüentemente transferida para um funil deseparação, deixando-se que as duas fases líquidas se separassem. A ca-mada de hexano superior separada foi transferida para um béquer, ao passoque a camada de extrato bruto inferior foi novamente misturada com 50 mLde hexano fresco e agitada como antes.

O fracionamento foi repetido 20 vezes com solvente fresco, paraotimizar a recuperação dos compostos. O mesmo procedimento foi seguidocom os outros solventes orgânicos. As quatro frações separadas foram eva-poradas até secar sob vácuo, em um banho de água a 35°C, por meio de umrotoevaporador Büchi.

A massa de material seco recuperado foi determinada para cadafração. Do material seco de cada fração, prepararam-se soluções de esto-que a 1 mg mL"1 em água. Para estabelecer o sucesso do processo de fra-cionamento, obteve-se um perfil de cromatografia em camada fina qualitativa(TLC) para cada fração em uma placa de Sílica-gel 60 de 0,5 mm, usando-se clorofórmio : metanol : água (80:20:10) como fase móvel (Exemplo 16).Para determinar onde os ingredientes ativos estavam localizados, os oitoextratos foram triados quanto às propriedades antifúngicas. Usou-se o mes-mo procedimento descrito no Exemplo 5.

Exemplo 16: Fracionamento por cromatografia de coluna direcionada paraatividade (CCF)

Antes da separação por cromatografia de coluna de compostosativos nos extratos em hexano semipurificados obtidos por meio de extraçãolíquido-líquido, usando-se Silica-Gel como fase estacionária, o sistema sol-vente mais eficaz foi testado usando-se placas de TLC de Sílica-Gel. Os sis-temas solventes testados variaram do menos polar ao mais polar e incluí-ram: hexano : acetona (9,5:0,5-6:4); hexano : acetato de etila (8:2-6:4); he-xano : acetona : acetato de etila (6:2:2); hexano : acetona : metanol (6:3:1) eclorofórmio : metanol (9:1-5:5). Tanto para extratos de partes aéreas, quantoabaixo do solo, o sistema solvente mais adequado foi determinado comohexano : acetona (9,5:0,5 e 9:1, respectivamente). Uma bureta de vidro co-mum (1,5 m χ 2 cm) foi usada como coluna de separação. Depois de colocarum pequeno pedaço de lã de algodão no fundo da coluna, uma pasta semi-fluida de Sílica-Gel 60, previamente preparada usando-se o sistema solven-te, foi lentamente vertida na coluna e deixada endurecer até se atingir umaaltura final de 1,49 m. Tomou-se cuidado para evitar a formação de bolhasde ar. Um funil de separação enchido com cerca de 1,5 litros do sistema sol-vente foi colocado no topo da coluna, para assegurar um suprimento contí-nuo da fase móvel e para manter uma coluna de solvente de 10 cm acima dafase estacionária. A coluna foi equilibrada durante uma noite antes de sedeterminar o volume do leito, e o extrato semi-purificado ativo foi carregadona coluna. Doze g dos extratos líquido-líquido ativos secos foram dissolvidosem um volume adequado de solvente hexano:acetona e suavemente carre-gados na coluna usando-se uma pipeta. Deixou-se endurecer sobre a super-fície da sílica e se difundir na fase estacionária antes de se deixar a fasemóvel migrar sob gravidade.

Os compostos foram eluídos a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min,e se coletaram frações de 12 mL usando-se um coletor de fração durante umperíodo de dois a dois meses e meio. As colunas foram constantemente mo-nitorizadas para assegurar que não secassem. Foram coletadas frações atéque as colunas estivessem descoloridas. Subseqüentemente, o sistema sol-vente hexano.acetona (9,5:0,5) foi substituído por um mais polar de hexa-no:acetona a uma razão de 9:1 ou 8:2, 7:3, 6:4 ou 5:5. Perto do fim do pro-cesso de separação, mais compostos foram removidos das colunas por meiode metanol a 100%.

Exemplo 17: Cromatografia de camada fina qualitativa (Q-TLC)

