WO2007079715A2 - Neue lysolipin derivate - Google Patents

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WO2007079715A2
WO2007079715A2 PCT/DE2006/002324 DE2006002324W WO2007079715A2 WO 2007079715 A2 WO2007079715 A2 WO 2007079715A2 DE 2006002324 W DE2006002324 W DE 2006002324W WO 2007079715 A2 WO2007079715 A2 WO 2007079715A2
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lysolipin
och3
acid
acetyl
single bond
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Carsten Fischer
Andreas Hornung
Meike Holzenkämpfer
Stefan Pelzer
Horst Priefert
Ulf-Dietrich Renner
Silke Vierling
Sven-Eric Wohlert
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Merlion Pharmaceuticals Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to novel lysolipin derivatives, uses of such lysolipin derivatives, pharmaceutical compositions containing such lysolipin derivatives, processes for preparing such lysolipin derivatives and intermediates for the preparation of modified lysolipin derivatives.
  • lysolipin The bacterial strain Streptomyces tendae TÜ4042 (CB28) produces the polyketide antibiotic lysolipin (Figure 1), which belongs to the group of polycyclic xanthones.
  • lysolipin was first described as a metabolite of the Streptomyces violaceon TÜ96 strain (Drautz et al., 1975, Arch Microbiol. 106, 175-190).
  • Lysolipin I which is formed by rearrangement of lysolipin X, which is primarily excreted by the producer strain, is very effective against a broad spectrum of Gram-positive (MIC 0.001 ⁇ g / ml) and against some Gram-negative bacteria.
  • a strong tumorstatische effect against various tumor cell lines (IC 50 0.001 ug / ml) were detected (Pultar, 1988, Disseration University of Tübingen).
  • oxygen atoms (9 of the 12 oxygen atoms in lysolipin X are probably introduced from molecular oxygen by oxygenases), chlorination presumably by a halogenase, and introduction of methyl groups on the hydroxy groups (C6, C16, C24), the methylene group C28 and on the nitrogen presumably by methyltransferases.
  • lysolipin as a new anti-infective agent has been hitherto prevented by poor water solubility and above all by a strong cytotoxicity.
  • use as an antibiotic requires a significant reduction in cytotoxicity.
  • improved physicochemical and pharmacological properties, in particular also reduced toxicity are desirable over the substance known to date.
  • Changes of toxic as well as physicochemical properties of substances are usually achieved by substance derivatizations.
  • a total synthesis of new derivatives of this complex class of substances has not previously been described and thus, if at all, feasible only with extremely great effort.
  • the possibilities of chemical variation are limited to certain functions by the presence of "natural protecting groups".
  • the invention is therefore based on the technical problem of providing new lysolipin derivatives with which infections can be treated which are no longer or only with difficulty treatable due to resistances that occur. Furthermore, the invention is based on the technical problem of providing novel lysolipin derivatives which have improved pharmacological properties, in particular reduced cytotoxicity and simultaneously good antibacterial activity. Broad features of the invention and embodiments:
  • the invention teaches lysolipin derivatives according to formula I.
  • R 1 to R 11 may be the same or different and independent of one another:
  • R1 H, F, Cl, Br, or I
  • R2 H or C1-12 alkyl, alkenyl and alkynyl, linear or branched, saturated or unsaturated, C3-6 aryl or heteroaryl, in each case optionally substituted
  • R3 H , OH, oR 11, or O or directly bonded pentenoyl, allyl, or C1-20 acyl, optionally substituted
  • R4 H, OH, or OR11
  • R5 H, OH or OR11 1
  • R6 H, OH, or OR11
  • R7 H, C1-12 alkyl, alkenyl and alkynyl, linear or branched, saturated or unsaturated, C3-6 aryl or heteroaryl, allyl, or C1-20 acyl, in each case optionally substituted
  • R8 H, OH, OR11 , C1-12 alkyl, alkenyl and alkynyl, linear or branched, saturated or unsaturated, C3-6
  • R10 H, C1-12 alkyl, alkenyl and alkynyl, linear or branched, saturated or unsaturated, C3-6 aryl or heteroaryl, or AlIIyI, each optionally substituted
  • R11 C1-12 alkyl, alkenyl and alkynyl, linear or branched , saturated or unsaturated, C 3-6 aryl or heteroaryl, each optionally substituted
  • R 4 and R 5 may alternatively be together forming a ring -O-CH 2 -O-, where X 1 and X 2 may be linked together by a single bond or a double bond where X3 can be a C atom, an N atom, or, in the absence of R10, an O atom, where X4 can be -O- or -CO-, with all free valencies bonded to H, but H may be replaced by C12 by OH, where one OH group or several OH groups can be independently esterified with a C1-16 saturated or unsatur
  • R1 H, Cl, or Br
  • R2 H or CH3,
  • R3 OH, OCH3, pentenoyl, AIIyI, or acetyl
  • R4 H, OH, or OCH3,
  • R5 H, or OH
  • R6 H , OH, or OCH3,
  • R7 H, CH3, AIIyI, or acetyl
  • R8 H, OH, propyl, or O-CO-O-CH3,
  • R9 OCH3, CH3, H, or OH
  • R10 H, CH3 , or AIIyI, where R4 and R5 may alternatively together form a ring -O-CH2-O-, where X1 and X2 may be joined together by a single bond or a double bond, where X3 is a C atom, an N atom, or, in the absence of R10 may be an O atom, where X4 may be -O- or -CO-, all free valencies being bonded to H
  • R1 is H, Cl, or Br
  • R2 is H or CH3
  • R3 is OH, OCH3, pentenoyl, or AlIIyI
  • R4 is H, or OCH3
  • R5 is H, or OH
  • R6 is H, OH, or OCH3
  • R 7 H, CH 3, or AIIyI
  • R 8 H, OH, propyl, or O-CO-O-CH 3
  • R 9 OCH 3, or CH 3
  • R 10 H, CH 3, or AIIyI, where R 4 and R 5 are alternatively taken together Ring may be -O-CH 2 -O-, where X 1 and X 2 may be joined together by a single bond or a double bond, where X 3 is a C atom, an N atom, or, in the absence of R 10, an O atom where X4 can be -O- or -CO-, with all free valencies being bonded to H, where one OH group or several OH groups independently of one another with
  • lysolipin derivatives according to one of the following formulas, optionally esterified at one or more OH functionalities or etherified, or isomers, diastereomers, enantiomers or salts of such compounds:
  • a lysolipin derivative according to the invention it is initially of considerable advantage that it can be used as a replacement therapy in the case of resistance to a known Active substance is used.
  • therapy is possible in such a case only in the first place.
  • a number of the new lysolipin derivative also have improved efficacy over known drugs.
  • at least some of the new lysolipin derivatives may further have reduced side effects and have altered physicochemical and / or pharmacological properties.
  • C1-C12 alkyl, alkenyl and alkynyl are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, vinyl, propen-1-yl, propen-2-yl, but-1-en-1-yl, but-1-en-2-yl, but-2-ene 1-yl, but-2-en-2-yl, 2-methylprop-2-en-1-yl, 2-methylprop-1-en-1-yl, but-1-ene-3 yl, but-3-en-1-yl, allyl, acetylenyl, propyn-1-yl, propargyl, but-1-yn-1-yl, but-1-yn-4-yl, but-2-yne 1-yl, but-1-yn-3-yl, 3-methylbut-1-
  • Acids suitable for the esterification of OH groups are, for example: acetic acid, propionic acid, butyric acid, pentanoic acid, saturated and unsaturated fatty acids, hydroxy acids (eg lactic acid), ⁇ -, ⁇ - and ⁇ -ketocarboxylic acids (eg pyruvic acid), amino acids.
  • esterification it is meant that in the derivative an ester structure is established, which is derived from said acid. It is not necessary to perform an esterification reaction, the functionality can also be set up in other ways.
  • Alcohols suitable for the etherification of OH groups are, for example: methanol, ethanol, 1,2-ethanediol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, tert-butanol, glycerol, 1,2-propanediol, 1,3-propadiol, 1 , 2-butanediol, 1, 3-butanediol, 1, 4-butanediol, n-pentanol, iso-pentanol, methoxyethanol, polyalcohols (eg sugar).
  • etherification means that an ether structure derived from said alcohol is established in the derivative. It is not necessary to perform an etherification reaction, the functionality can also be set up in other ways.
  • heteroaryls examples include: thiophene, furanyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyridinyl, pyrimidinyl, triazinyl, quinolinyl, isoquinolinyl, indolyl, pyrrolyl, pyrazolyl, pyrazinyl.
  • Isomers are to be understood as meaning chemical compounds of the same empirical formula but of different chemical structure.
  • Constitutional isomers have the same molecular formula, but differ in how their atoms or atomic groups are linked. These include functional isomers, positional isomers, tautomers or valence isomers.
  • Stereoisomers basically have the same structure (constitution) - and therefore also the same molecular formula - but differ by the spatial arrangement of the atoms.
  • configuration isomers and conformational isomers are stereoisomers that can only be converted into each other by bond breaking.
  • Enantiomers are stereoisomers that behave in the same way as image and mirror image and have no plane of symmetry. All stereoisomers that are not enantiomers are called diastereomers.
  • a special case are E / Z (ice / trans) Isomers of double bonds. Conformational isomers are stereoisomers that can be converted into each other by the rotation of single bonds. For the differentiation of the isomeric species from each other, see also the IUPAC rules Section E (Pure Appl. Chem. 1976, 45, 11-30.).
  • the compounds of general formula I according to the invention also include the possible tautomeric forms and include the E or Z isomers or, if a chiral center is present, also the racemates and enantiomers. These are also to be understood as meaning double bond isomers.
  • the invention also relates to the use of a lysolipin derivative according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition, in particular for the treatment and / or prophylaxis of a bacterial or viral infection or a fungal disease.
  • a pharmaceutical composition may be prepared by mixing a physiologically effective dose of the lysolipin derivative of the present invention with at least one galenic Hilsstoff and prepared into a dosage form, preferably an oral or parenteral (e.g., i.v., i.m., or subcutaneous injection) dosage form.
  • Suitable counterions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
  • Suitable solid or liquid galenic preparations are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, ointments, drops or solutions for injection (iV, Lp., Im, sc) or Nebulization (aerosols), transdermal systems or other topical application, as well as preparations with protracted release of active ingredient, during their preparation conventional adjuvants such as carriers, blasting, binding, coating, swelling, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers , Find use.
  • magnesium carbonate titanium dioxide, Lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents such as sterile water and monohydric or polyhydric alcohols, for example, glycerol, called.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be prepared by mixing at least one active ingredient used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier and optionally further suitable active ingredients, additives or excipients with a defined dose and preparing it to the desired dosage form ,
  • a pharmaceutical composition according to the invention is galenically prepared for oral, parenteral or topical administration.
  • Dosages for a 75 kg adult are 0.01 to 25 mg / kg / day, 0.01 to 10 mg / kg / day, 0.01 to 5.0 mg / kg / day, especially 0.01 to 1, 0 mg / kg / day, (orally), or 0.001 to 25 mg / kg / day, 0.001 to 10 mg / kg / day, 0.001 to 2.5 mg / kg / day, especially 0.005 to 1.0 mg / kg / Day, (parenteral) in question.
  • the active ingredient concentration may be 0.001 to 10% by weight, 0.001 to 1.0% by weight, in particular 0.01 to 0.1% by weight, of the finished ointment.
  • the invention also relates to a method for the treatment or prophylaxis of a bacterial or viral infection or a fungal disease, wherein a pharmaceutical composition containing a physiologically effective dose of a lysolipin derivative of the invention is administered to a person who is ill or threatens to become ill with the infection or disease , preferably in one of the above Dosage forms and one of the mentioned doses.
  • lysolipin derivatives of the invention are totally synthetic, if at all, very difficult to prepare. You can, however, for more targeted Molecular genetic manipulation of the lysolipin biosynthetic gene cluster are expressed in the biosynthetic exporting mutants.
  • a desired derivatization of a drug naturally synthesized by the cell can be achieved by substituting, in place of or in addition to a natural corresponding gene for a defined partial synthesis step, a foreign gene other than the defined part synthesis step for the defined partial synthesis step is introduced. This can be done by constructing and introducing the entire foreign or mutant drug biosynthetic gene cluster or parts thereof. It is as it were a mutated biosynthesis tailored according to the desired derivatization. At the same time, it is possible to naturally or partially delete a gene which is naturally present in the cell and codes for a protein or peptide which is functional for a partial synthesis step of the biosynthesis of the active substance or an active substance derivative. This can also be done for several such genes naturally contained in the cell.
  • Suitable cells are preferably selected from the group of actinomycetes, e.g. the streptomycetes, or enterobacteria, e.g. E. coli. It is understood that a cell according to the invention generates a mutant or mutant produced by a transformation vehicle according to the invention.
  • the invention also teaches a process for the preparation of a lysolipin derivative according to the invention with the following process steps: a) a desired modification to lysolipin I or lysolipin X is defined, b) one gene or several of the genes according to SEQ ID to 92 selected on the basis of their functionality assignment with the proviso that the gene, its mutation and / or its inhibition, in particular partial or total deletion, is functional for the synthesis of the modification, c) a cell is generated by transformation, which is the gene or the gene according to step b), optionally mutated and / or inhibited, contains, wherein the gene or genes are arranged in a functional context of the lysolipin biosynthetic cluster of the cell, d) the cell is cultured, e) the lysolipin derivative is from the Isolated cell or the culture supernatant, f) optionally, a chemically synthesized derivatization of the product from step e).
  • Lysolipin derivatives according to the invention do not necessarily have per se the desired pharmacological properties or may not yet be optimized with regard to the pharmacological properties. In order to obtain the desired pharmacological properties, it may be sufficient to carry out a chemically synthetic modification of the derivative. Therefore, the invention also relates to the use of a lysolipin derivative of the invention as an intermediate for the chemical synthesis of modified lysolipin derivatives.
  • the invention also teaches the use of one or more of the proteins of SEQ ID NOS 1 to 46 for the enzymatic catalytic derivatization of lysolipin, wherein the protein comprises a lysolipin precursor or a lysolipin derivative and all the derivatives enzymatically catalyzed by the protein necessary metabolite is contacted and wherein the resulting lysolipin derivative is isolated.
  • suitable proteins or genes are also described in the dissertation P. Lopez, 2005.
  • lysolipin was synthesized from 12 malonyl-CoA units following a typical type II polyketide synthesis scheme.
  • the biosynthesis of the backbone of aromatic polyketides is carried out iteratively by means of the so-called minimal PKSII, which consists of 3 separate enzymes: 2 ⁇ -ketoacyl synthase subunits KSa and KS ⁇ and the "acyl carrier protein" (ACP), comparing the three minimal PKS coding Genes of different PKSII biosyntheses among each other, it is striking that these are highly conserved and usually have the characteristic organization KS ⁇ -KS /? - ACP KSa or KS /?
  • lysolipin is a halogenated natural product bearing a C1 substituent on C1
  • a gene for an NADH / FAD-dependent halogenase van Pee, 2001, Arch. Microbiol. 175, 250-258 should also be present within the lysolipin biosynthetic gene cluster.
  • primers can be used for the identification of halogenase genes and associated biosynthetic gene clusters (Piraee and Vining, 2002, J. Ind., Microbiol., Biotechnol., 29, 1-5).
  • the identification of the lysolipin biosynthetic gene cluster was done using PKSII and halogenase-specific gene probes against spotted clones of a cosmid gene bank of strain CB28.
  • a gene bank of CB28 was prepared as follows: Homogenized bacterial cultures were embedded in 0.5% low melting point agarose (SeaPIaque GTG, Biozyme) and then incubated with 2 mg / ml HEW lysozyme (Roth) for 14 h at room temperature and with 1 mg / ml proteinase K (Merck) for 24 h at 50 0 C incubated. The embedded DNA was partially cleaved with Sau3A ⁇ , extracted with gelase (Epicentre) and dephosphorylated according to methods described. Genomic DNA was probed with 750 ng ⁇ amHI digested cosmid vector pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes
  • the PCR mixture had the following composition: 1.0 ⁇ l of CB28 genomic DNA (about 0.2 ⁇ g), 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 2.5 ⁇ l of PCR-DIG probe Synthesis Mix (Roche), 5.0 ⁇ l Q-Solution, 0.5 ⁇ l PKSII-FOR primer (50 pmol), 0.5 ⁇ l PKSII-REV primer (50 pmol), 0.5 ⁇ l Qiagen Taq polymerase ( 2.5 u), 14.5 ⁇ l H 2 O.
  • PCR was performed in a MJ Research PCR apparatus (PTC-225) under the following conditions: 1 ⁇ (2 min, 95 ° C.), 30 ⁇ (95 0 C, 1 min, 72 ° C, 2 min, 72 ° C, 1.30 min), 1 x (72 ° C, 5 min).
  • Use of the thus amplified homologous PKSII probe in a hybridization against the CB28 cosmid library yielded 13 hybridizing cosmid clones.
  • another probe directed against halogenase genes was used.
  • the following conserved primers were also used with the help of the genomic DNA of CB28:
  • the PCR was carried out with the aid of the PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) and had the following composition: 1.10 ⁇ l of CB28 genomic DNA (about 0.2 ⁇ g), 5 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 5 ⁇ l of PCR DIG labeling mix, 1 ⁇ l Halo For and Halo Rev primer (50 pmol), 0.75 ⁇ l enzyme mix, 36.25 ⁇ l H 2 O.
  • the PCR was carried out in a PCR instrument from MJ Research (PTC-100). performed under the following conditions: 1 x (2 min, 94 ° C), 25 x (94 ° C, 1 min; 61 0 C, 1 min; 72 ° C, 1 min), 1 x (72 ° C, 10 min ).
  • the co-hybridizing cosmid 28-4H04 was transferred to S. albus J 1074 which, inter alia, was successfully used as a heterologous host for the production of rebeccamycin (Sanchez et al., 2002, Chem Biol. 9 (4): 519-31).
  • the cosmid vector 28-4H04 also has an integrating function of the actinomycete phage PhiC31. This was the precondition for the fact that the cosmid of E. coli could be intergenerically conjugated to S.
  • the cultivation took place with the following cultures.
  • Preculture 50 ml of R5 medium containing 25 ug / ml apramycin [Composition R5 (s. Kieser et al., 2000) pH 7.2] were inoculated with the transconjugant CB3818 and for 48 h at 28 0 C and 160 rpm incubated;
  • Main culture 100 ml of R5 medium containing 25 ⁇ g / ml apramycin [composition R5 see above] were inoculated with 1 ml of the preculture and incubated for 120 h incubated at 28 0 C and 160 rpm.
  • the control culture (S. albus) was cultured without the addition of apramycin.
  • each 1 ml of the main culture was extracted after addition of 50 .mu.l of 1 N HCl with 1 ml of ethyl acetate and the organic phase was concentrated to dryness, ii) the residue was taken up in 100 .mu.l of methanol and the production of Lysolipin analyzed by LC (DAD) -MS.
  • the injection volume was 20 ⁇ l.
  • the N 2 - Desolvationsgasfluß was 600 l / h at 25O 0 C.
