WO2006032232A2 - Neuer lysolipin biosynthesegencluster - Google Patents

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WO2006032232A2
WO2006032232A2 PCT/DE2005/001494 DE2005001494W WO2006032232A2 WO 2006032232 A2 WO2006032232 A2 WO 2006032232A2 DE 2005001494 W DE2005001494 W DE 2005001494W WO 2006032232 A2 WO2006032232 A2 WO 2006032232A2
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lysolipin
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nucleic acid
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protein
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Wolfgang Wohlleben
Stefan Pelzer
Patricio Lopez
Andreas Hornung
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Combinature Biopharm Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the invention relates to a novel lysolipin biosynthetic gene cluster, new genes or gene fragments from such a biosynthetic gene cluster,
  • Lysolipin derivatives uses of such novel lysolipin derivatives and pharmaceutical compositions contain such lysolipin derivatives.
  • the bacterial strain Streptomyces tendae TÜ4042 produces the polyketide antibiotic lysolipin, a polycyclic xanthone with strong antibiotic activity against bacteria and antitumor activity against various tumor cell lines.
  • lysolipin was first described as a metabolite of the strain Streptomyces violaceon Tü96 (Drautz et al., 1975, Arch Microbiol. 106, 175-190).
  • the term lysolipin actually describes two substances.
  • the lysolipin X secreted by the producer strain is converted to the more stable lysolipin I by light, heat or UV radiation (FIG. 1). Lysolipin I has a 10-50-fold higher biological activity.
  • lysolipin I The antibacterial effect of lysolipin I presumably consists in an inhibition of cell wall biosynthesis by interaction with the carrier lipid, since murein precursors are increasingly accumulated after lysolipin addition in the inhibited cells. Lysolipin I is very effective against Gram-positive (MIC 0.001 ⁇ g / ml), as well as against some Gram-negative bacteria. Furthermore, a strong tumorstatische effect against different Tumor cell lines (IC 50 0.001 ug / ml) are detected (Pultar, 1988, Disseration University of Tübingen).
  • lysolipin The biosynthesis of lysolipin has been studied by means of incorporation studies of radioactively labeled precursors (Bockholt et al., 1994, J. Org. Chem. 59, 2064-2069). In these studies, it was found that the synthesis of lysolipin from 12 malonyl CoA units follows a typical polyketide synthesis scheme of type II (characteristic of aromatic polyketides). Rather unusual is the use of malonyl CoA as a starter unit which is complete, i. without decarboxylation. So far, there are only a few known substances that use malonyl-CoA as a starter, such as tetracycline and cycloheximide.
  • lysolipin exhibits "reverse" orientation of the malonate molecule, and the nitrogen-containing heterocycle of lysolipin is believed to be formed through the intermediary of a malonamide intermediate
  • lysolipin X or I Biosynthesis of the backbone numerous modifications must take place to produce the final product lysolipin X or I. These include cyclization and aromatization, introduction of oxygen atoms (9 of the 12 oxygen atoms in lysolipin X are probably introduced from molecular oxygen by oxygenases, including both xanthone oxygens), chlorination presumably by a halogenase, and introduction of methyl groups on the hydroxy groups (C6, C16 , C24), methylene group C28 and nitrogen, presumably by methyltransferases.
  • lysolipin can be assigned to the substance class of N-containing polycyclic xanthones.
  • Other related structures of bacterial origin with pharmaceutically interesting properties are the antibiotics albofungin / Chloralbofungin, cervinomycin, simaomicin, citreamicin, the cytostatic and antifungisch Actinoplanone and the antifungisch active substances Seh 42137 and Seh 54445.
  • the pharmaceutical use of these substances has hitherto been prevented by the poor solubility and the toxicity anticipated on account of the xanthone structure and proven for some substances.
  • the invention is therefore based on the technical problem of providing means for the synthesis of novel lysolipin derivatives, in particular of lysolipin derivatives which are difficult or difficult to access and which also have improved pharmacological properties.
  • the invention teaches an isolated protein or peptide containing or consisting of one or more amino acid sequences SEQ ID 1 to 46.
  • Protein or peptides according to the invention can be expressed in a cell, in particular a transformed cell, for biosynthesis, but it is also the import externally generated Protein or peptide in a biosynthetic exporting cell possible. In both cases, it is recommended that the expression of a corresponding natural gene of the cell is inhibited or reduced.
  • the protein or peptide is preferably functional for a partial synthesis step of the biosynthesis of a lysolipin derivative, especially a lysolipin antibiotic.
  • the invention further relates to an isolated nucleic acid, in particular DNA, for example genomic DNA, cDNA, or RNA, in particular mRNA, coding for a protein or peptide according to the invention.
  • the targeted molecular genetic manipulation of secondary metabolite biosynthetic gene clusters is made possible, whereby new, modified substance derivatives can be biologically produced.
  • the invention in this context is based on the initial identification and characterization of a biosynthetic gene cluster for bacterial, N-containing
  • Xanthones This provides the basis for any targeted genetic manipulation to produce lysolipin derivatives that are totally synthetic, if at all, very difficult to produce. These can in turn be semisynthetically derivatized as precursor molecules.
  • the knowledge gained from the gene cluster sequence allows a rapid molecular genetic access to the biosynthesis of all other bacterial N-containing polycyclic xanthones with pharmaceutical potential.
  • the invention also encompasses homologs of the disclosed sequences wherein the homology is at least 60% identity, preferably greater than 80% or 90% identity, most preferably greater than 95% identity (calculated using the program MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in U.S. Pat Registration date valid version).
  • homologs of the disclosed sequences wherein the homology is at least 60% identity, preferably greater than 80% or 90% identity, most preferably greater than 95% identity (calculated using the program MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in U.S. Pat Registration date valid version).
  • nucleic acid sequences complementary or allelic variants are also included.
  • sequences are included which only partial sequences or gene fragments of explicitly disclosed sequences or complementary sequences thereof, with the proviso that in the case of the nucleic acids these partial sequences have a sufficient length for a hybridization with a nucleic acid according to the invention, at least 50 or 150 bases, and in the case of the proteins or peptides, optionally encoded by a nucleic acid binding with at least the same affinity to a protein- or peptide-specific target molecule.
  • all nucleic acids which hybridize with nucleic acids used according to the invention are those which are stable under stringent conditions (5 ° C. to 25 ° C.
  • the invention also comprises expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences according to the invention having at least one control or regulatory sequence.
  • Such an expression cassette may also comprise a sequence for a known protein, wherein in the course of translation, a fusion protein of a known protein and a protein or peptide according to the invention is formed.
  • antisense sequences to the above nucleic acid sequences are also included.
  • the terms of the nucleic acids or proteins or peptides in addition to the full lengths of the disclosed sequences also include partial sequences or gene fragments thereof, with a minimum length of 21 nucleotides, preferably a minimum length of 30 to 90 Nucleotides, in the case of the nucleic acids and a minimum length of 7 amino acids, preferably a minimum length of 10 to 30 amino acids, in the case of proteins or peptides. In particular, between 21 and 90 as well as 7 and 30 every single numerical value is possible as a minimum length.
  • Previously known sequences and / or their use which fall under the definitions used in the context of this description, can be excluded by a disclaimer in claims.
  • the invention further comprises an isolated transformation vehicle, in particular plasmid or cosmid containing an inventive
  • Nucleic acid It can contain a plurality, in particular 1 to 50, identical and / or different nucleic acids according to the invention. In this case, it is particularly recommended if the majority of the nucleic acids form a biosynthetic gene cluster or a part of a biosynthetic gene cluster for a lysolipin derivative.
  • the transformation vehicle may additionally contain at least one regulatory nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid according to the invention is under the control of the regulatory nucleic acid sequence, in particular of a promoter.
  • one or more regulatory sequences can be set up with the proviso that a plurality of nucleic acids, in particular a gene cluster or a part of a gene cluster are controlled.
  • the invention further relates to a cell comprising a foreign nucleic acid according to the invention or several different such foreign nucleic acids and / or an inventive foreign protein or peptide or several different such foreign proteins or peptides, wherein the cell optionally with a foreign nucleic acid according to the invention or several different such foreign nucleic acids can be transformed.
  • a desired derivatization of a lysolipin derivative naturally synthesized by the cell can be achieved by a foreign gene different from the defined partial synthesis step in a lysolipin biosynthetic gene cluster of the cell instead of or in addition to a natural corresponding gene for a defined partial synthesis step Defined Operayntheseschhtt is introduced.
  • Suitable cells are preferably selected from the group of actinomycetes, e.g. the streptomycetes, or enterobacteria, e.g. E. coli. It is understood that a cell according to the invention is a mutant or recombinant of known strains produced with a transformation vehicle according to the invention, and that the antibiotic which can be produced therewith is derivatized with respect to known compounds.
  • the invention also encompasses lysolipin derivatives, in particular lysolipin derivative antibiotics, which are obtainable by cultivating a cell according to the invention and, after cultivation, isolating the lysolipin derivative from the cell and / or from the cultivation supernatant.
  • a lysolipin derivative of the invention is for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of bacterial or viral infections, mucus,
  • a lysolipin derivative according to the invention can be used "only" as a replacement therapy in the case of resistance to a known active substance. Then there is the advantage that by means of the active ingredient according to the invention in the first place a therapy is possible. Especially desireable, however, are new lysolipin derivatives with reduced side effects. Finally, particularly effective production methods are possible with the invention.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a lysolipin derivative according to the invention or a plurality of such lysolipin derivatives in a physiologically effective dose.