Realizou-se a cromatografia de camada fina qualitativa (TLC) emplacas de alumínio Kieselgel 6OF254, 0,25 mm, de 10 χ 20 cm (Merck). A re-velação das placas de TLC no solvente apropriado foi seguida por pulveriza-ção com formaldeído (40%)-ácido sulfúrico (2:98) ou com anisaldeído-ácidosulfúrico-etanol (5:5:90) e aquecimento a 120°C. Um total de cerca de 3.600tubos de ensaio foram coletados para cada extrato durante a separação porcromatografia de coluna acima delineada. A cromatografia de camada finaqualitativa (Q-TLC) foi realizada nos compostos separados em cada terceirafração de tubo de ensaio coletada. O mesmo sistema solvente usado paraseparação por cromatografia de coluna também foi usado para a separaçãopor TLC. As placas foram reveladas e subseqüentemente investigadas sobluz UV a 254 e 365 nm. Pontos fluorescentes visíveis foram marcados comum lápis antes de se pulverizar as placas com o reagente de vanilina-ácidosulfúrico para mostrar os pontos. Os valores de RF de compostos separa-dos, assim como os perfis de TLC das diferentes frações de coluna foramcomparados. Frações de coluna mostrando perfis e valores de RF similaresforam combinadas. Frações de coluna combinadas foram evaporadas sobpressão reduzida a 40°C em um evaporador rotativo, e a massa das fraçõessecas foi determinada.

Exemplo 18: Determinação da atividade antifúngica de frações de cromato-grafia de coluna combinadas

Para se determinar em que frações de coluna a maioria doscompostos antifúngicos estavam localizados, o mesmo procedimento deline-ado conforme acima descrito foi seguido, usando-se apenas F. oxysporum,relativamente resistente ao extrato de parte aérea como organismo de teste.Apenas as frações de cromatografia de coluna combinadas mais ativas fo-ram consideradas para purificação adicional.

Exemplo 19: Cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC)Apenas compostos nas frações de cromatografia de colunacombinadas mais ativas foram adicionalmente purificados por meio de cro-matografia de camada fina preparatória (P-TLC). A separação foi realizadaem placas de vidro de 20 χ 20 cm revestidas com 1,0 mm de Kieselgel PF254(Merck, Alemanha), que foram secadas ao ar e usadas sem ativação anteri-or. Aproximadamente 250-300 mg de cada fração de coluna combinada ativaforam dissolvidos em um pequeno volume (3-5 mL) de metanol, clorofórmioou fase móvel, dependendo do solvente mais eficaz. A solução foi espalhadasobre as linhas basais de cerca de 20 placas de P-TLC nessas bandas uni-formes finas, aplicando-se pequenos volumes de uma vez e secando-se en-tre as aplicações, até que cerca de 15 mg fossem aplicados por placa. Paraseparar todos os compostos em uma fração de coluna combinada, nestecaso, foram usadas cerca de 20-25 placas de P-TLC. Hexano:acetona(9,5:0,5) foi usado como sistema solvente para revelar as placas em tanquesde vidro. Quando a fase móvel atingiu a linha frontal, as placas foram remo-vidas dos tanques de revelação e colocadas em uma coifa ventilada parasecar. Subseqüentemente, as placas foram examinadas sob luz UV a 254 e365 nm, e as bandas fluorescentes foram marcadas com a ponta afiada deuma espátula, antes de as bandas serem raspadas usando-se uma espátula,e transferidas para frascos marcados correspondentes. Os compostos foramcobertos com um volume adequado de clorofórmio e eluídos de sílica poragitação vigorosa durante 10 min antes da filtragem por sucção através deinúmeros cadinhos com etiquetas correspondentes às etiquetas das bandasde sílica. Os filtrados foram coletados em frascos pré-pesados correspon-dentes, colocados em um armário ventilado para secar, a massa de recupe-ração foi determinada e testada quanto à atividade antifúngica.

Exemplo 20: Determinação da atividade antifúngica de compostos purifica-dos por meio de cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC)

Para determinar quais dos compostos separados por meio de P-TLC eram ativos, o mesmo procedimento delineado no Exemplo 5 foi segui-do, usando-se F. oxysporum apenas como organismo de teste. Apenas oscompostos mais ativos foram adicionalmente purificados.Exemplo 21: Purificação final dos compostos ativos isolados

Apenas os compostos isolados mais ativos foram novamentetestados quanto à pureza em um sistema de cromatografia de camada finaanalítica original (TLC) (Mikes e Chalmers1 1979, Laboratory Handbook ofChromatographic and Allied Methods. Ellis Horwood Ltd., Londres), seguin-do-se os procedimentos de Q-TLC (vide seção 6.2.3.3) e P-TLC (vide aci-ma), com ligeiras modificações das fases móveis. Usou-se clorofór-mio:metanol:água (80:20:10 v/v) ou tolueno:acetona:acetato de etila (7:2:1v/v; Wagner e Bladt, 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatogra-phy Atlas, Segunda Edição, Springer, Nova Iorque) como sistema solvente,para separar compostos ativos de quaisquer outros compostos que pudes-sem ter compartilhado a mesma posição nas placas de Q-TLC ou P-TLC.Depois de secar as placas em uma corrente de ar, os compostos foram de-tectados sob luz UV a 254 e 365 nm, ou as placas foram tingidas com H2SO4etanólico a 5% (v/v) ou vanilina a 1% (m/v) (1 g em 100 mL de H2SO4; Wag-ner e Bladt, 1996).