  • HpA is a gene whose gene product has the highest similarity to asparagine synthases / glutamine amidotransferases. These enzymes transfer amino groups from glutamine to aspartate, resulting in the synthesis of asparagine and glutamate. Similarly, LIPA could transfer the amino group of glutamine to malonyl-CoA, resulting in the formation of malonamide-CoA.
  • HpZI HpZI
  • IIpZIII HpZIV whose gene products have the highest identity to 3-oxoacyl-ACP reductases.
  • These enzymes could be responsible for the reductions described in Bockholt et al., 1994, which are the prerequisite for the deoxygenation of the corresponding keto groups.
  • the biosynthesis of an aromatic backbone is usually completed by means of cyclases or aromatases, whereby at least 2 cyclases are needed.
  • cyclases or aromatases whereby at least 2 cyclases are needed.
  • lysolipin biosynthetic gene cluster three genes are present with the genes HpCI-III, whose gene products show highest identity to cyclases of griseorhodin / rubromycin biosynthesis.
  • LIpOVIII has the highest similarity (47% identity) to the tetracenomycin hydroxylase TcmG responsible for 3-fold hydroxylation (Rafanan et al., 2000, Org Leu. 5; 2 (20): 3225) -7).
  • cluster 3 contains genes UpOIV, HpOVI and HpOVII, whose derived gene products have the highest identity to cytochrome P450-dependent monooxygenases (CYP450).
  • LIpOIV shows highest similarity to MycG (48% identity), a CYP450 responsible for both hydroxylation and epoxidation in the course of mycinamycin biosynthesis (Inouye et al., 1994 Mol Gen Gen. 245 (4): 456-64 ).
  • HpKeIn gene downstream of HpOIV is also HpKeIn gene, which encodes a ferrodoxin.
  • LIpOVI is most similar to a CYP450 from the pradimicin biosynthetic gene cluster.
  • the derived gene products LIpOII and LIpOIII also show the highest similarity to genes of the pradimicin group (RubT, GrhV, GrhU), for which no function is described.
  • a motif search (Pfam analysis) reveals a clear "antibiotic biosynthesis monooxygenase" motif for both enzymes, so that these two enzymes should also be involved in oxygenation reactions
  • HpL encodes a gene product with the highest homology to the hydroxylase annotated enzyme The exact function of this enzyme within the lysolipin biosynthesis remains to be clarified as well as the function of all other lysolipin oxygenases.
  • LIPU gene product has "alcohol dehydrogenase” motif and shows highest similarity to dehydrogenases
  • LIPZII gene product shows highest identity (42%) to MmcJ, one F420-dependent tetrahydromethanopterin (H4MPT) reductase Mitomycin biosynthesis. This enzyme catalyses a carbonyl
  • a possible function of the two dehydrogenases, LIPU or LIPS, could be the oxidation of a lysolipin precursor, which might be necessary for the introduction of the methylene group.
  • the gene HpH encodes a gene product that shows the highest similarity to NADH / FAD-dependent halogenases (37-39%). Thus, LIpH will be responsible for the halogenation at C1.
  • lysolipin requires 4 O-methylations and N-methylation.
  • 6 genes can be identified (HpMI to HpMVI) whose gene products have the highest similarity to O-methyltransferases of different antibiotic biosyntheses, such as tetracenomycin, griseorhodin and enterocin.
  • the cluster codes for 6 O-methyltransferases, although only 5 are needed.
  • the cluster contains 4 regulatory genes (HpRI-llpRIV).
  • LIPRIV has high homology (39%) to the RubS regulator of rubromycin biosynthesis, known as SARPs ("Streptomyces antibiotic regulatory protein"), a biosynthesis-specific transcriptional activator of some of the lysolipin genes LIpRI shows homology to a transcriptional regulator (presumably a repressor) and could mark the beginning of the cluster LIpRII and LIpRIII show the highest similarity to transcriptional activators (see Table 1).
  • Lysolipin-like xanthones (Kunimoto et al., 2003, 56, 1012-1017), however, glycosylated lysolipin derivatives are not yet known. Whether, as in the case of macrolides, a possible intermediate glycosylation is a resistance mechanism remains to be tested.
  • Lysolipin at position 1 carries a Cl residue introduced by the NADH / FAD-dependent halogenase LIpH.
  • Some halogenases have astonishing flexibility with respect to the halide ion, as described by an exchange of chloride ions for bromide ions in the fermentation batch, as exemplified by the glycopeptide antibiotics (Bister, B. et al., 2003 Chem. BioChem. 4 (7): 658-662 ), the biosynthesis of brominated derivatives might be possible.
  • structurally related xanthones, such as actinoplanone the presence of the Cl residue increases the cytotoxicity of the substance, making modifications to the halogenation status of lysolipin useful.
  • the lysolipin heterologously producing S. albus strain CB3818 was fermented with the addition of NaBr (production as described under 2., to the preculture medium and main culture medium was added 5 g NaBr instead of NaCl). After extraction by LC-DAD-MS (see 2.), the dechlorinated lysolipin derivative CBS44 and the brominated lysolipin derivative CBS49 were detected in the supernatant (description of the isolation and structure elucidation see 3).
  • Modification reactions characterized. These reactions are catalyzed by tailoring enzymes such as oxygen-introducing oxidoreductases, methyltransferases, and a halogenase. By inactivating tailoring enzymes, mutants can be generated that accumulate specific precursors or intermediates. These derivatives may per se have interesting, new pharmacological and physicochemical properties or be used as starting material for further chemical derivatizations.
  • the targeted inactivation of selected biosynthesis genes can be achieved in principle by different methods. Since in the case of lysolipin a heterologous expression of the entire cluster by cosmid 28-4H04 is possible, it is possible to inactivate certain genes in E. coli and then to transfer the modified S.
  • the kanamycin resistance gene can not be used as an inactivation marker because the apramycin resistance gene aac (3) IV simultaneously confers resistance to apramycin and kanamycin, while the kanamycin resistance gene as a vector marker does not show cross-resistance to apramycin.
  • the replacement of the apramycin resistance gene aac (3) IV with the kanamycin resistance gene aphl1 can be carried out with the aid of an "overlapping PCR" -based strategy, since there are no suitable restriction enzyme cleavage sites in the hybrid cosmid 28-4H04.
  • 4H04 is an approximately 3450 bp region located upstream and a 4520 bp region downstream of aac (3) IV, with primers aac-upA and aac-upB, and aac-downA and aac-downB in separate PCR Reactions amplified:
  • Primers for amplification of the DNA region located upstream of aac (3) 1 V are: aac-upA ⁇ '-AAATCTAGAGATCCTCTACGCCGGACGCATC-S 'aac-upB: 5'-GAGYGCTTGCGGCAGCGtGATGCAGGTCGACGGATCTTTTCCGCTGC-S' primer for amplification of the downstream of aac (FIG.
  • IV located DNA region are: aac-downA: 5'-GCGGGACTCTGGGGTTGCACGAGCGGATCGGGGATTGTCTTTCTTCAG- 3 'aac-downB: ⁇ '-AAAACTAGTGGTACCAACCCAGGCAGGTAGC-S'
  • the primer aac-upA has a Xibal interface and primer aac-downB
  • Primer aac-upB has a 20 bp overhanging 5 'end that is homologous to the upstream DNA regions of the aphl1 gene.
  • Primer aac-downA thus has a 20 bp overhanging 5 'end homologous to the downstream DNA regions of the aphl1 gene.
  • the template used is isolated DNA of hybrid cosmid 28-4H04.
  • the ProofStart DNA polymerase kit Qiagen GmbH, Hilden, Germany
  • the following PCR program should be used for the amplification of the ca. 3450 or 4520 bp PCR fragments: Program: Step 1: 5 min 95 ° C, Step 2: 1 min 94 ° C
  • Step 3 1 min 50 - 70 0 C * Step 4: 10 min 72 0 C Step 5: 5 min 72 ° C
  • Steps 2 to 4 were repeated 35 times *
  • the annealing temperature in step 3 is device-specific and by means of a gradient cycler, e.g. MJ Research PT-200.
  • apM gene is amplified as a 1165 bp DNA fragment with the primers ap / // / - up and ap / // / - down: apM-up: ⁇ '-TCACGCTGCCGCAAGCACTC-S 'aphll-down: ⁇ '- GTGCAACCCC ⁇ GAGTCCCGC-S '
  • the template used is the streptomycete plasmid pGM9 (Muth et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 219, 341-348).
  • the PCR reaction is carried out as described above, but the time for step 4 is 1.5 minutes.
  • the three PCR products obtained are purified and used in a PCR reaction (conditions such as for the amplification of the aphlI gene), but in which no primer is added. Subsequently, the product obtained is used as template DNA in a PCR reaction (conditions as above, wherein the time for step 4 is 20 min), serving as primers aac-upA and aac-downB.
  • the approximately 9 kb fragment is first in a vector with blunt end interface, such as pBluescript Il KS (-) after EcoRV cleavage, cloned between. All clonings and DNA modifications are performed as described in Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY). Finally, the pBluescript cloned PCR product (approximately 9 kb) is digested with Xba ⁇ and Spei and ligated with Xba ⁇ -Spe ⁇ digested 28-4H04 DNA. E.
  • Kanamycin-resistant and apramycin-sensitive clones contain the hybrid cosmid 28-4H04-ap ⁇ //.
  • Apramycin insertion mutants can be generated via homologous recombination by plasmid constructs which, instead of the gene to be inactivated, have the apramycin resistance gene cassette aac (3) IV and have flanking homologous gene regions.
  • the plasmid constructs to be used for insertion mutagenesis can also be used for the preparation of hybrid plasmids which are suitable for in-frame deletion mutagenesis.
  • the inserted apramycin resistance gene cassette is provided by PCR with singular, compatible Spei and Nhe ⁇ interfaces. The interfaces can be designed so that after ingestion and digestion digestion and religation an in frame deletion in the gene to be inactivated arises.
  • the corresponding hybrid plasmids are suitable for the generation of in-frame deletion mutants.
  • the unique spel site present in 28 ⁇ 4H04-aphll, which is adjacent to the cosmid insert, must be eliminated beforehand. This is possible by integration of an ampicillin-resistance gene cassette (bla) into this Spel-interface and selectable due to the additional resistance in E. coli.
  • the bla-gene is amplified with the following primers to give a 939 bp DNA fragment, which after Purification with XbaI-digested pK18 (Schäfer et al., 1994, Gene, 145, 69-73) is ligated: Bla_xba_For: ⁇ '-CCGCTCTCTAGACAATAACCCTGATAAATG -S 'Bla_xba_Rev
  • Step 5 5 min 72 ° C
  • Steps 2 to 4 were repeated 29 times.
  • the annealing temperature in step 3 is device-specific and by means of a gradient cycler, e.g. MJ Research PT-200.
  • the PCR product is isolated using the GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, UK).
  • the isolated DNA fragment is digested with Xba ⁇ and then ligated with Xba ⁇ - linearized pK18 DNA.
  • the ligation mixture is used to transform E. coli XL1-blue and to select transformants on carbenicilin-containing (50 ⁇ g / ml) LB medium.
  • carbenicilin-containing (50 ⁇ g / ml) LB medium From the resulting hybrid plasmid pK18-ö / a, the bla resistance gene cassette is preparatively isolated after digestion with Xba ⁇ , and ligated with Spei digested 28-4H04-ap / - / - DNA. Subsequently, E. coli XL1-blue is transformed with the ligation mixture and selection is carried out on LB plates with carbenicillin (50 ⁇ g / ml) and kanamycin (50 ⁇ g / ml).
  • the cosmids are isolated from the resulting transformants and the integration of the bla gene into the Spel interface by cleavage with Spei and Xba ⁇ confirmed.
  • the corresponding hybrid cosmid is given the designation 28-4H04-ap ⁇ // -b / a.
  • the modified 28-4H04-ap /? // - b / a cosmid can be brought to S. albus and the lysolipin production checked as described above.
  • the S. albus recombinant carrying the modified cosmid 28-4H04-ap ⁇ // - /) / a is given the designation CB3919.
  • the apramycin resistance gene is amplified with primers that allow a subsequent cloning as Spel ⁇ / ⁇ el fragment.
  • two further PCR fragments (in each case about 2000 bp) are generated, which are amplified from DNA regions upstream and downstream of the gene to be inactivated by PCR and also with a spei or Near ⁇ interface are provided. All 3 PCR fragments are inserted into the non-replicative streptomycete inactivation vector pDH5 (Hillemann et al., 1991 Nucleic Acids Res. 19 (4): 727-31).
  • the corresponding inactivation plasmids carry an insert in which the upstream region of the target gene to be inactivated is fused via a Spel interface to the apramycin resistance gene cassette and this in turn is flanked by a ⁇ / ⁇ el interface from the downstream region of the target gene (see Fig. 9).
  • Corresponding hybrid plasmids are transferred by a PEG-induced protoplast transformation (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) into S. albus strain CB3919, which already contains the lysolipin biosynthetic gene cluster-carrying cosmid 28- 4H04-aphll-bla contains.
  • S. albus strain CB3919 which already contains the lysolipin biosynthetic gene cluster-carrying cosmid 28- 4H04-aphll-bla contains.
  • apramycin it is possible to select clones in which either the pDH5 hybrid plasmid is integrated into the chromomeome by homologous recombination via the upstream or downstream region (simple crossover) or already by a double crossover to a gene exchange of the target gene came against the apramycin cassette (see Fig.
  • plasmid integrations can be distinguished from apramycin insertion mutants (thiostrepton-sensitive).
  • plasmid integrations thiostrepton resistant
  • apramycin insertion mutants thiostrepton-sensitive.
  • the pDH5 hybrid plasmids used to generate the corresponding apramycin insertion mutants undergo double digestion with NheI and SpeI, followed by ligation via the compatible single stranded ends produced by both enzymes In this way, the apramycin resistance gene is eliminated (see Fig. 10)
  • Hybrid plasmids for generating deletion mutants are also induced by PEG-induced
  • clones By selection on thiostrepton-containing medium clones can be selected, in which there has been an integration of the pDH5 hybrid plasmid upstream or downstream region.
  • the integrated plasmid In order to generate an in-frame deletion mutant from the corresponding plasmid integration mutant, the integrated plasmid must have a second cross-linked mutant. from the chromosome such that the target gene to be inactivated is exchanged for the frame deleted gene copy (see Figure 10). In this homologous recombination-mediated disintegration, however, there is also the possibility that the integrated hybrid plasmid recombines via the fragment over which it originally integrated. Such an event would result in undesirable wild-type recovery.
  • apramycin insertion mutants and in-frame deletion mutants in the lysolipin biosynthesis genes HpH, HpMI, WpMWl, HpMVI, HpOI, HpOIV, HpOVI, HpOVIII and HpZHI is described in detail below:
  • the apramycin resistance gene must first be amplified as shown in FIG.
  • the aac (3) IV gene is used as
  • Primer aac (3) IV-up has a Spel interface and primer aac (3) I V-down has a ⁇ / ⁇ el site at the 5 'end (marked in bold).
  • the plasmid pHP45 ⁇ aac (Blondelet-Rouault et al., 1997, 190, 315-317) serves as template for the PCR reaction.
  • the ProofStart DNA polymerase kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) is used as described by the manufacturer.
  • Step 5 5 min 72 ° C Steps 2 to 4 were repeated 35 times
  • the annealing temperature in step 3 is device-specific and by means of a gradient cycler, e.g. MJ Research PT-200.
  • the PCR fragment is first amplified in a blunt-end vector, e.g. pBluescript II KS (-) after EcoRV cleavage, between cloned and can then be isolated in large concentration from this vector as SpeVNhel fragment.
  • a blunt-end vector e.g. pBluescript II KS (-) after EcoRV cleavage
  • Interface compatible with the multiple cloning site (MCS) of pDH5 and the "B" candidate for the "upstream” region of the target gene has a Spel interface.
  • the respective "A” primer for the "downstream” region of the target gene has a ⁇ // jel interface and the respective " B "-P ⁇ mer for the" DownstrearrV 'area has a compatible MCS pDH5 Hllndlll interface.
  • the respective "A” primer for the "UpstrearrT” region has an EcoRI site that is compatible with the MCS of pDH5, and the "B "-Primer for the" UpstreanrT "region of the target gene a / Vnel interface.
  • the respective "A" primer for the "DownstreanrT” region of the target gene has a Spel interface and the respective "B” primer for the "DownstrearrV” region has a H / NIII interface compatible with the MCS of pDH5 in these genes after ligation with the amplified aac (3) IV gene to an orientation of the apramycin resistance gene cassette opposite to the target gene).
  • Downstream region of the target genes can be used are listed in Fig. 11. DNA from the lysolipin biosynthetic gene cluster-carrying cosmid 28-4H04 serves as template in the PCR reactions.
  • the ProofStart DNA polymerase kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) is used as described by the manufacturer.
  • the following PCR program is used for amplification of the fragments of 1000-2000 bp PCR: Program: Step 1: 5 min 95 0 C, Step 2: 1 min 94 ° C
  • Step 3 1 min 50 - 70 0 C * Step 4: 2.5 min 72 ° C Step 5: 5 min 72 ° C Steps 2 to 4 were repeated 35 times *
  • the annealing temperature in step 3 is device-specific and with Help determine a gradient cycler, such as MJ Research PT-200. All PCR fragments are also cloned in a vector with a blunt end cleavage site, such as pBluescript II KS (-) after EcoRV cleavage, in order subsequently to cleave it in large concentration from this vector after cleavage with the respectively flanking restriction cleavage sites (see FIG 11) to isolate.
  • a blunt end cleavage site such as pBluescript II KS (-) after EcoRV cleavage
  • pDH5 The respective PCR fragments (downstream and upstream region of the target gene and the apramycin resistance gene) were subsequently cloned into the vector pDH5 (see Fig. 9).
  • a pDH5 derivative is thus produced which is suitable for the preparation of apramycin insertion mutants.
  • the apramycin-resistant cassette can be removed from all pDH5 hybridplamides and the respective hybrid plasmid religated.
  • a further pDH5 hybrid plasmid is generated, which can be used to generate in-frame deletion mutants.
  • apramycin insertion mutants and in frame deletion mutants of each target gene to be inactivated can be generated. All mutants are verified by PCR experiments.
  • _A symbolizes an apramycin insertion in the corresponding target gene
  • _D denotes an in frame deletion in the target gene
  • lysolipin gene inactivation approach (2.2) primarily generated substances characterized by the loss of certain decorative groups compared to lysolipin I.
  • chemical modifications have produced lysolipin derivatives which have new substituents on the groups accessible to the modification.
  • lysolipin I derivatives were introduced following the introduction of selective protecting groups as follows: Bis-TBS-Lysolipin (2)
  • 5 g / l NaBr was added to the preculture medium or 5 g / l NaBr instead of NaCl into the main culture medium.
  • the following antibiotics were added during selection: 25 ⁇ g / ml apramycin to CB3818 (S. albus plus lysolipingencluster cosmid 28-4H04) and all CB3919 apramycin insertion mutants and double mutant; 50 ⁇ g / ml kanamycin to the CB3919 deletion mutant.