  • it may contain galenic auxiliaries and / or carriers.
  • Suitable counterions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, ointments, drops or solutions for injection (iV, ip, im, sc) or nebulization (Aerosols), transdermal systems or other topical application, as well as preparations with protracted release of active ingredient, in the preparation of which conventional auxiliaries such as excipients, disintegrants, binders, coating, swelling or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers, Find use.
  • excipients may be magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents, such as sterile water and monohydric or polyhydric alcohols, for example glycerol.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be prepared by mixing at least one active ingredient used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier and optionally further suitable active ingredients, additives or excipients with a defined inhibitor dose and preparing it to the desired dosage form.
  • a pharmaceutical composition according to the invention is galenically prepared for oral or parenteral administration.
  • Dosages are 0.01 to 5.0 mg / kg / day for a 75 kg adult, in particular 0.01 to 1, 0 mg / kg / day, (orally), 0.001 to 2.5 mg / kg / day, in particular 0.005 to 1, 0 mg / kg / day, (ip) in question.
  • the active ingredient concentration may be 0.001 to 1.0% by weight, in particular 0.01 to 0.1% by weight, of the ointment.
  • Example 1 Identification of the Lysolipin Biosynthetic Gene Cluster by Genetic Screening and Functional Detection by Heterologous
  • lysolipin is synthesized from 12 malonyl CoA units following a typical type II polyketide synthesis scheme.
  • biosynthesis of the backbone of aromatic polyketides is iterative by the minimal PKSII, which consists of 3 separate enzymes: 2 ß-ketoacyl synthase subunits KSa and KSB (previously known as "Chain Length Factor", CLF) and the "Acyl Carrier Protein" (ACP)
  • CLF Choin Length Factor
  • ACP Acyl Carrier Protein
  • the KSa and KS ⁇ subunits are believed to control the selection and eventual processing of the starter ketide the number of condensations and the actual iterative condensation between the acyl thioesters and the growing C chain, which acts as a kind of anchor for the growing polyketide chain.
  • KSa or KSß are thus suitable marker genes for aromatic polyketides and the use of derived gene probes should therefore also in the case of lysolipin producers, for the identification of PKSII clusters ("reverse genetics"), leading to the biosynthesis of aromatic polyketides, such as lysolipin
  • reverse genetics leading to the biosynthesis of aromatic polyketides, such as lysolipin
  • the method of gene bank production is based essentially on protocols described under Beye et al., 1998, GENOMICS 49, 317-320 and Burgtorf et al., 1998, GENOMICS 52 (2): 230-2. homogenized
  • Bacterial cultures were embedded in 0.5% low melting point agarose (SeaPlaque GTG, Biozyme) followed by 2 mg / ml HEW lysozyme (Roth) for 14 h at room temperature and 1 mg / ml proteinase K (Merck) for 24 h incubated at 50 0 C.
  • the embedded DNA was partially cleaved with Sau3A ⁇ , extracted with gelase (Epicentre) and dephosphorylated according to methods described.
  • the genomic DNA was ligated to 750 ng of ⁇ amHI digested cosmid vector pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England.), Desalted, packaged (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene) and into DH5 ⁇ (Invitrogen) transfected.
  • Cosmid clones were picked in 384 MTP followed by nylon filters
  • the PCR mixture had the following composition: 1.0 ⁇ l of CB28 genomic DNA (about 0.2 ⁇ g), 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 2.5 ⁇ l of PCR-DIG Probe Synthesis Mix (Roche), 5.0 ⁇ l Q-Solution, 0.5 ⁇ l PKSII-FOR primer (50 pmol), 0.5 ⁇ l PKSII-REV primer (50 pmol), 0.5 ⁇ l Qiagen Taq polymerase (2.5 u), 14 , 5 ⁇ l H 2 O.
  • the PCR was carried out in a PCR instrument from MJ Research (PTC-225) under the following conditions: 1 ⁇ (2 min, 95 ° C.), 30 ⁇ (95 ° C., 1 min, 72 ° C, 2 min, 72 ° C, 1.30 min), 1 x (72 ° C, 5 min).
  • PKSII amplicons show a characteristic size of about 600 bp.
  • Cosmid library revealed 13 hybridizing cosmid clones that could be confirmed by a control PCR.
  • another probe directed against halogenase genes was used.
  • the following conserved primers were also used with the help of the genomic DNA of CB28: Halo-For: GCG GCT GCA G (GC) T GG (AGT) (AT) (GC) AT (CT) C CG (CT) T Halo Rev: CC (GC) (GC) TG GAT CC (GC) CGGGTC (GC) A (GCT) GAA GC (see also: van Pee, Zehner, S., 2003.
  • Characteristic halogenase amplicons showed a size of about 260 bp.
  • Use of the thus amplified homologous halogenase probe in a hybridization against the CB28 cosmid library yielded 11 hybridizing cosmid clones that could be confirmed by control hybridization.
  • a total of 3 cosmid clones (28-4H04, 28-4022, and 28-3J01) cohybridized against PKSII and halogenase probes, so that they were likely to encode parts or the complete lysolipin biosynthetic gene cluster.
  • Aromatic polyketide biosynthetic gene clusters consist of about 30 to 40 ORFs having a coding capacity of between 30 to 35 kb. Since average insert sizes of about 40 kb are achieved in the generated cosmid library, there is the theoretical possibility that the complete lysolipin biosynthesis gene cluster is located on one of the 3 co-hybridizing cosmids. Functional detection may be by heterologous expression of the entire cluster and production of lysolipin in a foreign host respectively.
  • S. coelicolor S.albus J1074 which has been used successfully as a heterologous host for the production of rebeccamycin, among others, is a suitable host (Sanchez et al., 2002, Chem Biol.
  • IncP coli donor strain containing IncP plasmid such as ET12567 (pUB307) [McNeil et al., 1992, Gene 111, 61-68], which simultaneously contains an oriT-carrying and therefore mobilizable plasmid, which can be mobilized to actinomycetes during conjugation by the IncP plasmid.
  • the basic cosmid vector pOJ436 has a corresponding oriT and in addition an integrating function of the Actinomycetenphagen PhiC31, which allows the integration of the cosmid into the chromosome of a variety of Streptomyceten, including in S. albus (Kieser et al., 2000).
  • the cosmid 28-4H04 was intergenerically conjugated to S. albus by E. coli (standard method see: Kieser et al., 2000). Successful transfer and integration of the cosmids can be detected by selection on the apramycin resistance gene marker aacC4. Therefore, the transconjugation approach was overlaid with 1 mg apramycin (selected for transfer and integration of the cosmid) and 1 mg phosphomycin (kills the unwanted E. coli donors present in the transconjugation mixture). After 4 - 6 days of incubation at 28 0 C more transconjugants were visible, their apramycin resistance could be successfully verified.
  • each 1 ml of the main culture was extracted after addition of 50 .mu.l of 1 N HCl with 1 ml of ethyl acetate and the organic phase was concentrated to dryness, ii) the residue was taken up in 100 .mu.l of MeOH and the production of Lysolipin examined by LC-DAD-MS.
  • the injection volume was 20 ⁇ l.
  • the LC-DAD-MS analysis of the transconjugant S. a ⁇ bt; s / 28-4H04 clearly shows that, in contrast to the negative control (S. albus), it synthesizes a substance whose retention time, UV spectrum and mass correspond to those of lysolipin I. , 2 to 5, the total ion current (TIC) chromatograms (positive mode, FIG Ion chromatograms (positive mode and between m / z 597 to 599
  • the substance corresponding to this peak shows a UV spectrum ( Figure 6, top) which corresponds to the UV spectrum of lysolipin I (pure lysolipin I in a biocatalysis approach, Figure 6, bottom).
  • Figure 7, top A comparison of the heterologously synthesized substance at 4.6 min ( Figure 7, top) with lysolipin (pure lysolipin I in a biocatalysis approach, Figure 7, bottom) shows that a substance was formed in the transconjugant, its mass and isotope distribution pattern which corresponds to the single-chlorinated lysolipin I.
  • ORFs A total of 46 putative ORFs could be identified, with 'ORF46 being incomplete (the characteristics and designations of ORFs are summarized in Figure 8). These ORFs are in 9 groups different transcription direction organized (Fig. 9). Due to the annotation, the lysolipin biosynthetic gene cluster should comprise 44 ORFs (L / p genes) with a coding range of about 38.6 kb. The gene product of the wm 5 'region, presumably outside of the cluster of localized ORFs 1, shows highest homology to a conserved hypothetical protein from S.
  • HpA Within the cluster HpA is a gene whose gene product is highly similar to asparagine synthases / glutaminamido. These enzymes transfer amino groups from glutamine to aspartate, resulting in the synthesis of asparagine and glutamate. Similarly, LIpA was able to transfer the ammo group of glutamine to malonyl-CoA, resulting in the formation of malonamide-CoA substantiates the fact that LIPA has a 51% identity to the asparagine synthase TcsG of the oxytetracycline cluster.
  • malonamoyl CoA postulates a nitrogen-modified starter (Hunter and Hill, 1997, in Biotechnology of Antibiotics (Strohl, WR , ed., 2nd Ed, pp 659-682, Marcel Decker, Ine, New York)
  • the Condensation of the Putative Malonamide-A This is coded by the three genes HpD, HpE and HpF.