Compostos não puros foram novamente submetidos a TLC pre-paratória acidificada com HCI a 1 % (v/v), até que fossem obtidos compostospuros. Apenas compostos puros que mostrassem a maior atividade antifún-gica foram submetidos a espectroscopia de ressonância magnética nuclear(RMN) para identificá-los e para elucidar suas estruturas moleculares.Exemplo 22: RMN e espectroscopia de massa

Para identificar os compostos mais bioativos purificados das par-tes de planta aéreas e abaixo do solo e para elucidar suas estruturas mole-culares, os compostos isolados foram lavados repetidamente com acetonapara se obter um nível aceitável de pureza. Subseqüentemente, os compos-tos foram submetidos a espectroscopia de ressonância magnética nuclear(13C e 1H 1D e 2D RMN). A espectroscopia de RMN foi realizada em um es-pectrômetro Bruker ADVANCE 300MHz DRX 300, a 23°C (296°K) com te-trametilsilano (Si(CH3)4; TMS) como padrão interno. Os solventes usadosforam deuterioclorofórmio (CDCb) ou deuterioacetona [(CD3)2CO], conformeindicado. Os deslocamentos químicos foram relatados em partes por milhão(ppm) na escala δ, e as constantes de acoplamento foram dadas em Hz. Osespectros de MS e as determinações de massa foram obtidos com um es-pectrômetro de massa Kratos MS-80 no modo de impacto de elétrons (El) defoco duplo.

Claims

1. Preparação adequada para proteção biológica de plantas àbase de plantas ou partes de plantas de Tulbaghia violacea (alho selvagem)na forma de um extrato bruto, obtenível pelas seguintes etapas:(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar;(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão entre 0,2-2 mm;(iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polarselecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando, as-sim, uma suspensão/solução;(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separaçãodo sobrenadante da fase sólida;(v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez;(vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e remo-ção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se, assim, o resíduo de extrato bruto.

2. Preparação adequada para proteção biológica de plantas àbase de plantas ou partes de plantas de Tulbaghia violacea (alho selvagem)na forma de um pó seco, obtenível pelas seguintes etapas:(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar;(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão menor que-0,1 mm;(iii) encharcamento do material triturado em metanol, formando, assim,uma suspensão/solução;(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão;(v) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da faseorgânica solúvel;(vi) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em etanol e repe-tição das etapas (iv) e (v); e(vii) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, umpó seco.

3. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 3, em que se usa uma ou mais das diferentes partes aéreas das plantas.

4. Preparação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que seusam partes de solo da planta.

5. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende um, mais ou todos os se-guintes compostos:- 2,4,5,7-tetratiaoctano;- 2,4,5,6,8-pentatianonano;- 2,3,5,7,8-pentatiadecano;- 2,4,6-tritiaeptano; e- 2,4-ditiapentano.

6. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo adicionalmente materiais de veículo ou cargas sólidaspulverulentas.

7. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo adicionalmente aditivos que aumentem ou regulem oefeito da preparação.

8. Preparação na forma de uma solução ou suspensão aquosa àbase de uma preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Preparação de acordo com a reivindicação 8, em que a con-centração de extrato bruto ou pó seco está na faixa de 0,2 g/L a 2 g/L.

10. Preparação, de acordo com a reivindicação 9, em que a con-centração de extrato bruto ou pó seco está na faixa de 0,5-1,0 g/L.

11. Composição compreendendo uma primeira preparação ve-getal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e pelo me-nos uma segunda preparação vegetal na forma de um extrato bruto, pó secoou uma suspensão ou solução aquosa a mesma, a dita segunda preparaçãovegetal exercendo um efeito protetor de plantas adicional sobre as plantasou suas partes tratadas com a composição.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza-da pelo fato de que a segunda preparação vegetal deriva de uma espécie dogênero Agapanthus e é obtida por etapas de processo análogas às da ditaprimeira preparação vegetal.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que seusa a espécie Agapanthus africanus.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 13, caracterizada pelo fato de que a segunda preparação vegetalderiva de uma mistura de espécies da família do cravo e espécies de alfafa,em que a proporção em peso do material de espécies de cravo está entre 80e 99%, a dita segunda preparação vegetal sendo obtida por etapas de pro-cesso análogas às da dita primeira preparação vegetal.