  • Main culture medium E1 (see above), 28 0 C, 160rpm, 120 h-168h After incubation, the culture medium at 4000 rpm (15 ° C) by centrifugation. The clear supernatant was adjusted to pH 4 with 1N HCl. The precipitated flocculent precipitate containing the main amount of Lysolipinderivaten and was centrifuged off at 4500 rpm, 15 ° C, added with ethyl acetate and left in an ultrasonic bath for 15 min. It was then filtered through a Buchner funnel. This process was repeated until the ethyl acetate remained almost colorless. The clear filtrate was also shaken out with ethyl acetate until the organic phase remained almost colorless. The combined organic phases were concentrated to dryness. The purification of the crude extract of the lysolipin derivatives was carried out in the following 3 steps:
  • the MIC value was calculated using the
  • the incubation was for 20 h at 37 °.
  • the MIC values were determined by
  • the cytotoxicity of the new lysolipin derivatives was investigated in vitro by determining the IC50 values against defined cell lines in the so-called resazurin test (addition of a vitality dye).
  • the following cell lines were used:
  • cryoconserves of the test cells were thawed and the cells expanded under the optimal conditions for them.
  • Adherent cells were trypsinized for passenger. After reaching a sufficient cell number, the cells were sewn with 100 ul medium per well in 96 well plates. The vitality of the cells was> 95%. The cells were then incubated for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO2 in a humid atmosphere.
  • Solvent control was used medium with the highest concentration of DMSO assayed. Here a quadruple determination was made (100% value). As a positive control, cycloheximide was used at a concentration of 20 ⁇ g / ml (0% value). The cells were then incubated for 48 hours at 37 ° C and 5% CO2 in a humidified atmosphere.
  • Resazurin is reduced by the mitochondria of living cells. This produces the fluorescence-active form resofurin.
  • the amount of resofurin produced can be quantified via a fluorescence reader and is directly related to the number of living cells.
  • To the cells are added 100 ⁇ l of a 50 ⁇ M resazurin solution (Sigma-Aldrich). This solution was previously prepared, filtered sterile over 0.2 micron filter and aliquoted. The aliquots were stored at -20 0 C. The plates were then incubated for 4 hours at 37 ° C and 5% CO2 in a humidified atmosphere. The development of the fluorescent compound can be monitored optically by staining the test solution from blue to pink.
  • the plates were read in a fluorescence reader (Genios, Tecan). An excitation wavelength of 560 nm and an emission filter of 590 nm were chosen for this purpose. The data was determined using Microsoft Excel and a user application (XFIuor4, Tecan). • Evaluation
  • the raw data were normalized. Here, the positive control gave the value for the wells with the dead cells (0% value) and the negative / solvent control the 100% value.
  • the mean values obtained were used to calculate the IC50 value. The calculation was carried out with the help of the analysis program Graph Päd Prism 4.0.
  • CBS73 700 fold less cytotoxic with moderate loss of activity (15 fold lower: e.g., S. aureus MIC 0.5)] chemically modified:
  • Lysolipin derivatives CBS64 and CBS90 (diallyl and monoallyl derivative) show strong reduction of cytotoxicity (100x) in moderate
  • Example 16 CBS73.
  • UVA / is (maxima): 237 nm; 280 nm; 354 nm

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Lysolipin Derivate, Verwendungen solcher Lysolipin Derivate, pharmazeutische Zusammensetzungen mit solchen Lysolipin Derivaten, Verfahren zur Herstellung solcher Lysolipin Derivate und Zwischenprodukte der Herstellung solcher Lysolipin Derivate.

Description

Neue Lysolipin Derivate
Gebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft neue Lysolipin Derivate, Verwendungen solcher Lysolipin Derivate, pharmazeutische Zusammensetzungen mit solchen Lysolipin Derivaten, Verfahren zur Herstellung solcher Lysolipin Derivate und Zwischenprodukte der Herstellung modifizierter Lysolipin Derivate.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik:
Der Bakterienstamm Streptomyces tendae TÜ4042 (CB28) produziert das Polyketid-Antibiotikum Lysolipin (Fig. 1), das zur Gruppe der polyzyklischen Xanthone gehört. 1975 wurde Lysolipin, erstmals als ein Metabolit des Stammes Streptomyces violaceoniger TÜ96 beschrieben (Drautz et al., 1975, Arch Microbiol. 106, 175-190). Lysolipin I, das durch Umlagerung des primär vom Produzentenstamm ausgeschiedenen Lysolipin X entsteht, wirkt sehr effizient gegen ein breites Spektrum Gram-positiver (MIC 0,001 μg/ml), sowie gegen einige Gram-negative Bakterien. Desweiteren konnte eine starke tumorstatische Wirkung gegen verschiedene Tumorzelllinien (IC500,001 μg/ml) nachgewiesen werden (Pultar, 1988, Disseration Uni Tübingen).
Einbaustudien haben gezeigt, dass die Biosynthese des Lysolipin-Rückgrats aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs Il erfolgt (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064-2069). Nach der Biosynthese des Grundgerüstes müssen zahlreiche Modifikationen stattfinden, um das Endprodukt Lysolipin X bzw. I zu erzeugen. Dazu zählen eine Zyklisierung und Aromatisierung, Einführen von Sauerstoffatomen (9 der 12 Sauerstoffatome in Lysolipin X werden aus molekularem Sauerstoff vermutlich durch Oxygenasen eingeführt), Chlorierung vermutlich durch eine Halogenase, und Einführung von Methylgruppen an den Hydroxygruppen (C6, C16, C24), der Methylengruppe C28 und am Stickstoff vermutlich durch Methyltransferasen.
Der pharmazeutische Einsatz von Lysolipin als neues Antiinfektivum wurde bisher durch die schlechte Wasserlöslichkeit und vor allem durch eine starke Cytotoxizität verhindert. Der Einsatz als Antibiotikum erfordert allerdings eine signifikante Senkung der Cytotoxizität. Somit sind gegenüber der insofern bekannten Substanz verbesserte physikochemische und pharmakologische Eigenschaften, insbesondere auch verringerte Toxizität, wünschenswert. Veränderungen von toxischen aber auch physikochemischen Eigenschaften von Substanzen werden in der Regel durch Substanz-Derivatisierungen erreicht. Eine Totalsynthese von neuen Derivaten dieser komplexen Substanzklasse ist bisher nicht beschrieben und damit, wenn überhaupt, nur mit extrem großen Aufwand durchführbar. Die Möglichkeiten der chemischen Variation sind durch das Vorhandensein „natürlicher Schutzgruppen", auf bestimmte Funktionen beschränkt.
Im übrigen ist es auf Grund auftretender Resistenzen besonders wünschenswert, neue Lysolipin Derivate zur Verfügung zu stellen, die in solchen Resistenzfällen eine Therapie überhaupt erst möglich machen.
Technisches Problem der Erfindung:
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, neue Lysolipin- Derivate zur Verfügung zu stellen, mit welchen Infektionen behandelbar werden, die auf grund auftretender Resistenzen nicht mehr oder nur schwer therapierbar sind. Des Weiteren liegt der Erfindung das technische Problem zu Grunde, neue Lysolipin Derivate zur Verfügung zu stellen, welche verbesserte pharmakologische Eigenschaften, insbesondere verringerte Cytotoxizität bei gleichzeitig guter antibakterieller Aktivität, aufweisen. Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen:
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung Lysolipin Derivate gemäß Formel I
Figure imgf000004_0001
Formel I
wobei R1 bis R11 gleich oder verschieden und unabhängig voneinander sein können :
R1 = H, F, Cl, Br, oder I, R2 = H oder C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl,, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, R3 = H, OH, OR11 , oder über O oder direkt gebundenes Pentenoyl, AIIyI, oder C1-20 Acyl, ggf. substituiert, R4 = H, OH, oder OR11 , R5 = H, OH1 oder OR11 , R6 = H, OH, oder OR11 , R7 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, AIIyI, oder C1-20 Acyl, jeweils ggf. substituiert, R8 = H, OH, OR11 , C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder O-CO-O-R11 , jeweils ggf. substituiert, R9 = OR11 , C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, H, oder OH,
R10 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder AIIyI, jeweils ggf. substituiert, R11 = C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen Carbonsäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure, ggf. substituiert, verestert sein können, und wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einem C1 -16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen ein- oder mehrwertigem Alkohol, ggf. substituiert, verethert sein können, sowie Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze solcher Verbindungen,
wobei die folgenden Kombinationen ausgenommen sind: i) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H,
R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O; wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann ii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 =
OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-; R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iv) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, v) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vi) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, viii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = H, R9 = OCH3, R10 = CH3, Doppelbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, ix) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O, x) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xi) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = =0, R9 = =O, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O.
Vorzugsweise ist: R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, AIIyI, oder Acetyl, R4 = H, OH, oder OCH3, R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, AIIyI, oder Acetyl, R8 = H, OH, Propyl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, CH3, H, oder OH, R10 = H, CH3, oder AIIyI, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer a-, ß-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
Höchstvorzugsweise ist R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, oder AIIyI, R4 = H, oder OCH3, R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, oder AIIyI, R8 = H, OH, Propyl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, oder CH3, R10 = H, CH3, oder AIIyI, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer a-, ß-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
Weiterhin bevorzugt sind Lysolipin Derivate gemäß einer der folgenden Formeln, optional an einer oder mehreren OH Funktionalitäten verestert oder verethert, oder Isomere, Diastereomere, Enantiomere oder Salze solcher Verbindungen:
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Bei einem erfindungsgemäßen Lysolipin Derivat ist zunächst von erheblichem Vorteil, dass es als Ersatztherapie bei Resistenz gegen einen bekannten Wirkstoff Verwendung findet. Mittels des erfindungsgemäßen Wirkstoffes ist in einem solchen Fall überhaupt erst wieder eine Therapie möglich. Eine Reihe der neuen Lysolipin Derivat weisen aber auch zudem eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber bekannten Wirkstoffen auf. Hinzu kommt, dass zumindest einige der neuen Lysolipinderivate des Weiteren reduzierte Nebenwirkungen haben können, und veränderte physikochemischen und/oder pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
Als C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl kommen beispielsweise in Frage Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Vinyl, Propen-1-yl, Propen-2-yl, But-1-en-1-yl, But-1-en-2-yl, But-2-en-1-yl, But-2-en-2-yl, 2-Methyl-prop-2-en-1-yl, 2-Methyl-prop-1-en-1-yl, But-1-en-3-yl, But-3-en-1-yl, AIIyI, Acetylenyl, Propin-1-yl, Propargyl, But-1-in-1- yl, But-1 -in-4-yl, But-2-in-1-yl, But-1-in-3-yl, 3-Methyl-but-1-in-3-yl, Isoprenyl, Terpene, cyclische Terpene, monozyklische Alkylringe, wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, oder Cycloheptyl, mit Alkyl substituierte zyklische Alkylringe, mit Alkyl substituierte Heteroalicyclen (z.B. Morpholinoethyl, 2,2-Dimethyl-1 ,3-dioxolan-4-methanol, Pyrrolidin-N-alkyl), Acetale (z.B.:Zucker: Pyranosen, Furanosen, z.B. Glucosyl, Mannosyl, Ribosyl, Arabinosyl; Zucker mit geschützten OH-Gruppen) Disaccharide, Oligosaccharide, Glucuronsäuren.
Als C1-20 Acyl kommen beispielsweise in Frage Acetyl, Propanoyl, n-Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl, 2-Methyl-Butanoyl, 3-Methyl-Butanoyl, n- und iso- Formen der Alkansäuren C-nhfen+iCOOH (n=5 bis 19) (z.B. Fettsäuren), ungesättigte Fettsäuren, Aminosäuren, Dipeptide, Oligopeptide, Glykolsäure.
Zur Veresterung von OH-Gruppen geeignete Säuren sind beispielsweise: Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Hydroxysäuren (z.B. Milchsäure), a-, ß-, und ω- Ketocarbonsäuren (z.B. Brenztraubensäure), Aminosäuren. Hierbei ist mit dem Begriff der Veresterung gemeint, dass in dem Derivat eine Esterstruktur eingerichtet ist, die von besagter Säure abgeleitet ist. Es muss nicht notwendigerweise eine Veresterungsreaktion durchgeführt werden, die Funktionalität kann auch auf anderem Wege eingerichtet sein.
Zur Veretherung von OH-Gruppen geeignete Alkohole sind beispielsweise: Methanol, Ethanol, 1 ,2-Ethandiol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tert- Butanol, Glycerin, 1 ,2-Propandiol, 1 ,3-Propadiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, n-Pentanol, iso-Pentanol, Methoxyethanol, Polyalkohole (z.B. Zucker). Hierbei ist mit dem Begriff der Veretherung gemeint, dass in dem Derivat eine Etherstruktur eingerichtet ist, die von besagtem Alkohol abgeleitet ist. Es muss nicht notwendigerweise eine Veretherungsreaktion durchgeführt werden, die Funktionalität kann auch auf anderem Wege eingerichtet sein.
Als Heteroaryl kommen beispielsweise in Frage: Thiophen, Furanyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Triazinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Indolyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Pyrazinyl.
Unter Isomeren sind chemische Verbindungen der gleichen Summenformel aber unterschiedlicher chemischer Struktur zu verstehen. Man unterscheidet im Allgemeinen Konstitutionsisomere und Stereoisomere. Konstitutionsisomere besitzen die gleiche Summenformel, unterscheiden sich jedoch durch die Verknüpfungsweise ihrer Atome oder Atomgruppen. Hierzu zählen funktionelle Isomere, Stellungsisomere, Tautomere oder Valenzisomere. Stereoisomere haben grundsätzlich die gleiche Struktur (Konstitution) - und damit auch die gleiche Summenformel - unterscheiden sich aber durch die räumliche Anordnung der Atome. Man unterscheidet im allgemeinen Konfigurationsiso- mere und Konformationsisomere. Konfigurationsisomere sind Stereoisomere, die sich nur durch Bindungsbruch ineinander überführen lassen. Hierzu zählen Enantiomere, Diastereomere und E / Z (eis / trans) Isomere. Enantiomere sind Stereoisomere, die sich wie Bild und Spiegelbild zueinander verhalten und keine Symmetrieebene aufweisen. Alle Stereoisomere, die keine Enantiomere sind, bezeichnet man als Diastereomere. Ein Spezialfall sind E / Z (eis / trans) Isomere an Doppelbindungen. Konformationsisomere sind Stereoisomere, die sich durch die Drehung von Einfachbindungen ineinander überführen lassen. Zur Abgrenzung der Isomerie-Arten voneinander siehe auch die IUPAC Regeln Sektion E (Pure Appl. Chem. 1976, 45, 11-30.).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I beinhalten auch die möglichen tautomeren Formen und umfassen die E- oder Z-Isomeren oder, falls ein chirales Zentrum vorhanden ist, auch die Racemate und Enantiomeren. Hierunter sind auch Doppelbindungsisomeren zu verstehen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivats zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung läßt sich herstellen, indem eine physiologisch wirksame Dosis des erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates mit zumindest einem galenischen Hilsstoff gemischt und zu einer Darreichungsform, vorzugsweise einer oralen oder parenteralen (z.B. i.V., i.m. oder subkutane Injektion) Darreichungsform, hergerichtet wird.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclo- hexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Salben, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.V., Lp., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme oder sonstige topische Applikation, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammen- setzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Wirkstoff in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung galenisch hergerichtet zur oralen, parenteralen oder topischen Gabe.
Als Dosierungen kommen für einen 75 kg Erwachsenen 0,01 bis 25 mg/kg/Tag, 0,01 bis 10 mg/kg/Tag, 0,01 bis 5,0 mg/kg/Tag, insbesondere 0,01 bis 1 ,0 mg/kg/Tag, (oral), oder 0,001 bis 25 mg/kg/Tag, 0,001 bis 10 mg/kg/Tag, 0,001 bis 2,5 mg/kg/Tag, insbesondere 0,005 bis 1 ,0 mg/kg/Tag, (parenteral) in Frage. Im Falle der topischen Anwendung kann die Wirkstoffkonzentration 0,001 bis 10 Gew.-%, 0,001 bis 1 ,0 Gew.-%, insbesondere 0,01 bis 0,1 Gew.-%, der fertigen Salbe betragen.
Insofern betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eine erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates einer Person verabreicht wird, welche an der Infektion oder Erkrankung erkrankt ist oder zu erkranken droht, vorzugsweise in einer der o.g. Darreichungsformen und einer der genannten Dosen.
Viele der erfindungsgemäßen Lysolipin Derivate sind totalsynthetisch, wenn überhaupt, nur sehr schwer darstellbar. Sie können dagegen nach gezielter molθkulargenetischer Manipulation des Lysolipin-Biosynthesegenclusters in den die Biosynthese ausführenden Mutanten exprimiert werden.
Die Inaktivierung bestimmter Modifikationsgene und die Analyse der von den jeweiligen Mutanten erzeugten Strukturen, erlaubt eine Funktionszuweisung für viele der inaktivierten Gene. So ist es z.B. durch ein Inaktivierungsexperiment und die Strukturaufklärung der von der Mutante CB3818LlpMVI_A synthetisierten Substanz gelungen, der Methyltransferase LIpMVI die spezifische Funktion der Methylierung der Hydroxylgruppe am C16 (Fig. 1) zuzuweisen.
Generell kann eine gewünschte Derivatisierung eines natürlicherweise von der Zelle synthetisierten Wirkstoffs dadurch erreicht werden, dass in eine Wirkstoff produzierende Zelle an Stelle oder zusätzlich zu einem natürlichen korrespondierenden Gen für einen definierten Teilsyntheseschritt ein hiervon verschiedenes fremdes Gen für einen von dem definierten Teilsyntheseschritt verschiedenen anderen definierten Teilsyntheseschritt eingeführt ist. Dies kann durch Konstruktion und Einführung des gesamten fremden bzw. mutierten Wirkstoff-Biosynthesegenclusters oder Teilen hiervon erfolgen. Es wird gleichsam eine mutierte Biosynthese maßgeschneidert nach Maßgabe der gewünschten Derivatisierung. Es ist gleichzeitig möglich, ein natürlicherweise in der Zelle enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese des Wirkstoffs oder eines Wirkstoffderivates funktional ist, zu inhibieren oder zu mutieren, insbesondere ganz oder teilweise zu deletieren. Dies kann auch für mehrere natürlicherweise in der Zelle enthaltene solche Gene erfolgen.
Geeignete Zellen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Actinomyceten, wie z.B. die Streptomyceten, oder Enterobakterien, wie z.B. E. coli. Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Zelle eine mit einem erfindungsgemäßen Transformationsvehikel erzeugte Mutante bzw.
Rekombinante bekannter Stämme ist, und dass der damit erzeugbare Wirkstoff gegenüber bekannten Verbindungen derivatisiert ist.
Daher lehrt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates mit den folgenden Verfahrensschritten: a) es wird eine gewünschte Modifikation gegenüber Lysolipin I oder Lysolipin X definiert, b) es wird ein Gen oder werden mehrere der Gene gemäß Seq.-ID 47 bis 92 anhand ihrer Funktionalitätszuordung mit der Maßgabe ausgewählt, dass das Gen, dessen Mutation und/oder dessen Inhibierung, insbesondere teilweise oder totale Deletion, für die Synthese der Modifikation funktional ist, c) es wird eine Zelle durch Transformation erzeugt, welche das Gen oder die Gene gemäß Stufe b), ggf. mutiert und/oder inhibiert, enthält, wobei das Gen bzw. die Gene in funktionalem Zusammenhang des Lysolipin Biosyntheseclusters der Zelle angeordnet sind, d) die Zelle wird kultiviert, e) das Lysolipin Derivat wird aus der Zelle oder dem Kulturüberstand isoliert, f) optional erfolgt eine chemisch synthetische Derivatisierung des Produktes aus der Stufe e).