  • the derived gene products show the highest similarities (52, 69 and 78%) to the ACP and to the ⁇ -ketoacyl synthase subunits KS ⁇ and KSa of the rubromycin biosynthetic gene cluster Since the KS ⁇ subunit should have an influence on the chain length of the polyketide, it is not surprising that the highest homology to the KSß subunit of rubromycin biosynthesis is found at 78%, since rubromycin with 12 required condensations belongs to the largest polyketides (the biosynthesis of lysohpin requires 11 condensations) The biosynthesis of lysohpin requires several praaromatic deoxygenations, which may be initiated during the formation of the polyketide (Bockholt et al 1994, J Org Chem 59, 2064-2069) In lysolipin Biosynthesegencluster are present with HpZI, HpZIII and HpZIV three genes whose gene products supreme Ide Similarity to 3-oxoacyl-ACP reduc
  • the genes // pC / - /// contain three genes whose gene products show the highest identity to cyclases of griseorhodin / rubromycin biosynthesis.
  • the highest identity of LIpCl-III especially to cyclases involved in the synthesis of pradimicin-like antibiotics underscores the fact that these antibiotics form a lysolipin-like intermediate.
  • Oxidoreductions are shown in FIG. Since 9 of the 12 oxygen atoms present in lysolipin X ( Figure 1) are from molecular oxygen, the presence of a large number of oxygen-introducing oxidoreductases is not surprising.
  • the oxygenoredases belonging to the oxidoreductases catalyze the introduction of one (monooxygenase) or two oxygen atoms (dioxygenases) into the corresponding substrate. These can catalyze various chemical reactions, such as hydroxylation, epoxidation, and oxidative rearrangements, such as the Baeyer-Villiger reaction. They differ in their cofactors. Cytochrome P-450 monooxygenases (CYP450) and FAD-dependent mono- and dioxygenases are common in PKS biosynthesis (Rix et al., 2002, Nat. Prod. Rep. 19, 542-580).
  • the cluster contains 3 genes HpOIV, HpOVI and HpOVII, whose derived gene products have the highest identity to cytochrome P450-dependent monooxygenases (CYP450).
  • LIpOIV shows the highest similarity to MycG (48% identity), a CYP450, which in the course of the
  • Mycinamycin biosynthesis is responsible for both hydroxylation and epoxidation (Inouye et al., 1994 Mol Gen Gen. 245 (4): 456-64).
  • HpOIV downstream of HpOIV with HpK is a gene coding for a ferrodoxin.
  • LIpOVI is most similar to a CYP450 from the pradimicin biosynthetic gene cluster.
  • the derived gene products LIpOII and LIpOIII also show the highest similarity to genes of the pradimicin group (RubT, GrhV, GrhU), for which no function is described.
  • a motif search (Pfam analysis), however, gives a clear "antibiotic biosynthesis monooxygenase” motif for both enzymes, so that both of them
  • HpL encodes a gene product that has the highest homology to the hydroxylase annotated enzyme SnoaW. The exact function of this enzyme within the lysolipin biosynthesis remains to be clarified as well as the function of all other lysolipin oxygenases.
  • LIPU gene product has "alcohol dehydrogenase” motif and shows highest similarity to dehydrogenases.
  • LIpZII Gene product shows highest identity (42%) to MmcJ, a F420-dependent tetrahydromethanopterin (H4MPT) reductase of mitomycin biosynthesis. This enzyme catalyzes carbonyl reduction and may be involved in the biosynthesis of the lysolipin starter.
  • LIPS Gene product shows highest identity (37%) to 3-hydroxybutyrate
  • the gene HpH encodes a gene product that shows the highest similarity to NADH / FAD-dependent halogenases (37-39%). Thus, LIpH will be responsible for the halogenation at C1.
  • lysolipin requires 4 O-methylations and N-methylation.
  • 6 genes can be identified (HpMI to HpMVI) whose gene products have the highest similarity to O-methyltransferases of different antibiotic biosyntheses, such as tetracenomycin, griseorhodin and enterocin.
  • the cluster codes for 6 O-methyltransferases, although only 5 are needed.
  • the cluster contains 4 regulatory genes (llpRI-llpRIV).
  • LIPRIV has high homology (39%) to the RubS regulator of rubromycin biosynthesis, known as SARPs ("Streptomyces antibiotic regulatory protein"), a biosynthesis-specific transcriptional activator of some of the lysolipin genes LIpRI shows homology to a transcriptional regulator (presumably a repressor) and could mark the beginning of the cluster LIpRII and LIpRIII show the highest similarity to transcriptional activators (see Table 1).
  • a function of these proteins has not previously been described. Nevertheless, both membrane proteins could also contribute to the mediation of resistance.
  • the lysolipin gene cluster with HpG one gene is located whose derived gene product has significant identity (42%)
  • Glycosyltransferases shows. There are kigamycin very well glycosylated lysolipin-like xanthones (Kunimoto et al., 2003, 56, 1012-1017), but glycosylated lysolipin derivatives are not yet known. Whether, as in the case of macrolides, a possible intermediate glycosylation is a resistance mechanism remains to be tested.
  • SEQ. ID 93 is the total nucleic acid sequence.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Gene aus Lysolipin-produzierenden Mikroorganismen, neue Genkluster, welche aus neuen und/oder bekannten Genen dieser Mikroorganismen gebildet sind, Expressionsprodukte dieser Gene, Transformationsvehikel enthaltend solche Gene, Genfragmente oder Gencluster, transformierte Zellen enthaltend solche Gene oder Genkluster, Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Lysolipinderivaten, Verfahren zur kombinatorischen Biosynthese von Lysolipinderivaten, neue Lysolipinderivate, Verwendungen solcher Lysolipinderivate und pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend solche Lysolipinderivate.

Description

Neuer Lysolipin Biosynthesegencluster
Gebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft einen neuen Lysolipin Biosynthesegencluster, neue Gene oder Genfragmente aus einem solchen Biosynthesegencluster,
Expressionsprodukte dieser Gene oder Genfragmente, Transformationsvehikel enthaltend solche Gene, Genfragmente oder Gencluster, transformierte Zellen enthaltend solche Gene, Genfragmente oder Gencluster, Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Lysolipin und Lysolipinderivaten, Verfahren zur kombinatorischen Biosynthese von Lysolipinderivaten, neue
Lysolipinderivate, Verwendungen solcher neuer Lysolipinderivate und pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten solche Lysolipinderivate.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik:
Der Bakterienstamm Streptomyces tendae TÜ4042 (CB28) produziert das Polyketid-Antibiotikum Lysolipin, ein polyzyklisches Xanthon mit starker antibiotischer Wirkung gegen Bakterien sowie Antitumorwirkung gegen verschiedene Tumorzelllinien. 1975 wurde Lysolipin erstmals als ein Metabolit des Stammes Streptomyces violaceoniger Tü96 beschrieben (Drautz et al., 1975, Arch Microbiol. 106, 175-190). Der Begriff Lysolipin beschreibt genau genommen zwei Substanzen. Das vom Produzentenstamm ausgeschiedene Lysolipin X wird durch Licht, Hitze oder UV-Strahlung in das stabilere Lysolipin I umgewandelt (Fig. 1). Lysolipin I weist eine 10-50 fach höhere biologische Aktivität auf. Die antibakterielle Wirkung von Lysolipin I besteht vermutlich in einer Inhibierung der Zellwandbiosynthese durch Interaktion mit dem Carrierlipid, da nach Lysolipin-Zugabe in den inhibierten Zellen verstärkt Mureinvorstufen angehäuft werden. Lysolipin I wirkt sehr effizient gegen Gram- positive (MIC 0,001 μg/ml), sowie gegen einige Gram-negative Bakterien. Desweiteren konnte eine starke tumorstatische Wirkung gegen verschiedene Tumorzelllinien (IC500,001 μg/ml) nachgewiesen werden (Pultar, 1988, Disseration Uni Tübingen).
Die Biosynthese von Lysolipin wurde mit Hilfe von Einbaustudien radioaktiv markierter Vorstufen untersucht (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064- 2069). In diesen Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Synthese von Lysolipin aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs Il (charakteristisch für aromatische Polyketide) erfolgt. Eher ungewöhnlich ist die Verwendung von Malonyl-CoA als Starter-Einheit, welches vollständig, d.h. ohne Decarboxylierung, verwendet wird. Bisher gibt es nur wenige bekannte Substanzen, die Malonyl-CoA als Starter verwenden, wie Tetracyclin und Cycloheximid. Vergleicht man die Biosynthese dieser beiden Antibiotika mit der des Lysolipins, so fällt bei Lysolipin der Einbau des Malonat-Moleküls in „umgekehrter" Orientierung auf. Der stickstoffhaltige Heterozyklus des Lysolipins wird vermutlich über die Zwischenstufe eines Malonamid-Intermediats ausgebildet. Nach der
Biosynthese des Grundgerüstes müssen zahlreiche Modifikationen stattfinden, um das Endprodukt Lysolipin X bzw. I zu erzeugen. Dazu zählen eine Zyklisierung und Aromatisierung, Einführen von Sauerstoffatomen (9 der 12 Sauerstoffatome in Lysolipin X werden aus molekularem Sauerstoff vermutlich durch Oxygenasen eingeführt, darunter beide Xanthon Sauerstoffe), Chlorierung vermutlich durch eine Halogenase, und Einführung von Methylgruppen an den Hydroxygruppen (C6, C16, C24), der Methylengruppe C28 und am Stickstoff vermutlich durch Methyltransferasen.