15. Composição compreendendo:(i) uma primeira preparação vegetal como definida ém qualquer uma dasreivindicações 1 a 10,(ii) uma segunda preparação vegetal derivada de uma espécie do gêneroAgapanthus, e(iii) uma terceira preparação vegetal derivada de uma mistura de espéciesda família do cravo e espécies de alfafa, em que a proporção em pesodo material seco das espécies de cravo está entre 80 e 99%, cada pre-paração na forma de um extrato bruto, pó seco ou uma suspensão ousolução aquosa do mesmo, as ditas segunda e terceira preparaçõesvegetais exercendo um efeito protetor de plantas adicional sobre plan-tas ou suas partes tratadas com a composição.

16. Uso de uma preparação/composição como definida em qual-quer uma das reivindicações 1 a 15 como um agente biológico protetor deplantas.

17. Uso de uma preparação/composição, como definida na rei-vindicação 16, em que o agente biológico protetor de plantas é um agenteantimicrobiano.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, em que o agenteantimicrobiano é um agente antibacteriano.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, em que o agenteantimicrobiano é um agente antifúngico.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, em que o agenteantifúngico inibe o crescimento de micélios de fungos.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, para a pre-venção de infecção de colheitas por fungos sob condições de campo.

22. Uso de uma preparação/composição, de acordo com a rei-vindicação 16, em que o agente biológico protetor de plantas é um agentebioestimulante.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, em que o agentebioestimulante induz resistência adquirida sistêmica (SAR) e provoca indu-ção de crescimento em plantas ou partes de plantas tratadas com o agente.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, em que o agentebioestimulante provoca estimulação do crescimento de mudas.

25. Composto de fórmula 1, isolado de uma preparação comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10:- 1Ch3S3CH2SSS7CH2S9CH3 (2,4,5,6,8-pentatianonano) (fórmula 1).

26. Composto de fórmula 2, isolado de uma preparação comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10:- 1Ch3SS4Ch2S6Ch2S8Ch2S10Ch3 (2,3,5,7,8-pentatiadecano) (fórmula 2).

27. Composto de fórmula 3, isolado de uma preparação comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10:- 1CH3S3CH2S5CH2S7CH3 (2,4,6-tritiaeptano) (fórmula 3).

28. Composto de fórmula 4, isolado de uma preparação comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10: 1CH3S3CH2S5CH3 (2,4-ditiapentano) (fórmula 4).

29. Composição adequada para proteção de plantas, compreen-dendo pelo menos dois dos compostos selecionados do grupo que consisteem: 2,3,5,7,8-pentatiadecano; 2,4,5,6,8-pentatianonano; 2,4,6-tritiaeptano;- 2,4-ditiapentano; 2,4,5,7-tetratiaoctano.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, compreen-dendo todos os cinco compostos indicados.

31. Uso de um composto/composição, como definido em qual-quer uma das reivindicações 25 a 30, como agente biológico protetor deplantas.

32. Uso de um composto/composição, de acordo com a reivindi-cação 31, como agente antifúngico.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, em que o agenteantifúngico inibe o crescimento de micélios de fungos.

34. Processo para a preparação de um extrato bruto ou umapreparação de pó seco ou suspensões ou soluções aquosas o mesmo, co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelofato de que se realizam as seguintes etapas:(i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar;(ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão entre 0,2-2 mm;(iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar,formando, assim, uma suspensão/solução;(iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separaçãodo sobrenadante da fase sólida;(v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez;(vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e remo-ção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se, assim, o resíduo de extrato bruto;e, no caso da preparação de uma preparação aquosa:(vii) suspensão do extrato bruto resultante em água a uma concentraçãoadequada;ou, alternativamente, as etapas de:(ia) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar;(iia) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão menor que-0,1 mm;(iiia) encharcamento do material triturado em um primeiro solvente orgânicopolar, formando, assim, uma suspensão/solução;(iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão;(va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da faseorgânica solúvel;(via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em um segundosolvente orgânico polar e repetição das etapas (iva) e (va);(viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, umpó seco;e, no caso da preparação de uma preparação aquosa:(viii) suspensão do pó seco resultante em água a uma concentração ade-quada.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o solvente orgânico polar da etapa (iii) é metanol ou etanola 90-100%.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o dito primeiro solvente orgânico polar da etapa (iiia) é me-tanol a 90-100%, e o dito segundo solvente orgânico polar da etapa (via) éetanol a 90-100%.

37. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o respectivo solvente é usado paraextrações a uma concentração de 1,0-3,0 mL/g de peso seco do materialvegetal triturado.

38. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que a concentração do extrato bruto oudo material em pó seco na solução ou suspensão aquosa está entre 0,2 g/Le 1 g/L.