Erfindungsgemäße Lysolipin Derivate müssen nicht notwendigerweise per se die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften aufweisen bzw. sind möglicherweise in Hinblick auf die pharmakologischen Eigenschaften noch nicht optimiert. Um die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften zu erhalten, kann es ausreichend sein, eine chemisch synthetische Modifikation des Derivates durchzuführen. Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates als Zwischenprodukt für die chemisch synthetische Herstellung von modifizierten Lysolipin Derivaten.
Schließlich ist es möglich, die im Rahmen der Erfindung charakterisierten und eingesetzten Proteine bzw. Enzyme für eine biokatalytische Derivatisierungsreaktion einzusetzen. Daher lehrt die Erfindung auch die Verwendung eines Proteins oder mehrere der Proteine gemäß der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 46 zur enzymatisch katalytischen Derivatisierung von Lysolipin, wobei das Protein mit einem Lysolipinvorläufer oder einem Lysolipinderivat sowie mit allen für die mit dem Protein enzymatisch katalysierte Derivatisierung notwendigen Metaboliten kontaktiert wird und wobei das erhaltene Lysolipin Derivat isoliert wird. Geeignete Proteine bzw. Gene sind auch in der Dissertation P. Lopez, 2005, beschrieben.
Im Folgenden wird die Erfindung durch Beschreibung der Herstellung der neuen Lysolipin-Derivate, ihre Strukturaufklärung und die biologische Charakterisierung näher erläutert. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keinster Weise beschränkend zu verstehen.
Beispiel 1 : Identifizierung und Charakterisierung des Lysolipin Biosyntheseclusters
Mit Hilfe von Gensonden konnte in Hybridisierungen das gesamte Gencluster wie folgt identifiziert werden [s. auch DE 10 2004 047269.6, DE 10 2005 026 103.5, und PCT/DE2005/001494, hiermit „incorporated by reference"]:
Die chemische Struktur von Lysolipin und Fütterungsexperimente führten zu der Vermutung, dass Lysolipin aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs Il synthetisiert wird. Die Biosynthese des Rückgrats aromatischer Polyketide erfolgt iterativ mit Hilfe der so genannten Minimal PKSII, die aus 3 separaten Enzymen besteht: 2 ß-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSa und KSß und dem „Acyl Carrier Protein" (ACP). Vergleicht man die drei Minimal-PKS kodierenden Gene unterschiedlicher PKSII-Biosynthesen untereinander, so fällt auf, dass diese hochkonserviert sind und meist die charakteristische Organisation KSα-KS/?-ACP aufweisen. KSa bzw. KS/? sind somit geeignete Markergene für aromatische Polyketide (Metsä- Ketelä et al., 2002, Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472-4479) und der Einsatz abgeleiteter Gensonden führte daher auch im Falle des Lysolipin-Produzenten, zur Identifizierung von PKSII-Clustern. Da Lysolipin ein halogenierter Naturstoff darstellt, der an C1 einen Cl- Substituenten trägt, sollte innerhalb des Lysolipin Biosynthesegenlusters auch ein Gen für eine NADH/FAD abhängige Halogenase (van Pee, 2001 , Arch. Microbiol. 175, 250-258) vorhanden sein. Auch von Halogenasegenen abgeleitete Primer lassen sich zur Identifikation von Halogenasegenen und dazugehöriger Biosynthesegencluster einsetzen (Piraee and Vining, 2002, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29, 1-5).
Entsprechend erfolgte die Identifizierung des Lysolipin-Biosynthesegenclusters unter Verwendung von PKSII- und Halogenase-spezifischen Gensonden gegen gespottete Klone einer Cosmid-Genbank des Stammes CB28.
Dazu wurde ein Genbank von CB28 wie folgt hergestellt: Homogenisierte Bakterienkulturen wurden in 0.5% "low melting point agarose" (SeaPIaque GTG, Biozym) eingebettet und anschließend mit 2 mg/ml HEW-Lysozym (Roth) für 14 h bei Raumtemperatur und mit 1 mg/ml Proteinase K (Merck) für 24 h bei 50 0C inkubiert. Die eingebettete DNA wurde partiell mit Sau3A\ gespalten, mit Gelase (Epicentre) extrahiert und nach beschriebenen Methoden dephosphoryliert. Die genomische DNA wurde mit 750 ng ßamHI gespaltenen Cosmidvektor pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes
Foundation, Norwich, England.) ligiert, entsalzt, verpackt (Gigapack IM Gold Packaging Extract, Stratagene) und in DH5α (Invitrogen) transfiziert. Cosmidklone wurden in 384 MTP gepickt und anschließend auf Nylonfilter (Amersham) gespottet. Nachdem die Kolonien auf den Membranen gewachsen waren, wurden diese nach Nizetic et al., 1991 , PNAS 88:3233-7 prozessiert und unter Verwendung der Standard-Methoden nicht-radioaktiv hybridisiert (Roche). Zur Identifizierung von PKSII-kodierenden Cosmiden wurde zunächst eine homologe Sonde mit Hilfe der genomischen DNA aus CB28 hergestellt (PCR- Primer s. Metsä-Ketelä et al., Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472-4479). Der PCR-Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 1 ,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 2,5 μl 10 x Puffer, 2,5 μl PCR-DIG probe Synthesis Mix (Roche), 5,0 μl Q-Solution, 0,5 μl PKSII-FOR -Primer (50 pmol), 0,5 μl PKSII- REV-Primer (50 pmol), 0,5 μl Qiagen-Taq-Polymerase (2,5 u), 14,5 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC-225) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 x (2 min, 950C), 30 x (950C, 1 min; 72°C, 2 min; 72°C, 1.30 min), 1 x (72°C, 5 min). Ein Einsatz der so amplifizierten homologen PKSII-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28 Cosmidbibliothek ergab 13 hybridisierende Cosmidklone. Um aus diesen Cosmiden solche auszuwählen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Teile des oder das gesamte Lysolipin- Biosynthesegencluster kodieren, wurde eine weitere Sonde, die gegen Halogenasegene gerichtet war, eingesetzt. Dazu wurde ebenfalls mit Hilfe der genomischen DNA von CB28 folgende konservierte Primer eingesetzt:
Halo-For: GCG GCT GCA G(GC)T GG(AGT)(AT)(GC)A T(CT)C CG(CT) T Halo-Rev: CC(GC) (GC)TG GAT CC(GC) CGGGTC (GC)A(GCT) GAA GC (s. auch: van Pee, Zehner.S., 2003. Enzymology and molecular genetics of biological halogenation. In: Gribble.G. (Ed.), The Handbook of Environmental Chemistry, Part P Natural Production of Organohalogen Compounds. Springer Verlag, Heidelberg, Vol. 3). Die PCR wurde mit Hilfe des PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) durchgeführt und hatte folgende Zusammensetzung: 1 ,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 5 μl 10 x Puffer, 5 μl PCR DIG Labeling Mix, je 1 μl Halo-For- und Halo-Rev-Primer (50 pmol), 0,75 μl Enzym- Mix, 36,25 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC- 100) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 x (2 min, 94°C), 25 x (94°C, 1 min; 610C, 1 min; 72°C, 1 min), 1 x (72°C, 10 min). Ein Einsatz der so amplifizierten homologen Halogenase-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28 Cosmidbibliothek ergab 11 hybridisierende Cosmidklone, die sich durch eine Kontroll-Hybridisierung bestätigen ließen. Insgesamt 3 Cosmidklone (28- 4H04, 28-4022 und 28-3J01 ) zeigten eine Cohybridisierung gegen PKSII- und Halogenase-Sonde, so dass diese mit einer großen Wahrscheinlichkeit Teile bzw. das vollständige Lysolipin Biosynthesegencluster kodieren sollten. Durch heterologe Expression von Lysolipin in S. albus konnte wie folgt der
Nachweis erbracht werden, dass das identifizierte cohybridisierende Cosmid 28- 4H04 alle für die Biosynthese von Lysolipin notwendigen Gene kodiert:
Das cohybridisierende Cosmid 28-4H04 wurde nach S. albus J 1074 transferiert, der u.a. erfolgreich als heterologer Wirt zur Produktion von Rebeccamycin eingesetzt wurde (Sanchez et al. 2002, Chem Biol. 9(4):519-31 ). Der Cosmidvektor 28-4H04 verfügt neben einen origin of transfer (oriT) auch über eine Integrationsfunktion des Actinomycetenphagen PhiC31. Dies stellte die Voraussetzung dafür dar, dass das Cosmid von E. coli nach S. albus intergenerisch konjugiert werden konnte (Standard-Methode siehe Kieser et al., 2000, Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) und anschließend über die Integrationsfunktion in das Chromosom von S. albus integrierte. Ein erfolgreicher Transfer und Integration der Cosmide konnte durch Selektion auf den Apramycin-Resistenzgenmarkers aacC4 (Selektion durch Überschichtung mit 1 mg Apramycin) nachgewiesen werden. Zur Abtötung der E. coli Donoren wurde zusätzlich mit 1 mg Phosphomycin überschichtet. Nach 4 - 6 Tagen Inkubation bei 28 0C wurden mehrere Transkonjuganden sichtbar, deren Apramycin-Resistenz erfolgreich verifiziert werden konnte.
Um eine potentielle heterologe Lysolipin-Produktion im Transkonjuganten S. a/jfc>ι/s/28-4H04 (CB3818) nachzuweisen, wurde dieser unter Produktionsbedingungen fermentiert und nach Extraktion mit Hilfe der LC(DAD)- MS analysiert. Als Negativ-Kontrolle diente eine S. albus Kultur ohne Cosmid, die unter identischen Bedingungen kultiviert und extrahiert wurde.
Die Anzucht erfolgte mit folgenden Kulturen. Vorkultur: 50 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 (s. Kieser et al., 2000) pH 7,2] wurden mit der Transkonjugante CB3818 angeimpft und für 48 h bei 28 0C und 160 rpm inkubiert; Hauptkultur: 100 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 s.o.] wurden mit 1 ml der Vorkultur beimpft und für 120 h bei 28 0C und 160 rpm inkubiert. Die Kontrollkultur (S. albus) wurde ohne Zugabe von Apramycin kultiviert.
Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt: i) jeweils 1 ml der Hauptkultur wurde nach Zugabe von 50 μl 1 N HCl mit 1 ml Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur Trockne eingeengt, ii) der Rückstand wurde in 100 μl Methanol aufgenommen und die Produktion von Lysolipin mittels LC(DAD)-MS untersucht. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
Gerätespezifikation HPLC:
Waters Alliance 2790; Säule: Gram Sil 120 ODS-4 HE, 3 μm, Dim. 40 mm L x 4.0 mm ID; Vorsäule: Phenomenex C18 ODS, 4.0 mm L x 3.0 mm ID; Gerätespezifikation MS:
Micromass Q-TOF 2; verwendet wurde die ESI Technik; Scan-Bereich m/z im positiven Modus: 100 - 1700; für die Quasimolekülionen [M+H]+ und Fragmentionen wurde eine Kapillarspannung von 2,70 kV, eine Cone-Spannung von 33 V und eine lonenquellen-Temperatur von 1200C angewandt. Der N2- Desolvationsgasfluß betrug 600 l/h bei 25O0C
Die LC(DAD)-MS-Analyse wurde mit folgendem Gradientensystem durchgeführt (Eluent A: Reinstwasser mit 0.1% (v/v) Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril): Zeit A [%] B [%] Fluss [ml/min] Kurve
0.00 80.0 20.0 1.000 1
7.00 10.0 90.0 1.000 6
8.00 4.0 96.0 1.700 6
10.0 4.0 96.0 1.700 6
11.5 80.0 20.0 1.000 6
12.0 80.0 20.0 1.000 6
Die LC(DAD)-MS-Analyse des Transkonjuganten S. a/όt/s/28-4H04 (CB3818) zeigt deutlich, dass diese im Gegensatz zur Negativkontrolle (S. albus) eine Substanz synthetisiert, deren Retentionszeit, UV/Vis-Spektrum sowie Masse der des Lysolipin I entspricht. Hierzu sind in Figur 2 bis 4 die fokussierten lonenchromatogramme (positiver Modus, fokussiert zwischen m/z 597 bis 599 (Lysolipin I [M+H]+: 598); Fig. 2), die UV/Vis(DAD)-Chromatogramme (Base Peak Index (BPI); Fig. 3) sowie die auf den Bereich von 260 bis 280 nm (BPI) fokussierten UV(DAD)-Chromatogramme (Fig. 4) des Transkonjuganten CB3818 (oben) im Vergleich zur Negativkontrolle S. albus (mitte) und Lysolipin I (unten; reines Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz) abgebildet. Das Transkonjuganten Chromatogramm zeigt einen zusätzlichen Peak, der eine Retentionszeit von ca. 4,6 min aufweist. Die diesem Peak entsprechende Substanz zeigt ein UV/Vis-Spektrum (Fig. 5, oben), das dem UV/Vis-Spektrum von Lysolipin I (reines Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz; Fig.5, unten) entspricht. Ein massenspektrometrischer Vergleich dieser heterolog synthetisierten Substanz (Retentionszeit: 4,7 min; Fig. 6, oben) mit Lysolipin I (Retentionszeit des reinen Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz: 4.7 min; Fig. 6, unten) zeigt, dass im Transkonjuganten CB3818 eine Substanz gebildet wurde, deren Masse und Isotopenverteilungsmuster der des einfach chlorierten Lysolipin I entspricht.
Da die erfolgreiche heterologe Expression von Lysolipin in CB3818 gezeigt hat, dass das Cosmid 28-4H04 alle zur Synthese von Lysolipin notwendigen Gene trägt, konnte das Gencluster durch Sequenzierung identifiziert und wie folgt annotiert werden.
Durch Shotgunsequenzierung wurde die Sequenz des Inserts mit 43.202 bp doppelsträngig ermittelt, wozu auf das Sequenzprotokoll verwiesen wird (SEQ.- ID 93). Der GC-Gehalt des gesamten sequenzierten Bereiches wurde mit für Actinomyceten typischen 72,2 % bestimmt. Zur Identifizierung potentieller Lysolipin-Biosynthesegene wurden umfassende ORF (Open Reading Frame)- Analysen unter Verwendung des ORF-Finders "zCurve" (Guo et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(6):1780-9) und BlastP-Analysen durchgeführt. Insgesamt konnten 46 putative ORFs identifiziert werden, wobei 'ORF46 unvollständig ist (die Charakteristika und Bezeichnungen der ORFs sind in Fig. 7 zusammengefasst). Diese ORFs sind in 9 Gruppen unterschiedlicher
Transkriptionsrichtung organisiert (Fig. 8). Aufgrund der Annotation umfasst das Lysolipin-Biosynthesegencluster 44 ORFs (L/p-Gene) mit einem Kodierbereich von ca. 38,6 kb. Das Genprodukt des im 5'-Bereich, vermutlich außerhalb des Cluster lokalisierten ORFs 1 zeigt höchste Homologie zu einem konservierten hypothetischen Protein aus S. coelicolor (75% Identität), während im 3'-Bereich des Clusters der unvollständige ORF46 höchste Ähnlichkeit (86% Identität) zu dem terminalen Protein TpgR2 aus Streptomyces rochei zeigt. Generell ist auffallend, dass die Produkte von insgesamt 16 Lysolipin-Biosynthesegenen (LIpOII, LIpOIII, LIpZI, LIpB, LIpCI, LIpD, LIpE, LIpF, LIpCII, LIpCIII, LIpOVI, LIpMI, LIpMII, LIpQ, LIpZIII, LIpRIV, s. Fig. 7) höchste Homologien zu Genprodukten der Biosynthesen von Pradimicin, Rubromycin bzw. Griseorhodin aufweisen (Pradimicin-Typ-Antibiotika). Diese drei Substanzen stellen ebenfalls durch eine Typll-PKS synthetisierte, polyzyklische Polyketide dar. Eine weitere Auffälligkeit besteht darin, dass aufgrund der Annotation 16 Llp-Genprodukte höchste Ähnlichkeit zu Enzymen aufweisen, die an Redoxprozessen beteiligt sind. Diese Tatsache erklärt den hoch oxidierten Charakter von Lysolipin. Derzeit ist kein anderes Cluster bekannt, das mehr Enzyme dieser Klasse aufweist.
Die aufgrund des Proteinsequenzvergleichs zu postulierenden Funktionen der einzelnen Lysolipin-Biosynthesegene bzw. Genprodukte legen nahe, dass die Biosynthese von Lysolipin wie folgt abläuft: Innerhalb des Clusters ist mit HpA ein Gen zu finden, dessen Genprodukt höchste Ähnlichkeit zu Asparaginsynthasen/Glutaminamidotransferasen aufweist. Diese Enzyme übertragen Aminogruppen von Glutamin auf Aspartat, was die Synthese von Asparagin und Glutamat zur Folge hat. In ähnlicher Weise könnte LIpA die Aminogruppe von Glutamin auf Malonyl-CoA übertragen, was die Bildung von Malonamid-CoA zur Folge hätte.
Die Kondensation der putativen Malonamid-Einheit mit 11 weiteren Malonat- Einheiten wird durch die Minimal-PKS katalysiert. Diese wird durch die drei Gene HpD, HpE und HpF kodiert. Die abgeleiteten Genprodukte zeigen höchste Ähnlichkeiten (52, 69 und 78%) zum ACP und zu den ß-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSß und KSa des Rubromycin-Biosynthesegenclusters. Die Biosynthese von Lysolipin erfordert mehrere präaromatische Deoxygenierungen, die eventuell schon während der Bildung des Polyketids initiiert werden (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064-2069). Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit HpZI, llpZIII und HpZIV drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu 3-oxoacyl-ACP Reduktasen aufweisen. Diese Enzyme könnten für die in Bockholt et al., 1994 beschriebenen Reduktionen verantwortlich sein, die die Voraussetzung für die Deoxygenierung der entsprechenden Ketogruppen darstellt.
Die Biosynthese eines aromatischen Backbones wird meist mit Hilfe von Cyclasen bzw. Aromatasen abgeschlossen, wobei mindestens 2 Cyclasen benötigt werden. Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit den Genen HpCI- III drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu Cyclasen der Griseorhodin/Rubromycin-Biosynthese zeigen.