Aufgrund seiner Struktur kann man Lysolipin der Substanzklasse der N-haltigen polyzyklischen Xanthone zuordnen. Weitere verwandte Strukturen bakterieller Herkunft mit pharmazeutisch interessanten Eigenschaften sind die Antibiotika Albofungin/Chloralbofungin, Cervinomycin, Simaomicin, Citreamicin, die cytostatisch und antifungisch wirksamen Actinoplanone und die antifungisch aktiven Substanzen Seh 42137 und Seh 54445. Der pharmazeutische Einsatz dieser Substanzen wird bisher durch die schlechte Löslichkeit und die aufgrund der Xanthonstruktur antizipierte und für einige Substanzen nachgewiesene Toxizität verhindert. Durch chemische Modifikation ist es jedoch exemplarisch gelungen, nach Acetylierung von Cervinomycin A1 , Derivate zu erzeugen, die besser löslich, weniger toxisch und sogar aktiver sind (US 4,886,884). Die Möglichkeiten der chemischen Variation sind durch das Vorhandensein „natürlicher Schutzgruppen", wie gerade im stark modifizierten Lysolipin, eingeschränkt.
Gegenüber den insofern bekannten Substanzen sind verbesserte pharmakologische Eigenschaften, beispielsweise auch verringerte Toxizität, sowie höhere Selektivität und Spezifität erwünschenswert. Die hierfür erforderliche Derivatisierung ist ohne weiteres aus den vorstehend genannten Gründen schwierig, wenn nicht gar unmöglich.
Technisches Problem der Erfindung:
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, Mittel zur Synthese von neuen Lysolipinderivaten, insbesondere von einer chemischen Synthese nicht oder nur schwer zugänglichen Lysolipinderivaten, welche zudem verbesserte pharmakologische Eigenschaften aufweisen, zur Verfügung zu stellen.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen:
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein isoliertes Protein oder Peptid enthaltend oder bestehend aus einer oder mehrerer Aminosäuresequenzen SEQ-ID 1 bis 46. Erfindungsgemäße Protein oder Peptide können in einer Zelle, insbesondere einer transformierten Zelle, zur Biosynthese exprimiert werden, es ist jedoch auch der Import extern erzeugten Proteins oder Peptids in eine die Biosynthese ausführende Zelle möglich. In beiden Fällen kann es sich empfehlen, wenn die Expression eines entsprechenden natürlichen Gens der Zelle inhibiert oder reduziert ist. Das Protein oder Peptid ist vorzugsweise für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Lysolipinderivates, insbesondere eines Lysolipin- Antibiotikums, funktional.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine isolierte Nukleinsäure, insbesondere DNA, beispielsweise genomische DNA, cDNA, oder RNA, insbesondere mRNA, codierend für ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid.
Mit der Erfindung ist die gezielte molekulargenetische Manipulation von Sekundärmetabolit-Biosynthesegenclustern ermöglicht, wodurch neue, modifizierte Substanzderivate biologisch erzeugt werden können. Die Erfindung beruht in diesem Zusammenhang auf der erstmaligen Identifizierung und Charakterisierung eines Biosynthesegenclusters für bakterielle, N-haltige
Xanthone. Hierdurch ist die Grundlage für jede gezielte genetische Manipulation zur Erzeugung von Lysolipinderivaten, die totalsynthetisch, wenn überhaupt, nur sehr schwer darstellbar sind, geschaffen. Diese können wiederum als Precursor-Moleküle semisynthetisch derivatisiert werden. Darüber hinaus erlauben die aus der Genclustersequenz gewonnenen Erkenntnisse einen schnellen molekulargenetischen Zugang zur Biosynthese aller anderen bakteriellen N-haltigen polyzyklischen Xanthone mit pharmazeutischem Potential.
Mit der Erfindung umfaßt sind auch Homologe der offenbarten Sequenzen, wobei die Homologie zumindest 60% Identität, vorzugsweise mehr als 80 % oder 90% Identität, höchstvorzugsweise mehr als 95% Identität, beträgt (berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum Anmeldezeitpunkt gültigen Fassung). Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen bzw. Genfragmente der explizit offenbarten Sequenzen oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 50 oder 150 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide, ggf. codiert durch eine Nukleinsäure, mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfasst, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J. M. Sambrook et al., A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E. M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfasst, i.e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfasst. Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Nukleinsäuren oder Proteine bzw. Peptide neben den Volllängen der offenbarten Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen bzw. Genfragmente hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 21 Nukleotiden, vorzugsweise einer Mindestlänge von 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlänge von 7 Aminosäuren, vorzugsweise einer Mindestlänge von 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Proteine oder Peptide. Insbesondere zwischen 21 und 90 sowie 7 und 30 ist jeder einzelne Zahlenwert als Mindestlänge möglich. Vorbekannte Sequenzen und/oder deren Verwendung, welche unter die im Rahmen dieser Beschreibung verwendeten Definitionen fallen, können durch einen Disclaimer in Patentansprüchen ausgeschlossen werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein isoliertes Transformationsvehikel, insbesondere Plasmid oder Cosmid, enthaltend eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure. Es kann eine Mehrzahl, insbesondere 1 bis 50, gleicher und/oder verschiedener erfindungsgemäßer Nukleinsäuren enthalten. Dabei wird es sich insbesondere empfehlen, wenn durch die Mehrzahl der Nukleinsäuren ein Biosynthesegencluster oder ein Teil eines Biosynthesegenclusters für ein Lysolipinderivat gebildet ist. Das Transformationsvehikel kann zusätzlich zumindest eine regulatorische Nukleinsäuresequenz enthalten, wobei die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäuresequenz, insbesondere eines Promotors, steht. Selbstverständlich können ein oder mehrere regulatorische Sequenzen mit der Maßgabe eingerichtet sein, dass eine Mehrzahl von Nukleinsäuren, insbesondere ein Gencluster oder ein Teil eines Genclusters kontrolliert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle enthaltend eine erfindungsgemäße fremde Nukleinsäure oder mehrere verschiedene solcher fremden Nukleinsäuren und/oder ein erfindungsgemäßes fremdes Protein oder Peptid oder mehrere verschiedene solcher fremden Proteine oder Peptide, wobei die Zelle optional mit einer erfindungsgemäßen fremden Nukleinsäure oder mehreren verschiedenen solcher fremden Nukleinsäuren transformiert sein kann. Hierbei kann eine gewünschte Derivatisierung eines natürlicherweise von der Zelle synthetisierten Lysolipinderivates dadurch erreicht werden, dass in einem Lysolipinbiosynthesegencluster der Zelle an Stelle oder zusätzlich zu einem natürlichen korrespondierenden Gen für einen definierten Teilsynthese¬ schritt ein hiervon verschiedenes fremdes Gen für einen von dem definierten Teilsyntheseschritt verschiedenen anderen definierten Teilsyntheseschhtt eingeführt ist. Dies kann durch Konstruktion und Einführung des gesamten fremden bzw. mutierten Lysolipinbiosynthesegenclusters oder Teilen hiervon erfolgen. Es wird gleichsam eine mutierte Biosynthese maßgeschneidert nach Maßgabe der gewünschten Derivatisierung. Es ist gleichzeitig möglich, ein natürlicherweise in der Zelle enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschhtt der Biosynthese des Lysolipins oder eines Lysolipinderivates funktional ist, zu inhibieren oder zu mutieren, insbesondere ganz oder teilweise zu deletieren. Dies kann auch für mehrere natürlicherweise in der Zelle enthaltene solche Gene erfolgen.
Mit der Erfindung wird erreicht, dass neben gezielten molekulargenetischen Eingriffen auch durch das Einbringen heterologer Modifizierungsgene, also durch "Kombinatorische Biosynthese", neue Lysolipinderivate erzeugt werden können.
Geeignete Zellen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Actinomyceten, wie z.B. die Streptomyceten, oder Enterobakterien, wie z.B. E. coli. Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Zelle eine mit einem erfindungsgemäßen Transformationsvehikel erzeugte Mutante bzw. Rekombinante bekannter Stämme ist, und dass das damit erzeugbare Antibiotikum gegenüber bekannten Verbindungen derivatisiert ist.
Die Erfindung umfasst auch Lysolipinderivate, insbesondere Lysolipinderivat- Antibiotika, welche dadurch erhältlich sind, dass eine erfindungsgemäße Zelle kultiviert wird, und dass nach Kultivierung das Lysolipinderivat aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird. Ein erfindungsgemäßes Lysolipinderivat ist zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von bakteriellen oder viralen Infektionen, Mucosen,
Tumorerkrankungen und/oder inflammatorischen Erkrankungen geeignet. Dabei kann die Biosynthese dahingehend mutiert sein, dass das neue Lysolipinderivat eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber bekannten Wirkstoffen aufweist. Es ist aber auch möglich, dass ein erfindungsgemäßes Lysolipinderivat "lediglich" als Ersatztherapie bei Resistenz gegen einen bekannten Wirkstoff Verwendung findet. Dann liegt der Vorteil darin, dass mittels des erfindungsgemäßen Wirkstoffes überhaupt erst wieder eine Therapie möglich ist. Besonders Wünschenwert sind jedoch auch neue Lysolipinderivate mit reduzierten Nebenwirkungen. Schließlich sind mit der Erfindung auch besonders effektive Herstellungsverfahren möglich. Die Erfindung betrifft des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein erfindungsgemäßes Lysolipinderivat oder mehrere solcher Lysolipinderivate in physiologisch wirksamer Dosis. Zusätzlich enthalten können sein galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Salben, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.V., i.p., im, s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme oder sonstige topische Applikation, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Wirkstoff in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung galenisch hergerichtet zur oralen oder parenteralen Gabe.
Als Dosierungen kommen für einen 75 kg Erwachsenen 0,01 bis 5,0 mg/kg/Tag, insbesondere 0,01 bis 1 ,0 mg/kg/Tag, (oral), 0,001 bis 2,5 mg/kg/Tag, insbesondere 0,005 bis 1 ,0 mg/kg/Tag, (i.p.) in Frage. Im Falle der topischen Anwendung kann die Wirkstoffkonzentration 0,001 bis 1 ,0 Gew.-%, insbesondere 0,01 bis 0,1 Gew.-%, der Salbe betragen.
Im Folgenden wird die Erfindung durch Beschreibung der Identifizierung, Sequenzierung, Annotation des Lysolipin-Biosynthesegenclusters näher erläutert. In diesen Ausführungsformen können einzelne Merkmale der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Merkmalen verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keinster Weise beschränkend zu verstehen.
Beispiel 1 : Identifizierung des Lysolipin-Biosynthesegenclusters durch genetisches Screening und funktioneller Nachweis durch heterologe
Expression des gesamten Genclusters
Die Identifizierung und Analyse aller zur Biosynthese eines bakteriellen Naturstoffs notwendigen Gene, wird in der Ordnung der Actinomyceten, zu denen die bekannte Gattung der Streptomyceten gehört, dadurch ermöglicht, dass in der Regel alle zur Synthese notwendigen Gene auf dem Chromosom physikalisch benachbart, in so genannten Genclustern organisiert sind. Diese Gencluster beinhalten neben den eigentlichen Biosyntheseenzyme kodierenden Genen, auch die Gene, die für die Regulation, Export und die Resistenzvermittlung notwendig sind. Dies bedeutet, dass nach der
Identifikation eines Substanz-spezifischen Biosynthesegens, alle übrigen Gene des Clusters durch die Analyse der angrenzenden Regionen identifiziert werden können.
In den letzten Jahren hat sich der Einsatz der Strategie der „reversen Genetik", die die Konserviertheit von Genen ausnutzt, welche an der Biosynthese bestimmter konservierter Strukturelemente beteiligt sind, als sehr effizient erwiesen. Bei dieser Strategie nutzt man zunächst die chemische Struktur und Ergebnisse von Einbaustudien dazu, ein potentielles Biosyntheseschema zu postulieren. Im zweiten Schritt werden charakteristische Gene bzw. Enzyme bestimmt, die für die zu identifizierende Strukturklasse konserviert sind. Nach Sequenzvergleich werden von diesen hochkonservierte Motive ermittelt, die zur Generierung von Primersonden für PCR oder Hybridisierung eingesetzt werden können. Die gezielte Kombination unterschiedlicher Sonden führt dann zum Auffinden von Genen bzw. Genclustern, die an der Biosynthese der zu untersuchenden Substanz beteiligt sein könnten.
Die chemische Struktur von Lysolipin und Fütterungsexperimente legen nahe, dass Lysolipin aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs Il synthetisiert wird. Im Gegensatz zu komplexen Polyketiden (wie z.B. Makrolide), die durch die modular organisierten multifunktionalen Typ I Polyketidsynthasen synthetisiert werden, erfolgt die Biosynthese des Rückgrats aromatischer Polyketide iterativ durch die Minimal PKSII, die aus 3 separaten Enzymen besteht: 2 ß-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSa und KSß (zuvor auch als „Chain Length Factor, CLF, bezeichnet) und dem „Acyl Carrier Protein" (ACP). Im Verlauf der Biosynthese sind die KSa- und KSß-Untereinheiten vermutlich für die Auswahl und evtl. Prozessierung des Starterketids, die Kontrolle der Anzahl der Kondensationen und die eigentliche iterative Kondensation zwischen den Acylthioestern und der wachsende C-Kette verantwortlich. Das ACP fungiert als eine Art Anker für die wachsende Polyketid kette.
Vergleicht man die drei Minimal-PKS kodierenden Gene unterschiedlicher PKSII-Biosynthesen untereinander, so fällt auf, dass diese hochkonserviert sind und meist die charakteristische Organisation KSα-KSß-ACP aufweisen. Es gibt jedoch Ausnahmen, wie z.B. im Daunorubicin-Biosynthesegencluster von S. peucetius, in dessen Gencluster das ACP separiert von KSa und KSß vorliegt. KSa bzw. KSß sind somit geeignete Markergene für aromatische Polyketide und der Einsatz abgeleiteter Gensonden sollte daher auch im Falle des Lysolipin- Produzenten, zur Identifizierung von PKSII-Clustern führen („reverse Genetik"), die an der Biosynthese von aromatischen Polyketiden, wie Lysolipin beteiligt sein sollten. Diese Strategie wurde bereits erfolgreich zur Identifizierung von unterschiedlichen PKSII Clustern angewendet (Metsä-Ketelä et al., 2002, Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472-4479). Da man in Streptomyceten häufig mehrere PKSII-Gencluster findet, die zum einen an der Biosynthese von Sporenpigmenten aber auch an der Biosynthese mehrerer aromatischer Polyketide in einem Stamm beteiligt sein können, ist der Einsatz einer weiteren Gensonde zur spezifischen Identifizierung des Lysolipin-Biosynthesegenclusters vorteilhaft.
Im Falle von Lysolipin bietet sich hier eine Strategie an, bei der die Einführung des Cl-Substituenten an C1 im Mittelpunkt steht. Die spezifische Halogenierung von Naturstoffen bakteriellen Ursprungs, wie z.B. Chlor-Tetracyclin, Pyrrolnitrin oder Vancomycin wird durch NADH/FAD abhängige Halogenasen katalysiert (van Pee, 2001 , Arch. Microbiol. 175, 250-258). Alle Halogenasen, die an der Halogenierung von Phenyl- bzw. Pyrrolresten beteiligt sind, weisen auf Proteinebene hohe Ähnlichkeiten auf und erlauben die Auswahl hochkonservierter Regionen, die wiederum zur Ableitung von Primern geeignet sind. Derartige Primer lassen sich zur Identifikation von Halogenasegenen und dazugehöriger Biosynthesegencluster einsetzen (Piraee and Vining, 2002, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29, 1-5).
1.1 .
Die Identifizierung des Lysolipin-Biosynthesegenclusters erfolgte unter Verwendung von PKSII- und Halogenase- spezifischen Gensonden gegen gespottete Klone einer Cosmid-Genbank des Stammes CB28.
Die Methode der Genbankherstellung basiert im Wesentlichen auf Protokollen, die unter Beye et al., 1998, GENOMICS 49, 317-320 und Burgtorf et al., 1998, GENOMICS 52(2):230-2 beschrieben wurden. Homogenisierte
Bakterienkulturen wurden in 0.5% "low melting point agarose" (SeaPlaque GTG, Biozym) eingebettet und anschließend mit 2 mg/ml HEW-Lysozym (Roth) für 14 h bei Raumtemperatur und mit 1 mg/ml Proteinase K (Merck) für 24 h bei 50 0C inkubiert. Die eingebettete DNA wurde partiell mit Sau3A\ gespalten, mit Gelase (Epicentre) extrahiert und nach beschriebenen Methoden dephosphoryliert. Die genomische DNA wurde mit 750 ng ßamHI gespaltenen Cosmidvektor pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England.) ligiert, entsalzt, verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene) und in DH5α (Invitrogen) transfiziert. Cosmidklone wurden in 384 MTP gepickt und anschließend auf Nylonfilter
(Amersham) gespottet. Nachdem die Kolonien auf den Membranen gewachsen waren, wurden diese nach Nizetic et al., 1991 , PNAS 88:3233-7 prozessiert und unter Verwendung der Standard-Methoden nicht-radioaktiv hybridisiert (Roche). Zur Identifizierung von PKSII-kodierenden Cosmiden wurde zunächst eine homologe Sonde mit Hilfe der genomischen DNA aus CB28 hergestellt (PCR- Primer s. Metsä-Ketelä et al., Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472-4479). Der PCR-Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 1 ,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 2,5 μl 10 x Puffer, 2,5 μl PCR-DIG probe Synthesis Mix (Roche), 5,0 μl Q-Solution, 0,5 μl PKSII-FOR -Primer (50 pmol), 0,5 μl PKSII- REV-Primer (50 pmol), 0,5 μl Qiagen-Taq-Polymerase (2,5 u), 14,5 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC-225) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 x (2 min, 95°C), 30 x (95°C, 1 min; 72°C, 2 min; 72°C, 1.30 min), 1 x (72°C, 5 min). PKSII-Amplifikate zeigen eine charakteristische Größe von ca. 600 bp. Ein Einsatz der so amplifizierten homologen PKSII-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28
Cosmidbibliothek ergab 13 hybridisierende Cosmidklone, die sich durch eine Kontroll-PCR bestätigen ließen. Um aus diesen Cosmiden solche auszuwählen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Teile des oder das gesamte Lysolipin- Biosynthesegencluster kodieren, wurde eine weitere Sonde, die gegen Halogenasegene gerichtet war, eingesetzt. Dazu wurde ebenfalls mit Hilfe der genomischen DNA von CB28 folgende konservierte Primer eingesetzt: Halo-For: GCG GCT GCA G(GC)T GG(AGT)(AT)(GC)A T(CT)C CG(CT) T Halo-Rev: CC(GC) (GC)TG GAT CC(GC) CGGGTC (GC)A(GCT) GAA GC (s. auch: van Pee, Zehner.S., 2003. Enzymology and molecular genetics of biological halogenation. In: Gribble.G. (Ed.), The Handbook of Environmental Chemistry, Part P Natural Production of Organohalogen Compounds. Springer Verlag, Heidelberg, Vol. 3). Die PCR wurde mit Hilfe des PCR DIG Probe
Synthesis Kit (Roche) durchgeführt und hatte folgende Zusammensetzung: 1,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 5 μl 10 x Puffer, 5 μl PCR DIG Labeling Mix, je 1 μl Halo-For- und Halo-Rev-Primer (50 pmol), 0,75 μl Enzym- Mix, 36,25 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC- 100) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 x (2 min, 940C), 25 x (94°C, 1 min; 610C, 1 min; 72°C, 1 min), 1 x (72°C, 10 min). Charakteristische Halogenase-Amplifikate zeigten eine Größe von ca. 260 bp. Ein Einsatz der so amplifizierten homologen Halogenase-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28 Cosmidbibliothek ergab 11 hybridisierende Cosmidklone, die sich durch eine Kontroll-Hybridisierung bestätigen ließen. Insgesamt 3 Cosmidklone (28- 4H04, 28-4022 und 28-3J01) zeigten eine Cohybridisierung gegen PKSII- und Halogenase-Sonde, so dass diese mit einer großen Wahrscheinlichkeit Teile bzw. das vollständige Lysolipin Biosynthesegencluster kodieren sollten.