Da 9 der 12 in Lysolipin X (Bockholt et al., 1994) vorhandenen Sauerstoffatome aus molekularem Sauerstoff stammen, ist das Vorhandensein einer großen Anzahl von Sauerstoff-einführenden Oxidoreduktasen nicht verwunderlich. Die zu den Oxidoreduktasen gehörenden Oxygenasen katalysieren die Einführung von einem (Monooxygenase) oder zwei Sauerstoffatomen (Dioxygenasen) in das entsprechende Substrat. Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind aufgrund der Sequenzannotation 3 Gene vorhanden, die für drei FAD-abhängige Mono- oder Dioxygenasen (LIpOI, LIpOV und LIpOVIII) kodieren. Die abgeleiteten Genprodukte weisen eine Größe von 461 , 397 und 541 Aminosäuren (AS) auf. Aufgrund der Proteinsequenz und Homologie, lässt sich nicht vorhersagen, an welcher konkreten Oxygenierung die jeweilige FAD-abhängige Oxygenase beteiligt ist. Dennoch erscheint es wahrscheinlich, dass eines dieser Enzyme an der Bildung des Xanthons bzw. an der oxidativen Ringspaltung beteiligt ist, da eine solche Baeyer-Villiger Oxidation in der Mithramycin-Biosynthese durch die FAD abhängige Monooxygenase MtmOIV katalysiert wird (Rodriguez et al. 2003, J Bacteriol. 185(13):3962-5). Interessant ist allerdings die Tatsache, dass LIpOVIII höchste Ähnlichkeit (47% Identität) zur Tetracenomycin-Hydroxylase TcmG aufweist, die für eine 3-fach Hydroxylierung verantwortlich ist (Rafanan et al., 2000, Org Leu. 5; 2(20):3225-7).
Darüber hinaus befinden sich im Cluster 3 Gene UpOIV, HpOVI und HpOVII, deren abgeleitete Genprodukte höchste Identität zu Cytochrom P450- abhängigen Monooxygenasen (CYP450) aufweisen. LIpOIV zeigt höchste Ähnlichkeit zu MycG (48% Identität), eine CYP450, die im Verlauf der Mycinamycin-Biosynthese sowohl für eine Hydroxylierung als auch Epoxidierung verantwortlich ist (Inouye et al., 1994 Mol Gen Genet. 245(4):456-64). Wie bei einigen anderen CYP450, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind, befindet sich auch stromabwärts von HpOIV mit HpKeIn Gen, das für ein Ferrodoxin kodiert. LIpOVI zeigt größte Ähnlichkeit zu einer CYP450 aus dem Pradimicin-Biosynthesegencluster. Die abgeleiteten Genprodukte LIpOII und LIpOIII zeigen ebenfalls höchste Ähnlichkeit zu Genen der Pradimicingruppe (RubT, GrhV, GrhU), für die keine Funktion beschrieben ist. Eine Motivsuche (Pfam-Analyse) ergibt jedoch für beide Enzyme ein eindeutiges „Antibiotic biosynthesis monooxygenase"-Motiv, so dass auch diese beiden Enzyme an Oxygenierungsreaktionen beteiligt sein sollten. Weiterhin kodiert HpL für ein Genprodukt, das höchste Homologie zu dem als Hydroxylase annotierten Enzym SnoaW aufweist. Die genaue Funktion dieses Enzyms innerhalb der Lysolipin-Biosynthese bleibt ebenso wie die Funktion aller übrigen Lysolipin Oxygenasen zu klären.
Darüber hinaus sind im Cluster noch folgende weitere Gene lokalisiert, deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu Oxidoreduktasen zeigen: LIpU: Genprodukt weist „alcohol dehydrogenase" Motiv auf und zeigt höchste Ähnlichkeit zu Dehydrogenasen. LIpZII: Genprodukt zeigt höchste Identität (42%) zu MmcJ, einer F420 abhängigen Tetrahydromethanopterin (H4MPT) -Reduktase der Mitomycin-Biosynthese. Dieses Enzym katalysiert eine Carbonyl-
Reduktion und könnte eventuell an der Biosynthese des Lysolipinstarters beteiligt sein. LIpS: Genprodukt zeigt höchste Identität (37%) zu 3-Hydroxybutyrat-
Dehydrogenasen, die im Lipidstoffwechsel involviert sind.
Eine mögliche Funktion der beiden Dehydrogenasen, LIpU oder LIpS könnte in der Oxidation einer Lysolipin-Vorstufe bestehen, die zur Einführung der Methylengruppe notwendig sein könnte.
Das Gen HpH kodiert ein Genprodukt, das höchste Ähnlichkeiten zu NADH/FAD- abhängige Halogenasen (37-39%) zeigt. Somit wird LIpH für die Halogenierung an C1 verantwortlich sein.
Für die Biosynthese von Lysolipin sind 4 O-Methylierungen und eine N- Methylierung notwendig. Im Cluster können 6 Gene identifiziert werden (HpMI bis HpMVI), deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu O-Methyltransferasen unterschiedlicher Antibiotika-Biosynthesen, wie Tetracenomycin, Griseorhodin und Enterocin aufweisen. Auffallend ist, dass das Cluster für 6 O- Methyltransferasen kodiert, obwohl nur 5 benötigt werden.
Im Cluster befinden sich 4 Regulatorgene (HpRI-llpRIV). LIpRIV weist hohe Homologie (39%) zu dem Regulator RubS der Rubromycin-Biosynthese auf, der zu den sog. SARPs („Streptomyces antibiotic regulatory protein") gehört. SARP- Regulatoren stellen Biosynthese-spezifische Transkriptionsaktivatoren dar. Vor einigen Lysolipin-Genen können dementsprechend typische SARP-spezifische Erkennungssequenzen gefunden werden. LIpRI zeigt Homologie zu einem Transkriptionsregulator (vermutlich einem Repressor) und könnte den Beginn des Clusters markieren. LIpRII und LIpRIII zeigen höchste Ähnlichkeit zu Transkriptionsaktivatoren (s. Tabelle 1). Das Cluster beherbergt mit HpN ein Gen, dessen abgeleitetes Genprodukt höchste Identität (30%) zu einem „multidrug transporter" aus Lactococcus lactis zeigt. Dieses Protein ist wahrscheinlich an der Resistenzvermittlung beteiligt. Darüber hinaus kodiert das Lysolipin-Biosynthesegencluster mit LIpB und LIpQ, 2 Genprodukte, die die höchste Identität (40-50%) zu den Membranproteinen RubQ und GrhM der Rubromycin- bzw. Griseorhodin-Synthese zeigen. Eine Funktion dieser Proteine ist bisher nicht beschrieben. Dennoch könnten beide Membranproteine ebenfalls zur Resistenzvermittlung beitragen. Überraschenderweise ist im Lysolipin-Gencluster mit HpG ein Gen lokalisiert, dessen abgeleitetes Genprodukt signifikante Identität (42%) zu Glykosyltransferasen zeigt. Es gibt mit Kigamycin sehr wohl glykosylierte
Lysolipin-ähnliche Xanthone (Kunimoto et al., 2003, 56, 1012-1017), allerdings sind glykosylierte Lysolipin-Derivate bisher nicht bekannt. Ob wie bei Makroliden eine evtl. intermediäre Glykosylierung ein Resistenzmechanismus darstellt, bleibt zu prüfen.
Im Cluster befinden sich mit HpT und HpV weiterhin 2 Gene, deren Genprodukte höchste Homologie zu einer als Polyketidsynthase CurD annotierten Sequenz bzw. zu WhiE aufweisen. Die Funktion innerhalb der Synthese ist aufgrund dieser Homologien jedoch nicht vorhersagbar. Weitere Gene/ORFs unbekannter Funktion sind HpJ und HpW.
Im Cluster befinden sich mit HpT und llp V weiterhin 2 Gene, deren Genprodukte höchste Homologie zu einer als Polyketidsynthase CurD annotierten Sequenz bzw. zu WhiE aufweisen. Die Funktion innerhalb der Synthese ist aufgrund dieser Homologien jedoch nicht vorhersagbar. Weitere Gene/ORFs unbekannter Funktion sind HpX, HpY, HpP und HpJ.
Für die Funktionalitäten bzw. Zuordnungen wird auf die Figuren 7 und 8 verwiesen. Für das Sequenzprotokoll ergibt sich die folgende Genliste (ID Nukleinsäure / ID Protein): 0RF1 47/1 ; HpX 48/2; HpY 49/3; HpP 50/4; HpRI 51/5; MpOI 52/6; HpJ 53/7; MpOII 54/8; HpOIII 55/9; HpZI 56/10; MpB 57/11 ; MpCI 58/12; MpD 59/13; MpE 60/14; MpF 61/15; MpCII 62/16; HpCIII 63/17; MpU 64/18; HpG 65/19; HpA 66/20; HpRII 67/21 ; HpOIV 68/22; HpK 69/23; HpT 70/24; HpL 71/25; HpOV 72/26; HpN 73/27; HpRI 11 74/28; HpOVI 75/29; MpMI 76/30; MpOVII 77/31 ; HpMII 78/32; MpOVIN 79/33; HpMIII 80/34; MpQ 81/35; HpZII 82/36; MpMIV 83/37; HpS 84/38; HpV 85/39; HpZIII 86/40; HpH 87/41 ; HpRIV 88/42; HpZIV 89/43; HpMV 90/44; HpMVI 91/45; und ORF46 92/46. SEQ.-ID 93 ist die Gesamtnukleinsäuresequenz.
Beispiel 2: Beschreibung der Darstellung neuer Lysolipin-Derivate
Zur Synthese neuer Lysolipinderivate wurden die drei folgenden Strategien zum Teil auch in Kombination eingesetzt:
2.1 Gezielte Fermentation zur Erzeugung von unchlorierten und bromierten Lysolipin-Derivaten
Lysolipin trägt an Position 1 einen Cl-Rest, der durch die NADH/FAD-abhängige Halogenase LIpH eingeführt wird. Einige Halogenasen besitzen eine erstaunliche Flexibilität hinsichtlich des Halogenidions, so dass durch einen Austausch von Chloridionen gegen Bromidionen im Fermentationsansatz, wie am Beispiel der Glykopeptid-Antibiotika beschrieben (Bister, B. et al., 2003 ChemBioChem. 4(7):658-662), die Biosynthese von bromierten Derivaten möglich sein könnte. Da bei strukturverwandten Xanthonen, wie Actinoplanon die Anwesenheit des Cl-Restes die Cytotoxizität der Substanz erhöht, erscheinen Modifikationen des Halogenierungsstatus von Lysolipin sinnvoll. Aus diesem Grund wurde der Lysolipin heterolog produzierende S. albus Stamm CB3818 unter Zugabe von NaBr fermentiert (Produktion wie unter 2. beschrieben, zum Vorkultur Medium und Hauptkultur-Medium wurde 5 g NaBr anstelle von NaCI zugegeben). Im Überstand konnte nach Extraktion durch LC-DAD-MS (s. 2.) das dechlorierte Lysolipinderivat CBS44 und das bromierte Lysolipinderivat CBS49 nachgewiesen werden (Beschreibung der Isolierung und Strukturaufklärung s. 3). Die erfolgreiche fermentative Herstellung eines Lysolipin Dechloro- und Brom- Derivates in einem Medium, das NaBr aber kein NaCI enthält, eröffnet die Möglichkeit, aus allen Lysolipin-Derivat produzierenden Geninaktivierungsmutanten (s. 2.2) nach NaBr-Fermentation entsprechende Dechloro- bzw. Brom-Derivate biosynthetisch zu erzeugen. So konnte z.B. durch gezielte Fermentation (Zugabe von NaBr, s.o.) der Apramycin-Insertionsmutante CB3919LlpOI_A ein neues dechloriertes CBS40 gewonnen werden, das mit CBS48 bezeichnet wurde (s. 3.).
2.2 Inaktivierung von Lysolipinbiosynthesegenen
Die Biosynthese von Lysolipin ist durch eine Vielzahl von Post-PKS
Modifikationsreaktionen gekennzeichnet. Diese Reaktionen werden durch „Tailoring'-Enzyme wie Sauerstoff-einführende Oxidoreduktasen, Methyltransferasen und einer Halogenase katalysiert. Mit Hilfe der Inaktivierung von Tailoring-Enzymen können Mutanten generiert werden, die bestimmte Vorstufen bzw. Zwischenprodukte anhäufen. Diese Derivate können per se interessante, neue pharmakologische und physikochemische Eigenschaften aufweisen bzw. als Ausgangsmaterial für weitere chemische Derivatisierungen eingesetzt werden. Die gezielte Inaktivierung von ausgewählten Biosynthesegenen kann prinzipiell durch unterschiedliche Methoden erreicht werden. Da im Falle des Lysolipins eine heterologe Expression des gesamten Clusters durch Cosmid 28-4H04 möglich ist, besteht die Möglichkeit, bestimmte Gene in E. coli zu inaktivieren und anschließend das modifizierte Cosmid nach S. albus zur heterologen Expression des entsprechenden Derivats zu transferieren. Zur Inaktivierung der auf dem Cosmid lokalisierten Lysolipin-Biosynthesegene in E. coli sind folgende Methoden denkbar: i. die ortsspezifische Mutagenese von Genen eventuell kombiniert mit einer „long ränge PCR"; ii. das Auffüllen von Schnittstellen in den zu inaktivierenden Genen, das die Einführung von frame shift Mutationen zur Folge hätte; iii. die Inaktivierung von Genen nach Anwendung der in vivo Rekombination (s. z. B. Gust et al., 2004, Adv Appl Microbiol. 2004; 54:107-28). Alternativ ist es ebenfalls möglich, Biosynthesegene nach Transfer und Integration des gesamten Lysolipingenclusters ins Chromosom traditionell durch homologe Rekombination zu inaktivieren. Bei dieser Methode wird das zu inaktivierende Zielgen gegen eine Resistenzgen kassette oder ein „in frame" deletiertes Allel mit Hilfe der homologen Rekombination im heterologen Produzentenstamm ausgetauscht („gene replacement").
Zur Inaktivierung von Lysolipin-Biosynthesegenen bietet sich die klassische Methode der „gene replacement" Mutagenese im heterologen Lysolipin- Produktionsstamm S. albus an, der über eine sehr gute genetische Handhabbarkeit verfügt. Die Durchführung dieses Ansatzes für das Lysolipin-Biosynthesegencluster erfordert folgende Schritte:
• Austausch des Cosmid-Resistenzmarkers aac(C3(IV) gegen das Kanamycin-Resistenzgen aphll
• Inaktivierung einer singulären Spei Site des Lysolipingencluster- kodierenden Cosmids 28-4H04-ap/?// durch Insertion einer Ampicillin-
Resistenzgenkassette
• Transfer des modifizierten Cosmids 28-4H04-aphll-bla nach S. albus
• Konstruktion von Inaktivierungsplasmiden und Generierung von gezielten Insertions- und in frame Deletionsmutanten in Genen des Lysolipinbiosynthesegenclusters in S. albus 28-4H04-aphll-bla (CB3919)
Übertragen auf das Lysolipin-Biosynthesegen-tragende Cosmid können die einzelnen Schritte wie folgt durchgeführt werden:
Austausch des Cosmid-Resistenzmarkers aac(C3(IV) gegen das Kanamvcin- Resistenzgen aphll: Zur Inaktivierung von Biosynthesegenen des Lysolipin-Genclusters bietet sich die Apramycin-Resistenzgenkassette aac(3)IV an, da die Apramycin-Resistenz in Streptomyceten und E. coli sehr zuverlässig ist. Da diese Resistenz bereits im Grundvektoranteil pOJ436 des Lysolipingencluster tragenden Cosmids 28-4H04 vorhanden ist, muss dieser Marker zunächst z.B. gegen das Kanamycin- Resistenzgen ausgetauscht werden. Das Kanamycin-Resistenzgen kann nicht als Inaktivierungsmarker eingesetzt werden, da das Apramycin-Resistenzgen aac(3)IV gleichzeitig Resistenz gegen Apramycin und Kanamycin vermittelt, während das Kanamycin-Resistenzgen als Vektormarker keine Kreuzresistenz gegen Apramycin zeigt. Der Austausch des Apramycin-Resistenzgens aac(3)IV gegen das Kanamycin-Resistenzgen aphll kann mit Hilfe einer „überlappenden PCR"-basierte Strategie durchgeführt werden, da im Hybridcosmid 28-4H04 keine geeigneten Restriktionsenzymschnittstellen vorhanden sind. Dazu wird ausgehend vom Hybridcosmid 28-4H04 ein ca. 3450 bp Bereich, der stromaufwärts und ein 4520 bp Bereich der stromabwärts von aac(3)IV lokalisiert ist, mit den Primern aac-upA und aac-upB, bzw. aac-downA und aac- downB in getrennten PCR-Reaktionen amplifiziert. Primer zur Amplifikation des stromaufwärts von aac(3)l V gelegen DNA-Bereichs sind: aac-upA δ'-AAATCTAGAGATCCTCTACGCCGGACGCATC-S' aac-upB: 5'-GAGYGCTTGCGGCAGCGtGATGCAGGTCGACGGATCTTTTCCGCTGC-S' Primer zur Amplifikation des stromabwärts von aac(3)IV gelegen DNA-Bereichs sind: aac-downA: 5'-GCGGGACTCTGGGGTTGCACGAGCGGATCGGGGATTGTCTTTCTTCAG- 3' aac-downB: δ'-AAAACTAGTGGTACCAACCCAGGCAGGTAGC-S'
Der Primer aac-upA weist eine Xibal-Schnittstelle und Primer aac-downB eine
Spel-Schnittstelle am 5'-Ende auf (fett hervorgehoben). Primer aac-upB weist ein 20 bp umfassendes überhängendes 5'-Ende auf, das homolog zu dem stromaufwärts gelegenen DNA-Bereichen des aphll-Gens ist. Primer aac-downA weist dementsprechend ein 20 bp umfassendes überhängendes 5'-Ende auf, das homolog zu dem stromabwärts gelegenen DNA-Bereichen des aphll-Gens ist.
PCR-Reaktion:
Als Template wird isolierte DNA des Hybridcosmids 28-4H04 eingesetzt. Zur Amplifikation kann der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt werden. Folgendes PCR-Programm ist für die Amplifikation der ca. 3450 bzw. 4520 bp großen PCR- Fragmente einzusetzen: Programm: Schritt 1 : 5 min 95°C, Schritt 2: 1 min 94°C
Schritt 3: 1 min 50 - 700C* Schritt 4: 10 min 720C Schritt 5: 5 min 72°C
Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt * Die Annealing Temperatur im Schritt 3 ist Geräte-spezifisch und mit Hilfe eines Gradienten-Cyclers, wie z.B. MJ Research PT-200 zu bestimmen.
Das eigentliche apM-Gen wird als 1165 bp DNA-Fragment mit den Primern ap/?//-up und ap/?//-down amplifiziert: apM-up: δ'-TCACGCTGCCGCAAGCACTC-S' aphll-down: δ'-GTGCAACCCCÄGAGTCCCGC-S'
Als Template wird das Streptomycetenplasmid pGM9 eingesetzt (Muth et al. 1989, Mol. Gen. Genet. 219, 341-348). Die PCR-Reaktion erfolgt wie oben beschrieben, wobei die Zeit für Schritt 4 jedoch 1 ,5 min beträgt. Die drei erhaltenen PCR-Produkte werden aufgereinigt und in einer PCR- Reaktion eingesetzt (Bedingungen wie zur Amplifikation des aphll-Gens), bei der jedoch kein Primer zugesetzt wird. Anschließend wird das erhaltene Produkt als Template-DNA in einer PCR-Reaktion eingesetzt (Bedingungen wie oben, wobei die Zeit für Schritt 4 20 min beträgt), bei als Primer aac-upA und aac- downB dienen. Das ca. 9 kb große Fragment wird zunächst in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript Il KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert. Alle Klonierungen und DNA-Modifikationen werden wie unter Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt. Abschließend wird das in pBluescript klonierte PCR-Produkt (ca. 9 kb) mit Xba\ und Spei verdaut und mit Xba\-Spe\ verdauter 28-4H04-DNA ligiert. E. coli XU- blue wird mit dem Ligationsansatz transformiert und auf LB-Platten mit Kanamycin (50 μg/ml) selektioniert. Kanamycin-resistente und Apramycin- sensitive Klone enthalten das Hybridcosmid 28-4H04-apΛ//.