1.2.
Der Nachweis, dass das identifizierte cohybridisierende Cosmid 28-4H04 alle für die Biosynthese von Lysolipin notwendigen Gene kodiert, erfolgte durch heterologe Expression in S. albus.
Biosynthesegencluster für aromatische Polyketide bestehen aus ca. 30 bis 40 ORFs, die eine Kodierkapazität zwischen 30 bis 35 kb aufweisen. Da in der erzeugten Cosmid-Genbank durchschnittliche Insertgrößen von ca. 40 kb erreicht werden, besteht die theoretische Möglichkeit, dass das komplette Lysolipin-Biosynthese-Gencluster auf einem der 3 cohybridisierenden Cosmide lokalisiert ist. Ein funktioneller Nachweis kann durch die heterologe Expression des gesamten Clusters und eine Produktion von Lysolipin in einem fremden Wirt erfolgen. Als geeigneter Wirt zeichnet sich neben S. coelicolor vor allem S. albus J1074 aus, der u.a. erfolgreich als heterologer Wirt zur Produktion von Rebeccamycin eingesetzt wurde (Sanchez et al. 2002, Chem Biol. 9(4):519-31). Zum Nachweis des evtl. Vorliegens des kompletten Lysolipin Biosynthesegenclusters wurde das cohybridisierende Cosmid 28-4H04 nach S. albus transferiert. Der Transfer genetischer Information nach Actinomyceten ist mit Hilfe der intergenerischen Konjugation von E. coli möglich (Kieser et al., 2000, Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England). Voraussetzung ist hier ein IncP-Plasmid enthaltender E. coli- Donor-Stamm, wie z.B. ET12567(pUB307) [McNeil et al., 1992, Gene 111 , 61-68], der gleichzeitig ein oriT-tragendes und daher mobilisierbares Plasmid enthält, das im Verlaufe der Konjugation durch das IncP-Plasmid nach Actinomyceten mobilisiert werden kann. Der Cosmidgrundvektor pOJ436 verfügt über einen entsprechenden oriT und zusätzlich über eine Integrationsfunktion des Actinomycetenphagen PhiC31 , der die Integration des Cosmids in das Chromosom einer Vielzahl von Streptomyceten, u.a. auch in S. albus, ermöglicht (Kieser et al., 2000). Das Cosmid 28-4H04 wurde von E. coli nach S. albus intergenerisch konjugiert (Standard-Methode siehe: Kieser et al., 2000). Ein erfolgreicher Transfer und Integration der Cosmide kann durch Selektion auf den Apramycin- Resistenzgenmarkers aacC4 nachgewiesen werden. Daher wurde der Transkonjugationsansatz mit 1 mg Apramycin (selektioniert auf Transfer und Integration des Cosmids) und 1 mg Phosphomycin (tötet die im Transkonjugationsansatz vorhandenen unerwünschten E. coli Donoren ab) überschichtet. Nach 4 - 6 Tagen Inkubation bei 28 0C wurden mehrere Transkonjuganden sichtbar, deren Apramycin-Resistenz erfolgreich verifiziert werden konnte.
Um eine potentielle heterologe Lysolipin-Produktion im Transkonjuganten S. a/ιfc>ivs/28-4H04 nachzuweisen, wurde dieser unter Produktionsbedingungen fermentiert und nach Extraktion mit Hilfe der LC-DAD-MS analysiert. Als Negativ-Kontrolle diente eine S. albus Kultur ohne Cosmid, die unter identischen Bedingungen kultiviert und extrahiert wurde. Die Anzucht erfolgte mit folgenden Kulturen. Vorkultur: 50 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 s. Kieser et al., 2000, pH 7,2] wurden mit der Transkonjugante S. a/ö.vs/28-4H04 angeimpft und für 48 h bei 28 °C und 160 rpm inkubiert; Hauptkultur: 100 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 s.o.] wurden mit 1 ml der Vorkultur beimpft und für 120 h bei 28 0C und 160 rpm inkubiert. Die Kontrollkultur (S. albus) wurde ohne Zugabe von Apramycin kultiviert.
Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt: i) jeweils 1 ml der Hauptkultur wurde nach Zugabe von 50 μl 1 N HCl mit 1 ml Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur Trockne eingeengt, ii) der Rückstand wurde in 100 μl MeOH aufgenommen und die Produktion von Lysolipin mittels LC-DAD- MS untersucht. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
LC-DAD-MS-Analyse (Gerätespezifikationen: HPLC: Waters Alliance 2790; Säule: Grom Sil 120 ODS-4 HE, 3 μm, Dim. 40 x 4 mm; Vorsäule: Phenomenex C18 ODS, 4 mm L x 3.0 mm ID; MS: Micromass Q-TOF 2) wurde mit folgendem Gradientensystem durchgeführt (Lösungsmittel: A - Wasser mit 0.1 % Ameisensäure, B - Acetonitril):
Zeit A% B% Fluss Kurve 0.00 98.0 2.0 1.000 1
5.00 16.7 83.3 1.000 6
6.00 4.0 96.0 1.700 6
8.00 4.0 96.0 1.700 6
8.50 98.0 2.0 1.000 6 10.00 98.0 2.0 1.000 6
Die LC-DAD-MS-Analyse des Transkonjuganten S. aΛbt;s/28-4H04 zeigt deutlich, dass diese im Gegensatz zur Negativkontrolle (S. albus) eine Substanz synthetisiert, deren Retentionszeit, UV-Spektrum sowie Masse der des Lysolipin I entspricht. Hierzu sieht man in Figur 2 bis 5 die Total Ion Current (TIC) Chromatogramme (positiver Modus; Fig. 2), die fokussierten lonenchromatogramme (positiver Modus und zwischen m/z 597 bis 599
(Lysolipin I [M+H+]+: 598); Fig. 3), DAD-UV-Chromatogramme (Base Peak Index (BPI); Fig. 4) sowie die fokussierten DAD-UV-Chromatogramme (BPI; 260 bis 280 nm, Fig. 5) der Transkonjugante S. a/jbαs/28-4H04 (oben) im Vergleich zur Negativkontrolle S. albus (mitte) und Lysolipin I (unten; reines Lysolipin I in einem Biokatalyse-Ansatz). Im Transkonjuganten Chromatogramm erscheint ein zusätzlicher Peak, der eine Retentionszeit von ca. 4,6 min aufweist. Die diesem Peak entsprechende Substanz zeigt ein UV-Spektrum (Fig. 6, oben), das dem UV-Spektrum von Lysolipin I (reines Lysolipin I in einem Biokatalyse-Ansatz; Fig.6, unten) entspricht. Ein Vergleich der heterolog synthetisierten Substanz bei 4,6 min (Fig. 7, oben) mit Lysolipin (reines Lysolipin I in einem Biokatalyse- Ansatz; Fig. 7, unten) zeigt, dass im Transkonjuganten eine Substanz gebildet wurde, deren Masse und Isotopenverteilungsmuster der des einfach chlorierten Lysolipin I entspricht.
Beispiel 2. Sequenzierung des kompletten Biosynthesegenclusters,
Sequenzannotation und Entwicklung eines Biosyntheseschemas
Die vorstehende erfolgreiche heterologe Expression zeigte, dass das Cosmid 28-4H04 alle zur Synthese von Lysolipin notwendigen Gene trägt. Zur
Bestimmung der Sequenz des putativen Lysolipin-Biosynthesegenclusters wurde das ca. 43 kb große Insert des Cosmids komplett shotgun sequenziert. Insgesamt wurde eine Sequenz von 43.202 bp doppelsträngig ermittelt, wozu auf das Sequenzprotokoll verwiesen wird (SEQ. -ID 93). Der GC-Gehalt des gesamten sequenzierten Bereiches wurde mit für Actinomyceten typischen 72,2 % bestimmt. Zur Identifizierung potentieller Lysolipin-Biosynthesegene wurden umfassende ORF (Open Reading Frame)-Analysen unter Verwendung des ORF-Finders "zCurve" (Guo et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(6):1780-9) und BlastP-Analysen durchgeführt. Insgesamt konnten 46 putative ORFs identifiziert werden, wobei 'ORF46 unvollständig ist (die Charakteristika und Bezeichnungen der ORFs sind in Fig. 8 zusammengefasst). Diese ORFs sind in 9 Gruppen unterschiedlicher Transkriptionsrichtung organisiert (Fig. 9). Aufgrund der Annotation sollte das Lysolipin-Biosynthesegencluster 44 ORFs (L/p-Gene) mit einem Kodierbereich von ca. 38,6 kb umfassen. Das Genprodukt des wm 5'- Bereich, vermutlich außerhalb des Cluster lokalisierten ORFs 1 zeigt höchste Homologie zu einem konservierten hypothetischen Protein aus S. coelicolor (75% Identität), während im 3'-Bereich des Clusters der unvollständige 'ORF46 höchste Ähnlichkeit (86% Identität) zu dem terminalen Protein TpgR2 aus Streptomyces rochei zeigt. Generell ist auffallend, dass die Produkte von insgesamt 16 Lysolipin-Biosynthesegenen (LIpOII, LIpOIII, LIpZI, LIpB, LIpCI, LIpD, LIpE, LIpF, LIpCII, LIpCIII, LIpOVI, LIpMI, LIpMII, LIpQ, LIpZIII, LIpRIV, s. Fig. 8) höchste Homologien zu Genprodukten der Biosynthesen von Pradimicin, Rubromycin bzw. Griseorhodin aufweisen (Pradimicin-Typ-Antibiotika). Diese drei Substanzen stellen ebenfalls durch eine Typll-PKS synthetisierte, polyzyklische Polyketide dar. Auch wenn sich die Spiroketal-Antibiotika Rubromycin und Griseorhodin strukturell von Lysolipin unterscheiden, so zeigt doch das postulierte hexazyklische Biosynthese-Intermediat Pradimicin auffallende strukturelle Ähnlichkeiten zu Lyolipin (Li und Piel, 2002, Chem. & Biol. 9, 1017-1026). Dies könnte erklären, warum gerade die Backbone synthetisierenden Enzyme (u.a. die Lysolipin Minimal-PKS LIpD-E, s.u.) hohe Homologien zueinander aufweisen. Eine weitere Auffälligkeit besteht darin, dass aufgrund der Annotation 16 Llp-Genprodukte höchste Ähnlichkeit zu Enzymen aufweisen, die an Redoxprozessen beteiligt sind. Diese Tatsache erklärt den hoch oxidierten Charakter von Lysolipin. Derzeit ist kein anderes Cluster bekannt, das mehr Enzyme dieser Klasse aufweist.
Im Folgenden wird die aufgrund des Proteinsequenzvergleichs gefundene Funktion der einzelnen Lysolipin-Biosynthesegene bzw. Genprodukte entsprechend des postulierten Biosyntheseschemas beschrieben. Die Biosynthese des Lysolipin-Rückgrats ist in Fig. 10 dargestellt. Eine Besonderheit des Lysolipins ist die Verwendung einer Malonat-Einheit als Startereinheit der in umgekehrter Orientierung eingebaut wird (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064-2069). Die Interpretation der Einbaustudien legen weiterhin nahe, dass der Malonyl-CoA Starter in Malonamid-CoA überfuhrt werden muss, was die notwendige Einfuhrung der N-Gruppe in den Heterozyklus A des Lysohpins zur Folge hat Innerhalb des Clusters ist mit HpA ein Gen zu finden, dessen Genprodukt höchste Ähnlichkeit zu Asparaginsynthasen/Glutaminamido- transferasen aufweist Diese Enzyme übertragen Aminogruppen von Glutamin auf Aspartat, was die Synthese von Asparagin und Glutamat zur Folge hat In ähnlicher Weise konnte LIpA die Ammogruppe von Glutamin auf Malonyl-CoA übertragen, was die Bildung von Malonamid-CoA zur Folge hatte Diese These wird durch die Tatsache untermauert, dass LIpA eine Identität von 51% zu der Asparaginsynthase TcsG des Oxytetrazykhnclusters aufweist Auch bei der Tetrazykhn-Biosynthese wird mit Malonamoyl-CoA ein Stickstoff-modifizierter Starter postuliert (Hunter und Hill, 1997, in Biotechnology of Antibiotics (Strohl, W R , ed), 2nd Ed , pp 659-682, Marcel Decker, Ine , New York) Die Kondensation der putativen Malonamid-Einheit mit 11 weiteren Malonat- Einheiten wird durch die Mmimal-PKS katalysiert Diese wird durch die drei Gene HpD, HpE und HpF kodiert Die abgeleiteten Genprodukte zeigen höchste Ähnlichkeiten (52, 69 und 78%) zum ACP und zu den ß-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSß und KSa des Rubromycin-Biosynthesegenclusters Da die KSß-Untereιnheιt einen Emfluss auf die Kettenlange des Polyketids haben sollte, ist es nicht verwunderlich, dass mit 78% die höchste Homologie zur KSß- Untereinheit der Rubromycin-Biosynthese gefunden wird, da Rubromycin mit 12 erforderlichen Kondensationen zu den größten Polyketiden gehört (die Biosynthese von Lysohpin erfordert 11 Kondensationen) Die Biosynthese von Lysohpin erfordert mehrere praaromatische Deoxygenierungen, die eventuell schon wahrend der Bildung des Polyketids initiiert werden (Bockholt et al 1994, J Org Chem 59, 2064-2069) Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit HpZI, HpZIII und HpZIV drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu 3-oxoacyl-ACP Reduktasen aufweisen, die für die in Fig 10 dargestellten Reduktionen verantwortlich sein konnten Diese Reduktionen stellen die Voraussetzung für die Deoxygenierung bestimmter Ketogruppen dar Die Biosynthese eines aromatischen Backbones wird meist mit Hilfe von Cyclasen bzw. Aromatasen abgeschlossen, wobei mindestens 2 Cyclasen benötigt werden. Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit den Genen //pC/-/// drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu Cyclasen der Griseorhodin/Rubromycin-Biosynthese zeigen. Die höchste Identität von LIpCI-III gerade zu Cyclasen, die in der Synthese Pradimicin-artiger Antibiotika involviert sind, unterstreicht die Tatsache, dass diese Antibiotika ein zu Lysolipin ähnliches Intermediat bilden.
Folgend werden Tailoring-Reaktionen beschrieben.
Oxidoreduktionen sind in Fig. 11 dargestellt. Da 9 der 12 in Lysolipin X (Fig. 1) vorhandenen Sauerstoffatome aus molekularem Sauerstoff stammen, ist das Vorhandensein einer großen Anzahl von Sauerstoff-einführenden Oxidoreduktasen nicht verwunderlich. Die zu den Oxidoreduktasen gehörenden Oxygenasen katalysieren die Einführung von einem (Monooxygenase) oder zwei Sauerstoffatomen (Dioxygenasen) in das entsprechende Substrat. Diese können verschiedene chemische Reaktionen, wie Hydroxylierung, Epoxidierung und oxidative Umlagerungen, wie die Baeyer-Villiger Reaktion katalysieren. Sie unterscheiden sich in ihren Kofaktoren. In der PKS-Biosynthese sind Cytochrom P-450 Monooxygenasen (CYP450) und FAD-abhängige Mono- und Dioxygenasen verbreitet (Rix et al., 2002, Nat. Prod. Rep. 19 , 542-580).
Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind aufgrund der Sequenzannotation mit LIpOI, LIpOV und LIpOVIII drei FAD-abhängige Mono- oder Dioxygenasen vorhanden. Die abgeleiteten Genprodukte weisen eine Größe von 461 , 397 und 541 Aminosäuren (AS) auf. Aufgrund der Proteinsequenz und Homologie, lässt sich derzeit nicht vorhersagen, an welcher konkreten Oxygenierung die jeweilige FAD-abhängige Oxygenase beteiligt ist. Dennoch erscheint es wahrscheinlich, dass eines dieser Enzyme an der Bildung des Xanthons bzw. an der oxidativen Ringspaltung beteiligt ist, da eine solche Baeyer-Villiger Oxidation in der Mithramycin-Biosynthese durch die FAD abhängige Monooxygenase MtmOIV katalysiert wird (Rodriguez et al. 2003, J Bacteriol. 185(13):3962-5). Interessant ist allerdings die Tatsache, dass LIpOVIII höchste Ähnlichkeit (47% Identität) zur Tetracenomycin-Hydroxylase TcmG aufweist, die für eine 3-fach Hydroxylierung verantwortlich ist (Rafanan et al., 2000, Org Lett. 5; 2(20):3225-7). Darüber hinaus befinden sich im Cluster 3 Gene HpOIV, HpOVI und HpOVII, deren abgeleitete Genprodukte höchste Identität zu Cytochrom P450- abhängigen Monooxygenasen (CYP450) aufweisen. LIpOIV zeigt höchste Ähnlichkeit zu MycG (48% Identität), eine CYP450, die im Verlauf der
Mycinamycin-Biosynthese sowohl für eine Hydroxylierung als auch Epoxidierung verantwortlich ist (Inouye et al., 1994 Mol Gen Genet. 245(4):456-64). Wie bei einigen anderen CYP450, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind, befindet sich auch stromabwärts von HpOIV mit HpK ein Gen, das für ein Ferrodoxin kodiert. LIpOVI zeigt größte Ähnlichkeit zu einer CYP450 aus dem Pradimicin-Biosynthesegencluster. Die abgeleiteten Genprodukte LIpOII und LIpOIII zeigen ebenfalls höchste Ähnlichkeit zu Genen der Pradimicingruppe (RubT, GrhV, GrhU), für die keine Funktion beschrieben ist. Eine Motivsuche (Pfam-Analyse) ergibt jedoch für beide Enzyme ein eindeutiges „Antibiotic biosynthesis monooxygenase"-Motiv, so dass auch diese beiden
Enzyme an Oxygenierungsreaktionen beteiligt sein sollten. Weiterhin kodiert HpL für ein Genprodukt, das höchste Homologie zu dem als Hydroxylase annotierten Enzym SnoaW aufweist. Die genaue Funktion dieses Enzyms innerhalb der Lysolipin-Biosynthese bleibt ebenso wie die Funktion aller übrigen Lysolipin Oxygenasen zu klären.