Inaktivierung einer singulären Spei site des Lvsolipinqencluster-kodierenden Cosmids 28-4H04-aohll durch Insertion einer Ampicillin-Resistenzqenkassette
Apramycin-Insertionsmutanten können über homologe Rekombination durch Plasmidkonstrukte generiert werden, die anstelle des zu inaktivierenden Gens die Apramycin-Resistenzgenkassette aac(3)IV aufweisen und flankierende homologe Genregionen aufweisen. Die zur Insertionsmutagenese einzusetzenden Plasmidkonstrukte kann man auch zur Herstellung von Hybridplamiden nutzen, die für eine in-frame Deletionsmutagenese geeignet sind. Dazu wird die inserierte Apramycin-Resistenzgenkassette durch PCR mit singulären, kompatiblen Spei und Nhe\ Schnittstellen versehen. Die Schnittstellen können so konzipiert werden, dass nach Spei und Λ/ftel-Verdau und Religation eine in frame Deletion im zu inaktivierenden Gen entsteht. Die entsprechenden Hybridplasmide sind zur Generierung von in frame Deletionsmutanten geeignet. Um diese Strategie für alle zu inaktivierenden Lysolipin-Biosynthesegene einzusetzen, muss zuvor die in 28~4H04-aphll vorhandene singuläre Spel-Schnittstelle, die sich angrenzend zum Cosmidinsert befindet, eliminiert werden. Dies ist durch Integration einer Ampicillin- Resistenzgenkassette (bla) in diese Spel-Schnittstelle möglich und aufgrund der zusätzlichen Resistenz in E. coli selektionierbar Daher wird das bla-Gen mit folgenden Primern amplifiziert, wodurch ein 939 bp DNA-Fragment erhalten wird, das nach Aufreinigung mit Xbal-verdautem pK18 (Schäfer et al., 1994, Gene, 145, 69-73) ligiert wird: Bla_xba_For: δ'-CCGCTCTCTAGACAATAACCCTGATAAATG -S' Bla_xba_Rev
5'-TGAGTATCTAGAGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATC -S' Als Template dient das isolierte Plasmid pBluescript Il KS (-). Zur Amplifikation wurde die Taq DNA-Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt. Programm: Schritt 1 : 5 min 95°C, Schritt 2: 1 min 94°C Schritt 3: 1 min 50 - 700C* Schritt 4: 1 min 72°C
Schritt 5: 5 min 72°C
Schritte 2 bis 4 wurden 29 mal wiederholt.
* Die Annealing Temperatur im Schritt 3 ist Geräte-spezifisch und mit Hilfe eines Gradienten-Cyclers, wie z.B. MJ Research PT-200 zu bestimmen.
Das PCR-Produkt wird mit dem GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, UK) isoliert.
Das isolierte DNA-Fragment wird mit Xba\ verdaut und anschließend mit Xba\- linearisierter pK18-DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wird E. coli XL1-blue transformiert und Transformanden auf Carbenicilin-haltigem (50 μg/ml) LB- Medium selektiert. Aus dem so erhaltenen Hybridplasmid pK18-ö/a wird die bla- Resistenzgenkassette nach Verdauung mit Xba\ präparativ isoliert, und mit Spei verdauter 28-4H04-ap/?//-DNA ligiert. Anschließend wird E. coli XL1-blue mit dem Ligationsansatz transformiert und Selektion erfolgt auf LB-Platten mit Carbenicillin (50 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml).
Die Cosmide werden aus den erhaltenen Transformanden isoliert und die Integration des bla-Gens in die Spel-Schnittstelle mittels Spaltung mit Spei und Xba\ bestätigt. Das entsprechende Hybridcosmid erhält die Bezeichnung 28- 4H04-apΛ//-b/a.
Transfer des modifizierten Cosmids 28-4HQ4-aphll-bla nach S. albus
Durch intergenerische Konjugation kann das modifzierte 28-4H04-ap/?//-b/a Cosmid nach S. albus gebracht und die Lysolipin-Produktion wie oben beschrieben überprüft werden. Die S. albus Rekombinante, die das modifizierte Cosmid 28-4H04-apΛ//-/)/a trägt, bekommt die Bezeichnung CB3919.
Konstruktion von Inaktivierungsplasmiden und Generierunα von gezielten Insertions- und in frame Deletionsmutanten in Genen des Lvsolipinbiosvntheseqenclusters in S. albus 28-4H04-aph I l-bla (CB3919)
Zur gezielten Erzeugung von Mutanten in ausgewählten Genen des Lysolipin- Biosynthesegenclusters wird einerseits die Apramycin-Resistenzgenkassette (aac(3)IV) ins Zielgen integriert (Insertionsmutante) und andererseits an gleicher Stelle eine „in frame'-Deletion erzeugt (in frame Deletionsmutante). Die Erzeugung von in frame Deletionsmutanten hat neben der Vermeidung polarer Effekte den Vorteil, dass ausgehend von entsprechenden Deletionsmutanten die Apramycinkassette erneut als Marker auf dem Weg zur Herstellung von Doppelbzw. Mehrfachmutanten eingesetzt werden kann.
Die generelle Strategie zur Mutagenese der Zielgene kann wie folgt beschrieben werden (s. Fig. 9 und 10): Zunächst wird das Apramycin-Resistenzgen mit Primern amplifiziert, die eine anschließende Klonierung als Spel-Λ/Λel-Fragment zulassen. Darüber hinaus werden zwei weitere PCR-Fragmente (jeweils ca. 2000 bp) erzeugt, die von DNA-Bereichen stromaufwärts („upstream") und stromabwärts („downstream") des zu inaktivierenden Gens durch PCR amplifiziert werden und ebenfalls mit einer Spei bzw. Nhe\ Schnittstelle versehen sind. Alle 3 PCR-Fragmente werden in den in Streptomyceten nicht replikativen Inaktivierungsvektor pDH5 (Hillemann et al., 1991 Nucleic Acids Res. 19(4):727-31) kloniert. Nach erfolgreicher Klonierung tragen die entsprechenden Inaktivierungsplamide ein Insert, in dem der Upstream-Bereich des zu inaktivierenden Zielgens über eine Spel-Schnittstelle mit der Apramycin-Resistenzgenkassette fusioniert ist und diese wiederum über eine Λ/Λel-Schnittstelle vom Downstream-Bereich des Zielgens flankiert ist (s. Fig. 9).
Entsprechende Hybridplasmide werden durch eine PEG-induzierte Protoplastentransformation (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) in den S. albus Stamm CB3919 übertragen, der bereits das Lysolipin-Biosynthesegencluster- tragende Cosmid 28-4H04-aphll-bla enthält. Durch Selektion auf Apramycin können Klone selektiert werden, bei denen entweder das pDH5-Hybridplasmid durch homologe Rekombination über den Upstream- oder Downstream-Bereich ins Chromsom integriert sind (einfaches cross over) oder es bereits durch ein doppeltes cross-over zu einem Genaustausch des Zielgens gegen die Apramycin-Kassette gekommen ist (s. Fig. 10, oberer Teil). Durch Selektion auf Thiostrepton haltigem Medium kann eine Plasmidintegrationen (Thiostrepton resistent) von Apramycin-Insertionsmutanten (Thiostrepton-sensitiv) unterschieden werden. Zur Erzeugung der „in-frarne"-Deletionsmutanten, werden die zur Generierung der entsprechenden Apramycin-Insertionsmutanten verwendeten pDH5- Hybridplasmide einer Doppelverdauung mit Nhe\ und Spei unterzogen. Anschließend erfolgt eine Ligation über die von beiden Enzymen erzeugten kompatiblen Einzelstrang-Enden. Auf diese Weise wird das Apramycin- Resistenzgens eliminiert (s. Fig. 10). Hybrid plasmide zur Generierung von Deletionsmutanten werden ebenfalls durch PEG-induzierte
Protoplastentransformation in den S. albus Stamm CB3919 übertragen. Durch Selektion auf Thiostrepton-haltigem Medium können Klone selektiert werden, bei denen es zu einer Integration des pDH5-Hybridplasmids über den Upstream- oder Downstream-Bereich gekommen ist. Um nun aus der entsprechenden Plasmid-Integrationsmutante eine in frame- Deletionsmutante zu erzeugen, muss das integrierte Plasmid über ein 2. cross- over derart aus dem Chromosom desintgrieren, dass das zu inaktivierende Zielgen gegen die in frame deletierte Genkopie ausgetauscht wird (s. Fig. 10). Bei dieser über homologe Rekombination vermittelten Desintegration besteht allerdings auch die Möglichkeit, dass das integrierte Hybridplasmid über das Fragment rekombiniert, über das es ursprünglich integrierte. Ein solches Ereignis hätte die unerwünschte Widerhersteilung des Wildtyps zur Folge.
Untersuchungen haben gezeigt, dass ein solches Desintegrationsereignis durch Stressfaktoren wie Hitze und Ultraschall forciert werden kann. Aus diesem Grund wurden die Integrationsmutanten einem Stressprotokoll unterzogen, das im Detail in Puk et al. 2002 beschrieben ist (Chem. & Biol. 9, 225-235). Die nach dem Stressprotokoll unter nichtselektiven Bedingungen erhaltenen Klone werden parallel auf HA-Agar (20 g Agar, 4 g Bacto Yeast Extrakt, 10 g Malz Extrakt, 4 g Glucose, pH 7,3; nach dem Autoklavieren 1 ml 1 M CaCI2 zugeben) und HA-Agar mit 25 μg/ml Thiostrepton gepickt und 3 - 4 d bei 28 0C inkubiert. Klone, die die Thiostrepton-Resistenz verloren haben, sind entweder gewünschte in frame Deletionsmutanten oder zum Wildtyp revertiert. Mit Hilfe eines PCR-Experimentes, das so konzipiert ist, eine potentielle Deletion des Zielgens nachzuweisen, kann zwischen Wildtyp und Deletionsmutante unterschieden werden.
Im Folgenden wird die Herstellung von Apramycin-Insertionsmutanten und in frame Deletionsmutanten in den Lysolipin-Biosynthesegene HpH, HpMI, WpMWl, HpMVI, HpOI, HpOIV, HpOVI, HpOVIII und HpZHI detailliert beschrieben:
Zur Generierung der Mutanten muss zunächst wie in Fig. 9 dargestellt das Apramycin-Resistenzgen amplifiziert werden. Dazu wird das aac(3)IV-Gen als
1325 bp DNA-Fragment mit den Primern aac(3)IV-up und aac(3)IV-down amplifiziert. aac(3)IV-υp(Spe\):
5'- AAAACTAGTCTGCTCGCGCAGGCTGGGTG -3' aac(3)IV-do\Nn(Nhe\):
5'- AAAGCTAGCGGCTGTGAGCAATTATGTGC -3' Primer aac(3)IV-up weist eine Spel-Schnittstelle und Primer aac(3) I V-down eine Λ/Λel-Schnittstelle am 5'-Ende auf (fett markiert). Als Template für die PCR- Reaktion dient das Plasmid pHP45Ωaac (Blondelet-Rouault et al., 1997, 190, 315-317). Zur Amplifikation wird der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt. Folgendes PCR-Programm ist für die Amplifikation des 1325 bp großen PCR- Fragments einzusetzen: Programm: Schritt 1 : 5 min 95°C, Schritt 2: 1 min 94°C Schritt 3: 1 min 50 - 7O0C* Schritt 4: 1 ,5 min 72°C
Schritt 5: 5 min 72°C Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt
* Die Annealing Temperatur im Schritt 3 ist Geräte-spezifisch und mit Hilfe eines Gradienten-Cyclers, wie z.B. MJ Research PT-200 zu bestimmen.
Das PCR-Fragment wird zunächst in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript Il KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert und kann anschließend in großer Konzentration aus diesem Vektor als SpeVNhel Fragment isoliert werden.
Die zur Erzeugung der Hybridplasmide notwendigen „Upstream" und „Downstream" Bereiche (s. Fig. 9) der zu inaktivierenden Biosynthesegene HpH, HpMI, llpMIII, HpMVI, HpOI, HpOIV, HpOVI, HpOVIII und HpZIII wurden wie folgt amplifiziert und anschließend kloniert:
Für den Austausch durch homologe Rekombination werden für jedes zu inaktivierende Gen ein „Upstream"- und ein „DownstrearrT-Bereich von ca. 2000 bp (ca. 1000 bp im Falle von HpMVI) durch PCR amplifiziert. Für die Erzeugung von Mutanten in den Genen HpMIII, HpOI, HpOIV und HpOVIII weist der jeweilige „A"-Primer für den „UpstreanrT'-Bereich eine EcoRI
Schnittstelle, die kompatibel zur multiple cloning site (MCS) von pDH5 ist, auf und der „B"-Pιϊmer für den „Upstream'-Bereich des Zielgens eine Spel- Schnittstelle. Der jeweilige „A"-Primer für den „Downstream"-Bereich des Zielgens weist eine Λ//jel-Schnittstelle auf und der jeweilige „B"-Pιϊmer für den „DownstrearrV'-Bereich weist eine zur MCS von pDH5 kompatible H/ndlll Schnittstelle auf. Für die Erzeugung von Mutanten in den Genen HpH, HpMI, HpMVI, HpOVI, und UpZUI weist der jeweilige „A"-Primer für den „UpstrearrT'-Bereich eine EcoRI Schnittstelle, die kompatibel zur MCS von pDH5 ist, auf und der „B"-Primer für den „UpstreanrT'-Bereich des Zielgens eine /Vnel-Schnittstelle. Der jeweilige „A"- Primer für den „DownstreanrT'-Bereich des Zielgens weist eine Spel-Schnittstelle auf und der jeweilige „B"-Primer für den „DownstrearrV'-Bereich eine zur MCS von pDH5 kompatible H/ndlll Schnittstelle auf (führt in diesen Genen nach Ligation mit dem amplifizierten aac(3)IV-Ger\ zu einer zum Zielgen entgegengesetzten Orientierung der Apramycin-Resistenzgenkassette).
Alle Primersequenzen, die zur Amplifikation des „Upstream"- bzw.
„Downstream'-Bereichs der Zielgene eingesetzt werden können, sind in Fig. 11 aufgelistet. Als Template in den PCR-Reaktionen dient jeweils DNA des Lysolipin-Biosynthesegencluster-tragenden Cosmids 28-4H04.
Zur Amplifikation wird der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt. Folgendes PCR-Programm wird für die Amplifikation der 1000 bis 2000 bp großen PCR- Fragmente eingesetzt: Programm: Schritt 1 : 5 min 950C, Schritt 2: 1 min 94°C
Schritt 3: 1 min 50 - 700C* Schritt 4: 2,5 min 72°C Schritt 5: 5 min 72°C Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt * Die Annealing Temperatur im Schritt 3 ist Geräte-spezifisch und mit Hilfe eines Gradienten-Cyclers, wie z.B. MJ Research PT-200 zu bestimmen. Alle PCR-Fragmente werden ebenfalls in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript Il KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert, um diese anschließend in großer Konzentration aus diesem Vektor nach Spaltung mit den jeweils flankierenden Restriktionsschnittstellen (s. Fig. 11) zu isolieren.
Die jeweiligen PCR-Fragmente (Downstream und Upstream-Bereich des Zielgens und das Apramycin-Resistenzgen) wurden anschließend in den Vektor pDH5 kloniert (s. Fig. 9). Für jedes zu inaktivierende Zielgen entsteht somit ein pDH5-Derivat, das zur Herstellung von Apramycin Insertionsmutanten geeignet ist. Durch Spe\/Nhe\ Spaltung kann darüber hinaus aus allen pDH5 Hybridplamiden die Apramycin-Resistentkassette entfernt und das jeweilige Hybridplasmid religiert werden. So entsteht für jedes zu inaktivierende Zielgen ein weiteres pDH5-Hybridplamid, das zur Generierung von in frame Deletionsmutanten eingesetzt werden kann.
Nach Transfer der jeweiligen Apramycin Insertions- und Deletions- Hybridplasmide und Selektion der entsprechenden Klone können, wie oben beschrieben, Apramycin-Insertionsmutanten und in frame Deletionsmutanten eines jeden zu inaktivierende Zielgens erzeugt werden. Alle Mutanten werden durch PCR-Experimente verifiziert.
Folgende Mutanten wurden durch Geninaktivierung erzeugt (die Bezeichnung
_A symbolisiert eine Apramycin-Insertion im entsprechenden Zielgen, während _D eine in frame Deletion im Zielgen markiert):
Gen: Mutante:
HpH CB3919LlpH_D
HpOI CB3919LlpOI_A
HpOIV CB3919LlpOIV_D HpOVI CB3919LlpOVI_A
HpOVIII CB3919LIpOVI I I_D HpMI CB3919LlpMI_A llpMIII CB3919LlpMIII_A
HpMVI CB3919LlpMVI_A
HpZIII CB3919LlpZIII_D
Zusätzlich konnte folgende Doppelmutante erzei
Gen: Mutante:
HpOIV/llpH CB3919LlpOIV_D/LlpH_A
HpH/HpMIII CB3919LlpH_D/LlpMIII_A
HpOlV/llpOVI CB3919LlpOIV_D/LlpOVI_A HpOVIII/llpH CB3919LlpOVIII_D/LlpH_A
Diese Mutanten wurden wie unter 3. beschrieben durch LC-DAD-MS Analytik analysiert und evtl. neu gebildete Lysolipin-Derivate aufgereinigt.
2.3 Chemische Modifikation von Lysolipin
Durch den Lysolipin-Geninaktivierungsansatz (2.2) wurden in erster Linie Substanzen generiert, die im Vergleich zum Lysolipin I durch den Verlust bestimmter dekorativer Gruppen gekennzeichnet sind. Durch chemische Modifikation wurden darüber hinaus Lysolipin-Derivate erzeugt werden, die an den der Modifikation zugänglichen Gruppen neue Substituenten aufweisen.
In einem ersten Ansatz wurden Lysolipin I Derivate nach der Einführung selektiver Schutzgruppen wie folgt dargestellt: Bis-TBS-Lysolipin (2)
Figure imgf000047_0001
41 mg Lysolipin I (1) (69 μmol) 40 mg Imidazol, 78 mg DMAP und 120 mg TBSCI wurden in 2 ml_ trockenem DMF 24 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ether/Pentan 1 :1 wässrig aufgearbeitet und über MgSO4 getrocknet. Chromatographie erfolgte an Kieselgel mit Ether/Pentan 1 :2. Ansatz lieferte als 2. Fraktion 56 mg (68 μmol; 98%) die Titelverbindung (2).
Mono-TBS-Lysolipin (3)
Figure imgf000047_0002
47 mg Bis-TBS-Lysolipin (2) wurden in 2.4 ml DMSO gelöst. Nach Zugabe von 0.6 ml Wasser wurde der Ansatz auf 800C erwärmt. Die klare Lösung wurde nicht gerührt. Das Produkt kristallisierte bereits während der Reaktion. Nach 2 h ließ man den Ansatz auf RT abkühlen und filtrierte die gelben Nadeln. Waschen mit Wasser und trocknen lieferte 31 mg (3) (77%).
Bisacetyl-mono-TBS-Lysolipin (4)
Figure imgf000048_0001
20 mg (3) wurden in 1 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 1 ml NEt3, 0.5 ml Acetanhydrid und 20 mg DMAP wurde der Ansatz 48 h bei RT gerührt. Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ether 14 mg (4) (17.6 μmol; 63%).
Bisacetyl-Lysolipin (5)
Figure imgf000048_0002
14 mg (4) (17.6 μmol) wurden in 10 ml trockenem THF bei -78°C vorgelegt. 23 μl_ einer 1 M TBAF-Lösung in trockenem THF wurden zugetropft. Der Ansatz wurde auf O0C aufgetaut (ca. 1h). Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ethylacetat 10 mg (5) (14.7 μmol; 83 %). Die Substanz (5) wurde als CBS53 bezeichnet und die Struktur wie unter 3. beschrieben bestätigt.
Diallyl-mono-TBS-Lysolipin (6)
Figure imgf000048_0003
9.6 mg (3) (13.5 μmol), 14 mg Kaliumcarbonat und 30 μl_ Allylbromid wurden in 1 ml trockenem DMF bei RT unter Stickstoff intensiv gerührt. Nach 6 h wurden weitere 50 μl_ Allylbromid zugegeben. Der Ansatz wurde noch 16 h gerührt und wässrig mit Ether/Pentan 1 :1 aufgearbeitet. Chromatographie mit Ether an Kieselgel lieferte 10 mg (12.6 μmol; 88%) (6).
Diallyl-Lysolipin (7)
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0002
10 mg (12.6 μmol) (6) wurden bei -780C in 5 ml_ trockenem THF vorgelegt. 16 μl einer 1 M-TBAF-Lösung in trockenem THF wurden zugetropft und langsam auf RT auftauen lassen (ca. 1 h). Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ethylacetat 5 mg (7) (7.4 μmol; 59 %) als 2. Fraktion. Als Nebenprodukt dieses Ansatzes konnte ebenfalls die Substanz (17) aufgereinigt werden. Die Substanz (7) wurde als CBS64 bezeichnet und die Substanz (17) als CBS104. Beide Strukturen wurden wie unter 3. beschrieben bestätigt.
Bisacetyl-monoallyl-Lysolipin (8)
Figure imgf000050_0001
9 mg (5) (13 μmol) wurden mit 0.1 ml Allylbromid, 0.1 g Silber-l-oxid und 10 mg MgSO414 Tage in 1 ml_ trockenem Ether unter Lichtausschluß gerührt. Der Ansatz wurde filtriert. Der feste Rückstand wurde 3 x mit Dichlormethan/ Methanol 10:1 gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingedampft und mit Etylacetat/Hexan 2:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 8 mg (11 μmol; 85%) (8).
Monopropyl-Lysolipin (9)
Hydrazin / MeOH
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000050_0003
8 mg (11 μmol) (8) wurden in 0.2 ml Dichlormethan gelöst und zu 0.3 ml Methanol und 0.1 ml Hydrazinhydrat gegeben. Es wurde 2 h bei RT gerührt und ohne Wärmezufuhr zur Trockne evaporiert. Der Rückstand wurde mit
Dichlormethan/Methanol 10:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 4 mg (6.3 μmol; 57 %) (9). Die Substanz (9) wurde als CBS63 bezeichnet und die Struktur wie unter 3. beschrieben bestätigt. Bispentenoyl-mono-TBS-Lysolipin (10)
Figure imgf000051_0001
10 mg (3) (14 μmol) wurden in 1 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 0.28 ml (2 mmol; 202 mg) Triethylamin wurde der Ansatz auf -5°C abgekühlt. 50 μL Pentenoylchlorid in 0.5 ml trockenem THF wurden langsam zugetropft. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt und wieder auf -5°C abgekühlt. Es wurden weitere 50 μL Pentenoylchlorid in 0.5 ml THF zugetropft. Nach einer 2 h Inkubation bei RT und wurde der Ansatz wässrig aufgearbeitet. Chromatographie an Kieselgel mit Ether/Pentan 2:1 lieferte 6.9 mg (7.9 μmol; 56%) (10).
Monopentenoyl-Lysolipin (11)
Figure imgf000051_0002
6.9 mg (7.9 μmol) (10) wurden in 6 ml_ trockenem THF bei -78°C vorgelegt. 10μL einer 1 M TBAF-Lösung in trockenem THF wurden langsam zugetropft. Der Ansatz wurde innerhalb 1 h auf 00C aufgetaut. Nach wässriger Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan / Ether 4:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 2.6 mg (3.8 μmol; 48%) (11). Die Substanz (11) wurde als CBS56 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt. In einem weiteren Ansatz wurde Lysolipin I direkt ohne Schutzgruppenmodifikation wie folgt derivatisiert:
11-Monoallyl-Lysolipin (12)
DMF
Figure imgf000052_0002
Figure imgf000052_0001
15 mg Lysolipin I (1) wurden mit 10 Äquivalenten Allylbromid und 10 Äquivalenten K2CO3 in trockenem DMF für 20 h bei RT gerührt. Nach wässriger Aufarbeitung wurde der Ansatz mittels präparativer LC (Bed. s.u.) aufgearbeitet. Aus dem Produktgemisch konnten ca. 3 mg 11-Monoallyl-Lysolipin (12) aufgereinigt werden. Die Substanz (12) wurde als CBS90 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
11 ,19-Bismethoxy-23-Acetoxy-Lysolipin (13)
Figure imgf000052_0003
15 mg Lysolipin I (1) wurden mit 10 Äquivalenten Methyljodid und 10 Äquivalenten K2CO3 in trockenem DMF bei RT gerührt. Nach wässriger Aufarbeitung wurde der Ansatz mittels präparativer LC (Bed. s. 2.) aufgearbeitet. Aus dem Produktgemisch konnten ca. 4 mg 11 ,19-Bismethoxy-23Acetoxy- Lysolipin (13) aufgereinigt werden. Die Substanz (13) wurde als CBS76 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
Zusätzlich wurde die nach Geninaktivierung von UpOl in der Mutante CB3919LlpOI_A generierte Substanz CBS40 zur chemischen Derivatisierung (Allylierung) wie folgt eingesetzt: 11 , 25-Diallyl-CBS40 (15)
Figure imgf000053_0001
20 mg CBS40 (14) wurden mit 10 Äquivalenten Allylbromid und 5 Äquivalenten K2CO3 in trockenem DMF 2 Tage bei RT gerührt. DMF wurde im Hochvakuum abdestilliert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die weitere Aufreinigung erfolgte mit Hilfe von Säulenchromatographie und mittels präparativer HPLC (Bed. s. 2.). Aus dem Produktgemisch konnten 3,7 mg 11, 25-Diallyl-CBS40 (15) aufgereinigt werden. Die Substanz (15) wurde als CBS89 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
Beispiel 3: Identifizierung und Strukturaufklärung neuer Derivate
Zur Identifizierung neuer Substanzen wurden die unter 2.1. beschriebenen gezielten Fermentationsansätze bzw. die Fermentationsüberstände der unter 2.2 beschriebenen Mutanten einer LC-DAD-MS-Analyse unterzogen. Die Anzucht der Kulturen erfolgte im analytischen Maßstab wie folgt. Vorkultur: 50 ml TSB-Medium [Tryptic Soy Broth, Beckton Dickinson] wurden mit den zu analysierenden Rekombinanten/Mutanten angeimpft und für 48 h bei 28 0C und 160 rpm inkubiert; Hauptkultur: 100 ml E1 -Medium [20 g Glucose, 20 g lösliche Stärke, 5 g Hefeextrakt, 2,5 g Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton OiI Company, Memphis, USA), 1 g MgSO4 x 7 H2O, 1 ,3 g KH2PO4 x 3 H2O, 3 g NaCI, 3 g CaCO3 mit Leitungswasser auf 1 I auffüllen, pH 7,5] wurden mit 1 ml der Vorkultur beimpft und für 168 h bei 28 0C und 160 rpm inkubiert. In den gezielten Fermentationen wurde 5 g/l NaBr zum Vorkulturmedium bzw. 5 g/l NaBr anstelle von NaCI ins Hauptkulturmedium gegeben. Je nach Mutante wurden zur Selektion während der Anzucht folgende Antibiotika zugegeben: 25 μg/ml Apramycin zu CB3818 (S. albus plus Lysolipingenclustercosmid 28-4H04) und allen CB3919 Apramycin-Insertionsmutanten und zur Doppelmutante; 50 μg/ml Kanamycin zur CB3919-Deletionsmutante.
Die Extraktion und die LC(DAD)-MS-Analyse der Überstände wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die LC(DAD)-MS-Analyse der oben beschriebenen Rekombinanten und Mutanten ergab, dass diese im Gegensatz zur Lysolipin-produzierenden Kontrolle (CB3818, Fig. 2-6) folgende neuartige Substanzen synthetisieren:
Rekombinante/Mutante Neue Substanzen
CB3818 (S. albus + 28-4H04) + NaBr CBS44, CBS49
CB3919LlpOI_A CBS40
CB3919LlpOI_A + NaBr CBS48 CB3919UpOIV_D CBS62, CBS68
CB3919UpOVI_A CBS61 , CBS84 CB3919LlpMI_A CBS60
CB3919LlpMIII_A CBS68, CBS73
CB3919LlpMVI_A CBS70, CBS72, CBS98, CBS100
CB3919LlpZIII_D CBS66
CB3919LlpOIV_D/LlpH__A CBS86, CBS87
CB3919LlpH_D/LlpMIII_A CBS102
CB3919LIpOI V_D/LlpOVI_A CBS110
CB3919LIpOVI I LD/LlpH_A CBS112
Um die Struktur der neuen Substanzen aufzuklären, wurden die entsprechenden Mutanten/Rekombinanten im 10 - 20 I Maßstab (jeweils in 250 ml Glaskolben mit 3 Schikanen und Cellulose Stopfen mit je 100 ml Kulturlösung) angezogen: Vorkulturmedium: TSB (s.o.), 28°C, 160 rpm, 72h
Hauptkulturmedium: E1 (s.o.), 280C, 160rpm, 120 h-168h Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium bei 4000 rpm (15°C) abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit 1 N HCl auf pH 4 eingestellt. Der dabei ausfallende flockige Niederschlag enthält die Hauptmenge an Lysolipinderivaten und wurde bei 4500 rpm, 15°C abzentrifugiert, mit Ethylacetat versetzt und im Ultraschallbad für 15 min belassen. Anschließend wurde über einen Büchnertrichter filtriert. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt bis das Ethylacetat fast farblos blieb. Das klare Filtrat wurde ebenfalls mit Ethylacetat ausgeschüttelt bis die organische Phase fast farblos blieb. Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zur Trockne eingeengt. Die Aufreinigung des Rohextrakts der Lysolipin-Derivate erfolgte in folgenden 3 Schritten:
1 Schritt: Rohprodukt wurde an einer Kieselgelsäule (400 x 50 mm, Bettvolumen: 800 ml, Kieselgel 60; 0,063-0,200 mm) mit CH2CI2/MeOH 9:1 chomatographiert. 2 Schritt: Sephadex LH20 (MeOH oder MeOH + 0,01 % TFA)
3 Schritt: Semipräparative HPLC (XTerra PrepMSCiβ, 10 μm, 19x300mm)
Laufmittel: Acetonitril/Wasser (mit TFA 0%-0.05%). Die Gradienten wurden so eingestellt, dass eine gute Trennung der einzelnen Derivate möglich war.
Je nach Rekombinante/Mutante konnten zwischen 0.5 mg und 30 mg der einzelnen Lysolipin-Derivate einer Reinheit > 90% aufgereinigt werden. Mittels NMR-Analyse wurde die Struktur der neuen Derivate aufgeklärt und auch die Struktur der chemischen Derivate aus 1.3 bestätigt:
Die Strukturaufklärung der einzelnen Lysolipinderivate wurde mit Hilfe hochaufgelöster 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie (1H, 13C, H1H-COSY (Long
Range-Correlation Spectroscopy), HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)) in Kombination mit UV, ESI- und HR-Massenspektoskopie durchgeführt. Alle Spektren wurden mit XWIN-NMR Software Bruker prozessiert. Chemische Verschiebungen wurden in δ-Werten (ppm) relativ zum jeweiligen Lösungsmittel als internen
Standard angegeben. Kopplungskonstanten (J) in [Hz]. Verwendete Abkürzungen: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m
= Multiplett, br = breit, ESI = Electron Impact lonization, HRMS = High
Resolution Mass Spectrometry.
Gerätespezifikationen: Bruker Avance 600 (600 MHz) und 400 MHz
Spektrometer. Die NMR-Daten und die daraus für die einzelnen neuartigen Lysolipin-Derivate resultierenden Strukturen sind in folgenden Abbildungen zusammengefasst:
Derivate aus der „biologischen" Modifikation:
CBS40 - Beispiel 5
CBS44 - Beispiel 6 CBS48 - Beispiel 7 CBS49 - Beispiel 8
CBS60 - Beispiel 9
CBS61 - Beispiel 10
CBS62 - Beispiel 11
CBS66 - Beispiel 12 CBS68 - BeispieM3
CBS70 - Beispiel 14
CBS72 - Beispiel 15
CBS73 - Beispiel 16
CBS84 - Beispiel 17 CBS86 - BeispieM8
CBS87 - Beispiel 19
CBS98 - Beispiel 20
CBS100 - Beispiel 21
CBS 102 - Beispiel 22 CBS 110 - Beispiel 23
CBS 112 - Beispiel 24
Derivate der „chemischen" Derivatisierung (s. 2.3):
CBS53 - Beispiel 25 CBS56 - Beispiel 26
CBS63 - Beispiel 27
CBS64 - Beispiel 28
CBS76 - Beispiel 29
CBS89 - Beispiel 30 CBS90 - Beispiel 31
CBS 104 - Beispiel 32
Die Struktur der von den Mutanten generierten Lysolipin-Derivate legt nahe, dass die Produkte der inaktivierten Zielgene für folgende Funktionen verantwortlich sind (Zuordnung s. Fig. 1): LIpOI: Oxygenierung am A-Ring LIpOIV: Oxygenierung an C15 LIpOVI: Oxygenierung an C16 LIpOVIII: Oxygenierung am A Ring LIpMI: Methyltransfer am C24 Sauerstoff LIpMIII: Methyltransfer am C6 Sauerstoff LIpMVI: Methyltransfer am C16 Sauerstoff LIpH: Halogenase am C1
Beispiel 4: Biologische Charakterisierung neuer Derivate
Alle neuartigen Lysolipin-Derivate wurden einer biologischen Charakterisierung unterzogen. Dabei wurde zum einen die in vitro efficacy (Minimale Hemmkonzentration = MIC) gegen 5 Testkeime und zum anderen die in vitro Cytotoxizität gegen 3 Zelllinien im Vergleich zur Ausgangssubstanz Lysolipin I (CBS42) bestimmt.
In vitro efficacy:
Von einigen Substanzen wurde der MIC Wert mit Hilfe des
Makrodilutionsverfahren (Testvolumen 1 ml) bestimmt mit den folgenden
Ergebnissen.
Figure imgf000059_0001
nd = nicht bestimmt
Folgende Medien wurden für die Testkeime eingesetzt:
E. faecalis VRE ATCC51575: TSB plus 7% Fetales Rinderserum S. aureus Me/GM/TC ATCC33592: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/I) S. epidermidis ATCC12228: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/I) S. pneumoniae EM & AM: TSB plus 7% Fetales Rinderserum E. coli ATCC10536: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/I)
Die Inkubation erfolgte für 20 h bei 37°. Die MIC-W erte wurden durch
Trübungsmessung bestimmt.
Weitere Lysolipin-Derivate wurden mit Hilfe des "Broth-Mikrodilutionsverfahrens" nach den Richtlinien der CLSI (ehemals NCCLS) getestet (National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved Standard - 6m ed. Document M7-A6. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA) mit den folgenden Ergebnissen.
Figure imgf000060_0001
In vitro Cytotoxizität:
Die Cytotoxizität der neuen Lysolipinderivate wurde in vitro durch die Bestimmung der IC50 Werte gegen definierte Zelllinien im sogenannten Resazurin-Test (Zugabe eines Vitalitätsfarbstoffes) untersucht. Folgende Zellinien wurden eingesetzt:
• humane Leberzelllinie Huh-7
• Mauszellinie J774a.1
• humane Lymphoblastenzelllinie THP-1 Die Ergebnisse sind folgend dargestellt.
Figure imgf000061_0001
nd = nicht bestimmt Der eigentliche Test wurde wie folgt durchgeführt:
• Vorbereitung der Zellen
Definierte Kryokonserven der Testzellen wurden aufgetaut und die Zellen unter den für sie optimalen Bedingungen expandiert. Adherente Zellen wurden für das Passagieren trypsiniert. Nach Erreichen einer ausreichenden Zellzahl wurden die Zellen mit 100 μl Medium je Well in 96 well Platten eingesäht. Die Vitalität der Zellen war > 95%. Die Zellen wurden im Anschluss für 24 Stunden bei 370C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert.
• Inkubation mit den Testsubstanzen
100 μl jeder Verdünnungsstufe der Substanzen wurde zu den Zellen in die Wells gegeben. Hierbei wurden je Stufe drei Wells verwendet. Als
Lösungsmittelkontrolle wurde Medium mit der höchsten im Assay befindlichen Konzentration an DMSO verwendet. Hier wurde eine Vierfachbestimmung vorgenommen (100% Wert). Als Positivkontrolle wurde Cycloheximid in einer Konzentration von 20 μg/ml eingesetzt (0% Wert). Die Zellen wurden im Anschluß für 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert.
• Durchführung des Resazurin-Assays
Resazurin wird durch die Mitochondrien lebender Zellen reduziert. Hierbei entsteht die fluoreszenzaktive Form Resofurin. Die Menge an entstandenem Resofurin kann über einen Fluoreszenzreader quantifiziert werden und steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl an lebenden Zellen. Zu den Zellen werden 100 μl einer 50 μM Resazurinlösung (Sigma-Aldrich) gegeben. Diese Lösung wurde zuvor angesetzt, über 0,2 μm Filter steril filtriert und aliquotiert. Die Aliquots wurden bei -200C gelagert. Die Platten wurden im Anschluß für 4 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert. Die Entwicklung der fluoreszierenden Verbindung kann optisch durch eine Verfärbung der Testlösung von blau nach pink verfolgt werden. Zur Auswertung wurden die Platten in einem Fluoreszenzreader (Genios, Tecan) ausgelesen. Hierfür wurde eine Anregungswellenlänge von 560 nm und ein Emissionsfilter von 590 nm gewählt. Die Daten wurden über Microsoft Excel und eine Anwenderapplikation (XFIuor4, Tecan) ermittelt. • Auswertung
Die Rohdaten wurden normalisiert. Hierbei gab die Positivkontrolle den Wert für die Wells mit den toten Zellen (0% Wert) und die Negativ- /Lösungsmittelkontrolle den 100% Wert. Die erhaltenen Mittelwerte wurden zur Berechnung des IC50 Wertes herangezogen. Die Berechnung wurde mit Hilfe des Analyseprogramms Graph Päd Prism 4.0 durchgeführt.