Darüber hinaus sind im Cluster noch folgende weitere Gene lokalisiert, deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu Oxidoreduktasen zeigen: LIpU: Genprodukt weist „alcohol dehydrogenase" Motiv auf und zeigt höchste Ähnlichkeit zu Dehydrogenasen.
LIpZII: Genprodukt zeigt höchste Identität (42%) zu MmcJ, einer F420 abhängigen Tetrahydromethanopterin (H4MPT) -Reduktase der Mitomycin-Biosynthese. Dieses Enzym katalysiert eine Carbonyl- Reduktion und könnte eventuell an der Biosynthese des Lysolipinstarters beteiligt sein. LIpS: Genprodukt zeigt höchste Identität (37%) zu 3-Hydroxybutyrat-
Dehydrogenasen, die im Lipidstoffwechsel involviert sind.
Eine mögliche Funktion der beiden Dehydrogenasen, LIpU oder LIpS könnte in der Oxidation einer Lysolipin-Vorstufe bestehen, die zur Einführung der Methylengruppe notwendig ist (Fig. 12).
Das Gen HpH kodiert ein Genprodukt, das höchste Ähnlichkeiten zu NADH/FAD- abhängige Halogenasen (37-39%) zeigt. Somit wird LIpH für die Halogenierung an C1 verantwortlich sein.
Für die Biosynthese von Lysolipin sind 4 O-Methylierungen und eine N- Methylierung notwendig. Im Cluster können 6 Gene identifiziert werden (HpMI bis HpMVI), deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu O-Methyltransferasen unterschiedlicher Antibiotika-Biosynthesen, wie Tetracenomycin, Griseorhodin und Enterocin aufweisen. Auffallend ist, dass das Cluster für 6 O- Methyltransferasen kodiert, obwohl nur 5 benötigt werden.
Im Cluster befinden sich 4 Regulatorgene (llpRI-llpRIV). LIpRIV weist hohe Homologie (39%) zu dem Regulator RubS der Rubromycin-Biosynthese auf, der zu den sog. SARPs („Streptomyces antibiotic regulatory protein") gehört. SARP- Regulatoren stellen Biosynthese-spezifische Transkriptionsaktivatoren dar. Vor einigen Lysolipin-Genen können dementsprechend typische SARP-spezifische Erkennungssequenzen gefunden werden. LIpRI zeigt Homologie zu einem Transkriptionsregulator (vermutlich einem Repressor) und könnte den Beginn des Clusters markieren. LIpRII und LIpRIII zeigen höchste Ähnlichkeit zu Transkriptionsaktivatoren (s. Tabelle 1).
Das Cluster beherbergt mit //pΛ/ ein Gen, dessen abgeleitetes Genprodukt höchste Identität (30%) zu einem „multidrug transporter" aus Lactococcus lactis zeigt. Dieses Protein ist wahrscheinlich an der Resistenzvermittlung beteiligt. Darüber hinaus kodiert das Lysolipin-Biosynthesegencluster mit LIpB und LIpQ, 2 Genprodukte, die die höchste Identität (40-50%) zu den Membranproteinen RubQ und GrhM der Rubromycin- bzw. Griseorhodin-Synthese zeigen. Eine Funktion dieser Proteine ist bisher nicht beschrieben. Dennoch könnten beide Membranproteine ebenfalls zur Resistenzvermittlung beitragen. Überraschenderweise ist im Lysolipin-Gencluster mit HpG ein Gen lokalisiert, dessen abgeleitetes Genprodukt signifikante Identität (42%) zu
Glykosyltransferasen zeigt. Es gibt mit Kigamycin sehr wohl glykosylierte Lysolipin-ähnliche Xanthone (Kunimoto et al., 2003, 56, 1012-1017), allerdings sind glykosylierte Lysolipin-Derivate bisher nicht bekannt. Ob wie bei Makroliden eine evtl. intermediäre Glykosylierung ein Resistenzmechanismus darstellt, bleibt zu prüfen.
Im Cluster befinden sich mit HpT und HpV weiterhin 2 Gene, deren Genprodukte höchste Homologie zur einer als Polyketidsynthase CurD annotierten Sequenz bzw. zu WhiE aufweisen. Die Funktion innerhalb der Synthese ist aufgrund dieser Homologien jedoch nicht vorhersagbar. Weitere Gene/ORFs unbekannter Funktion sind HpX, HpY, HpP und //pJ
Für das Sequenzprotokoll ergibt sich die folgende Genliste (ID Nukleinsäure / ID
Protein): ORF1 47/1 ; HpX 48/2; HpY 49/3; HpP 50/4; MpRI 51/5; HpOI 52/6; HpJ 53/7; HpOII
54/8; HpOIII 55/9; HpZI 56/10; HpB 57/11 ; HpCI 58/12; NpD 59/13; HpE 60/14; HpF
61/15; HpCII 62/16; HpCIII 63/17; HpU 64/18; HpG 65/19; MpA 66/20; HpRII 67/21 ;
HpOIV 68/22; HpK 69/23; HpT 70/24; HpL 71/25; HpOV 72/26; HpN 73/27; llpRIII
74/28; MpOVI 75/29; MpMI 76/30; HpOVII 77/31 ; HpMIl 78/32; llpOVIII 79/33; HpMIII 80/34; HpQ 81/35; HpZII 82/36; MpMIV 83/37; MpS 84/38; MpV 85/39; HpZIII
86/40; HpH 87/41 ; HpRIV 88/42; HpZIV 89/43; HpMV 90/44; MpMVI 91/45; und
ORF46 92/46.
SEQ. -ID 93 ist die Gesamtnukleinsäuresequenz.

Claims

Patentansprüche:
1. Isoliertes Protein oder Peptid enthaltend, insbesondere bestehend aus, einer oder mehreren der Aminosäurensequenzen SEQ-ID 1 bis 46.
2. Protein oder Peptid nach Anspruch 1 , wobei das Protein oder Peptid für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Lysolipinderivates, insbesondere eines Lysolipinderivat-Antibiotikums, funktional ist.
3. Isolierte Nukleinsäure, insbesondere DNA, beispiels- weise genomische DNA, cDNA, oder RNA, insbesondere mRNA, codierend für ein Protein oder Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, vorzugsweise enthaltend oder bestehend aus einer oder mehreren der
Nukleinsäuresequenzen SEQ-ID 47 bis 92, oder gemäß SEQ-ID 93.
4. Isoliertes Transformationsvehikel, insbesondere Plasmid oder Cosmid, enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 3.
5. Isoliertes Transformationsvehikel nach Anspruch 4, enthaltend eine
Mehrzahl, insbesondere 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, bis zu 46, verschiedener Nukleinsäuren nach Anspruch 3.
6. Isoliertes Transformationsvehikel nach Anspruch 4 oder 5, zusätzlich enthaltend zumindest eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren unter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäuresequenz, insbesondere eines Promotors, steht bzw. stehen.
7. Zelle enthaltend eine fremde Nukleinsäure oder mehr- ere verschiedene fremde Nukleinsäuren nach Anspruch 3 und/oder ein fremdes Protein oder Peptid oder mehrere verschiedene fremde Proteine oder Peptide nach Anspruch 1 oder 2, welche optional mit einer fremden Nukleinsäure oder mehreren verschiedenen fremden Nukleinsäuren nach Anspruch 3 transformiert ist.
8. Zelle nach Anspruch 7, welche erhältlich ist durch Transformation mit einem Transformationsvehikel nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
9. Zelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei ein natürlicherweise enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Lysolipin oder eines Lysolipinderivates, insbesondere eines Lysolipinderivat-Antibiotikums, funktional ist, inhibiert oder mutiert, insbesondere ganz oder teilweise deletiert, ist, oder wobei mehrere natürlicherweise enthaltene solche
Gene inhibiert oder mutiert, insbesondere deletiert, sind.
10. Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9, ausgewählt aus der Gruppe der Actinomyceten oder Enterobakterien.
1 1. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Zelle mit einem Transformationsvehikel nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert wird.
12. Lysolipinderivat, insbesondere Lysolipinderivat-Antibiotikum, dadurch erhältlich, dass eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 kultiviert wird, und dass nach Kultivierung das Lysolipinderivat aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird.
13. Verfahren zur Herstellung eines Lysolipindehvates, insbesondere eines Lysolipinderivat-Antibiotikums, wobei eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 kultiviert wird, und wobei nach Kultivierung das Lysolipinderivat aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird.
14. Verwendung eines Lysolipinderivates nach Anspruch 12 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von bakteriellen und/oder viralen Infektionen, Mucosen, Tumorerkrankungen und/oder inflammatorischen Erkrankungen.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Lysolipinderivat oder mehrere verschiedene Lysolipinderivate nach Anspruch 12 in physiologisch wirksamer Dosis.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, zusätzlich enthalten galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, galenisch hergerichtet zur topischen, oralen oder parenteralen Gabe.
18. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei ein Lysolipinderivat oder mehrere Lysolipinderivate nach Anspruch 12 in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet, insbesondere zur oralen oder parenteralen Gabe, werden.
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