Die biologische Validierung der generierten Lysolipinderivate und ein Vergleich der zur Ausgangssubstanz Lysolipin I erzeugten strukturellen Veränderungen führen zu folgenden überraschenden Erkenntnissen: • die durch biologische Modifikation erzeugten Lysolipin-Derivate sind weiterhin antibakteriell aktiv
• das Halogen beeinflusst die Cytotoxizität (Br anstelle von Cl =>30 fache Reduktion der Cytotoxizität gegen THP-1 bei unveränderter in vitro efficacy) • die Methylendioxybrücke ist für in vitro efficacy entbehrlich
• Folgende Substanzen sind deutlich weniger cytotoxisch aber weiterhin antibiotisch aktiv: biologisch generiert:
CBS70 [30 fach weniger cytotoxisch bei unveränderter antibiotischer Aktivität]
CBS73 [700 fach weniger cytotoxisch bei moderatem Aktivitätsverlust (15 fach geringer: z.B. S. aureus MIC 0.5)] chemisch modifiziert:
Lysolipinderivate CBS64 und CBS90 (Diallyl- und Monoallylderivat) zeigt starke Verringerung der Cytotoxizität (100 x) bei moderatem
Aktivitätsverlust
Die Generierung und Validierung neuer Lysolipinderivate hat somit überraschenderweise gezeigt, dass die Cytotoxizität und die antibiotische Aktivität strukturell zu trennen sind. Beispiel 5: CBS40 Molekulare Formel: C28H20CINO9
UV/Vis (Maxima): 252 nm; 273 nm; 301 nm; 327 nm; 363 nm; 378 nm
ESI-MS:m/z
HRMS C28H
Figure imgf000064_0001
1H-NMR 600 MHz, CDCl3 13C-NMR 150.9 MHz CDCl3
Figure imgf000064_0002
Zuordnung vertauschbar Beispiel 6: CBS44
Molekulare Formel: C29H25NO11
UV/Vis (Maxima): 237 nm; 262 nm; 320 nm; 349 nm; 363 nm; 395 nm
ESI-MS:m/z = 564.21 [M+H], 1149.50 [2M+Na]
HRMS C29H25NOn: ber. 563.1428, gef. 563.1421
Figure imgf000065_0001
1H-NMR 600 MHz, (J6-DMSQ 13C-NMR 150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Signale überlappen
Beispiel 7: CBS48
Molekulare Formel: C28H21NO9 UV/Vis (Maxima): 254 nm; 301 nm; 325 nm; 378 nm ESI-MS:m/z = 516.19 [M+H], 1053.41 [2M+Na] HRMS C28H22NO9: ber. 516.1295, gef. 516.1311
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000066_0003
Figure imgf000067_0002
> Zuordnungen vertauschbar
Beispiel 8: CBS49
Molekulare Formel: 029H24BrNOn
UV/Vis (Maxima): 241 nm; 256 nm; 274 nm; 304 nm; 348 nm; 397 nm;
ESI-MS:m/z = 642.12 [M+H], 1307.27 [2M+Na]
HRMS C29H25BrNO11: ber.642.0611 , gef. 642.0589
Figure imgf000067_0001
H-NMR (600 MHz, d6-DMSO , 1 "3C, -NMR (150.9 MHz, (J6-DMSO)
Figure imgf000067_0003
Figure imgf000068_0002
Signale überlappen
2) Signale kollabieren zu einem Singulett
Beispiel 9: CBS60
Molekulare Formel: C29H22CINO9
UV/Vis (Maxima): 253 nm; 273 nm; 303 nm; 329 nm; 364 nm; 379 nm
ESI-MS:m/z = 564.09 [M+H], 1149.29 [2M+Na]
HRMS C29H23CINO9: ber.564.1061 , gef. 564.1071
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0003
Figure imgf000069_0002
' Zuordnungen vertauschbar
Beispiel 10: CBS61
Molekulare Formel: C28H20CINO8
UV/Vis (Maxima): 253 nm; 302 nm; 329 nm; 356 nm; 369 nm
ESI-MS:m/z = 534.10 [M+H], 1089.24 [2M+Na]
HRMS C28H20CINO8: ber. 533.0877, gef. 533.0881
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0003
Figure imgf000070_0002
Beispiel 11 : CBS62
Molekulare Formel: C29H26ÖNO10 UV/Vis (Maxima): 245 nm; 272 nm ESI-MS:m/z = 584.06 [M+H], 1189.27 [2M+Na] HRMS C29H26CINOi0: ber. 583.1245, gef. 583.1271
Figure imgf000070_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000070_0003
Figure imgf000071_0002
Beispiel 12: CBS66
Molekulare Formel: C2SH22ClNO9
UV/Vis (Maxima): 250 nm; 298 nm; 323 ran; 354 nm; 367 nm
ESI-MS:m/z = 552.06 [M+H], 1125.18 [2M+Na]
HRMS C28H22ClNO9: ber. 551.0983, gef. 551.0964
Figure imgf000071_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000072_0002
Signale überlappen
Beispiel 13: CBS68
Molekulare Formel: C27H20CINO8 UV/Vis (Maxima): 256 nm; 323 nm; 359 nm ESI-MS:m/z = 522.08 [M+H], 1065.29 [2M+Na] HRMS C27H2ICINO8: ber. 522.0956, gef. 522.0960
Figure imgf000072_0001
1H-NMR (600 MHz, CJ6-DMSO , 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000073_0001
Beispiel 14: CBS70
Molekulare Formel: 0-26Hi8CINO8 UV/Vis (Maxima): 257 nm; 323 nm; 354 nm; 366 nm ESI-MS:m/z = 508.11 [M+H], 1037.24 [2M+Na] HRMS C26Hi8CINO8Na: ber. 530.0619, gef. 530.0618
Figure imgf000074_0001
1H-NMR 600 MHz (I6-DMSO 13C-NMR 150.9 MHz CJ6-DMSO)
Figure imgf000074_0002
fl überlagert von Wassersignal Beispiel 15: CBS72
Molekulare Formel: C27H20CINO9
UV/Vis (Maxima): 251 nm; 299 nm; 323 nm; 353 nm; 368 nm
ESI-MS:m/z = 538.07 [M+H], 1097.16 [2M+Na]
HRMS C27H20CINO9: ber. 537.0827, gef. 537.0821
Figure imgf000075_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000075_0002
C-26 166.9 s
Beispiel 16: CBS73 .
Molekulare Formel: C27H20CINO9
UV/Vis (Maxima): 257 nm; 299 nm; 324 nm; 354 nm; 368 nm
ESI-MS:m/z = 538.12 [M+H], 1097.28 [2M+Na]
HRMS C27H2ICINO9: ber.538.0905, gef. 538.0919
Figure imgf000076_0001
1H-NMR 600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, (J6-DMSO)
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0002
Signale überlappen
Beispiel 17: CBS84
Molekulare Formel: C27H20CINO8 UV/Vis (Maxima): 251 nm; 324 nm; 352 nm; 366 nm ESI-MS:m/z = 522.04 [M+H], 1065.18 [2M+Na] HRMS C27H20CINO8Na: ber. 544.0775, gef. 544.0790
Figure imgf000077_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO , 13C-NMR (150.9 MHz5 (J6-PMSO)
Figure imgf000077_0003
Figure imgf000078_0002
Beispiel 18: CBS86
Molekulare Formel: C27H21NO8
UV/Vis (Maxima): 256 nm; 321 nm; 360 nm
ESI-MS:m/z = 488.11 [M+H]
HRMS C27H2INO8Na: ber. 510.1165, gef. 510.1155
Figure imgf000078_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000078_0003
Figure imgf000079_0002
, Zuordnungen vertauschbar
Beispiel 19: CBS87
Molekulare Formel: C2δH23NO8
UV/Vis (Maxima): 254 nm; 320 nm; 360 nm
ESI-MS:m/z = 502.09 [M+H]
HRMS C28H23NO8Na: ber. 524.1321 , gef. 524.1308
Figure imgf000079_0001
1H-NMR 600 MHz, d6-DMSO , 13C-NMR (150.9 MHz, (I6-DMSO)
Figure imgf000079_0003
Figure imgf000080_0002
n.o. nicht beobachtet
Beispiel 20: CBS98
Molekulare Formel: C26H19CIO10 UV/Vis (Maxima): 276 nm; sh 322 nm ESI-MS:m/z = 527.03 [M+H], 1075.05 [2M+Na] HRMS C26H19CIO10Na: ber. 549.0564, gef. 549.0562
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0003
Figure imgf000081_0002
Signale überlappen n.o. nicht beobachtet
Beispiel 21 : CBS100
Molekulare Formel: C27H20CINO8
UV/Vis (Maxima): 250 nm; 322 nm; 354 nm; 366 nm
ESI-MS:m/z = 522.08 [M+H]
HRMS C27H20CINO8Na: ber. 544.0775, gef. 544.0769
Figure imgf000081_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000081_0003
Figure imgf000082_0002
Zuordnungen vertauschbar 2' überlagert von Lösungsmittelpeak
Beispiel 22: CBS 102
Molekulare Formel: C27H21NO9 UV/Vis (Maxima): 256 nm; 323 nm; 355 nm; 368 nm ESI-MS:m/z = 504.09 [M+H], 1029.20 [2M+Na] HRMS C27H2INO9Na: ber. 526.1114, gef. 526.1111
Figure imgf000082_0001
1H-NMR (600 MHz, (I6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Figure imgf000082_0003
Figure imgf000083_0002
Signale überlappen
2) Zuordnungen vertauschbar
Beispiel 23: CBS110 Molekulare Formel: C26Hi8CINO7
UV/Vis (Maxima): 256 nm; 322 nm; 350 nm; 364 nm
ESI-MS:m/z = 492.08 [M+H]
HRMS C26Hi9CINO7: ber. 492.0850, gef. 492.0849
Figure imgf000083_0001
1H-NMR 600 MHz, (I6-DMSO , 13C-NMR (150.9 MHz, (J6-DMSO)
Figure imgf000083_0003
Figure imgf000084_0002
Signale überlappen.
2) überlagert von Wassersignal
Beispiel 24: CBS112
Molekulare Formel: C29H23NO9
UV/Vis (Maxima): 254 nm; 302 nm; 318 nm; 365 nm; 378 nm
ESI-MS:m/z = 530.16 [M+H], 1081.34 [2M+Na]
HRMS C29H23NO9Na: ber. 552.1271 , gef. 552.1276
Figure imgf000084_0001
1H-NMR (600 MHz, (J6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
Position 51H (PPm) 813C (ppm)
C-I 7.57 d, 8.1 Hz, IH 117.1 d
Figure imgf000085_0002
Beispiel 25: CBS53
Molekulare Formel: C33H28CINO-13
UVA/is (Maxima): 237 nm; 280 nm; 354 nm
ESI-MS:m/z = 640.19 [M-acetyl+H], 682.25 [M+H], 1385.50 [2M+Na]
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
' ' Zuordnungen vertauschbar
Beispiel 26: CBS56
Molekulare Formel: Ca4H30CINOi2 UV/Vis (Maxima): 267 nm; 340 nm ESI-MS:m/z = 680.28 [M+H]
Figure imgf000086_0002
Figure imgf000086_0003
Figure imgf000087_0002
Beispiel 27: CBS63
Molekulare Formel: C32H30CINO1-1
UV/Vis (Maxima): 245 nm; 273 nm; 305 nm; 349 nm; 400 nm
ESI-MS:m/z = 640.19 [M+H], 1301.47 [2M+Na]
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000087_0003
Figure imgf000088_0003
Beispiel 28: CBS64
Molekulare Formel: C35H32CINO11
UV/Vis (Maxima): 239 nm; 270 nm; 281 nm; 363 nm
ESI-MS:m/z = 678.10 [M+H], 1377.32 [2M+Na]
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000088_0002
auch vertauscht sein Beispiel 29: CBS76
Molekulare Formel: C33H30CINO13 UV/Vis (Maxima): 268 nm; 323 nm ESI-MS:m/z = 684.04 [M+H], 1389.23 [2M+Na]
Figure imgf000089_0001
1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, (J6-DMSO)
Figure imgf000089_0002
Figure imgf000090_0002
Signale überlappen
2) Signale kollabieren zu einem Singulett
Beispiel 30: CBS89
Molekulare Formel: C34H2BCINO9 UV/Vis (Maxima): 258 nm; 310 nm; 363 nm; 382 nm ESI-MS:m/z = 588.84 [M-allyl], 630.05 [M+H], 1281.15 [2M+Na] HRMS C34H28CINO9Na: ber. 652.1350, gef. 652.1354
Figure imgf000090_0001
1H-NMR 600 MHz, de-DMSO , 13C-NMR 150.9 MHz CJ6-DMSO)
Figure imgf000090_0003
Figure imgf000091_0002
' Signale überlappen
Beispiel 31 : CBS90
Molekulare Formel: C32H2SCINOH
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000091_0003
Figure imgf000092_0002
Signale überlappen
Beispiel 32: CBS104
Molekulare Formel: C34H28CINO10
UV/Vis (Maxima): 247 nm; 279 nm; 310 nm; 340 nm; 388 nm; 433 nm
ESI-MS:m/z = 646.18 [M+H]
HRMS C34H28CINO10: ber. 645.1402, gef. 645.1384
Figure imgf000092_0001
1H-NMR (600 MHz, (J6-DMSO , 13C-NMR (150.9 MHz, (I6-DMSO)
Figure imgf000093_0001
Signale überlappen
5) überlagert von Wassersignal
6'7'S) Signale vertauschbar
Die Zuordnungen für die Allylreste C-Il und C-19 basieren nur auf Η-Daten und können deshalb auch vertauscht sein.

Claims

Patentansprüche:
1. Lysolipin Derivat gemäß Formel I
Figure imgf000094_0001
Formel I
wobei R1 bis R11 gleich oder verschieden und unabhängig voneinander sein können:
R1 = H, F, Cl, Br, oder I,
R2 = H oder C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert,
R3 = H, OH, OR11 , oder über O oder direkt gebundenes Pentenoyl, AIIyI, oder C1-12 Acyl, ggf. substituiert,
R4 = H, OH, oder ORH ,
R5 = H, OH, oder ORH ,
R6 = H, OH, oder ORH , R7 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, AIIyI, oder C1-20 Acyl, jeweils ggf. substituiert,
R8 = H, OH, OR11 , C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl,, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder 0-C0-O-R11 , jeweils ggf. substituiert,
R9 = OR11 , C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, H, oder OH,
R10 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl , linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder AIIyI, jeweils ggf. substituiert,
R11 = C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl , linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-
Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen Carbonsäure, einer
Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure, ggf. substituiert, verestert sein können, und wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einem C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen ein- oder mehrwertigem
Alkohol, ggf. substituiert, verethert sein können sowie Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze solcher Verbindungen,
wobei die folgenden Kombinationen ausgenommen sind: i) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7
= H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und
X2, X3 = N, sowie X4 = O; wobei jedoch H an C12 optional durch OH ersetzt sein kann ii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7
= Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iv) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 =
OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, v) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 =
OCH3, R7 = Acetyl, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vi) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 =
OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, viii). R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3,
R7 = H, R8 = H, R9 = OCH3, R10 = CH3, Doppelbindung zwischen X1 und
X2, X3 = N, sowie X4 = O, ix) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH1 R6 = OCH3, R7 = H,
R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O, x) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xi) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = =0, R9 = =0, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O, und xiii) R1 = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = 0CH3, R5 = -OH oder -O-CO-CH3, R6 = H, R7 = H, R8 = H oder OH, R9 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = O, sowie X4 = -CO-.
2) Lysolipin nach Anspruch 1 , wobei
R1 = H, Cl1 oder Br, R2 = H oder CH3,
R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, AIIyI, oder Acetyl,
R4 = H, OH, oder OCH3
R5 = H, oder OH,
R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, AIIyI, oder Acetyl,
R8 = H, OH, Proypl, oder O-CO-O-CH3,
R9 = OCH3, CH3, H, oder OH,
RIO = H, CH3, oder AIIyI1 wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-
Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere
Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer a-, ß-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer
Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
3) Lysolipin Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei
R1 = H, Cl, oder Br,
R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, oder AIIyI,
R4 = H, oder OCH3
R5 = H, oder OH,
R6 = H, OH, oder OCH3,
R7 = H, CH3, oder AIIyI, R8 = H, OH, Proypl, oder O-CO-O-CH3,
R9 = OCH3, oder CH3,
RIO = H1 CHS1 OdBr AIIyI1 wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-
Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere
Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer a-, ß-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer
Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
4) Lysolipin Derivat gemäß einer der folgenden Formeln, optional an einer oder mehreren OH Funktionalitäten verestert oder verethert, oder Isomere, Diastereomere, Enantiomere oder Salze solcher Verbindungen:
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5) Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
6) Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Inhibierung von Bakterien, Viren oder Pilzen. 7) Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung.
8) Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei eine physiologisch wirksame Dosis eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit zumindest einem galenischen Hilsstoff gemischt und zu einer Darreichungsform, vorzugsweise einer oralen oder parenteralen Darreichungsform, hergerichtet wird.
9) Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eine
Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 einer Person verabreicht wird, welche an der Infektion oder Erkrankung erkrankt ist oder zu erkranken droht.
10) Verfahren zur Herstellung eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit den folgenden Verfahrensschritten: a) es wird eine gewünschte Modifikation gegenüber Lysolipin I oder Lysolipin X definiert, b) es wird eine oder mehrere der Gene gemäß Seq.-ID 47 bis 92 anhand ihrer Funktionalitätszuordung mit der Maßgabe ausgewählt, dass das Gen, dessen Mutation und/oder dessen Inhibierung, insbesondere teilweise oder totale Inhibierung, für die Synthese der Modifikation funktional ist, c) es wird eine Zelle erzeugt, welche das Gen oder die Gene gemäß Stufe b), ggf. mutiert und/oder inhibiert, enthält, wobei das Gen bzw. die Gene in funktionalem Zusammenhang des Lysolipin Biosyntheseclusters angeordnet sind, d) die Zelle wird kultiviert, e) das Lysolipin Derivat wird aus der Zelle oder dem Kulturüberstand isoliert, f) optional erfolgt eine chemisch synthetische Derivatisierung des Produktes aus der Stufe e).
11 ) Verwendung eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Zwischenprodukt für die chemisch synthetische Herstellung von modifizierten Lysolipin Derivaten.
12) Verwendung eines Proteins oder mehrere der Proteine gemäß der
Sequenzen Seq. -I D 1 bis 46 zur enzymatisch katalytischen Derivatisierung von Lysolipin, wobei das Protein mit einem Lysolipinvorläufer oder einem Lysolipinderivat sowie mit allen für die mit dem Protein enzymatisch katalysierte Derivatisierung notwendigen Metabo I iten kontaktiert wird und wobei das erhaltene Lysolipin Derivat isoliert wird.
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